CN1816352A - 使用一种免疫毒素治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用免疫毒素预防或治疗头颈鳞状上皮细胞癌及膀胱癌的方法，此免疫毒素包括：(a)结合癌细胞上一种蛋白的配体，连接于(b)；(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。在本发明具体的实施方案中，使用VB4－845预防或治疗头颈鳞状上皮细胞癌及膀胱癌，VB4－845是一种重组免疫毒素，含有人源化、MOC31衍生的单链抗体片段，此片段与截断型假单胞菌外毒素A融合。本发明还包括预防或治疗癌症的联合治疗方法，其中包括减少化学治疗药物的使用剂量。本发明还包括为预防或治疗癌症直接将重组免疫毒素导入癌瘤的配方及方法。

Description

使用一种免疫毒素治疗癌症的方法
技术领域
本发明涉及对患有癌症或有患癌风险的病人施予一种免疫毒素以预防或治疗癌症的方法，此免疫毒素可以结合选择性表达于癌细胞表面的抗原。
背景技术
最近，免疫治疗方法已经显现为一种潜在有效的抗癌新方法。鼠源和人源化/嵌合抗体及各自的抗体片段定向攻击肿瘤相关抗原(TAAs)的方法已经用于某些人类癌症的诊断及治疗5-13。这些抗体的非偶联形式、偶联毒素形式及放射标记形式已经用于此类治疗。
与免疫治疗有关的一种肿瘤相关抗原是Ep-CAM(上皮细胞粘附分子，已知的有17-1A、KSA、EGP-2及GA733-2)。Ep-CAM是一种在许多实体肿瘤，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌及头颈部鳞状细胞癌中高表达的跨膜蛋白，但在大多数正常上皮组织表达量很少，Ep-CAM在癌瘤形成中的作用仍不清楚，但其表达与细胞增生率相关。Ep-CAM特异性抗体已经用于反映及检测小细胞肺癌和非小细胞肺癌病人的原发性肿瘤及其转移瘤。抗Ep-CAM的单克隆抗体中鼠源单克隆抗体PANOREX(也称为依决可单抗)在德国已经被批准用于结肠癌的治疗，在美国处于临床试验阶段14-15。然而，众人瞩目的PNOREX治疗伴有不良副反应，包括腹部痛性痉挛、恶心、短暂腹泻及皮肤荨麻疹损伤39-41，57。其它Ep-CAM靶向抗体的临床试验不很成功，抗体BIS-1治疗伴有外周血管收缩、呼吸困难及发烧，抗体3622W94治疗伴有急性坏死性胰腺炎36-38。探索有效、低毒性的抗Ep-CAM抗体仍在继续，已有报道完全人源化的抗Ep-CAM抗体M-T201，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)而发挥作用58。衍生于鼠源单克隆抗体MOC31的人源化、稳定的单链抗Ep-CAM抗体4D5MOC-B也已经开发，在2000年4月10日及2000年10月19日公布的国际专利申请PCT/EPOO/03176(公开号No.WO 00/61635)及Willuda等59中有所描述。这些公开的治疗方法未揭露人源化抗体在治疗头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)及膀胱癌中的使用。
如上所述，与Ep-CAM表达增加相关的癌症之一是头颈鳞状上皮细胞癌(“HNSCC”)，Ep-CAM表达与人类头颈鳞状上皮细胞癌的发展有关。头颈鳞状上皮细胞癌在目前世界上最常见的癌症中位居第六。头颈鳞状上皮细胞癌可以引起严重的病症，尤其是语言和吞咽功能的异常。手术、放射治疗、化学药物治疗、或者这些方法的结合通常作为治疗方法的选择。
尽管所有方法试图治愈患头颈鳞状上皮细胞癌的病人，但复发仍然是头颈部癌症治疗失败(40％-50％的病人)的最常见原因。补救治疗包括与一线治疗相同的治疗方法。然而，姑息手术常常是困难的而且会毁损面容。另外，放射治疗很少可行或有益，化学药物治疗基本上不会实质改善头颈鳞状上皮细胞癌病人存活率。这些病人的预后仍旧很差，复发后的生存中值仅为大约六个月。
由于头颈鳞状上皮细胞癌病人预后不良，疾病对生活质量的影响及有限的治疗方法选择，人们对新型肿瘤特异性治疗方法的研制尤其是针对头颈鳞状上皮细胞癌的方法有很大兴趣，而且是迫切需要。
膀胱癌是世界第七大最常见癌症，估计每年产生260,000新病例。在欧洲，每年导致大约50,000人死亡。膀胱组织癌几乎完全作为移行细胞癌在移行上皮细胞，排列于膀胱组织表层发生。在初次诊断中，70％-90％的膀胱癌病人具有泌尿道上皮表层癌的浅表病变，为非侵入性且呈乳头状瘤(指状突起)。目前的治疗包括血管内化学药物治疗，及接种卡介苗(BCG)的免疫治疗，其可以引起全身感染结核杆菌的危险。尽管使用攻击治疗方法，这些浅表乳头状瘤中的70％会在延长的临床病程中复发，导致严重的病症，大约4-8％会发展成侵袭性癌。
为满足此医学需求，需要研制新型肿瘤特异性治疗方法，其中一种新方法是使用免疫毒素的靶向治疗方法：抗体与毒素交联，抗体特异性结合肿瘤细胞并释放能有效杀伤肿瘤细胞的毒素。
发明内容
本发明涉及治疗头颈鳞状上皮细胞癌及膀胱癌的新方法，通过给予需要此种治疗的病人施予有效药量、可以特异结合(因此是“靶向”)癌细胞表面一种蛋白的重组免疫毒素。如需要，免疫毒素可以与一种或多种其它抗癌治疗剂联合给药，同时给药和/或顺序给药，和/或与放射治疗或手术联合。
本发明还涉及预防癌症发生、复发或降低其复发率的方法，包括直接将有效药量的免疫毒素导向疑有癌症发生或复发的部位。
本发明还涉及降低手术后并发症危险的方法，包括在癌症手术之前、手术中、和/或手术后直接将有效药量的免疫毒素用于手术部位。
本发明还涉及使肿瘤或癌症对另一种癌症治疗剂敏感的方法，该方法包括使用有效药量免疫毒素，其它癌症治疗剂可以是在给予免疫毒素之前、重叠、同时，和/或之后给予。
本发明治疗方法所使用的免疫毒素包括：(a)结合癌细胞上一种蛋白的配体，连接于(b)；(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。癌细胞结合部分(a)可以例如通过化学连接或遗传连接与毒素部分(b)偶联。
在具体的非限制性实施方案中，配体结合Ep-CAM，在一个具体的非限制性实施方案中，配体是抗体或抗体片段。
从下列详细描述中本发明其它特点及优点将显而易见。然而，应该清楚，从此详细描述本发明精神和范围的各种变化和修改将为本领域技术人员所熟悉，表现本发明优先方案的详细描述及具体的实施例仅通过举例说明的方法给出。
附图说明
本发明现以下列图例描述：
图1：向肿瘤块免疫毒素和/或其它癌症治疗剂瘤内给药示意图。
图2.(A)VB4-845图。本图描述免疫毒素的4D5MOC scFV和ET-A252-608部分及可变区连接的结构，包括组氨酸标签，PelB信号，连接子区，VL和V-H区，ETA的II、Ib和III区，及内质网(ER)滞留信号。(B)预测的4D5MOCB-ETA三维模型，显示了scFV(VL和VH)，ETA252-608(II、Ib和III结构域)，连接肽及两个组氨酸标签的结构。
图3A-D及SEQ ID NOS：1和2显示了VB4-845的DNA和氨基酸序列。核苷酸及多肽序列可以划分为以下几个结构域：包括胞质表达的信号序列，组氨酸标签，CDR1区，CDR2区，CDR3区，VL区，VH区，连接子区，ETA的结构域II区、Ib区和III区，及内质网(ER)滞留信号KDEL。
图4.VB4-845对人类肿瘤异种移植物的抗肿瘤作用53。对于负荷Ep-CAM阳性肿瘤异种移植物(HT29、SW2、CAL27)或阴性对照(COLO320(o))的裸鼠每隔一日给予VB4-8455ug(给药9次(■))或10ug(给药3次(▲))静脉治疗。肿瘤大小相对于初始的中值肿瘤大小160mm3给出。
图5.对于负荷CAL27肿瘤异种移植物裸鼠的肿瘤周围给药治疗。肿瘤周围途径给予负荷Ep-CAM阳性的CAL27肿瘤异种移植物的裸鼠VB4-845，隔日一次(周一/周三/周五)，每次5ug(给药9次)。肿瘤大小相对于初始的中值肿瘤大小给出。
图6.VB4-845(4D5MOCB-ETA)治疗后的肝功能测定。为了进行比较，也显示了SchUmann等55-56所描述的以单次致死剂量(85ug/kg)野生型ETA治疗的小鼠转氨酶活性。数据以均数±标准差(n＝3)来表示。
图7.VB4-845诱发的肝脏和脾脏组织病理学结果。圆圈表明20ug剂量组中坏死肝细胞的区域。
定义
在本发明中，术语“动物”是指包括人在内的动物界所有成员，优选的动物是患有头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的人。
在本发明中，术语“癌症治疗方法”是指可以有效治疗或预防癌症的化合物或治疗方法，包括但不仅限于化学制剂、其它免疫制剂、癌症疫苗、抗血管原性化合物、某些细胞因子、某些激素、基因疗法、放射疗法、手术及饮食疗法。
在本发明中，术语“有效药量”意思是在剂量及用药时间方面为获得预期结果所需的有效药量。免疫毒素的有效药量可以因诸多因素如疾病状态、年龄、性别及动物体重而不同。可以调节给药方案以提供最适宜的治疗反应。例如，可以每日给予分份剂量或根据治疗情况的紧急事件提示按比例减少剂量。
在本发明中，术语“人源化抗体或抗体片断”是指包含人框架区的抗体或抗体片断。来自非人物种抗体的人源化已在有关文献中有所描述。见EP-B1023-9400和Carter&Merchant 1997(Curr Opin Biotechnol 8，449-454，1997)。
在本发明中，术语“直接将免疫毒素施予癌症部位”是指直接或基本上直接药物导入肿瘤，包括但不仅限于单次或多次直接将免疫毒素注入于肿瘤或从肿瘤周围给药，连续或间断直接灌注于肿瘤处或从肿瘤周围灌入，将储药装置导入肿瘤或肿瘤周围，将缓释装置导入肿瘤或肿瘤周围，将缓释制剂导入肿瘤或肿瘤周围，直接用到肿瘤上，直接注入基本直接供应肿瘤区的动脉，直接注入基本引流至肿瘤区的淋巴管，直接或基本上直接导入封闭的空腔(如胸膜腔)或内腔(如血管内)。“肿瘤周围的”是指被认为是肿瘤边界，其在10cm以内，优选的5cm以内，更优选的1cm以内的区域，例如但不仅限于可触及的肿瘤边界。在关于预防癌症发生及复发的上下文中“直接给药”被定义为直接将药物用于存在癌症发生或复发危险的部位。
在本发明中，术语“结合癌细胞上一种蛋白质的配体”包括通过结合癌细胞上一种蛋白质可以选择性将免疫毒素靶向癌细胞的任何分子。优选地，癌细胞上的靶蛋白是与正常细胞相比在癌细胞高水平表达的肿瘤相关抗原。
在本发明中，术语“MOC-31抗体”是指本技术领域所熟知的鼠抗Ep-CAM抗体或抗EGP-2抗体，可以从商业来源获得，如BioGenex，cat no.MU316-UC，ZymedLaboratories Inc.，cat.No.18 0270或United States Biological，cat no.M4165。
在本发明中，术语“4D5MOC-A”是指被移接到scFv 4D5的人工人同源框架的人源化scFv MOC31抗体，如以参考文献形式并入本发明中的WO 00/61635所描述。
在本发明中，术语“4D5MOC-B”是指4D5MOC-A的稳定变体，其制备方法如以参考文献形式并入本发明中的WO 00/61635所描述。
在本发明中，术语“VB4-845”是指免疫毒素：其包括：a)scFv人源化抗体4D5MOC-B，与b)融合；b)为由252-608位氨基酸组成的截断型假单胞菌外毒素A。
在本发明中，术语“药学可以接受的”是指临床上普遍使用和/或由联邦或州政府管理机构批准，在美国药典中列出或由相关技术领域的技术人员普遍接受。
在本发明中，抗体结合的“生理条件”表现但不一定复制体内结合Ep-CAM的多肽遇到一个Ep-CAM分子所需的条件。生理条件下的结合应该可以预言体内结合的发生。
在本发明中，术语“预防癌症”是指预防癌症的发生。某些情况下，预防性治疗降低癌症复发率。在其它情况下，预防性治疗减少病人癌症发展的危险，或抑制癌前状态(如结肠息肉)演变成实质上的恶性肿瘤。
在本发明中，术语“减少的剂量”是指低于正常给药剂量和/或推荐剂量的剂量。癌症治疗剂的正常给药剂量可以在技术人员熟知的参考文献中找到，例如最新版本的《医师案头参考》(Physician′s Desk Reference)。
在本发明中，术语“治疗癌症”是指抑制癌细胞的复制，抑制癌瘤扩散(转移)，抑制肿瘤生长，减少癌细胞数目或肿瘤生长，降低癌症的恶性等级(例如分化增加)，或改善癌症相关症状。
在本发明中，术语“变体”指药学上接受的免疫毒素的衍生物、相似体或其片段，抗体或抗体片段，毒素(例如假单胞细菌毒素)，或本发明中描述的癌症治疗剂。变体还包括一个或多个多聚体组分，含单一组分的多聚体，含多个单一组分的多聚体(例如参照分子多聚体)，化学分解产物及生物分解产物。在具体的非限制性实施方案中，免疫毒素可以是由于参照免疫毒素的Ep-CAM结合部分和/或毒素部分改变而相对于参照免疫毒素的“变体”。例如，免疫毒素变体可含有抗体部分和/或毒素部分的多聚体。使用检测参照毒素制剂毒性的标准方法，分子毒素部分的变体保留至少10％的毒性和优选至少30％的毒性。
在生理条件下，具有参照免疫毒素Ep-CAM结合部分变异的免疫毒素变体与抗Ep-CAM参照抗体竞争结合至少10％，优选至少30％(见下文)。竞争10％意思是在饱和浓度抗Ep-CAM参照抗体结合Ep-CAM的分析中，当所检测的变异抗Ep-CAM免疫毒素达到当量浓度的平衡时，10％结合的参照抗体被取代。作为非限制性实施方案，抗体之间的竞争，或抗体与免疫毒素之间的竞争可以通过以下方法检测：(1)将标记的抗Ep-CAM参照抗体结合细胞表面的Ep-CAM，或结合表面为Ep-CAM的固态底物，这样事实上所有的Ep-CAM位点被抗体结合；(2)使抗体-抗原复合体接触未标记的试验抗Ep-CAM抗体或未标记的试验免疫毒素；及(3)检测标记抗体被从Ep-CAM结合位点取代的数量，其中游离的标记抗体量表示发生竞争的数量。
发明详述
发明者已经证实了含有结合与假单胞菌外毒素A相连接的人Ep-CAM胞外域的人源化抗体片段的免疫毒素可以有效治疗头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)及膀胱癌。发明者尤其证实了包含单链Fv重组稳定及与缺少细胞结合结构域的截断型假单胞菌外毒素A(ETA)融合的人源化Ep-CAM抗体片段的免疫毒素对于头颈鳞状上皮细胞癌及膀胱癌具有细胞毒性作用。免疫毒素结合表达于癌细胞表面的Ep-CAM。一旦结合，免疫毒素被内在化，假单胞菌外毒素A阻止蛋白质合成，从而导致细胞死亡。重要的是由于大多数正常粘膜细胞和成纤维细胞不广泛表达Ep-CAM，不能内在化免疫毒素，从而被保护避免了外毒素的杀伤效应。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种包含向需要治疗的动物施予有效药量免疫毒素来治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌的方法，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。本发明还提供使用有效药量免疫毒素治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。本发明进一步提供在药剂生产中使用有效药量免疫毒素治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含向需要治疗的动物施予有效药量免疫毒素来治疗或预防膀胱癌的方法，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。本发明还提供使用有效药量免疫毒素治疗或预防膀胱癌，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。本发明进一步提供在药剂生产中使用的有效药量免疫毒素治疗或预防膀胱癌，所述免疫毒素包括：(a)结合癌细胞表面的一种蛋白质的配体，与(b)连接；(b)对癌细胞产生细胞毒性作用的毒素。
结合癌细胞上一种蛋白质的配体可能是可以选择性将免疫毒素靶向癌细胞的任何分子。在一个实施方案中，配体结合肿瘤相关抗原。表达于头颈鳞状上皮细胞癌细胞的蛋白质包括IL-4受体、EGF受体、HER21神经膜表面蛋白及Ep-CAM。表达于膀胱癌细胞的蛋白质包括EGF受体、gp54及Ep-CAM。在具体的实施方案中配体结合Ep-CAM。
在一个优选的实施方案中，配体是抗体或抗体片段。可以使用的抗体片段包括重组来源和/或在转基因动物中生产的Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv及dsFv。抗体或其片段可以是来自包括小鼠、大鼠、家兔、地鼠及人的任何物种。嵌合抗体衍生物，即结合非人动物可变区及人恒定区的抗体分子也在本发明涉及范围之内。嵌合抗体分子可以包括例如含有来自小鼠、大鼠或其它物种抗原结合结构域及人恒定区的人源化抗体。
常规方法可以用于制备嵌合抗体，参见例如Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等，Nature 314，452(1985)，Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567；Boss等，U.S.Patent No.4,816,397；Tanaguchi等，European Patent PublicationEP171496；European Patent Publication 0173494，United Kingdom patent GB 2177096B。人源化抗体的制备在EP-B 10239400中有所描述。人源化抗体还可以商业生产(ScotgenLimited，2Holly Road，Twickeuham，Middlesex，Great Britain.)。预期在受试人体内嵌合抗体比相应的非嵌合抗体具有较小的免疫原性。人源化抗体可以进一步稳定，如WO00/61635所描述。
头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌细胞的反应蛋白质—特异的抗体或抗体片段，可以通过筛选免疫球蛋白基因或其部分的编码基因表达文库，在细菌中由编码蛋白质的核苷酸以肽的形式表达产生的。例如，完整的Fab片段、VH区及FV区可以在细菌内使用噬菌体表达文库进行表达(参见Ward等，Nature 341，544-546：(1989)；Huse等，Science246，1275-1281(1989)；and McCafferty等，Nature 348，552-554(1990))。可选择的由Genpharm建立的SCID-hu小鼠模型也可以用于生产抗体或其片段。
免疫毒素的配体部分可以由免疫球蛋白衍生，即免疫球蛋白(或抗体)作为起始分子。例如配体可以通过使用本技术领域熟知的标准技术修饰免疫球蛋白支架产生。在另一个非限制性实施方案中，免疫球蛋白结构域(如可变的重链和/或轻链)可以与非免疫球蛋白支架连接。另外，配体可以通过，但不限于化学反应或基因设计的方法产生。因此，非限制性实施方案中，免疫毒素可包括：(1)特异结合头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌细胞的免疫球蛋白衍生多肽(例如，自抗体文库选择的抗体)或其变体；及(2)毒素或其变体。该免疫球蛋白多肽配体可以重新设计以影响其靶向肿瘤相关分子结合特性或改良其例如物理特征。
免疫毒素的配体部分不需要以免疫球蛋白为基础。因此，免疫毒素可包括：(1)特异结合头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌细胞的非免疫球蛋白多肽(例如Affibody)或其变体，及(2)毒素或其变体。该非免疫球蛋白多肽配体可以进行设计以结合目标肿瘤相关分子。此外，可以对非免疫球蛋白多肽配体进行设计以达到预期的亲和力或亲合力，可以耐受机体条件的变化，包括极端的pH范围和相对的高体温。
的确，作为在药物组分中的使用，非免疫球蛋白多肽设计成在生理条件下(如37℃，肽酶存在)相对较长的半衰期是有利的。此外，这样的分子或其变体，表现为溶解性好、体积小及适当折叠且可以在容易获得的成本低廉的细菌系统中表达，因此可以在商业上以适当的数量进行生产。设计非免疫球蛋白多肽是普通技术人员掌握的技术。参见如U.S.Patent Nos.5,831,012及6,534,628中关于普遍采用的设计、生产及选择预期结合配对体的技术。
抗原表位结合多肽的例子包括但不限含纤维结合素III型结构域的配体(参见如International Publication Nos.WO 01/64942，WO 00/34784，WO 02/32925)。A蛋白亲和力文库用于鉴定抗原表位结合多肽(参见U.S.Patent Nos.5,831,012及6,534,628)，依据本发明相，这些文库可用于选择与特异结合头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌细胞选择性结合的多肽。
本领域技术人员所熟悉的其它类型结合分子包括但不限于以重复蛋白结构域组合的结合分子(见如Forrer等，2003，“设计固定重复蛋白模块性质的结合分子的一种新方法”FEBS Lett.539：2-6；Kohl等，2003，“锚蛋白同源重复序列稳定晶体结构的设计”Proc Natl Acad Sci USA.100：1700-1705)。依据本发明，随机组合的重复结构域文库可用于选择与特异结合头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌细胞的选择性结合的配体。
几种非免疫球蛋白为基础的抗原表位结合多肽及其制备和使用该多肽方法为本领域已知。(参见如Eklund等，2002，“从A蛋白为基础的亲和体文库中选择的抗个体基因型蛋白”Prot.Struct.Funct.Gen.48：454-462；Gunneriusson等，1999″通过螺旋移动Taq DNA聚合酶特异亲和体的亲和力成熟″Prot.Eng.12：873-878；Hansson等，1999，“体外选择性结合蛋白(亲和体)显示依赖构象的呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白识别”Immunotechnol.4：237-252；Henning等，2002，“以衍生于葡萄球菌蛋白A的三螺旋束支架为基础的一类新配体对腺病毒5趋向性进行遗传修饰”Human Gene Therapy13：1427-1439；Hogbom等，2003，“体外变体亲和体的识别结构基础”Proc Natl AcadSci USA.100(6)：3191-3196；；Nord等，1997，“选自螺旋状细菌受体结构域的组合文库的结合蛋白”Nature Biotechnol.15：772-777；Nor d等，2000，“选自A蛋白组合文库的配体用于载脂蛋白A-1M和Taq DNA聚合酶亲和力捕获”J.Biotechnol.80：45-54；Nord等，1995，“α螺旋细菌受体结构域组合文库”Prot.Eng.8：601-608；Nord等，2001，“选自噬菌体显示的A蛋白组合文库的重组人因子VIII特异亲和配体”Eur.J.Biochem.268：1-10；Nygren等，1997，“蛋白工程中新结合位点支架”Curr.Opin.Struct.BioI.7：463-469；Ronnmark等，2002，“来自A蛋白组合工程的人免疫球蛋白(IgA)特异配体”Eur.J.Biochem.269：2647-2655；Ronnmark等，2002，“大肠杆菌产生的亲和体-Fc嵌合体结构及特征”J.ImmunoI.Meth.261：199-211；Wahlberg等，2003，“亲和体与靶蛋白的复合体：结构及双重折叠”Proc Natl Acad Sci USA.100(6)：3185-3190；Gotz等，2002，“复合体中荧光素和相关的工程脂质运载蛋白之间超高速电子转移，所谓的反向运载蛋白”Biochemistry.41：4156-4164；Skerra，2001，“反向运载蛋白：具有类抗体性质的新型工程配体结合蛋白”J BiotechnoI.2001 74：257275；Skerra，2000，“脂质运载蛋白作为支架”Biochim Biophys Acta.1482：337-350；Skerra等，2000，“分子识别的工程蛋白支架”J Mol Recognit.13：167-187；Schlehuber等，2000，“异羟基洋地黄毒甙元特异的、以脂质运载蛋白支架为基础的新型受体蛋白”J Mol BioI.297：1105-1120；Beste等，1999，“脂质运载蛋白折叠衍生具有规定的配体特异性的类抗体小蛋白”Proc Natl Acad Sci USA.96：1898-1903；PCT国际公开号WO97/45538“功能性分子表面产生、筛选及演化的新型合成蛋白结构模板”(关于衍生于血小板-白细胞C激酶底物同系(PH)结构域的结构模板框架的肽序列文库的构建))。
假如受影响的细胞表现在细胞表面表达靶向蛋白增加，根据本发明可以治疗的癌症包括但不限于任何类型的头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌。可以对肿瘤或肿瘤细胞进行评估确定其对本发明治疗方法的敏感性，例如通过获取肿瘤组织或细胞的标本确定标本结合免疫毒素配体部分的能力。在一个实施方案中，癌细胞上的蛋白为Ep-CAM。通过一种能增加癌前或癌组织细胞表面Ep-CAM的稳态表达水平的介质来诱导或升高Ep-CAM在细胞表面的表达。
因此，本发明包括在使用本发明治疗方法之前的诊断方法和诊断试剂盒以确定头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌是否表达一定水平被免疫毒素配体结合的蛋白。因此，在进一步实施方案中，本发明包括治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌方法，包括：(1)检测病人肿瘤标本中与头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌相关的可疑蛋白表达，及(2)如果与对照比较肿瘤标本中蛋白以较高水平表达，给予病人有效药量的免疫毒素，所述免疫毒素包括：
(a)结合癌症细胞上蛋白的配体，连接于(b)；
(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。
本发明还包括诊断头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的试剂盒，其包括结合癌细胞上一种蛋白的配体，及其诊断癌症的使用说明书。
在优选的非限制性实施方案中，癌症易受直接使用免疫毒素的治疗影响。例如，靶肿瘤组织块接近皮肤表面，再例如，病灶组织被包囊包裹，或被发现基本上处于包围腔内，包括但不限于内腔(如膀胱)。(关于直接给药的详细情况在后面公开)。
在其它实施方案中，癌症易受静脉使用免疫毒素的治疗影响。
本发明还提供降低手术后并发症危险的方法，其包括在手术前、手术中或手术后使用有效药量的免疫毒素及在具体非限制性实施方案中手术治疗癌症。
本发明还提供预防癌症发生、预防或延期复发或降低头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌复发率的方法，其包括直接给予需要治疗的病人有效药量的免疫毒素。
本发明还提供使肿瘤或癌肿对一种或多种其它癌症治疗剂敏感的方法，其包括使用本发明的免疫毒素。在非限制性实施方案中，其它癌症治疗剂包括其它Ep-CAM靶向免疫毒素。在另一非限制性实施方案中，其它癌症治疗剂包括放射线。其它治疗剂可以在给予免疫毒素之前、与之重叠、同时给予，和/或之后给予。当同时给予时，免疫毒素和其它治疗剂可以单一的配方或各自分离的配方给予，如果分开给予然后随意采用不同的给予模式。因此，一种或多种免疫毒素及一种或多种其它治疗剂的联合可以协同抗肿瘤或癌症。
除一种或多种治疗剂外还可以给予本发明的免疫毒素，其它治疗剂包括但不限于2，2′，2″三氯三乙胺，6-氮尿苷，6-重氮基-5-氧-L-己氨酸，6-巯基嘌呤，醋葡醛内酯，阿克拉霉素放线菌素，六甲密胺，氨鲁米特，格鲁米特，安吖啶，阿纳托唑，环胞苷，血管生成因子反义寡核苷酸，安曲霉素，5-氮杂胞苷，重氮丝氨酸，氮丙啶，巴马司他，B细胞淋巴瘤反义寡核苷酸，苄替派，比卡鲁胺，比山群，争光霉素，乙基酰胺，二甲磺酸丁酯，放线菌素嗜癌霉素C，7β，17α-二甲睾酮，顺羧酸铂，卡巴苯醌，嘧福禄，亚硝脲氮芥，10-去甲基柔红霉素，苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯地孕酮，氯乙链脲菌素，色霉素，顺铂，2-氯脱氧腺苷，环磷酰胺，阿糖胞苷，氮烯唑胺，更生霉素，柔红霉素，磷氨氮芥，秋水仙胺，N10，9-二甲基叶酸，亚胺醌氨酯，紫杉萜，去氧氟尿苷，阿霉素，屈洛昔芬，屈他雄酮，依达曲沙，艾佛鸟氨酸，醋酸羟哔咔唑，乙嘧替氟，诺希他布(enocitabune)，表柔比星，环硫雄醇，雌氮芥，三聚乙二醇二缩水甘油醚，依托扑沙，法倔唑，芬维A胺，5-氟脲嘧啶脱氧核苷，氟达拉滨，5-氟尿嘧啶，氟硝丁酰胺，甲酰四氢叶酸，福美坦，磷雌酚，佛替姆丁，硝酸镓，2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷，戈舍瑞林，己烷雌酚，羟基脲，去甲氧基柔红霉素，异磷酰胺，英丙舒凡，α干扰素，干扰素β，干扰素γ，白细胞介素2，天门冬酰胺酶，香菇多糖，来曲唑，醋酸亮丙瑞林，环己亚硝脲，氯尼达明，甘露醇氮芥，双氯乙基甲胺，盐酸氧氮芥，甲羟孕酮，醋酸甲地孕酮，甲烯雌醇，苯丙氨酸氮芥，美诺立尔，环戊缩环硫雄烷，氨甲喋呤，四甲尿烷亚胺，米铂，米替福新，二溴甘露醇，丙米腙，二溴卫矛醇，丝裂霉素C，邻氯苯对氯苯二氯乙烷，盐酸米托蒽醌，单哌潘生丁，霉酚酸，安得乐，尼莫司丁，二胺硝吖啶，诺加霉素，新氮芥，橄榄霉素，奥沙利铂，紫杉醇，葡萄糖酸锑，派来霉素，过磷酰胺，蛋氨氮芥，苯乙酸氮芥胆甾醇酯，溴丙哌嗪，哌酰硫烷，吡喃阿霉素，吡曲克辛，光辉霉素，鬼臼酸2-乙基-酰肼，聚雌二醇，聚磷酸雌二醇，卟吩姆钠，甲基丝裂霉素，松龙苯芥，丙帕锗，云芝多糖-k，蝶酰三谷氨酸，博罗霉素，雷莫司汀，丙亚胺，罗喹美克，裂裥多糖，索布佐生，螺旋锗，链黑菌素，链唑霉素，三苯氧胺，呋氟尿嘧啶，替莫唑胺，鬼臼噻吩甙，薄佐酸(tenuzonic acid)，睾内酯，硫唑嘌呤胺，2-氨基-6-巯基嘌呤，拓优得，托泊替康，托瑞米芬，三亚胺醌，三亚胺嗪，噻替派，硫替派，曲洛司坦，曲美沙特，曲普瑞林，氯乙环磷酰胺，脞特肯(trontecan)，杀结核菌素，苯丁抑制素，尿嘧啶氮芥，尿烷亚胺，氨基甲酸乙酯，长春碱，长春新碱，新制癌菌素，佐柔比星，阿糖胞苷，吉姆单抗，硫垩培(thioepa)，环瑟伏酰胺(cyclothosphamide)，抗代谢物(例如，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-巯基鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，氟达拉滨，2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷，氮烯唑胺，替莫唑胺)，六甲基嘧胺，米托坦片剂，核苷类似物，植物生物碱(例如，紫杉酚，紫杉醇，喜树碱，托泊替康，依立替康(盐酸伊立替康和山梨醇注射剂、喜树碱-11)，长春新碱，长春药属生物碱如长春碱)。鬼臼毒素，鬼臼乙叉甙，VP-16VP-16(鬼臼乙叉甙)，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，蒽环类抗生素，(例如柔红霉素)，阿霉素脂质体，二羟蒽林，光辉霉素，更生霉素，阿地白介素，阿鲁特胺(allutamine)，拜敖霉素(biaomycin)，卡培他滨，顺羧酸铂，氯阮布新(chlorabusin)，环阿拉素(cyclarabine)，达克利诺霉素(daclinomycin)5-氟脲嘧啶脱氧核苷，劳普莱德乙酸酯(lauprolide acetate)，左旋咪唑，环己亚硝脲，巯基嘌诺(mercaptopurino)，巯乙磺酸钠，核染质，派格泼葛(pegaspergase)，戊莱汀(pentoslatin)，光辉霉素，如克斯迈(riuxlmab)，莰帕斯-1(campath-1)，瑞普佐新(straplozocin)，维甲酸，血管内皮(细胞)生长因子反义寡核苷酸，长春花碱酰胺，长春瑞滨。本发明也考虑了由一种或多种癌症治疗剂的组合(FLAG和CHOP)，FLAG包括氟达拉滨，阿糖胞苷(Ara-C)及集落粒细胞刺激因子G(G-CSF)，CHOP包括环磷酰胺，长春新碱，阿霉素，及泼尼松。关于本领域已知的癌症治疗剂完整列表参见最新版《默克索引》及《医师案头参考》。同样，本发明的免疫毒素可以与放射疗法或其它已知癌症治疗方式结合。
联合治疗的药物组分包括但不限于抗生素(如更生霉素、争光霉素、光辉霉素、安曲霉素)，天门冬酰胺酶，卡介苗，白喉毒素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，抗有丝分裂剂，相思豆毒素，蓖麻油酸盐，假单胞菌外毒素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤维蛋白溶酶原激活剂，抗组织胺药，抗恶心药。
的确，直接为需要治疗的病人给予有效药量的免疫毒素可以减少其它治疗剂的剂量，具有显著临床功效。在未予免疫毒素治疗的情况下观察不到这种减少其它治疗剂剂量的功效。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法包括使用减少了剂量的一种或多种其它癌症治疗剂。
此外，包括给予需要治疗的病人免疫毒素的联合治疗与标准治疗方法的持续时间和周期次数相比需要相对较短的治疗时间。因此，本发明提供治疗肿瘤或癌症的方法包括以相对较短的持续时间和/或较短的治疗周期次数给予一种或多种其它癌症治疗剂。
因此，根据本发明，包括免疫毒素和其它癌症治疗剂的联合治疗可以减少总体癌症治疗的毒性(即副反应)。例如，与单一疗法或其它联合治疗相比，当给予减量的免疫毒素和/或其它癌症治疗剂时，和/或当减少治疗周期的持续时间(即单一治疗周期或一系列给药的周期)，和/或当减少循环的次数时，可以观察到毒性减轻。
在优选的实施方案中，本发明提供治疗和/或改善患有头颈鳞状上皮细胞癌的病人临床状况。因此，本发明提供的治疗方法包括给予病人有效药量的免疫毒素以：(i)减小头颈鳞状上皮细胞癌肿瘤大小，生长速度，侵袭力，恶性等级，和/或复发风险，(ii)延长其他治疗后的无病间隔时间，和/或(iii)改善头颈鳞状上皮细胞癌病人的呼吸、吞咽和/或语言功能。临床改善可以是主观的或客观判定，例如通过评估受试者呼吸困难较轻，吞咽流体和固体的能力，梗阻的程度，语言的质量或音量，及其它临床人员熟悉的指征。
在其它的优选实施方案中，本发明提供治疗和/或改善患有浅表膀胱移行细胞癌病人的临床状况。因此，本发明提供的治疗方法包括给予病人有效药量的免疫毒素以：(i)减小膀胱癌肿瘤大小，生长速度，侵袭力，恶性等级，和/或复发风险，(ii)延长治疗后的无病间隔时间，和/或(iii)治愈患有浅表膀胱移行细胞癌病人的疾病。临床改善可以通过临床技术人员熟悉的方法如细胞学评估、细胞检查或活组织检查来判定。
如前所述，本发明的免疫毒素包括：(a)结合癌症细胞上蛋白的配体，连接(b)；(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。配体可以被任何方式“连接”于目的物，以此方式配体与可毒素联系或连接。例如，配体可以通过化学或重组的方法连接于毒素。制备融合物或轭合物的化学方法为本领域已知，而且可以用于制备免疫毒素。用于偶联配体和毒素的方法必须能够连接配体和毒素而不干扰配体结合癌细胞上靶分子的能力。
在一个实施方案中，配体和毒素均为蛋白质，可以使用本领域已知的技术进行连接。有几百种交联剂可用于结合两种蛋白质。(参见“蛋白结合与交联的化学作用”，1991，Shans Wong，CRe Press，Ann Arbor)。交联剂一般是以反应功能基为基础选择的，或嵌入配体或毒素。另外，如果无反应基团，可以使用光激活交联剂。在某些情况，需要包括配体和毒素之间的间隔物。本领域已知的交联剂包括同基双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物及双丙烯酰胺，及异基双功能试剂：马来酰亚胺苯甲酰-N羟基琥珀酰亚胺及硫代马来酰亚胺苯甲酰-N羟基琥珀酰亚胺。
配体蛋白与毒素蛋白融合物还可以使用重组DNA技术进行制备。在这种情况下，编码配体的DNA序列与编码毒素的DNA序列融合，从而产生嵌合DNA分子。嵌合DNA分子被转染到表达配体-毒素融合蛋白的宿主细胞内。融合蛋白可以使用本领域已知的技术从细胞培养物中恢复及纯化。
优选地，配体结合Ep-CAM。在一个实施方案中，免疫毒素包括：(a)结合癌症细胞上EP-CAM的抗体或抗体片断，连接于(b)；(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。(在此该免疫毒素被称作“Ep-CAM-靶向免疫毒素”)在一个具体的实施方案中，免疫毒素包括：(a)结合人Ep-CAM胞外域的人源化抗体和抗体片段，以及包括从MOC-31抗体衍生的互补决定区(CDR)序列，连接于(b)；(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。来自4D5MOC-B抗体的CDR序列示于在SEQ ID NOS：4-9。
根据本发明，合适的Ep-CAM靶向免疫毒素包括但不限于VB4-845及其变体，含有MOC31可变区的其它免疫毒素或其变体，及含有其它选择性结合EpCAM的单链或双链免疫球蛋白的免疫毒素或其变体。
在一个实施方案中，Ep-CAM结合部分包括完整的免疫球蛋白分子。在另一实施方案中，Ep-CAM结合部分是Fab、Fab′、scFv、单结构域抗体片段或二硫键稳定的Fv片段的二聚体。又一实施方案中，Ep-CAM结合部分包括重链可变区，轻链可变区，Fab、Fab′、scFv、单结构域抗体片段或二硫键稳定的Fv片段。Ep-CAM结合分子部分可以源自一个或多个物种，优选包含源自人种的部分，最优选的是完整的人源的或人源化的。为便于纯化或与毒素偶联而设计的区域可以被包括在或添加到Ep-CAM结合部分。
在具体的非限制性实施方案中，免疫毒素含有VB4845，如SEQ ID NO：2所示。在另一实施方案中，免疫毒素含有VB4-845变体，VB4845变体结合相同的Ep-CAM表位或被VB4845结合的基本相似的Ep-CAM表位，在生理条件下，变体可以竞争抑制VB4-845结合Ep-CAM至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％。VB4-845变体可以含有与VB4-84相同的假单胞菌外毒素A片段，或可以含有相同外毒素的不同部分或不同毒素。
在另一非限制性实施方案中，免疫毒素包含Ep-CAM结合部分或其变体，所述Ep-CAM结合部分包含MOC31可变区。在又一实施方案中，免疫毒素包含Ep-CAM结合部分或其变体，所述Ep-CAM结合部分包含4D5MOCB。在生理条件下，这些任意一免疫毒素与Ep-CAM的结合可以因与参照MOC31或4D5MOCB抗体竞争而减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％。采用活细胞的间接流式细胞计量术测得VB4-845的亲和力是KD＝1.6×10-8。L-ineweaverBurke分析(数据手册：0935，第50页)使用方法按照Benedict等(1997)J.Immunol.Methods，201：223-231。如Willuda等(Cancer Research59，5758-5767，1999)所描述，使用放射免疾分析法及Biacore方法，MOC31B的亲和力是KD＝3.9×10-9。因此，本发明包括解离常数(KD)小于2.0×10-8的免疫毒素。
可选择的，免疫毒素包括除前几段讨论的可选择性结合Ep-CAM的Ep-CAM结合部分。在优选的实施方案中，所述Ep-CAM结合部分的结合亲和力至少为四个数量级，优选地至少三个数量级，更优选地小于由标准实验技术检测的VB4-845，PANOREX，或MT-201的二个数量级的结合亲和力。在非限制性实施方案中，生理条件下，Ep-CAM结合部分可以竞争阻断已知的抗Ep-CAM抗体，例如，但不限于PANOREX或MT201，结合Ep-CAM至少0.1％、1％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％。
本领域技术人员知道特异性决定残基可以被识别。术语“特异性决定残基”也称为“SDR”，是指形成抗体互补位部分，尤其是互补决定区(CDR)的残基，个别由丙氨酸不依赖任何其它变异取代，减少抗体表位的亲和力至少10倍，优选地至少100倍，更优选地至少1000倍。此亲和力降低强调残基在抗体结合表位能力方面的重要性。参见如Tamura等，2000，“抗癌抗体的结构关联：特异性决定残基(SDRs)的识别及通过仅保留SDRs研制最小免疫原性的抗体变体”J.Immunoi.164(3)：1432-1441。
评估单一或多个突变对结合活性尤其是结合亲和力的影响可以同时评价特殊系列氨基酸在结合相互作用中的重要性(如有助轻链或重链CDR2结合)。还可以顺序评估氨基酸突变的效应从而评价当个别评价时单个氨基酸的作用。此评估可以通过例如体外饱和扫描(参见如U.S.Patent No.6,180,341；Hilton等，1996，“促红细胞生成素受体WSXWS基序的饱和诱变”J BioI Chem.271：4699-4708)及位点定向诱变作用(参见如Cunningham and Wells，1989，“丙氨酸分区诱变作用高分辨率表位定位hGH-受体相互作用”Science 244：1081-1085；Bass等，1991，“人类生长激素受体激素结合物的系统突变分析”Proc Natl Acad Sci.USA 88：4498-4502)进行。丙氨酸分区诱变技术中，分子中多个残基处引入单个丙氨酸突变，检测所生成的突变分子生物活性以鉴定在分子活性中起关键作用的氨基酸残基。
配体受体或其它生物学相互作用的位点可以通过结构的物理分析例如，核磁共振、结晶照相术、电子衍射或光亲和标记并结合推断的接触位点氨基酸突变来确定。(参见如de Vos等，1992，“人类生长激素及其受体的胞外域：复合体的晶体结构”Science255：306-312；Smith等，1992，“人白细胞介素4的四螺旋束蛋白的溶液结构”J MolBioI.224：899-904；Wlodaver等，1992，“人重组白细胞介素4在2.25A解析度的晶体结构”FEBS Lett.309：59-64.)。另外，特殊单个氨基酸或系列氨基酸的重要性可以通过与相关多肽或相似结合位点的氨基酸序列比较进行评估。
此外，本领域技术人员知道增加了的亲合力可以补偿较低的结合亲和力。免疫毒素对Ep-CAM的亲合力可以衡量Ep-CAM结合部分结合具有多个结合位点的Ep-CAM的强度。Ep-CAM与Ep-CAM结合部分的功能结合强度可以表现所有亲和键的总强度，因此单个组分可以以较低的亲和力结合，但这些组分的多聚体可以表现出有力的生物效应。事实上，Ep-CAM结合位点和Ep-CAM表位之间的多种相互作用可以表现比累积生物效应大得多的效应，即关于平衡常数多价的有利之处在于多个数量级。
在一个非限制性实施方案中，Ep-CAM结合部分具有与4D5MOCB基本相似的结构。基本相似的结构特征可以参照反映免疫毒素Ep-CAM结合部分对于Ep-CAM分子的结合位点表位图。
同样，根据本发明多种毒素可以用于设计Ep-CAM靶向免疫毒素。在优选的实施方案中，毒素包括具有核蛋白体钝化活性的多肽，其包括但不限于白树毒素，梫木毒素(bouganin)，皂草素，篦麻毒素A链，榄香胶素(bryodin)，白喉毒素，局限曲菌素及其变体。当毒素为具有核蛋白体钝化活性的蛋白质时，免疫毒素必须通过结合癌细胞时被内在化以使毒素对细胞具有细胞毒性作用。
在具体的优选实施方案中，毒素部分包括至少假单胞菌外毒素A(“ETA”)，或其变体的毒素部分。在具体的实施方案中，细胞毒素部分包括ETA变体，当单独给药时基本不能结合细胞。在进一步的具体实施方案中，细胞毒素部分可以包括ETA252-608。毒素部分包括一种或多种本领域已知的假单胞菌外毒素(参见如Kreitman，1995，“假单胞菌外毒素靶向血液恶性肿瘤”癌症生物学学术讨论会6：297-306；Pastan，2003，“含有假单胞菌外毒素A的免疫毒素：简介”Cancer Immunol.Immunother.52：338-341)或其变体。
一些假单胞菌外毒素变体及含有假单胞菌外毒素变体的结构制备及使用方法为本领域已知(参见如U.S.Patent Application No.US2003054012；U.S.Patent No.6531133；U.S.Patent No.6426075；U.S.Patent No.6423513；U.S.Patent No.6074644；U.S.PatentNo.5980895；U.S.Patent No.5912322；U.S.Patent No.5854044；U.S.Patent No.5821238；U.S.Patent No.5705163；U.S.Patent No.5705156；U.S.Patent No.5621078；U.S.PatentNo.5602095；U.S.Patent No.5512658；U.S.Patent No.5458878；U.S.Patent No.5082927；U.S.Patent No.4933288；U.S.Patent No.4892827；U.S.Patent No.4677070；U.S.PatentNo.4545985；国际公开号：WO98/20135，WO93/25690；WO91/18100；WO91/18099；WO91/09949；及WO88/02401；Kondo等，19888，“缺少细胞识别结构域的修饰假单胞菌外毒素构建的免疫毒素活性”J BioI Chern.263：9470～9475；Batra等，1989，“以抗转移受体及假单胞菌外毒素重组形式制备的免疫毒素在小鼠体内的抗肿瘤活性”Proc Natl.Acad.Sci.USA 86：8545-8549；Puri等，1991，“鼠肉瘤细胞高亲和力白介素4受体的表达及通过白介素4与假单胞菌外毒素之间的嵌合蛋白质受体介导的肿瘤细胞毒性作用”Cancer Res 51：3011-3017；Siegall et al.，1992，“与假单胞菌外毒素轭合的嵌合(人鼠)单克隆抗体BR96 IgG，F(ab′)2，and Fab′细胞毒性。Bioconjug-Chem 3：302-307；Hall et al.，1994，“体内膜内转铁蛋白-假单胞菌外毒素A免疫毒素抗LOX黑素瘤效应”Neurosurgery 34：649-655；Kuan and Pai，1995，“靶向Ley的含假单胞菌外毒素的免疫毒素以抗体特异模式破坏人内皮细胞：与血管渗漏综合征有关”Clin Cancer Res1：1589-1594；Kreitman，1995，“假单胞菌外毒素靶向血液恶性肿瘤”Sem Cancer BioI6：297-306；Kawooya等.，“大肠杆菌分泌的假单胞菌外毒素40(PE40)的表达、亲合纯化及重组特征”J Biotechnol 42：922；Kaun and Pai，1995，Puri et aI.，1996，“含有循环置换的白介素4和截断型假单胞菌外毒素的重组毒素治疗恶性星形细胞瘤的临床前研制”Cancer Res 56：5631-5637；Pai等.，1996，“免疫毒素LMB-1(连接于假单胞菌外毒素的一种抗体)治疗晚期实体肿瘤”Nature Med.3：350-353；Pai等.，1998，“假单胞菌外毒素免疫毒素的临床试验”Curr Top.Microbioi.Immunol.234：83-96；Klimka et aI.，1999，“由噬菌体展示选择的抗CD30单链Fv与假单胞菌外毒素A融合(Ki-4(scFv)-ETA′)产生有效抗淋巴网状细胞瘤衍生的细胞系的免疫毒素”British J Cancer 80：1214-1222；Rand等.，2000，“高级神经胶质瘤病人瘤内给予重组循环置换白介素4-假单胞菌外毒素”Clin Cancer Res 6：2157-2165；Leland et aI.，2000，“人乳粟细胞表达II型IL-4受体及于体内外对嵌合IL-4假单胞菌外毒素融合蛋白的抗肿瘤活性敏感”Molecular MedicineToday待6：165-178；Tur等.，2001，“由噬菌体展示选择的抗GD2单链Fv与假单胞菌外毒素A融合对神经母细胞瘤具有特异的细胞毒活性”Int J MoI.Med 8：579-584；Onda et ai.，2001，“由TP-3Fv片段与截断型假单胞菌外毒素A组成的抗骨肉瘤重组免疫毒素的细胞毒性”J Immunother 24：144-150；18.“抗p185her-2假单胞菌外毒素融合蛋白[scfv(frp5)-eta]及电离辐射抑制过表达HER-2的卵巢癌细胞生长的协同作用”Schmidtet aI.，“抗p185HER-2假单胞菌外毒素融合蛋白[scFv(FRP5)-ETA]及电离辐射抑制过表达HER-2的卵巢癌细胞生长的协同作用”Gynecol Oncol 80：145-155；Pastan，2003，“含有假单胞菌外毒素A的免疫毒素：简介”Cancer Immunol Immunother 52：338-341；Li等.，1996，“与腺嘌呤二核苷酸类似物复合的假单胞菌外毒素A的催化区晶体结构：涉及催化过程及ADP核糖基化”Proc Natl Acad Sci USA.9：6902-6906；Kreitman andPastan，2003，“毛样细胞白血病的免疫生物学治疗”Best Pract Res Clin Haematol.16：117-33。
在其它非限制性实施方案中，毒素包括破坏DNA的药剂。因此，毒素可以包括但不限于依乃定(enediynes)(例如刺孢霉素和斯佩拉霉素(esperamicin)及非依乃定(enediynes)小分子药剂(如争光霉素、甲锭丙基乙二胺四乙酸)。其它与本发明一致的有用毒素包括但不限于柔红霉素，阿霉素，偏端霉素，顺铂，丝裂霉素C，特纳斯丁(ecteinascidins)，朵卡霉素(duocarmycin)/环胞苷-1065及争光霉素/派来霉素。
在其它非限制性实施方案中，毒素包括破坏微管蛋白的药剂，此毒素包括但不限于根霉素/美坦生，紫杉醇，长春新碱及长春碱，秋水仙素，多拉司他汀auristatin10MMAE，及佩洛如赛(peloruside)A。
在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫毒素的毒素部分可由烷化剂组成，包括但不限于：亮氨酸溶肉瘤素NSC 167780，AZQ NSC 182986，BCND NSC 409962，二甲磺酸丁酯NSC 750，羟邻苯二酸铂(carboxyphthalatoplatinum)NSC 271674，碳铂NSC 241240，罗氮芥NSC 79037，CHIP NSC 256927，苯丁酸氮芥NSC 3088，氯乙链脲菌素NSC 178248，顺铂NSC 119875，氯乙矾NSC 338947，氰基吗琳代多如摆素(cyanomorpholinodoxorubicin)NSC 357704，环迪松(cyclodisone)NSC 348948，二脱水半乳糖醇NSC 132313，氟多潘NSC 73754，赫普磺胺(hepsulfam)NSC 329680，羟胺硫蒽酮NSC 142982，苯丙氨酸氮芥NSC 8806，赛氮芥NSC 95441，丝裂霉素C NSC26980，米托唑胺NSC 353451，氮芥NSC 762，PCND NSC 95466，哌嗪NSC 344007，哌嗪二酮NSC 135758，，哌双溴丙酰NSC 25154，泊非霉素NSC 56410，派洛丹托(spirohydantoin)芥NSC 172112，替罗昔隆NSC 296934，四铂NSC 363812，硫替派NSC 6396，三亚胺嗪NSC 9706，尿嘧啶氮芥NSC 34462，and吉雄864NSC 102627。
在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫毒素的毒素部分可由抗有丝分裂剂组成，包括但不限于阿洛克信素(allocolchicine)NSC 406042，软海绵素B NSC 609395，秋水仙素NSC 757，秋水仙素衍生物NSC 33410，多拉司他汀10NSC 376128(NG-auristatin衍生)，美坦生NSC 153858，根霉素NSC 332598，紫杉酚NSC 125973，紫杉酚衍生物NSC 608832，硫代秋水仙碱NSC 361792，三苯甲基半胱氨酸NSC 83265，长春碱NSC 49842，及硫酸长春新碱NSC 67574.
在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫毒素的毒素部分可由拓扑异构酶I抑制剂组成，包括但不限于喜树碱NSC 94600，喜树碱钠盐NSC100880，氨基喜树碱NSC603071，喜树碱衍生物NSC 95382，喜树碱衍生物NSC 107124，喜树碱衍生物NSC643833，喜树碱衍生物NSC 629971，喜树碱衍生物NSC 295500，喜树碱衍生物NSC249910，喜树碱衍生物NSC 606985，喜树碱衍生物NSC 374028，喜树碱衍生物NSC176323，喜树碱衍生物NSC 295501，喜树碱衍生物NSC 606172，喜树碱衍生物NSC606173，喜树碱衍生物NSC 610458，喜树碱衍生物NSC 618939，喜树碱衍生物NSC610457，喜树碱衍生物NSC 610459，喜树碱衍生物NSC 606499，喜树碱衍生物NSC610456，喜树碱衍生物NSC 364830，喜树碱衍生物NSC 606497，及吗啉代阿霉素NSC354646。
在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫毒素的毒素部分可由拓扑异构酶II抑制剂组成，包括但不限于阿霉素NSC 123127，氨萘非特NSC 308847，胺苯吖啶NSC249992，蒽吡唑衍生物NSC 355644，吡唑啉吖啶NSC 366140，比山群HCL NSC337766，柔红霉素NSC 82151，脱氧多可鲁拜素(deoxydoxorubicin)NSC 267469，盐酸米托蒽醌NSC 301739，美诺立尔NSC 269148，N，N-二苯基柔红霉素NSC 268242，氧化蒽酚NSC 349174，拜得佐(mbidazone)NSC 164011，表足叶草毒噻吩甲基甙NSC 122819，及鬼臼乙叉苷NSC 141540。
在其它非限制性实施方案中，本发明的免疫毒素的毒素部分可由RNA或DNA代谢拮抗物组成，包括但不限于亚硝基羟基丙氨酸NSC 153353，5-氮(杂)胞苷NSC102816，5-氟尿嘧啶NSC 19893，阿西维辛NSC 163501，氨基蝶呤衍生物NSC 132483，氨基蝶呤衍生物NSC 184692，氨基蝶呤衍生物NSC 134033，an antifol NSC 633713，叶酸拮抗剂NSC 623017，Baker′s叶酸拮抗剂NSC 139105，二氯醛安替比林NSC 126771，布奎那NSC 368390，呋喃氟尿嘧啶(前体药物)NSC 148958，5，6-二氢-5-氮(杂)胞苷NSC 264880，methotrexate NSC 740，氨甲喋呤衍生物NSC 174121，N-磷酸乙酰-L-天冬氨酸，磷乙天冬氨酸(PALA)NSC 224131，吡唑呋喃菌素NSC 143095，曲美沙特NSC352122，3-HP NSC 95678，2′-脱氧-5-氟尿苷NSC 27640，5-HP NSC 107392，α-TGDR硫代鸟嘌呤脱氧核甙NSC 71851，阿非迪霉素甘氨酸盐NSC 303812，阿糖胞苷NSC 63878，5-乙酰唑胺-2′-脱氧胞苷酸NSC 127716，β-硫代鸟嘌呤脱氧核甙NSC 1071261，环胞苷NSC 145668，三氨三唑NSC 1895，羟基脲NSC 32065，次黄嘌呤核苷糖二醛(glycodialdehyde)NSC 118994，麦克菌素II NSC 330500，焦佐洛米佐(pyrazoloimidazole)NSC 51143，硫鸟嘌呤NSC 752，及巯基嘌呤NSC 755。
此外，细胞毒素可以被改变以减少或抑制免疫毒素结构以外的结合。或减少毒素的种型。例如，细胞毒素可以被改变调整等电位点至大约7.0，从而减少肝毒性。
使用本发明的免疫毒素治疗癌症的临床结果容易由相关领域技术人员确认，如医师。例如，检测癌症临床标记物的标准医学检查是治疗有效性强有力的指示。此类检查包括，但不限于体格检查，行为尺度，疾病标志，12导心电图(ECG)，肿瘤测量，活组织检查，细胞检查，细胞学检查，肿瘤最长直径计算，X光线照相术，肿瘤数字图像，生命体征，体重，不良事件记录，感染事件的评估，伴随给药的评估，疼痛评估，血液或血清化学，尿分析，CT扫描及药物代谢动力学分析。此外，包括免疫毒素及其它癌症治疗剂的联合治疗的协同作用可以通过进行单一治疗的病人对照试验来确定。
特别在头颈鳞状上皮细胞癌的病例中，呼吸、吞咽、语言及某些生活质量的改善易于确定。另外头颈鳞状上皮细胞癌的减轻可以通过本领域技术人员接受的标准来评估。参见如Therasse等，2000，“实体肿瘤治疗反应评估新指南，欧洲癌症研究与治疗组织(European Organization for Research and Treatment of Cancer)，美国国立癌症研究所(National Cancer Institute of the United States)，加拿大国立癌症研究所(NationalCancer Institute of Canada)”J Natl Cancer Inst.Feb 2；92(3)：205-16。
在治疗周期免疫毒素有效给药剂量根据给药方式而变化。与全身静脉内免疫毒素给药相比，直接给药(例如，瘤内注射)需要较小的全身剂量。为本领域技术人员显而易见的是局部给药致较低的全身剂量，在这些情况下，预期将会达到免疫毒素循环血浆水平较低。
此外，具体免疫毒素治疗剂的有效剂量依赖于其它因素，包括癌症类型，头颈鳞状上皮细胞癌肿瘤大小、癌症发展阶段、免疫毒素对病人的毒性、靶向癌细胞的特异性及病人的年龄、体重及健康状况。
在一个实施方案中，免疫毒素直接给药的有效剂量范围大约为10-3000ug/肿瘤/日，20-900ug/肿瘤/日，30-800ug/肿瘤/日，40-700ug/肿瘤/日，50-600ug/肿瘤/日，60-500ug/肿瘤/日，70-400ug/肿瘤/日，80-300ug/肿瘤/日，90-200ug/肿瘤/日，或100-150ug/肿瘤/日。在另一实施方案中，剂量范围大约为10-20ug/肿瘤/日，21-40ug/肿瘤/日，41-80ug/肿瘤/日，81-100ug/肿瘤/日，101-130ug/肿瘤/日，131-150ug/肿瘤/日，151-200ug/肿瘤/日，201-280ug/肿瘤/日，281-350ug/肿瘤/日，351-500ug/肿瘤/日，501-1000ug/肿瘤/日，1001-2000ug/肿瘤/日，或2001-3000ug/肿瘤/日。在具体实施方案中，剂量至少大约为20ug/肿瘤/日，40ug/肿瘤/日，80ug/肿瘤/日，130ug/肿瘤/日，200ug/肿瘤/日，280ug/肿瘤/日，400ug/肿瘤/日，500ug/肿瘤/日，750ug/肿瘤/日，1000ug/肿瘤/日，2000ug/肿瘤/日或3000ug/肿瘤/日。
在其它实施方案中，免疫毒素的有效剂量范围为100-5000ug/肿瘤/月，200-4000ug/肿瘤/月，300-3000ug/肿瘤/月，400-2000ug/肿瘤/月，500-1000ug/肿瘤/月，600-900ug/肿瘤/月，或700-1500ug/肿瘤/月。在其它实施方案中，免疫毒素的有效剂量范围大约为100-199ug/肿瘤/月，200-399ug/肿瘤/月，400-649ug/肿瘤/月，650-999ug/肿瘤/月，1000-1799ug/肿瘤/月，1800-2499ug/肿瘤/月，2500-3499ug/肿瘤/月，3500-4999ug/肿瘤/月，5000-7499ug/肿瘤/月，7500-10000ug/肿瘤/月，或10001-20000ug/肿瘤/月。在具体实施方案中，剂量至少大约为100ug/肿瘤/月，200ug/肿瘤/月，400ug/肿瘤/月，650ug/肿瘤/月，1000ug/肿瘤/月，1400ug/肿瘤/月，2000ug/肿瘤/月，2500ug/肿瘤/月，3000ug/肿瘤/月，3500ug/肿瘤/月，4000ug/肿瘤/月，4500ug/肿瘤/月，5000ug/肿瘤/月，7500ug/肿瘤/月，10000ug/肿瘤/月，或20000ug/肿瘤/月。
在另一实施方案中，免疫毒素的有效剂量导致瘤内免疫毒素浓度至少大约为5ug/cm3，10ug/cm3，20ug/cm3，30ug/cm3，40ug/cm3，50ug/cm3，60ug/cm3，75ug/cm3，100ug/cm3，125ug/cm3，150ug/cm3，100ug/cm3，200ug/cm3，300ug/cm3，400ug/cm3，或500ug/cm3。在其它实施方案中，导致的瘤内免疫毒素浓度大约为5-500ug/cm3，10-400ug/cm3，15-300ug/cm3，20-200ug/cm3，25-100ug/cm3，30-90ug/cm3，35-80ug/cm3，40-70ug/cm3，45-60ug/cm3，或50-55ug/cm3。在其它实施方案中，导致的瘤内免疫毒素浓度大约为10-15ug/cm3，16-20ug/cm3，21-25ug/cm3，26-30ug/cm3，31-35ug/cm3，36-40ug/cm3，41-45ug/cm3，46-50ug/cm3，51-55ug/cm3，56-60ug/cm3，61-65ug/cm3，66-70ug/cm3，71-75ug/cm3，76-80ug/cm3，81-85ug/cm3，86-90ug/cm3，91-95ug/cm3，96-100ug/cm3，或100-200ug/cm3。
在其它实施方案中，有效剂量的免疫毒素导致的血浆浓度低于大约0.1ug/升，1ug/升，2.5ug/升，5ug/升，7.5ug/升，10ug/升，15ug/升，20ug/升，30ug/升，40ug/升，或50ug/升。在其它实施方案中，导致的免疫毒素循环浓度大约0.1-50ug/升，1-40ug/升，2.5-30ug/升，5-20ug/升，或7.5-10ug/升。在其它实施方案中，导致的免疫毒素循环浓度大约0.1-1ug/cm3，1.1-2.4ug/cm3，2.5-5ug/cm3，5.1-7.4ug/cm3，7.5-10ug/cm3，11-15ug/cm3，16-20ug/cm3，21-30ug/cm3，31-40ug/cm3，或41-50ug/cm3。
在具体的非限制性实施方案中，免疫毒素的有效剂量在大约100ug/肿瘤/月至3000ug/肿瘤/月之间，例如，大约100ug/肿瘤/月，200ug/肿瘤/月，300ug/肿瘤/月，400ug/肿瘤/月，750ug/肿瘤/月，或1000ug/肿瘤/月，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量大约每月给药连续大约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月，或6个月。此周期之后，继后的周期开始于大约1个月、2个月、4个月、6个月，或12个月后。治疗方案包括1个周期、2个周期、4个周期、5个周期，或6个周期，周期之间间隔大约1个月、2个月、4个月、6个月，或12个月。
在具体的非限制性实施方案中，免疫毒素的有效剂量大约在20-1240ug/肿瘤/日之间，例如，大约20ug/肿瘤/日，40ug/肿瘤/日，80ug/肿瘤/日，130ug/肿瘤/日，200ug/肿瘤/日，或280ug/肿瘤/日，或大约100g/肿瘤/日，200ug/肿瘤/日，330ug/肿瘤/日，500ug/肿瘤/日，700ug/肿瘤/日，930ug/肿瘤/日，1240ug/肿瘤/日，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量大约每日给药(可以随意跳过一日或多日)，连续大约1日、2日、3日、4日、5日、6日，或7日。此周期后，继后的周期开始于大约1周、2周、3周、4周、5周，或6周后。治疗方案包括1个周期、2个周期、3个周期、4个周期、5个周期，或6个周期，周期之间间隔大约1周、2周、3周、4周、5周，或6周。
优选的注射量至少是适于肿瘤类型和/或位置的有效量。单次剂量最大注射量在肿瘤体积的大约25％至75％之间，例如大约是估计的靶肿瘤体积的四分之一、三分之一或四分之三。在具体的非限制性实施方案中，单次剂量最大注射量大约是肿瘤体积的30％。
在其它实施方案中，免疫毒素瘤内给药每周期的总剂量等于或低于安全试验中建立的最大耐受剂量，但药量根据肿瘤体积给予标准化。例如，受试者接受1ug/cm3及500ug/cm3肿瘤或剂量足够达到大约14皮摩尔/cm3肿瘤组织和7纳摩尔/cm3肿瘤组织。给药容量不超过大约肿瘤体积的20-50％。免疫毒素以适当的盐溶液稀释。例如，对于估计体积是3cm3的肿瘤，14皮摩尔(1ug/cm3)的靶剂量及大约1/3肿瘤体积的最大注射相对容量，3ug的免疫毒素以1ml稀释剂稀释。
在其它具体的非限制性实施方案中，免疫毒素的有效剂量大约为20-300ug/肿瘤/日，例如，大约20ug/肿瘤/日、40ug/肿瘤/日、80ug/肿瘤/日、130ug/肿瘤/日、200ug/肿瘤/日，或280ug/肿瘤/日，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量最大注射量在肿瘤体积的大约25％和75％之间，例如大约是估计的靶肿瘤体积的四分之一、三分之一或四分之三。单次剂量每隔一日给药大约连续5日、7日、9日、11日、13日、15日、17日、19日、21日、23日、25日、27日、29日，或31日。此周期之后，继后的周期开始于大约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周，或12周之后。治疗方案包括1个周期、2个周期、3个周期、4个周期、5个周期，或6个周期。每周期间隔大约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周，或12周。
在一个具体的非限制性实施方案中，VB4-845以大约280ug/肿瘤/日的剂量给予，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量最大注射量是估计的靶肿瘤体积的大约三分之一，单次剂量每日给一次大约连续5日。此周期之后，继后的周期开始于大约一个月之后，优选地从第一个周期的第一天的一个月。治疗方案包括三个周期，每周期间隔大约一个免治疗周。
在另一个具体的非限制性实施方案中，VB4-845以大约280ug/肿瘤/日的剂量给予，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量最大注射量大约为估计的靶肿瘤体积的三分之一，单次剂量隔日给药一次、大约连续一周。此周期之后，继后的周期开始于大约一周之后。治疗方案包括三个周期，每周期间隔大约一周。
在又一个具体实施方案中，VB4-845以大约280ug/肿瘤/日的剂量给予，其中每日给予病人单次剂量。单次剂量最大注射量是大约为估计的靶肿瘤体积的三分之一，单次剂量隔日给一次大约连续三周。此周期之后，继后的周期开始于大约一周之后，治疗方案包括三个周期，每周期间隔大约一周。
对于腔内给药，如膀胱，免疫毒素的有效剂量大约为100-2000ug/周(50ml)，(相当于大约29纳摩尔-580纳摩尔之间的浓度)，例如，大约100ug/周(50ml)、200ug/周(50ml)、335g/周(50ml)、500ug/周(50ml)、700ug/周(50ml)、930ug/周(50ml)、1240ug/周(50ml)，其中每周给予病人单次剂量，肿瘤组织暴露于免疫毒素至少大约30分钟。例如，溶液在腔内保留大约30分钟至3小时。在一个具体的非限制性实施方案中，肿瘤组织暴露于免疫毒素大约1小时或优选地大约2小时。此周期之后，继后的周期开始于大约前一次给药之后的1周、2周、4周、6周，或12周。治疗方案包括1个周期、2个周期、3个周期、4个周期、5个周期，或6个周期。每周期间隔大约1个月、2个月、4个月、6个月，或12个月。
对于较小或较大的空腔例如包囊或膀胱，其基本上比一般较小或较大，可以调节容量以确保组织可以足够暴露而不过度扩展而空腔。当容量需要调节时，免疫毒素的有效剂量大约为20纳摩尔-600纳摩尔毒素，浓度为每分子一个结合位点。
免疫毒素的剂量还可以癌细胞蛋白结合位点的摩尔浓度表示。例如，免疫毒素VB4-845分子量大约为69.7kDa，具有一个Ep-CAM结合位点。已知其它免疫毒素形式如二价形式，Fab、Fab′或(Fab′)2片段因多肽链中氨基酸数目不同而具有不同的分子量。另外，已知对于相似的形式，可以通过添加附加基团如半糖或聚乙二醇改变分子量。不同毒素或毒素变体的使用可以产生与实施方案中使用的VB4-845不同分子量的免疫毒素。另外，也可以通过多肽链的变化产生较长或较短片段，而不丧失免疫毒素结合癌细胞选择性蛋白的特性。本申请中考虑到了所有这些变化情况。因此，依照癌细胞上的蛋白结合位点摩尔数表示免疫毒素的剂量是有帮助的。在多个实施例及各种实施方案中，剂量以ug表示并以VB4-845分子量为基础。下列公式提供了将结合位点的微克数转换成摩尔当量的简单方法：
(1×10-6g/每摩尔免疫毒素的克数)×每免疫毒素分子的结合位点数目＝
从已知免疫毒素的微克(1×10-6g/)到结合位点摩尔数的转换率
对于每分子仅一个结合位点的免疫毒素VB4-845，按下列方法转换：
微克数×14.3×10-12摩尔/微克＝摩尔数
例如，在给定的一日内，于瘤内注射3000ug：
3000ug×14.3×10-12摩尔/微克＝＝42.9×10-9摩尔结合位点(或42.9纳摩尔或42,900皮摩尔)，当剂量以稀释液中浓度或肿瘤组织体积表示，可以将免疫毒素的质量转换为摩尔，然后通过稀释液容量分配摩尔数，结果以摩尔浓度表示或肿瘤组织体积分配摩尔数，结果以每cm3组织(或其它体积单位)的摩尔数表示)。
例如，于50ml容积的膀胱内给予1240ug：1240ug×14.3×10-12摩尔/微克＝大约18×10-12摩尔结合位点和18×10-12摩尔/50ml(或0.05升)＝大约355×10-9摩尔(或355纳摩尔)。
治疗周期中与免疫毒素一起给药的其它癌症治疗剂有效剂量也根据给药方式不同而变化。一种或多种癌症治疗剂可以通过瘤内或通过其它给药方式给药。典型的化学治疗药物采用全身给药，标准剂量及用药方法为本领域已知(参见如最新版《默克索引》及《医师案头参考》。)
例如，在一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氮烯唑胺，剂量范围大约为200-4000mg/m2/周期。在优选的实施方案中，剂量范围是700-1000mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氟达拉滨，剂量范围大约为25-50mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括阿糖胞苷(Ara-C)，剂量范围大约为200-2000mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括紫杉萜，剂量范围大约为1.5-7.5mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括紫杉醇，剂量范围大约为5-15mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括顺铂，剂量范围大约为5-20mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括5-氟尿嘧啶，剂量范围大约为5-20mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括阿霉素，剂量范围大约为2-8mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括鬼臼乙叉甙，剂量范围大约为40-160mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括环磷酰胺，剂量范围大约为50-200mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括依立替康，剂量范围大约为50-75mg/m2/周期，75-100mg/m2/周期，100-125mg/m2/周期或125-150mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括长春碱，剂量范围大约为3.7-5.4mg/m2/周期，5.5-7.4mg/m2/周期，7.5-11mg/m2/周期，或11-18.5mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括长春新碱，剂量范围大约为0.7-1.4mg/m2/周期，或1.5-2mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氨甲喋呤，剂量范围大约为3.3-5mg/m2/周期，5-10mg/m2/周期，10-100mg/m2/周期，或100-1000mg/m2/周期。
结合免疫毒素的联合治疗可以使癌症或肿瘤对其它癌症治疗剂的给予敏感。因此，本发明涉及了联合治疗以预防、治疗和/或预防癌症复发，包括在减量的其它癌症治疗剂之前、之后或同时给予有效药量的免疫毒素。例如，起始以免疫毒素治疗可以增加癌症或肿瘤对继后一次给药的其它癌症治疗剂攻击的敏感性。此剂量接近或低于当其它癌症治疗剂单独给药或不给予免疫毒素情况下的标准剂量低范围。当同时给药时，免疫毒素可与其它癌症治疗药分别给予，以及可选择的通过不同的给药方式给予。
因此，在一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括顺铂，如PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)，剂量范围大约为5-10mg/m2/周期，11-20mg/m2/周期，21-40mg/m2/周期，或41-75mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括顺羧酸铂，如PARAPLATIN(BristolMyers)，剂量范围大约为2-3mg/m2/周期，4-8mg/m2/周期，9-16mg/m2/周期，17-35mg/m2/周期，或36-75mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括环磷酰胺，如CYTOXAN(Brisol MyersSquibb)，剂量范围大约为0.25-0.5mg/kg/周期，0.6-0.9mg/kg/周期，1-2mg/kg/周期，3-5mg/kg/周期，6-10mg/kg/周期，11-20mg/kg/周期，或21-40mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括阿糖胞苷，如CYTOSAR-U(Pharmacia&Upjohn)，剂量范围大约为0.5-1mg/m2/周期，2-4mg/m2/周期，5-10mg/m2/周期，11-25mg/m2/周期，26-50mg/m2/周期，或51-100mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括阿糖胞苷脂质体，如DEPOCYT(ChironCorp)，剂量范围大约为5-50mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氮烯唑胺，如DTIC或DTICDOME(Bayer Corp.)，剂量范围大约为15-250mg/m2/周期或从大约0.2-2mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括托泊替康，如HYCAMTIN(SmithKlineBeecham)，剂量范围大约为0.1-0.2mg/m2/周期，0.3-0.4mg/m2/周期，0.5-0.8mg/m2/周期，或0.9-1.5mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括依立替康，如CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn)，剂量范围大约为5-9mg/m2/周期，10-25mg/m2/周期，或26-50mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氟达拉滨，如FLUDARA(BerlexLaboratories)，剂量范围大约为2.5-5mg/m2/周期，6-10mg/m2/周期，11-15mg/m2/周期，16-25mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)，剂量范围大约为200-2000mg/m2/周期，300-1000mg/m2/周期，400-800mg/m2/周期，或500-700mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括紫杉萜，如TAXOTERE(Rhone PoulencRorer)，剂量范围大约为6-10mg/m2/周期，11-30mg/m2/周期，或31-60mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括紫杉醇，如TAXOL(Bristol MyersSquibb)，剂量范围大约为10-20mg/kg/周期，21-40mg/kg/周期，41-70mg/kg/周期，或71-135mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括5-氟尿嘧啶，剂量范围大约为0.5-5mg/kg/周期，1-4mg/kg/周期，或2-3mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括阿霉素，如ADRIAMYCIN(Pharmacia&Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(Bristol Myers Squibb)，剂量范围大约为2-4mg/kg/周期，5-8mg/kg/周期，9-15mg/kg/周期，16-30mg/kg/周期，或31-60mg/kg/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括鬼臼乙叉苷，如VEPESID(Pharmacia&Upjohn)，剂量范围大约为3.5-7mg/m2/周期，8-15mg/m2/周期，16-25mg/m2/周期，或26-50mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括长春碱，如VELBAN(Eli Lilly)，剂量范围大约为0.3-0.5mg/m2/周期，0.6-0.9mg/m2/周期，1-2mg/m2/周期，或3-3.6mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括长春新碱，如ONCOVIN(Eli Lilly)，剂量范围大约为0.1mg/m2/周期，0.2mg/m2/周期，0.3mg/m2/周期，0.4mg/m2/周期，0.5mg/m2/周期，0.6mg/m2/周期或0.7mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，其它癌症治疗剂包括氨甲喋呤，剂量范围大约为0.2-0.9mg/m2/周期，1-5mg/m2/周期，6-10mg/m2/周期，或11-20mg/m2/周期。
在另一个实施方案中，免疫毒素联合至少一种其它免疫治疗剂(包括，但不限于B细胞单克隆抗体、利妥昔单抗、吉姆单抗、及佐突如迈(trastuzutmab)。
在另一个实施方案中，免疫毒素与一种或多种抗血管生成制剂联合使用。所述抗血管生成制剂包括，但不限于血管他丁，反应停，kringle 5，内皮他丁，丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗凝血酶，纤维结合素29kDa氨基末端及40kDa羧基末端蛋白水解片段，催乳激素的16kDa蛋白水解片段，血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段，与血小板因子-4的片段相应的13氨基酸肽(Maione等，1990，Cancer Res.51：2077-2083)，与胶原I片段相应的14氨基酸肽(Tolma等，1993，J.Cell BioI.122：497-511)，与血小板反应素I片段相应的19氨基酸肽(Tolsma等，1993，J.Cell BioI.122：497-511)，与富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白片段(SPARC)相应的20氨基酸肽(Sage等，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，及其变体，包括药学上接受的盐。
在另一个实施方案中，免疫毒素与放射治疗方法联合使用。所述治疗方法还包括手术和/或化学疗法。例如，免疫毒素可以联合放射治疗方法及顺铂(Platinol)、5-氟尿嘧啶(5-FU，Admcil)、卡铂(Paraplatin)，和/或紫杉醇(Taxol)。免疫毒素治疗允许使用低剂量的放射线和/或低频率的放射治疗其可以例如降低重症咽喉痛的发生率，重症咽喉痛可以潜在妨碍吞咽功能导致体重降低或脱水。
在另一个实施方案中，免疫毒素与一种或多种细胞因子联合使用。所述细胞因子包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴细胞毒素、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白、粒性白细胞单核细胞集落刺激因子、白细胞介素(包括但不限于白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18)，及其变体，包括药学上接受的盐。
在另一个实施方案中，免疫毒素与癌症疫苗联合使用，所述癌症疫苗包括但不限于自体的细胞或组织、非自体的细胞或组织、癌胚抗原、α-甲胎蛋白(AFP)、人体绒毛膜促性腺激素、卡介苗活菌苗、黑色素细胞系蛋白质及突变的肿瘤特异性抗原。
在另一个实施方案中，免疫毒素联合激素疗法使用。所述激素治疗剂包括但不限于激素激动剂、激素拮抗剂(如氟他米特、三苯氧胺、醋酸亮丙瑞林(LUPRON))，及类固醇(如地塞米松、维甲酸类、倍他米松、氢化考的松、可的松、强的松、去氢睾丸酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾丸酮、黄体酮)。
在另一个实施方案中，免疫毒素联合基因疗法来治疗或预防癌症。
在另一个实施方案中，Ep-CAM靶向的免疫毒素联合一种或多种增加EpCAM在肿瘤细胞表达的治疗剂使用。优选地Ep-CAM表达增加从而肿瘤细胞表面的Ep-CAM分子数量增加。例如，此治疗剂可以抑制Ep-CAM抗原细胞内吞作用的正常周期。此联合治疗可以改善Ep-CAM靶向免疫毒素单独给药或与其它癌症治疗剂或放射疗法同时应用的临床疗效。在具体的非限制性实施方案中，增加Ep-CAM在肿瘤细胞表达的治疗剂为长春瑞滨酒石酸(诺维本)和/或紫杉酚(Taxol)。参见如Thurmond等，2003，“体外暴露于诺维本或Taxol的腺癌细胞通过新的机制增加Ep-CAM表达”，Cancer ImmunolImmunother.Ju1；52(7)：429-37。
因此，联合治疗可以增加癌症或肿瘤对免疫毒素和/或其它癌症治疗剂的敏感性。以这种方式可以缩短治疗周期，从而减少毒性事件的发生。因此，本发明提供一种治疗或预防癌症的方法，包括给予病人有效药量的免疫毒素及至少一种其它癌症治疗剂，维持短期治疗周期。所述周期持续时间大约为1-30日，2-27日，3-15日，4-12日，5-9日，或6-8日。周期持续时间可根据所使用的具体癌症治疗剂而不同。本发明还涉及了连续或间断给药方法，或每日剂量分配成几份给药。具体癌症治疗剂的恰当周期持续时间可由本领域技术人员确定，本发明还涉及了每一癌症治疗剂的最佳治疗方案连续评估。本领域技术人员的具体准则为本领域已知，参见，如Therasse等，2000，“评价实体肿瘤治疗反应的新准则”，欧洲癌症研究与治疗组织，美国国立癌症研究所，加拿大国立癌症研究所”，J Natl Cancer Inst.Feb 2；92(3)：205-16。
可选择的，一般倾向于选择较长的治疗周期。因此，周期持续时间大约为10-56日、12-48日、14-28日、16-24日，或18-20日，周期持续时间根据使用的具体癌症治疗剂而不同。
本发明涉及了至少一个周期，优选地多于一个周期，期间使用单一或系列癌症治疗剂。具体癌症治疗剂的恰当周期数及周期之间的间隔时间可由本领域技术人员确定，周期数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，或21个周期。周期之间的间隔时间可以为1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日，或21日。本发明涉及了每一免疫毒素与其它癌症治疗剂最佳治疗方案的连续评估。
在本发明的非限制性实施方案中，免疫毒素以高剂量(如，高于约100ug/cm3、200ug/cm3、300ug/cm3、400ug/cm3、500ug/cm3，或1000ug/cm3的剂量)短期直接给药。因此，在非限制性具体实施方案中，免疫毒素瘤内给药剂量(一周一次，共两周)导致瘤内免疫毒素的浓度至少大约为200ug/cm3、300ug/cm3、400ug/cm3，或500ug/cm3。
根据本发明，免疫毒素可以被包含在药用组分或药剂中，适于直接用药的药用组分包括但不限于低压冻干粉或水溶性或非水溶性无菌注射溶液或混悬液，这些药用组分可以进一步含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂及溶质，使其基本上与预期受者血液等渗。这些组分中的其它成分包括例如水、乙醇、多元醇、甘油及植物油等。临时的注射溶液及混悬液可以由无菌粉剂、粒料及片剂制备。免疫毒素的提供方式可以是但不限于低压冻干粉，在给予病人之前可以使用无菌水或盐水重新溶解配成原来的浓度。
本发明的药用组分可以包括药学上接受的载体。药学上接受的合适载体基本上包括化学上无活性及无毒性的组分，不会干扰药物成分的生物活性作用。合适药物载体包括但不限于水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-氧化三甲铵(DOTMA)，二油酰基磷酸脂酰乙醇胺(DOPE)，及脂质体。这些混合物含有有效治疗量的化合物及合适数量的载体以为病人提供直接给药形式。
在另一个实施方案中，药用组分包括于任意药学上接受的载体中的免疫毒素及一种或多种其它癌症治疗剂。
药用组分可以是药学上接受的盐形式，包括但不限于与自由氨基团形成的例如那些盐酸、磷、乙酸、草酸、酒石酸等盐形式，及与自由羧基团形成的，例如那些钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等盐形式。
在本发明不同的实施方案中，药用组分直接给予肿瘤区，通过注射，例如，通过手术中局部灌注，局部应用(例如，结合手术后伤口敷料)，导管方法，栓剂方法或植入法。植入物可以是多孔的、非多孔的、或凝胶状物质、包括薄膜，如sialastic膜或纤维素膜。按重量，栓剂一般含有有效成分为0.5％-10％。
在其它实施方案中，控释系统可以置于靶肿瘤邻近处。例如，微泵可以直接将控释剂送至肿瘤区域，从而精确调节给药时间和药物组分的浓度(见，如Goodson，1984，控制释放的医学应用，vol.2，pp.115-138)。
本发明还提供一种试剂盒，其内含有有效药量免疫毒素，随意地与其它一种或多种癌症治疗剂联合，并带有治疗头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的使用说明书。
依据本发明一个方面，免疫毒素和/或其它癌症治疗剂通过直接给药方式给予病人。因此，免疫毒素和/或其它癌症治疗剂的给药途径可以通过，但不限于一次或多次直接注入肿瘤，连续或间断灌入肿瘤，采用免疫毒素存储装置，使用缓释装置，将缓释剂导入肿瘤，和/或直接敷于肿瘤上。本发明也涉及了通过“进入肿瘤”用药模式，将免疫毒素和/或其它癌症治疗剂导入肿瘤区或基本上直接引流至肿瘤区的血管或淋巴管。在每一情况下，药用组分以至少足够达到终点的量给予，如需要，包括药学上接受的载体。
本发明涉及了免疫毒素通过瘤内给药，而任何其它癌症治疗剂可以通过其它给药方式(例如，静脉给药)给予病人。此外，预期给予病人多种癌症治疗剂时，免疫毒素和一种或多种其它癌症治疗剂可以通过瘤内给予，而其它癌症治疗剂可以通过其它给药方式(如静脉和口服)给予。
在具体的非限制性实施方案中，免疫毒素和一种或多种其它癌症治疗剂可以通过瘤内注射给药，例如，按照图1显示的模板(参见Khuri等，2000，“选择性复制腺病毒ONYX-015与顺铂及5-氟尿嘧啶联合治疗头颈癌复发病人的瘤内用药对照试验，”NatureMed.6：879-885)。免疫毒素和一种或多种其它癌症治疗剂可以悬于缓冲水溶液中，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，含有免疫毒素的悬液容量可以低于靶瘤块估计体积的5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％，或95％。在具体的实施方案中，含有免疫毒素的悬液容量低于靶肿瘤估计体积的30％、40％或50％。
免疫毒素其它癌症治疗剂的每一次给药，皮肤或口腔粘膜至少被穿刺一次，位置在估计的肿瘤中心至肿瘤边缘之间距离大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的部位。免疫毒素直接注射给药，可以导致一个或多个从肿瘤块中心呈放射状的针迹。在具体的非限制性实施方案中，针迹基本可以按照图1描述进行定向。
对于膀胱癌，免疫毒素可以如实施例15描述通过导尿管导入。
在本发明的的非限制性实施方案中，医学影像技术用于指导将免疫毒素直接导入肿瘤。这对某些头颈部肿瘤及其它类型难以处理的肿瘤尤其有用。在这些情况下，对于给药工具(注射针、导尿管、缓释装置等)的影像指导用于防止破坏或给药至重要解剖结构，如血管、神经束等，以确保免疫毒素在三维肿瘤内充分分布。医学影像导向技术为医学技术人员熟知，包括超声、CT扫描、X射线及PET扫描导向。
通过下列的实施例说明可以更好地理解本发明，下列实施例不意图限制本发明。
实施例
实施例1.VB4-845免疫毒素
VB4-845是由单链Fv重组人抗体片段与截断型假单胞菌外毒素A(ETA252-608)融合所构成的免疫毒素，抗体片段衍生于可特异结合Ep-CAM的人源化MOC31单链抗体片段4D5MOCB。16-18
外毒素A是由绿脓假单胞菌致病菌株释放的的一种毒素蛋白19。以分子量为66,000道尔顿的酶原形式分泌20。外毒素A被转入易感的哺乳动物细胞，分子的共价变化可以使其具有酶活性。假单胞菌外毒素A可以通过对延长因子-2(称为白喉酰胺)翻译后修饰的组氨酸残基的二磷酸腺苷核糖基化作用而不可逆阻断细胞内蛋白合成，从而导致细胞调亡4。此构成物中使用的ETA截断倒位，尽管仍含有诱导细胞死亡的结构域，但缺少细胞结合结构域，从而阻止ETA部分进入不受免疫毒素抗体部分靶向作用的细胞。
编码截断型ETA(ETA252-608)的基因序列及结合Ep-CAM的4D5MOCB scFv序列用于构建VB4-845。分子含有氨基末端及羧基末端His5尾巴以利于纯化，如图2描述。VB4-845的DNA及氨基酸序列在图3A-D及SEQ ID NOS：1和2中描述。
Ep-CAM结合部分示于SEQ ID NO：3。CDR序列示于SEQ ID NOS：4-9。
结果蛋白保留亲本4D5MOCB对EpCAM的特异性。蛋白表达载体质粒pING3302(来自Xoma Ireland Ltd，质粒pING3302用于构建表达载体)由大肠杆菌E104宿主细胞携带表达。蛋白长度为648个氨基酸，预测分子量为69.7千道尔顿(kDa)。在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)分析中，VB4-845为大约70千道尔顿(kDa)的单个蛋白条带。蛋白等电点(pI)大约为5.9，为水溶性，溶解液澄清。关于VB4-845制备的其它详细内容在以下实施例9中提供。
VB4-845已显示可以特异抑制蛋白合成，及降低体外Ep-CAM阳性癌细胞的生存能力。如下面的实施例5中所示，VB4-845小鼠全身用药抑制来自肺、结肠、鳞状上皮细胞癌的肿瘤异种移植物的生长及诱导其退化。VB4-845显示与亲本单链片段(scFv)相似的器官分布，优选地，集中于Ep-CAM阳性肿瘤异种移植物，肿瘤：血的比率为5.4。
如实施例6中所示，小鼠肿瘤周围给药模型显示在VB4-845治疗的动物中具有显著的肿瘤生长抑制。事实上，此模型中，两只负荷较小体积(90mm3)肿瘤的小鼠，在治疗开始显示肿瘤完全退化，在试验期间保持无肿瘤(见下文)。在所有药效试验中，小鼠耐受治疗良好，无药物相关性死亡及提示毒性的临床观察结果。这些资料支持VB4-845直接给药以用于实体肿瘤的靶向治疗。
VB4-845在人体的每治疗周期剂量范围为4ug/公斤，即低于药效试验中静脉给药模型及肿瘤周围给药模型小鼠给药剂量的113倍。(见表7的脚注1)人体的月暴露可以微小剂量5日给药，整个肿瘤区可具有每周给药1次的累积效应。
实施例2.剂型及组分
VB4-845作为新生药物研究，已发现可以有效结合肿瘤细胞系，在某些模式系统中，可以防止肿瘤生长。VB4-845配制方法是：1mg/ml，20mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH7.2，可以使用22规的注射针通过瘤内途径给药。以1ml硼硅玻璃瓶包装，灰色丁基合成橡胶塞及铝封闭。目前有两种规格：0.1mL和0.2mL(分别为0.1mg及0.2mgVB4-845)，在-70℃保存。终产物不保存，仅单次使用。
制剂样品的标记、保存、及装运按照书面或批准的标准化操作规程进行，本制剂可以在冰冻条件(如干冰)下装运，可以在研究地点限制存取物品、控制在-70℃的冰箱内保存，冰箱定期给予监测温度。制剂可以在这种条件下保持至使用时间。
实施例3.VB4-845的稳
本制剂-70℃的贮存期限为至少6个月。在生理条件下，(如在37℃以PBS温育药物制剂4小时)，免疫毒素分子的大多数(至少91％)仍可作为适当分子量(大约70kDa)的单体被洗脱。在37℃，20小时后，VB4-845的量随时间缓慢减少，不少于大约47％的初始蛋白以单体形式存在。在人血清中培育以99mTc标记的VB4-845获得了相似的结果，进一步确证了免疫毒素体内使用的适应性。
已经进行了短期稳定性试验来评估在临床地点常规操作下研究制剂的内在稳定性。对标准剂型的VB4-845在室温及2-8℃下进行了评估。另外，VB4-845在带有或无800mM尿素的磷酸盐缓冲盐水注射缓冲液中配制，检测室温条件下达6个小时的稳定性。短期稳定性试验还评估了反复冻融对VB4-845的影响。
研究发现，所有短期稳定试验的VB4-845保留其生物学活性。可以从-70℃冰箱取出日剂量的VB4-845并在室温下融解。VB4-845可从-70℃贮存条件移除4-6小时内以注射缓冲液配制。一旦制剂按配方以磷酸盐缓冲液注射缓冲液配制，可在配制的6小时内注入病人体内。如果制剂在适当的时间内无法使用，从存品中取一瓶新的制剂给药。
VB4-845在原包装及室温下至少20小时稳定，如果保存在冰箱内(如，2-8℃)，则至少24小时稳定。如果制剂未曾使用过，尤其是原包装/封闭系统仍完整的情况下，可以冻存起来以备后用。
生理溶液包括人血浆、血清、及尿液中的短期稳定性试验(培育时间直到16小时)显示VB4-845保持其结合特性及细胞毒性至少16小时。
实施例4.体外药理学试验
已进行研究确定VB4-845在体外对肿瘤细胞培养及动物体内药效模型的细胞毒性。
为确定VB4-845特异抑制Ep-CAM阳性肿瘤细胞生长的能力，进行了MTT(溴化3-[4，5二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑)试验53。MTT试验是通过监测仅在活细胞内存在的酶将四唑盐还原为甲月替而检测细胞活力。不同浓度的VB4-845被添加到培养细胞，监测细胞生长状况超过72小时。
VB4-845对Ep-CAM阳性细胞系(如HT29-结肠直肠癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系、CAL27鳞状细胞癌细胞系、SW2小细胞肺癌细胞系)具有特异细胞毒性作用，不影响EpCAM阴性细胞系RL(如非何杰金氏淋巴瘤)及COLO320(结肠直肠癌)的生长。研究发现，SW2、CAL27及MCF7细胞对VB4-845的细胞毒性作用具有相同敏感度，仅用0.005pM的IC50(半数感染量)即可抑制它们的增殖。HT29细胞被发现敏感度最低(IC50(半数感染量)为0.2pM)。
假单胞菌外毒素通过对延长因子2的ADP核糖基化不可逆地抑制哺乳动物细胞的蛋白合成21-22。为证明Ep-CAM阳性肿瘤细胞系中VB4-845的细胞毒活性与其抑制蛋白合成的能力有关，监测了Ep-CAM阳性细胞SW2对放射标记代谢物[3H]亮氨酸的摄取53。
以VB4-845处理SW2细胞共30小时，用0.01pM的IC50抑制其蛋白合成的为。这一结果与前述细胞毒性试验中测量的剂量应答关系相似。Ep-CAM阴性对照细胞系RL的蛋白合成不受影响。
实施例5.VB4-845全身用药体内试验
对于负荷Ep-CAM阳性的SW2(小细胞肺癌细胞系)，HT29(结肠直肠癌细胞系)或CAL27(头颈鳞状上皮细胞癌细胞系)巨大肿瘤异种移植物的小鼠给予VB4-845静脉内给药治疗(i.v.)，使用两个不同方案中之一：每隔一天5ug，给药三周(共45ug)；或每隔一天10ug，给药一周(共30ug)。负荷Ep-CAM阴性的COLO320肿瘤异种移植物的小鼠作为对照。试验过程中检测肿瘤大小(治疗开始后33-51天)53。
结果总结于表4。小鼠耐受治疗良好，无药物相关死亡，无提示毒性的重要临床观察结果。如图4所示，使用任一剂量方案，均可使所有Ep-CAM阳性肿瘤生长显著受抑。负荷SW2异种移植物的小鼠治疗导致肿瘤体积缩小至初始大小的至多20％，监测期结束时肿瘤生长轻度恢复，最终增加2.6倍。对CAL27肿瘤的治疗获得了相似的结果，肿瘤体积减少至初始体积的至多60％。开始治疗50日后，中值肿瘤体积不超过初始大小的1.4倍。以5ug剂量方案治疗的七只小鼠中两只显示有肿瘤完全退化，且保持无肿瘤。无论CAL27还是SW2肿瘤对两种治疗方案的反应均没有显示显著差异。
对于HT29肿瘤，以5ug剂量方案治疗取得了显著生长抑制(初始体积的0.7倍)。如CAL27肿瘤观察的情况一样，七只小鼠中有三只显示他们的HT29肿瘤完全退化，10ug剂量方案的效力比较低，表明对于这些肿瘤，长期治疗方案较为有效。
在负荷Ep-CAM阴性的COLO320对照肿瘤的小鼠中未发现VB4-845的抗癌作用。
实施例6.VB4-845直接给药的体内试验
给予裸鼠侧胁腹皮下(s.c.)注射107CAL27头颈鳞状上皮细胞癌细胞54。肿瘤建立四周后，按每只平均肿瘤体积为150mm3随机分成两组，8只小鼠给予肿瘤周围注射VB4-845，每隔一天(周一/周三/周五)给予5ug剂量，给药三周(总剂量为45ug)。5ug免疫毒素每次分成2-3个注射点注射。对照小鼠(n＝5)未予治疗。
如表5概述，给予治疗的动物可以观察到显著的肿瘤生长抑制(图5)。两只肿瘤体积较小(90mm3)的小鼠在治疗开始肿瘤即完全退化，在试验期间保持无肿瘤。免疫毒素治疗期间及治疗后未观察到毒性。
实施例7.生物分布
一般而言，文献报道scFv迅速从循环中清除，在动物模型早期时间点具有高肿瘤-本底比值(在肿瘤块中特异滞留)23-25。平均半衰期(T1/2)为2-4小时26-27，依赖分子结构28及给药途径可以较长(＞8小时)。全身注入药物后，依赖分子的最高摄取量倾向于发生在肾脏和肝脏。
对于VB4-845的生物分布在负荷Ep-CAM阳性的SW2和在对侧胁腹为Ep-CAM阴性的COLO320异种移植物的小鼠体内进行了评估53。SW2肿瘤内用药4小时后检测到的放射标记VB4-845最大剂量为2.93％ID/g，24小时和48小时后分别逐渐降至1.95％ID/g和1.13％ID/g。相比之下，集中在COLO320对照肿瘤中的VB4-845在30分钟后最大剂量为1.65％ID/g，4小时后降至1.06％ID/g，48小时后仅为本底水平。
VB4-845较亲本scFv显示出较慢的血液清除率。24小时后，VB4-845在血液中的总剂量为0.42％ID/g，比亲本scFv(0.28％ID/g)大1.5倍。此外，SW2肿瘤内的免疫毒素与亲本scFv相比定位延迟，48小时后VB4-845的分布显示肿瘤：血液比值为5.38，与24小时后达到的比值具有可比性。在每一时间点，与COLO320对照肿瘤相比，VB4-845优先集中于Ep-CAM阳性的SW2肿瘤内，SW2：COLO320比值变化在1.28-2.95。这表明VB4-845通过特异的抗体-抗原相互作用及细胞摄取而保留在Ep-CAM阳性细胞。COLO320对照肿瘤内的边缘蓄积可由于肿瘤内常见的血管渗透性增加所致。这些动物的正常组织分析显示VB4-845还集中于肾脏、脾脏、肝脏及较小程度集中于骨骼。
小鼠的药物代谢动力学和药效模型的临床观察结果显示本发明制剂具有良好的可耐受性，无提示毒性的临床体征。研究过程的始终所有动物存活，无药物相关性死亡。
实施例8.毒性研究
进行了非药品安全性试验规范(non-GLP)研究以评估VB4-845增高的剂量对三种组织，肝脏、肾脏及骨骼的潜在毒性，研究发现在药物代谢动力学试验过程中放射标记VB4-845在此三种组织具有最高水平的集中。
试验结果示于表6。
在具有免疫能力的C57BL/6小鼠给予VB4-845，C57BL/6小鼠比前述药效试验模型中使用的裸鼠对野生型ETA介导的肝损害更为敏感。静脉给予小鼠VB4-845每隔一日5ug(250ug/kg)或10ug(500ug/kg)，给药三次，或每隔一日20ug(1000ug/kg)，给药两次。最后一次给药后24小时，测定血浆转氨酶活性并与以PBS处理的小鼠(0ug/kgVB4-845)进行对照。完成5ug及10ug剂量方案后24小时小鼠血浆中未观察到血清丙氨酸转氨酶或天门冬氨酸转氨酶(ALT/AST)水平升高(图6)。转氨酶活性升高仅于20ug剂量给药时可以观察到。在给药后24小时时间点，动物被处死，肝脏及脾脏组织标本以苏木素/伊红染色，光学显微镜分析。
在免疫毒素20ug(1000ug/kg)剂量方案，总暴露剂量为40ug(2000ug/kg)治疗后，与所观察的转氨酶活性一致，仅少许位点可以发现坏死的肝细胞(图7)。
任何剂量下脾脏及全血血样的细胞成分中均未观察到组织病理学变化或骨髓抑制征象。
VB4-845在人体的低起始剂量为20ug(70kg成人，0.29ug/kg)/日，每日以微剂量给予肿瘤不同部位，给药5日，单周期累积暴露量为100ug/肿瘤(70kg成人，1.43ug/kg)。较高剂量为280ug(70kg成人，4.0ug/kg)，给药模式同前，单周期累积暴露量为1400ug/肿瘤(70kg成人，20ug/kg)。在体重基础上，起始剂量和较高剂量分别比上述小鼠试验中使用的静脉给药月暴露量约小1585倍和小113倍(表7)。在此安全范围基础上，考虑到小鼠重复用药方式使用的剂量未导致提示毒性的临床观察结果，以及起始剂量低于VB4-845月暴露量的1056倍在小鼠无转氨酶水平升高或组织病理学变化，认为此剂量范围是安全的。
啮齿类scFv可从循环中迅速清除，且在早期时间点具有高肿瘤-本底比值(在肿瘤块内特异性滞留)23-25，平均半衰期为2-4小时，即使半衰期延长亦如此26-27。
与动物中所获得的结果相似，123I标记的抗癌胚抗原(CEA)scFv呈现相对的短半衰期，例如，在病人为0.42(t1/2)和5(t1/2)29。肿瘤与血液比值随时间增加(24小时为5.6∶1，相比较，完整IgG抗CEA抗体比值为1-1.5∶1)，在开始的24小时内，所给予的放射性大约有15-41％从尿液排泄，提示肾脏是主要的排泄器官。一小时后在肝脏可以观察到活性，在接下来的21个小时活性迅速降低，并且可以在胆囊观察到，这与抗体的肝脏代谢后放射性核苷酸的胆汁分泌一致29。第二次试验表明了相似的半衰期，分别为0.32(t1/2)及10.59(t1/2)30。LMB-2为一种scFv-ETA免疫毒素，其平均半衰期为173-494分钟(单指数式衰减)；然而，这与外周血液及脾脏的疾病负荷部分有关31-32。
可对VB4-845在人体给药的药物代谢动力学(PK)研究进行评估，此研究不仅包括未偶联的毒素，还包括抗VB4-845抗体(中和抗体)，及毒素(假单胞菌外毒素A)抗体在血浆中的水平。自由循环毒素的药物代谢动力学可以在每位病人进行评估，优选地，在治疗的第一个周期及随访中进行。中和抗体及抗毒素抗体可以在在治疗的第一个周期及随访中评估。达到峰值循环浓度所需时间(Tmax)可因例如肿瘤内用药途径而延迟。此外，峰值循环浓度(Cmax)可以降低。
针对淋巴瘤相关抗原的单克隆抗体已被开发及用于一些人类癌症的诊断与治疗研究。关于使用单克隆抗体或抗体片段对人体的毒性已有报道，其主要与输注有关。这样的毒性事件包括发烧、寒战、恶心及头痛14、荨麻疹、过敏反应、无菌性脑膜炎、溶血、白细胞减少、血小板病及血管渗漏综合征33-35。某些情况下，由于大多数临床试验使用鼠源、或鼠/人嵌合抗体，这些反应部分归因于病人对异种蛋白的免疫反应33-34。
相比较而言，VB4-845是人源化蛋白。此外，使用优选的给药途径，肿瘤内或肿瘤周围使用VB4-845不会导致前述其它癌症免疫治疗方法那样多的毒性事件或相似程度的毒性。
实施例9.VB4-845的制备
VB4-845(也称为4D5MOCB-ETA)表达载体的构建。编码截断型ETA(ETA252-608)的序列通过PCR从质粒pSW20060扩增，并克隆为Ep-CAM结合的4D5MOCB scFv序列的1164bp EcoRIHindIII片段下游，其存在于pIG6为基础61的4D5MOCB scFv表达载体62。引物(Tox1：CTCGGAATTCGGTGGCGCGCCGGAGTTCCCGAAACCGTCCACCCCGCCGGGTTCTTCTGGTTTA(SEQ ID NO：10)；Tox2：GTCAAGCTTCTACAGTTCGTCTTTATGGTGATGGTGATGGTGGTGATGCGGCGGTTT CCCGGGCTG(SEQ ID NO：11))在scFv和毒素之间引入了一个EcoRI限制酶切位点，一羧基末端六组氨酸标签随后是内质网(ER)滞留信号KDEL，一终止密码子，及一HindIII限制酶切位点。为改善固定化金属离子亲和层析(IMAC)的纯度及产量，在胞质信号序列和4D5MOCB编码区之间的氨基末端添加第二个六组氨酸标签。在此结束后，两对寡核苷酸：(XbaI 5′：CTAGATAACGAGGGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGCACTGGCTGGTTCGCTACCGT(SEQ ID NO：12)；XbaI 3′：GCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTT TTGCCCTCGTTAT(SEQ ID NO：13)；及EcoRV 5′：AGCGCAGGCCGACCACCATCATCACCATCACGAT(SEQ ID NO：14)；EcoRV 3′：ATCGTGATGGTGATGATGGTGGTCGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGT(SEQ ID NO：15)被加热至80℃，逐渐冷至室温退火，然后在pIG6-4D5MOCBETAH6KDEL的XbaI和EcoRV位点之间进行连接。试验上已经证实了此序列。
对于VB4-845的胞质表达，使用pIG6载体，使基因处于在lac启动子控制下，在SB536(一种大肠杆菌菌株，缺乏胞质蛋白酶HhoA及HhoB.63)中表达。在5ml含有氨苄青霉素(100mg/ml)的2YT培养基接种含有VB4-845(4D5MOCB-ETA)表达质粒的单菌落，25℃过夜生长。细菌被稀释于1升添加0.5％葡萄糖及氨苄青霉素(100mg/ml)的2YT培养基中，至A550nm在0.1-0.2，转移至3升带有挡板的摇瓶中。培养物于25℃继续生长至A550nm为0.5，通过添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma公司)而诱导4小时产生免疫毒素。收获从最终A550nm为6的细菌培养物中所得的沉淀于-80℃贮存。
为了纯化，1升培养物所得的沉淀重新悬浮于25ml裂解缓冲液(含50mM Tris-HCl(pH7.5)，300mM NaCl，2mM MgSO4)中，添加无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，曼海姆，德国)及DNA酶I。细菌悬液在弗氏压碎器(SLS仪器，Urbana，IL)中裂解两次，在SS-34转子中转速48,000g4℃离心30分钟，随后给予过滤除菌(0.22nm)。存在于澄清上清液中的免疫毒素通过使用BIOCAD-装置(Perseptive BioSystems)层析纯化，装置带有Ni2+-亚氨二醋酸(IDA)柱及HQ/M阴离子交换柱双流线，方法如Pluckthun等64所述)。在装裂解产物之前，Ni2+-IDA柱以20mM的Tris(pH7.5)，300mM NaCl平衡。在装裂解产物之后，柱子以不同盐溶液洗三次，顺序为300mM、510mM及90mMNaCL，均以20mM的Tris(pH7.5)缓冲。之后，以20mM的Tris(pH7.5)，10mM咪唑，90mM NaCl清洗柱子，然后结合的免疫毒素以含有200mM咪唑的相同溶液(pH7.5)洗脱。
洗脱液直接装至HQ/M阴离子交换柱，结合的免疫毒素以90-1000mM的NaCl盐梯度洗脱(以20mM Tris(pH7.5)缓冲)。收集含4D5MOCB-ETA的部分并使用10kDa截断过滤器通过2000g、4℃离心浓缩(Ultrafree-MC低蛋白结合、微孔)。纯化后VB4-845(4D5MOCB-ETA)的特性通过10％SDS聚丙烯酰胺凝胶及免疫印(Western blotting)迹法进行分析，其中免疫印迹法使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗四组氨酸抗体(QIAGEN，Hilden，德国)，依照厂家推荐稀释为1∶5000。
凝胶过滤法分析及热稳定性测定
10ug纯化的VB4-845(4D5MOCB-ETA)用50ml pH7.4的含0.005％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，之后37℃温育。在不同的时间点(在0小时、2小时、4小时、8小时、10小时及20小时之后)通过凝胶过滤法使用带有Superose-12 PC3.2/30柱的Smart装置(Pharmacia，Uppsala)对样品进行分析，柱子以带有三种蛋白标准，即乙醇脱氢酶(Mr150,000)、牛血清白蛋白(Mr 66,000)、碳酸酐酶(Mr 29,000))的相同缓冲液定标。在人血浆37℃温育20小时后，使用相同的分析装置评估99mTc标记的免疫毒素的热稳定性，通过洗脱部分的g-闪烁计数测定免疫毒素单体量。
放射性标记及抗原结合亲和力的测定
VB4-845(4D5MOCB-ETA)通过99m Tc-丙三醇稳定的位点特异性配位放射性的标记于存在蛋白序列中的六组氨酸标签上65。这一自发反应通过将30ml免疫毒素溶液(1mg/ml)与1/3容量的pH6.8的1M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和1/3容量新鲜合成的99mTc-tricarbonyl化合物混合而诱导。混合物在37℃温育1小时，按照厂商的建议，反应的终止采用以含0.005％Tween-20的PBS平衡的Biospin-6柱(BioRad，Hercules，CA)上脱盐的方法。免疫反应的免疫毒素所占比例按照Lindmo等66所述的方法评估。使用放射免疫分析法(RIA)于SW2细胞测定99mTc标记免疫毒素的结合亲和力，基本如scFv4D5MOCB所描述的方法。
实施例10.VB4-845的制造过程.
VB4-845大肠杆菌(E.coli)发酵.在研究实验室中，使用转动培养振荡器在2L摇瓶中生产VB4-845。转动培养振荡器处于温度可以调节在1℃摄氏温度之内的环境控制房间内，种子培养基和生产培养基的培养及所有无菌操作均在带有高效粒子空气(HEPA)过滤装置及空气等级为100的II/B型生物学安全工作橱下进行。细胞的分离、浓缩及透滤在研究试验室进行。
VB4-845由VB4-845 E104宿主细胞E.coli原始细胞库(MCB)生产，(来自XomaIreland公司的pING3302质粒用于构建表达载体)。用于临床等级VB4-845生产的细胞起始增殖扩大(发酵)水平为：每摇瓶1L工作体积，26×2L摇瓶，总体积为26L。VB4-845E.coli原始细胞库(MCB)在合成的含氮培养基中生长，培养基含甘油其作为细胞生长的主要碳源。发酵程序如下所述：
接种物制备
为运行26L摇瓶，制备VB4-845E.coli原始细胞库(MCB)500ml作为前接种物，每次培养时，从-18℃贮槽中取出一小管MCB，允许在室温下解冻。小管外部以70％乙醇擦拭，允许在生物学安全工作橱里风干。添加MCB细胞悬液(1.5ml)至含500mL无菌育种培养基(改良的2YT培养基和25mg/L四环素)的2L锥形瓶中。转移锥形瓶至转动振荡器，设定200rpm(每分钟转数)，在25±1℃下生长直至光密度达3.0±0.2或更高(10.5±1小时，对数生长中期)。接种物作为种子培养物接种到26个生产摇瓶中。
26×2L摇瓶中发酵
使用2L无挡板的摇瓶发酵，每瓶含1L生产培养基。临床级别VB4-845的典型生产方式采用26×2L摇瓶，每瓶含有1L生产培养基(改良的Terrific发酵液TB)。于发酵培养基接种上述培养获得的1％接种物，在振荡器(200rpm)于25±1℃培养，直至最后接种的摇瓶光密度达到1.2(大约6-7小时)。诱导时典型的OD600范围为1.2-1.5。VB4-845的表达通过添加0.1％阿拉伯糖诱导。大约诱导6小时后收获细胞。
细胞分离
在收获时，从振荡器房间按接种次序移除所有摇瓶，最先接种的先移除。在生物罩下，将第一个摇瓶的内容物添加到第二个摇瓶中。同样方法移除所有后面的摇瓶。汇合培养物的摇瓶置于2-8℃冷藏。从上述的发酵培养物分6组移除VB4-845 E104 E.coli细胞，使用Sorvall and Beckman离心机于2-8℃、离心力为6,800g、离心15分钟。丢弃细胞，保留无细胞培养液以进行进一步的处理。按照确定的方法收集、灭活及处置集中的细胞悬液。收集培养上清并保留5ml样品以进行产物定量。在处置发酵培养液之前，彻底清洗离心机、转子及离心瓶。
浓缩/透滤
使用带有截留分子量为10kD额定分子量(NMW)切线流过滤Pellicon系统的Sartorius薄膜(Hydrosart)及3平方英尺的表面积)浓缩及透滤收获的培养物。Pellicon过滤系统在使用前彻底清洗。浓缩时，近样速度为4L/min，渗透速度为500ml/min，最后一步浓缩时取5ml样品。透滤采用0.02M、pH7.2±0.2的磷酸钠。需要5个体积变化来取得预期＜10mS的电导率。使用Sorvall离心机澄清透滤浓缩产物，离心力6,800g，大约30分钟，设定温度2-8℃。含产物的澄清溶液纯化前使用0.22um截断过滤器过滤。透滤后澄清步骤包括离心、通过0.2um截断过滤器、添加聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、调节电导率、调节pH，然后接下来纯化。
VB4-845纯化过程
VB4-845的纯化在Viventia Biotech′s中试工厂进行，工厂为具有高效粒子空气(HEPA)过滤装置及空气等级为10,000的受控环境的cGMP(现代优良生产操作规程)控制区。采用金属螯合亲和层析分离VB4-845，并利用阴离子交换层析进一步纯化。纯化过程在图9的流量图中概述，并描述如下：
Sepharose金属相互作用螯合层析
金属亲和柱的制备是通过于XK26/20玻璃柱中装入螯合的SepharoseHP树脂，柱体积大约为17±1mL。装柱在3bar反压力下进行。工作层流速度(LFR)为90cm/h。5个柱体积(CV)的注射用水(WFI)通过螯合Sepharose柱。使用金属离子使螯合Sepharose柱带有电荷，取5个柱体积(CV)、0.1M的氯化镍溶液通过柱子。未结合的氯化镍残留物以5个柱体积(CV)的注射用水(WFI)洗除。然后以10个柱体积(CV)含150mM氯化钠及0.1％Triton X-100、pH7.2±0.1的20mM磷酸钠缓冲液(螯合Sepharose平衡缓冲液)平衡柱子。
使用氯化钠调节含VB4-845的浓缩/透滤溶液的电导率至15±1mS，并且以1M氢氧化钠(NaOH)调节其pH值至7.2±0.1。于螯合SepharoseHP树脂柱以90cm/小时或8ml/分钟的工作层流速度(LFR)纯化含VB4-845的溶液。然后以20个柱体积(CV)的洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，150mM氯化钠，20mM咪唑，0.1％TritonX-100，pH7.2±0.1缓冲液)洗柱。以6个柱体积(CV)的螯合Sepharose洗脱液(20mM磷酸钠、150mM氯化钠、500mM咪唑、pH7.2±0.1缓冲液)洗脱VB4-845。在洗脱峰开始收集3个柱体积(CV)的产物。
Q-Sepharose-阴离子交换层析
使用Q-Sepharose HP树脂填充XK16/20玻璃柱，最终柱体积为5.0±0.5mL。工作层流速度为156cm/小时。以10个柱体积(CV)的注射用水(WFI)洗柱，然后用5个柱体积(CV)pH7.2±0.1的含1M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液洗柱，并用10个柱体积(CV)的2-琼脂糖平衡缓冲液(20mM磷酸钠、90mM氯化钠、pH7.2±0.1)平衡。以20mM、pH7.2±0.1的磷酸钠缓冲液稀释螯合Sepharose柱洗脱液，直至电导率达到10±1mS。以5.2ml/min的流速将部分纯化的VB4-845装入Q-Sepharose柱进一步降低毒素水平及减少DNA。一旦产物被结合，使用15个柱体积(CV)的Q-Sepharose平衡缓冲液洗阴离子交换柱。在流动过程及冲洗步骤可发现污染物。使用3mL 20mM磷酸钠、500mM氯化钠、pH7.2±0.1的缓冲液洗脱产物。
实施例11.VB4-845竞争性分析
在4℃于用冰预冷的含5％FCS(胎牛血清)PBS中使用非饱和量的生物素化VB4-845scFv(0.5-1.0ug)预培养Ep-CAM阳性细胞系CAL-27(0.9×106)10分钟。之后，以冰预冷的含5％FCS(胎牛血清)PBS稀释检测抗体(竞争抗体)并以与能够完全抑制生物素化VB4-845scFv的结合的非生物素化VB4-845scFv等摩尔的当量添加至混合物中。接下来在4℃培养1小时，以用冰预冷的PBS-5％FCS(胎牛血清)清洗细胞，以洗涤液稀释的Cy Chrome标记的抗生物素蛋白链菌素(Pharmingen，1∶120)存在下于4℃继续培养30分钟。培养阶段结束后清洗细胞，并采用流式细胞计量术进行分析。以4B5 scFv，其为一种抗个体基因型特异性scFv，与GD2特异的抗体14G2a反应，但不与CAL-27反应，代替VB4-845 scFv培养CAL-27肿瘤细胞作为阴性对照。可选择的，添加结合CAL-27的非竞争抗体(抗HER-2/neu)以取代4B5 scFv。仅就检测生物素化VB4-845 scFv而言，任何一种情况均未检测出最小变化的中值荧光。对每一抗体来说，根据下列方程式计算抑制百分数：
           PI＝[(FMax-FBgd)-(FT-FBgd)/(FMax-FBgd)]×100
其中：PI＝抑制百分数；FMax＝生物素化VB4-845 scFv的最大中值荧光；FT＝检测抗体存在时生物素化VB4-845 scFv的中值荧光；FBgd＝本底中值荧光，即单独生物素化VB4-845 scFv和在任何一种阴性对照抗体存在时生物素化VB4-845 scFv中值荧光差异。参见Willuda等，1998，“高热稳定性对于抗体片段的肿瘤靶向是必需的：人源化抗上皮糖蛋白细胞-2(上皮细胞粘附分子)单链Fv片段的工程”Cancer Res.59：5758-5767。
实施例12.头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)临床试验
在两个主要旨在测定最大耐受剂量及评估不同剂量方案的头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)临床试验中，根据不同剂量方案，晚期HNSCC受试者将接受VB4-845瘤内注射。起始剂量(20ug/肿瘤/日，5日)低于小鼠3周试验(体表面积为基础)的最大单剂量静脉暴露的1/120及低于小鼠3周试验(体表面积为基础)最大5日静脉暴露的1/70。
第一个试验(开放队列，单组，安全性及耐受性试验)正在进行中，已经完成或开始至少13名受试者的治疗。在这些受试者中，大多数已经完成130ug/肿瘤/日、给药5日的两个周期(剂量等级4；650ug/肿瘤/周期，每肿瘤总暴露量1300ug)的治疗。在此试验中，直接将药物注射至头颈区的肿瘤位置或次生生长瘤之一(转移灶)处。选择最大或最易处理的瘤灶注射(标志瘤灶或靶瘤灶)。试验包括2周期剂量扩大方案。每周期持续4周(28天)。在周期的最开始的连续5天内，受试者每天接受瘤内注射药物起始剂量为20ug/肿瘤/日，连续5天，因此，提供100ug/周期/肿瘤(剂量等级1)。5日阶段之后是23日的休息期，在此期不给药。然而，受试者将接受每周随访，包括临床检查、及血液和尿样检测。在最终评估之前重复第二个28日周期。最少1至3名受试者以每一剂量等级给药。6个剂量等级为100ug/肿瘤/周期、200ug/肿瘤/周期、400ug/肿瘤/周期、650ug/肿瘤/周期、1000ug/肿瘤/周期、及1400ug/肿瘤/周期(或20ug/肿瘤/日、40ug/肿瘤/日、80ug/肿瘤/日、130ug/肿瘤/日、200ug/肿瘤/日及280ug/肿瘤/日，连续5日)。在开始配药时，每小管以至多900uL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，将需要量的VB4-845抽入注射器中。调节稀释比率达到注射容量不超过肿瘤块估计体积的约30％。在5日阶段及最后一次给药的24小时内，受试者在重症监护病房接受治疗。每日取血及尿样监测肝脏及肾脏功能，及测定血中的药浓度。每次给药时，皮肤或口腔粘膜单穿刺位于从肿瘤中心至外周大约80％的位置，以保证穿刺位置与先前不同。从穿刺点放射状发散6-8个针迹，在每一处注射等量溶液。在治疗期间使用适当的镇痛药。皮质激素的局部或全身使用限制于毒性等级为3-4的皮肤或粘膜症状性毒性。
第二个试验中，也是直接将药物注射至头颈区的肿瘤位置或次生生长瘤之一(转移灶)处。如果受试者有超过一处的瘤灶，选择在任何最大范围接近5cm的最易处理的病灶注射。如果可处理的瘤灶仅为小瘤灶，多个瘤灶可以结合起来为5cm的最大范围进行治疗。予受试者每周给药一次，连续四周，之后是四周休息期，此期内，监测受试者身体状况。VB4-845的起始剂量水平是100ug/肿瘤/周，其它剂量水平为200ug/肿瘤/周、330ug/肿瘤/周、500ug/肿瘤/周、700ug/肿瘤/周、930ug/肿瘤/周及1240ug/肿瘤/周。在开始配药时，每小管以至多800uL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，将需要量的VB4-845抽入注射器中。注射的终容量使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)悬液容量进行调节，以至不超过肿瘤块估计体积的约30％。在每一给药日，将肿瘤的全部体积包括在内给药。注射时，将小注射针(25-27规)连接1cc的Luer锁紧接口注射器，以约45度角刺入肿瘤基底。依照肿瘤大小及位置，从单个穿刺点追踪治疗剂通过肿瘤的途径进行注射，或通过从多点，增大1cm，并排大约分开约0.5至1.0cm进行注射，从而分布于整个肿瘤。在治疗前基线随访及第四周每继后给药前及试验结束时评估肿瘤反应。如有可能，于第4周及第8周(或终访)在防护下进行CT扫描。在观察整体或部分反应时，4周后进行CT扫描以确定结果。其它的评估将通过临床观察及操作直接测量肿瘤。完全反应(CR)会显示注射肿瘤完全消失(在用药4周确定)；部分反应(PR)显示在被治疗的肿瘤最大直径减少至少30％(在4周确定)；稳定病情(SD)显示受治肿瘤退化少于受治肿瘤最大直径的30％或进展少于受治肿瘤最大直径的20％，及肿瘤进展(TP)显示在受治肿瘤最大直径增加20％，关于CR、PR或SD尚无记录。使用模拟疼痛模型在治疗前、每次用药前、第4周及第8周(或终访)评估疼痛，从靶肿瘤组织随机细针抽取活组织检查观察VB4-845在细胞水平的作用。使用标准程序评价全身及局部毒性，正在进行的不良反应事件、实验室毒性及受试者疼痛状态的评估将贯穿于整个治疗过程。
实施例13.VB4-845对膀胱肿瘤细胞系的生物学活性
概要
通过流式细胞计量术评价VB4-845[抗Ep-CAM scFv及缺少细胞结合结构域(ETA252-608)的假单胞菌外毒素A融合蛋白]对一组人肿瘤细胞系(包括14种膀胱肿瘤细胞系)的细胞表面反应性，以确定Ep-CAM在这些潜在临床适应症中表达的程度和广度。VB4-845对14种膀胱肿瘤细胞系中的10种显示强大的反应性，对其它几种具有弱反应性。VB4-845对11种VB4-845阳性的膀胱癌细胞系显示强烈的细胞毒性作用，暴露72小时IC50值变化范围为0.001-320pM。相反，在3种VB4-845阴性的细胞系未检测到细胞毒性作用。确定4种膀胱癌细胞系(T-24、SW-870、UM-UC-10及1A6)对VB4-845治疗最敏感。在另一暴露时间限制至2小时的亚细胞系试验中，VB4-845可以对鳞状膀胱癌细胞系SCaBER及过渡型鳞状膀胱癌细胞系5637发挥有效的细胞毒性作用(＞93％)。相比之下，5637于对照免疫毒素4B5-PE 500pM暴露2小时，非特异细胞毒性最低(＜10％)，即使增加100倍剂量(50000pM)仍处于相同水平。总之，VB4-845对膀胱癌细胞系的体外有效抗肿瘤活性表明VB4-845可用于膀胱癌抗癌治疗的临床前及临床研究。
试验设计
通过流式细胞计量术检测VB4-845对肿瘤细胞系反应性及细胞毒性的试验设计已有描述3，4。纯化的scFv-ETA融合蛋白VB4-845(批号：02203，Img/mL)及阴性对照4B5scFvETA(批号：032403，1.5mg/mL)如前所述产生，分量贮存于-80℃
试验中使用的肿瘤细胞系组及其特征见表9。遵循美国模式培养物保收藏所(ATCC)或欧洲动物细胞库(ECACC)方案，所有肿瘤细胞在含10-20％FCS(胎牛血清)及适当的添加物的培养基中繁殖。当肿瘤培养细胞活力大于90％，汇合50-70％时收获。CAL-27细胞系表达高水平的Ep-CAM抗原，用作阳性对照，而Ep-CAM低表达细胞COLO 320用作阴性对照。
通过流式细胞计量术检测VB4-845对肿瘤细胞系的反应性
通过流式细胞计量术检测纯化的VB4-845对一组肿瘤细胞系的作用，以确定细胞表面反应。简言之，使用纯化VB4-845或作为4B5 scFv阴性对照于10ug/mL在冰上培养肿瘤细胞(0.9×106/300uL)2小时。小鼠抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(Oncogene Research，Cat#OP15，1ug/mL)用作阳性对照。细胞培养之后，以含5％FBS(小牛血清)的PBS清洗细胞，使用VB4-845的抗组氨酸标签抗体(Amersham PharmaciaCat#27-4710-01，1∶800稀释)或生物素结合的抗表皮生长因子受体抗小鼠IgG(Piercecat#31174，1∶200稀释)于冰上培养1小时。以含5％FBS(小牛血清)的PBS清洗细胞，然后使用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的山羊抗小鼠IgG(The binding Site Cat#AF271，1∶100稀释，抗-HIS处理细胞)，或抗生物素蛋白链菌素Cy-Chrome(Pharmingen cat#13038A，1∶120稀释)于冰上培养30分钟。最后清洗细胞并重悬于0.5mL含0.6ug/mL碘化丙锭(Molecular Probes cat#P-1304)的缓冲液中。使用FACSCalibur测定肿瘤细胞结合。如果抗体治疗的肿瘤细胞阳性荧光变化在阳性细胞超过阴性对照有＞30％的细胞(1.3倍对照)，则认为抗体阳性。
细胞增殖试验评估VB4-845介导的细胞毒性作用
通过MTS方法测定细胞增殖的抑制判断VB4-845的细胞毒性。简言之，使用通过按5000个细胞/50uL/孔接种肿瘤细胞于含10％FCS的培养基制备96孔微量滴定板。滴定板在5％CO2存在下37℃培养3小时。此时，10倍系列稀释VB4-845，于每孔添加50uL不同含量的VB4-845(0.00005 to 500pM)，每孔最终容量为100UL。使用相同浓度的4B5scFv-ETA作为阴性对照。对照细胞和对照孔(空白)仅以100uL培养基培养，设四组。滴定板在5％CO2存在下37℃培养72小时。每一次分析重复两次以表现结果的重复性及一致性。培养之后，采用MTS方法测定细胞活力。简言之，将75uL吩嗪硫酸甲酯(PMS)(0.92mg/mL以PBS溶解)添加到1.5mL四唑盐化合物MTS(Promega，Cat#G 111A and G109C，2mg/mL，以PBS溶解)，然后将20uL
PMS/MTS混合物添加到每孔。滴定板在5％CO2存在下37℃培养2小时。随后，使用ELISA(酶联免疫吸附测定)读板机于490nm读板。
测定由VB425 845介导的细胞毒性作用所需最小暴露时间
通过使每一膀胱癌细胞系暴露于VB4-84572小时，测定IC50值(与仅以培养基处理的细胞对照能杀伤50％细胞的VB4-845浓度)。选择5种不同杀伤敏感度的敏感细胞系(SW-780、DC-MC-10、1A6、UC-MC-14及5637)测定使用接近IC50的固定浓度杀伤50％肿瘤细胞所需最小暴露时间。将肿瘤细胞暴露于固定浓度(0.01pM、0.6pM或6pM)VB4-8452小时、4小时、24小时、48小时及72小时。除72小时外，在每个时间点，使用新鲜培养基取代含VB4-845的培养基以减少免疫毒素VB4-845的暴露时间，72小时后进行MTS试验以确定与对照细胞(仅以培养基处理的细胞)相比的细胞毒性作用(50％肿瘤细胞杀伤)。为进一步评估VB4-845对低敏感鳞状上皮细胞癌细胞系(SCaBER)及敏感的膀胱移行细胞癌细胞系(5637)及两种其它膀胱癌细胞系(UM-UC-10及UM-UC-14)，使细胞暴露于固定浓度或不同剂量的VB4-845两小时。培养2小时后，清洗细胞去除VB4-845，使用新鲜培养基培养，72小时后进行MTS试验。另外，为测定VB4-845的特异细胞毒性作用，将5637细胞暴露于不同剂量(500pM、5000pM、50000pM)的VB4-845及阴性对照免疫毒素4B5-PE以确定在较高浓度下的杀伤效应。培养之后每一时间点2小时、6小时、12小时、24小时及48小时，使用培养基清洗细胞以去除VB4-845，使用新鲜培养基培养，72小时后进行MTS试验以确定细胞毒性。根据初始IC50值结果选择剂量范围，以期最小剂量VB4-845对此细胞系具有最大杀伤效应。
试验结果
VB4-845肿瘤细胞反应性
对一组膀胱癌细胞系评估了VB4-845的细胞表面效应。VB4-845在14种膀胱癌细胞系中有11种表现阳性反应。数据总结于表10。
体外VB4-845对膀胱癌细胞系的毒性效应
使用浓度范围0.00005-500pM的VB4-845培养肿瘤细胞72小时，通过MTS试验评价细胞增殖的抑制。结果总结于表10。VB4-845对三种EGP-2阴性的细胞系(J-82、UM-UC-3及UM-UC-13)无细胞增殖抑制作用，但对Ep-CAM抗原高表达的四种细胞系(T-24、SW-780，、UM-UC-10及1A6)显示强烈的抑制作用(IC50为0.001-0.033pM)，在其它细胞系显示中等抑制水平。
体外VB4-845介导的对膀胱癌细胞系的细胞毒性作用所需最小暴露时间
在标准的细胞增殖试验中，将膀胱癌细胞暴露于VB4-84572小时，之后评价细胞增殖的抑制。对于膀胱癌，膀胱内治疗停留时间很少超过2小时。因此，进行细胞增殖试验以确定在等于或接近IC50值(0.01或0.6pM)的固定浓度VB4-845暴露下杀伤50％肿瘤细胞所需的最小暴露时间。第一个试验中，将两种VB4-845敏感的膀胱癌细胞系(SW-780及1A6)暴露于0.01pM浓度的VB4-8452小时、4小时、6小时、24小时、48小时或72小时。即使在短暴露时间后VB4-845也对SW-780及1A6膀胱癌细胞系表现强烈的细胞毒性作用。对高敏感膀胱癌细胞系SW-780(IC50值为0.002pM)，暴露3小时后50％肿瘤细胞被杀伤，而对低敏感细胞系1A6(IC50值为0.033pM)，暴露37小时后取得相同结果。在第二个试验中，三种不同的膀胱癌细胞系暴露于0.6pM浓度的VB4-845取得了一组相似的数据。结果表明UM-UC-10、5637或UM-UC-14细胞在分别暴露4小时、16小时及20小时后有50％被杀伤。这三种细胞系的敏感度次序与它们IC50值次序相同。
在单独的试验中，暴露于较高浓度(6.0pM)VB4-845两小时，UM-UC-10、5637及UM-UC-14分别有96％、89％及93％的细胞被杀伤。在进一步的评价中，低敏感细胞系(SCaBER)及敏感细胞系(5637)暴露于不同剂量的VB4-845两小时，3900pM剂量暴露取得了杀伤＞93％SCaBER细胞的强烈细胞毒性作用，而低得多的剂量(＜498pM)在5637细胞取得了相同程度的细胞毒性作用。因此，研究证实获得最大细胞毒性作用所需的最低VB4-845剂量依赖于细胞系的敏感度。另外，在一个单独的试验中，5637细胞暴露于500pM浓度的VB4-845两小时呈现有效的细胞杀伤效应(＞93％)，对照免疫毒素4B5-PE则呈现最小的非特异细胞毒性(＜10％)。事实上，即使增加4B5-PE浓度100倍暴露两小时，非特异细胞杀伤效应仍处于最低水平。
实施例14.人体临床膀胱结合
取手术及尸体剖检的人膀胱组织标本使用VB4-845检测Ep-CAM结合。标本以福尔马林固定及石腊包埋，对新鲜冷冻及固定标本的方法进行验证以确保本试验所需的固定标本量足够及确定抗体(VB4-845)的最佳使用浓度(使非特异染色降至最小)。
17个III级II期或III期膀胱移行细胞癌及12个正常膀胱对照标本以4ug/mlVB4-845(～57nM)进行染色。载玻片的制备及封闭依照已知的免疫组织化学操作程序进行。使用兔抗假单胞细菌外毒素抗体(Sigma P2318)，然后使用以生物素标记的抗兔二抗(Vector抗兔BA1000)及使用Vector红作为底物的Vector亲和-生物素-酸性磷酸酶(vector ABC-AP)检测系统检测VB4-845与组织的结合。
相对于正常的移行上皮细胞，癌肿显示染色增加，阳性结果中的最强染色为膜相关染色。癌肿中，染色的强度及分布不同。与相同肿瘤低分化或高度间变及多型的区域相比，在中等程度分化(如移行或柱状分化)的区域也看到染色增加。
在17个染色的移行癌中，有8个标本显示轻度-中度膜染色(在标本2、6、8、11、13、15、及16中，0-4染色强度分级为2-3)，有一个标本显示弱染色区(标本9)，其它标本膜染色呈阴性。肿瘤内染色不同，与标本的分化程度有关。在12个正常的膀胱样本中，有2个显示轻度及低频率膜染色(标本2和11)。在阴性对照免疫毒素未发现染色(scFv-PE从抗体至无关抗原)。
在一些正常标本及癌标本中胞质染色很少，核染色更为少见。在验证试验中，较高浓度的VB4-845结果显示“红染”或胞质染色增多，但较高比例的癌细胞膜染色较强。在临床使用中(体内)，由于细胞质及细胞核不暴露于治疗剂，可使用较高浓度的VB4-845以增加与受体数量较低细胞的结合。
实施例15.膀胱临床试验
在评价VB4-845最大耐受剂量的临床试验中，对BCG抵抗性膀胱移行细胞癌(TCC)受试者给予膀胱内给药。治疗周期包括6周用药及4-6周的随访。将通过插入导管直接将适当剂量的VB4-845导入膀胱(肿瘤)，每周一次，连续6周。
在6个给药日，每日7个剂量水平的VB4-845为100ug(50ml)、200ug(50ml)、335ug(50ml)、500ug(50ml)、700ug(50ml)、930ug(50ml)及1240ug(50ml)。
在用药之前，必须立即排空膀胱，之后插入导管。对于男性受试者，将使用带有Urojet的16French Coude导管，对于女性受试者，将使用带无菌润滑剂的14French红橡胶导管。重新溶解配成原浓度的VB4-845溶液将以50ml生理盐水稀释，通过导管慢慢地灌入空膀胱内，并加紧固定导管，在膀胱内保留2小时。2小时结束时，通过松开导管排空膀胱。
在治疗3周后剂量增加之前，对每一剂量进行安全性即实验室及不良反应(AE)资料进行评价。受试者以确定的剂量水平继续每周的治疗持续6周，或直至产生药物相关的剂量最大容许毒性(DLT)。用药最后一周后的4-6周内进行随访。发生剂量最大容许毒性(DLT)但显示临床治疗有效的受试者，一旦所有毒性反应解除在次低剂量水平接受另一周期的治疗。然而，在减少了的剂量发生第二次剂量最大容许毒性(DLT)的受试者将终止治疗。将通过细胞学、细胞检查及活组织检查评价肿瘤反应。
尽管就目前认为是优选的实施例描述了本发明，应该清楚本发明不限于已公开的实施例。相反，本发明旨在涵盖包括在附加的权利要求书精神及范围中的各种修改及等同处置。
所有出版物、专利及专利申请书全部以参考文献形式完整合并在本文中，如同每一单独的出版物、专利或专利申请书被特别单独指明通过参考文献完整合并。
                    表1VB4-845产品规格
  检验项目  标准
  外观  2-8℃澄清溶液
  蛋白质(BCA)  1.0±0.2mg/ml
  pH  7.2±0.2
  SDS-PAGE(非还原性：考马斯蓝)  主条带～70kDa(面积≥90％)
  生物活性(荧光激活细胞分类)(FACS)  荧光比对照抗体增加≥50倍
  细胞毒性(IC50)  ≤0.50pM
  总DNA  ≤1.0ng/mg
  内毒素(鲎变形细胞溶解物)(LAL)  ≤2000EU/mg
  无菌试验  无细菌生长
               表2体外VB4-845抗肿瘤细胞作用概要
  试验系统信息   瑞士苏黎士大学医院内科医学肿瘤学区细胞系：SW2小细胞肺癌CAL27鳞状上皮细胞癌HT29结肠直肠癌COLO320结肠直肠癌MCF7乳腺癌RL非何杰金氏淋巴瘤
  剂型   VB4-845：0.0001-100pM
  测定方法   MTT(溴化二甲基噻唑二苯四唑)试验
  试验持续时间   72小时
  评价参数   VB4-845对细胞生长的抑制
  观察结果及结论   研究发现SW2、CAL27及MCF7细胞对VB4-845的细胞毒性作用具有相同的敏感度(IC50＝0.005pM)，HT29细胞敏感度最低(IC50＝0.2pM)
     表3体外VB4-845抑制肿瘤细胞内蛋白合成作用概要
  试验系统信息   瑞士苏黎士大学医院内科医学肿瘤学区细胞系：SW2小细胞肺癌RL非何杰金氏淋巴瘤
  剂型   VB4-845：不同含量
  测定方法   [4，53H]亮氨酸的吸收
  试验持续时间   30小时
  评价参数   [3H]亮氨酸的摄取(蛋白质合成的测定)
  观察结果及结论   Ep-CAM阳性细胞SW2蛋白合成受0.01pMIC50VB4-845的抑制，Ep-CAM阴性对照细胞系RL的蛋白合成不受影响。
      表4VB4-845对小鼠癌症异种移植模型中实体肿瘤作用概要
  试验动物信息   小鼠、裸鼠瑞士苏黎士大学医院内科医学肿瘤学区动物皮下移植下列肿瘤之一：SW2小细胞肺癌CAL27鳞状上皮细胞癌HT29结肠直肠癌COLO320结肠直肠癌
  剂型   VB4-845：5ug及10ug(见下文)
  给药途径   静脉
  治疗方案   i)每隔一日5ug，给药三周(共45ug)ii)每隔一日10ug，给药一周(共30ug)
  试验持续时间   50日
  评价参数   原发性肿瘤大小
  观察结果与结论   SW2：肿瘤体积缩小至初始大小的最大20％，在监测期结束时轻度恢复生长最终增加2.6倍。CAL27：肿瘤体积缩小至初始大小的最大60％，治疗开始后50日，中值肿瘤体积不超过初始体积的1.4倍。使用5ug剂量，7只小鼠中有2只显示肿瘤完全退化且保持无肿瘤。无论CAL27还是SW2对两个治疗方案均无显著差异。HT29：5ug剂量方案肿瘤减小0.7倍，7只小鼠中有3只显示HT29肿瘤完全退化。10ug剂量方案的效力比较低，提示对于这些肿瘤长期治疗较为有效。负荷Ep-CAM阴性的COLO320对照肿瘤中未发现抗肿瘤作用。
表5小鼠癌症异种移植模型中VB4-845肿瘤周围注射对CAL27鳞状上皮细胞癌作用概要
  试验动物信息   小鼠、裸鼠瑞士苏黎士大学医院内科医学肿瘤学区动物皮下移植CAL27鳞状上皮细胞癌
  剂型   VB4-845：5ug(见下文)
  给药途径   肿瘤周围
  治疗方案   每隔一日5ug(周一/周三/周五)，给药三周(共45ug)
  试验持续时间   80天
  评价参数   原发性肿瘤大小
  观察结果及结论   在受治动物中观察到显著的肿瘤生长抑制。两只小鼠显示肿瘤完全退化，在试验期间保持无肿瘤。
表6VB4～845重复剂量增加对具有免疫能力小鼠肝脏、脾脏及骨骼作用概要
  试验动物信息  小鼠、具有免疫能力的C57BL/6瑞士苏黎士大学医院内科医学肿瘤学区
  剂型  VB4-845：5ug(见下文)10ug20ug
  给药途径  静脉
  治疗方案  每隔一日5ug或10ug，给药三次(分别共15ug或30ug)每隔一日20ug，给药二次(共40ug)
  试验组  每组3只动物5组
  试验持续时间  7日
  评价参数  血浆ALT/AST(丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶)组织病理学结果肝脏、脾脏及骨骼
  观察结果及结论  在5ug或10ug剂量方案小鼠最后一次给药后24小时无肝酶升高。在20ug剂量给药的动物最后一次给药后24小时观察到ALT/AST升高。在5ug或10ug剂量组未发现组织病理学结果。在20ug治疗组发现几处坏死的肝细胞。任何剂量组在脾脏或全血标本细胞组分中未发现组织病理学变化或骨髓抑制。
                      表7VB4～845在小鼠试验使用的剂量与人用建议的低剂量及较高剂量之间的关系
  品系   单剂量暴露(ug/kg)小鼠   人剂量倍数(低/高剂量)1   每月总体暴露(ug/kg)小鼠   人每月剂量倍数(低/高剂量)2   总体暴露(ug/kg)小鼠   人总剂量倍数(低/高剂量)3
  裸鼠   250   862/63   2250   1585/113   2250   523/38
  裸鼠   500   1724/125   1500   1056/75   1500   349/25
  裸鼠   250   862/63   2250   1585/113   2250   523/38
  C57BL/小鼠   250   862/63   750   528/38   750   174/13
  C57BL/小鼠   500   1724/125   1500   1056/75   1500   349/25
  C57BL/小鼠   1000   3448/250   2000   1408/100   2000   465/33
10.29及4ug/kg分别为人用建议的低单剂量及较高单剂量，(即70kg的人给药20ug及280ug)
21.4及20ug/kg分别为人用建议的低月剂量及较高月剂量，(即70kg的人每日给药20ug及280ug，连续给药5日，有三周的洗出期)
34.3及60ug/kg分别为人用建议的低总剂量及较高总剂量，(即70kg的人每日给药20ug及280ug，连续给药5日，有三周的清除期，治疗三个周期)。
                            表8
  标本号   癌症分级   癌症分期   阳性膜染色   阳性细胞所占百分比％
  1   III   II   -   -
  2   III   II   是   40％
  3   III   II   -   -
  4   III   II   -   -
  5   III   II   -   -
  6   III   II   是   10％
  7   III   II   -   -
  8   III   II   是   40％
  9   III   III   是   70％
  10   III   III   -   -
  11   III   III   是   25％
  12   III   III   -   -
  13   III   III   是   30-40％
  14   III   III   -   -
  15   III   III   是   10％
  16   III   III   是   30％
  17   III   III   -   -
                               表9：膀胱癌细胞系特征
  参考文献号   膀胱癌细胞系   起源的原始肿瘤组织   肿瘤分级   肿瘤分期   分化程度
  1   1A6   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   好
  2   T-24   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   差
  3   SW-780   膀胱移行细胞癌   低   侵袭期   无相关资料
4 HT-1197 膀胱移行细胞癌 高 侵袭期 差
  5   RT-4   膀胱移行细胞癌   低   浅表(非侵袭期)   好
  6   ScaBER   膀胱鳞状上皮细胞癌   无相关资料   侵袭期   中度
  7   HT-1376   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   差
  8   TCCSUP   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   差
  9   J-82   膀胱鳞状上皮细胞癌   高   侵袭期   差
  10   UM-UC-3   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   差
  10   UM-UC-13   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   无相关资料
  11   UM-UC-10   无相关资料   无相关资料   无相关资料   无相关资料
  11   UM-UC-14   无相关资料   无相关资料   无相关资料   无相关资料
  1   5636   膀胱移行细胞癌   高   侵袭期   无相关资料
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                   表10：VB4-845肿瘤细胞表面反应性
  膀胱癌细胞系   反应性：荧光呈倍数增加1   细胞毒性作用IC50(pM)   细胞毒性作用：相对于CAL27的相对敏感度2
  1A6   154.7±15.2   0.033±0.01   8.8
  T-24   134.1±35.9   0.001±0.0   290
  UM-UC-10   124.6±5.3   0.024±0.00   12.1
  5637   97.0±11.2   0.38±0.13   0.8
  SW-780   86.7±3.1   0.002±0.00   145
  HT-1197   56.5±2.3   0.23±0.05   4.3
  RT-4   55.3±16.4   0.20±0.10   1.4
  ScaBER   54.0±2.1   10.1±0.0   0.03
  HT-1376   40.7±0.3   3.3±1.2   0.1
  UM-UC-14   25.7±1.2   0.17±0.2   1.6
  TCCSUP   2.0±0.1   320.0±102.0   0.0009
  J-82   1.2±0.1   ＞500   n/a
  UM-UC-3   1.2±0.1   ＞500   n/a
  UM-UC-13   1.3±0.1   ＞500   n/a
  CAL-27(阳性对照)   87.0±3.0   0.29±0.1   1.0
  COLO-320(阴性对照)   1.1±0.1   ＞500   n/a
1高于对照的中值荧光倍数增加，数值表达为：均数±SEM，抗体对给定的适应症的反应性通过在适应症每一细胞系计算中值荧光的平均增加倍数进行确定。
2细胞系呈现荧光的阳性移位小于30％(1.3倍增加)被认为是阴性。
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53.Di Paolo，C.，Willuda，J.，Kubetzko，S.，Lauffer，I.，Tschudi，D.，Waibel，R.，Pluckthun，A.，Stahel，R.A.，and Zangemeister-Witte，U.A recombinantimmunotoxin derived from a humanized Ep-CAM-specific single-chain antibodyfragment has potent and selective antitumor activity.(submitted)
54.Di Paolo，C.and Zangemeister-Witte.U.，Personal communication，Zurich.
55.Schümann，J.，Angermüller，S.，Bang，R.，Lohoff，M.，and Tiegs，G.Acutehepatotoxicity of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A in mice depends on T cellsand TNF.J.Immunol.，161：5745-5754，1998.
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缩写
ADME：  给药、分布、代谢及排泄
ADP：   二磷酸腺苷
ALT：   丙氨酸氨基转移酶(SGPT)
AST：   天冬氨酸氨基转移酶(SGOT)
BCA：   二辛可宁酸方法
Cmax：  最大浓度
DNA：   脱氧核糖核酸
Ep-CAM：上皮细胞细胞粘附分子
ETA：   假单胞菌外毒素A
EU：    内毒素单位
FACS：  荧光激活细胞分类方法
GLP：   最佳实验室管理规范
HNSCC： 头颈部鳞状细胞癌
IC50：  50％抑制浓度
i.t.：  瘤内注射
i.v.：  静脉注射
kDa：   千道尔顿
LAL：   鲎变形细胞溶解
MAbs：  单克隆抗体
Mg：    毫克
ML：    毫升
mM：    毫摩尔
MTD：   最大耐受剂量
MTT：   溴化二甲基噻唑二苯四唑
NaCl:  氯化钠
ng：    纳克
PBS：   磷酸盐缓冲盐水
pI：    等电点
PK：      药物代谢动力学
PM：      皮摩尔
p.t.：    肿瘤周围注射
s.c.：    皮下注射
scFv：    单链抗体可变区基因片段
SCLC：    小细胞肺癌
SD：      标准差
SDS PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳法
t1/2：   半衰期
Tmax：    最大浓度的时间
ug：      微克
VLS：     血管渗漏综合征
WHO：     世界卫生组织
wt：      野生型
上述具体实施方案不限制本发明的范围，本发明的许多修改(除了以上具体叙述的)，根据即时公开为本领域技术人员显而易见，这些修改放在附加的权利要求书范围内。所有上述引用的出版物及专利全部以参考文献形式合并在本文中。
                               序列表
<110>Zangemeister-Wittke，Uwe
     Di Paolo，Claudio
     Tschudi，Dominique C.
     Fitsialos，Dimitri
     Glover，Nicholas R.
<120>使用一种免疫毒素治疗癌症的方法
<130>10241-10
<150>60/466,608
<151>2003-04-30
<160>15
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2084
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VB4-845
<220>
<221>CDS
<222>(66)..(2084)
<223>
<400>1
gaattcctgc aggtctatgg aacgataaat gcccatgaaa attctatttc aaggagacag    60
tcata atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc    110
      Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu
      1               5                   10                  15
gct gcc caa cca gcg atg gcg cac cat cat cac cat cac gat atc cag      158
Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala His His His His His His Asp Ile Gln
                20                  25                  30
atg acc cag tcc ccg tcc tcc ctg agt gct tct gtt ggt gac cgt gtt      206
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
            35                  40                  45
acc atc acc tgc cgt tcc acc aaa tcc ctc ctg cac tcc aac ggt atc      254
Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile
        50                  55                  60
acc tac ctt tat tgg tat caa cag aaa ccg ggt aaa gct ccg aaa ctt      302
Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
    65                  70                  75
ctg atc tac cag atg tcc aac ctg gct tcc ggt gtt ccg tct cgt ttc      350
Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
80                  85                  90                  95
tcc agt tct ggt tct ggt acc gac ttc acc ctg acc atc tct tct ctg      398
Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
                100                 105                 110
cag ccg gaa gac ttc gct acc tac tac tgc gct cag aac ctg gaa atc      446
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile
            115                 120                 125
ccg cgt acc ttc ggt cag ggt acc aaa gtt gaa ctt aag cgc gct acc      494
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
        130                 135                 140
ccg tct cac aac tcc cac cag gtt cca tcc gca ggc ggt ccg act gct      542
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
    145                 150                 155
aac tct gga act agt gga tcc gaa gta cag ctg gtt cag tcc ggc ccg      590
Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
160                 165                 170                 175
ggt ctt gtt caa ccg ggt ggt tcc gtt cgt atc tct tgc gct gct tct      638
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser
                180                 185                 190
ggt tac acg ttc acc aac tac ggc atg aac tgg gtc aaa cag gct ccg      686
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro
            195                 200                 205
ggt aaa ggc ctg gaa tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggt gaa      734
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
        210                 215                 220
tcc acc tac gct gac tcc ttc aaa ggt cgc ttc act ttc tcc ctc gac    782
Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
    225                 230                 235
aca agt gct agt gct gca tac ctc caa atc aac tcg ctg cgt gca gag    830
Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu
240                 245                 250                 255
gat aca gca gtc tat tac tgc gcc cgt ttc gct atc aaa ggt gac tac    878
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr
                260                 265                 270
tgg ggt caa ggc acg ctg ctg acc gtt tcc tcg gaa ttt ggt ggc gcg    926
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Glu Phe Gly Gly Ala
            275                 280                 285
ccg gag ttc ccg aaa ccg tcc acc ccg ccg ggt tct tct ggt tta gag    974
Pro Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu
        290                 295                 300
ggc ggc agc ctg gcc gcg ctg acc gcg cac cag gcc tgc cac ctg ccg    1022
Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro
    305                 310                 315
ctg gag act ttc acc cgt cat cgc cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg    1070
Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
320                 325                 330                 335
gag cag tgc ggc tat ccg gtg cag cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg    1118
Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
                340                 345                 350
gcg cga ctg tca tgg aac cag gtc gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg    1166
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
            355                 360                 365
gcc agc ccc ggc agc ggc ggc gac ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag    1214
Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
        370                 375                 380
ccg gag cag gcc cgt ctg gcc ctg acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag    1262
Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu
    385                 390                 395
cgc ttc gtc cgg cag ggc acc ggc aac gac gag gcc ggc gcg gcc agc    1310
Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser
400                 405                 410                 415
gcc gac gtg gtg agc ctg acc tgc ccg gtc gcc gcc ggt gaa tgc gcg    1358
Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala
                420                 425                 430
ggc ccg gcg gac agc ggc gac gcc ctg ctg gag cgc aac tat ccc act    1406
Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr
            435                 440                 445
ggc gcg gag ttc ctc ggc gac ggt ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc    1454
Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg
        450                 455                 460
ggc acg cag aac tgg acg gtg gag cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa    1502
Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln
    465                 470                 475
ctg gag gag cgc ggc tat gtg ttc gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc    1550
Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu
480                 485                 490                 495
gaa gcg gcg caa agc atc gtc ttc ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag    1598
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln
                500                 505                 510
gat ctc gac gcg atc tgg cgc ggt ttc tat atc gcc ggc gat ccg gcg    1646
Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala
            515                 520                 525
ctg gcc tac ggc tac gcc cag gac cag gaa ccc gac gcg cgc ggc cgg    1694
Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
        530                 535                 540
atc cgc aac ggt gcc ctg ctg cgg gtc tat gtg ccg cgc tcc agc ctg    1742
Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu
    545                 550                 555
ccg ggc ttc tac cgc acc ggc ctg acc ctg gcc gcg ccg gag gcg gcg    1790
Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
560                 565                 570                 575
ggc gag gtc gaa cgg ctg atc ggc cat ccg ctg ccg ctg cgc ctg gac    1838
Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp
                580                 585                 590
gcc atc acc ggc ccc gag gag gaa ggc ggg cgc ctg gag acc att ctc    1886
Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu
            595                 600                 605
ggc tgg ccg ctg gcc gag cgc acc gtg gtg att ccc tcg gcg atc ccc    1934
Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro
        610                 615                 620
acc gac ccg cgc aac gtc ggt ggc gac ctc gac ccg tcc agc atc ccc    1982
Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser SerIle Pro
    625                 630                 635
gac aag gaa cag gcg atc agc gcc ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc    2030
Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro
640                 645                 650                 655
ggc aaa ccg ccg cat cac cac cat cac cat aaa gac gaa ctg tag tga    2078
Gly Lys Pro Pro His His His His His His Lys Asp Glu Leu
                660                 665
ctc gag                                                            2084
Leu Glu
670
<210>2
<211>669
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VB4-845
<400>2
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala His His His His His His Asp Ile Gln Met
            20                  25                  30
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
        35                  40                  45
Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr
    50                  55                  60
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
            100                 105                 110
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro
        115                 120                 125
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro
    130                 135                 140
Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly
                165                 170                 175
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly
        195                 200                 205
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser
    210                 215                 220
Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr
225                 230                 235                 240
Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                245                 250                 255
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp
            260                 265                 270
Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Glu Phe Gly Gly Ala Pro
        275                 280                 285
Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu Gly
    290                 295                 300
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu
305                 310                 315                 320
Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu
                325                 330                 335
Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala
            340                 345                 350
Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala
        355                 360                 365
Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro
    370                 375                 380
Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg
385                 390                 395                 400
Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser Ala
                405                 410                 415
Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly
            420                 425                 430
Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly
        435                 440                 445
Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly
    450                 455                 460
Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu
465                 470                 475                 480
Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu
                485                 490                 495
Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp
            500                 505                 510
Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu
        515                 520                 525
Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile
    530                 535                 540
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro
545                 550                 555                 560
Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly
                565                 570                 575
Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala
            580                 585                 590
Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly
        595                 600                 605
Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr
    610                 615                 620
Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp
625                 630                 635                 640
Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly
                645                 650                 655
Lys Pro Pro His His His His His His Lys Asp Glu Leu
            660                 665
<210>3
<211>254
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ep-CAM结合蛋白
<400>3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
                85                  90                  95
Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly
        115                 120                 125
Pro Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
    130                 135                 140
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys
                165                 170                 175
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr
            180                 185                 190
Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe
        195                 200                 205
Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu
    210                 215                 220
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys
225                 230                 235                 240
Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR1(L)
<400>4
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213人工序列
<220>
<223>CDR2(L)
<400>5
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR3(L)
<400>6
Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr
1               5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR1(H)
<400>7
Asn Tyr Gly Met Asn
1               5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR2(H)
<400>8
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR3(H)
<400>9
Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr
1               5
<210>10
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Tox1 primer
<400>10
ctcggaattc ggtggcgcgc cggagttccc gaaaccgtcc accccgccgg gttcttctgg    60
ttta                                                                 64
<210>11
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Tox2引物
<400>11
gtcaagcttc tacagttcgt ctttatggtg atggtggtga tgcggcggtt tcccgggctg    60
<210>12
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>12
ctagataacg agggcaaaaa atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg    60
gtttcgctac cgt                                                       73
<210>13
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>13
gccactgcaa tcgcgatagc tgtctttttc attttttgcc ctcgttat                   48
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
agcgcaggcc gaccaccatc atcaccatca cgat                                  34
<210>15
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>15
atcgtgatgg tgatgatggt ggtcggcctg cgctacggta gcgaaaccag ccagt           55

Claims (57)

1.有效量的免疫毒素在制备治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药剂的用途，其中所述免疫毒素包括：
(a)结合癌细胞上一种蛋白的配体，连接于(b)，
(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的配体结合癌细胞上的Ep-CAM。
3.权利要求1或2的用途，其中所述的配体为抗体或抗体片段。
4.根据权利要求3的用途，其中所述的抗体或抗体片段为鼠源、人源或嵌合抗体或抗体片段。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述的配体为人源化抗体或抗体片段。
6.根据权利要求5的用途，其中所述的人源化抗体或抗体片段结合人Ep-CAM的胞外域，并且含有从MOC-31抗体衍生的互补决定区(CDR)序列。
7.根据权利要求6的用途，其中所述的CDR序列如SEQ ID NOS：4-9所示。
8.根据权利要求3-7任一项的用途，其中所述的抗体片段为Fab、Fab′、(Fab′)2、scFv或dsFv片段。
9.根据权利要求5的用途，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-A。
10.根据权利要求5的用途，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-B。
11.根据权利要求7-10任一项的用途，其中所述的抗体片段为scFv片段。
12.根据权利要求3-11任一项的用途，其中所述的抗体片段具有如SEQ ID NO：3所示的序列或其变体。
13.根据权利要求3-11任一项的用途，其中所述的抗体或抗体片段结合人Ep-CAM的解离常数(KD)低于2.0×10-8。
14.根据权利要求1-13任一项的用途，其中所述的免疫毒素为VB4-845或其变体。
15.根据权利要求1-13任一项的用途，其中所述的免疫毒素为VB4-845。
16.根据权利要求15的用途，其中所述的免疫毒素具有如SEQ ID NO：2.所示的序列。
17.根据权利要求1-16任一项的用途，其另外包括一种或多种其它癌症治疗剂同时、单独或顺序给药，在制备治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药剂的用途。
18.根据权利要求1-17任一项的用途，其中所述的药剂直接用于癌症部位。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述的直接给药方法为瘤内给药、血管内或肿瘤周围给药。
20.根据权利要求1-19任一项的用途，其中所述的药剂以大约10-3000ug免疫毒素/肿瘤/日的剂量给药。
21.根据权利要求1-19任一项的用途，其中所述的药剂以大约20-1240ug免疫毒素/肿瘤/日的剂量给药治疗头颈鳞状上皮细胞癌。
22.根据权利要求20或21的用途，其中所述的药剂给药的一个周期由每日一次，1-7天组成。
23.根据权利要求22的用途，其中所述的药剂给药1-6个周期。
24.根据权利要求1-19任一项的用途，其中所述的药剂以大约100-2000ug免疫毒素/周的剂量给药治疗膀胱癌。
25.根据权利要求24的用途，其中所述的药剂给药的一个周期由每周给药一次组成。
26.根据权利要求25的用途，其中所述的药剂给药1-6个周期。
27.根据权利要求1-26任一项的用途，其中所述的毒素是核蛋白体钝化的多肽。
28.根据权利要求27的用途，其中所述的毒素选自由白树毒素、梫木毒素(bouganin)、皂草素、篦麻毒素、篦麻毒素A链、榄香胶素(bryodin)、白喉毒素及局限曲菌素组成的组。
29.根据权利要求27的用途，其中所述的毒素是假单胞菌外毒素A或其变体。
30.一种用于治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的试剂盒，其包括有效药量的免疫毒素，所述免疫毒素包括：
(a)结合癌细胞上一种蛋白的配体，连接于(b)，
(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素，以及其用于治疗癌症的使用说明书。
31.根据权利要求30的试剂盒，其中所述的配体结合癌细胞上的Ep-CAM。
32.根据权利要求30或31的试剂盒，其中所述的配体为抗体或抗体片段。
33.根据权利要求32的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段为鼠源、人源或嵌合抗体。
34.根据权利要求30-33任一项的试剂盒，其中所述的配体是人源化的抗体或抗体片段。
35.根据权利要求34的试剂盒，其中所述的人源化抗体或抗体片段结合人Ep-CAM的胞外域，并且包括来自MOC-31抗体的互补决定区(CDR)序列。
36.根据权利要求35的用途，其中所述的CDR序列如SEQ ID NOS：4-9所示。
37.根据权利要求32-36任一项的试剂盒，其中所述的抗体片段为Fab、Fab′、(Fab′)2、scFv或dsFv片段。
38.根据权利要求34的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-A。
39.根据权利要求34的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-B。
40.根据权利要求37-39任一项的试剂盒，其中所述的抗体片段为scFv片段。
41.根据权利要求32-40任一项的试剂盒，其中所述的抗体片段具有如SEQ ID NO：3所示的序列或其变体。
42.根据权利要求31-41任一项的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段以低于2.0×10-8的解离常数(KD)结合人Ep-CAM。
43.根据权利要求31-41任一项的试剂盒，其中所述的免疫毒素为VB4-845或其变体。
44.根据权利要求31-41任一项的试剂盒，其中所述的免疫毒素为VB4-845。
45.一种用于诊断头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的试剂盒，其包括结合癌细胞上一种蛋白的配体及其用于诊断癌症的使用说明书。
46.根据权利要求45的试剂盒，其中所述的配体结合癌细胞上的Ep-CAM。
47.根据权利要求45-46任一项的试剂盒，其中所述的配体为一种抗体或抗体片段。
48.根据权利要求47的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段为鼠源、人源或嵌合抗体。
49.根据权利要求45-48任一项的试剂盒，其中所述的配体是人源化抗体或抗体片段。
50.根据权利要求49的试剂盒，其中所述的人源化抗体或抗体片段结合人Ep-CAM的胞外域，并且含有从MOC-31抗体衍生的互补决定区(CDR)序列。
51.根据权利要求47-50任一项的试剂盒，其中所述的抗体片段为Fab、Fab′、(Fab′)2、scFv或dsFv片段。
52.根据权利要求51的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-A.。
53.根据权利要求51的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段来自4D5MOC-B。
54.根据权利要求50-53任一项所述的试剂盒，其中所述的抗体片段为scFv片段。
55.根据权利要求47-54任一项的试剂盒，其中所述的抗体片段具有如SEQ ID NO：3所示的序列或其变体。
56.根据权利要求46-55任一项的试剂盒，其中所述的抗体或抗体片段以低于2.0×10-8的解离常数(KD)结合人Ep-CAM。
57.一种用于治疗或预防头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌的方法包括：
(1)检测病人肿瘤标本疑与头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌有关的蛋白的表达，及
(2)与对照相比，如果肿瘤标本中蛋白呈较高水平表达，给予病人有效药量的免疫毒素，所述免疫毒素包括：
(a)结合癌细胞上一种蛋白的配体，连接于(b)，
(b)对癌细胞具有细胞毒性作用的毒素。
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