ES2639301T3 - Procedimientos de tratamiento de cáncer usando una inmunotoxina - Google Patents

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Claudio Di Paolo
Dominique Christine Tschudi
Nicholas Ronald Glover
Dimitri Peter Fitsialos
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Universitaet Zuerich
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Abstract

Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevención de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello administrándola directamente al sitio del cáncer por vía intratumoral o peritumoral y en el que dicha inmunotoxina comprende: (a) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM en la célula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotóxica para la célula cancerosa.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos de tratamiento de cancer usando una inmunotoxina Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a procedimientos para la prevencion o el tratamiento de cancer mediante la administracion a pacientes que tienen cancer, o en riesgo de tener cancer, una inmunotoxina que se une a un antigeno expresado de manera selectiva en la superficie de celulas cancerosas.
Antecedentes de la invencion
Recientemente, la inmunoterapia ha surgido como un enfoque nuevo potencialmente eficaz para combatir el cancer. Los anticuerpos murinos y humanizados/quimericos y sus respectivos fragmentos de anticuerpo dirigidos contra antigenos asociados a tumor ("TAA") se han usado para el diagnostico y la terapia de determinados canceres humanos.5"13 Las formas no conjugadas, conjugadas a toxina y radiomarcadas de estos anticuerpos se han usado en dichos tratamientos.
Un antigeno asociado a tumor de interes para la inmunoterapia es Ep-CAM (por Epithelial Cell Adhesion Molecule (molecula de adhesion celular epitelial), que tambien se conoce como 17-1A, KSA, EGP-2 y GA733-2). La Ep-CAM es una protema transmembranal que se expresa de forma elevada en muchos tumores solidos, incluidos carcinomas de pulmon, de mama, de ovario, colorrectales y carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello, pero que se expresa de forma debil en la mayor parte de los tejidos epiteliales normales. El papel de la Ep-CAM en la formacion de cancer permanece sin aclarar; no obstante, su expresion se correlaciona con la velocidad de proliferacion celular. Se han usado anticuerpos espedficos de Ep-CAM para realizar imagenes y detectar tumores primarios y metastasis en pacientes con cancer de pulmon de celula pequena y cancer de pulmon de celula no pequena. Entre los MAb (anticuerpos monoclonales) anti-Ep-CAM, PANOREX®, que es un anticuerpo monoclonal murino conocido tambien como edrecolomab, se ha aprobado para el tratamiento de cancer de colon en Alemania, y esta sujeto a ensayos clmicos en Estados Unidos.1 -15 Debe indicarse, sin embargo, que el tratamiento con PANOREX® se ha asociado con efectos secundarios no deseables, incluidos calambres abdominales, nauseas, diarrea transitoria y lesiones de urticaria cutaneas.3941 57, Los ensayos clmicos con otros anticuerpos dirigidos a Ep-CAM han sido menos exitosos; el anticuerpo BIS-1 se ha asociado con vasoconstriccion periferica, disnea y fiebre, y el anticuerpo 3622W94 se ha asociado con pancreatitis necrotizante aguda.36-38 La busqueda de un anticuerpo anti-Ep-CAM eficaz de baja toxicidad continua: se ha informado de un anticuerpo anti-Ep-CAM totalmente humanizado, MT201, pretendido para que actue mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo ("ADCC").58 Tambien se ha desarrollado un anticuerpo anti-Ep-CAM humanizado, estabilizado, monocatenario, 4D5MOC-B, que esta derivado del anticuerpo monoclonal murino MOC31, y se describe en la solicitud de patente internacional PCT/EP00/03176, publicacion N° WO 00/61635, presentada el 10 de abril de 2000 y publicada el 19 de octubre de 2000, y por Willuda y col.59 Estas publicaciones no divulgan el uso de anticuerpo humanizado en el tratamiento de carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello (HNSCC) o cancer de vejiga.
Como se ha indicado anteriormente, uno de los canceres asociados con la expresion aumentada de Ep-CAM es el carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello ("HNSCC"). La expresion de Ep-CAM se correlaciona con la evolucion del carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello en seres humanos. El HNSCC es actualmente el sexto cancer mas comun en el mundo. El HNSCC es una enfermedad que causa una morbididad significativa, especialmente con respecto a las funciones del habla y de deglucion. La cirugfa, la radioterapia, la quimioterapia o combinaciones de las mismas estan generalmente disponibles como opciones de tratamiento.
A pesar de todos los esfuerzos para curar pacientes afectados por HNSCC, la recafda sigue siendo la causa mas comun de fracaso (en el 40 % - 50 % de pacientes) despues de una terapia contra el cancer de la cabeza y el cuello. La terapia de ultimo recurso consiste en las mismas opciones de tratamiento que para la terapia de primera lmea. No obstante, la cirugfa paliativa es a menudo diffcil y causa desfiguraciones. Ademas, la radioterapia es raramente factible o beneficiosa, y la quimioterapia no mejora sustancialmente las tasas de supervivencia en pacientes con HNSCC. El pronostico para estos pacientes sigue siendo malo, de modo que la mediana de supervivencia despues de la recafda es solo de aproximadamente seis meses.
Debido al mal pronostico para estos pacientes con HNSCC, el efecto de esta enfermedad en la calidad de vida y las opciones limitadas de tratamiento, existe un interes considerable y una necesidad apremiante en el desarrollo de tratamientos espedficos del tumor novedosos, particularmente dirigidos a HNSCC.
El cancer de vejiga es el septimo cancer mas comun en el mundo que tiene como consecuencia 260.000 nuevos casos estimados cada ano. En Europa, esta enfermedad es la causa de muerte de aproximadamente 50.000 personas al ano. Los carcinomas del tejido de la vejiga aparecen casi completamente dentro del epitelio transicional, la capa o tejido superficial que encierra la vejiga, como carcinomas de celula transicional. En un diagnostico inicial, del 70 al 90 % de pacientes con canceres de vejiga tienen enfermedad superficial que implica carcinomas en la capa urotelial superficial que son no invasivos y muestran tumores papilares (proyecciones con forma de dedo). Los tratamientos actuales incluyen la administracion por via intravesicular de quimioterapia e inmunoterapia con la vacuna del bacilo Calmette-Guerin (BCG), lo que implica el riesgo adicional de infeccion sistemica con la bacteria de
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la tuberculosis. A pesar de este regimen de tratamiento agresivo, el 70 % de estos tumores papilares superficiales volveran a aparecer en una evolucion clmica prolongada, causando una morbididad significativa; aproximadamente del 4 al 8 % evolucionaran para dar carcinomas invasivos. Strome, S.E: y col. Clinical Cancer Research (2002) 8:281-286 ensena un modelo animal de tratamiento de HNSCC por medio de una inyeccion intratumoral de una inmunotoxina de IL-4. En respuesta a esta necesidad medica, existe una necesidad considerable de desarrollar nuevos tratamientos espedficos del tumor. Un enfoque novedoso es la terapia dirigida usando una inmunotoxina: un anticuerpo conjugado con una toxina. El anticuerpo se une espedficamente a celulas tumorales para suministrar la toxina para destruir de forma eficaz la celula tumoral.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a procedimientos novedosos para el tratamiento de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello administrando a un paciente que necesite tal tratamiento, una cantidad eficaz de una inmunotoxina recombinante que se une espedficamente a (y, por tanto, esta “dirigida a”) una protema en la superficie de las celulas cancerosas. Cuando se desee, la inmunotoxina se puede coadministrar, administrar simultaneamente y/o administrar de manera secuencial con uno u otros agentes anticancengenos mas, y/o en conjunto con radiacion o cirugfa.
La divulgacion tambien se refiere a procedimientos para prevenir, prevenir la recafda o reducir la tasa de recafda de un cancer, que comprenden administrar directamente una cantidad eficaz de una inmunotoxina en un sitio sospechoso de aparicion o recafda.
La divulgacion tambien se refiere a procedimientos para reducir el riesgo de complicaciones posquirurgicas que comprenden administrar directamente al sitio de cirugfa una cantidad eficaz de una inmunotoxina antes, durante y/o despues de cirugfa contra el cancer.
La divulgacion tambien se refiere a procedimientos para sensibilizar un tumor o cancer a otro producto terapeutico contra el cancer que comprenden administrar una cantidad eficaz de una inmunotoxina. El producto terapeutico contra el cancer adicional puede administrarse antes, de forma solapada con, concurrentemente y/o despues de la administracion de la inmunotoxina.
La inmunotoxina usada en los procedimientos terapeuticos de la invencion comprende (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Ep-Cam en la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para la celula cancerosa. La porcion (a) de union a la celula cancerosa puede estar unida a la porcion (b) de toxina, por ejemplo, mediante enlace qrnmico o enlace genetico.
Otras caractensticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada. Se entendera, no obstante, que la descripcion detallada y los ejemplos espedficos, aunque indican realizaciones preferentes de la invencion, se ofrecen solo a modo de ilustracion, ya que diversos cambios y modificaciones seran evidentes Para los expertos en la materia a partir de la presente descripcion detallada.
Breve descripcion de las figuras
La invencion se describira ahora con relacion a los dibujos en los que:
La Figura 1 es un esquema que muestra una plantilla para la administracion intratumoral de inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer a una masa tumoral.
Figura 2. (A) Mapa de VB4-845. El mapa representa la organizacion de las porciones de scFv 4D5MOCB y ETA252-608 unidas a inmunotoxina, asf como diversos dominios, incluidas las colas de histidina, senal PelB, regiones enlazantes, las regiones VLy Vh, regiones ETA II, Ib y II, y la senal de retencion en el RE. (B) Modelo tridimensional predictivo de 4D5MOCB-ETA. Se muestran la estructura del scFv (VL y VH), ETA252-608 (dominios II, Ib y III), el peptido enlazante y ambas colas de histidina.
Las Figuras 3A-D y las SEQ ID NO:1 y 2 muestran las secuencias de ADN y de aminoacidos de VB4-845. Las secuencias de nucleotidos y polipeptidos pueden dividirse en dominios que incluyen: la secuencia de senal para la expresion periplasmica, colas de histidina, dominios CDR 1,2 y 3, dominio VL, dominio VH, enlazadores, dominios ETA II, Ib, III y una senal de retencion en el RE KDEL.
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Figura 4. Efecto antitumoral de VB4-845 en xenoinjertos tumorales humanos . Ratones atfmicos que portan xenoinjertos tumorales positivos a Ep-CAM (HT29, SW2, CAL27) o un control negativo (COL0320 (o)) se trataron i.v. cada dos dfas con VB4-845 a 5 |jg (9 dosis (■)) o 10 |jg (3 dosis (▲)). El tamano del tumor se da con respecto a la mediana de tamano del tumor inicial de 160 mm3.
Figura 5. Tratamiento por via peritumoral de ratones atfmicos que portan xenoinjertos tumorales de CAL27. Ratones atfmicos que portan xenoinfertos tumorales de CAL27 positivos a Ep-CAM se trataron por via peritumoral cada dos dfas (lunes/miercoles/viernes) con VB4-845 a 5 jg (9 dosis). El tamano del tumor se da con respecto a la mediana de tamano del tumor inicial.
Figura 6. Funcion hepatica despues del tratamiento con VB4-845 (4D5MOCB-ETA). Para la comparacion, tambien se muestra la actividad de transaminasas de ratones tratados con una dosis unica mortal de ETA de tipo silvestre (85 jg/kg), tal como se describe por Schumann y col.55-56. Los datos se expresan como la media ± DT (n = 3). Figura 7. Resultados histopatologicos en tngado y bazo inducidos por VB4-845. Los drculos indican el area de
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hepatocitos necroticos en el grupo de dosificacion de 20 |jg. Definiciones
Como se usa en el presente documento, el termino “animal” incluye todos los miembros del reino animal, incluidos seres humanos. El animal es preferentemente un ser humano con HNSCC o cancer de vejiga.
Como se usa en el presente documento, la frase “productos terapeuticos contra el cancer” se refiere a compuestos o tratamientos que son eficaces en el tratamiento o la prevencion de cancer, incluidos, sin limitacion, agentes qmmicos, otros productos inmunoterapeuticos, vacunas contra el cancer, compuestos antiangiogenicos, determinadas citocinas, determinadas hormonas, terapia genica, radioterapia, cirugfa y terapia dietetica.
Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado deseado. Las cantidades eficaces de una inmunotoxina pueden variar segun factores tales como estado de la enfermedad, edad, sexo, peso del animal. Los regfmenes de dosificacion se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente tal como indiquen las exigencias de la situacion terapeutica.
Como se usa en el presente documento, la frase “anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado” significa que el anticuerpo o el fragmento comprende regiones estructurales humanas. La humanizacion de anticuerpos a partir de especies no humanas se ha descrito bien en la literatura. Vease, por ejemplo, el documento EP-B1 0239400 y Carter y Merchant 1997 (Curr Opin Biotechnol 8,449-454,1997).
Como se usa en el presente documento, la frase “la inmunotoxina se administra directamente al sitio del cancer” se refiere a la introduccion directa o sustancialmente directa que incluye, sin limitacion, inyecciones unicas o multiples de la inmunotoxina directamente en el tumor o por via peritumoral, la perfusion continua o discontinua en el tumor o por via peritumoral, la introduccion de un deposito en el tumor o por via peritumoral, la introduccion de un aparato de liberacion lenta en el tumor o por via peritumoral, introduccion de una formulacion de liberacion lenta en el tumor o por via peritumoral, la aplicacion directa al tumor, la inyeccion directa en una arteria que alimenta de forma sustancialmente directa la region del tumor, la inyeccion directa en un vaso linfatico que drena sustancialmente en la region del tumor, la introduccion directa o sustancialmente directa en una cavidad sustancialmente encerrada (por ejemplo, la cavidad pleural) o lumen (por ejemplo, por via intravesicular). "Peritumoral" es un termino que describe una region, dentro de aproximadamente 10 cm, preferentemente dentro de aproximadamente 5 cm, mas preferentemente 1 cm, de lo que se considera el lfmite del tumor, es decir, pero sin limitacion, el lfmite palpable de un tumor. "Administracion directa" en el contexto de prevencion de la aparicion o la prevencion de recafda se define como la administracion directamente al sitio de riesgo para el desarrollo o recafda de un cancer.
Como se usa en el presente documento, la frase “ligando que se une a una protema de la celula cancerosa” incluye cualquier molecula que pueda dirigir selectivamente la inmunotoxina a la celula cancerosa uniendose a una protema de las celulas cancerosas. La protema objetivo de la celula cancerosa es preferentemente un antfgeno asociado al tumor que se expresa a niveles mas elevados en la celula cancerosa en comparacion con celulas normales.
Como se usa en el presente documento, la expresion "anticuerpo MOC-31" significa el anticuerpo anti-Ep-CAM o anti-EGP-2 murino que es conocido en la tecnica y esta disponible de fuentes comerciales tales como BioGenex, N° de cat. MU316-UC, Zymed Laboratories Inc., N° de cat. 18-0270 o United States Biological, N° de cat. M4165.
Como se usa en el presente documento, el termino "4D5MOC-A" significa el anticuerpo scFv humanizado MOC31 que se ha injertado en el marco estructural de consenso humano artificial de scFv 4D5 tal como se describe en el documento WO 00/61635. Como se usa en el presente documento, el termino "4D5MOC-B" significa una variante estable de 4D5MOC-A que se ha preparado tal como se describe en el documento WO 00/61635.
Como se usa en el presente documento, el termino "VB4-845" significa una inmunotoxina que comprende a) el anticuerpo humanizado scFv 4D5MOC-B que esta fusionado a b) una forma truncada de exotoxina A de pseudomonas que consiste en los aminoacidos 252-608.
Como se usa en el presente documento, la frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere al uso clmico general y/o la aprobacion por parte de la agencia reguladora del Gobierno Federal o del estado, enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos, o la aceptacion general por los expertos en la tecnica en cuestion.
Como se usa en el presente documento, "condiciones fisiologicas" para la union de anticuerpos reflejan, pero no duplican necesariamente con exactitud, las condiciones en las que un polipeptido de union a Ep-CAM se encontrana en una molecula Ep-CAM in vivo. La union en condiciones fisiologicas debena predecir razonablemente la union que tendra lugar in vivo.
Como se usa en el presente documento, la frase “prevenir cancer” se refiere a la prevencion de la aparicion de cancer. En determinados casos, el tratamiento de prevencion reduce la recafda del cancer. En otros casos, el tratamiento de prevencion reduce el riesgo de un paciente de desarrollar un cancer, o inhibe la evolucion de un
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estado precanceroso (por ejemplo, un polipo en el colon) a una neoplasia maligna real.
Como se usa en el presente documento, la frase “dosis reducida” se refiere a una dosis que es inferior a la administrada normalmente y/o a la dosis recomendada. Las dosis administradas normalmente de un producto terapeutico contra el cancer pueden hallarse en materiales de referencia bien conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, la ultima edicion de la Physician's Desk Reference.
Como se usa en el presente documento, la frase “tratar el cancer” se refiere a la inhibicion de la replicacion de celulas cancerosas, la inhibicion de la expansion del cancer (metastasis), la inhibicion del crecimiento del tumor, la reduccion del numero de celulas cancerosas o del crecimiento del tumor, la reduccion del grado de tumores malignos de un cancer (por ejemplo, aumento de la diferenciacion), o la mejora de smtomas relacionados con el cancer.
Como se usa en el presente documento, el termino “variante” se refiere a cualquier derivado, analogo o fragmento farmaceuticamente aceptable de una inmunotoxina, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una toxina (por ejemplo, una toxina de Pseudomonas) o producto terapeutico contra el cancer descrito en el presente documento. Una variante tambien abarca uno o mas componentes de un multimero, multimeros que comprenden un componente individual, multfmeros que comprende multiples componentes individuales (por ejemplo, multfmeros de una molecula de referencia), un producto de desintegracion qrnmico y un producto de desintegracion biologico. En particular, en realizaciones no limitantes, una inmunotoxina puede ser una “variante” con respecto a una inmunotoxina de referencia en virtud de una alteracion o de alteraciones en la porcion de union a Ep-CAM y/o la porcion de toxina de la inmunotoxina de referencia. Por ejemplo, una inmunotoxina variante puede contener multfmeros de la porcion de anticuerpo y/o la porcion de toxina. Una variante de la porcion de toxina de la molecula conserva una toxicidad de al menos el 10 por ciento y preferentemente al menos el 30 por ciento en un ensayo estandar usado para medir la toxicidad de una preparacion de la toxina de referencia.
Una inmunotoxina variante que tiene una variacion de la porcion de union a Ep-CAM de la inmunotoxina de referencia compite con la union de un anticuerpo de referencia anti-Ep-CAM, en condiciones fisiologicas, en al menos el 10 por ciento y preferentemente al menos el 30 por ciento (y vease mas adelante). La competencia del 10 por ciento significa que, en un ensayo en el que una concentracion de saturacion de un anticuerpo de referencia anti-Ep-CAM se une a Ep-CAM, el l0 por ciento de estos anticuerpos de referencia unidos esta desplazado cuando se alcanza un equilibrio con una concentracion equivalente de la inmunotoxina anti-Ep-CAM variante que se esta analizando. Como ejemplo no limitante, la competencia entre anticuerpos, o entre un anticuerpo y una inmunotoxina, se mide (1) uniendo el anticuerpo de referencia anti-Ep-CAM marcado a Ep-CAM en la superficie de celulas, o an sustrato solido recubierto con Ep-CAM, de modo que virtualmente todos los sitios de Ep-CAM esten unidos al anticuerpo; (2) poniendo en contacto estos complejos anticuerpo-antfgeno con anticuerpo anti-Ep-CAM de ensayo no marcado o inmunotoxina de ensayo no marcada y (3) midiendo la cantidad de anticuerpo marcado desplazado de sitios de union de Ep-CAM, indicando la cantidad de anticuerpo marcado liberado la cantidad de competencia que ha tenido lugar.
Descripcion detallada de la invencion
Los inventores han demostrado que una inmunotoxina que comprende un fragmento de anticuerpo humanizado que se une al dominio extracelular de Ep-CAM humana unido a exotoxina A de Pseudomonas es eficaz en el tratamiento de carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello (HNSCC) y de cancer de vejiga. En particular, los inventores han demostrado que una inmunotoxina que comprende un fragmento de anticuerpo estabilizado y humanizado recombinante Fv monocatenario a Ep-CAM que se ha fusionado con una forma truncada de exotoxina A (ETA) de Pseudomonas que carece del dominio de union a celulas es citotoxico contra celulas de HNSCC y de cancer de vejiga. Esta inmunotoxina se une a Ep-CAM expresada en celulas cancerosas. Una vez se ha unido, la inmunotoxina se internaliza y la exotoxina A de pseudomonas bloquea la smtesis de protemas, causando de este modo la muerte celular. Es importante que ya que la mayor parte de las celulas de mucosa y fibroblastos normales no expresan ampliamente Ep-CAM y, por lo tanto, no pueden internalizar la inmunotoxina, estan protegidas del efecto destructor de la exotoxina.
En consecuencia, en una realizacion. la presente invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento o prevencion de carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello que comprende administrar a un animal con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Ep-Cam en la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas. La presente invencion tambien proporciona un uso de una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Ep-Cam en la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas para tratar o prevenir un carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello. La presente invencion tambien proporciona un uso de una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Ep-Cam en la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir un carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello.
En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevencion de
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cancer de vejiga que comprende administrar a un animal con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un ligando que se une a una protema de la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas. La presente divulgacion tambien proporciona un uso de una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un ligando que se une a una protema de la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas para tratar o prevenir el cancer de vejiga. La presente divulgacion tambien proporciona un uso de una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende: (a) un ligando que se une a una protema de la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir un cancer de vejiga.
El ligando que se une a una protema de la celula cancerosa puede ser cualquier molecula que puede dirigir de forma selectiva la inmunotoxina a las celulas de cancer. En una realizacion, el ligando se une a un anffgeno asociado al tumor. Los ejemplos de protemas que se expresan en celulas de HNSCC incluyen el receptor de IL-4, el receptor de EGF, la protema de superficie HER21 neu y Ep-CAM. Los ejemplos de protemas que se expresan en celulas de cancer de vejiga incluyen el receptor de EGF, gp54 y Ep-CAM. En una realizacion espedfica, el ligando se une a Ep- CAM.
En una realizacion preferida, el ligando es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo que pueden usarse incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv y dsFv de fuentes recombinantes y/o producidos en animales transgenicos. El anticuerpo o fragmento puede ser de cualquier especie, incluidos ratones, ratones, conejos, hamsteres y seres humanos. Los derivados de anticuerpo quimerico, es decir, moleculas de anticuerpo que combinan una region variable de animal no humano y una region constante humana se contemplan tambien dentro del ambito de la invencion. Las moleculas de anticuerpo quimerico pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos humanizados que comprenden el dominio de union a anffgeno de un anticuerpo de un raton, rata u otras especies, con regiones constantes humanas. Pueden usarse procedimientos convencionales para producir anticuerpos quimericos. (Vease, por ejemplo, Martinet y col., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81,6851 (1985); Takeda y col., Nature 314, 452 (1985), Cabilly y col., patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Boss y col., patente de Estados Unidos N° 4.816.397; Tanaguchi y col., publicacion de patente europea EP171496; publicacion de patente europea 0173494, patente del Reino Unido GB 2177096B). La preparacion de anticuerpos humanizados se describe en el documento EP-B 10 239400. Tambien pueden producirse comercialmente anticuerpos humanizados (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretana.). Se espera que los anticuerpos quimericos sean menos inmunogenos en un sujeto humano que el anticuerpo no quimerico correspondiente. Los anticuerpos humanizados pueden estabilizarse adicionalmente, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 00/61635.
Tambien pueden generarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos espedficos, protemas reactivas sobre HNSCC o las celulas de cancer de vejiga cribando bibliotecas de expresion que codifican genes de inmunoglobulina, o porciones de los mismos, expresados en bacterias con peptidos producidos a partir de moleculas de acidos nucleicos que codifican las protemas. Por ejemplo, pueden expresarse fragmentos Fab, regiones VH y regiones FV en bacterias usando bibliotecas de expresion en fagos (vease, por ejemplo, Ward y col., Nature 341, 544-546: (1989); Huse y col., Science 246, 1275-1281 (1989); y McCafferty y col. Nature 348, 552-554 (1990)). Alternativamente, un raton SCID-hu, por ejemplo el modelo desarrollado por Genpharm, puede usarse para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.
La porcion de ligando de la inmunotoxina puede estar derivada de inmunoglobulina, es decir, puede rastrearse hasta una molecula inicial que es una inmunoglobulina (o anticuerpo). Por ejemplo, el ligando puede producirse por modificacion de un esqueleto de inmunoglobulina usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica. En otro ejemplo no limitante, los dominios de inmunoglobulina (por ejemplo, las cadenas variables pesada y/o ligera) pueden unirse a un esqueleto que no sea de inmunoglobulina. Ademas, el ligando puede desarrollarse, sin limitacion, mediante reaccion qmmica o diseno genetico. En consecuencia, en un ejemplo no limitante, una inmunotoxina puede comprender (1) un polipeptido derivado de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo seleccionado de una biblioteca de anticuerpos), o una variante del mismo, que se une espedficamente a HNSCc o a celulas de cancer de vejiga y (2) una toxina o variante de la misma. Dichos ligandos de polipeptido de inmunoglobulina pueden redisenarse para afectar a sus caractensticas de union a una molecula diana asociada a tumor, o para mejorar sus caractensticas ffsicas, por ejemplo.
No es necesario que la porcion de ligando de la inmunotoxina este basada en inmunoglobulina. En consecuencia, una inmunotoxina puede comprender (1) un polipeptido que no sea de inmunoglobulina (por ejemplo, Affibody®)), o una variante del mismo, que se une espedficamente a HNSCC o a celulas de cancer de vejiga y (2) una toxina o variante de la misma. Dichos ligando de polipeptido que no son de inmunoglobulina pueden disenarse para que se unan a moleculas diana asociadas a tumor. Ademas, pueden manipularse geneticamente ligandos de polipeptido que no son de inmunoglobulina hasta una afinidad o una avidez deseada y pueden disenarse para que toleren una diversidad de condiciones ffsicas, incluidos intervalos de pH extremos y temperaturas relativamente elevadas.
De hecho, para usar en una composicion farmaceutica, el diseno de un polipeptido que no es de inmunoglobulina con una semivida relativamente larga en condiciones fisiologicas (por ejemplo, 37 °C en presencia de peptidasas) puede ser ventajoso. Ademas, dichas moleculas, o variantes de las mismas, pueden demostrar una buena solubilidad, tamano pequeno, plegamiento apropiado y pueden expresarse en sistemas bacterianos de bajo coste facilmente disponibles, y fabricarlas de este modo en cantidades comercialmente razonables. La capacidad para
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disenar un polipeptido que no sea de inmunoglobulina esta dentro de la capacidad de un experto. Veanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.831.012 y 6.534.628 para tecnicas adaptables, en general, para disenar, fabricar y seleccionar asociados de union deseados.
Los ejemplos de polipeptidos de union a epitope incluyen, sin limitacion, ligados que comprenden un dominio de fibronectina de tipo III (veanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales N° WO 01/64942, WO 00/34784, WO 02/32925). Las bibliotecas de afinidad basadas en protema A tambien se han usado para identificar polipeptidos de union a epitope (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.831.012 y 6.534.628) y dichas bibliotecas pueden ser utiles segun la presente divulgacion para seleccionar polipeptidos que se unan selectivamente a celulas de HNSCC o de cancer de vejiga.
Otros tipos de moleculas de union que son conocidas en la tecnica incluyen, sin limitacion, moleculas de union basadas en el ensamblaje de dominios de protemas repetidos (vease, por ejemplo, Forrer y col., 2003, "A novel strategy to design binding molecules harnessing the modular nature of repeat proteins." FEBS Lett. 539:2-6; Kohl y col., 2003, "Designed to be stable: crystal structure of a consensus ankyrin repeat protein." Proc Natl Acad Sci USA. 100:1700-1705). Las bibliotecas de dominios repetidos ensamblados aleatoriamente pueden ser utiles segun la presente divulgacion para seleccionar ligandos que se unan selectivamente a celulas de HNSCC o de cancer de vejiga.
Varios polipeptidos de union a epitope no basados en inmunoglobulina y procedimientos para fabricar y usar dichos polipeptidos son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Eklund y col., 2002, "Anti-idiotypic protein domains selected from Protein A-based affibody libraries." Prot. Struct. Funct. Gen. 48:454-462; Gunneriusson y col., 1999, "Affinity maturation of a Taq DNA polymerase specific affibody by helix shuffling." Prot. Eng. 12:873-878; Hansson y col., 1999, "An in vitro selected binding protein (affibody) shows conformation-dependent recognition of the respiratory syncytial virus (RSV) G protein." Immunotechnol. 4: 237-252; Henning y col., 2002, "Genetic modification of adenovirus 5 tropism by a novel class of ligands based on a three-helix bundle scaffold derived from staphylococcal protein A." Human Gene Therapy 13:1427-1439; Hogbom y col., 2003, "Structural basis for recognition by an in vitro evolved affibody. Proc Natl Acad Sci USA. 100(6):3191-3196; Nord y col., 1997, "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an -helical bacterial receptor domain." Nature Biotechnol. 15:772777; Nord y col., 2000, "Ligands selected from combinatorial libraries of protein A for use in affinity capture of apolipoprotein A-1M and Taq DNA polymerase." J. Biotechnol. 80:45-54; Nord y col., 1995, "A combinatorial library of an alpha-helical bacterial receptor domain." Prot. Eng. 8:601-608; Nord y col., 2001, "Recombinant human factor VIII- specific affinity ligands selected from phage-displayed combinatorial libraries of protein A." Eur. J. Biochem. 268:110; Nygren y col., 1997, "Scaffolds for engineering novel binding sites in proteins." Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469; Ronnmark y col., 2002, "Human immunoglobin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A." Eur. J. Biochem. 269:2647-2655; Ronnmark y col., 2002, "Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli." J. Immunol. Meth. 261:199-211; Wahlberg y col., 2003, "An affibody in complex with a target protein: structure and coupled folding." Proc Natl Acad Sci USA. 100(6):3185-3190; Gotz y col., 2002, "Ultrafast electron transfer in the complex between fluorescein and a cognate engineered lipocalin protein, a socalled anticalin." Biochemistry. 41:4156-4164; Skerra, 2001, "Anticalins: a new class of engineered ligand-binding proteins with antibody-like properties." J Biotechnol. 2001 74:257-275; Skerra, 2000, "Lipocalins as a scaffold." Biochim Biophys Acta. 1482:337-350; Skerra y col., 2000, "Engineered protein scaffolds for molecular recognition." J Mol Recognit. 13:167-187; Schlehuber y col., 2000, "A novel type of receptor protein, based on the lipocalin scaffold, with specificity for digoxigenin." J Mol Biol. 297:1105-1120; Beste y col., 1999, "Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold." Proc Natl Acad Sci USA. 96:1898-1903; publicacion internacional PCT N° WO97/45538 titulado "Novel Synthetic Protein Structural Templates For The Generation, Screening And Evolution Of Functional Molecular Surfaces" (con respecto a la produccion de bibliotecas de secuencias de peptidos en el marco estructural de una plantilla estructural derivada de dominios de homologfa con pleckstrina (PH))).
Los canceres que pueden tratarse segun la divulgacion incluyen, sin limitacion, cualquier tipo de HNSCC o cancer de vejiga siempre que las celulas afectadas muestren una expresion aumentada de una protema que pueda actuar como diana en la superficie celular. Los tumores o las celulas tumorales pueden evaluarse para determinar su susceptibilidad a los procedimientos de tratamiento de la divulgacion, por ejemplo obteniendo una muestra de tejido tumoral o celulas tumorales y determinando la capacidad de la muestra para unirse a la porcion de ligando de la inmunotoxina. En una realizacion, la protema de las celulas cancerosas es Ep-CAM. La expresion en la superficie celular de Ep-CAM puede inducirse, o elevarse, mediante un agente que aumenta los niveles en estado estacionario de Ep-CAM en la superficie celular en tejidos precancerosos o cancerosos.
En consecuencia, la presente divulgacion incluye procedimientos de diagnostico y kits que pueden usarse antes del procedimiento terapeutico de la invencion para determinar si HNSCC o el cancer de vejiga expresa, o no, niveles de la protema que se une mediante el ligando a la inmunotoxina. Por lo tanto, en una realizacion adicional, la presente divulgacion incluye un procedimiento de tratamiento o de prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello o cancer de vejiga que comprende:
(1) analizar una muestra de tumor procedente de un paciente para determinar la expresion de una protema
sospechosa de estar asociada con el carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello o el cancer de vejiga;
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(2) si la protema se expresa a niveles superiores en la muestra de tumor en comparacion con un control,
administer al paciente una cantidad eficaz de inmunotoxina que comprende:
(a) un ligando que se une a la protema de la celula cancerosa unido a;
(b) una toxina que es citotoxica para la celula cancerosa.
La presente divulgacion tambien incluye un kit para diagnosticar carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello o cancer de vejiga que comprende un ligando que se une a una protema de la celula cancerosa e instrucciones para usar el mismo para diagnosticar el cancer.
En realizaciones preferentes no limitantes, el cancer no puede tratarse mediante administracion directa de la inmunotixina. Por ejemplo, una masa tumoral diana puede estar cercana a la superficie de la piel. En otro ejemplo, un tejido enfermo puede estar encapsulado por un quiste, o se encuentra en una cavidad sustancialmente cerrada que incluye, sin limitacion, un lumen (por ejemplo, vejiga). (Mas detalles sobre la administracion directa se proporcionan mas adelante en la divulgacion.)
En otras realizaciones, el cancer no puede tratarse mediante administracion intravenosa de la inmunotixina.
La divulgacion tambien proporciona procedimientos para reducir el riesgo de complicaciones posquirurgicas que comprenden administrar una cantidad eficaz de una inmunotoxina antes, durante o despues de la cirugfa, y en realizaciones espedficas no limitantes, cirugfa para tratar el cancer.
La divulgacion tambien proporciona procedimientos para prevenir la aparicion, para prevenir o retrasar la recafda o reducir la tasa de recafda de HNSCC o cancer de vejiga que comprende administrar directamente a un paciente con necesidad de ello una cantidad eficaz de una inmunotoxina.
La divulgacion tambien proporciona procedimientos para sensibilizar un tumor o cancer a uno o mas productos terapeuticos contra el cancer adicionales que comprenden administrar una inmunotoxina de la divulgacion. En una realizacion no limitante, el otro producto terapeutico contra el cancer comprende otra inmunotoxina dirigida a Ep- CAM. En otra realizacion no limitante, el otro producto terapeutico contra el cancer comprende radiacion. El otro producto terapeutico contra el cancer puede administrarse antes, en forma solapada a, concurrentemente a y/o despues de la administracion de la inmunotoxina. Cuando se administran concurrentemente, la inmunotoxina y otro producto terapeutico contra el cancer pueden administrarse en una formulacion unica o en formulaciones separadas, y si se hace de forma separada, entonces, opcionalmente, mediante modos diferentes de administracion. En consecuencia, la combinacion de una o mas inmunotoxinas y uno o mas productos terapeuticos contra el cancer adicionales puede actuar de forma sinergica para combatir el tumor o cancer.
Cuando se administra una inmunotoxina de la invencion ademas de uno o mas agentes terapeuticos contra el cancer adicionales, estos productos terapeuticos contra el cancer adicionales pueden incluir, sin limitacion, 2,2',2"triclorotrietilamina, 6-azauridina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, 6-mercaptopurina, aceglarona, aclacinomicina actinomicina, altretamina, aminoglutetimida, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, ancitabina, oligonucleotico antisentido de angiogenina, antramicina, azacitidina, azaserina, aziridina, batimastar, oligonucleotico antisentido de bcl-2, benzodepa, bicalutamida, bisantreno, bleomicina, buserelina, busulfan, cactinomicina, calusterona, carboplatino, carbocuona, carmofur, carmustina, carubicina, carzinofilina, clorambucilo, clorafazina, acetato de clormadinona, clorozotocina, cromomicinas, cisplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, defosfamida, demecolcina, denopterina, diazicuona, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, droloxifeno, dromostanolona, edatrexato, eflomitina, acetato de eliptinio, emitefur, enocitabuna, epirrubicina, epitiostanol, estramustina, etoglucido, etoposido, fadrozol, fenretinida, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, flutamida, acido folmico, formestano, fosfestrol, fotemustina, nitrato de galio, gemcitabina, goserelina, hexestrol, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, improsulfan, interferon-alfa, interferon-beta, interferon-gamma, interleucina-2, L-asparaginasa, lentinano, letrozol, leuprolida, lomustina, lonidamina, manomustina, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melengestrol, melfalan, menogarilo, mepitiostano, metotrexato, meturedepa, miboplatino, miltefosina, mitobronitol, mitoguazona, mitolactol, mitomicinas, mitotano, mitoxantrona, mopidamol, acido micofenolico, nilutamida, nimustina, nitracina, nogalamicina, novembiquina, olivomicinas, oxaliplatino, paclitaxel, pentostama, peplomicina, perfosfamida, fenamet, fenesterina, pipobroman, piposulfan, pirarrubicina, piritrexim, plicamicina, 2-etil-hidrazida del acido podofilmico, fosfato de poliestradiol, porfimer sodico, porfiromicina, prednimustina, procabazina, propagermanio, PSK, pteropterina, puromicina, ranimustina, razoxano, roquinimex, sizofican, sobuzoxano, espirogermanio, estreptonigrina, estreptozocina, tamoxifeno, tegafur, temozolomida, teniposido, acido tenuzonico, testolacona, tiamiprina, tioguanina, Tomudex, topotecan, toremifeno, triazicuona, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trilostano, trimetrexato, triptorelina, trofosfamida, trontecan, tubercidina, ubenimex, mostaza de uracilo, uredepa, uretano, vinblastina, vincristina, zinostatina y zorubicina, citosina arabinosido, gemtuzumab, tioepa, ciclotosfamida, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, fludarabina, gemcitabina, dacarbacina, temozoamida), hexametilmelamina, LYSODREN, analogos de nucleosido, alcaloides vegetales (por ejemplo, Taxol, paclitaxel, camptotecina, topotecan, irinotecan (CAMPTOSAR,CPT-11), vincristina, alcaloides de vinca tales como vinblastina) podofilotoxina, epipodofilotoxina, VP-16 (etoposido), citocalasina B,
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gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina), doxorrubicina liposomal, dihidroxiantracindiona, mitramicina, actinomicina D, aldesleucina, alutamina, biaomicina, capecitabina, carboplatino, clorabusina, ciclarabina, daclinomicina, floxurida, acetato de lauprolida, levamisol, lomuslina, mercaptopurino, mesna, mitolanc, pegaspergasa, pentoslatina, picamicina, riuxlmab, campat-1, estraplozocina, tretinoma, oligonucleotidos antisentido de VEGF, vindesina y vinorelbina. Tambien se contemplan en la presente invencion composiciones que comprenden uno o mas productos terapeuticos contra el cancer (por ejemplo, FLAG, CHOP). FLAG comprende fludarabina, citosina arabinosido (Ara-C) y G-CSF. CHOP comprende ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona. Para una lista completa de productos terapeuticos contra el cancer conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, la ultima edicion del mdice de Merck y la Physician's Desk Reference. Asimismo, la inmunotoxina de la invencion puede usarse junto con radioterapia u otras modalidades terapeuticas contra el cancer conocidas.
Las composiciones farmaceuticas para terapia de combinacion tambien pueden incluir, sin limitacion, antibioticos (por ejemplo, dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina), asparaginasa, Bacillus y Guerin, toxina de difteria, procama, tetracama, lidocama, propranolol, agentes antimitoticos, abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activado de plasminogeno tisular, agentes antihistammicos, agentes antinauseas, etc.
De hecho, la administracion directa de una cantidad eficaz de una inmunotoxina a un paciente con necesidad de dicho tratamiento puede dar como resultado dosis reducidas de otro producto terapeutico contra el cancer que tenga eficacia clmicamente significativa. Dicha eficacia de la dosis reducida del producto terapeutico contra el cancer adicional no puede observarse sin la administracion con una inmunotoxina. En consecuencia, la presente divulgacion proporciona procedimientos para tratar un tumor o cancer que comprende administrar una dosis reducida de uno o mas productos terapeuticos adicionales.
Ademas, la terapia de combinacion que comprende administrar una inmunotoxina a un paciente con necesidad de dicho tratamiento puede permitir tiempos de tratamiento relativamente cortos en comparacion con la duracion o el numero de ciclos de regfmenes de tratamiento estandar. En consecuencia, la presente divulgacion proporciona procedimientos para tratar un tumor o un cancer que comprenden administrar uno o mas productos terapeuticos contra el cancer adicionales durante un periodo relativamente corto y/o en menos ciclos de tratamiento.
Asf, segun la presente invencion, las terapias de combinacions que comprenden una inmunotoxina y otro producto terapeutico contra el cancer pueden reducir la toxicidad (es decir, los efectos secundarios) del tratamiento contra el cancer general. Por ejemplo, una toxicidad reducida, en comparacion con una monoterapia u otra terapia de combinacion, puede observarse cuando se administra una dosis reducida de inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer, y/o cuando se reduce la duracion de un ciclo (es decir, el periodo de una administracion unica o el periodo de una serie de dichas administraciones), y/o cuando se reduce el numero de ciclos.
En una realizacion preferida, la invencion se refiere a procedimientos para tratar y/o mejorar el estado clmico de pacientes que padecen HNSCC. En consecuencia, la invencion se refiere a procedimientos para (i) reducir el tamano del tumor de HNSCC, la velocidad de crecimiento, la invasividad, el grado de malignidad y/o el riesgo de recafda, (ii) prolongar el intervalo carente de enfermedad despues del tratamiento y/o (iii) mejorar la funcion de la respiracion, la deglucion y/o el habla en un paciente con HNSCC, comprendiendo la administracion al paciente de una cantidad eficaz de una inmunotoxina. La mejora clmica puede determinarse subjetiva u objetivamente, por ejemplo evaluando la capacidad del sujeto para respirar con menos dificultad, la capacidad del sujeto para deglutir lfquidos frente a solidos, el grado de obstruccion, la calidad o volumen del habla y otros indices conocidos en las tecnicas clmicas.
En otra realizacion preferente, la divulgacion proporciona procedimientos para tratar y/o mejorar el estado clmico de pacientes que padecen carcinoma de celula transicional superficial de la vejiga. En consecuencia, la divulgacion proporciona procedimientos para (i) reducir el tamano del tumor de carcinoma de vejiga, la velocidad de crecimiento, la invasividad, el grado de malignidad y/o el riesgo de recafda, (ii) prolongar el intervalo carente de enfermedad despues de otro tratamiento y/o (iii) curar la enfermedad en un paciente con carcinoma de celula transicional de la vejiga, que comprenden la administracion al paciente de una cantidad eficaz de una inmunotoxina. La mejora clmica puede determinarse, por ejemplo, mediante evaluacion citologica, citoscopia o biopsia de un modo conocido en las tecnicas clmicas.
Como se ha mencionado previamente, una inmunotoxina de la divulgacion comprende: (a) un ligando que se une a una protema de la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para la celula cancerosa. El ligando puede “unirse” a la diana mediante cualquier medio por el que el ligando pueda asociarse con, o unirse a, la toxina. Por ejemplo, el ligando puede unirse a la toxina por medios qmmicos o recombinantes. Se conocen en la tecnica medios qmmicos para preparar fusiones o conjugados y pueden usarse para preparar la inmunotoxina. El procedimiento usado para conjugar el ligando y la toxina debe ser capaz de unir el ligando con la toxina sin interferir en la capacidad del ligando para unirse a la molecula diana de la celula cancerosa.
En una realizacion, el ligando y la toxina son ambas protemas y pueden conjugarse usando tecnicas bien conocidos en la tecnica. Existen varios cientos de reticulantes disponibles que pueden conjugar dos protemas. (Vease, por
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ejemplo, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking". 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). El reticulante se elige generalmente en base a los grupos funcionales reactivos disponibles o insertados en el ligando o la toxina. Ademas, si no hay grupos reactivos puede usarse un reticulante fotoactivable. En determinados casos puede ser deseable incluir un espaciador entre el ligando y la toxina. Los agentes reticulantes conocidos en la tecnica incluyen los agentes homobifuncionales: glutaraldelddo, adipimidato de dimetilo y bis(diazobenzidina) y los agentes heterobifuncionales: m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida y sulfo-m-maleimidobenzoil-N-
hidroxisuccinimida.
Una fusion de protema ligando protema-toxina tambien puede prepararse usando tecnicas de ADN recombinantes. En dicho caso, una secuencia de ADN que codifica el ligando se fusiona a una secuencia de ADN que codifica la toxina, dando como resultado una molecula de ADN quimerico. La secuencia de ADN quimerico se transfecta a una celula huesped que expresa la protema de fusion ligando-toxina. La protema de fusion puede recuperarse del cultivo celular y purificarse usando tecnicas conocidas en la tecnica.
Preferentemente, el ligando se une a Ep-CAM. En una realizacion, la inmunotoxina comprende (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM de la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas. (Esta inmunotoxina se denomina a veces "inmunotoxina dirigida a Ep-CAM" en el presente documento.) En una realizacion espedfica, la inmunotoxina comprende (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado que se une al dominio extracelular de Ep-CAM humano y comprende secuencias de region determinante de la complementariedad (CDR) derivadas de anticuerpo MOC-31 unido a; (b) una toxina que es citotoxica para las celulas cancerosas. Las secuencias de CDR del anticuerpo 4D5MOC-B se muestran en las SEQ ID NO: 4-9.
Las inmunotoxinas dirigidas a Ep-CAM segun la invencion incluyen, sin limitacion, VB4-845 y variantes de la misma, otras inmunotoxinas que comprenden la region variable de MOC31 o variantes de las mismas, asf como inmunotoxinas que comprenden otras inmunoglobulinas de cadena sencilla o doble que se unen selectivamente a Ep-CAM, or variantes de las mismas.
En una realizacion, la porcion de union a Ep-CAM comprende una molecula de inmunoglobulina completa. En otra realizacion, la porcion de union a Ep-CAM es un dfmero de Fab, Fab', scFv, fragmentos de anticuerpos de dominio unico o fragmentos Fv estabilizados con disulfuro. En otra realizacion, la porcion de union a Ep-CAM comprende una cadena pesada variable, una cadena ligera variable, Fab, Fab', scFv, fragmentos de anticuerpos de dominio unico o fragmentos Fv estabilizados con disulfuro. Las porciones de la molecula de union a Ep-CAM pueden estar derivadas de una o mas especies, comprendiendo preferentemente porciones derivadas de la especie humana y, mas preferentemente, son completamente humanas o estan completamente humanizadas. Las regiones disenadas para facilitar la purificacion o para la conjugacion a la toxina tambien pueden incluirse o anadirse a la porcion de union a Ep-CAM.
En una realizacion espedfica no limitante, la inmunotoxina comprende VB4-845 como se muestra en la SEQ ID NO:2. En otras realizaciones no limitantes, la inmunotoxina comprende una variante de VB4-845. Una variante de VB4-845 se une al mismo epitope de Ep-CAM o a un epitope de Ep-CAM sustancialmente similar que se una a VB4- 845, y la variante puede inhibir competitivamente la union de VB4-845 a Ep-CAM, en condiciones fisiologicas, en al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 %. Una variante de VB4-845 puede comprender el mismo fragmento de exotoxina A de Pseudomonas que VB4-845, o puede comprender una porcion diferente de la misma exotoxina o una toxina diferente.
En otra realizacion no limitante, la inmunotoxina comprende una porcion de union a Ep-CAM que comprende la region variable de MOC31 o una variante de la misma. En otra realizacion mas, la inmunotoxina comprende una porcion de union a Ep-CAM que comprende 4D5MOCB o una variante del mismo. La union de cualquiera de estas inmunotoxinas a Ep-CAM puede reducirse en al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % mediante competencia con el anticuerpo MOC31 o 4D5MOCB de referencia en condiciones fisiologicas. La afinidad de VB4-845 es Kd =1,6 x10-8, usando citometria de flujo indirecta en celulas vivas. El analisis de Lineweaver-Burke (Cuaderno de datos: 0935, pagina 50) se realizo usando el procedimiento de Benedict y col. (1997). J. Immunol. Methods, 201:223-231. La afinidad de MOC31B, tal como se describe por Willuda y col. (Cancer Research 59, 5758-5767, 1999) es Kd = 3,9 x 10-9, medida usando RIA y Biacore tal como se describe en procedimientos. En consecuencia, la presente invencion incluyen inmunotoxinas que tienen una constante de disociacion (Kd) inferior a 2,0x10-8.
Alternativamente, la inmunotoxina comprende una porcion de union a Ep-CAM diferente de las que se han tratado en los parrafos anteriores, pero que se una selectivamente a Ep-CAM. En una realizacion preferente, la afinidad de union de dicha porcion de union a Ep-CAM es al menos de cuatro ordenes de magnitud, preferentemente al menos de tres ordenes de magnitud, mas preferentemente menos de dos ordenes de magnitud de la afinidad de union de VB4-845, PANOREX® o MT-201 medida por tecnicas estandar de laboratorio. En realizaciones no limitantes, la porcion de union a Ep-CAM puede bloquear competitivamente la union de un anticuerpo anti-Ep-CAM conocido, tal como, pero sin limitacion, PANOREX® o MT201, a Ep-CAM, en condiciones fisiologicas, en al menos el 0,1 %, 1 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 %.
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El experto apreciara que pueden identificarse residuos determinantes de la especificidad. La expresion "residuo determinante de la especificidad", tambien conocido "SDR", se refiere a un residuo que forma parte del paratopo de un anticuerpo, particularmente residuos CDR; la sustitucion individual del mismo por analina, independientemente de cualesquiera otras mutaciones, disminuye la afinidad por el epftope en al menos 10 veces, preferentemente en al menos 100 veces, mas preferentemente en al menos 1000 veces. Esta perdida de afinidad destaca la importancia de ese residuo en la capacidad del anticuerpo para unirse al epftope. Vease, por ejemplo, Tamura y col., 2000, "Structural correlates of an anticarcinoma antibody: Identification of Specificity-Determining Residues (SDRs) and Development of a Minimally Immunogenic Antibody Variant by Retention of SDRs Only. J. Immunol. 164, 1432-1441.
El efecto de mutaciones unicas o multiples sobre la actividad de union, particularmente sobre la afinidad de union, puede evaluarse simultaneamente para evaluar la importancia de una serie particular de aminoacidos en la interaccion de union (por ejemplo, la contribucion de la cDR2 de cadena ligera o pesada en la union). Los efectos de una mutacion de aminoacidos tambien pueden evaluarse secuencialmente para determinar la contribucion de un aminoacido determinado cuando se valoran individualmente. Dichas evaluaciones pueden realizarse, por ejemplo, mediante analisis de saturacion in vitro (veanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.180.341; Hilton y col., 1996, "Saturation mutagenesis of the WSxWs motif of the erythropoietin receptor," J Biol Chem. 271:46994708) y mutagenesis dirigida al sitio (veanse, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, "High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis," Science 244:1081-1085; Bass y col., 1991, "A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor," Proc Natl Acad Sci. USA 88:4498-4502). En la tecnica de mutagenesis de analisis de alanina, se introducen mutaciones de alanina unicas en multiples residuos de la molecula, y las moleculas mutantes resultantes se analizan para determinar la actividad biologica para identicar residuos de aminoacidos que son crfticos en la actividad de la molecula.
Los sitios de ligando-receptor u otra interaccion biologica tambien pueden identificarse mediante analisis ffsico de estructura determinada mediante, por ejemplo, resonancia magnetica nuclear, cristalograffa, difraccion electronica o marcado de fotoafinidad, junto con la mutacion de aminoacidos del sitio de contacto putativos (veanse, por ejemplo, de Vos y col., 1992, "Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex," Science 255:306-312; Smith y col., 1992, "Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein," J Mol Biol. 224:899-904; Wlodaver y col., 1992, "Crystal structure of human recombinant interleukin- 4 at 2.25 A resolution," FEBS Lett. 309:59-64. Adicionalmente, la importancia de aminoacidos individuales particulares, o series de aminoacidos, puede evaluarse mediante comparacion con la secuencia de aminoacidos de polipeptidos relacionados o sitios de union analogos.
Ademas, el experto apreciara que una avidez aumentada puede compensar una afinidad de union reducida. La avidez de una inmunotoxina por Ep-CAM es una medida de la fuerza de la union de la porcion de union a Ep-CAM a Ep-CAM, que tiene multiples sitios de union. La fuerza de union funcional entre Ep-CAM y la porcion de union a Ep- CAM representa la suma de fuerzas de todos los enlaces de afinidad y, por lo tanto, un componente individual pude unirse con una afinidad relativamente baja, pero un multimero de dichos componentes puede demostrar un efecto biologico potente. De hecho, las interacciones multiples entre sitios de union a Ep-CAM y epftopes de Ep-CAM pueden mostrar un efecto biologico muy superior al aditivo, es decir, la ventaja de la multivalencia puede ser de muchos ordenes de magnitud con respecto a la constante de equilibrio.
En una realizacion no limitante, la porcion de union a Ep-CAM tiene una estructura sustancialmente similar a la de 4D5MOCB. La estructura sustancialmente similar puede caracterizarse por referencia a mapas de epftopes que reflejan los puntos de union de la porcion de union a Ep-CAM de la inmunotoxina a una molecula de Ep-CAM.
Asimismo, puede usarse una diversidad de toxinas para disenar una inmunotoxina dirigida a Ep-CAM segun la invencion. En realizaciones preferentes, la toxina comprende un polipeptido que tiene actividad de inactivacion de ribosomas que incluye, sin limitacion, gelonina, bouganina, saporina, cadena de ricina A, briodina, toxina de difteria, restrictocina y variantes de las mismas. Cuando la protema es una protema inactivadora de ribosomas, la inmunotoxina debe internalizarse despues de la union a la celula cancerosa para que la toxina sea citotoxica para las celulas.
En una realizacion particular preferente, la porcion de toxina comprende al menos una porcion toxica de exotoxina A
("ETA") de pseudomonas, o una variante de la misma. En una realizacion espedfica, la porcion citotoxica
comprende una variante de ETA que, cuando se administra sola, es sustancialmente incapaz de unirse a celulas. En 1 1 __ 1 otra realizacion espedfica, la porcion citotoxica comprende ETA ' . La porcion citotoxica puede comprender una
o mas exotoxinas de Pseudomonas conocidas en la tecnica (veanse, por ejemplo, Kreitman, 1995, "Targeting
pseudomonas exotoxin to hematologic malignancies," Seminars in Cancer Biology 6: 297-306; Pastan, 2003,
"Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin A: a short history," Cancer Immunol. Immunother. 52: 338-341), o
variantes de las mismas.
Se conocen en la tecnica diversas variantes de exotoxina de Pseudomonas, asf como procedimientos para producir y usar constructos que comprenden variantes de exotoxina de Pseudomonas (veanse, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N° US2003054012; patente de Estados Unidos N° 6531133; patente de Estados Unidos N° 6426075; patente de Estados Unidos N° 6423513; patente de Estados Unidos N° 6074644; patente de Estados
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Unidos N° 5980895; patente de Estados Unidos N° 5912322; patente de Estados Unidos N° 5854044; patente de Estados Unidos N° 5821238; patente de Estados Unidos N° 5705163; patente de Estados Unidos N° 5705156; patente de Estados Unidos N° 5621078; patente de Estados Unidos N° 5602095; patente de Estados Unidos N° 5512658; patente de Estados Unidos N° 5458878; patente de Estados Unidos N° 5082927; patente de Estados Unidos N° 4933288; patente de Estados Unidos N° 4892827; patente de Estados Unidos N° 4677070; patente de Estados Unidos N° 4545985; publicaciones internacionales de patente N° WO98/20135, WO93/25690; WO91/18100; WO91/18099; WO91/09949 y WO88/02401; Kondo y col., 19888, "Activity of immunotoxins constructed with modified pseudomonas exotoxin a lacking the cell recognition domain." J Biol Chem. 263:9470-9475; Batra y col., 1989, "Antitumor activity in mice of an immunotoxin made with anti-transferring receptor and a recombinant form of pseudomonas exotoxin." Proc Natl.Acad.Sci.USA 86:8545-8549; Puri y col., 1991, "Expression of high-affinity interleukin 4 receptors on murine sarcoma cells and receptor-mediated cytotoxicity of tumor cells to chimeric protein between interleukin 4 and Pseudomonas exotoxin." Cancer Res 51:3011-3017; Siegall y col., 1992, "Cytotoxicity of chimeric (human murine) monoclonal antibody BR96 IgG, F(ab')2, and Fab' conjugated to Pseudomonas exotoxin." Bioconjug-Chem 3:302-307; Hall y col., 1994, "In vivo efficacy of intrathecal transferrin-Pseudomonas exotoxin A immunotoxin against LOX melanoma." Neurosurgery 34:649-655; Kuan y Pai, 1995, "Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin that target Le y damage human endothelial cells in an antibody-specific mode: relevance to vascular leak syndrome." Clin Cancer Res 1:1589-1594; Kreitman, 1995, "Targeting pseudomonas exotoxin to hematologic malignancies." Sem Cancer Biol 6:297-306; Kawooya y col., "The expression, affinity purification and characterization of recombinant pseudomonas exotoxin 40 (PE40) secreted from Escherichia coli." J Biotechnol 42:922; Kaun y Pai, 1995, "Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin that target LeY damage human endothelial cells in an antibody-specific mode: Relevance to vascular leak syndrome." Clin Cancer Res 1:1589-1594; Puri y col., 1996, "Preclinical development of a recombinant toxin containing circularly permuted interleukin 4 and truncated Pseudomonas exotoxin for therapy of malignant astrocytoma." Cancer Res 56:5631-5637; Pai y col., 1996, "Treatment of advanced solid tumors with immunotoxin LMB-1: An antibody linked to Pseudomonas exotoxin." Nature Med. 3:350-353; Pai y col., 1998, "Clinical Trials with pseudomonas exotoxin immunotoxins." Curr Top. Microbiol. Immunol. 234: 83-96; Klimka y col., 1999, "An anti-CD30 single chain Fv selected by phage display and fused to pseudomonas exotoxin A (Ki-4(scFv)-ETA') is a potent immunotoxin against a Hodgkinderived cell line." British J Cancer 80:1214-1222; Rand y col., 2000, "Intratumoral administration of recombinant circularly permuted interleukin- 4-Pseudomonas exotoxin in patients with high-grade glioma." Clin Cancer Res 6:2157-2165; Leland y col., 2000, "Human breast carcinoma cells express type II IL-4 receptors and are sensitive to antitumor activity of chimeric IL-4- pseudomonas exotoxin fusion protein in vitro and in vivo." Molecular Medicine Today 6:165-178;Tur y col., 2001, "An anti-GD2 single chain Fv selected by phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A develops specific cytotoxic activity against neuroblastoma derived cell lines." Int J Mol.Med 8:579-584; Onda y col., 2001, "Cytotoxicity of antiosteosarcoma recombinant immunotoxins composed of TP-3 Fv fragments and a truncated pseudomonas exotoxin A." J Immunother 24:144-150; 18."Synergistic interaction between an anti-p185her-2 pseudomonas exotoxin fusion protein [scfv(frp5)-eta] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2." Schmidt y col., 2001, "Synergistic interaction between an anti-p185HER-2 pseudomonas exotoxin fusion protein [scFv(FRP5)-ETA] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER- 2."Gynecol Oncol 80:145-155; Pastan, 2003, "Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin A: a short history." Cancer Immunol Immunother 52:338-341; Li y col., 1996, "Crystal structure of the catalytic domain of Pseudomonas exotoxin A complexed with a nicotinamide adenine dinucleotide analog: implications for the activation process and for ADP ribosylation." Proc Natl Acad Sci USA. 9:6902-6906; Kreitman y Pastan, 2003, "Immunobiological treatments of hairy-cell leukaemia." Best Pract Res Clin Haematol. 16:117-33.
En otras realizaciones no limitantes, la toxina comprende un agente que actua alterando ADN. Asf, las toxinas pueden comprender, sin limitacion, enediinas (por ejemplo, calicheamicina y esperamicina) y agentes de molecula pequena que no sean enediinas (por ejemplo, bleomicina, metidiopropil-EDTA-Fe(II)). Otras toxinas utiles segun la invencion incluyen, sin limitacion, daunorrubicina, doxorrubicina, distamicina A, cisplatino, mitomicina C, ecteinascidinas, duocarmicina/CC-1065 y bleomicina/pepleomicina.
En otras realizaciones no limitantes, la toxina comprende un agente que actua alterando tubulina. Dichas toxinas pueden comprender, sin limitacion, rizoxina/maitansina, paclitaxel, vincristina y vinblastina, colchicina, auristatina dolastatina 10 MMAE y pelorusido A.
En otras realizaciones no limitantes, la porcion de toxina de una inmunotoxina de la invencion puede comprender un agente alquilante que incluye, sin limitacion, Asaley NSC 167780, AZQ NSC 182986, BCNU NSC 409962, Busulfan NSC 750, carboxiftalatoplatino NSC 271674, CBDCA NSC 241240, CCNU NSC 79037, CHIP NSC 256927, clorambucilo NSC 3088, clorozotocina NSC 178248, cisplatino NSC 119875, clomesona NSC 338947, cianomorfolinodoxorrubicina NSC 357704, ciclodisona NSC 348948, dianhidrogalactitol NSC 132313, fluorodopan NSC 73754, hepsulfam NSC 329680, hicantona NSC 142982, melfalan NSC 8806, metilo CCNU NSC 95441, mitomicina C NSC 26980, mitozolamida NSC 353451, mostaza de nitrogeno NSC 762, PCNU NSC 95466, piperazina NSC 344007, piperazinadiona NSC 135758, pipobroman NSC 25154, porfiromicina NSC 56410, mostaza espirohidantoma NSC 172112, teroxirona NSC 296934, tetraplatino NsC 363812, tio-tepa NSC 6396, trietilenmelamina NSC 9706, mostaza de nitrogeno y uracilo NSC 34462 y Yoshi-864 NSC 102627.
En otras realizaciones no limitantes, la porcion de toxina de una inmunotoxina de la invencion puede comprender un agente antimitotico que incluye, sin limitacion, alocolchicina NSC 406042, Halicondrina B nSc 609395, colchicina
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NSC 757, derivado de colchicina NSC 33410, dolastatina 10 NSC 376128 (derivado de NG-auristatina), maitansina NSC 153858, rizoxina NSC 332598, taxol NSC 125973, derivado de taxol NsC 608832, tiocolchicina NSC 361792, tritil-cistema NSC 83265, sulfato de vinblastina NSC 49842 y sulfato de vincristina NSC 67574.
En otras realizaciones no limitantes, la porcion de toxina de una inmunotoxina de la invencion puede comprender un inhibidor de topoisomerasa I que incluye, sin limitacion, camptotecina NSC 94600, sal de Na de camptotecina NSC 100880, aminocamptotecina NSC 603071, derivado de camptotecina NSC 95382, derivado de camptotecina NSC 107124, derivado de camptotecina NSC 643833, derivado de camptotecina NSC 629971, derivado de camptotecina NSC 295500, derivado de camptotecina NSC 249910, derivado de camptotecina NSC 606985, derivado de camptotecina NSC 374028, derivado de camptotecina NSC 176323, derivado de camptotecina NSC 295501, derivado de camptotecina NSC 606172, derivado de camptotecina NSC 606173, derivado de camptotecina NSC 610458, derivado de camptotecina NSC 618939, derivado de camptotecina NSC 610457, derivado de camptotecina NSC 610459, derivado de camptotecina NSC 606499, derivado de camptotecina NSC 610456, derivado de camptotecina NSC 364830, derivado de camptotecina NSC 606497 y morfolinodoxorrubicina NSC 354646.
En otras realizaciones no limitantes, la porcion de toxina de una inmunotoxina de la invencion puede comprender un inhibidor de topoisomerasa II que incluye, sin limitacion, doxorrubicina NSC 123127, amonafida NSC 308847, m- AMSA NSC 249992, derivado de antrapirazol NSC 355644, pirazoloacridina NSC 366140, bisantreno HCL NSC 337766, daunorrubicina NSC 82151, deoxidoxorrubicina NSC 267469, mitoxantrona NSC 301739, menogaril NSC 269148, N,N-dibencil-daunomicina NSC 268242, oxantrazol NSC 349174, rubidazona NSC 164011, VM-26 NSC 122819 y VP-16 NSC 141540.
En otras realizaciones no limitantes, la porcion de toxina de una inmunotoxina de la invencion puede comprender un antimetabolito de ARN o ADN que incluye, sin limitacion, L-alanosina NSC 153353, 5-azacitidina NSC 102816, 5- fluorouracilo NSC 19893, acivicina NSC 163501, derivado de aminopterina NSC 132483, derivado de aminopterina NSC 184692, derivado de aminopterina NSC 134033, un antifol NSC 633713, un antifol NSC 623017, antifol soluble de Baker NSC 139105, dicloralil-lawsona NSC 126771, brequinar NSC 368390, ftorafur (pro-farmaco) NSC 148958, 5,6-dihidro-5-azacitidina NSC 264880, metotrexato NSC 740, derivado de metotrexato NSC 174121, N- (fosfonoacetil)-L-aspartato (PALA) NSC 224131, pirazofurina NSC 143095, trimetrexato NSC 352122, 3-HP NSC 95678, 2'-deoxi-5-fluorouridina NSC 27640, 5-HP NSC 107392, alfa-TGDR NSC 71851, glicinato de afidicolina NSC 303812, ara-C NSC 63878, 5-aza-2'-deoxicitidina NSC 127716, beta-TGDR NSC 71261, ciclocitidina NSC 145668, guanazol NSC 1895, hidroxiurea NSC 32065, inosina glicodialdetndo NSC 118994, macbecina II NSC 330500, pirazoloimidazol NSC 51143, tioguanina NSC 752 y tiopurina NSC 755.
Ademas, una citotoxina puede modificarse para disminuir o inhibir la union fuera del contexto de la inmunotoxina, o para reducir tipos espedficos de toxicidad. Por ejemplo, la citotoxina puede modificarse para ajustar el punto isoelectrico a aproximadamente 7,0 de modo que se reduzca la toxicidad en el tngado.
Los resultados clmicos de tratamientos contra el cancer usando una inmunotoxina de la invencion son facilmente perceptibles para un experto en la tecnica relevante, tal como un medico. Por ejemplo, ensayos medicos estandar para medir marcadores clmicos de cancer pueden ser indicadores significativos de la eficacia del tratamiento. Dichos ensayos pueden incluir, sin limitacion, examen ffsico, escalas de rendimiento, marcadores de la enfermedad, ECG de 12 derivaciones, mediciones del tumor, biopsia de tejido, citoscopia, citologfa, calculos del diametro mas largo del tumor, radiograffa, imagen digital del tumor, signos vitales, peso, recuerdo de eventos adversos, evaluacion de eposodios infecciosos, evaluacion de medicaciones concomitantes, evaluacion del dolor, qrnmica de sangre y suero, analisis de orina, tomograffa computerizada (TC) y analisis farmacocinetico. Ademas, los efectos sinergicos de una terapia de combinacion que comprende la inmunotoxina y otro producto terapeutico contra el cancer pueden determinarse mediante estudios comparativos con pacientes que se estan sometiendo a monoterapia.
Particularmente en el caso de HNSCC, la mejora en la respiracion, la deglucion, el habla y determinadas mediciones de calidad de vida son facilmente verificables. Adicionalmente, la remission de HNSCC puede evaluarse usando criterios aceptados por el experto. Vease, por ejemplo, Therasse y col., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada," J Natl Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16.
La dosis eficaz de inmunotoxina que se va a administrar durante un ciclo vana segun el modo de administracion. La administracion directa (por ejemplo, inyeccion por via intratumoral) requiere dosis corporales totales de inmunoglobulina mucho mas pequenas en comparacion con la administracion intravenosa sistemica de la inmunotoxina. Sera evidente para un experto que la administracion local puede tener como consecuencia dosis corporales mas reducidas y en esas circunstancias, y los niveles en plasma circulantes bajas resultantes de inmunotoxina senan esperados y deseados.
Ademas, la dosis eficaz de un constructo de inmunotoxina espedfico puede depender de factores adicionales que incluyen el tipo de cancer, el tamano del tumor en el caso de HNSCc, el estadio del cancer, la toxicidad de la inmunotoxina para el paciente, la especificidad de dirigirse a celulas cancerosa, asf como la edad, el peso y la salud del paciente.
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En una realizacion, la dosis eficaz por administracion directa de inmunotoxina puede variar de aproximadamente 10 a 3000, 20 a 900, 30 a 800, 40 a 700, 50 a 600, 60 a 500, 70 a 400, 80 a 300, 90 a 200, o 100 a 150 microgramos/tumor/dfa. En otras realizaciones, la dosis puede variar de aproximadamente 10 a 20, 21 a 40, 41 a 80, 81 a 100, 101 a 130, 131 a 150, 151 a 200, 201 a 280, 281 a 350, 351 a 500, 501 a 1000, 1001 a 2000, o 2001 a 3000 microgramos/tumorMa. En realizaciones espedficas, la dosis puede ser al menos aproximadamente 20, 40, 80, 130, 200, 280, 400, 500, 750, 1000, 2000 o 3000 microgramos/tumorMa.
En otra realizacion, la dosis eficaz de inmunotoxina puede variar de aproximadamente 100 a 5000, 200 a 4000, 300 a 3000, 400 a 2000, 500 a 1000, 600 a 900, o 700 a 1500 microgramos/tumor/mes. En otras realizaciones, la dosis puede variar de aproximadamente 100 a 199, 200 a 399, 400 a 649, 650 a 999, 1000 a 1799, 1800 a 2499, 2500 a 3499, 3500 a 4999, 5000 a 7499, 7500 a 10000, o 10001 a 20000 microgramos/tumor/mes. En realizaciones espedficas, la dosis puede ser al menos aproximadamente 100, 200, 400, 650, 1000, 1400, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 7500, 10000 o 20000 microgramos/tumor/mes.
En otra realizacion, la dosis eficaz de inmunotoxina da como resultado una concentracion intratumoral de al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 100, 200, 300, 400 o 500 microgramos/cm3 de la inmunotoxina. En otras realizaciones, la concentracion intratumoral resultante de inmunotoxina es aproximadamente 5 a 500, 10 a 400, 15 a 300, 20 a 200, 25 a 100, 30 a 90, 35 a 80, 40 a 70, 45 a 60 o 50 a 55 microgramos/cm3. En otras realizaciones, la concentracion intratumoral resultante de inmunotoxina es aproximadamente 10 a 15, 16 a 20, 21 a 25, 26 a 30, 31 a 35, 36 a 40, 41 a 45, 46 a 50, 51 a 55, 56 a 60, 61 a 65, 66 a 70, 71 a 75, 76 a 80, 81 a 85, 86 a 90, 91 a 95, 96 a 100 o 100 a 200 microgramos/cm3.
En otra realizacion, la dosis eficaz de inmunotoxina da como resultado una concentracion en plasma inferior a 0,1, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 microgramos/litro. En otras realizaciones, la concentracion en circulacion resultante de inmunotoxina es aproximadamente 0,1 a 50, 1 a 40, 2,5 a 30, 5 a 20 o 7,5 a 10 microgramos/litro. En otras realizaciones, la concentracion en circulacion resultante de inmunotoxina es aproximadamente 0,1 a 1, 1,1 a 2,4, 2,5 a 5, 5,1 a 7,4, 7,5 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 30, 31 a 40 o 41 a 50 microgramos/litro.
En una realizacion particular no limitante, la dosis eficaz de la inmunotoxina se encuentra entre aproximadamente 100 y 3000 microgramos/tumor/mes, por ejemplo aproximadamente 100, 200, 300, 400, 750 o 1000 microgramos/tumor/mes, en la que se administra al paciente una dosis unica por dfa. La dosis unica se administra aproximadamente cada mes durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses consecutivos. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente 1,2, 4, 6 o 12 meses despues. El regimen de tratamiento puede incluir 1,2, 3, 4, 5 o 6 ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente 1,2, 4, 6 o 12 meses.
En una realizacion particular no limitante, la dosis eficaz de la inmunotoxina se encuentra entre aproximadamente 20 y 1240 microgramos/tumor/dfa, por ejemplo aproximadamente 20, 40, 80, 130, 200 o 280 microgramos/tumor/dfa o aproximadamente 100, 200, 330, 500, 700, 930, 1240 microgramos/tumor/dfa, en la que se administra al paciente una dosis unica por dfa. La dosis unica se administra aproximadamente cada dfa (uno o mas dfas pueden saltarse opcionalmente) durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas consecutivos. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas despues. El regimen de tratamiento puede incluir 1,2, 3, 4, 5 o 6 ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente 1,2, 4, 3 o 5 semanas.
El volumen de inyeccion es preferentemente al menos una cantidad eficaz, que es apropiada para el tipo y la ubicacion del tumor. El volumen de inyeccion maximo en una dosis unica puede encontrarse entre aproximadamente el 25 % y el 75 % del volumen del tumor, puede ser por ejemplo aproximadamente un cuarto, un tercio o tres cuartos del volumen estimado del tumor diana. En una realizacion espedfica no limitante, el volumen de inyeccion maximo en una dosis unica es aproximadamente el 30 % del volumen del tumor.
En otra realizacion, la inmunotoxina se administra por via intratumoral a una dosis total por ciclo equivalente a, o inferior a, la dosis maxima tolerada establecida en un ensayo de seguridad pero lo dosificacion se estandariza con relacion al volumen del tumor. Por ejemplo, los sujetos recibiran entre 1 microgramo por cm3 y 500 microgramos por cm3 de tumor o una dosis suficiente para alcanzar aproximadamente entre 14 picomoles y 7 nanomoles por cm3 de tejido tumoral. La dosis se administrara en un volumen que no exceda aproximadamente el 20-50 % del volumen del tumor. La inmunotoxina se diluira en una solucion salina adecuada. Por ejemplo, para un tumor con un volumen estimado de 3 cm3, una dosis objetivo de 14 picomoles (1 microgramo por cm3) y un volumen relativo de inyeccion maximo de aproximadamente 1/3 del tumor, se diluiran 3 microgramos de inmunotoxina en aproximadamente 1 ml de diluyente.
En otra realizacion particular, la dosis eficaz de la inmunotoxina se encuentra entre aproximadamente 20 y 300 microgramos/tumorMa, siendo por ejemplo aproximadamente 20, 40, 80, 130, 200 o 280 microgramos/tumor/dfa, administrandose al paciente una dosis unica por dfa. El volumen de inyeccion maximo en una dosis unica puede encontrarse entre aproximadamente el 25 % y el 75 % del volumen del tumor, pudiendo ser por ejemplo aproximadamente un cuarto, un tercio o tres cuartos del volumen estimado del tumor diana. La dosis unica se administra cada dos dfas durante aproximadamente 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 o 31 dfas consecutivos. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas despues. El regimen de tratamiento puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos, estando separado
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En una realizacion espedfica no limitante, se administra VB4-845 a una dosis de aproximadamente 280 microgramos/tumorMa, administrandose al paciente una dosis unica por dfa. El volumen de inyeccion maximo en una dosis unica es aproximadamente un tercio del volumen estimado del tumor diana. La dosis unica se administra cada dfa durante aproximadamente cinco dfas consecutivos. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente un mes despues, preferentemente un mes a partir del primer dfa del primer ciclo. El regimen de tratamiento puede incluir tres ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente una semana sin tratamiento.
En otra realizacion espedfica no limitante, se administra VB4-845 a una dosis de aproximadamente 280 microgramos/tumorMa, administrandose al paciente una dosis unica por dfa. El volumen de inyeccion maximo en una dosis unica es aproximadamente un tercio del volumen estimado del tumor diana. La dosis unica se administra cada dos dfas durante aproximadamente una semana. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente una semana despues. El regimen de tratamiento puede incluir tres ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente una semana.
En otra realizacion espedfica mas, se administra VB4-845 a una dosis de aproximadamente 280 microgramos/tumorMa, administrandose al paciente una dosis unica por dfa. El volumen de inyeccion maximo en una dosis unica es aproximadamente un tercio del volumen estimado del tumor diana. La dosis unica se administra cada dos dfas durante aproximadamente tres semanas. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente una semana despues. El regimen de tratamiento puede incluir tres ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente una semana.
Para la administracion a una cavidad tal como la vejiga urinaria, la dosis eficaz de la inmunotoxina se encuentra entre aproximadamente 100 y 2000 microgramos en 50 ml/semana (equivalentes a una concentracion de entre aproximadamente 29 nanomolar a 580 nanomolar), siendo por ejemplo aproximadamente 100, 200, 335, 500, 700, 930, 1240 microgramos en 50 ml/semana, administrandose al paciente una dosis unica por semana y el tejido del tumor se expone a la inmunotoxina durante al menos aproximadamente 30 minutos. Por ejemplo, la solucion se mantiene en la cavidad durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 3 horas. En una realizacion espedfica no limitante, el tejido tumoral se expone a la inmunotoxina durante aproximadamente 1 hora o mas preferentemente durante aproximadamente 2 horas. Despues de este ciclo, puede comenzar un ciclo subsiguiente aproximadamente 1, 2, 4, 6 o 12 semanas despues de la dosis previa. El regimen de tratamiento puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos, estando separado cada ciclo por aproximadamente 1,2, 4, 6 o 12 meses.
Para cavidades mas grandes o mas pequenas tales como quistes o vejigas sustancialmente mas pequenas o mas grandes que la media, el volumen puede ajustarse para asegurar una exposicion adecuada del tejido sin sobrecargar la cavidad. Cuando se necesita ajustar el volumen, la dosis eficaz de la inmunotoxina debena encontrarse entre una aproximadamente 20 y 600 nanomolar en concentracion para una toxina con un sitio de union por molecula.
La dosificacion para la inmunotoxina tambien puede expresarse como molaridad del sitio de union para la protema de las celulas cancerosas. Por ejemplo, la inmunotoxina VB4-845 tiene un peso molecular de 69,7 kDa y un sitio de union para Ep-Cam. Se sabe que otros formatos de inmunotoxina tales como formatos divalentes, fragmentos Fab, Fab' o (Fab')2 podnan tener un peso molecular diferente en virtud del numero de aminoacidos en la cadena o cadenas de polipeptidos. Se sabe tambien que para un formato similar se podna alterar el peso molecular uniendo grupos adicionales al polipeptido tales como restos de azucar o polietilelglicol. El uso de una toxina diferente o una variable diferente de la toxina podna tener como resultado tambien una inmunotoxina con un peso molecular direrente de la VB4-845 usada en los ejemplos. Ademas, tambien podnan realizarse cambios en la cadena de polipeptidos que danan como resultado un fragmento mas largo o mas corto y ademas sin deshacer la union de la inmunotoxina a la protema elegida de la celula cancerosa. Todas estas variaciones se contemplan en la presente solicitud. Como resultado puede ser util expresar la dosificacion de la inmunotoxina en terminos del numero de moles de los sitios de union para la protema de las celulas cancerosas. En los ejemplos y las diversas realizaciones, las dosificaciones se expresan en microgramos y se basan en el peso molecular de VB4-845. La formula siguiente proporciona un modo sencillo de transformar microgramos en equivalentes en moles de sitios de union; (1 x 10" 6g/numero de g por mol de inmunotoxina) x numero de sitios de union por molecula de inmunotoxina = Factor de conversion para pasar de microgramos (1 x 10"6g) de una IT dada a moles de sitios de union. Para VB4-845, una inmunotoxina con un unico sitio de union por molecula, la conversion se realizana como sigue:
Numero de microgramos x 14,3 x 10 moles/microgramo = numero de moles.
Por ejemplo, cuando se inyectan 3000 microgramos en un tumor un dfa dado, 3000 microgramos x 14,3 x 10"12 moles/microgramo = 42,9 x 10"9 moles de sitios de union (o 42,9 nanomoles o 42.900 picomoles). Cuando la dosis se expresa en terminos de una concentracion en un diluyente o mediante volumen de tejido tumoral, se puede transformar el peso de la inmunotoxina en moles y despues dividir este numero de moles por el volumen de diluyente cuando el resultado pueda expresarse en terminos de molaridad o mediante el volumen del tejido tumoral cuando el resultado pueda expresarse como moles por cm3 (u otras unidades de volumen) de tejido.
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Por ejemplo cuando se van a administrar 1240 microgramos a la vejiga en un volumen de 50 ml: 1240 microgramos x 14,3 x 10-12 moles/microgramo = aproximadamente 18 x 10-12 moles de sitios de union y 18 x 10-12 moles/50 ml (o 0,05 litros) = aproximadamente 355 x 10-9 M (o 355 nanomolar).
La dosis eficaz del producto terapeutico contra el cancer adicional que se va a administrar conjuntamente con una inmunotoxina durante un ciclo tambien vana segun el modo de administracion. El uno o mas compuestos terapeuticos contra el cancer pueden administrarse por via intratumoral, o por otras vfas de administracion. Tfpicamente, los agentes quimioterapeuticos se administran por via sistemica. La dosificacion y los regfmenes de tratamiento estandar son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la ultima edicion del mdice de Merck y la Physician's Desk Reference).
Por ejemplo, en una realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende dacarbazina en una dosis que vana de aproximadamente 200 a 4000 mg/m2/ciclo. En una realizacion preferente, la dosis vana de 700 a 1000 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende fludarabina en una dosis que vana de aproximadamente 25 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende citosina arabinosido (Ara-C) en una dosis que vana de aproximadamente 200 a 2.000 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende docetaxel en una dosis que vana de aproximadamente 1,5 a 7,5 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende paciltaxel en una dosis que vana de aproximadamente 1,5 a 15 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende cisplatino en una dosis que vana de aproximadamente 5 a 20 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende 5-fluorouracilo en una dosis que vana de aproximadamente 5 a 20 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende doxorrubicina en una dosis que vana de aproximadamente 2 a 8 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende epipodofilotoxina en una dosis que vana de aproximadamente 40 a 160 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende ciclofosfamida en una dosis que vana de aproximadamente 50 a 200 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende irinotecan en una dosis que vana de aproximadamente 50 a 75, 75 a 100, 100 a 125 o 125 a 150 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende vinblastina en una dosis que vana de aproximadamente 3,7 a 5,4, 5,5 a 7,4, 7,5 a 11 u 11 a 18,5 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende vincristina en una dosis que vana de aproximadamente 0,7 a 1,4 o 1,5 a 2 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion mas, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende metotrexato en una dosis que vana de aproximadamente 3,3 a 5, 5 a 10, 10 a 100 o 100 a 1.000 mg/m2/ciclo.
La terapia de combinacion con una inmunotoxina puede sensibilizar el cancer el tumor a la administracion de un producto terapeutico contra el cancer adicional. En consecuencia, la presente invencion contempla terapias de combinacion para prevenir, tratar y/o prevenir la recafda de cancer que comprenden la administracion de una cantidad eficaz de una inmunotoxina antes de, subsiguientemente o concurrentemente con una dosis reducida de un producto terapeutico contra el cancer. Por ejemplo, el tratamiento inicial con una inmunotoxina puede reducir la sensibilidad de un cancer o tumor a una exposicion subsiguiente a una dosis de producto terapeutico contra el cancer. La dosis esta cercana, o es inferior, al intervalo inferior de dosificaciones estandar cuando el producto terapeutico contra el cancer se administra solo, o en ausencia de inmunotoxina. Cuando se administran concurrentemente, la inmunotoxina puede administrarse de forma separada al compuestos terapeutico contra el cancer, y opcionalmente usando un modo de administracion diferente.
En consecuencia, en una realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende cisplatino, por ejemplo, PLATINOL o PLATINOL-AQ (Bristol Myers), en una dosis que vana de aproximadamente 5 a 10, 11 a 20, 21 a 40 o 41 a 75 mg/m2/ciclo.
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En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende carboplatino, por ejemplo, PARAPLATIN (Bristol Myers), en una dosis que vana de aproximadamente 2 a 3, 4 a 8, 9 a 16, 17 a 35 o 36 a 75 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende ciclofosfamida, por ejemplo, CYTOXAN (Bristol Myers Squibb), en una dosis que vana de aproximadamente 0,25 a 0,5, 0,6 a 0,9, 1 a 2, 3 a 5, 6 a 10, 11 a 20 o 21 a 40 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende citarabina, por ejemplo, CYTOSAR-U (Pharmacia & Upjohn), en una dosis que vana de aproximadamente 0,5 a 1, 2 a 4, 5 a 10, 11 a 25, 26 a 50 o 51 a 100 mg/m2/ciclo. En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende citarabina liposoma, por ejemplo DEPOCYT (Chiron Corp.), en una dosis que vana de aproximadamente 5 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende dacarbazina, por ejemplo, DTIC or DTICDOME (Bayer Corp.), en una dosis que vana de aproximadamente 15 a 250 mg/m2/ciclo o vana de aproximadamente 0,2 a 2 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende topotecan, por ejemplo, HYCAMTIN (SmithKline Beecham), en una dosis que vana de aproximadamente 0,1 a 0,2, 0,3 a 0,4, 0,5 a 0,8 o 0,9 a 1,5 mg/m2/ciclo. En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende irinotecan, por ejemplo, CAMPTOSAR (Pharmacia & Upjohn), en una dosis que vana de aproximadamente 5 a 9, 10 a 25 o 26 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende fludarabina, por ejemplo, FLUDARA (Berlex Laboratories), en una dosis que vana de aproximadamente 2,5 a 5, 6 a 10, 11 a 15 o 16 a 25 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende citosina arabinosido (Ara-C) en una dosis que vana de aproximadamente 200 a 2000 mg/m2/ciclo, 300 a 1000 mg/m2/ciclo, 400 a 800 mg/m2/ciclo o 500 a 700 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende doecetaxel, por ejemplo, TAXOTERE (Rhone Poulenc Rorer), en una dosis que vana de aproximadamente 6 a 10, 11 a 30 o 31 a 60 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende paclitaxel, por ejemplo, TAXOL (Bristol Myers Squibb), en una dosis que vana de aproximadamente 10 a 20, 21 a 40, 41 a 70 o 71 a 135 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende 5-fluorouracilo en una dosis que vana de aproximadamente 0,5 a 5 mg/kg/ciclo, 1 a 4 mg/kg/ciclo o 2-3 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende doxorrubicina, por ejemplo, ADRIAMYCIN (Pharmacia & Upjohn), DOXIL (Alza), RUBEX (Bristol Myers Squibb), en una dosis que vana de aproximadamente 2 a 4, 5 a 8, 9 a 15, 16 a 30 o 31 a 60 mg/kg/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende etoposido, por ejemplo, VEPESID (Pharmacia & Upjohn), en una dosis que vana de aproximadamente 3,5 a 7, 8 a 15, 16 a 25 o 26 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende vinblastina, por ejemplo, VELBAN (Eli Lilly), en una dosis que vana de aproximadamente 0,3 a 0,5, 0,6 a 0,9, 1 a 2 o 3 a 3,6 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende vincristina, por ejemplo, ONCOVIN (Eli Lilly), en una dosis que vana de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, el producto terapeutico contra el cancer adicional comprende metotrexato en una dosis que vana de aproximadamente 0,2 a 0,9, 1 a 5, 6 a 10 u 11 a 20 mg/m2/ciclo.
En otra realizacion, se administra una inmunotoxina en combinacion con al menos otro compuesto inmunoterapeutico que incluye, sin limitacion, rituxan, rituximab, campat-1, gemtuzumab y trastuzutmab.
En otra realizacion, se administra una inmunotoxina en combinacion con uno o mas agentes antiantiogenicos que incluyen, sin limitacion, angiostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, serpina (inhibidor de serina proteasa), antitrombina, fragmentos proteolfticos con extremo N terminal de 29 kDa y extremo C terminal de 40 kDa de fibronectina, fragmento proteolfticos de 16 kDa de prolactina, fragmento proteolftico de 7,8 kDa de factor de plaquetas 4, un peptido de 13 aminoacidos correspondiente al factor de plaquetas 4 (Maione y col., 1990, Cancer Res. 51:2077-2083), un peptido de 14 aminoacidos correspondiente a un fragmento de colageno I (Tolma y col., 1993, J. Cell Biol. 122:497-51), un peptido de 19 aminoacidos correspondiente a un fragmento de trombospondina I
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(Tolsma y col., 1993, J. Cell Biol. 122:497-511), un peptido de 20 aminoacidos correspondiente a un fragmento de SPARC (Sage y col., 1995, J. Cell. Biochem. 57:1329-1334), y una variante de los mismos, incluida una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En otra realizacion, se administra una inmunotoxina en combinacion con un regimen de radioterapia. La terapia tambien puede comprender cirugfa y/o quimioterapia. Por ejemplo, la inmunotoxina puede administrarse en combinacion con radioterapia y cisplatino (Platinol), fluorouracilo (5-FU, Adrucil), carboplatino (Paraplatin), y/o paclitaxel (Taxol). El tratamiento con la inmunotoxina puede permitir usar dosis bajas de radiacion y/o tratamientos de radiacion de menor frecuencia, que pueden, por ejemplo, reducir la incidencia de dolores de garganta agudos que impidan la funcion de deglucion, lo que tiene como consecuencia, potencialmente, una perdida de peso y deshidratacion.
En otra realizacion, se administra una inmunotoxina en combinacion con una o mas citocinas que incluyen, sin limitacion, una linfocina, factores de necrosis tumoral, citosina similar al factor de necrosis tumoral, linfotoxina, interferon, protema inflamatoria de macrofagos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos, interleucina (incluidas, sin limitacion, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15, interleucina-18), y una variante de las mismas, incluidas sales farmaceuticamente aceptables de las mismas.
En otra realizacion mas, se administra una inmunotoxina en combinacion con una vacuna contra el cancer que incluye, sin limitacion, celulas o tejidos autologos, celulas o tejidos no autologos, antfgeno carcinoembrionico, alfa- fetoprotema, gonadotropina corionica humana, vacuna viva de BCG, protemas de linaje de melanocitos y antfgenos espedficos de tumor, mutados.
En otra realizacion mas, se administra una inmunotoxina en asociacion con terapia hormonal. Los productos terapeuticos hormonales incluyen, sin limitacion, un agonista hormonal, antagonistas hormonales (por ejemplo, flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON)) y esteroides (por ejemplo, dexametasona, retinoide, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidrotestosterona, glucocorticoide, mineralocorticoide, estrogeno, testosterona, progestina).
En otra realizacion mas, se administra una inmunotoxina en asociacion con un programa de terapia genica para tratar o prevenir cancer.
En otra realizacion mas, se administra una inmunotoxina dirigida a Ep-CAM en combinacion con uno o mas agentes que aumentan la expresion de Ep-CAM en las celulas tumorales de interes. La expresion de Ep-CAM se aumenta preferentemente de modo que se exprese un numero mayor de moleculas de Ep-CAM en la superficie de la celula tumoral. Por ejemplo, el agente puede inhibir los ciclos normales de endocitosis de antfgeno de Ep-CAM. Dicho tratamiento de combinacion puede mejorar la eficacia clmica de la inmunotoxina dirigida a Ep-CAM sola o con otros productos terapeuticos contra el cancer o radioterapia. En realizaciones espedficas no limitantes, el agente que aumenta la expresion de Ep-CAM en las celulas tumorales es tartrato de vinorelbina (Navelbine) y/o paclitax (Taxol). Vease, por ejemplo, Thurmond y col., 2003, "Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism." Cancer Immunol Immunother. Jul; 52(7):429-37.
La terapia de combinacion puede aumentar, por lo tanto, la sensibilidad del cancer o tumor a la inmunotoxina administrada y/o producto terapeutico contra el cancer adicional. De este modo, pueden ser posibles ciclos de tratamiento mas cortos, reduciendo de este modo eventos toxicos. En consecuencia, la divulgacion proporciona un procedimiento de tratamiento o prevencion de cancer que comprende administrar a un paciente con necesidad de ello una cantidad eficaz de una inmunotoxina y al menos otro producto terapeutico contra el cancer durante un ciclo de tratamiento corto. La duracion del ciclo puede variar de aproximadamente 1 a 30, 2 a 27, 3 a 15, 4 a 12, 5 a 9 o 68 dfas. La duracion del ciclo puede variar segun el producto terapeutico contra el cancer espedfico que se use. La invencion tambien contempla la administracion continua o discontinua, o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. Una duracion de ciclo apropiada para un producto terapeutico contra el cancer espedfico sera evidente para el experto, y la divulgacion contempla la evaluacion continua de agendas de tratamiento optimas para cada producto terapeutico contra el cancer. Las directrices espedficas para el experto son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Therasse y col., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada," J Natl Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16.
Alternativamente, pueden ser deseables ciclos de tratamiento mas largos. En consecuencia, la duracion del ciclo puede variar de aproximadamente 10 a 56, 12 a 48, 14 a 28, 16 a 24 o 18 a 20 dfas. La duracion del ciclo puede variar segun el producto terapeutico contra el cancer espedfico que se use.
La presente invencion contempla al menos un ciclo, preferentemente mas de un ciclo durante el que se administra un unico producto terapeutico contra el cancer o series de productos terapeuticos. Un numero total apropiado de ciclos, y los intervalos entre ciclos, se apreciaran por parte de un experto. El numero de ciclos puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 ciclos. El intervalo entre ciclos puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 2, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 dfas. La invencion contempla la evaluacion continua de agendas de tratamiento optimas para cada inmunotoxina y producto terapeutico contra el cancer adicional.
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En una realizacion no limitante de la invencion, la inmunotoxina se administra directamente en dosis elevadas (por ejemplo, una dosis que tiene como resultado mas de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500 o 1000 microgramos/cm3) durante periodos cortos. En consecuencia, en una realizacion espedfica no limitante, la inmunotoxina se administra por via intratumoral en una dosis que da como resultado una concentracion intratumoral de inmunotoxina de al menos aproximadamente 200, 300, 400 o 500 microgramos/cm3 una vez a la semana durante dos semanas.
Una inmunotoxina segun la invencion puede estar comprendida en una composicion farmaceutica o en un medicamento. Las composiciones farmaceuticas adaptadas para la administracion directa incluyen, sin limitacion, polvos liofilizados o soluciones o suspensiones inyectables esteriles acuosas o no acuosas, que pueden contener adicionalmente antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que las composiciones sean sustancialmente isotonicas con la sangre de un receptor pretendido. Otros componentes que pueden estar presentes en dichas composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las soluciones y suspensiones de inyeccion improvisada pueden prepararse a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles. La inmunotoxina puede suministrarse, por ejemplo, pero sin limitacion, como un polvo liofilizado que se reconstituye con agua o solucion salina esteril antes de la administracion al paciente.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender un vetuculo farmaceuticamente aceptable. Los vetuculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen composiciones no toxicas esencialmente qmmicamente inertes que no interfieren con la eficacia de la actividad biologica de la composicion farmaceutica. Los ejemplos de vetuculos farmaceuticos adecuados incluyen, pero sin limitacion, agua, soluciones salinas, soluciones de glicerina, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), diolesilfosfotidil-etanolamina (DOPE) y liposomas. Dichas composiciones debenan contener una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto, junto con una cantidad adecuada de vetuculo para proporcionar la forma de admnistracion directa al paciente.
En otra realizacion, una composicion farmaceutica comprende una inmunotoxina y uno o mas productos terapeuticos contra el cancer adicionales, opcionalmente en un vetuculo farmaceuticamente aceptable.
La composicion puede estar en forma de una sal farmaceuticamente aceptable que incluye, sin limitacion, las formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de acidos clortudrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procama, etc.
En diversas realizaciones de la invencion, la composicion farmaceutica se administra directamente a la region del tumor o los tumores mediante, por ejemplo, infusion local durante cirugfa, aplicacion topica (por ejemplo, junto con un aposito para heridas despues de la cirugfa), inyeccion, por medio de un cateter, por medio de un supositorio o por medio de un implante. Un implante puede ser de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialasticas, o fibras. Los supositorios generalmente contienen ingredientes activos en el intervalo de 0,5 % a 10 % en peso.
En otras realizaciones, puede disponerse un sistema de liberacion controlada en la proximidad del tumor diana. Por ejemplo, una microbomba puede suministrar dosis controladas directamente a la region del tumor, regulando finamente, por lo tanto, los tiempos de suministro y la concentracion de la composicion farmaceutica (vease, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138).
La presente divulgacion tambien proporciona un kit que comprende una cantidad eficaz de una inmunotoxina, opcionalmente, en combinacion con uno o mas productos terapeuticos contra el cancer, junto con instrucciones para usar el mismo para tratar HNSCC o cancer de vejiga.
Segun un aspecto de la presente divulgacion, la inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer se administran al paciente mediante administracion directa. En consecuencia, la inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer pueden administrarse, sin limitacion, mediante una o mas inyecciones directas en el tumor, mediante perfusion continua o discontinua en el tumor, mediante introduccion de un deposito de la inmunotoxina, mediante introduccion de un aparato de liberacion lenta en el tumor, mediante introduccion de una formulacion de liberacion lenta en el tuor, y/o mediante aplicacion directa en el tumor. Con el modo de administracion “en el tumor”, tambien se contempla la introduccion de la inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer a la region del tumor, o en un vaso sangumeo o vaso linfatico que fluye de modo sustancialmente directo a la region del tumor. En cada caso, la composicion farmaceutica se administra en al menos una cantidad suficiente para lograr el punto final y, si es necesario, comprende un vetuculo farmaceuticamente aceptable.
Se contempla que la inmunotoxina pueda administrarse por via intratumoral, mientas que cualquier otro producto terapeutico contra el cancer pueda administrarse al paciente mediante otro modo de administracion (por ejemplo, por via intravenosa). Adicionalmente, cuando se pretende administrar al paciente multiples productos terapeuticos contra el cancer, la inmunotoxina y uno o mas de los otros productos terapeuticos contra el cancer pueden administrarse por via intratumoral, mientras que otros productos terapeuticos contra el cancer pueden administrarse mediante otros modos de administracion (por ejemplo, por via intravenosa y por via oral).
En una realizacion particular no limitante, la inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer pueden
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administarse mediante inyeccion intratumoral, por ejemplo, siguiendo la plantilla mostrada en la Figura 1 (vease Khuri y col., 2000, "A controlled trial of intratumoral ONYX-015, a selectively-replicating adenovirus, in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with recurrent head and neck cancer," Nature Med. 6:879-885). La inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer pueden suspenderse comprendiendo una solucion acuosa tamponada, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfatos ("PBS"). El volumen de la suspension que comprende la inmunotoxina puede ser inferior a aproximadamente el 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85 o el 95 % del volumen estimado de la masa tumoral que se va a inyectar. En realizaciones espedficas, el volumen de la suspension que comprende la inmunotoxina es inferior a aproximadamente el 30, 40 o el 50 % del volumen estimado de la masa tumoral diana.
Con cada administracion de la inmunotoxina y/u otro producto terapeutico contra el cancer, al menos se realiza al menos una puncion en la piel o la mucosa bucal en el sitio a aproximadamente el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100 % de la distancia desde el centro del tumor estimado a la periferia del tumor. La administracion de la inmunotoxina mediante inyeccion directa puede dar como resultado uno o mas trayectos de aguja que surgen radialmente desde el centro de la masa tumoral. En una realizacion particular no limitante, los trayectos de agujas pueden estar orientados sustancialmente tal como se representan en la Figura 1.
Para carcinoma de vejiga, la inmunotoxina puede introducirse mediante cateter tal como se describe en el Ejemplo 15.
En una realizacion no limitante de la invencion, se usan tecnicas de imagen medicas para guiar la administracion de la inmunotoxina directamente al tumor. Esto es particularmente util en algunos tumores de la cabeza y el cuello y en otros tipos de tumor que son de diffcil acceso. En estos casos, la grna por imagenes de la herramienta de administracion (aguja, cateter, aparato de liberacion lenta, etc.) se usa para evitar danos a, o la administracion a estructuras anatomicas cnticas tales como vasos sangumeos, aparato nervioso, etc., y para asegurar que la inmunotoxina se distribuye adecuadamente a lo largo de las tres dimensiones del tumor. Las tecnicas de grna por imagenes son bien conocidas en la tecnica medica y comprenden ultrasonidos, tomograffa computerizada (CT), rayos X y tomograffa por emision de positrones (PET).
La presente invencion se entendera mejor mediante las ensenanzas de ejemplos siguientes. Los ejemplos establecidos en el presente documento no pretenden limitar la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1. Inmunotoxina VB4-845.
La VB4-845 es una inmunotoxina que consiste en un fragmento de anticuerpo humano recombinante Fv monocatenario que estan fusionado a una forma truncada de exotoxina A de Pseudomonas (ETA 252-608). El fragmento de anticuerpo esta derivado del fragmento de anticuerpo monocatenario de MOC31 humanizado, 4D5MOCB, que se une espedficamente a Ep-CAM.16-18
La exotoxina A es una de las protemas toxicas liberadas por cepas patogenas de Pseudomonas aeruginosa19. Se secreta como una proenzima con un peso molecular de 66.000 daltons20. La exotoxina A se transloca en celulas de mairnfero susceptibles, en las que la alteracion covalente de la molecula la hace enzimaticamente activa. La exotoxina A de Pseudomonas bloquea de forma irreversible la smtesis de protemas en celulas ribosilando con difosfato de adenosina un residuo de histidina modificado postraduccionalmente del factor 2 de elongacion, denominado diftamida, e induce la apoptosis .4 La version truncada de ETA usada en este constructo, aunque contiene aun los dominios para inducir la muerte celular, carece de dominio de union a la celula, evitando de este modo que la porcion de ETA penetre en celulas a las que no se dirige la porcion de anticuerpo de la inmunotoxina.
__ __ oro
La secuencia genica que codifica una forma truncada de la ETA (ETA - ) y la secuencia de scFv 4D5MOCB de
union a Ep-CAM se usaron para el contructo VB4-845. La molecula contiene colas His5 en ambos extremos N y C terminales para la purificacion, tal como se representa en la figura 2. La secuencia de ADN y de aminoacidos de VB4-845 se representan en las Figuras 3A-D y las SEQ ID NO:1 y 2. La porcion de union a Ep-CAM se muestra en la SEQ ID NO:3. Las secuencias de CDR se muestran en las SEQ ID NO:4-9.
La protema resultante conserva la especificidad del 4D5MOCB original por la Ep-CAM. El vector de expresion para la protema, pING3302 (se uso el plasmido pING3302 de Xoma Ireland Ltd para la construccion del vector de expresion) se transporta a, y se expresa por, la cepa huesped de E. coli E104. La protema tiene una longitud de 648 aminoacidos y tiene un peso molecular predicho de 69,7 kilodaltons (kDa). En el analisis de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio), se observa la VB4-845 como una banda de protema sencilla de aproximadamente 70 kDa. La protema tiene un punto isoelectrico (pI) de aproximadamente 5,9 y es hidrosoluble, formando una solucion transparente. Detalles adicionales con respecto a la preparacion de VB4-845 se proporcionan en el Ejemplo 9, mas adelante.
Se ha demostrado que la VB4-845 inhibe espedficamente la smtesis de protemas y reduce la viabilidad de celulas de carcinoma positivas a Ep-CAM in vitro. Como se demuestra en el Ejemplo 5, mas adelante, despues de la administracion sistemica a ratones, la VB4-845 inhibio el crecimiento e indujo la regresion de xenoinjertos tumorales
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derivados de carcinomas de pulmon, colon o celula escamosa. La VB4-845 mostro una distribucion en organos similar al fragmento monocatenario original (scFv) y se localizo preferentemente en xenoinjertos de tumores positivos a Ep-CAM con una relacion de tumor:sangre de 5,4.
Como se demuestra en el Ejemplo 6, un modelo peritumoral mostro la inhibicion significativa de crecimiento tumoral en animales tratados con VB4-845. De hecho, en este modelo, dos ratones con volumenes de tumor mas pequenos (90 mm3) al comienzo del tratamiento mostraron una regresion completa del tumor y permanecieron sin tumores durante el experimento (vease mas adelante). En todos los estudios de eficacia, los ratones toleraron los tratamientos bien, sin mortalidad relacionada con farmacos y sin observaciones clmicas significativas que sugieran toxicidad. Estos datos apoyan la administracion directa de VB4-845 para la terapia dirigida de tumores solidos.
El intervalo de dosis por ciclo de VB4-845 en seres humanos puede ser de 4 microgramos/kilogramo, es decir, 113 veces inferior a las dosis dadas a ratones en los estudios de eficacia, tanto en modelos intravenosos como peritumorales (vease la nota 1 al pie de la table 7). La exposicion mensual en seres humanos puede administrarse como una microdosis durante un periodo de 5 dfas con un efecto acumulativo de 1 dosis por semana a lo largo de la totalidad de la region tumoral.
Ejemplo 2. Formas de dosificacion y composiciones.
La VB4-845 se ha estudiado como un farmaco incipiente y se ha encontrado que es eficaz en la union a lmeas celulares tumorales en algunos sistemas de modelos, previniendo el crecimiento del tumor. La VB4-845 se formula a 1 mg/ml en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,2, y puede administrarse por via intratumoral con una aguja de calibre 22. Se envasa en viales de vidrio de borosilicato de 1 ml, se cierra con un tapon de butilo gris y una cubierta de aluminio. Hay disponibles actualmente dos tamanos de llenado: 0,1 y 0,2 ml (0,1 mg y 0,2 mg de VB4- 845, respectivamente). El farmaco se almacena a -70 °C. El producto final no se conserva y se conserva solo para un unico uso.
El producto de muestra se etiqueta, se almacena y se distribuye segun procedimientos de operacion estandar escritos y aprobados. El producto puede distribuirse en condiciones heladas (por ejemplo, en hielo seco) y puede mantenerse, por ejemplo, en un sitio de estudio en un congelador controlado a -70 °C con acceso liimitado cuya temperatura se controla regularmente. El producto puede mantenerse en estas condiciones hasta el momento de su uso.
Ejemplo 3. Estabilidad de VB4-845.
La vida en almacenamiento del producto cuando se almacena a -70 °C es al menos de seis meses. En condiciones fisiologicas (por ejemplo, incubacion del producto farmacologico durante cuatro horas a 37 °C en PBS), la mayor parte de las moleculas de inmunotoxina (al menos el 91 %) estan todavfa eluidas como monomeros del peso molecular apropiado (aproximadamente 70 kDa). La cantidad de VB4-845 disminuye lentamente con el tiempo estando presente no menos de aproximadamente el 47 % de la protema inicial en forma monomerica despues de veinte horas a 37 °C. Resultados similares se obtuvieron despues de incubacion de VB4-845 marcado con 99mTc en suero humano, corroborando adicionalmente la adecuabilidad de la inmunotoxina para la aplicacion in vivo.
Se han realizado estudios de estabilidad a corto plazo para evaluar la estabilidad inherente del producto de investigacion en una manipulacion rutinaria en el sitio clmico. Se ha evaluado la VB4-845 en su formulacion estandar a temperatura ambiente y a 2-8 °C. Ademas, se preparo VB4-845 en tampon de inyeccion de solucion salina tamponada con fosfato con y sin urea 800 nM y se analizo hasta seis horas a temperatura ambiente. Los estudios de estabilidad a corto plazo tambien evalua el efecto de ciclos de congelacion-descongelacion repetidos sobre VB4- 845.
Se encontro que la VB4-845 conservaba su actividad biologica durante el transcurso de todos los estudios de estabilidad a corto plazo. La VB4-845 puede extraerse del congelador a -70 °C el dfa de dosificacion y dejarla descongelar a temperatura ambiente. La VB4-845 puede prepararse en un tampon de inyeccion en un periodo de 4 - 6 horas despues de su retirada de la condicion de almacenamiento a -70 °C. Una vez el producto se formula en el tampon de inyeccion de solucion salina tamponada con fosfatos, el producto puede inyectarse al paciente dentro de un periodo de seis horas despues de su preparacion. Si el producto no puede usarse dentro de un periodo de tiempo adecuado, puede obtenerse un nuevo vial del inventario para dosificacion.
La VB4-845 es estable en su envase original durante al menos 20 horas a temperatura ambiente, y si se mantuvo refrigerado (por ejemplo, a 2-8 °C), durante al menos 24 horas. Si el producto no se usa, puede volver a congelarse para un uso posterior, particularmente si el sistema de recipiente/cierre original permanece intacto.
Los estudios de estabilidad a corto plazo (hasta 16 h de tiempo de incubacion) en fluido biogico que incluye plasma, suero y orina humanos demostraron que la VB4-845 retiene su propiedad de union y de toxicidad celular al menos 16 horas.
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Ejemplo 4. Farmacologia in vitro.
Se han realizado estudios para determinar la citotoxicidad in vitro de VB4-845 para cultivos de celulas tumorales y modelos de eficacia in vivo en animales.
Para determinar la capacidad de VB4-845 para inhibir espedficamente el crecimiento de celulas tumorales positivas a Ep-CAM, se realizaron ensayos de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-disfeniltetrazolio)53 El ensayo de MTT mide la viabilidad de celulas controlando la reduccion de la sal de tetrazolio a formazan por enximas contenidas solo en celulas vivas. Se anadieron concentraciones variables de VB4-845 a cultivos celulares y se realizo un seguimiento del crecimiento celular durante 72 horas.
La VB4-845 es especificamente citotoxica frente a lmeas celulares positivas a Ep-CAM (por ejemplo, carcinoma colorectal HT29, adenocarcinoma de mama MCF7, carcinoma de celula escamosa CAL27, carcinoma de pulmon de celula pequena SW2) y no afecta al crecimiento de lmeas celulares negativas a Ep-CAM RL (por ejemplo, linfoma de no Hodgkin) y COLO320 (carcinoma colorrectal). Se encontro que las celulas SW2, CAL27 y MCF7 eran igualmente sensibles al efecto citotoxico de VB4-845 y su proliferacion se inhibio con una CI50 de solo 0,005 pM. Se encontro que las celulas HT29 eran las menos sensibles (Cl50de 0,2 pM). La exotoxina de Pseudomonas inhibe la smtesis de protemas en celulas de mairnfero mediante la ADP-ribosilacion de factor de elongacion 221'22 Para demostrar que la actividad citotoxica de VB4-845 se correlaciona con su capacidad para inhibir la smtesis de protemas en lmeas celulares tumorales positivas a Ep-CAM, se realizo un seguimimiento de la absorcion de un metabolito marcado radioactivamente, [3H]leucina, en celulas SW2 positivas a Ep-CAM53.
Despues del tratamiento de celulas SW2 con VB4-845 durante un total de treinta horas, la smtesis de protemas se inhibio con una CI50 de 0,01 pM. Este efecto mostro una relacion de respuesta de dosis similar a la medida previamente en el ensayo citotoxico. La smtesis de protemas en la lmea celular negativa a Ep-CAM, RL, no se vio afectada.
Ejemplo 5. Estudios in vivo de administracion sistemica de VB4-845.
Los ratones que portaban xenoinjertos tumorales de SW2 (cancer de pulmon de celula pequena), HT29 (carcinoma colorrectal) o CAL27 (HNSCC) positivos a Ep-CAM grandes establecidos se trataron por via intravenosa (i.v.) con VB4-845 usando 1 de 2 regfmenes de dosificacion diferentes: 5 |jg administrados cada dos dfas durante 3 semanas (45 jg en total); o 10 jg administrados cada dos dfas durante 1 semana (30 jg en total). Los ratones que portaban xenoinjertos tumorales de COLO320 negativos a Ep-CAM se usaron como controles. Se realizo un seguimiento del tamano del tumor durante el transcurso del estudio (33-51 dfas despues del inicio del tratamiento)53.
Los resultados se resumen en la Tabla 4. Los ratones toleraron los tratamientos bien, sin mortalidad relacionada con farmacos y sin observaciones clmicas significativas que sugieran toxicidad. Como se muestra en la Figura 4, la inhibicion significativa de todos los tumores positivos a Ep-CAM se logro tratando ratones con cualquiera de las agendas de dosificacion. El tratamiento de ratones que portan xenoinjertos de SW2 dio como resultado una reduccion del volumen del tumor a un maximo del 20 % del tamano inicial y una ligera reanudacion de crecimiento a un aumento de tamano final de 2,6 veces al final del periodo de seguimiento. Un efecto similar se logro despues del tratamiento de tumores de CAL27, que se redujeron a un maximo del 60 % del volumen inicial. Cincuenta dfas despues del comienzo del tratamiento, la mediana del volumen del tumor no excedio 1,4 veces el tamano inicial. Dos de siete ratones tratados con la agenda de dosificacion de 5 jg mostraron una regresion total del tumor y permanecieron sin tumores. Ni los tumores de CAL27 ni los de SW2 mostraron una diferencia significativa en la respuesta del tumor a las dos agentes de tratamiento.
Para tumores de HT29, se logro una inhibicion fuerte del crecimiento (0,7 veces el volumen inicial) con la agenda de dosificacion de 5 jg. Como se ha observado ya, para tumores de CAL27, 3 de 7 ratones mostraron la regresion completa de sus tumores de HT29. La eficacia de la agenda de 10 jg fue comparativamente inferior, indicando que para estos tumores es mas eficaz un tratamiento a largo plazo. No se observo ningun efecto antitumoral de VB4-845 en ratones que portaban tumores de control de COLO320 negativos a Ep-CAM.
Ejemplo 6. Estudios in vivo de administracion directa de VB4-845.
Se inyectaron a ratones atfmicos por via subcutanea (s.c.) en el flanco lateral 107 celulas de carcinoma de celula escamosa de HNSCC de CAL2754. Despues de cuatro semanas, cuando los tumores se hubieron establecido, los ratones se dividieron en dos grupos aleatoriamente con un volumen promedio de tumor de 150 mm3 cada uno. Se trataron ocho ratones mediante inyeccion por via peritumoral de VB4-845 con una dosis de 5 jg administrada cada dos dfas (lunes/miercoles/viernes) durante 3 semanas (dosis total de 45 jg). Con cada inyeccion los 5 jg de inmunotoxina se distribuyeron en 2 a 3 puntos de inyeccion. Los ratones de control (n=5) permanecieron sin tratar.
Como se resume en la Tabla 5, se observo una inhibicion significativa del crecimiento del tumor en animales tratados (Figura 5). Dos ratones con volumenes de tumor mas pequenos (90 mm3) al comienzo del tratamiento mostraron una regresion completa del tumor y permanecieron sin tumores durante el experimento. No pudo observarse toxicidad durante y despues del tratamiento con inmunotoxina.
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Ejemplo 7. Biodistribucion.
En general, la literatura indica que el scFv se elimina rapidamente de la circulacion, y proporciona relaciones de tumor a fondo elevadas (retencion espedfica en la masa tumoral) en puntos temporales tempranos en modelos animales23-25. Las Ti/2eran, en promedio, 2-4 horas26"27, pero pueden ser mas elevadas (> 8 horas) dependiendo de la construccion de la molecula28 y de la v^a de administracion. La absorcion mas elevada, dependiendo de la molecula, tiende a producirse en los rinones y el hugado despues de la infusion sistemica.
La biodistribucion de VB4-845 se ha evaluado en ratones que portaban xenoinjertos de SW2 positivos a Ep-CAM y de COLO320 negativos a Ep-CAM en los flancos contralaterales53 La dosis maxima de VB4-845 radiomarcado detectada en tumores de SW2 fue del 2,93 % de Dl/g (dosis inyectada/g) despues de cuatro horas, que despues disminuyo gradualmente al 1,95 % de Dl/g y al 1,13 % de Dl/g despues de 24 y 48 horas, respectivamente. Por el contrario, la VB4-845 en los tumores de control de COLO320 se localizo con una dosis maxima del 1,65 % de Dl/g despues de treinta minutos, que despues disminuto rapidamente al 1,06 % de Dl/g despues de cuatro horas y mostro solo niveles de fondo despues de 48 horas.
La VB4-845 mostro una eliminacion de la sangre mas lenta que el scFv original. Despues de 24 horas, la dosis total de VB4-845 en la sangre era del 0,42 % de Dl/g, que era 1,5 veces mas que el scFv original (0,28 % de Dl/g). Ademas, la localizacion de la inmunotoxina en tumores de SW2 tambien se retraso en comparacion con el scFv original y la distribucion de VB4-845 revelo una relacion tumor:sangre de 5,38 despues de 48 horas, que era comparable a la relacion obtenida con el scFv despues de 24 horas. En cada punto temporal, la VB4-845 se acumulo en tumores de SW2 positivos a Ep-CAM en comparacion con tumores de control de COLO320 con una relacion SW2:COLO320 que variaba entre 1,28 y 2,95. Esto indica que la VB4-845 se retuvo en tumores positivos a Ep-CAM mediante interacciones anticuerpo-antfgeno espedficas y absorcion celular. La acumulacion marginal en tumores de control de COLO320 puede deberse al aumento en la permeabilidad vascular encontrada a menudo en tumores. El analisis en tejidos normales en estos animales revelo que la VB4-845 tambien se localizaba en los rinones, el bazo, el hugado y a una menor medida en los huesos.
Las observaciones realizadas durante la conduccion de la farmacocinetica y modelos de eficacia en ratones indican que el producto fue bien tolerado sin ningun signo clmico indicativo de toxicidad. Todos los animales estuvieron vivos a lo largo del transcurso de los estudios y no hubo mortalidad relacionada con farmacos.
Ejemplo 8. Estudios de toxicidad (Ejemplo comparativo).
Se realizo un estudio no GLP para aceder a la toxicidad potencial de dosis escalonadas de VB4-845 en los 3 tejidos, hfgado, bazo y huesos, que se observo para tener el nivel de localizacion mas elevado de VB4-845 radiomarcada durante el estudio de farmacocinetica.
Los resultados se muestran en la Tabla 6.
La VB4-845 se administro a ratones C57BL/6 inmunocompetentes que eran mas sensibles a danos en el hfgado mediados por ETA de tipo silvestre que los ratones atfmicos usados en los modelos de eficacia previos. La VB4-845 se administro a los ratones i.v. a o bien 5 |jg (250 jg/kg) o bien 10 |jg (500 jg/kg) cada dos dfas durante tres dosis, o 20 jg (1000 jg/kg) cada dos dfas durante dos dosis. Veinticuatro horas despues de la ultima dosis, la actividad de transaminasa en plasma se determino y se comparo con ratones tratados con PBS (es decir, 0 jg de VB4-845/kg). No se observo una elevacion de los niveles de ALT/AST en el plasma de ratones 24 horas despues de completar los regfmenes de dosificacion de 5 jg y 10 jg (Figura 6). Solo se observo una actividad de transaminasas elevada despues de la administracion de la dosis de 20 jg. En el punto temporal de 24 horas despues de la dosis, los animales se sacrificaron y se tineron espedmenes de tejidos del hfgado y del bazo por medio de hematoxilina/eosina y se analizaron con el microscopio optico.
En consecuencia con la actividad de transaminasa observada, solo unos pocos sitios con hepatocitos necroticos se encontraron despues del tratamiento con el regimen de dosificacion de inmunotoxina de 20 jg (1000 jg/kg), exposicion total de 40 jg (2000 jg/kg) (Figura 7). No se observaron signos de cambios histopatologicos o mielosupresion en ninguna dosis en el bazo y componentes celulares de muestras de sangre completa.
Una dosis inicial baja de VB4-845 en seres humanos pueden ser 20 jg (0,29 jg/kg para un adulto de 70 kg) administrados diariamente mediante administracion de microdosis a diferentes secciones del tumor cada dfa durante cinco dfas, con una exposicion acumulativa de ciclo unico de 100 jg/tumor (1,43 jg/kg para un adulto de 70 kg). Una dosis superior puede ser 280 jg (4,0 jg/kg para un adulto de 70 kg) administrados del mismo modo para una exposicion acumulativa de ciclo unico de 1400 jg/tumor (20 jg/kg para un adulto de 70 kg). En una base de peso corporal, la dosis inicial es aproximadamente 1585 veces inferior a la dosis mas elevada que es 113 veces inferior a la exposicion mensual mediante administracion intravenosa usada en los estudios en ratones descritos anteriormente (Tabla 7). En base a este margen de seguridad, dicho intervalo de dosificacion se considera seguro con respecto a las dosis usadas de un modo repetido en ratones que dieron como resultado ninguna observacion clmica indicativa de toxicidad y la dosis inicial es 1056 inferior a la exposicion mensual a VB4-845 que no mostro ninguna elevacion en los niveles de transaminasas o cambios histopatologicos en ratones.
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Los Fv monocatenarios en roedores se eliminan rapidamente de la circulacion y proporcionan relaciones de tumor a fondo elevadas (retencion espedfica en masa tumoral) en puntos temporales tempranos 23-25, con una ti/2 de 2-4 horas en promedio, aunque este tiempo puede ser superior26-27.
De forma similar a los resultados obtenidos en animales, Los scFv anti-CEA marcados con 123I mostraron una semivida relativamente corta, por ejemplo, 0,42 (t-io) y 5 (t-io) horas en pacientes humanos29. Las relaciones de tumor a sangre aumentaron con el tiempo (5,6:1 en 24 horas, en comparacion con 1-1,5:1 para anticuerpos anti-CEA de IgG). Aproximadamente el 15-41 % de la radioactividad administrada se excreto en la orina dentro de las primeras 24 horas, sugiriendo que los rinones son el organo principal de excrecion. Se observo actividad en el hngado despues de una hora, actividad que disminuyo rapidamente en las siguientes 21 horas, y se observo en la vesfcula biliar, en consecuencia con la excrecion biliar de radionucleoticos despues del catabolismo del anticuerpo en el hngado29. Un segundo estudio mostro una semivida similar de 0,32 (t1/2) y 1o,59 (ti/2) horas, respectivamente30. La semivida media para LMB-2, que es una scFv-inmunotoxina de ETA, vario de 173-494 minutos (decaimiento monoexponencial); sin embargo, esto se relaciono parcialmente con la carga patologica en la sangre periferica y el bazo31- .
Los estudios PK de VB4-845 administrado a seres humanos pueden evaluarse, y dichos estudios pueden abarcar no solo niveles de toxina sin conjugar, sino tambien los de los anticuerpos anti-VB4-845 (anticuerpos de neutralizacion), junto con anticuerpos a la toxina (exotoxina A de Pseudomonas) en plasma. La PK de la toxina en circulacion libre puede evaluarse en cada paciente, preferentemente en el primer ciclo de tratamiento y siguientes. Los anticuerpos de neutralizacion y los anticuerpos antitoxina pueden evaluarse dentro del primer ciclo de tratamiento y siguientes. El tiempo requerido para logar la concentracion en circulacion maxima (Tmax) puede retrasarse debido, por ejemplo, a una via intratumoral de administracion. Ademas, la concentracion maxima en circulacion (Cmax) puede reducirse.
Los anticuerpos monoclonales ("MAb") dirigidos contra antfgenos asociados a linfoma se han desarrollado y se han investigado clmicamente para el diagnostico y terapia de una pluralidad de canceres humanos. Se ha informado de la toxicidad relacionada con la administracion de MAb o fragmentos de anticuerpo a seres humanos, aunque en relacion, principalmente, con la infusion. Dichos eventos de toxicidad pueden incluir fiebre, escalofnos, nauseas y dolor de cabeza14, urticaria, anafilaxia, meningitis aseptica, hemolisis, leucopenia, trombocitopenia y smdrome de fuga vascular33-35. En algunos casos, estas reacciones pueden atribuirse parcialmente a la respuesta inmunitaria del paciente a protemas extranas ya que la mayor parte de los ensayos clmicos han usado anticuerpos quimericos murinos o murino/humanos33-3 .
Por el contrario, la VB4-845 es una protema humanizada. Ademas, en una via de administracion preferente, la administracion intratumoral o peritumoral de VB4-845 puede no tener como resultado tantos eventos de toxicidad, o con un grado de toxicidad similar, que los observados para otras inmunoterapias contra el cancer.
Ejemplo 9. Preparacion de VB4-845.
Construccion del vector de expresion de VB4-845 (tambien denominado 4D5MOCB-ETA). La secuencia que codifica una forma truncada de ETA (ETA252-608) se amplifico mediante PCR a partir del plasmido pSW20060 y se clono como un fragmento de 1164 pb de EcoRIHindIII posteriormente a la secuencia de scFv 4D5MOCB de union a Ep- CAM presente en el vector de expresion61 de scFv 4D5MOCB basado en pIG662. Los cebadores (Tox1: CTCGGAATTCGGTGGCGCGCCGGAGTTCCCGAAACCGTCCACCCCGCCGGGTTCTTCTGGTTTA (SEQ ID NO:10); Tox2: GTCAAGCTTCTACAGTTCGTCTTTATGGTGATGGTGGTGATGCGGCGGTTTCCCGGGCTG (SEQ ID NO:11)) introdujeron un sitio de restriccion de EcoRI entre scFv y la toxina y una cola de hexahistidina C terminal seguido por la senal de retencion del retfculo endoplasmico (RE) KDEL, un codon de detencion y un sitio de restriccion de HindIII. Para mejorar la pureza y el rendimiento durante la IMAC, se anadio una segunda cola de hexahistidina al extremo N terminal entre la secuencia de senal periplasmica y la region codificante de 4D5MOCB. Para ello, se calentaron dos pares de oligonucleotidos (XbaI 5': CTAGATAACGAGGGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGT (SEQ ID NO:12); XbaI 3': GCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGCCCTCGTTAT (SEQ ID NO:13); y EcoRV 5': AGCGCAGGCCGACCACCATCATCACCATCACGAT (SEQ ID NO:14); EcoRV 3': ATCGTGATGGTGATGATGGTGGTCGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGT (SEQ ID NO:15)) a 80 °C, dejando que se hibridiran mediante calentamiento gradual a temperatura ambiente y despues se ligaron entre los sitios Xbal y EcoRV de pIG6-4D5MOCBETAH6KDEL. La secuencia se confirmo experimentalmente.
Para la expresion periplasmica de VB4-845 se uso el vector pIG6, que situa el gen bajo el control del promotor de Iac en SB536, una cepa de E. coli que carece de las proteasas periplasmicas HhoA y HhoB.63. Se inocularon cinco ml de medio 2YT que contema ampicilina (100 mg/ml) con una colonia de bacterias unica que contema el plasmido de expresion de VB4-845 (4D5MOCB-ETA) y se cultivo durante la noche a 25 °C. Las bacterias se diluyeron en un litro de medio 2YT suplementado con el 0,5 % de glucosa y ampicilina (100 mg/ml) para alcanzar una A550 nm entre 0,1 y 0,2 y se transfirieron a matraces con agitacion y con deflectores de 3 litros. El cultivo se cultivo adicionalmente a 25 °C a una A550 nm de 0,5 y la produccion de inmunotoxina se indujo durante 4 h anadiendo una concentracion final de isopropil-b-D-tiogalactopiranosido (IPTG, Sigma) 1 mM. La aglomeracion recogida derivada de un cultivo bacteriano con una A550 nm final de 6 se almaceno a -80 °C.
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Para la purificacion, el aglomerado obtenido a partir de un cultivo de un litro se volvio a suspender en 25 ml de tampon de lisis, que contema Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 300 mM, MgSO4 2 mM y estaba suplementado con un coctel de EDTA-inhibidor de proteasa libre (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y DNase I. La suspension bacteriana se liso con dos ciclos en una prensa French Pressure Cell (SLS Instruments, Urbana, IL), se centrifugo a 48.000 g en un rotor SS-34 durante 30 min a 4 °C y subsiguientemente se esterilizo mediante un filtro (0,22 mm). La inmunotoxina presente en el sobrenadante retirado se purifico mediante cromatograffa usando un sistema BIOCAD (Perseptive, BioSystems) con una columna de Ni2+-iminodiacetico (IDA) y una columna de intercambio anionico HQ/M acoplada en lmea tal como se describe por Pluckthun y col.64 Antes de cargar el lisado, la columna de Ni2+- IDA se equilibro con Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 300 mM. Despues de la carga, la columna se lavo tres veces con diferentes soluciones salinas, todas tamponadas con Tris 20 mM (pH 7,5), en el orden de NaCl 300 mM, 510 mM y 90 mM. Subsiguientemente, la columna se lavo con Tris 20 mM (pH 7,5), imidazol 10 mM, NaCl 90 mM, antes de eluir la inmunotoxina unida con la misma solucion que contema imidazol 200 mM (pH 7,5).
El eluato se cargo directamente en la columna de intercambio anionico HQ/M y la inmunotoxina se eluyo con un gradiente de sal de NaCl 90-1000 mM, tamponado con Tris 20 mM (pH 7,5). Las fracciones que conteman 4D5MOCB-ETA se recogieron y se concenraron usando un filtro de corte de 10 kDa mediante centrifugacion a 2000 g y 4 °C (union de protema baja Ultrafree-MC, Millipore). La calidad de VB4-845 (4D5MOCB-ETA) purificada se analizo mediante un SDS al 10 %-gel de poliacrilamida e inmunotrasferencia Western usando un anticuerpo antitetrahistidina conjugado a peroxidasa de rabano picante (HRP) (QIAGEN, Hilden, Alemania) diluido 1:5000 segun las recomendaciones del fabricante.
Filtracion en gel analitica y determinacion de la estabilidad termica. Se diluyeron diez microgramos de VB4-845 (4D5MOCB-ETA) purificada en 50 ml de PBS, pH 7,4, que contema el 0,005 % de Tween-20 y subsiguientemente se incubaron a 37 °C. Las muestras se analizaron en diferentes puntos temporales (despues de 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 10 h y 20 h) mediante filtracion en gel usando el sistema Smart (Pharmacia, Uppsala) con una columna Superose-12 PC3.2/30. La columna se calibro en el mismo tampon con tres patrones proteicos: alcohol dehidrogenasa (Mr 150.000), albumina de suero bovino (Mr 66.000) y anhidrasa carbonica (Mr 29.000). La misma disposicion analftica se uso para evaluar la estabilidad termica de la inmunotoxina marcada con 99mTc despues de una incubacion de 20 h a 37 °C en suero humano. La cantidad de monomeros de inmunotoxina se determino mediante recuento por g- centello de las fracciones eluidas.
Radiomarcado y determinacion de la afinidad de union a antigeno. La VB4-845 (4D5MOCB-ETA) se marco radioactivamente mediante coordinacion espedfica del sitio estable de trihidrato de 99mTc-tricarbonilo a las colas de hexahistidina presentes en la secuencia de protemas. 65 Esta reaccion espontanea se indujo mezclando 30 ml de solucion de inmunotoxina (1 mg/ml) con un tercio del volumen de acido 2-[N-morfolino]etanosulfonico (MES) 1 M, pH 6,8, y un tercio del volumen del compuesto de 99mTc-tricarbonilo sintetizado recientemente. La mezcla se incubo durante 1 h a 37 °C y la reaccion se detuvo desalando a traves de una columna Biospin-6 (BioRad, Hercules, CA) equilibrada con PBS que contema el 0,005 % de Tween-20, segun las recomendaciones del fabricante. El porcentaje de inmunotoxina inmunorreactiva se evaluo tal como se describe por Lindmo y col.66 La afinidad de union de la inmunotoxina marcada con 99mTc se determino en celulas SW2 en un radioinmunoensayo (RIA), esencialmente tal como se ha descrito para el scFv 4D5MOCB.
Ejemplo 10. Proceso de fabricacion de VB4-845.
Fermentacion de VB4-845 de E. coli. La produccion de VB4-845 se llevo a cabo en matraces de 2 litros con agitacion usando un agitador incubador rotatorio en un laboratorio de investigacion. El agitador rotatorio se encuentra dentro de un espacio de control ambiental en el que la temperatura puede regularse en un margen de un grado Celsius. La inoculacion de medio de sembrado, medio de produccion y todas las manipulaciones asepticas tienen lugar en una cabina de seguridad biologica de tipo II/B con filtracion de HEPA y clasificacion de aire de 100. La separacion de celulas, la concentracion y la diafiltracion tienen lugar en un laboratorio de investigacion.
La VB4-845 se produce a partir de VB4-845 de un banco celular primario (MCB, Master Cell Bank) de celulas huesped E104 de E. coli de (Se uso el plasmido pING3302 de Xoma Ireland Ltd para la construccion del vector de expresion). La escala inicial de (fermentacion) propagacion celular para la produccion de VB4-845 de grado clmico ha sido al nivel de 26 x matraces de 2 l con agitacion con un volumen de trabajo de 1 l por matraz, volumen total de 26 l. El MCB de E. coli con VB4-845 se cultiva en un medio de nitrogeno complejo que contiene glicerina como fuente de carbono principal para el crecimiento celular. El procedimiento de fermentacion se describe mas adelante.
Preparacion del inoculo. Durante un proceso de un matraz con agitacion de 26 l, se prepara un cultivo de 500 ml de MCB de E. coli con VB4-845 como preinoculo. Para cada cultivo, se extrae un vial de MCB del tanque de almacenamiento a -18 °C y se deja descongelar a temperatura ambiente. El vial se limpia externamente con etanol al 70 % y se deja secar al aire en una cabina de seguridad biologica. Se anade la suspension celular de MCB (1,5 ml) a un matraz Erlenmeyer de 2 l que contiene 500 ml de medio de sembrado esteril (medio 2YT modificado y 25 mg/l de tetraciclina). El matraz se transfiere a un equipo agitador rotatorio a 200 rpm y se cultiva a 25 ± 1 °C hasta alcanzar una densidad optica de 3,0 ± 0,2 o superior (10,5 ± 1 h, fase semi-log de crecimiento). El inoculo se usa despues como cultivo de siembra para inocular los 26 matraces con agitacion de produccion.
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Fermentacion en 26 x matraces con agitacion de 2 l. La fermentacion se lleva a cabo en matraces de 2 l sin deflectores que contiene cada uno 1 l de medio de produccion. Un proceso de produccion ffpico para VB4-845 de grado clmico ha sido 26 x matraces de 2 l que conteman 1 l de medio de produccion (Terrific Broth, TB, modificado) por matraz. El medio de fermentacion se siembra con el 1 % de inoculos a partir del cultivo anterior y se incuba en un agitador (200 rpm) a 25 ± 1 °C hasta alcanzar una densidad optica de 1,2 (aproximadamente 6-7 horas) en el ultimo matraz con agitacion inoculado. Un intervalo de DO600 ffpico en induccion es 1,2-1,5. La expresion de VB4- 845 se induce mediante la adicion del 0,1 % de L-arabinosa. Las celulas se recogen aproximadamente 6 horas despues de la induccion.
Separacion de celulas. Al cosechar, todos los matraces con agitacion se retiran de la cabina con agitacion para la inoculacion, retirando primero el primer matraz inoculado. El contenido del primer matraz con agitacion se anade al segundo matraz con agitacion bajo una cubierta biologica. Todos los matraces con agitacion se retiran igualmente. Los matraces con agitacion reunidos se disponen en refrigeracion a 2-8 °C. Las celulas de E. coli E104 con VB4-845 se retiran en grupos de 6 a partir de los cultivos de fermentacion anteriores mediante centrifugacion a 6.800 g de fuerza durante 15 minutos a 2-8°C en una centrifugadora de Sorvall and Beckman. Las celulas se descartan mientra que el caldo exento de celulas se mantiene para un procesamiento posterior. La suspension de celulas concentrada se recoge, se inactiva y se elimina mediante procedimientos establecidos. El sobrenadante resultante se reune y se reserva una muestra de 5 ml para la cuantificacion del producto. Las centrifugadoras, rotores y frascos de centrifugadora se limpian a conciencia antes de procesar el caldo de fermentacion.
Concentracion/diafiltracion. La concentracion y la diafiltracion del sobrenadante de cultivo recogido se realizan usando un sistema Pellicon de flujo tangencial con una membrana Sartorius (Hydrosart) con un corte molecular de 10 kD de NMW (peso molecular nominal) y que tiene un area superficial de 3 pies cuadrados (0,278 metros cuadrados). El sistema de filtracion de Pellicon se lava a conciencia antes de su uso. La concentracion se realiza con una velocidad de alimentacion de 4 l/min y una velocidad de permeado de 500 ml/min. Se toma una muestra de 5 ml en la etapa de concentracion final. La diafiltracion se realiza frente a fosfato de sodio 0,02 M, pH 7,2 ± 0,2. Se requieren cinco cambios de volumen para lograr la conductividad deseada de < 10 mS. El producto concentrado diafiltrado se aclara en una centrifugadora Sorvall a 6.800 g de fuerza durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura establecidad de 2-8 °C. La solucion transparente que contiene el producto de interes se filtra antes de la purificacion usando un filtro de punto muerto de 0,22 pm. La etapa de clarificacion comprende, despues de la diafiltracion, centrifugacion, paso a traves del filtro de 0,2 pm, adicion de Triton X-100, ajuste de conductividad, ajuste del pH y despues sigue la purificacion.
Procedimientos de purificacion de VB4-845. La purificacion de VB4-845 se realiza en una planta piloto de Viventia Biotech, un area controlada con GMPc con filtracion de HEPA y controlada ambientalmente con una clasificacion de aire de 10.000. La protema VB4-845 se afsla mediante cromatograffa quelante de afinidad con metal y se purifica adicionalmente mediante una elusion de cromatograffa de intercambio anionico. El procedimiento de purificacion se resume en el diagrama de flujo de la Figura 9 y se describe mas adelante
Cromatograffa de interaccion de sefarosa-metal quelante. La columna de afinidad a metal se prepara empaquetando resina de sefarosa HP quelante en una columna de vidrio XK26/20, con un volumen de columna de aproximadamente 17 ± 1 ml. El empaquetamiento se realiza a una presion posterior de 300 kPa. La relacion de flujo lineal (LFR) de trabajo es 90 cm/h. Se hicieron pasar cinco volumenes de columna (CV) de agua para inyeccion (WFI) a traves de la columna de sefarosa quelante. Para cargar la columna de sefarosa quelante con iones metalicos, se hicieron pasar 5 CV de solucion de cloruro de mquel 0,1 M a traves de la columna. El remanente del cloruro de mquel no enlazado se retiro mediante lavado con 5 CV de WFI. La columna se equilibra despues con 10 CV de fosfato de sodio 20 mM que contiene cloruro de sodio 150 mM y el 0,1 % de Triton X-100, tampon de pH 7,2 ± 0,1 (tampon de equilibrado de sefarosa quelante).
La conductividad de la solucion concentrada/diafiltrada que contiene VB4-845 se habfa ajustado a 15 ± 1 mS con cloruro de sodio y el pH se ajusta a 7,2 ± 0,1 con hidroxido de sodio (NaOH) 1 M. La solucion que contiene VB4-845 se aplica a la columna HP de sefarosa quelante a una LFR de 90 cm/h u 8 ml/min. La columna se lava despues con 20 CV de tampon de lavado, fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1 que contiene imidazol 20 mM y el 0,1% de Triton X-100 (tampon de lavado). La VB4-845 se eluye a partir de la columna con seis CV de fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1, que contiene imidazol 500 mM (tampon de elucion de sefarosa quelante). El producto se recoge en una fraccion de 3 CV partiendo del comienzo del maximo de elucion.
Cromatograffa de intercambio anionico de Q-sefarosa. La resina HP de Q-sefarosa se empaqueta en una columna de vidrio XK16/20 con un volumen de columna final de 5,0 ± 0,5 ml. La velocidad de flujo lineal de trabajo es 156 cm/h. La columna se lava con 10 CV de WFI, despues se lava con 5 CV de cloruro de sodio 1 M en fosfato de sodio 20 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1 y se equilibra con 10 CV de fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 90 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1 (tampon de equilibrado de 2-sefarosa). La elucion de la columna de sefarosa quelante se diluye con fosfato de sodio 20 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1 hasta alcanzar una conductividad de 10 ± 1 mS. La VB4- 845 parcialmente purificada se carga en una columna de Q-sefarosa a un caudal de 5,2 ml/min para reducir adicionalmente niveles de endotoxina y ADN. Una vez el producto se ha enlazado, la columna de intercambio ionico se lava con 15 CV de tampon de equilibrado de Q-sefarosa. Los contaminantes se encuentran en el flujo a traves y
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las etapas de lavado. El producto se eluye con fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, tampon de pH 7,2 ± 0,1 como una fraccion de 3 ml.
Ejemplo 11. Ensayo de competencia de VB4-845.
La lmea celular positiva a Ep-Cam CAL-27 (0,9 x 106) se preincuba con una cantidad no saturante de scFv VB4-845 biotinilado (0,5-1,0 pg) durante 10 min a 4 °C PBS-5 % de FCS enfriado con hielo. Despues de ello, el anticuerpo de ensayo (competidor) se diluye en PBS-5 % de FCS enfriado con hielo y se anade a la mezcla a una cantidad equimolar a la cantidad de scFv VB4-845 no biotiniladO capaz de inhibir completamente la union del scFv VB4-845 biotinilado. Despues de la incubacion durante 1h a 4 °C, las celulas se lavan con PBS-5 % de FCS enfriado con hielo y se incuban durante 30 min adicionales a 4 °C en presencia de Cy estreptavidina conjugada con cromo (Pharmingen, 1:120) diluida en tampon de lavado. Las celulas se lavan al final del periodo de incubacion y se analizan mediante citometna de flujo. Como control negativo, se incubaron celulas tumorales CAL-27 con scFv 4B5, un scFv espedfico anti-idiotipo que reacciona con anticuerpo espedfico de GD2 14G2a pero no con CAL-27, en lugar de scFv VB4-845. Alternativamente, se anade un no competidor (anti-HER-2/neu) que se une a CAL-27 en lugar de scFv de 4B5. En cada caso, se detecta de ningun cambio a un cambio mmimo en la mediana de la fluorescencia a partir de esa medicion para el scFv VB4-845 biotinilada solo. Para cada anticuerpo, el porcentaje de inhibicion se calcula segun la siguiente ecuacion:
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en la que:
PI = porcentaje de inhibicion; Fmbx = mediana maxima de fluorescencia con scFv VB4-845 biotinilado; Ft = mediana de fluorescencia de scFv VB4-845 biotinilado en presencia del anticuerpo de ensayo; FBgd= mediana de fluorescencia de fondo, la diferencia en la mediana de fluorescencia entre scFv VB4-845 biotinilado solo y scFv VB4-845 biotinilado en presencia de cualquiera de los anticuerpos de control negativos. Vease tambien Willuda y col., 1998, "High thermal stability is essential for tumor targeting of antibody fragments: engineering of a humanized anti-epithelial glycoprotein-2 (epithelial cell adhesion molecule) single-chain Fv fragment," Cancer Res. 59:5758-5767.
Ejemplo 12. Ensayos clmicos de HNSCC
En dos ensayos clmicos en HNSCC dirigidos principalmente a determinar la dosis tolerada maxima y a evaluar diferentes protocolos de dosificacion, los sujetos con HNSCC avanzado recibiran inyeccion por via intratumoral de VB4-845 segun diferentes protocolos de dosificacion. La dosis inicial (20 microgramos/tumor/dfa durante 5 dfas) representa menos de un ciento veinteavo de la exposicion intravenosa a dosis unica mas elevada observada en estudios en ratones de 3 semanas (en base al area superficial corporal) y menos de un setentavo de la exposicion intravenosa del dfa 5 mas elevada en estudios en ratones de 3 semanas (sobre una base de area superficial corporal).
El primer ensayo (un estudio de seguridad y tolerabilidad, de un solo brazo, abierto) es continuo y se ha completado o iniciado el tratamiento de al menos 13 sujetos. Se han completado dos ciclos de hasta 130 microgramos/tumor/dfa durante 5 dfas (nivel de dosis 4; 650 microgramos por tumor por ciclo, exposicion total de 1300 microgramos por tumor) en la mayor parte de estos sujetos. En este ensayo, el farmaco se inyecta directamente en el sitio del tumor o en uno de los crecimientos secundarios (metastasis) en la region de la cabeza y el cuello. La lesion accesible mas grande o mejor se selecciona para la inyeccion (lesion indicadora o diana). El ensayo comprende un esquema de escala de dosis de 2 ciclos. Cada ciclo tiene 4 semanas o 28 dfas de duracion. En los primeros 5 dfas consecutivos del ciclo los sujetos reciben diariamente inyecciones por via intratumoral del farmaco con una dosis inicial de 20 microgramos/tumor/dfa durante 5 dfas consecutivos, proporcionando asf 100 microgramos por tumor por ciclo (nivel de dosis 1). El periodo de 5 dfas viene seguido por un periodo de descanso de 23 dfas durante el que no se administrara farmaco. El sujeto se sometera semanalmente a seguimientos que incluyen examenes clmicos y analisis de muestras de sangre y de orina. Despues se repite un segundo ciclo de 28 dfas antes de la evaluacion final. Se dosifican en cada nivel de dosis un mmimo de 1 y hasta 3 sujetos. Los 6 niveles de dosis son 100, 200, 400, 650, 1000 y 1400 microgramo/tumor/ciclo (o 20, 40, 80, 130, 200 y 280 microgramos/tumor/dfa durante 5 dfas consecutivos). La manana de la dosificacion, cada vial se diluyo con hasta 900 pl de solucion salina tamponada con fosfatos (PBS), y la cantidad requerida de VB4-845 se introdujo en la jeringa. La tasa de dilucion se ajusta para lograr que el volumen que se va a inyectar no exceda aproximadamente el 30 % del volumen estimado de la masa tumoral que se va a inyectar. En el periodo de 5 dfas y las 24 horas siguientes a su ultima dosis, los sujetos se tratan en una unidad de cuidados intensivos. Se toman muestras de orina y de sangre diariamente para realizar un seguimiento de las funciones del tngado y los rinones y determinar la concentracion de farmaco en sangre. En cada evento de dosificacion, se realiza una puncion de la piel o la mucosa bucal en un sitio a aproximadamente el 80 % de distancia del centro del tumor fuera de la periferia del tumor, asegurando que la puncion se realiza en un sitio diferente a las punciones previas. Se realizan de seis (6) a ocho recorridos de aguja que surgen radialmente desde el sitio de puncion y se inyectan volumenes iguales de solucion en cada area. Se administraran analgesicos durante el tratamiento. El uso topico o sistemico de corticosteroides se restringira a toxicidad sintomatica de piel o mucosa
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de grado 3 o 4.
En un segundo ensayo, el farmaco se inyecta tambien directamente en el sitio del tumor o en uno de los crecimientos secundarios (metastasis) en la region de la cabeza y el cuello. Si el sujeto tiene mas de una lesion, se inyectara la lesion mas acesible dentro de una distancia de 5 cm en cualquer dimension mas grande. Si solo hay disponibles lesiones pequenas, pueden tratarse lesiones multiples en una dimension mas grande combinada de 5 cm. Los sujetos reciben dosificacion una vez a la semana, durante cuatro semanas consecutivas. Este periodo de 4 semanas vendra seguido por un periodo de descanso de 4 semanas, durente el que se realizara un seguimiento del estado del sujeto. El nivel de dosis inicial de VB4-845 es 100 p/tumor/semana y los otros niveles de dosis son 200, 330, 500, 700, 930 y 1240 microgramos/tumor/semana. La manana de la dosificacion, el vial o los viales se diluyen con hasta 800 pl de PBS, y despues la cantidad requerida de VB4-845 se introduce en la jeringa. El volumen final que se va a inyectar se ajusta usando un volumen de supension de solucion salina tamponada con fosfatos (PBS) de modo que no exceda el 30 % del volumen estimado de la masa tumoral que se va a inyectar. El farmaco se debe administrar de modo que se intente incluir la totalidad del volumen del tumor en cada dfa de dosificacion. Para la administracion, se insertan agujas pequenas (25 a 27 de calibre) unidas a jeringas Luer-lock de 1 cc en la base del tumor con un angulo de aproximadamente 45 grados. Dependiendo del tamano y de la ubicacion del tumor, la inyeccion puede realizarse adecuando la direccion del producto a traves del tumor desde un unico sitio de puncion o inyectando el tumor desde multiples sitios, con aumentos de 1 cm, en filas paralelas de aproximadamente 0,5 a 1,0 cm de distancia y desembolsando a lo largo de todo el tumor. Las respuestas del tumor se evaluaran antes del tratamiento en la visita de lmea base y la dosis previa en cada dosis subsiguiente, la semana 4 y al final del estudio. Cuando sea posible, se realiza una tomograffa computerizada (CT) en el cribado, semana 4 y semana 8 (o visita final). En el caso de que se observe una respuesta completa o parcial, se realizara una CT 4 semanas despues de confirmar el resultado. Otras evaluaciones se realizaran mediante medicion directa del tumor mediante observacion clmica y manipulacion. Una respuesta completa (CR) indicana la desaparicion total del tumor inyectado (confirmada a las 4 semanas); una respuesta parcial (PR) una reduccion en al menos el 30 % del diametro mas largo del tumor tratado (confirmada a las 4 semanas); enfermedad estable mediante una regresion del tumor inferior al 30 % o progresion inferior al 20 % y progresion del tumor (TP) un aumento del 20 % en el diametro mas largo del tumor tratado, no habiendose documentado previamente CR, PR o SD. El dolor puede evaluarse usando una escala de dolor analoga antes del tratamiento y antes de cada dosis y en la semana 4 y en la semana 8 (o visita final). Se tomaron biopsias aspiradas con aguja fina aleatorias del tumor diana para explorar los efectos de VB4-845 a un nivel celular. La toxicidad sistemica y local puede evaluarse usando procedimientos estandar y tendran lugar evaluaciones en continuo para determinar eventos adversos, toxicidades de laboratorio y el estado de dolor del sujeto a lo largo del tratamiento.
Ejemplo 13. Actividad biologica de VB4-845 contra lmeas de celulas tumorales de vejiga Sumario
La VB4-845 [protema de fusion de scFv anti-Ep-CAM y exotoxina A de Pseudomonas que carece del dominio de union a celulas (ETA252-608)] se evaluo mediante citometna de flujo para determinar la reactividad de superficie celular frente a una panel de lmeas celulares de tumor humanas que incluyen 14 lmeas celulares de cancer de vejiga para determinar el grado y la amplitud de la expresion de Ep-CAM en estas indicaciones clmicas potenciales. La VB4-845 muestra una reactividad fuerte frente a 10 de 14 lmeas celulares cancerosas de vejiga y una reactividad debil frente a otras. La VB4-845 muestra una citotoxicidad fuerte en once lmeas celulares de cancer de vejiga positivas a VB4-845; los valores de CI50 variaron de 0,001 a 320 pM para una exposicion de 72 horas. Por el contrario, no se detecto citotoxicidad frente a las tres lmeas celulares negativas a VB4-845. Se determino que cuatro lmeas celulares de cancer de vejiga (T-24, SW-870 UM-UC-10 y 1A6) eran las mas sensibles al tratamiento con VB4-845. En otro experimento sobre un subconjunto de lmeas celulares en el que el tiempo de exposicion se limito a 2 horas, la VB4-845 ejercio una citotoxidad eficaz (> 93 %) contra la lmea de celulas de cancer de vejiga escamosas, SCaBER y la lmea celular de carcinoma de vejiga transicional, 5637. Por el contrario, para una exposicion de 2 horas de 5637 a la inmunotoxina de control, 4B5-PE, se mostro que la citotoxidad no espedfica era minima (< 10 %) a 500 pM y permaneda en el mismo nivel incluso despues de aumentar la dosis 100 veces (50.000 pM). En resumen, la actividad antitumoral in vitro potente de VB4-845 sobre lmeas celulares de cancer de vejiga sugiere que la VB4-845 tiene utilidad para el desarrollo preclmico y clmico de terapia anticancerosa contra canceres de vejiga.
Diseno experimental
El diseno experimental para analizar la reactividad de VB4-845 con lmeas celulares tumorales mediante citometna de flujo se ha descrito 3,4. Las protemas de fusion scFv-ETA, VB4-845 (N° de lote 02203, 1 mg/ml) y el control negativo 4B5scFv-ETA (N° de lote 032403, 1,5 mg/ml) se generaron tal como se ha descrito y se almacenaron a -80 °C. El panel de lmeas celulares tumorales usadas en el estudio y sus caractensticas estan en la Tabla 9. Todas las celulas tumorales se propagaron en medio de cultivo que contema el 10-20 % de FCS y suplementos apropiados, siguiendo protocolos de ATCC o de ECACC. Las celulas tumorales se recogieron cuando los cultivos eran el 50-70 % confluentes con viabilidad superior al 90 %. La lmea celular CAL-27 expresa un nivel elevado de antfgeno Ep- CAM y se uso como control positivo, mientras que la lmea celular que expresa Ep-CAM a un nivel bajo COLO 320 se uso como control negativo.
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La VB4-845 purificada se analizo frente al panel de lmeas celulares tumorales para determinar la reactividad de superficie celular mediante citometna de flujo. Brevemente, se incubaron celulas tumorales (0,9 x 106/300 pl) con VB4-845 purificada o scFv 4B5 como control negativo, a 10 pg/ml durante 2 horas en hielo. Se uso un anticuerpo monoclonal de raton anti-EGFR (Oncogene Research, N° de cat. OP15, a 1 pg/ml) como control positivo. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS-5 % de FBS y se incubaron o bien con anticuerpo anti-HIS-Tag (Amersham Pharmacia N° de cat. 27-4710-01, diluido 1:800) para VB4-845 o bien IgG antirraton conjugada con biotina para anti-EGFR (Pierce NH° de cat. 31174, diluido 1:200) durante 1 hora en hielo. Las celulas se lavaron con PBS-5 % de FBS, proceso seguido por la incubacion con o bien IgG antirraton de cabra conjugada con FITC (The binding Site N° de cat. AF271, diluido 1:100, para celulas tratadas anti-HIS), o bien estreptavidina-Cy-cromo (Pharmingen N° de cat. 13038A, diluido 1:120) durante 30 minutos en hielo. Finalmente, las celulas se lavaron y se resuspendieron en 0,5 ml de tampon que contema yoduro de propidio (Molecular Probes N° de cat. P-1304) a 0,6 pg/ml. La union a la celula tumoral se determino usando un FACSCalibur. Los anticuerpos se consideraron positivos si las celulas tumorales tratadas con anticuerpo mostraban un desplazamiento positivo en fluorescencia que da como resultado > 30 % de celulas positivas (1,3 veces el control) sobre el control negativo.
Evaluacion de citotoxicidad mediada por VB4-845 mediante el ensayo de proliferacion celular
La toxicidad de VB4-845 se midio mediante determinacion de la inhibicion de la proliferacion celular mediante el ensayo MTS. Brevemente, se prepararon placas de microvaloracion de 96 pocillos sembrando celulas tumorales a 5000 celulas/50 pl/pocillo en medio de cultivo que contema el 10 % de fCs. Las placas se incubaron durante 3 horas a 37 °C en presencia del 5 % de CO2. Se realizaron diluaciones seriadas diez veces de VB4-845 en este momento y se anadieron cantidades variables de VB4-845 (0,00005 a 500 pM) a cada pocillo en un volumen de 50 pl, para llevarlo a un volumen final de 100 pL. Como control negativo se uso 4B5 scFv-ETA en las mismas concentraciones. Las celulas de control y los pocillos de control (vacms) se incubaron con 100 pl de medio solo, en grupos de cuatro. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C en presencia del 5 % de CO2. Cada ensayo se repitio dos veces para demostrar la reproducibilidad y la consistencia de los resultados. Despues de la incubacion, se realizo un ensayo MTS para medir la viabilidad celular. Brevemente, se anadieron 75 pl de metosulfato de fenazina, PMS (0,92 mg/ml en PBS) a 1,5 ml de un compuesto de tetrazolio, MTS (Promega, N° de cat. G111A y G109C, 2 mg/ml en PBS) y se anadieron 20 pL de la mezcla PMS/MTS a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C en presencia del 5 % de CO2. Subsiguientemente, las placas se leyeron a 490 nm usando un lector de placas de ELISA.
Determinacion del tiempo de exposicion mmimo a la inmunotoxina requerido para la citotoxidad mediada por VB4-845
La CI 50 (la concentracion de VB4-845 que destruye el cincuenta por ciento de celulas en comparacion con las celulas tratadas con medio solo) se determino exponiendo la VB4-845 a cada lmea celular de cancer de vejiga durante 72 horas. Se seleccionaron cinco lineas celulares sensibles de sensibilidad variable en la destruccion (SW-780, UC- MC-10, 1A6, UC-MC-14 y 5637) para establecer el tiempo de exposicion minimo requerido para destruir el 50 % de celulas tumorales usando una concentracion fijada que se aproximaba a la CI50. Las celulas tumorales se expusieron a VB4-845 a una concentracion fijada (0,01, 0,6 o 6 pM) durante 2, 4, 24, 48 y 72 horas. Excepto para 72 horas, en cada punto temporal, el medio que contema VB4-845 se reemplazo por un medio de cultivo nuevo para minimizar el tiempo de exposicion a la inmunotoxina (VB4-845). En ensayo MTS se realizo despues de 72 horas de incubacion para determinar la citotoxicidad (50 % de destruccion de celulas tumorales) en comparacion con el control (celulas con medio solo). Para evaluar adicionalmente el efecto de VB4-845 sobre una lmea celular de carcinoma de celula escamosa menos sensible (SCaBER) y una lmea celular de carcinoma transicional de vejiga sensible (5637) y otras dos lmeas celulares de cancer de vejiga (UM-UC-10 y UM-UC-14), las celula se expusieron durante 2 horas a una concentracion fijada o a dosis variables de VB4-845. Despues de 2 horas de incubacion, las celulas se lavaron para eliminar la VB4-845, se incubaron con medio nuevo y se realizo el ensayo de MTS despues de 72 horas. Ademas, para establecer el efecto citotoxido espedfico de VB4-845, se expusieron celulas 5637 a dosis variables (500, 5000, 50000 pM) de VB4-845 y la inmunotoxina de control negativa, 4B5-PE para determinar el efecto de destruccion a concentraciones mas elevadas. Despues de la incubacion en cada punto temporal, 2, 6, 12, 24 y 48 horas, las celulas se lavaron con medio para eliminar VB4-845, se incubaron con medio nuevo y se realizo el ensayo de MTS despues de 72 horas para determinar la citotoxicidad. El intervalo de dosificacion se selecciono en base a los resultados iniciales de CI50 con la esperanza de que la dosis minima de VB4-845 que se esta usando proporcionara la maxima destruccion de esta lmea celular.
Resultados
Reactividad de celulas tumorales a VB4-845
La reactividad de superficie cellular de VB4-845 se evaluo frente a un panel de lmeas celulares tumorales de vejiga. La VB4-845 mostro una reactividad positiva frente a 11 de las 14 lmeas celulares de cancer de vejiga. Los datos se resumen en la tabla 10.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las celulas tumorales se incubaron con VB4-845 durante 72 horas a concentraciones que variaban de 0,00005 a 500 pM y se evaluo la inhibicion de la proliferacion celular mediante ensayo de MTS. Los resultados se resumen en la Tabla 10. La VB4-845 no inhibio la proliferacion cellular en las tres lrneas celulares negativas a EGP-2 (J-82, UM- UC- 3 and UM-UC-13) pero mostro una inhibicion fuerte (CI50 de 0,001-0,033 pM) en la cuarta lmea cellular con una expresion muy elevada de antigeno de Ep-CAM (T-24, SW-780, UM-UC-10 y 1A6 y la inhibicion intermedia de otras lrneas celulares.
Tiempo de exposicion mrnimo requerido para lograr una citotoxicidad mediada por VB4-845 frente a lineas celulares de cancer de vejiga in vitro
En el ensayo de proliferacion celular estandar, se expusieron celulas de carcinoma de vejiga a VB4-845 durante 72 horas, despues de lo cual se evaluo la inhibicion de la proliferacion celular. Para cancer de vejiga, los tiempos de permanencia de la terapia intravesicular son raramente superiores a dos horas. Por lo tanto, se realizo un ensayo de proliferacion celular para determinar el tiempo de exposicion mrnimo requerido para destruir el 50 % de celulas tumorales despues de la exposicion a VB4-845 a una concentracion fijada a, o cercana a, la CI50 (0,01 o 0,6 pM). En el primer experimento, se expusieron dos lrneas celulares de cancer de vejiga sensibles a VB4-845 (SW-780 y 1A6) a VB4-845 a una concentracion 0,01 pM durante 2, 4, 6, 24, 48 o 72 horas. La VB4-845 mostro una citotoxicidad fuerte en las lrneas celulares de cancer de vejiga SW-780 y 1A6 incluso despues de un tiempo de exposicion corto. Para la lmea celular de canceer de vejiga muy sensible SW-780, (con una CI50 0,002 pM), se destruyeron el 50 % de las celulas tumorales despues de 3 horas de exposicion, mientras que para una lmea celular menos sensible, 1A6, (CI50 0,033 pM), se logro el mismo resultado despues de 37 horas de exposicion. Una serie de datos similares se obtiene en el segundo experimento, despues de una exposicion de tres lrneas celulares de cancer de vejiga a VB4- 845 a una concentracion 0,6 pM. Los resultados indicaron que el 50 % de celulas UM-UC-10, 5637 o uM-UC-14 se destruyeron despues de 4, 16 y 20 horas de exposicion, respectivamente. El orden de rango de sensibilidad de estas tres lrneas fue el mismo que para sus CI50.
En un experimento aparte, despues de la exposicion a VB4-845 a una concentracion mas elevada (6,0 pM) durante 2 horas, el 96, el 89 y el 93 % de celulas UM-UC-10, 5637 y UM-UC-14 se destruyeron, respectivamente. En una evaluacion posterior, despues de la exposicion a una lmea celular menos sensible (SCaBER) y a una lmea celular sensible (5637) durante 2 horas con una dosis variable de VB4-845, se logro un efecto citotoxico fuerte con > 93 % de destruccion de celulas SCaBER con una dosis de 3900 pM, cuando se habfa logrado el mismo grado de toxicidad con una dosis mucho menor para celulas (< 498 pM) para celulas 5637. Asf, se confirmo que la dosis minima de VB4-845 requerida para lograr el efecto de citotoxicidad maximo depende de la sensibilidad de la lmea celular. Ademas, en un experimento aparte, la exposicion de 5637 a VB4-845 durante 2 horas a una concentracion 500 pM mostro una destruccion eficaz (> 93 %) de las celulas con una citotoxidad no espedfica minima (< 10 %) demostrada mediante la inmunotoxina de control (4B5-PE). De hecho, durante una exposicion de 2 horas, se mantuvo la destruccion no espedfica a un nivel mrnimo incluso despues de aumentar la concentracion de 4B5-PE 100 veces.
Ejemplo 14. Union a vejiga clmica humana
Se obtuvieron espedmenes de tejido de vejiga humano por cirugfa y necropsia y se analizaron para determinar la union a Ep-CAM usando VB4-845. Los espedmenes se fijaron en formalina y se embebieron en parafina. La validacion del procedimiento se realizo en muestras congeladas nuevas y fijadas para confirmar la adeucacion del especimen fijado para este ensayo y para determinar la concentracion de anticuerpo (VB4-845) optima para usar (minimizando la tincion no espedfica).
Se tineron diecisiete carcinomas de celula transicional de vejiga de grado III y estadios II o III y 12 muestras de control de vejiga normales con anticuerpo VB4-845 a 4 microgramos/ml (~57 nM). La preparacion de las platinas y el bloqueo se realizaron segun procedimientos de inmunohistoqmmica bien conocidos. La deteccion de la VB4-845 unida al tejido se realizo usando un anticuerpo anti-exotoxina de Pseudomonas de conejo (Sigma P2318), seguido por un anticuerpo secundario anticonejo biotinilado (BA-1000 anti-conejo de Vector ) y el sistema de deteccion ABC- AP de Vector usando rojo Vector como sustrato.
Los carcinomas mostraron un tincion aumentada con respecto al epitelio transicional normal y la tincion mas fuerte observada en los casos positivos estaba asociada a membrana. Dentro de los carcinomas, la tincion fue variable en intensidad e irregular en distribucion. Hubo tambien una tincion aumentada dentro de areas que muestran grados de debiles a moderados de diferenciacion (es decir, diferenciacion transicional o columnal) en comparacion con areas dentro del mismo tumor o los mismos tumores que muestran menos diferenciacion o altos grados de anaplasia nuclear y pleomorfismo.
De los 17 carcinomas transicionales tenidos, ocho muestras mostraron areas de tincion de membrana de debiles a moderadas (2-3 en una escala de intensidad de tincion de 0-4 (muestras 2, 6, 8, 11, 13, 15 y 16), uno mostro areas de tincion debiles (muestra 9) y las otras muestras fueron negativas a la tincion de membrana. La tincion era variable dentro de los tumores y pareda asociada con el grado de diferenciacion dentro de la muestra. Dentro de las 12
5
10
15
20
25
30
35
muestras de vejiga normales, dos muestras mostraron tincion de membrana de frecuencia debil a moderada (muestras 2 y 11). No se observo tincion con una inmunotoxina de control negativo (scFv-PE de un anticuerpo a un antigeno irrelevante).
La tincion citoplasmica y, mas raramente, la nuclear se observo en algunos espedmenes normales y de carcinoma. En un estudio de validacion, la concentracion maxima de VB4-845 dio como resultado mas "coloracion roja" o tincion citoplasmica pero una tincion de membrana mas intensa en un porcentaje superior de celulas de carcinoma. En un ajuste clmico (in vivo) ya que el citoplasma y el nucleo no se exponen al producto podna usarse una concentracion mas elevada de VB4-845 para aumentar la union a celulas con un numero mas reducido de receptores.
Ejemplo 15. Ensayo clmico de vejiga
En un ensayo clmico para evaluar la dosis maxima tolerada de VB4-845, el farmaco se administra por via intravesicular a sujetos con carcinoma de celula transicional refractaria a BCG (TCC) de la vejiga. El ciclo de tratamiento incluye 6 semanas de terapia y 4 a 6 semanas de seguimiento. La dosis apropiada de VB4-845 se administrara mediante cateterizacion directamente en la vejiga (tumor) una vez a la semana durante 6 semanas consecutivas. Los 7 niveles de dosis de VB4-845 son 100, 2O0, 335, 500, 700, 930 y 1240 microgramos en 50 ml en cada uno de los 6 dfas de dosificacion.
Inmediatamente antes de la administracion del farmaco, la vejiga debe vaciarse despues de lo cual se insertara un cateter. Para un sujeto varon, se usara un cateter 16 French Coude con un Urojet y para un sujeto mujer se usara un cateter de goma roja 14 French con lubricante esteril. La solucion de VB4-845 reconstituida se diluira en 50 ml de solucion salina normal, instilada en una vejiga vada mediante cateterizacion, y se mantendra durante 2 horas con el cateter pinzado en el sitio. Al finalizar las 2 horas, la vejiga se vaciara despinzando el cateter.
La seguridad, es decir, los datos de experiencia de laboratorio y adversa (AE) en cada nivel de dosis se evaluaran despues de 3 semanas de tratamiento antesw de la escala de dosis. El sujeto continuara con la terapia semanal a un determinado nivel de dosis durante un periodo de 6 semanas o hasta que haya una toxicidad limitante de dosis (DLT) asociada con el farmaco. Se realizaran visitas de seguimiento dentro de un periodo de 4 a 6 semanas despues de la ultima semana de administracion del farmaco. Un sujeto que experimenta una DLT, pero muestra evidencias clmicas de beneficio de terapia recibira ciclos adicionales de tratamiento al nivel de dosis mas bajo siguiente una vez se han resuelto todas las toxicidades. El tratamiento no se terminara, sin embargo, para un sujeto que experimenta una segunda DLT a una dosis reducida. La respuesta del tumor se evaluara mediante citologfa, citoscopia y biopsia.
Aunque la presente invencion se ha descrito con referencia a lo que se considera en el presente documento que son los ejemplos preferentes, se entiende que la invencion no esta limitada a los ejemplos divulgados.
Tabla 1. Especificaciones de producto de la muestra de VB4-845
Ensayo
Criterios
Apariencia
Solucion transparente a 2 - 8 °C
Protema (BCA)
1,0 ± 0,2 mg/ml
ph
7,2 ± 0,2
SDS-PAGE (no reductor: Coomassie Blue)
Banda principal ~70 kDa (area >D90%)
Actividad biologica (FACS)
aumento >D50 veces en fluorescencia sobre el anticuerpo de control
Citotoxicidad (CI50)
< 0,50 pM
ADN total
< 1,0 ng/mg
Endotoxina (LAL)
< 2000 UE/mg
Esterilidad
Sin crecimiento
Informacion del sistema de ensayo:
Hospital Universitario de Zurich, Departmento de Medicina Interna, Division de Oncologfa Medica, Zurich, Suiza Lmeas celulares: Carcinoma de pulmon de celula pequena SW2 Carcinoma de celula escamosa CAL27 Carcinoma colorrectal HT29 Carcinoma colorrectal COLO320 Adenocarcinoma de mama MCF7 Linfoma de no Hodkin RL
Forma de dosificacion:
VB4-845: 0,0001-100 pM
Ensayo:
Ensayo de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2- ill-2,5-disfeniltetrazolio)
Duracion de estudio:
72 horas
Parametros evaluados:
Inhibicion del crecimiento celular por VB4-845
Efectos observados y conclusiones:
Se hallo que las celulas SW2, CAL27 y MCF7 eran igualmente sensibles al efecto citotoxico de VB4- 845 (CI50 = 0,005 pM). Se hallo que las celulas HT29 eran las menos sensibles (CI50 0,2 pM).
5
Tabla 3 Resumen del efecto de VB4-845 frente a la smtesis de protemas en celulas tumorales in vitro
Informacion del sistema de ensayo:
Hospital Universitario de Zurich, Departmento de Medicina Interna, Division de Oncologfa Medica, Zurich, Suiza Lmeas celulares: Carcinoma de pulmon de celula pequena SW2 Linfoma de no Hodkin RL
Forma de dosificacion:
VB4-845 - cantidades variables
Ensayo:
Absorcion de [4,5-3Hlleucina
Duracion de estudio:
30 horas
Parametros evaluados:
Absorcion de [3Hlleucina (medida de smtesis de protemas)
Efectos observados y conclusiones:
La smtesis de protemas se inhibio mediante VB4-845 en SW2 positivas a Ep-CAM con una CI50 0,01 pM. La smtesis de protemas en la lmea celular de control negative a Ep- CAM RL no se vio afectada
Tabla 4. Resumen del efecto de VB4-845 sobre tumores solidos en modelos de xenoinjerto en ratones de cancer
Informacion de animales de ensayo:
Raton, atimico desnudo Hospital Universitario de Zurich, Departmento de Medicina Interna, Division de Oncologfa Medica, Zurich, Suiza Animales implantados s.c. con uno de: Carcinoma de pulmon de celula pequena SW2 Carcinoma de celula escamosa CAL27 Carcinoma colorrectal HT29 Carcinoma colorrectal COLO320
Forma de dosificacion:
VB4-845: 5 y 10 |jg (vease mas adelante)
Via de administracion:
Intravenosa
Regimen de tratamiento:
i) 5 jg cada dos dfas durante 3 semanas (45 jg en total) i) 10 jg cada dos dfas durante 1 semana (30 jg en total)
Duracion de estudio:
50 dfas
Parametros evaluados:
Tamano del tumor primario
10
imagen2
(continuacion)
SW2: reduccion del volumen del tumor a un maximo del 20 % del tamano inicial y una ligera reanudacion de crecimiento a un aumento de tamano final de 2,6 veces al final del periodo de seguimiento.
CAL27: tumores reducidos a un maximo del 60 % del volumen inicial. La mediana del volumen tumoral no excede 1,4 el tamano inicial 50 dfas despues del inicio del tratamiento. Dos de 7 ratones tratados con la dosis de 5 |jg mostraron una regresion total del tumor y permanecieron sin tumores. Ni los tumores de CAL27 ni los de SW2 mostraron una diferencia significativa en la respuesta del tumor a las dos agentes de tratamiento.
HT29: el tamano del tumor disminuyo 0,7 veces con el regimen de dosificacion de 5 jg. Tres (3) de 7 ratones mostraron regresion completa de sus tumores HT29. La eficacia de la agenda de 10 jg fue comparativamente inferior, indicando que para estos tumores es mas eficaz un tratamiento a largo plazo.
No se observo ningun efecto antitumoral de VB4-845 en ratones que portaban tumores de control de COLO320 negativos a Ep-CAM.
5
Tabla 5. Resumen del efecto de inyecciones por via peritumoral de VB4-845 sobre tumores de carcinoma de celula escamosa CAL27 en modelos de xenoinjerto en ratones de cancer
Informacion de animales de ensayo:
Raton, atfmico desnudo Hospital Universitario de Zurich, Departmento de Medicina Interna, Division de Oncologfa Medica, Zurich, Suiza Animales implantados s.c. con carcinoma de celula escamosa CAL27
Forma de dosificacion:
VB4-845: 5 jg (vease mas adelante)
Via de administracion:
Peritumoral
Regimen de tratamiento:
5 jg cada dos dfas (lunes/miercoles/viernes) durante 3 semanas (45 jg en total)
Duracion de estudio:
80 dfas
Parametros evaluados:
Tamano del tumor primario
Efectos observados y conclusiones:
Se observo una inhibicion significativa del crecimiento tumoral en animales tratados. Dos ratones mostraron una regresion del tumor completa y permanecieron sin tumores durante la duracion del experimento.
Tabla 6 Resumen del efecto de dosis repetidas en escala de VB4-845 sobre el tugado, el bazo y los huesos de
ratones inmunocompetentes
Informacion de animales de ensayo:
Raton, inmunocompetente C57BL/6 Hospital Universitario de Zurich, Departmento de Medicina Interna, Division de Oncologfa Medica, Zurich, Suiza
Forma de dosificacion:
VB4-845: 5 jg (vease mas adelante) 10 jg 20 jg
Via de administracion:
i.v.
Regimen de tratamiento:
5 o 10 jg cada dos dfas durante 3 dosis (15 o 30 jg en total, respectivamente) 20 jg cada dos dfas durante 2 dosis (40 jg en total)
Grupos de estudio:
3 animales / grupo 5 grupos
Duracion de estudio:
7 dfas
Parametros evaluados:
ALT / AST en plasma Hallazgos histopatologicos, tugado, bazo y huesos
10
Efectos observados y conclusiones:
(Continuacion)
Ninguna elevacion en enzimas del hngado 24 horas despues del final de la dosificacion en los ratones de regimen de dosificacion de 5 o 10 |jg.
Niveles de ALT / AST observados 24 horas despues de la dosis final en los animales de 20 jg de dosis.
Ningun hallazgo histopatologico en los grupos de dosis de 5 y 10 jg.
Se hallaron unos pocos sitios con hepatocitos necroticos en el grupo de tratamiento de 20 jg.
No se observo ningun cambio histopatologico o mielosupresion en ningun grupo de dosificacion en el bazo o componentes celulares de muestras de sangre completa.___________________________
5
Tabla 7: Relacion entre dosis usadas en estudios con ratones y la dosis baja y alta propuestas de VB4-845 en seres
humanos.
Especie
Exposicion a una dosis unica (jg/kg) Raton Multiplo de dosis humanas (dosis baja/alta)1 Exposicion general mensual (jg/kg) Raton Multiplo de dosis humanas mensuales (dosis baja/alta)2 Exposicion total (jg/kg) Raton Multiplo de dosis humanas totales (dosis baja/alta)3
Raton atfmico
250 862/63 2250 1585/113 2250 523/38
Raton atfmico
500 1724/125 1500 1056/75 1500 349/25
Raton atfmico
250 862/63 2250 1585/113 2250 523/38
Raton C57BL/6
250 862/63 750 528/38 750 174/13
Raton C57BL/6
500 1724/125 1500 1056/75 1500 349/25
Raton C57BL/6
1000 3448/250 2000 1408/100 2000 465/3
1 0.29 y 4 jg/kg es la dosis unica baja y alta propuesta, respectivamente, para la administracion humana (es decir, 20 jg y 280 jg administrados a un individuo de 70 kg). 2 1,4 y 20 jg/kg es la dosis mensual baja y alta propuesta, respectivamente, para administracion humana (es decir, 20 jg y 280 jg administrados a un individuo de 70 kg cada dfa durante cinco dfas consecutivos con un periodo de lavado de tres semanas). 3 4,3 y 60 jg/kg es la dosis total baja y alta propuesta, respectivamente, para administracion humana (es decir, 20 jg y 280 jg administrados a un individuo de 70 kg cada dfa durante cinco dfas consecutivos con un periodo de lavado de tres semanas).
Tabla 8
Numero de muestra
Grado de carcinoma Estadio del carcionoma Tincion de membrana positiva % de celulas positivas
1
iii 11 - -
2
iii 11 Si 40 %
3
iii 11 - -
4
iii 11 - -
5
iii 11 - -
6
iii 11 Si 10 %
7
iii 11 - -
8
iii 11 Si 40 %
9
iii iii Si 70 %
10
iii iii - -
11
iii iii Si 25 %
12
iii iii - -
13
iii iii Si 30-40 %
14
iii iii - -
15
iii iii Si 10 %
16
iii iii Si 30 %
(continuacion)
Numero de muestra
Grado de carcinoma Estadio del carcionoma Tincion de membrana positiva % de celulas positivas
17
iii iii - -
Tabla 9: Caractensticas de lmeas celulares de cancer de vejiga
5
N° de ref.
Lmeas celulares de cancer de vejiga Tejido de tumor primario de origen Grado del tumor Estadio del tumor Diferenciacion
1
1A6 TCC de vejiga Alto Invasivo Buena
2
T-24 TCC de vejiga Alto Invasivo Mala
3
SW-780 TCC de vejiga Bajo Invasivo Sin datos
4
HT-1197 TCC de vejiga Alto Invasivo Mala
5
RT-4 TCC de vejiga Bajo Superficial (no invas.) Buena
6
SCaBER SqCC de vejiga Sin datos Invasivo Moderada
7
HT-1376 TCC de vejiga Alto Invasivo Mala
8
TCCSUP TCC de vejiga Alto Invasivo Mala
9
J-82 SqCC de vejiga Alto Invasivo Mala
10
UM-UC-3 TCC de vejiga Alto Invasivo Mala
10
UM-UC-13 TCC de vejiga Alto Invasivo Sin datos
11
UM-UC-10 Sin datos Sin datos Sin datos Sin datos
11
UM-UC-14 Sin datos Sin datos Sin datos Sin datos
1
5636 TCC de vejiga Alto Invasivo Sin datos
Referencias: 1: A clone of the parent cell line, 5637, Immunobiol. 172:175-184 (1986), Urol. Res. 21:2732 (1993); 2: Int. J. Cancer 11: 765-773 (1973), J. Uro 149: 1626-1632 (1993); 3: Cancer Res. 44: 39974005 (1984); 4: J. Natl. Cancer Inst. 58: 881-890 (1977); 5: J. Urol. 161: 692-698 (1999); 6: Int. J. Cancer 17: 707-714 (1976); 7: J. Natl. Cancer Inst. 58: 881-890 (1977); 8: Br. J. Cancer 35:142151 (1977); 9: Br. J. Cancer 38: 64-76 (1978) ; 10: J. Urol. 146: 227-231 (1991); 11: AntiCancer Inc, Cell lines. TCC: Carcinoma de celula transicional. SqCC: Carcinoma de celula escamosa.
Tabla 10: Reactividad de superficie celular tumoral de VB4-845
Lmeas celulares de cancer de vejiga
Reactividad 1 : Veces de aumento en fluorescencia Citotoxicidad CI50 (pM) Citotoxicidad: Sensitividad relativa frente a CAL27 2
1A6
154,7 ± 15,2 0,033 ± 0,01 8,8
T-24
134,1 ± 35,9 0,001 ± 0,0 290
UM-UC-10
124,6 ± 5,3 0,024 ± 0,00 12,1
5637
97,0 ± 11,2 0,38 ± 0,13 0,8
SW-780
86,7 ± 3,1 0,002 ± 0,00 145
HT-1197
56,5 ± 2,3 0,23 ± 0,05 1,3
RT-4
55,3 ± 16,4 0,20 ± 0,10 1,4
SCaBER
54,0 ± 2,1 10,1 ± 0,0 0,03
HT-1376
40,7 ± 0,3 3,3 ± 1,2 0,1
UM-UC-14
25,7 ± 1,2 0,17 ± 0,2 1,6
TCCSUP
7,2 ± 0,1 320,0 ± 102,0 0,0009
J-82
1,2 ± 0,12 > 500 n/a
UM-UC-3
1,2 ± 0,12 > 500 n/a
UM-UC-13
1,3 ± 0,12 > 500 n/a
CAL-27(Control positivo)
87,0 ± 3,0 0,29 ± 0,1 1,0
COLO-320(Control negativo)
1,1 ± 0,12 > 500 n/a
1 Veces de aumento de la mediana de la fluorescencia sobre el control. Los valores se expresan como media ± SEM. La reactividad del anticuerpo para una indicacion dada se determino mediante veces de aumento medio, en promedio, en la mediana de la fluorescencia calculada para cada lmea celular en esa indicacion. 2Las lmeas celulares que muestran un desplazamiento positivo en la fluorescencia < 30 % (1,3 veces de aumento) se consideraron negativas.
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ABREVIATURAS
ADME: administracion, distribucion, metabolismo y excrecion
ADP: adenosina fosfato
ALT: alanina aminotransferasa (SGPT)
AST: aspartato aminotransferasa (SGOT)
BCA: procedimiento de acido bicinconmico
Cmax: concentracion maxima
ADN: acido desoxirribonucleico
Ep-CAM: molecula de adhesion a celula epitelial
ETA: exotoxina A de Pseudomonas
UE: unidades de exotoxina
FACS: procedimiento de seleccion de celulas activadas por fluorescencia GLP: buenas practicas de laboratorio
HNSCC: carcinoma de celula escamosa de la cabeza y el cuello
CI 50: concentracion de inhibicion al 50
i.t. intratumoral
i.v. intravenoso
kDa: kilodalton
LAL: lisado de amebocitos de limulus MAb: anticuerpos monoclonales mg: miligramo ml: mililitro mM: milimolar
MTD: dosis maxima tolerada
MTT: bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-disfeniltetrazolio NaCl: cloruro de sodio ng: nanogramo
PBS: solucion salina tamponada con fosfatos
pI: punto isoelectrico
PK:: farmacocinetica
pM: picomolar
p.t.: peritumoral
s.c.: subcutaneo
scFv: fragmento de anticuerpo monocatenario SCLC: cancer de pulmon de celula pequena DT: desviacion tfpica
SDS PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio t-i/2: semivida
Tmax: tiempo a la concentracion maxima |jg: microgramo
VLS: smdrome de fuga vascular OMS: Organizacion Mundial de la Salud wt: tipo silvestre
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El ambito de la presente invencion no debe limitarse a las realizaciones espedficas descritas anteriormente. Seran evidentes muchas modificaciones de la presente invencion, ademas de las indicadas espedfica y anteriormente para los expertos en la tecnica de la presente divulgacion. Se pretende que estas modificaciones entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Zangemeister-Wittke, Uwe Di Paolo, Claudio Tschudi, Dominique C. Fitsialos, Dimitri Glover, Nicholas R.
<120> Procedimientos de tratamiento del cancer usando una inmunotoxina
<130> 10241-10
<150> 60/466,608 <151>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1 <211> 2084 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> VB4-845
<220>
<221> CDS <222> (66)..(2084)
<223>
<400> 1

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello administrandola directamente al sitio del cancer por via intratumoral o peritumoral y en el que dicha inmunotoxina comprende:
    (a) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM en la celula cancerosa unido a;
    (b) una toxina que es citotoxica para la celula cancerosa.
  2. 2. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es murino, humanizado o un anticuerpo o fragmento quimerico.
  3. 3. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab'. (Fab')2, scFv o dsFv, en el que, de manera opcional, el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv.
  4. 4. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende las CDR de cadena ligera como se define por las SEQ ID NO:4-6 y las CDR de cadena pesada como se definen por las SEQ ID NOS:7-9.
  5. 5. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o la prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 1, en la que la inmunotoxina consiste en la secuencia de aminoacidos como se define por la SEQ ID NO:2.
  6. 6. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun las reivindicaciones 1, en el que el fragmento de anticuerpo consiste en la secuencia de aminoacidos como se define por la SEQ ID NO:3 o una variante de la misma.
  7. 7. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo o fragmento se une a Ep-CAM humana con una constante de disociacion (Kd) inferior a 2,0 x 10"8.
  8. 8. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la toxina comprende un agente que actua alterando el ADN, un agente que actua alterando la tubulina, un agente alquilante, un agente antimitotico, un inhibidor de topoisomerasa I, un inhibidor de topoisomerasa II, un antimetabolito de ARN o de ADN, sulfato de vinblastina o un polipeptido inactivador de ribosomas, en el que opcionalmente es seleccionada la toxina del grupo que consiste en gelonina, bouganina, saporina, ricina, cadena de ricina A, briodina, difteria y restrictocina, en particular, en el que la toxina es exotoxina A de Pseudomonas o una variante de la misma.
  9. 9. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que adicionalmente comprende el uso de productos terapeuticos contra el cancer adicionales para el tratamiento o prevencion de forma simultanea, separada o secuencial de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, en el que los productos terapeuticos contra el cancer adicionales se seleccionan de los grupos que consisten en:
    (A) una o mas citosinas incluyendo una linfocina, factor de necrosis tumoral, citocina similar al factor de necrosis tumoral, linfotoxina, interferon, protema inflamatoria de macrofagos, factor estimulante de colonias de granulocitos y de monocitos e interleucina, y una variante de los mismos, incluyendo una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos;
    (B) antibioticos incluyendo bleomicina, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, agentes antihistammicos o agentes antinauseas;
    (C) productos terapeuticos hormonales incluyendo flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolida, dexametasona, retinoide, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidrotestosterona, glucocorticoide, mineralocorticoide, estrogeno, testosterona o progestina;
    (D) radioterapia, de manera opcional, en combinacion con cisplatino, fluorouracil, carboplatino y/o paclitaxel; cirugfa y/o quimioterapia;
    (E) terapia genica;
    (F) uno o mas agentes terapeuticos incluyendo bleomicina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbacina, docetaxel, fludarabina, fluorouracil, flutamida, gemcitabina, hidroxiurea, interferon alfa, interferon beta, interferon gamma, interleucina 2, metotrexato, mitomicinas, oxaliplatino, paclitaxel, tamoxifeno, vincristrina, gemtuzumab, 6-mercaptourina, 6-tioguanina, 5-fluorouracilo, temozamida, hexametilmelamina, analogos de nucleosido, camptotecina, topotecan, irinotecan, Irinotecan, vinca alcaloides, antraciclinas, acetato de leuprolida, rituximab, retinoina y vinorelbina.
    (G) al menos otro inmunoterapeutico incluyendo rituximab, gemtuzumab y trastuzumab; o
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    25
    (H) tartrato de vinorelbina y/o paclitaxel.
  10. 10. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la inmunotoxina es administrada a una dosis de 10 a 3000 |jg de inmunotoxina/tumor/dfa, de manera opcional, a una dosis de 20 a 1240 |jg de inmunotoxina/tumor/dfa.
  11. 11. Una cantidad eficaz de una inmunotoxina para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la inmunotoxina es administrada durante 1-6 ciclos, en los que cada ciclo comprende una dosis diaria durante 1 a 7 dfas.
  12. 12. Un kit para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello que comprende una cantidad eficaz de una inmunotoxina que comprende (a) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM en la celula cancerosa unido a; (b) una toxina que es citotoxica para la celula cancerosa.
  13. 13. Un kit para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 12, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab; Fab', (Fab')2, scFv o dsFv, en el que opcionalmente el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv.
  14. 14. Un kit para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 12, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende las CDR de cadena ligera defidinas por las SEQ ID NO: 4-6 y las CDR de cadena pesada como se define por las SEQ ID NO: 7-9 y en el que la inmunotoxina se administra directamente al sitio del cancer por via intratumoral o peritumoral.
  15. 15. Un kit para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 12, en el que la inmunotoxina consiste en la secuencia de aminoacidos como se define por la SEQ ID NO: 2 y en el que la inmunotoxina se administra directamente al sitio del cancer por via intratumoral o peritumoral.
  16. 16. Un kit para su uso en el tratamiento o prevencion de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello segun la reivindicacion 12, en el que el fragmento de anticuerpo consiste en la secuencia de aminoacidos como se define por la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma, y en el que la inmunotoxina se administra directamente al sitio del cancer por via intratumoral o peritumoral.
    imagen1
    imagen2
    FIGURA2A
    imagen3
    FIGURA2B
    GAA TTC CTO CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA Ecom |_______________________________Promotor AraB_________________________________
    CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GOT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC ------------------] MK YLLPT A A A G LLLL AA
    ^----------------------------------------------- Lider Pel B-------------------------------------------------------------
    CAA CCA GCG ATG GCG CAC CAT CAT CAC CAT CAC GAT ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG Q PA MAHHHHH HDI Q MT QS P _____ His6 |-----------------—---------VL Inicio

    15 10
    TCC TCC CTG AGT GCT TCT GTT GGT GAC CGT GTT ACC ATC ACC TGC CGT TOC ACC AAA
    S T K
    s s
    L S A SVG D R V T I T C R 1
    15
    20 25 3^
    TCC CTC CTG CAC TCC AAC GGT ATC ACC TAC CTT TAT TGG TAT CAA CAG AAA CCG GGT SLLHSNGI TYLYWYQQKPG

    --------------------CDR 1 (L)-----------------------------1

    35 40 45 50
    AAA GCT CCG AAA CTT CTG ATC TAC CAG ATG TCC AAC CTG GCT TCC GGT GTT CCG TCT KA PKLLI YQMSNL ASG VP S
    |--------CDR 2 (L) |
    55
    60
    65
    70

    CGT TTC TCC AGT TCT GOT TCT GGT ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC TCT TCT CTG CAG RFSS SGSGTDFTLTISSEQ 75 80 85 90
    CCG GAA GAC TTC GCT ACC TAC TAC TGC GCT CAG AAC CTG GAA ATC CCG CGT ACC TTC PE DFATYYCAQN LE IPRTF

    I__________ CDR 3 (L) ___________j

    95 lflo 105 1
    GGT CAG GGT ACC AAA GTT GAA CTT AAG CQC GCT ACC CCG TCT CAC AAC TCC CAC CAG GQGT K VE LK RAT P SHN SHQ
    Vl Fin--------------------[ |---------------------------------------------------------------------

    110 115 120 125
    GTT CCA TCC GCA GGC GGT CCG ACT GCT AAC TCT GGA ACT AGT GGA TCC GAA GTA CAG VPSAGGPTAN SGTSGSEVQ -----------------------------Enlazadef--------------------------------------------------------------------------------1|--------VH Inicio

    130 135 140 145

    CTG GTT CAG TCC GGC CCG GGT CTT GTT CAA CCG GGT GGT TCC GTT CGT ATC TCT TGC LVQS G PG LVQ PGG SVR I SC 150 155 160 165
    GCT GCT TCT GOT TAC ACG TTC ACC AAC TAC GGC ATG AAC TGG GTC AAA CAG GCT CCG AA SGYTFT NYG MN

    \----- CDR 1 (H) ----1

    170 175
    W V K
    Q A P
    180
    185
    GGT AAA GGC CTG GAA TGG ATG GGC TGG ATC AAC ACC TAC ACC GGT GAA TCC ACC TAC GKGLEWMGWINTYTGE STY
    |_____________________CDR 2 (H) __________

    190 1 195 200
    GCT GAC TCC TTC AAA GGT CGC TTC ACT TTC TCC CTC GAC ACA AGT GCT AGT GCT GCA ADSFK GRFTFSLDT S A S A A
    205
    21C
    215
    220

    TAC CTC CAA ATC AAC TCG CTG CGT GCA GAG GAT ACA GCA GTC TAT TAC TGC GCC CGT YLQI N SLR A E D T AVYYCAR 225 230 235 240
    TTC GCT ATC AAA GGT GAC TAC TGG GGT CAA GGC ACG CTG CTG ACC GTT TCC TCG GAA A I K GDY.WGQGT L LT VS SE

    CDR 3 (H) 245 ‘
    W G Q G T
    L L T V s s
    250
    255 260

    TTT GGT GGC GCG CCG GAG TTC CCG AAA CCG TCC ACC CCG CCG GGT TCT TCT GGT TTA FG GAP EFPKPST P P GS SGL --------------------------------------------------------------EnlazadoF-----------------------------------------------------------------------------[

    265 270 275 280
    GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG GCC TGC CAC CTG CCG CTG GAG EGGS LAALTAHQACHLPLE ]-----------------ETA 252-608 Inicio

    285 290 295

    ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT TFT RHRQP RGVVE Q LE QCG Y 300 305 310 315

    CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCG GCG CGA CTG TCA TGG AAC CAG GTC PVQRLVALYLAA RLSWNQV 320 325 330 335

    GAC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA DQVI R N A LAS PGSGGDLGE 340 345 350 355
    GCG ATC CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC CGT CTG GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG A I RE QPE QARLALT LA A A E

    360 365 370 375

    AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG GCC AGC GCC S ERFVRQGT GNDEAGAASA 380 385 390

    GAC GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC GCG GGC CCG GCG GAC D VVS LTC P V A A G ECA G PAD 395 400 405 410

    AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACT GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC S G DA LLE RN YPT GA E FLGD 415 420 425 430

    GGT GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG GGDVSFS TRGTQNWTVERL 435 440 445 450
    CTC CAG GCG CAC CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC EQAH RQLE E RGYVF VGYHG

    455 460 465 470

    ACC TTC CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC AGC CAG TFLEAAQS IVFGGVRARSQ 475 480 485

    GAT CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT CCG GCG CTG GCC TAC DLDAI WRGFY1AGDPALAY 490 495 500 505

    GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCG CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG G YAQDQE PDARGRI RNGAL 510 515 520 525

    CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC TCC AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC GGC CTG ACC LRVYVPRSS LPGFYRTGLT 530 535 540 545
    CTG GCC GCG CCG GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG
    laapeaageverli ghplp

    550 555 560 565

    CTG CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT LRLDAIT GPE EEG GRLET I 570 575 580

    CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCC ACC GAC LGWFLAERTVVI PSAIPTD 585 590 595 600

    CCG CGC AAC GTC GGT GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG PRNVGGDLDPSS IPDKEQA 605 610 615 620
    ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCC GGC AAA CCG CCG CAT CAC CAC CAT I S AL P D Y A S Q FGK P P HHH H
    ETA 252-608 Fin----------------------( Hisfi

    625 630 635 640
    CAC CAT AAA GAC GAA CTG TAG TGA CTC GAG HHKDEL . ,LE
    Xhol

    645 651
    Crecimiento tumoral (aumento relativo)
    imagen4
    Tiempo despues del comienzo del tratamiento (d)
    FIGURA4
    CD
    ro
    FIGURA5
    Dias
    Crecimiento tumoral (veces de aumento)
    O-i-f’00J-fckma>'-J00{0
    imagen5
    CD
    CO
    FIGURA6
    250 500 1000 85
    4D5MOCB-ETA wt ETA
    Actividad de transaminasa en plasma [U/L]
    imagen6
    0001
    Resultados histopatologicos en higado y bazo inducidos por VB4-845
    Los circulos indican el area de hepatocitos necroticos en el grupo de dosis de 20 pg
    imagen7
    FIGURA 7
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