JP2014523884A - 細胞外標的化薬物複合体 - Google Patents

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Abstract

Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合しているタンパク質を標的とするターゲティング部分が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用する薬物とリンカー、安定なリンカーを介して連結された細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）は、疾患の治療において、また生体系評価のための手段として有用である。一局面において、本発明は、非切断性リンカーによって治療薬と連結されたターゲティング部分を含む細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）を提供し、前記ターゲティング部分がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合し、前記治療薬が前記Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的を標的とする抗体またはその他のターゲティング薬剤（例えば、ターゲティング部分）が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とリンカーを介して連結されている薬物複合体を提供する。この複合体は疾患の治療に有用であるほか、生体系を評価する手段としても有用である。本発明は、生物学、化学、医薬品化学、医学、分子生物学および薬理学の分野に関する。
発生、免疫、および腫瘍形成をはじめとする全ての基本的な生物学的プロセスは、異なる組織および細胞型における遺伝子の選択的および差次的発現に関連する。例えば、多くの悪性腫瘍の形成は、ある特定の細胞表面シグナル伝達分子の産生および／または発現と関連することが示されている。現代の分子医学の目標の１つは、薬物を選択的に標的化して、薬物の不適切な毒性効果を軽減または除去する方法を見出すことである。抗体、ペプチドまたはアプタマーなどのターゲティング部分を用いて、病的細胞型に独特であるかまたは病的細胞型で高レベルにて発現される特定の標的に薬物を送達することが研究されてきた。これらのターゲティング部分を、リンカーを介して薬物に直接結合させるか、またはナノ粒子に結合させることも研究されてきた。
そのような薬物ターゲティングシステムは、「抗体薬物複合体」または略してＡＤＣと称され、１９８５年から熱心に研究されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、特許文献１を参照のこと）。このクラスの標的治療学の構成要素は、抗原に対して特異的な抗体と、細胞内で作用する薬物（複数可）と、抗体を薬物（複数可）に連結するリンカーとから構成される。非結合性抗体と結合したペプチド薬物が細胞外活性を有する例はいくつかあるが、ＡＤＣ活性が生じるのは通常、複合体からの細胞外または細胞間への薬物放出を介して、薬物が何らかの形で膜を貫通する場合に限られる（特許文献２）。
しかし最近、ＡＤＣ技術に関連する刺激的な新しい進展がみられた。このアプローチでは、非切断性リンカーまたは他の安定なリンカーを介して、抗体であり得るターゲティング部分を薬物に結合させる（参照により本明細書に組み込まれる、特許文献３を参照のこと）。「細胞外標的化薬物複合体」または「ＥＤＣ」と称されるこの新たなクラスのＡＤＣは、抗体またはその他のターゲティング部分が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とし（アルファ、ベータまたはガンマサブユニットのいずれかを含むが、多くの実施形態では、サブユニットガンマ５のディスアドヘリンを標的とするものである）、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニット上の活性部位と結合する薬物、例えば強心配糖体クラスのメンバーなどと連結されているＥＤＣを含む。
米国特許出願公開第２００９／０２２０５２９号明細書 米国特許第７，５２１，４２５号明細書 国際公開第２０１１／０３１８７０号
疾患治療のための新たなＥＤＣが依然として必要とされている。本発明はこの必要性を満たすものである。このほか、細胞表面上で、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと細胞シグナル伝達経路タンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を同定し評価する方法および試薬が依然として必要とされている。本発明はこの必要性も満たすものである。
本発明は全般的には、非切断性リンカーによって治療薬に連結されたターゲティング部分を含む細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）に関するものであり、ここでは、ターゲティング部分がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合し、治療薬がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する。
本発明は、多種多様なタンパク質がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用し、生化学経路、例えば細胞シグナル伝達経路を調節するという発見に関するものである。本発明はまた、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的、例えばＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用する細胞表面シグナル伝達経路タンパク質などにＥＤＣを標的化することによって、多種多様な重要な細胞シグナル伝達経路を調節することが可能であるという発見に関するものでもある。本発明では、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと（例えば、アルファサブユニットまたはＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと細胞表面シグナル伝達経路タンパク質との間の相互作用を攪乱もしくは崩壊させるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ上の別の部位で）結合する薬物と、会合するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的、例えば細胞表面シグナル伝達経路タンパク質などを標的とするターゲティング部分とを含むＥＤＣが提供される。したがって、本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの重要な役割についての新たな理解に関するものであり、またＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ選択性の活性を調節する治療薬を送達するための新たな技術を提供する。したがって、１つの態様において、本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的、例えば細胞表面シグナル伝達経路タンパク質などを含む特定の細胞表面複合体（例えば、受容体であり得るタンパク質上に存在し得る抗原）およびＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣを提供する。
本発明のＥＤＣはほかにも、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合するか、別の方法でこれと相互作用する薬剤を含む。薬剤は、ＥＤＣを薬物として使用する（このようなＥＤＣは研究手段としても有用である）場合、薬物、例えば治療薬であり得る。薬剤はこのほか、ＥＤＣを診断（例えば、特定の患者にＥＤＣによる治療法が奏効する可能性があるか、または特定の患者がＥＤＣによる治療によって治療可能な疾患もしくは状態を有するかを判定するため）に使用する場合または研究手段として使用する場合、標識した強心配糖体などの診断薬であり得る。１つの実施形態において、薬物は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットと相互作用するものであり、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成しているタンパク質（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットをはじめとするサブユニット以外のもの）と結合するターゲティング部分と結合している。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが細胞外タンパク質であることから、ＥＤＣの内部移行は必要ではなく、ターゲティング部分と治療（または診断）薬が協働して所望の治療（または診断）効果を示す。
したがって、１つの態様において、本発明は、ＥＤＣが最大の治療効果を発揮できるよう無傷で未切断である安定な（およびいくつかの実施形態では、非切断性の）リンカーを介して、治療薬がターゲティング部分（例えば、抗体）と共有結合したＥＤＣを提供する。ＥＤＣのターゲティング部分（例えば、抗体）は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的を標的とし、ＥＤＣの薬剤（例えば、薬物または診断薬）の標的は、特に限定されないが、アルファサブユニットをはじめとするＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼである。ある実施形態では、薬剤の標的は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ上にあって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的、例えば細胞表面シグナル伝達経路タンパク質などと会合するのに介在する部位にある。このような実施形態では、薬剤とタンパク質との結合がタンパク質とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの相互作用を調節する（阻害する、または活性化する）。しかし、他の多くの実施形態では、薬剤はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットを標的とするものである。このような実施形態の多くで、薬剤は強心配糖体のアグリコンである。
様々な実施形態において、ターゲティング部分（例えば、抗体）の標的は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを含む多タンパク質複合体中に存在する。様々な実施形態において、薬剤の標的とターゲティング部分の標的は異なるものであるが、ターゲティング部分と薬剤が同時にそれぞれの標的と相互作用するときにＥＤＣが所望の効果のみを発揮するよう（目的とする疾患またはその他の状態において）互いに近接している。したがって、ターゲティング部分の標的は治療（または診断）薬の標的と異なるものであるが、２つの標的は、ターゲティング部分と薬剤が互いに協働して作用するよう、また場合によっては相乗的に作用するよう接近して存在している。したがって、本発明のＥＤＣは一般に、ターゲティング部分の標的と薬剤の標的がともに細胞、組織または器官上で互いに近接している場合にのみ治療効果を示す。
様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は抗体である。１つの実施形態において、抗体は、一方のＦａｂが薬剤と連結し、他方のＦａｂがＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合する（例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの相互作用を介して生化学的経路を調節する）タンパク質を標的とする二価抗体である。様々な実施形態において、薬剤は、特に限定されないが、強心配糖体のアグリコンである薬物をはじめとする、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの活性を阻害する薬物またはその他の薬剤である。他の実施形態では、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼによって媒介されるシグナル伝達経路を直接的な阻害以外の手段で調節する、特に限定されないがジメチルオキサリルグリシン、グリベンクラミド、ペリリルアルコール、スタチンおよびプロゲステロンなどの薬物をはじめとする薬物またはその他の薬剤である。
１つの実施形態において、本発明のＥＤＣ中のリンカーは非切断性リンカー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と１つ以上のグリコシドとからなるリンカーなどである。本発明のＥＤＣの１つの実施形態において、単一の薬剤と単一のターゲティング部分が安定なリンカーまたは非切断性リンカーを介して結合しており、このターゲティング部分と薬剤は、同時にまたは実質的に同時にその標的と結合し、かつ／または作用する。様々な実施形態において、本発明は、非切断性リンカーの長さのみが異なるＥＤＣのセットを提供する。
別の態様では、本発明は、疾患の治療に有用な医薬製剤および単位投与形態を含めた組成物ならびに薬物送達系を提供する。１つの実施形態において、本発明は、活性成分として本発明のＥＤＣを含む、あるいはこれよりなるか、実質的にこれよりなる組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物は、静脈内投与を含むがこれに限定されない非経口投与に適した医薬製剤である。１つの実施形態において、本発明は、薬剤的に許容されるビヒクル、ベクター、希釈剤および／または賦形剤と組み合わせた本発明のＥＤＣを含む、あるいはこれよりなるか、実質的にこれよりなる医薬製剤を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明のＥＤＣに加え他の活性な医薬成分を少なくとも１つ含有する組成物を提供する。
本発明の医薬製剤は、疾患または障害の予防、改善および／または治療目的のためにインビボで使用することができる。本発明による医薬製剤を使用することができる疾患または障害の非限定的な例としては、ガン、転移、細胞アポトーシス障害、変性疾患、組織虚血、ウイルス性、細菌性または真菌性の感染症、炎症障害、糖尿病および病的血管新生が挙げられる。したがって、本発明の方法にしたがって、薬学的に有効な量の本発明による化合物または組成物で対象を治療することができる。本発明の１つの実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は、獣医学研究または科学研究の対象となる非ヒト哺乳動物である。
別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に治療有効量の本発明のＥＤＣまたはその他の化合物もしくは医薬組成物を投与することによって疾患またはその他の医学的状態を治療する（または診断する、または研究する）方法を提供する。ＥＤＣを治療薬として使用する場合、ＥＤＣは、ターゲティング部分と薬物成分がともにそれぞれの標的と結合した場合にのみ最大限の治療効果を発揮し、その治療効果は、ＥＤＣの標的となる他のタンパク質、例えば、細胞表面上にありＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの複合体中に存在する細胞シグナル伝達経路タンパク質と協働して作用するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼによって調節される細胞シグナル伝達経路を、ＥＤＣが調節することによってもたらされる。また、このようなＥＤＣを診断手段および／または研究手段として使用することもでき、例えば、その結果得られた細胞シグナル伝達経路調節がアッセイの読み出し情報としての役割を果たす。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼおよびそれと会合するタンパク質と複合体を形成するが、その会合によって調節される細胞シグナル伝達経路を調節しないＥＤＣを含めた他のＥＤＣが診断および研究に有用である。
したがって、本発明の方法、化合物および組成物は一般に、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的に特異的な治療（または診断）薬が投与される医学的状態の治療（ならびに診断および研究）に有用である。様々な実施形態において、本発明は、細胞増殖性および／または分化障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心血管障害、肝障害、腎障害、筋障害、神経障害、血液障害、ウイルス感染症、疼痛ならびに代謝障害からなる群より選択される障害を治療または予防する（ならびに診断および研究する）方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、ガン治療の方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ガン剤においておよびそれ自体が抗ガン剤として有用な新規な強心配糖体またはそのアグリコンを提供し、また本発明は、上記強心配糖体もしくはそのアグリコンを含むＥＤＣ、上記強心配糖体もしくはそのアグリコンを含む医薬組成物またはその医薬組成物を含むＥＤＣならびにその製造方法および使用方法も提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の化合物、ＥＤＣおよび組成物の製造方法ならびにその方法に有用な化合物を提供する。例えば、本発明は、本発明のＥＤＣの作製に有用な薬物−リンカー剤を提供する。この薬物−リンカー剤は、いくつかの実施形態では、強心配糖体のアグリコンと、ＰＥＧおよび１つ以上のグリコシドを含む非切断性リンカーと、抗体とのカップリングに適した反応基とを含む。本発明はほかにも、生物学的製剤、医薬品、化粧品および農産物を製剤化および調製する方法ならびに上記方法でＥＤＣ化合物および組成物を使用する方法も提供する。１つの実施形態において、本発明は、疾患を治療する薬剤製造のための本発明の化合物の使用に関する。
別の態様では、本発明は、本発明のＥＤＣの単独療法により、あるいは１つ以上の他の治療薬をその治療効果がいずれかの治療薬の単独使用より増大または増強するように併用して、疾患を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的、例えばＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの複合体中に共存する細胞表面シグナル伝達経路タンパク質などとの相互作用を検出する方法および試薬を提供する。一般に、この方法は、抗体が目的の細胞表面シグナル伝達経路を標的とし、薬物がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とし、この２つが安定なリンカーまたは非切断性リンカーによって連結されている抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を用いるものである。次いで、このＡＤＣを適切な対照（抗体および薬物）とともにインビトロおよび／またはインビボで試験し、ＡＤＣが、目的とする１つ以上の細胞型に対して、単独の抗体または薬物より強力および／または特異的な細胞毒性または細胞増殖、増殖もしくは分化の阻害などの効果を発揮するかどうかを判定する。ＡＤＣが単独の抗体または薬物より強力または特異的は効果を発揮すると判定されれば、抗体の標的となる細胞外標的（例えば、細胞表面タンパク質）が、目的とするそのような細胞型（複数可）においてＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成していることになる。
本発明の別の態様は、ＥＤＣと、容器と、疾患の治療、健康状態の診断、または研究機能の実行にＥＤＣがどのように使用できるかを示した添付文書またはラベルとを含む製品である。
別の態様では、本発明は、標的を発現する細胞を本明細書に開示される方法でＥＤＣと接触させることを含む、ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合させる方法を提供する。
別の態様では、本発明は、標的と結合させるのに有効な量の本明細書に開示されるＥＤＣを対象に投与することを含む、ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合させる方法を提供する。
本発明の上記およびその他の態様および実施形態について以下に詳細に記載する。
本発明は、薬剤（薬物または診断薬）とターゲティング部分が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ（例えばＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３およびＡＴＰ１Ａ４遺伝子を含めたＡＴＰ１遺伝子ファミリーによってコードされる）を含む複合体と結合するか、これに作用する、細胞外標的化薬物複合体またはＥＤＣを提供する。ＥＤＣは様々な用途、特にヒトの疾患および医学的状態の治療において有用である。本発明の理解を容易にするため、この詳細な説明をセクションに分ける。セクションＩでは、本開示で使用される用語の定義を提供する。セクションＩＩでは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼおよび重要な細胞シグナル伝達経路におけるその役割について記載する。セクションＩＩＩでは、本発明のＥＤＣに有用な抗体およびその他のターゲティング部分について記載する。セクションＩＶでは、本発明のＥＤＣに有用なリンカーについて記載する。セクションＶでは、本発明において有用な治療薬について記載する。セクションＶＩでは、本発明のＥＤＣの特定の実施形態について記載する。セクションＶＩＩでは、本発明の医薬製剤および疾患およびその他の医学的状態を治療するためにそれを投与する方法について記載する。本発明の詳細な説明に続いて、本発明の有用な用法およびＥＤＣを説明する一連の実施例を記載する。
本明細書で引用されるＰＣＴ公開第２０１０／０１７４８０号、同第２０１１／０３１８７０号、２０１２年３月９日に出願されたＰＣＴ出願公開第２０１２／０２８５８５号、その他の特許、特許出願および科学文献の参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｉ．定義
用語「アルデヒドタグ」または「ａｌｄ−タグ」とは、２−ホルミルグリシン残基（本明細書では「ＦＧｌｙ」と称する）を含むようホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によって変換可能であるかすでに変換されたスルファターゼモチーフに由来するアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはペプチド模倣物のことである。ＦＧＥによって生成されたＦＧｌｙ残基は、文献中で「ホルミルグリシン」と称されることが多いが、これは厳密には誤りである。したがって、本明細書で使用される「アルデヒドタグ」は、「未変換の」スルファターゼモチーフ（例えば、システインまたはセリン残基が未だＦＧＥによってＦＧｌｙに変換されていないが、変換可能なスルファターゼモチーフ）を含むアミノ酸配列または「変換された」スルファターゼモチーフ（例えば、システインまたはセリン残基がすでにＦＧＥによってＦＧｌｙに変換されたスルファターゼモチーフ）を含むアミノ酸配列を指し得る。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣薬を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸およびコードアミノ酸の修飾形態であるアミノ酸、例えば、ベータ−アラニン、Ｄ−セリン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンのことである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基または非天然アミノ酸（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を形成する各種Ｒ基と結合した炭素を有する化合物のことである。このようなアナログは修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾された骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸、例えばベータアミノ酸、Ｄ型アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣薬は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸とほぼ同じように機能する化合物を指す。
「抗体」という用語は、抗原のエピトープと特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそれらのフラグメントによってコード化される１以上のペプチド鎖を含むタンパク質またはタンパク質の混合物（遺伝子工学によって作製された非天然形態のものを含む）を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、これらは次に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。通常、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹを含む。本明細書中で用いられる場合、「抗体」という用語は、単鎖抗体を含む全抗体およびそれらの抗原結合フラグメントを含むことを意味する。抗体は、抗原結合抗体フラグメントでもあり得、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントならびにナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０４６７８号およびＮａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖ９（１）ｐｐ１２９−１３４，２００３を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。抗体は、鳥類および哺乳類をはじめとする任意の動物起源であり得る。通常、商業的または研究用途における抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ）、ウマ、またはニワトリ抗体である。本明細書で使用される「抗体」は、モノクローナル抗体、免疫吸着ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、インタクト抗体および単離された抗体を包含する。抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的またはさらに高次の多重特異的であり得る。
「抗体薬物複合体」または「ＡＤＣ」という用語は、１つまたは複数の治療薬（本明細書では薬剤、薬物または活性な医薬成分と称することがある）と連結された抗体を指す。
「抗原」という用語は、抗体またはターゲティング部分が結合する物質または標的を指す。抗原は、抗体またはターゲティング部分によって「結合」される能力によって特徴付けられる。抗原はさらに、ターゲティング部分の産生、例えば、抗原で免疫化することによる抗原特異的抗体の産生を誘導するために用いられる物質を意味することもある。抗原は多くの実施形態において、特に限定されないが受容体を含めたタンパク質である。
「抗原結合部位」または「エピトープ」という用語は、抗体などのターゲティング部分が結合する抗原の部分を指す。
「アプタマー」という用語は、ターゲティング部分となって抗体と同等に機能することができ、抗原のエピトープと特異的に結合し認識するＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド模倣薬を指す。
「特異的に結合する」という用語は、ターゲティング部分が、標的以外と結合する場合より高い親和性で細胞外標的と結合する能力を指す。ある実施形態では、特異的結合は、標的以外に対する親和性の少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍または１０００倍の親和性で細胞外標的と結合することを指す。
「結合親和性」という用語は、その結合定数および解離定数の関数としての、抗体（あるいは他のターゲティング部分もしくは薬物または他の薬剤）とその抗原（または標的）との間の相互作用の強度を指す。高い親和性は通常、ターゲティング部分が速いオン速度（結合）および遅いオフ速度（解離）を有することを意味する。結合親和性は、様々な生理的条件下で抗原または抗体／ターゲティング部分に起こる変化によって、これらの条件下で変化し得るものである。ターゲティング部分の結合親和性は、治療薬および／またはリンカーが結合している場合にも変化し得る。結合親和性は、抗原に若干の変化、例えば、抗原のアミノ酸配列またはグリコシル化の変化などが生じた場合にも変化し得る。
「ガン」という用語は、細胞の制御できない異常な増殖、冒された細胞が局所的に、または血流およびリンパ系を通して身体の他の部分へ広がる（例えば、転移する）能力ならびに多数の構造的および／または分子的特徴のいずれかによって特徴付けられる多くの疾患のいずれかを指す。「ガン性細胞」または「ガン細胞」は、分化が欠損し、浸潤および転移することができる、特定の構造的特性を有する細胞であると理解される。ガンの例には、胸部ガン、肺ガン、脳ガン、骨ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、結腸ガンおよび前立腺ガンがある（あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ら（編），２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第６版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照のこと）。
「キメラ抗体」という用語は、１つの種（通常はマウス）由来のモノクローナル抗体のＦｃ定常領域が、組換えＤＮＡ技術を用いて、別の種（通常はヒト）の抗体由来のＦｃ領域と置換されている抗体を指す。例えば、ネズミモノクローナル抗体をコード化するｃＤＮＡが、Ｆｃ定常領域をコード化する配列を除去するために特異的に選択された制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコード化するｃＤＮＡの等価な部分が置換されている。ＣＤＲグラフト抗体は、いわゆる「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を有するいわゆる「ドナー」抗体からのＣＤＲ「グラフト」によって置換されている抗体である。一般に、ドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種由来のモノクローナル抗体であり；通常、アクセプター抗体は、ヒト抗体（ヒトにおいてその抗原性を最小限に抑えるため）であり、この場合、結果として得られるＣＤＲグラフト抗体は「ヒト化」抗体と称される。グラフトは、アクセプター抗体の単一のＶＨまたはＶＬ内の単一のＣＤＲ（またはさらには単一のＣＤＲの一部）を有するものであり得るか、ＶＨおよびＶＬの一方または両方の複数のＣＤＲ（もしくはそれらの部分）を有するものであり得る。ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体を作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号；およびＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号によって教示されている。
「循環構造」という用語は、哺乳類の循環系の組織を含めた体液、間質液、リンパ液および血液を指す。
「近接」という用語は、例えば、ターゲティング部分（Ｘに対する）および治療薬（Ｙに対する）がリンカーを介して結合しており、ＸおよびＹがともにそれぞれの標的と結合したとき、この複合体が、単独のＸまたはＹによって誘発される所望の生物学的応答または医学的応答と異なるか、これより優れた所望の生物学的応答または医学的応答を誘発するよう物理的に接近している２つの標的ＸとＹを指す。１つの実施形態において、得られる生物学的応答または医学的応答は、単独のターゲティング部分または治療薬によってみられるものより大きいものである。別の実施形態では、得られる生物学的応答または医学的応答は、ターゲティング部分と治療薬の相加効果によってみられるものより大きいものである。例えば、ＸとＹが異なる分子上にあるが、その分子が同じ多分子複合体中に存在する場合、両標的は本明細書で定義される「近接」の状態にある。別の例では、ＸとＹが同じ細胞上で互いに２００オングストローム以内にあり、協働してシグナルを伝達するか、別の方法で生化学的応答を生じる場合、両標的は互いに、本明細書で定義される「近接」の状態にある。ＸとＹが異なる細胞上にあり（かつ／または互いに相互作用しない）場合、これらは本明細書で定義される「近接」の状態にはない。
「有効量」という用語は、対象に投与したとき、病的状態または状態の任意の症状、様相、パラメータまたは特徴に対して任意の検出可能で明確な治療効果を示すことができる、ＥＤＣの単独でのまたは医薬組成物の一部分としての量を指す。このような効果は、必ずしも有益なものである必要はない。
「エピトープ」という用語は、通常、特定の３次元構造特性および特定の電荷特性を有し、モノクローナル抗体が特異的に結合することができる抗原の表面のアミノ酸残基または糖側鎖などの分子の集団を指す。
「細胞外」および「細胞表面」という用語は、細胞膜の外側部分または循環構造の体液中に存在するタンパク質、抗原またはエピトープを指す（例えば、アンジオテンシン変換酵素は細胞外タンパク質である）。
「細胞外標的」という用語は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない標的、例えば、細胞膜上または循環構造の体液中に存在するタンパク質、ガングリオシド、抗原および／またはエピトープなどを指す。例えば、特に限定されないが、以下のものが細胞外標的である：細胞表面受容体、細胞表面イオンチャンネル、ＣＤ（分化または命名のクラスター）と略記されるタンパク質。より具体的には、同じく特に限定されないが、以下のものが細胞外標的である：ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ＣＤ９８、ＣＤ８７、ＣＤ２３０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＭＣＴ、アルファ−ｋｌｏｔｈｏ、ＰＥ−ＮＭＴ、線維芽細胞成長因子受容体、ＭＭＰ、ｃ−ＭＥＴ、ＡＴＰ感受性カリウムチャンネルおよびグルタミン酸トランスポーター。一般に、本発明のＥＤＣのターゲティング部分および治療薬の標的はともに細胞膜外表面の細胞外標的である。しかし、いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞膜内に組み込まれた標的と結合し得るもの（例えば、イオンチャンネル遮断薬）であり得る。一般に細胞外標的と見なされない標的としては、例えば、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＴＯＲキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子、チューブリンおよびアクチンが挙げられる。
「細胞外標的化薬物複合体」または「ＥＤＣ」という用語は、細胞外標的を標的とする抗体またはその他のターゲティング部分が安定なリンカーまたは非切断性リンカーを介して、細胞外標的と結合する薬物またはその他の薬剤と連結されている、本発明の薬物複合体を指す。
「ＦＸＹＤ５」、「ディスアドヘリン」、「ＡＴＰアーゼサブユニットガンマ５」または「ガンマ５」という用語は本明細書では互換的に使用され、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼイオンポンプ複合体のガンマサブユニット５を指す。
「ヘテロ二機能性リンカー」という用語は、両側に異なる反応性基を有し、タンパク質およびその他の分子中の２つの異なる官能基間で連続結合を可能にするリンカーを指す。
「インタクト抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲＸまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端まで次の順序で並んだ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子と免疫グロブリンとの結合を媒介することができる。結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
「リンカー」という用語は、ターゲティング部分および薬物などの２つ以上の分子と共有結合する化学部分または結合を指す。
「リンカースペーサー基」および「スペーサーアーム」という用語は、リンカーによって結合した２つの分子間に空間を提供するリンカー中の原子を指す。
「修飾抗体」という用語は、抗体の部分を、例えば欠失、付加、または置換することによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体を指す。例えば、抗体は、定常領域を欠失させ、抗体の半減期、例えば血清半減期、安定性または親和性を増大させることを目的とする定常領域とそれを置換することによって修飾することができる。治療薬の複数の分子または複数の異なる薬剤を１つの抗体分子とカップリングさせることができる。例えば、異なる部分を同じリンカーによって抗体分子にカップリングさせることができるか、または複数の結合部位を提供する複数のリンカー（例えば、デンドリマー）を使用することができる。
「調節する」という用語は、例えば、細胞シグナル伝達経路の活性を制限もしくは低減する（例えば、阻害する）または増加させることを含め、細胞シグナル伝達経路を直接的にまたは間接的に変化させるよう、ＥＤＣが細胞外標的およびＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用することを指す。
「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有し単一の結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって作製することができるが、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核、原核またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが作製される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術の使用を含めた当該技術分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。
「非切断性リンカー」という用語は、同じ生理学的条件下で治療薬部分またはターゲティング部分のいずれかよりもインビボで安定であるという特性を有する安定なリンカーを指す。非切断性リンカーの例としては、酸または塩基に感受性でなく（例えば、ヒドラゾン含有リンカー）、還元剤または酸化剤に対して感受性でなく（例えば、ジスルフィド結合を含むもの）、細胞または循環システムで見出すことができる酵素に対して感受性でないポリエチレングリコール鎖またはポリエチレン鎖を含むリンカーが挙げられる。非切断性のリンカーの具体例としては、ＳＭＣＣリンカー（米国特許出願公開第２００９０２０２５３６号）が挙げられる。例示を目的に、切断可能なリンカーの例としては、立体障害されていないグルタチオン感受性ジスルフィド、エステル、カテプシンまたはプラスミンなどのペプチダーゼに感受性のペプチド配列、ｐＨ感受性ヒドラゾンを含むリンカーが挙げられる［Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１（１），ｐｐ５−１３］。切断可能なリンカー具体例としては、立体障害されていないジスルフィドリンカーＳＰＰ（米国特許出願公開第２００９０２０２５３６号）が挙げられる。様々な実施形態において、非切断性リンカーには、実験により容易に特徴付けられる次のような特性が１つ以上ある：（１）非切断性リンカーは、ターゲティング部分と結合した治療薬を生理学的条件下で長時間（例えば、少なくとも約２〜８時間、少なくとも１〜５日間または少なくとも５〜約３０日間）保持しながら比較的無傷な状態であり続ける；（２）非切断性リンカーは、例えば循環構造内で、酵素に対して安定である；（３）非切断性リンカーは、ＥＤＣが細胞上の標的に作用した後でもその活性を維持することを可能にする；（４）非切断性リンカーは、ターゲティング部分の結合活性または特異性にマイナスに干渉しない；および／または（５）非切断性リンカーは、治療薬の活性にマイナスに干渉しない。安定なリンカーまたは非切断性リンカーの結合は、治療薬に対して何らかの影響を及ぼすことがあり、例えば、リンカー結合によって細胞毒性薬の細胞毒性が減少することがある（しかし、本発明のＥＤＣでは除去されない）。しかし、リンカー結合によって生じるいかなる活性の減少も、リンカーと薬剤とを含むＥＤＣの治療効果の増大によって十分に補われる。したがって、非切断性リンカーまたは安定なリンカーを介してターゲティング部分と結合した薬剤は、単独の薬剤を上回る利益を示す。このような利益としては、溶解度、毒性低下、薬物動態の向上および／または治療効果の増大が挙げられる。
「非切断」および「未切断」という用語は、存在するＥＤＣ成分の大部分（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％または＞８０％）が無傷である、例えば、薬剤とターゲティング部分を結合させるために使用するリンカーが切断されていない、任意の時点のＥＤＣ組成物を指す。
「非内部移行性ターゲティング部分」または「非内部移行性抗体」は、生理学的条件下（３７℃およびｐＨ７）、インビボまたはインビトロで、循環構造内または細胞表面で細胞外部の抗原と反応する（結合する）という特性を有し、その標的抗原と結合しても細胞内に入りリソソーム内で分解されることのないターゲティング部分または抗体をそれぞれ指す（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（６）２３５８−６４を参照のこと）。この文脈では、「内部移行性」および「内部移行」は、物質がリソソーム区画を介して細胞内に入るプロセスを指す。１つの実施形態において、ターゲティング部分または抗体は、その標的抗原と結合しても、細胞内に入りエンドソーム内に取り込まれることはない。「非内部移行性ターゲティング部分」または「非内部移行性抗体」の標的は、本明細書では「非内部移行性標的」と称され、これは、ターゲティング部分または抗体との結合によってリソソーム内に取り込まれることのない標的のことである。しかし、非内部移行性標的が他の生物学的プロセスで細胞内に取り込まれることがある。非内部移行性標的の例としては、特に限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２１およびＣＤ７２が挙げられる。例示目的で、「内部移行性標的」としては、例えば、特に限定されないがＣＤ７９およびＣＤ２２が挙げられる。
「非内部移行性治療薬」という用語は、生理学的条件下（３７℃およびｐＨ７）、インビボまたはインビトロで、細胞内に取り込まれずにその標的（通常、その受容体との結合を介して）と反応するという特性を有する治療薬（薬物）を指す。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、ペプチド模倣薬および「タンパク質」という用語は、ある程度互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマーおよび天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、「抗体」という用語も包含する。「ペプチド」は多くの場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」よりも少ないアミノ酸残基のポリマーを指すために用いられる。タンパク質は、同一であるか互いに異なり得る２つ以上のポリペプチドを含み得る。
送達される薬物の量に関連した「薬学的に有効な量」および「有効量」という用語は、組織、系、動物またはヒトにおいて所望の生物学的応答または医学的応答を誘発することができる薬物の量を指す。
「ポリクローナル抗体」という用語は、１つの抗原に対する２つ以上の異なる抗体の調製物を指す。このような調製物には、様々な異なる抗原結合部位と結合する抗体が含まれる。
「受容体」という用語は、細胞の原形質膜または細胞質のいずれかに埋め込まれ、１つ以上の特定の種類のシグナル伝達分子が結合することができる、細胞外標的タンパク質分子を指す。各細胞は通常、多種多様な受容体を多数有する。
「循環構造で安定な」という用語は、ＥＤＣなどの化合物が分解に抵抗するという特性を指し、例えば、約３７℃の循環血液中、化合物の約５０％未満、約２０％未満または通常約２％未満が少なくとも約２時間で分解または切断されることを意味する。
「安定なリンカー」という用語は、生理学的条件下（３７℃およびｐＨ７）、インビボまたはインビトロで、ＥＤＣが標的（複数可）に到達し標的（複数可）と結合するのに十分な時間の間、複合体が標的部位に送達または輸送されるまで安定かつ無傷のままであるリンカー（それが連結する２つの分子と共有結合したままである安定なリンカー）を指す。したがって、安定なリンカーは、一般的に、循環構造内で安定である（一般に、少なくとも２時間後、いくつかの実施形態では少なくとも４時間、８時間、１６時間または２４時間後で５％未満の分解を意味する）。安定なリンカーは、細胞、組織または器官内の酵素または生理学的条件（異なるｐＨなど）によって切断され得る。「安定な」リンカーの例としては非切断性リンカーが挙げられるが、安定なリンカーは、ＥＤＣがその標的（複数可）に到達し結合するまでに一般にインビボで切断されない限り、切断可能なものであり得る。例えば、安定なリンカーは、立体障害されていないグルタチオン感受性ジスルフィド、カテプシンなどのペプチダーゼに感受性のペプチド配列またはｐＨ感受性ヒドラゾンを含み得る［Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１（１），ｐｐ５−１３およびＣｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ １１（２ Ｐｔ １）：８４３−５２を参照のこと］。したがって、安定なリンカーは切断可能なリンカーであり得るが、それはこのようなリンカーを含むＥＤＣがその標的（複数可）に到達するまでにリンカーが切断されない場合に限られる。例えば、カテプシンが細胞内にあるリソソーム内のみにみられることから、カテプシンにより切断可能なリンカーは安定なリンカーである。不安定なリンカーの例には、エステル結合またはアシルヒドラゾン結合を含むリンカーがある。
「実質的に同時に」という用語は、同時にまたは比較的狭い時間枠内で起こる２つ以上の事象を指す。様々な実施形態において、実質的に同時にとは、互いに約６０秒、約４０秒、約３０秒、約２０秒、約１０秒、約５秒、約２秒もしくは約１秒または約１秒未満以内に起こる２つ以上の事象を指すものである。例えば、本発明のＥＤＣは、ターゲティング部分の結合と薬剤（薬物）の作用が実質的に同時に起こるような特性を有する。
「相乗的に」という用語は、２つ以上の薬剤を単独で使用する場合の両薬剤の効果の合計よりも高い、組み合わせて使用する場合の２つ以上の薬剤の効果を指す。例えば、本発明のＥＤＣでは、リンカーを介して連結された場合のターゲティング部分と薬剤（薬物）の相互作用を合わせた治療効果は、単独で使用する場合のターゲティング部分および薬剤の個々の効果を合わせたものより高い。「効果」は、結合、治療効果および／または特異性のいずれかを指し得る。
「標的」という用語は、ターゲティング部分が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物または核酸を指し、また治療薬が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物または核酸も指す。薬剤およびターゲティング部分は、「標的複合体」において異なる標的と結合することがあり、この場合、「標的複合体」は、２つ以上の分子、例えば、多サブユニットタンパク質の異なるサブユニットまたは多タンパク質複合体中の２つの異なるタンパク質などであって、インビボで互いに物理的に近接したものを指す。
「標的細胞」という用語は、病理に関与し、したがって治療活性の好ましい標的となる細胞を指す。標的細胞は、例えば限定されないが、以下の群の１つ以上の細胞であり得る：一次または二次腫瘍細胞（転移）、一次または二次腫瘍の間質細胞、腫瘍または腫瘍転移の血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、多形核白血球およびリンパ球ならびに腫瘍および腫瘍転移に浸潤する多核薬剤。
互換可能な「ターゲティング部分」および「”ターゲティング薬剤」という用語は、標的と特異的に結合する抗体、アプタマー、ペプチドまたはその他の物質を指す。ターゲティング部分は、抗体ターゲティング部分（例えば、抗体またはそのフラグメント）または非抗体ターゲティング部分（例えば、標的と特異的に結合するアプタマー、ペプチドまたはその他の物質）であり得る。
「標的組織」という用語は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）および標的細胞の環境中の細胞を指す。
「治療薬」、「薬物」および「薬剤」という用語は本明細書において、治療有効量で存在する場合、作用部位に結合すると、治療効果をもたらし、その作用部位が標的細胞の表面または内部に位置するか、その効果が標的細胞の表面または内部で発揮される化合物を指すのに互換的に用いられる。例として、治療薬は抗生物質剤、抗ガン剤、ポリペプチド、タンパク質または核酸などの化学剤であり得る。
「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状または疾患の副作用の軽減、除去および／または予防を指す。
「半減期を増大させる」という用語は、血液中の化合物、通常は治療薬の平均滞留時間を増大させること、または血液もしくは血漿クリアランスを参照化合物に比べて減少させることを意味する。
「治療すること」および「治療」という用語は互換的に用いられ、治療薬または組成物を、疾患もしくは障害（例えば、ガンもしくは転移ガン）、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者に、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患に対する素因を治療する、治癒する、軽減する、緩和する、変更する、矯正する、改善、向上させる影響を及ぼす目的で投与することを指す。ガンもしくは転移ガンを「治療すること」またはガンもしくは転移ガンの「治療」は、任意の客観的もしくは主観的パラメータ、例えば症状の寛解；緩和；減退または疾患状態に対する患者の許容度の増大；悪化もしくは減退の速度を低下させること；または悪化の最終点の衰弱を抑えることを含めたガンの治療、改善または予防を指す。症状の治療または改善は、医師による診察の結果を含めた客観的または主観的パラメータに基づくものであり得る。したがって、「治療すること」という用語は、新生物疾患を含むがこれに限定されない疾患に関連する症状または状態の発生を予防もしくは遅延するため、軽減するため、または停止もしくは阻害するために、治療薬を投与することを含む。
「腫瘍特異的抗原」という用語は、腫瘍に特有であるか、少なくとも腫瘍細胞上に正常な細胞より多量に存在するタンパク質またはその他の分子を指す。
ＩＩ．Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼおよび細胞シグナル伝達経路
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼはイオンチャンネルおよびシグナル伝達物質として機能する。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼは内在性膜貫通タンパク質酵素であり、最初は、濃度勾配に逆らってカリウムイオンを取込み、ナトリウムイオンを排出するだけのものであると考えられていたが、ごく最近では、ほかにも細胞膜の向こう側にシグナルを伝達することが示されている。この酵素は次の３つのサブユニットからなる：触媒コアであり、ステロイド化合物の主要な標的となるアルファサブユニット；アルファサブユニットを特定の細胞表面上の位置に輸送すると考えられ、アルファサブユニットの活性に必要なベータサブユニット；および補助的なサブユニットであり、様々な細胞型特異的アイソタイプとして存在するガンマサブユニット。強心（心作用性）配糖体のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの主要な結合部位は、膜貫通へリックスＭ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６によって形成されるくぼみに位置する［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００９，１０６，１３７４２−１３７４７］。
強心配糖体がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合することにより、様々な異なる疾患に対する多数の活性が誘発されることが報告されている。例えば、この結合事象がＨＩＦ−１アルファ合成、インターロイキン８（ＩＬ−８）産生および低酸素誘導因子ＮＦ−ｋＢを阻害すること、また慢性心不全および腎不全、心肥大および不整脈、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、神経疾患ならびにガンの病理発生ならびに治療に関連する活性を有することが報告されている［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，１８，８７２−８８５］。強心配糖体の現在承認されている用途（例えば、心房細動、心房粗動および心不全）のほかにも、多数の強心配糖体および強心配糖体を含有するエキス剤が、嚢胞性線維症、ガン、血圧および関節リウマチなどの適応症を対象に臨床試験で試験されたか、現在試験段階にある［それぞれ、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／名称：ＮＣＴ００７８２２８８、ＮＣＴ００８３７２３９、ＮＣＴ００８５２７８７、ＮＣＴ０１３５５３５４］。
ステロイド薬を含めた標的化薬物には、疾患治療における有益性が認められる。例えば、ＩＬ−８（強力な好中球動員および活性化因子）は通常、急性呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患および喘息を含めた多数の炎症性肺疾患の患者の臨床試料に検出される。このことは、臨床医にＩＬ−８の拮抗作用が疾患管理のための実用的な治療戦略となり得ると考えるに至らせた［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１（１），１９−２５（２００２）］。具体的には、嚢胞性線維症の場合、疾患の特徴である重度の肺炎症は、主として肺のＩＬ−８過剰産生に起因するものである。強心配糖体とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの結合が、膜の流動性およびミクロ粘性を変化させてＩＬ−８受容体を調節することにより、多様な細胞型におけるＩＬ−８媒介性の生物学的応答を阻害することが示されている［Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７，１９５−２０７（２００６）］。さらに、低濃度の強心配糖は、細胞死を防ぎ増殖を引き起こし虚血発作との関連において重要な下流のシグナル伝達カスケードを誘発する［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３，１０４６１−１０４６６（２００６）］。この結合事象はほかにも、球脊髄性筋萎縮症およびその他のポリグルタミン関連疾患などの神経変性疾患において重要な細胞シグナル伝達経路と関連させて研究されている［Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３，４３７−４４６（２００４）］。
しかし、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを対象とする治療薬の使用に関して大きな懸念がある。第一に、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼはあらゆる細胞上にみられ、これを標的とする薬物には多岐にわたる生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある。例えば、内因性配糖体のレベルが上昇すると、血圧上昇および高血圧症を来たす［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２，１５７２３−１５７２４（２００５）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２，１５８４５−１５８５０（２００５）］。第二に、これまでに試験されたＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物のほとんどが、抗ガン効果を示すのに必要なレベルで過度の毒性を示すことがわかっている。この毒性には心毒性および／または神経毒性が含まれ得る。第三に、強心配糖体の治療域は狭いものである。実際、承認されている強心配糖体（例えば、ジゴキシンまたはプロスシラリジン）が、投与を承認されているレベルの２〜３倍のレベルで患者を死に至らせることがある（Ａｎｅｓｔｈ Ｐｒｏｇ．２００７ Ｓｐｒｉｎｇ；５４（１）：１９−２４）。このような懸念が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬物の使用に大きな制約となっている。
さらに、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬物の効果についてのこれまでの報告を解釈するのは困難である。例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼがコレステロールを調節すること［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，２８４，１４８８１−１４８９０］、Ｋｌｏｔｈｏ（加齢プロセスに関与する膜貫通タンパク質）と相互作用すること［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１１ Ｊｕｎ ２３；５８５（１２）：１７５９−６４］、ｎ−メチルトランスフェラーゼと複合体を形成すること［ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｍａｙ ２５；１０：１２］およびＣＤ１４７と会合すること［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，２７（４５）：１２３３１−１２３４０］が示唆されているが、このような相互作用が起こる理由およびその結果は理解されておらず、治療またはその他の有用な目的に利用されるには至っていない。
本発明は部分的には、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが他の細胞表面タンパク質と密接に会合し（複合体を形成し）、協働して細胞シグナル伝達経路を調節し、このような複合体を標的とするＥＤＣが、特にガン治療において著明な治療活性を有するという発見によるものである。本発明のＥＤＣは、薬物がＥＤＣのターゲティング部分の標的と複合体を形成するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼにのみ作用し、すべてのＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼには作用しないようにすることによって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物によりもたらされるこれまでの課題を克服するものである。この目覚ましい成果は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬物をターゲティング部分の特定の標的（すなわち、目的とする細胞シグナル伝達経路の調節に関与する細胞表面タンパク質）と会合するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼにのみ作用させるターゲティング部分を使用することによるものである。本発明のＥＤＣに有用なターゲティング部分について以下のセクションに記載する。
ＩＩＩ．抗体およびその他のターゲティング部分
本発明は、安定なリンカーまたは非切断性リンカー（例えば、ＥＤＣがその最大の治療効果を発揮するよう無傷または非切断の状態でなければならないリンカー）を介して治療薬と連結されたターゲティング部分を含むＥＤＣを提供する。このＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合するタンパク質との複合体に作用する。本発明のＥＤＣは、治療薬をより選択的に標的細胞および組織に送達する。多くの実施形態において、ＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合し（例えば、特異的に結合し）、細胞シグナル伝達経路を調節するターゲティング部分を含み、かつ安定なリンカーまたは非切断性リンカーを介してターゲティング部分と結合したＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ（またはＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの相互作用を阻止するタンパク質結合部位）と結合する薬剤を含む。したがって、ほとんどの実施形態では、ターゲティング部分と治療薬は異なる細胞外標的と結合するか、これに作用する、例えば、ターゲティング部分が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合する細胞外標的を標的とし、薬剤がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする。多くの実施形態において、ターゲティング部分は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと近接し細胞シグナル伝達経路を調節する標的（例えば、それは細胞表面にあるシグナル伝達経路タンパク質である）と結合し、治療（または診断）薬はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用するか、これと結合する。
本発明のＥＤＣのターゲティング部分は、ターゲティング部分の標的と治療薬の標的、例えば、多くの実施形態ではＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとを含む標的細胞または組織にＥＤＣを方向付けるものである。したがって、いくつかの実施形態では、治療薬は、所望の治療効果をもたらすだけでなく、ＥＤＣの標的化特性も増大させる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分と薬剤が、ＥＤＣを１つまたは複数の標的に方向付けるのに相乗的に働く。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分も治療効果を有する。あらゆる実施形態において、安定なリンカーまたは非切断性リンカーは、生理学的条件下、ＥＤＣが結合し治療効果を発揮するのに十分な時間の間、ターゲティング部分と治療薬との結合を維持する。
したがって、本発明のＥＤＣの３つの部分は：（１）目的とする疾患またはその他の状態において、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではなく、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合し近接している細胞外標的と結合するターゲティング部分；（２）ターゲティング部分と治療薬とを連結し、ＥＤＣがその標的と結合するのに必要な時間の間、無傷（未切断）の状態を保持する安定なリンカーまたは非切断性リンカー；および（３）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ（または会合するタンパク質上にあるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの会合を制御する部位）に作用するか、これと結合する治療（または診断）薬を含むか、実質的にこれよりなるか、これよりなるものであり得る。
本発明のＥＤＣの多くの実施形態において、ターゲティング部分は、標的との結合時に内部移行を誘発しないため、その細胞外標的と結合してもリソソーム内に取り込まれないヒト抗体である。
感染細胞またはガン性細胞まで毒性の高いペイロードを運搬し、細胞内に薬物を運び放出することでプロドラッグの用に作用する抗体を開発するのに多大な努力が重ねられてきた。「抗体−薬物複合体」または「ＡＤＣ」法はこのような例の１つである。抗体の薬物動態または薬力学を利用する別の努力によって、薬物品質の低い（例えば、血清中半減期が短い、または分解される）薬物と抗体との結合がもたらされた。後者の場合、薬物は活性に抗体解離を必要とせず、抗体は薬物を特定の抗原に標的化しない。ある場合には、治療薬を抗体の標的結合部位と結合させることで、抗体の標的結合能が打ち消される。
ＡＤＣ法に関連する第一の困難な点は細胞透過と関係がある。治療効果を発揮するためには、ＡＤＣ全体または少なくともＡＤＣの薬物部分が標的細胞内に侵入しなければならない。ＡＤＣを無傷で細胞内に侵入させる方法としては、ＡＤＣを取り込む受容体を標的にすること、またはペプチド媒介による膜透過を用いて、抗体をその細胞内標的タンパク質まで送達することが挙げられる（米国特許出願公開第２００８００６３６３３号を参照のこと）。ある細胞型では抗体結合時に内部移行することがわかっているこのような受容体の多くが、別の細胞では内部移行しないことがあり、このことが、この方法が一般性に欠ける原因となっている［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（６）：２３５８−６４を参照のこと］。さらに、以下で述べるように、内部移行は通常、抗体から薬剤を放出することを目的とするものである。次いでこの放出により、遊離の薬物が細胞外に出て、罹患細胞に隣接する正常細胞と相互作用し、望ましくない毒性をもたらす。この現象は「バイスタンダー効果」と称される。さらに、内部移行後に薬物−抗体分離が起こらなければならないが、これが非効率的なプロセスであるため、ＡＤＣの薬物部分には極めて毒性の高い薬物が必要となる（Ｃａｒｔｅｒら，２００８ Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（３）１５４−１６９）。本発明のＥＤＣは内部移行を必要とせず、通常は内部移行しないため、ＡＤＣ法に関連する多くの問題点が軽減される。
ＡＤＣ法に関連する第二の困難な点は、薬物を活性化する、または薬物を細胞内に侵入させるため、細胞への侵入前または後にＡＤＣの薬物を抗体から解離させる必要があることである。選択的に解離させる方法としては、細胞特異的ペプチダーゼによって切断される特定のペプチド配列を組み込むこと（米国特許出願公開第２００９０２２０５２９号を参照のこと）あるいは解離または活性化が細胞膜付近、細胞膜内または細胞質ゾルもしくはエンドソーム区画の内側で起こるよう環境に感度性の結合を含ませることが挙げられる。特定の細胞型がＡＤＣを区画内に取り込むことがわかったが、その区画が活性型の薬物を放出しない可能性があることから、具体的なＡＤＣの範囲が限られている［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（６）：２３５８−６４］。本発明のＥＤＣは、ＥＤＣの薬物がターゲティング部分から解離することを必要としないため、薬物−抗体分離を必要とするＡＤＣ法に関連する問題点の多くが軽減される。
ＡＤＣ法に関連する第三の困難な点は、ＡＤＣがプロドラッグであるため、標的細胞内に侵入するとき、または標的細胞に接近したときにＡＤＣの薬物部分を活性化する必要があることである。この条件は、ＡＤＣとその標的が相互作用する前に抗体からの治療薬の解離またはＡＤＣの薬剤部分の活性化（毒性の増大をもたらし得る）が起こらないようにするために重要である。このほか、標的細胞と結合していない間ＡＤＣの効果を維持し、非結合抗体が標的部位を活性なＡＤＣから遮蔽しないようにするため、薬物複合体と抗体の結合を維持することが重要である。ＡＤＣ法に関する刊行物の大部分がこのような問題点を解決する方法を論じている。本発明のＥＤＣは効果を発揮するのに活性化を必要としない（これらはプロドラッグではない）ため、薬物−抗体分離（薬物活性化）を必要とするＡＤＣ法に関連する問題点の多くが軽減される。
ＡＤＣ法に関連する第四の困難な点は、薬剤が標的細胞に内部移行したときにターゲティング部分から解離することから、薬剤が、それが生じた細胞から外部に徐々に拡散し、隣接する抗原陰性細胞上で強力なバイスタンダー活性を引き起こし得ることである。したがって、ＡＤＣの遊離薬剤は標的細胞付近の他の正常な（標的外の）細胞に対して毒性、すなわちバイスタンダー効果として知られる現象を示す。このことがＡＤＣを投与することができる用量に制約となっている。本発明のＥＤＣは、効果を発揮するのに薬剤（薬物）がＥＤＣから解離する必要がないため、バイスタンダー効果と関連する問題点を軽減し、特異性を増大させる。
ＡＤＣ法に関連する第五の困難な点は、特異性の欠如、すなわち、抗体と薬剤の両方ではなく一方が細胞外標的に対して特異的であり得ることである。したがって、得られたＡＤＣの特異性は必要に応じたものではないことがある。ＡＤＣの特異性は、抗体の標的に対する特異性によって決まる。抗体の標的は正常細胞上にも十分に高いレベルでみられるため、安全で有効なＡＤＣの作製に使用できない抗体が多い。本発明のＥＤＣは結合するのに２つの異なる標的を必要とし、かつ両標的が近接している必要があるが、これは発生頻度が低いことであるため、ＥＤＣの特異性が高くなる。
従来の方法とは異なり、本発明は、細胞内への移行を必要とせず、リンカーに技術的に困難な制約を与えず、特異性が高く、バイスタンダー効果を低減し、薬剤をその標的部位付近に位置させることによって治療薬の活性を増大させる高特異性のＥＤＣを提供する。したがって、本発明のＥＤＣは、ターゲティング部分が内部移行を促進する必要がなく、抗体の標的化しない生物学的特性に依存しない。本発明のＥＤＣは、特に限定されないがアプタマーを含めた抗体以外のターゲティング部分を用い得る。本発明のＥＤＣは、最大の特異性および活性を得るため、薬剤と抗体が無傷な状態を保持する必要がある。本発明の抗体またはターゲティング部分は細胞外抗原を標的とするため、効果を発揮するのに内部移行を必要とせず、リソソームによる酵素分解を必要としない。本発明のＥＤＣに使用するリンカーは、安定であるか、場合によっては非切断性であるため、薬物のＥＤＣからの早期の解離が最小限に抑えられ、リンカーの設計がより柔軟で単純なものとなる。本発明のリンカーおよび治療薬は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接する様々な異なる標的に対するターゲティング部分と結合させることができるため、新たなＥＤＣの構築が容易になる。
本発明のＥＤＣは、それに含まれる薬物より選択性が高く、かつ／または毒性が低い。本発明のＥＤＣでは、ターゲティング部分および／またはリンカーは、ターゲティング部分がその標的と結合するまで、薬物の治療効果を効果的に抑制するか、大幅に減少させる（したがって、毒性のあるオフターゲット効果を低減する）ことができる。このことは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが他の多くシグナル伝達タンパク質と相互作用し、重大な望ましくない「オフターゲット」効果が起こる可能性が生じるという発見を考慮すれば、本発明の特に重要な側面である。したがって、本発明のＥＤＣは主として、ターゲティング部分がその標的と結合して治療薬の標的と近接し、ＥＤＣが無傷である場合にのみ活性を示す。以上のことをまとめると、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する可能性は抗体がその標的と結合したときにのみ大幅に高くなることから、ここに挙げた特徴はＥＤＣの特異性を増大させ、毒性を低下させるものである。本発明のＥＤＣは、ＥＤＣが治療効果を発揮するのに薬剤と抗体の標的部位がともに存在し、互いに近接している必要があるため、選択性が高くなる。本発明のＥＤＣは、薬剤が、標的と選択的に結合するターゲティング部分と安定なリンカーを介して連結し、薬剤が近接した状態が維持され、その距離にあるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼにのみ作用することができるため、毒性が低くなる。したがって、本発明のＥＤＣは、ターゲティング部分がその標的と結合していないとき、およびＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼがターゲティング部分の標的と近接していないときはほぼ不活性である。したがって、本発明のＥＤＣは、ターゲティング部分がその標的と結合しているが、ターゲティング部分の標的がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接していないときもほぼ不活性である。実際、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼがターゲティング部分の標的に近接していなければ、リンカーにより薬物がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに到達できない。
本発明のターゲティング部分は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合して細胞シグナル伝達経路を調節する抗原を標的とする。本開示を考慮すれば、当業者には、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合し、抗体と接触可能であることが知られている細胞外抗原が多数存在することが理解されよう。これらの多くが罹患細胞選択的である。このような抗原の多くが細胞表面にみられるものである。多くの承認薬が細胞表面の細胞外標的に作用する。治療薬のターゲティング部分（例えば、抗体）の標的として同様に本発明により利用され得るこのような標的の具体例としては、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）、ＣＤ９８（ＬＡＴ１）、ＣＤ８７（ｕＰＡＲ）、ＣＤ２３０（ＰｒＰまたはプリオン関連タンパク質）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ｃ−ＭＥＴ、ＲＡＮＫ（ＮＦ−ｋＢの受容体活性化因子）、ＣＤ７１（ＴｆＲ１）、ＣＤ１６６、ＥＡＡＴｓ、ＥｐＣＡＭ、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）、アンジオテンシン受容体、ＡＳＣＴ２、カルベオリン、インテグリンファミリーのタンパク質、ＧＡＢＡＡ受容体、ＧｌｕＲ２、５−ＨＴ１Ａ受容体、ＩＧＦ−１、ＩｎｓＰ３Ｒ、インスリン受容体、α−ｋｌｏｔｈｏ、ＭＣＴ１−４、ｍＴＮＦアルファ（膜貫通型）、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ、ＰＥ−ＮＭＴ（Ｎ−メチルトランスフェラーゼ）、ＰＬＡ２（ＰＣ−ホスホリパーゼＡ２）、ＲＳ１（レチノスキシン）、Ｓｅｌ−１、セロトニン輸送体、Ｔ−細胞受容体およびＴＬＲ４が挙げられる。
本発明のＥＤＣに有用なターゲティング部分の例が、ＣＤ１４７を特異的に認識し結合するものである。ＣＤ１４７は、胎児発生、網膜機能およびＴ細胞成熟に何らかの役割を演じている多面発現性分子である。ＣＤ１４７はシクロフィリンの細胞表面受容体であることが示されている。ＣＤ１４７は組織が再構築されている領域、すなわち腫瘍、子宮内膜、胎盤、皮膚および血管新生が進行中の部位で発現し（Ｉａｃｏｎｏら，２００７．Ｅｘｐ Ｍｏｌ．Ｐａｔｈ．８３：２８３−２９５を参照のこと）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびＶＥＧＦ産生を刺激する。ＣＤ１４７は単球分化の際に誘導され、ヒトアテロームにおいて発現する（Ｍａｊｏｒ Ｔ Ｃ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｌｕ Ｘ，Ｒｏｓｅｂｕｒｙ Ｗ，Ｂｏｃａｎ Ｔ Ｍ．２００２．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２２：１２００−１２０７）。ＣＤ１４７がＭＭＰ誘導および腫瘍周囲間質細胞によるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子系を介して、様々な腫瘍タイプの浸潤および転移を促進することが示されている。ＣＤ１４７はほかにも、ガン細胞の血管新生、アノイキス抵抗性、乳酸流出、多剤耐性および細胞増殖に関与する。ＣＤ１４７の過剰発現および／または機能が他の病理学的過程、例えば炎症性応答、肺線維症、関節リウマチ、エリテマトーデス、心不全、アルツハイマー病ならびにリンパ球内でのヒト免疫不全ウイルスおよびコロナウイルスの感染性サイクルなどに関連することがわかっている（Ｒｕｉｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，（９），５５５４−５５６６，２００８を参照のこと）。さらに、ＣＤ１４７の切断およびＣＤ１４７フラグメントのシェディングがＣＤ１４７の調節または活性フラグメントの解離に関与している可能性がある（Ｅｇａｗａら，２００６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（４９）：３７５７６−８５）。
抗ＣＤ１４７抗体が報告されている。マウス抗体ＩｇＭ Ｍａｂ、ＣＢＬ１（Ｂｉｌｌｉｎｇｓら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １：３０３−３１１，１９８２，米国特許第５，３３０，８９６号および同第５，６４３，７４０号）がステロイド抵抗性の急性移植片対宿主病で試験されている（Ｈｅｓｌｏｐら，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４６：８０５−８０６；Ｄｅｅｇら，２００１ Ｂｌｏｏｄ ９８：２０５２−８）。このほか、ＥＣＤの膜貫通ドメイン付近でＣＢＬ１（ａｋａ ＡＢＸ−ＣＢＬ）のエピトープと重複するエピトープに結合するヒト等価Ｍａｂが開発されている（米国特許出願公開第２００７０４８３０５Ａ１号）。Ｋｏｃｈら（Ｉｎｔｅｒｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（５）７７７−７８６，１９９９）は、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化に関連するＣＤ１４７エピトープをマッピングし、ＣＤ１４７に対して作製された１群の抗体のうち親和性が最も高いモノクローナル抗体（ＭＥＭ−Ｍ６／６）のみが、ＣＤ３に対するＭＡＢのＯＫＴ３によるヒトＴ細胞の活性化および増殖の抑制に効果を示すことを報告している。ヒトＣＤ１４７由来の腫瘍細胞に対するマウス抗体ＥＩＩＦ４（Ｅｌｌｉｓ，１９８９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４９：３３８５−９１；Ｂｉｓｗａｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５，４３４−４３９，１９９５）では、ヒト線維芽細胞の肺ガンＣＤ１４７誘発性コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１またはＭＭＰ−１）活性を阻止する能力が示されている。Ｎ末端Ｉｇドメインを欠く変異体ＥＣＤを調製すると、ＥＩＩＦ４抗体とＣＤ１４７が結合しないことが報告されている（Ｂｉｓｗａｓ，Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５，４３４−４３９，１９９５）。Ｋｕら（Ｓｃａｎ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６５（５）４３５−４４３，２００７）は、ＣＤ１４７関連ＭＭＰ軸の阻害として記載されているＭＡＢを同定し、また短縮ＣＤ１４７配列を用いて、ＣＤ１４７ ＭＭＰ誘導活性に重要なＮ末端の残基を同定した。
したがって、ＣＤ１４７に対する特定の抗体およびその他のアンタゴニストが知られているが、２つの免疫グロブリンドメインを含めたタンパク質の複雑な性質が多種多様な生物活性に影響を及ぼす機序は十分には明らかにされていない。ドメイン特異的アンタゴニストが、ＣＤ１４７提示および／または各種組織上での活性化に関連する各種病態の治療に有用な治療候補物質であることが明らかになる可能性がある。例えば、ＣＤ１４７によって誘発されるＭＭＰ産生またはＶＥＧＦ活性を阻止することができる治療薬がガン治療に有利である可能性も考えられる。したがって、ＣＤ１４７依存性疾患の症状を軽減または除去する治療および既知の抗体またはそのフラグメントの改良に使用するためのヒトＣＤ１４７を標的とする治療薬を提供する必要がある。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＢＳＧ遺伝子によってコードされるＣＤ１４７および／またはＥＭＭＰＲＩＮ（細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質；米国特許出願公開第２００７００４８３０５号、同第２００６０１０４９７４号およびＰＣＴ公開第２０１０／０３６４６０号を参照のこと）の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインと結合しＥＭＭＰＲＩＮを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えばヒト化型の抗ＣＤ１４７であり得る。１つの実施形態において、ヒト化抗体はＡＢＸ−ＣＢＬ（細胞表面のＣＤ１４７を認識するマウス免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）モノクローナル抗体）であり得る。１つの実施形態において、抗体は、抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ１４７と特異的に結合する。
実施例２（実施例８も参照のこと）には、ＣＤ１４７を標的とする本発明のＥＤＣの様々な例を記載する。以下の実施例のデータは、ＣＤ１４７に特異的な抗体を用いて本発明のＥＤＣを作製することができることを示している。このデータは、実施例２に記載されている通りに調製した各ＥＤＣが、表面にＣＤ１４７を発現する細胞系に対して、対照より活性が高いことを示している。ＥＤＣ２．１の薬物が１抗体当たり平均１．２であることが明らかとなったのに対し、ＣＤ１４７に特異的なターゲティング部分を含む他のＥＤＣは、薬物を１抗体当たり平均５．９〜８．６含んでいた。ＥＤＣ２．１の活性は、試験した４種類のＥＤＣのうち最も活性が低かった。ＥＤＣ２．１を除けば、実施例２の全ＥＤＣがナノモル濃度未満の活性を示したのに対し、陰性対照（薬物を１抗体当たり平均７．４含む抗体−薬物複合体）は、試験した全細胞系に対して高いナノモル濃度活性を示した。試験したガン細胞には、大細胞肺ガン細胞、結腸ガン細胞、非小細胞肺ガン細胞、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞、小細胞肺ガン細胞、黒色腫細胞および骨髄腫細胞が含まれていた。
本発明のＥＤＣの作製に有用なターゲティング部分の別の例が、ＣＤ４４を特異的に認識し結合するものである。ＣＤ４４は４つの機能ドメイン、すなわち、保存されたＮ末端細胞外ドメイン、保存されていない膜近位ドメイン領域、保存された膜貫通ドメインおよび保存された細胞質側末端からなる一本鎖の糖タンパク質である。ＣＤ４４は分子量が８０〜９０ｋＤａであり、差次的な選択的スプライシングによって８００前後の変異型イソ型を形成し得る（Ｃｉｃｈｙ，Ｊ．ら，（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６１：５，８３９−８４３）。最もよくみられるＣＤ４４のイソ型は標準型ＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ）と称されるものであり、９つの標準的なエキソンによってコードされ、分子量が約９０ｋＤａ（Ｓｐｒｉｎｇら，１９８８ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６４（１）：３７−４３）である。変異型のＣＤ４４（ＣＤ４４ｖ）には、タンパク質の細胞外および膜近位ドメイン領域中のほかのタンパク質配列を生じる変異型エキソン（ヒトではｖ２〜ｖ１０）と称されるほかのエキソンが含まれている。ガンでは、ＣＤ４４の変異型イソ型が発現する。ＣＤ４４は、白血球、線維芽細胞、上皮細胞、ケラチノサイトおよび一部の内皮細胞を含めた多数の細胞型で普遍的に発現し、ＣＤ４４ｓが最も多量に発現するイソ型である。
ＣＤ４４は、細胞同士の凝集、細胞周囲基質の保持、基質−細胞間および細胞−基質間のシグナル伝達、ヒアルロナンの受容体介在性の内部移行／分解ならびに細胞遊走を含めた多種多様な細胞機能に関与することが知られている。ＣＤ４４の様々な機能がヒアルロナンとの接着相互作用に依存している。ＣＤ４４は、グリコサミノグリカンヒアルロナン（ＨＡ）の細胞表面糖タンパク質受容体である。造血細胞Ｅ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）は、ＨＥＣＡ−４５２反応性のシアル酸付加されたフコシル化Ｎ−グリカンを含むＣＤ４４のグリコフォームである。ＨＣＥＬＬは、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチン両方のリガンドである（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２５）：１３８４１−４６，２０００；Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５３（６）：１２７７−１２８６，２００１）。ＣＤ４４の一部の機能は、ＣＤ４４タンパク質の翻訳後修飾、例えば硫酸化および／またはグリコシル化などの影響を受けるか、これより誘発される。高い親和性および特異性でヒトＣＤ４４の特定の変異体と結合する抗ＣＤ４４抗体が作製されている（米国特許出願公開第２００５０２１４２８３号）。ＣＤ４４糖タンパク質の変異体が腫瘍に転移性を付与するのに対し、標準型ＣＤ４４は付与しない。したがって、ＣＤ４４の変異体が腫瘍にリンパ管を通って転移する能力を付与する（Ｇｕｎｔｈｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ６５：１３−２４，１９９１）。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＣＤ４４遺伝子によってコードされるＣＤ４４分子（インド人血液型）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許第５，９１６，５６１号および米国特許出願公開第２００３０１０３９８５号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、変異型のＣＤ４４分子と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ｗａｎｇら，２００９ Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １１９（８）：１５１８−３０およびＧｒｉｆｆｉｔｈら，２０１０ Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．９３（６）：１７４５−９）。１つの実施形態において、本発明のＥＤＣのターゲティング部分は、標準型のＣＤ４４分子と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ４４の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ４４を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体はビバツズマブ（ＣＤ４４ｖ６に対するヒト化モノクローナル抗体）であり得る。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ４４と特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明は、変異型エキソンｖ４、ｖ５、ｖ６および／またはｖ９あるいはその一部分によってコードされるエピトープに対する抗体の使用に関する。
実施例３（実施例８も参照のこと）には、ＣＤ４４を標的とする本発明のＥＤＣの様々な例を記載する。以下の実施例のデータは、ＣＤ４４に特異的な抗体を用いて、表面にＣＤ４４を発現する細胞系に対して対照複合体より活性が高い本発明のＥＤＣを調製することができることを示している。ＥＤＣ３．１の薬物が１抗体当たり平均５．５であることが明らかとなったのに対し、ＥＤＣ３．２は薬物を１抗体当たり平均２．７含んでいた。ＣＤ４４特異的ＥＤＣ３．１は、非小細胞肺ガン細胞および膵臓ガン細胞に対して最も高い活性を示した両ＥＤＣとも、対照複合体（薬物を１抗体当たり平均７．４含むもの）より高い活性を示した。試験したガン細胞には、結腸ガン細胞、非小細胞肺ガン細胞、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞および小細胞肺ガン細胞が含まれていた。
本発明のＥＤＣの作製に有用なターゲティング部分の別の例が、ＣＤ９８（４Ｆ２ｈｃ）、そのヘテロ二量体パートナーまたはそれらが形成する複合体（例えば、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ＧＬＵＴ１、を特異的に認識し結合するものである。ＣＤ９８は５２９アミノ酸残基からなる約８０ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質鎖であり、様々なタイプのガン細胞で高度に発現することが知られている。ＣＤ９８はほかにも、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２およびグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）のような様々な栄養素輸送体と複合体を形成することがわかっている（Ｏｈｎｏら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３００：Ｃ１０４７−Ｃ１０５４，２０１１）。ＣＤ９８と結合すると考えられている６つのタイプのアミノ酸輸送タンパク質が知られている。ＣＤ９８はリンパ球活性化抗原として同定されているが、多数の生物学的機能、例えば細胞増殖シグナル伝達、インテグリン活性化、細胞融合などに関与すると考えられている（Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８１），１２６，１４０９−１４１４、Ｌｉｎｄｓｔｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，（１９８８），８，３８２０−３８２６、Ｔｅｉｘｅｉｒａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９１），２０２，８１９−８２６、Ｄｉａｚ Ｊｒ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ，（１９９８）１２，２５−３２）。
ＬＡＴ１／ＣＤ９８ヘテロ二量体複合体は、細胞膜を横切って大型の中性必須アミノ酸を輸送する主要な経路に関与し、多くのガンで過剰発現する。ＬＡＴ１は、アミノ酸輸送体活性（ジスルフィド結合を介する）を有する約４０ｋＤａのタンパク質であり、細胞膜上に発現する。ガン細胞には優勢に増殖するための様々な機序がある。例えば、ガン細胞は中性アミノ酸輸送体を過剰発現し、周囲の細胞より優位に増殖するのに必要な必須アミノ酸を取り込む。ガン細胞で特異的に高度に発現するアミノ酸輸送体のＬ型アミノ酸輸送体１（ＬＡＴ１）がクローン化されている（Ｋａｎａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），２７３，２３６２９−２３６３２）。ＬＡＴ１はＣＤ９８と複合体を形成し、大きい側鎖を有する中性アミノ酸、例えばロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジンなどをナトリウムイオンに依存する方法で輸送する。さらに、ＬＡＴ１は脳、胎盤、骨髄および精巣を除くほとんどの正常組織ではわずかに発現するか、全く発現しないが、ヒト悪性腫瘍、例えば結腸直腸ガン、胃ガン、乳ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、喉頭ガン、食道ガン、肺ガンなどの組織では、ＣＤ９８とともにその発現が増加することが知られている（Ｙａｎａｇｉｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（２００１），１５１４，２９１−３０２）。ガンを移植したマウスモデルでは、ＬＡＴ１の発現が減少しアミノ酸取込みが抑制されると、腫瘍の増殖が抑制されることが報告されており（日本公開特許第２０００−１５７２８６号）、したがって、ＬＡＴ１活性の抑制がガン治療に有望な方法であると考えられている。ガン細胞の細胞膜上で発現したときにＣＤ９８との特異的結合能を有するヒト抗体（またはヒト抗体の機能的フラグメント）が示されている（米国特許第７，９４３，７４５号）。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ９８と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＬＡＴ１の細胞外ドメインと結合し、ＬＡＴ１を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分はＬＡＴ２と結合する抗体である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分はＧＬＵＴ１と結合する抗体である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えばヒト化型の抗ＣＤ９８であり得る。１つの実施形態において、本発明のＥＤＣは、米国特許第７，９４３，７４５号に開示されており、細胞表面のＣＤ９８を認識するヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変配列で構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ９８と特異的に結合する。
実施例４（実施例８も参照のこと）には、ＣＤ９８を標的とする本発明のＥＤＣの例を記載する。実施例のデータは、ＣＤ９８に特異的な抗体を用いて、表面にＣＤ９８を発現する細胞系に対して対照複合体より活性が高い本発明のＥＤＣを作製することができることを示している。ＥＤＣ４．１の薬物が１抗体当たり平均３．４であることが明らかとなった。ＣＤ９８特異的ＥＤＣは、非小細胞肺ガン細胞に対して最も高い活性を示した試験したガン細胞には、非小細胞肺ガン細胞、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞、小細胞肺ガン細胞および骨髄腫細胞が含まれていた。
本発明のＥＤＣの作製に有用なターゲティング部分の別の例が、ＣＤ８７を特異的に認識し結合するものである。ＣＤ８７は、広く発現されるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の受容体であり、細胞表面プラスミノーゲン活性化の調節に重要な役割を演じている。ＣＤ８７が細胞接着、細胞運動性、血管新生、腫瘍浸潤および腫瘍転移を含めた多様な生理学的および病理学的過程の調節に関与していることを証拠が次々に示唆している（ＹｉｍｉｎおよびＥｌｇｈｅｔａｎｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，９：６７−７１）。精製ヒトＣＤ８７は、５０〜６０ｋｄの不均一な分子質量を有し高度にグリコシル化された一本鎖の細胞外タンパク質である。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子系は、セリンプロテアーゼウロキナーゼ（ｕＰＡ）、ウロキナーゼ細胞表面受容体（ｕＰＡＲまたはＣＤ８７）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）で構成されている。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子系は、多くの固形腫瘍の血管新生、浸潤および転移に関与する因子の１つである（Ｄａｎｏら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８５，４４：１３９−２６６）。ｕＰＡＲは、腫瘍細胞および血管新生内皮細胞による制御された細胞外基質の分解および再構築に不可欠な役割を演じている（図１）。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ依存性のカスケードはほかにも、プロマトリックスメタロプロテイナーゼ−９の活性化ならびにＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦベータを含めた成長因子および血管新生因子の活性化および放出をもたらす。
ｕＰＡＲは通常、休止細胞では検出可能なレベルで発現されないため、系の活動が開始する前にアップレギュレートされなければならない。ｕＰＡＲ発現は、ホルボールエステル（Ｌｕｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：５１７７−５１８１）などの薬剤、上皮細胞の形質転換ならびに各種の成長因子およびサイトカイン、例えばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−１、ＴＮＦアルファ（内皮細胞内）およびＧＭ−ＣＳＦ（マクロファージ内）など（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９１，１１３：１１９３−１２０１；Ｍａｎｄｒｉｏｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９７０９−９７１６；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １９９６，２０：３１９−３２６）によってインビトロで刺激される。ｕＰＡＲ発現には、細胞運動、浸潤および接着が増大するという機能上の結果が伴う（Ｍａｎｄｒｉｏｔａら，上記）。さらに重要なことに、ｕＰＡＲは、これまでに調べられているほとんどのヒトガン腫において、特に腫瘍細胞自体、血管新生中の腫瘍関連内皮細胞およびマクロファージにおいてインビボでアップレギュレートされると考えられ（Ｐｙｋｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：１９１１−１５）、このことが腫瘍血管新生の誘発に関与している可能性がある（Ｌｅｗｉｓら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．１９９５，５７：７４７−７５１）。ガン患者では進行ガンにおいてｕＰＡＲ発現がみられ、多数のヒトガン腫の予後不良と相関があるとされている（Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｃａｎｃｅｒ １９９６，７８：４８７−９２；Ｈｅｉｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１９９５，１：１０３５−３９）。さらに、ｕＰＡＲは腫瘍全体にわたって均一に発現するわけではなく、浸潤の周縁部にみられる傾向があり、ヒト胃ガンにおいて転移の表現型マーカーであると考えられている。したがって、ｕＰＡＲは、腫瘍細胞および血管新生内皮細胞による制御された細胞外基質の分解および再構築に不可欠なものである。ｕＰＡ−ｕＰＡＲが腫瘍増殖に重要な役割を演じていること、またｕＰＡ−ｕＰＡＲの多量の発現が腫瘍内でみられるが、正常組織ではみられないことから、この系は注目を集める診断および治療標的となっている。
ポリクローナルウロキナーゼ受容体抗体により腫瘍体積を減少させ、肉眼では見えない腫瘍転移の存在をインビボで検出することが可能であることが示されている（ＲａｂｂａｎｉおよびＧｌａｄｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：２３９０−７ ２００２）。ＣＤ８７を標的とする高親和性ペプチドが作製されている（Ｐｌｏｕｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，１２１５７−１２１６８）。ＣＤ８７に対するペプチドがガン細胞によるラミニン分解の阻害および転移の抑制に有効であることが、複数の動物モデルで示されており（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５７：７２７−７３３）、いくつかの実施形態では、本発明のＥＤＣのターゲティング部分としてこれを用いる。ｕＰＡのアミノ末端フラグメントとシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン由来の毒素との融合タンパク質が、数種類の腫瘍細胞に低濃度で細胞毒性を示すものとして複数記載されている（ＲａｊａｇｏｐａｌおよびＫｒｅｉｔｍａｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：７５６６−７５７３）。アデノウイルス媒介によるｕＰＡ−ＡＴＦ送達（Ｌｉら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５ １１０５−１１１３ １９９８；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：１１５７−１１６７ ２００５）、ｕＰＡ−ＡＴＦの安定なトランスフェクション（Ｚｈｕら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０：２９７−３０５ ２００１）、アンチセンスｕＰＡＲ（Ｍｏｈａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：３３６９−３３７３ １９９９）またはアンチセンスｕＰＡＲ／ｕＰＡの組合せ（Ｇｏｎｄｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：５９６７−５９７５ ２００３）が、ｕＰＡＲ活性の阻止または喪失および浸潤の阻害をインビトロで、また腫瘍増殖および浸潤をインビボでもたらすことが報告されている。さらに、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の非受容体結合領域由来のペプチドがインビボで腫瘍進行および血管新生を阻害し、腫瘍の細胞死を誘導することが報告されている（Ｇｕｏら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１４：１４００−１４１０ ２０００）。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）と特異的に結合し、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とｕＰＡＲとの結合を阻害するモノクローナル抗体が構築されている（米国特許出願第２０１２０１０８７９７号、同第２００８０１９９４７６号、同第２００８０１５２５８７号および米国特許第８，０２６，３４４号を参照のこと）。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ８７と特異的に結合するペプチドまたはｕＰＡのアミノ末端フラグメントなどの抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ８７の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ８７を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、抗ＣＤ８７重鎖および軽鎖可変配列から構成され得る。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ８７と特異的に結合する。
実施例５（実施例８も参照のこと）では、ＣＤ８７を標的とする本発明のＥＤＣの例を記載する。実施例のデータは、ＣＤ８７に特異的な抗体を用いて、表面にＣＤ８７を発現する細胞系に対して対照複合体より活性が高い本発明のＥＤＣを作製することができることを示している。ＥＤＣ５．１の薬物が１抗体当たり平均２．８であることが明らかとなった。ＣＤ８７特異的ＥＤＣは、黒色腫細胞系ＬＯＸに対して最も高い活性を示した試験したガン細胞には、大細胞肺ガン細胞、結腸ガン細胞、非小細胞肺ガン、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞、小細胞肺ガン、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞が含まれていた。細胞表面にＣＤ８７を発現する唯一の被験細胞系はＬＯＸ細胞であったが、このことは、ＣＤ８７特異的ターゲティング部分から作製したＥＤＣがガンのタイプに特異的であり得ることを示している。しかし、用いた試験条件下では、細胞が活性化されてＣＤ８７発現することはなく、上で述べたように、ＣＤ８７陰性の細胞系が試薬で予め活性化されればＣＤ８７発現が期待される。したがって、ＣＤ８７−Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体を標的とする本発明のＥＤＣは一般に、活性化条件下でこのような複合体を発現するガンの治療に有用である。
本発明のＥＤＣの作製に有用なターゲティング部分の別の例が、プリオン病およびプリオン関連疾患にみられるプリオン感染細胞を特異的に認識し結合するものである。プリオン病は特異な感染性の神経変性疾患である。プリオンは、宿主にコードされ、核酸なしで複製する正常なプリオンタンパク質ＰｒＰの選択可能なコンホメーションイソ型のみで構成される。ＰｒＰの感染型のコンホメーションの誘導によって複製が起こると考えられている。ＰｒＰの異なる安定なコンホメーションまたは「配座異性体」から、ミスフォールドタンパク質または誤ったプロセシングを受けたタンパク質が疾患の病理発生の原因であるとする、神経変性疾患のタンパク質コンホメーション病の概念が生まれた（Ｐｒｕｓｉｎｅｒら，２００１ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，１５１６−１５２６およびＴａｙｌｏｒら，２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，１９９１−５）。
近年、脳内で天然に産生される正常なプリオンタンパク質がアミロイド−βペプチドと相互作用することが示された。この相互作用を阻止することより、アルツハイマー病の顕著な特徴であるアミロイド−βペプチドの蓄積による神経学的異常が食い止められることが報告されている（Ｌａｕｒｅｎら，２００９ Ｎａｔｕｒｅ ４５７，１１２８−１１３２）。したがって、１つの実施形態において、ＣＤ２３０を標的とする本発明のＥＤＣはアルツハイマー病の治療に有用である。
多くのミスフォールドタンパク質が不溶性であることから、その分析は困難であるが、ミスフォールドタンパク質に特異的なリガンドの作製が、このようなタンパク質の細胞環境中でのコンホメーションを分析する鍵とされてきた（Ｌｅｌｉｖｅｌｄ，ＳＲら，２００７ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８５，２２８５−９７）。不溶性タンパク質の沈着物ではなくタンパク質の別の方法で折り畳まれた可溶性の配座異性体またはオリゴマーが疾患過程に関与するという見解に基づき、配座異性体またはオリゴマーに特異的なリガンドを開発することに努力が重ねられてきた。ＰｒＰの病的にミスホールドされたコンホメーションに対するコンホメーション特異的モノクローナル抗体（ｍＡＢ）が生み出され、一群のタンパク質の中からタンパク質の単一の配座異性体を検出することが可能になった（Ｋｏｒｔｈら，１９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８９，７４−７７およびＰａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓら，２００３ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，８９３−９およびＴｈａｃｋｒａｙら，２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０，８１−９０）。この試薬は、プリオン病または関連する疾患状態を発症するリスクのある無症候または初期段階の者を識別する方法として、組織または体液中のこのような疾患関連配座異性体の存在の検出に使用されている。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいて遺伝子ＰＲＮＰによってコードされるプリオン関連タンパク質（ＣＤ２３０、プリオン関連タンパク質、ＰｒＰ、主要プリオンタンパク質）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。ＰｒＰは、非転移性胃ガンに比べて転移性胃ガンで高度に発現されることが免疫組織化学染色により明らかにされている。ＰｒＰｃは、胃ガン細胞系の接着、浸潤およびインビボ転移能を大幅に促進することが報告されている［Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００６；２０：１８８６−１８８８］。胃ガン患者には免疫組織化学によってＰｒＰ発現が検出され、胃ガンではＰｒＰ発現が正常胃組織より有意に高いことが報告されている［Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１１ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２１；１７（３５）：３９８６−３９９３］。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ２３０の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ２３０を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、異なる安定なコンホメーションまたは「配座異性体」のＰｒＰと特異的に結合するコンホメーション特異的モノクローナル抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、異常型プリオンと結合するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオン特異的モノクローナル抗体である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は、例えば、モノクローナル抗体の抗ＣＤ２３０クローン３Ｆ４であり得る（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９９ Ｄｅｃ；１０７（４）：８０４−１４．）。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ２３０と特異的に結合する。
実施例６（実施例８も参照のこと）には、ＣＤ２３０を標的とする本発明のＥＤＣの例を記載する。実施例のデータは、ＣＤ２３０に特異的な抗体を用いて本発明のＥＤＣを作製することができることを示している。ＥＤＣ６．１の薬物が１抗体当たり平均７．２であることが明らかとなった。ＣＤ２３０特異的ＥＤＣは、Ａ５４９非小細胞肺ガン細胞に対して最も高い活性を示した試験したガン細胞には、非小細胞肺ガン細胞、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞および黒色腫細胞が含まれていた。ＣＤ２３０蛍光染色により判定したところ、試験した全細胞系が表面にＣＤ２３０を発現したが、ＥＤＣ６．１の活性は上記の他のＥＤＣより大幅に低いものであった。このことは、結合親和性が低いこと、使用した抗体の特異性、あるいは複合体が主として脳組織細胞内で形成されることが原因であった可能性が考えられる。プリオンタンパク質の疾患関連コンホメーションを標的とするターゲティング部分をＥＤＣターゲティング部分として使用し、得られたＥＤＣをプリオン関連疾患の治療に使用することができる。
本発明のＥＤＣの作製に有用なターゲティング部分の別の例が、ＣＤ５６またはＣＤ５６の特定のイソ型を特異的に認識し結合するものである。ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）は、小細胞肺ガン、神経芽腫、横紋筋肉腫、脳腫瘍、多発性骨髄腫および急性骨髄性白血病で発現される腫瘍関連抗原である。ＮＣＡＭは、少なくとも２５個のエキソンを含む単一の遺伝子によってコードされている。前駆体ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、様々な成熟ｍＲＮＡ種が生じることにより、ＮＣＡＭのタンパク質イソ型が産生され得る。ＮＣＡＭと細胞膜との結合様式および細胞内ＮＣＡＭドメインの大きさをそれぞれ決定するエキソン１５および１８の選択的スプライシングによって、主要なＮＣＡＭイソ型が３種類（計６種類）形成される。神経系では、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）により係留される１２０ｋＤａイソ型がグリア細胞表面に発現し、膜貫通型の１４０ｋＤａイソ型がニューロンおよびグリア細胞の両方に発現し、膜貫通型の１８０ｋＤａイソ型がニューロン表面に優勢にみられる。侵襲性のＣＤ５６陽性悪性新生物では、ＣＤ５６イソ型のみが発現するわけではないが、１４０ｋＤａイソ型が主要なものである（Ｇａｔｔｅｎｌｏｈｎｅｒら，２００９ ＡＪＰ Ｖ１７４，Ｎｏ．４．１１６０−１１７１）。ＮＣＡＭの細胞外部分は、５つのＩｇ様相同モジュール（Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５）および２つのフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（Ｆ３，１およびＦ３，２）が含む（Ｂｅｒｅｚｉｎら，２０００）。ＮＣＡＭは特殊な炭水化物ポリマーのポリ−アルファ２，８−シアル酸（ＰＳＡ）を有する。ＰＳＡは、負に帯電したＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）残基がアルファ２，８結合したポリマーである。ＮＣＡＭノックアウトマウスを用いた研究（Ｃｒｅｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６７，４５５−４５７）では、ＰＳＡの唯一の担体であるというわけではないが、ＮＣＡＭが主要なものであることが示されている。神経性および内分泌性を有する多くの腫瘍がＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現する。例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭは神経芽腫および髄芽腫（Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９０，５０，６３６４−６３７０）、肺小細胞ガン（Ｐａｔｅｌら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８９，４４，５７３−５７８）ならびに横紋筋肉腫に検出されており、これらの腫瘍の侵襲能および転移能に関連している可能性がある（Ｒｏｕｇｏｎら，Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ，１９９３ｂ）。近年、転移のヌードマウスモデルにノイラミニダーゼを注射することにより、原発性腫瘍上のＰＳＡが除去され、転移が遅くなることが示された（Ｄａｎｉｅｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０，９９７−１００４）。したがって、分子ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよび炭水化物ＰＳＡは、ガンを治療し転移を予防する本発明のＥＤＣのターゲティング部分の適切な標的となる。
ＮＣＡＭは、単に機械的な細胞接着を可能にする分子アンカーであるのではなく、細胞内の下流シグナル伝達を仲介する重要な機能的受容体である（Ｃｒｎｉｃら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（２００４）８６３０−８６３８）。ＤｏｈｅｒｔｙおよびＷａｌｓｈ（１９９９）は、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリンおよびＬ１が、ニューロンの線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を活性化することによって軸索伸長を刺激することを記載している。ＣＤ５６は、核因子（ＮＦ）−ｋＢ／ｂｃｌ２経路を介して、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における増殖の増大およびアポトーシスの減少を誘発する（Ｇａｔｔｅｎｌｏｅｈｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ２００７，１１０：２０２７−２０３３）。
ＮＣＡＭ（またはＣＤ５６）発現には形態形成事象との相関がみられ、このことはＮＣＡＭが発生の過程で重要なものであることを示唆している（Ｅｄｅｌｍａｎ，１９９０ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０：３０３−３１８）。したがって、ＮＣＡＭは神経系（Ｄａｓｔｏｎら，１９９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；１６：５４８８−５４９７）ならびに腎臓（Ｌａｃｋｉｅら，１９９０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９０；１１０：９３３−９４７）、肝臓（Ｋｎｉｔｔｅｌら，１９９６ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９６；１４９：４４９−４６２）、腸（Ｒｏｍａｎｓｋａら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １９９６；２２：３５１−３５８）、心臓（Ｇａａｒｄｓｖｏｌｌら，１９９３ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９３；６１：１００−１０７）、生殖腺（Ｍｏｌｌｅｒら，Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ １９９１；１８４：５４１−５４８）、膵臓（Ｍｏｌｌｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９２；６：１３３２−１３４２）および筋肉（Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒら，Ｎｅｕｔｒｏｎｅ １９９０；４−６５５−６６７）を含めた各種器官の発生に重要であると考えられている。したがって、ＮＣＡＭの機能に影響を及ぼすことができる本発明のＮＣＡＭ標的化ＥＤＣなどの治療薬は、標的細胞の適切な分化を誘導することによって上記器官の発生異常の状態に有用なものとなる。脳では、嗅覚系、海馬、小脳および網膜を含めた特定の脳領域の発達に異常があるノックアウトマウスによって、ＮＣＡＭの役割が裏付けられている（Ｃｒｅｍｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９７；８：３２３−３３５）。
培養細胞におけるＮＣＡＭ発現のアップレギュレートは接着結合喪失の直接的な結果であり、Ｅ−カドヘリン発現はＮＣＡＭ遺伝子発現のアップレギュレートを誘導する。その結果、ＮＣＡＭがｐ５９Ｆｙｎとともに集積して脂質ラフトを形成し、細胞運動およびＥＭＴに必要な活性であるＦＡＫリン酸化および接着点の組立てを引き起こす（Ｌｅｈｅｍｂｒｅら，ＥＭＢＯ（２００８）２７，２６０３−２６１５）。ＮＣＡＭが消失すると、腫瘍細胞の腫瘍形成能が低下する（Ｋｒｅｎら，（２００７）ＥＭＢＯ Ｊ ２６：２８３２−２８４２）。したがって、ＮＣＡＭを標的とする本発明のＥＤＣなどの治療薬は、ガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、神経細胞接着分子およびＮＣＡＭとしても知られるＣＤ５６と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ５６の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ５６を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ５６の１４０ｋＤａイソ型とのみ結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ターゲティング部分はＣＤ５６の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ５６を発現する細胞に効果を及ぼす。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＮＣＡＭ上のＰＳＡと結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、抗ＣＤ５６重鎖および軽鎖可変配列で構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ５６と特異的に結合する。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は抗体Ｎ９０１またはヒト型のＮ９０１である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２９４７−２９５１（１９８３）および米国特許第５，６３９，６４１号を参照のこと）。
実施例７（実施例８も参照のこと）には、ＣＤ５６を標的とする本発明のＥＤＣの例を記載する。実施例のデータは、ＣＤ５６に特異的な抗体を用いて、表面にＣＤ５６を発現する細胞系に対して対照複合体より活性が高い本発明のＥＤＣを作製することができることを示している。ＥＤＣ７．１の薬物が１抗体当たり平均４．６であることが明らかとなったのに対し、ＥＤＣ７．２は、薬物を１抗体当たり平均６．９含んでいた。ＣＤ５６特異的ＥＤＣは、ＣＤ５６を発現する唯一の細胞系の小細胞肺ガン細胞系Ｈ６９に対して最も高い活性を示した。この細胞に対しては、試験した両ＥＤＣの方が、薬物を１抗体当たり平均７．４含む対照複合体より高い活性を示した。試験したガン細胞には、大細胞肺ガン細胞、結腸ガン細胞、非小細胞肺ガン細胞、膵臓ガン細胞、乳ガン細胞、頭頸部ガン細胞、小細胞肺ガン細胞、黒色腫細胞および骨髄腫細胞が含まれていた。したがって、本発明のＥＤＣは、リンパ芽球性および骨髄性白血病（ＡＬＬ／ＡＭＬ）、悪性黒色腫ならびに小細胞肺ガンなどの多数のガン腫を含め、ＣＤ５６を発現するガンの治療に有用である。
ターゲティング部分のまた別の標的を用いて本発明のＥＤＣを作製し、様々な疾患の治療に使用することができる。細胞膜を横切る乳酸の輸送は、あらゆる哺乳動物細胞にとって基本的に重要である。解糖作用を示す細胞（例えば、白筋繊維および低酸素条件下にあるあらゆる細胞）が迅速に乳酸を排出し、他の組織が乳酸を取り込んで燃料呼吸作用（脳、心臓および赤筋）または糖新生作用（肝臓および腎臓）に供する必要がある。輸送は、ケトン体を含めた代謝に重要な他のモノカルボン酸の輸送にも関与するプロトン共役型モノカルボン酸輸送体（ＭＣＴ（複数可））のファミリーによって仲介される。ＭＣＴファミリーにはメンバーが１４あり、そのうち６つのメンバーの機能が特徴付けられている。当然のことながら、ＭＣＴ１−ＭＣＴ４のみが乳酸のプロトン共役輸送を触媒する。ガン細胞のミトコンドリアの酸化的代謝に供給する乳酸が必要な特定の固形腫瘍の増殖には、乳酸輸送が極めて重要であることがわかっている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｕｔｓｃｈｏｏｒｎら，２０１０ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ９：１７，３５１５−３５３３）。ＭＣＴ１はほとんどの細胞で発現されるが、ＭＣＴ４は、大量の乳酸を排出する必要のある解糖作用を示す組織（例えば、白筋）でのみ高レベルで発現される。ＭＣＴ２はほとんどのヒト組織には存在せず、ＭＣＴ３発現はほぼ網膜色素上皮に限られている。ＭＣＴ１、ＭＣＴ３およびＭＣＴ４は、細胞膜での発現に補助的な糖タンパク質のｇｐ７０（エンビジン）または多くの場合ＣＤ１４７（ベイシジン）を必要とする。ＭＣＴ２はＣＤ１４７と会合しないが、その機能的発現にはｇｐ７０が必要である。細胞膜ではＭＣＴがベイシジンまたはエンビジンとの会合を保持し、この相互作用がその活性に重要である。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、モノカルボン酸輸送体と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいて溶質キャリアファミリー１６、メンバー１（モノカルボン酸輸送体１）（ＳＬＣ１６Ａ１）遺伝子によってコードされる上皮細胞接着分子ＭＣＴ１と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＭＣＴ１の細胞外ドメインと結合し、ＭＣＴ１を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、ヒト化型の抗ＭＣＴ１である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＭＣＴ１と特異的に結合する。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＭＣＴ４の細胞外ドメインと結合し、ＭＣＴ４を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、ヒト化型の抗ＭＣＴ４である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＭＣＴ４と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＧＲＩＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質である、グルタミン酸受容体でイオンチャネル型のＡＭＰＡ２（ＧＬＵＲ２；ＧＬＵＲＢ；ＨＢＧＲ２）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＧＬＵＲ２の細胞外ドメインと結合し、ＧＬＵＲ２を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＧＬＵＲ２と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいて溶質キャリアファミリー１（中性アミノ酸輸送体）、メンバー５（ＳＬＣ１Ａ５）遺伝子によってコードされるＡＳＣＴ２と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２０１００１９６３９２号および同第２０１１０１３５５７０号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＡＳＣＴ２の細胞外ドメインと結合し、ＡＳＣＴ２を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、ヒト化型の抗ＡＳＣＴ２である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、米国特許出願公開第２０１００１９６３９２号に開示されている、細胞表面のＣＤ９８を認識する重鎖および軽鎖可変配列から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＡＳＣＴ２と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＥＰＣＡＭ遺伝子によってコードされる上皮細胞接着分子ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２００７０２５８９７８号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインと結合し、ＥｐＣＡＭを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、ヒト化型の抗ＥｐＣＡＭである。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面糖タンパク質ＥｐＣＡＭに対するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体ＭＡｂ１７−１Ａである。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面糖タンパク質ＥｐＣＡＭと結合する組換えヒトモノクローナル抗体のＭＡｂ１７−１Ａアデカツムマブ（ＭＴ２０１）である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２００７ ９：１９０−１９６）。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＥｐＣＡＭと特異的に結合する。
腫瘍血管新生には様々なインテグリンが重要な役割を演じている。インテグリンは、非共有結合したアルファおよびベータの２つのサブユニットからなる細胞外基質（ＥＣＭ）および基底膜タンパク質の膜貫通受容体である。インテグリンアルファｖベータ３およびアルファｖベータ５がＥＣＭ分子と結合する。インテグリンに標的化された薬物が腫瘍および網膜の血管新生を阻止することが報告されている（Ｍａｕｂａｎｔら，Ｂｌｏｏｄ， ２００６；１０８，（９）３０３５−３０４５）。したがって、インテグリンを認識するターゲティング部分は本発明のＥＤＣに有用である。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ベータ３インテグリンと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、アルファ５インテグリンと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、アルファ１インテグリンと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、Ｂｙｒｏｎら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；１２２，４００９−４０１１に記載されている抗インテグリン抗体である。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＡＬＣＡＭ遺伝子によってコードされる活性化白血球細胞接着分子（ＣＤ１６６）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ１６６の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ１６６を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ１６６と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＴＦＲＣ遺伝子によってコードされるトランスフェリン受容体（ＣＤ７１、ｐ９０、ＴＦＲ１）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許第７，７３６，６４７号および米国特許出願公開第２００６００３９９０７号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ７１の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ７１を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面のＣＤ７１を認識する重鎖および軽鎖可変配列（米国特許第７，７３６，６４７号を参照のこと）から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＣＤ７１と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＳＥＬ１Ｌ遺伝子によってコードされるｌｉｎ−１２様（センチュウ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））のｓｅｌ−１抑制因子（ＳＥＬ１Ｌ１、ＩＢＤ２）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＳＥＬ１Ｌ１の細胞外ドメインと結合し、ＳＥＬ１Ｌ１を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＳＥＬ１Ｌ１と特異的に結合する
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＲＳ１遺伝子によってコードされるレチノスキシン１（レチノスキシン、ＲＳ、ＸＬＲＳ２）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２０１０００４７７７９号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、レチノスキシンの細胞外ドメインと結合し、レチノスキシンを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はレチノスキシンと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＴＬＲ４遺伝子によってコードされるＴｏｌｌ様受容体４（ＣＤ２８４、ＴＬＲ４、ＴＯＬＬ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２０１００１８３６１９号および同第２０１００２６６６１９号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＴＬＲ４の細胞外ドメインと結合し、ＴＬＲ４を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面のＴＬＲ４を認識する重鎖および軽鎖可変配列（米国特許出願公開第２０１００１８３６１９号を参照のこと）から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＴＬＲ４と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体１型（ＩＰ３Ｒ、ＩＮＳＰ３Ｒ１）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＩＰ３Ｒ１細胞外ドメインと結合し、ＩＰ３Ｒ１を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＩＰ３Ｒ１と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、線維芽細胞成長因子受容体ファミリーと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願第２０１１０１３５６５７号および同第２０１００２４７５３１号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＦＧＦＲ１（ＣＤ３３１）の細胞外ドメインと結合し、ＦＧＦＲ１を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。別の実施形態では、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＦＧＦＲ２（ＣＤ３３２）の細胞外ドメインと結合し、ＦＧＦＲ２を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。別の実施形態では、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＦＧＦＲ３（ＣＤ３３３）の細胞外ドメインと結合し、ＦＧＦＲ３を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。別の実施形態では、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＦＧＦＲ４（ＣＤ３３４）の細胞外ドメインと結合し、ＦＧＦＲ４を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＦＧＦＲ１と特異的に結合する。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＦＧＦＲ２と特異的に結合する。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＦＧＦＲ３と特異的に結合する。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＦＧＦＲ４と特異的に結合する。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、ＩＭＣ−Ａ１（細胞表面のＦＧＦＲ１ｃを認識する完全ヒトモノクローナル抗体であり得る（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２９２：Ｅ９６４−Ｅ９７６，２００７を参照のこと）。１つの実施形態において、ヒト化抗体はＲ３Ｍａｂ（細胞表面のＦＧＦＲ３を認識する完全ヒトモノクローナル抗体、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９（５）Ｍａｙ ２００９を参照のこと）である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、線維芽細胞成長因子受容体ファミリーのメンバーと特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ターゲティング部分は、組換え型のＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３またはＦＧＦ７などの線維芽細胞成長因子である。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいて遺伝子ＫＬＢによってコードされるＫｌｏｔｈｏベータ（ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ、ＢＫＬ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２０１１０１３５６５７号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、Ｋｌｏｔｈｏベータの細胞外ドメインと結合し、Ｋｌｏｔｈｏベータを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面のＫｌｏｔｈｏベータを認識する重鎖および軽鎖可変配列（米国特許出願公開第２０１１０１３５６５７号を参照のこと）から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＫｌｏｔｈｏベータと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のタンパク質と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＣＤ３の細胞外ドメインと結合し、ＣＤ３を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体は、ＴＣＲαＶα７．２セグメントと特異的に結合する（Ｍａｒｔｉｎら（２００９）Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＭＡＩＴ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ７（３）：ｅ１００００５４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００００５４を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖベータ５．２／５．３と特異的に結合する（Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２ Ｍａｒ；９（２）：１５３−６４．）。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、マウスモノクローナル抗体は、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖａ７．２を認識する３Ｃ１０抗ＴＣＲａ Ｖａ７．２である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖベータ５．２／５．３を認識するＡＴＭ−０２７である（Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２ Ａｐｒ；５１（４）：４６７−７４）。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、特定の活性化Ｔ細胞上のＣＤ３受容体と結合するビジリズマブである。１つの実施形態において、抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３受容体と結合するマウスｍＡｂのＭｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３である。１つの実施形態において、抗体は、ＣＤ３を標的としＴＸＲ４としても知られる、キメラ／ヒト化ｍＡｂのオテリキシズマブである。１つの実施形態において、抗体は、ＣＤ３を標的としＭＧＡ０３１としても知られる、ヒト化ｍＡｂのテプリズマブである。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＴＣＲ複合体のタンパク質と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＩＧＦ１Ｒ遺伝子によってコードされるインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦＲ、ＣＤ２２１、ＩＧＦ１Ｒ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００８ １１：１７８−１８５，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １１，Ｎｕｍｂｅｒ １，Ｊａｎｕａｒｙ ２００８，ｐｐ．６２−６９（８））。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＩＧＦＲの細胞外ドメインと結合し、ＩＧＦＲを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒを認識する完全ヒトモノクローナル抗体のＡＭＧ４７９である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒを認識する完全ヒトモノクローナル抗体のフィギツムマブ（ＣＰ−７５１、８７１）である（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｎｕｍｂｅｒ ４／Ｊｕｌｙ ２００９）。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒを認識する完全ヒトモノクローナル抗体のＳＣＨ７１７４５４（ロバツムマブ）である（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１０；９：４１０−４１８）。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒを認識する完全ヒトモノクローナル抗体のＩＭＣ−Ａ１２（シクスツムマブ）である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：５５４９ｓ−５５５５ｓ）。別の実施形態では、ＥＤＣのターゲティング部分は、インスリン様成長因子１受容体と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＩＧＦ１Ｒと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＴＮＦ遺伝子によってコードされるタンパク質の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７４（５）：４６５−７２）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、膜貫通型ＴＮＦ−アルファの細胞外ドメインと結合し、ＴＮＦ−アルファを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子アルファに特異的なマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体のインフリキシマブ（ＩＮＮ；商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅ）である（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １２４，Ｉｓｓｕｅ ７，Ｐａｇｅｓ １７７４−１７８５，Ｊｕｌｙ ２００３）。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、腫瘍壊死因子アルファを認識する完全ヒトモノクローナル抗体のアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ、Ｄ２Ｅ７）である（米国特許第６，０９０，３８２号を参照のこと）。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＴＮＦ−アルファと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、膜結合型ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８ Ｆｅｂ；２７４（２ Ｐｔ １）：Ｃ４４７−５４．ＰＭＩＤ：９４８６１３５）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、膜結合型ＰＬＡ２の細胞外ドメインと結合し、ＰＬＡ２を発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、ヒト化抗体は、ＰＬＡ２を認識する重鎖および軽鎖可変配列（米国特許出願公開第２００５００５８６４９号を参照のこと）から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＰＬＡ２と特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＰＥＭＴ遺伝子によってコードされるタンパク質のホスファチジルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＥ−ＮＭＴ、ＰＥＭＴ、ＰＥＭＰＴ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９９ Ｊａｎ ４；１４３６（３）：４０５−１２およびＭｏｒｒｉｌｌら，ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０，１０：１２を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＰＥＭＴの細胞外ドメインと結合し、ＰＥＭＴを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＰＥＭＴと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＡＧＴＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質の１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＧＴＲ１Ａ、ＡＴ２Ｒ１）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許第６，８０５，８６４号およびＪ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８６．２２（２００８）ｐｐ ５３３７−５３４８，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９４：Ｆ９９０−Ｆ１０００，２００８を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＡＧＴＲ１Ａの細胞外ドメインと結合し、ＡＧＴＲ１Ａを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、米国特許第６，８０５，８６４号（請求項２を参照のこと）に記載されているモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＡＧＴＲ１Ａと特異的に結合する。
１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＳＬＣ６Ａ４遺伝子によってコードされるタンパク質の溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、セロトニン）、メンバー４（ＳＬＣ６Ａ４；ＨＴＴ；５−ＨＴＴ；５ＨＴＴ；ＯＣＤ１；ＳＥＲＴ；ｈＳＥＲＴ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８５：８３５−８４３，１９９８）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＳＥＲＴの細胞外ドメインと結合し、ＳＥＲＴを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＳＥＲＴと特異的に結合する。
ＴＲＡＮＣＥ受容体としても知られるＲＡＮＫ（核因子カッパＢの受容体活性化因子）は、間質細胞、骨芽細胞およびＴ細胞の表面で発現される。このほか骨肉腫、乳ガンおよび前立腺ガンなどのヒト起源のガン細胞系でＲＡＮＫ発現が確認されている（Ｓａｎｔｉｎｉら，２０１１ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）：ｅ１９２３４）。ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４）は、ＲＡＮＫと結合するリガンドである。ＲＡＮＫＬも表面結合分子である。ＲＡＮＫＬは十分な骨代謝に極めて重要であり、ＲＡＮＫＬの過剰発現は関節リウマチおよび乾癬性関節炎などの様々な変性骨疾患に関与する。ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬを標的とする本発明のＥＤＣは、関節リウマチおよび乾癬性関節炎などの変性骨疾患の治療に有用である。
したがって、１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ヒトにおいてＴＮＦＳＦ１１遺伝子によってコードされるタンパク質の腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１；ＯＤＦ；ＣＤ２５４；ＯＰＧＬ；ＲＡＮＫＬ；ＴＲＡＮＣＥ；ｈＲＡＮＫＬ２；ｓＯｄｆ）と特異的に結合する抗体またはその他のターゲティング部分である（米国特許出願公開第２００７０１３４２４５号および同第２００２００８６８２６号；ならびに米国特許第７，４１１，０５０号を参照のこと）。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインと結合し、ＲＡＮＫＬを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。様々な実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る抗体である。１つの実施形態において、モノクローナル抗体は、米国特許出願公開第２００７０１３４２４５号に記載されている抗ＲＡＮＫＬ重鎖および軽鎖可変配列から構築されている。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、ＥＤＣの抗体はＲＡＮＫＬと特異的に結合する。
別の実施形態では、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＲＡＮＫの細胞外ドメインと結合し、ＲＡＮＫを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。１つの実施形態において、ＥＤＣのターゲティング部分は、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインと結合し、ＲＡＮＫを発現する細胞に効果を及ぼす抗体またはその他のターゲティング部分である。
本発明のＥＤＣの抗体ターゲティング部分は通常、元の非複合体型の対応物の抗原結合能を保持している。したがって、本発明のＥＤＣに有用な抗体は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤（例えば、シラレニン）と安定な（およびいくつかの実施形態では、非切断性の）リンカーを介して結合しているが、抗原と特異的に結合することができる。このような抗原としては、治療的介入（または診断）の標的となっている細胞または組織のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合し近接しているタンパク質または標的が挙げられる。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製するのに様々な方法が用いられており、このような方法は本発明のＥＤＣに使用する抗体の作製に適用可能であるため、これについて以下で簡潔に概説する。ハイブリドーマ技術は単一のタイプの抗体を産生するクローン化された細胞系を指し、マウス（ネズミ）、ハムスター、ラットおよびヒトを含めた様々な種の細胞を用いるものである。キメラ抗体およびヒト化抗体を含めたＭＡｂを調製する他の方法では、遺伝子工学、例えば組換えＤＮＡ技術を用いる。
関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物にポリクローナル抗体を産生させることができる。実質的に均一な抗体の集団（例えば、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在し天然に生じたものであると考えられるものを除き同一である）からモノクローナル抗体が得られる。
このほか、ヒトモノクローナル抗体の産生についてヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系が記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０のＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定することができる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの供給源としての役割を果たす。ＤＮＡが一旦単離されたら、これを発現ベクターの中に入れ、次いでこれを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または他の方法では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成させる（米国特許出願公開第２００５００４８５７２号および同第２００４０２２９３１０号を参照のこと）。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８が挙げられる。
さらなる実施形態では、それぞれファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離について記載しているＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて作製した抗体ファージライブラリーから、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを単離することができる。のちの刊行物には、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３）による抗親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製ならびに巨大なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）が記載されている。したがって、ここに挙げた技術は、モノクローナル抗体を単離する従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の代替法として実行可能なものである。
ほかにも、例えば、相同なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコーディング配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７）号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１）、あるいは免疫グロブリンコーディング配列と、非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全部または一部を非共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾することができる。
通常、このような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインに置換するか、あるいは抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換し、ある抗原に特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を作製することができる。例えば、現在、免疫化によって内因性免疫グロブリン産生の非存在下で全レパートリーのヒト抗体を産生すること可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３；ならびに米国特許第５９１，６６９号；同第５，５８９，３６９号；および同第５，５４５，８０７号）。
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を用いて、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで作製することができる（Ｊｏｈｎｓｏｎら，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ．３：５６４−５７１）。未免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を実質的に単離することができる（Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）。このほか、インビトロで活性化させたＢ細胞によってヒト抗体を作製することができる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号）。ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体が記載されている（米国特許第５，７７２，９９７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９７／００２７１号）。
抗体フラグメントを作製するために様々な技術が開発されてきた。従来、インタクト抗体のタンパク質消化よってこのようなフラグメントを得た（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７；およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照のこと）。抗体フラグメントはほかにも、上で述べたような組換え宿主細胞および抗体ファージライブラリーによって直接産生させることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７）。また別の方法では、組換え宿主細胞の培養物からＦ（ａｂ’）２フラグメントを直接単離することができる。当業者には抗体フラグメントを作製する他の技術が明らかであろう。他の実施形態において、特に好ましい抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｖ（ｓＦｖ）二量体（Ｇｒｕｂｅｒら，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８）である。ほかにも、インタクト抗体をタンパク質分解により切断しＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する化学結合などを用いて、抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術が記載されている（Ｂｒｅｎｎａｎら，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＦａｂ’−ＳＨフラグメントを回収し、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる（Ｓｈａｌａｂｙら，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５）。「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するまた別の方法である（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）。
本発明のＥＤＣの様々な実施形態に価数が３以上の抗体を用いることができる。３つ以上の抗原結合部位と２つ以上の可変ドメインとを有する多価「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）」抗体を、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に作製することができる（米国特許出願公開第２００２０００４５８６号およびＰＣＴ公開第ＷＯ０１／７７３４２号）。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０）。
抗体のアミノ酸配列の改変（複数可）が本発明によって考慮される。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を向上させ、かつ／あるいはリンカーおよび／または治療薬と抗体との部位特異的結合を可能にするため、腫瘍関連抗原またはその他の抗原と結合する抗体の突然変異体および様々なイソ型が考慮される。抗体をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、あるいはペプチド合成によって抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性を有するという条件で、欠失、挿入および置換を任意に組み合わせて最終構築物に到達する。アミノ酸改変はほかにも、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体の翻訳後プロセスを変化させ得る。
突然変異誘発に好適な位置となる抗体の特定の残基または領域を特定するのに有用な方法が「アラニンスキャニング突然変異誘発」（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）であり、この方法では、アミノ酸残基または一群の標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）を特定し、アラニンまたはポリアラニンなどの中性または負荷電アミノ酸に置き換えて、抗原とアミノ酸との相互作用を最適化する。アミノ酸配列挿入としては、１残基の長さから１００以上の残基を含むポリペプチドの長さに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。
抗体のアミノ酸配列は通常、その元になる核酸配列を変化させることによって変化させる。当該技術分野で公知の様々な方法によって、抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子が調製される。このような方法としては、特に限定されないが、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチドを介した（または部位特異的）突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発およびこれまでに調製された抗体の変異体または非変異型の抗体のカセット突然変異誘発が挙げられる。置換による突然変異誘発で最も対象となりやすい部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も考慮される。
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域の例えば、シート構造もしくはらせん構造としてのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位にある分子の電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖のかさの維持に対する影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づき次の挙げるグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。上に挙げたクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに変化させるには、非保存的置換が必要となる。
このほか、抗体の適切なコンホメーションを維持するのに関与しない任意のシステイン残基を一般的にはセリンで置換し、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、抗体にシステイン結合（複数可）を付加し、その安定性を向上させることができる（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
抗体の血清半減期を増大させるため、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、抗体（特に抗体フラグメント）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書で使用される「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増大に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（米国特許出願公開第２００３０１９０３１１号ならびに米国特許第６，８２１，５０５号；同第６，１６５，７４５号；同第５，８３４，５９７号；同第５，６４８，２６０号；および同第５，６２４，８２１号を参照のこと）。このほか、ＰＥＧ化を用いて本発明のＥＤＣ半減期を増大させることができる。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化パターンを変化させた変異体である。変化させることは、抗体中にみられる炭水化物部分を１つ以上削除すること、抗体に炭水化物部分を１つ以上付加すること、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）またはグリコシル化の範囲を変化させることを意味する。抗体をその定常領域の保存された位置でグリコシル化することができる（Ｎ結合またはＯ結合）（Ｈｓｅら，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０；ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ，（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，（１９９７）ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）ならびに糖タンパク質のコンホメーションおよび提示される三次元表面に影響を及ぼす糖タンパク質の部分間での分子内相互作用（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ，上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）に影響を及ぼす。オリゴ糖はほかにも、特異的認識構造に基づき所与の糖タンパク質を特定の分子に対して標的化する働きを有し得る（Ｍａｌｈｏｔｒａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２３７−２４３；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。オリゴ糖の除去により、抗体の抗原結合特性およびその他の特性が最適化され得る（Ｂｏｙｄら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８）。
抗体の組換え産生時のグリコシル化に影響を及ぼす因子としては、増殖様式、培地の配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどが挙げられる（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，２７８，２９９号；および同第５，５１０，２６１号）。グリコシル化または特定のタイプのグリコシル化を、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を用いて酵素的に糖タンパク質から除去することができる。さらに、組換え宿主細胞を遺伝子操作して、例えば、特定のタイプの多糖のプロセシングを欠損させることができる。ここに挙げた技術およびこれと同様の技術が当該技術分野において周知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィー、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖組成分析、連続酵素消化および高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてオリゴ糖を電荷に基づき分離するＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを含めた従来の炭水化物分析技術によって容易に分析することができる。このほか、分析目的でオリゴ糖を解離させる方法が知られており、このような方法としては、特に限定されないが、酵素処理（一般に、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンド−ベータ−ガラクトシダーゼを用いて実施される）、強アルカリ環境を用いて主としてＯ結合構造を解離させる脱離ならびに無水ヒドラジンを用いてＮ結合およびＯ結合オリゴ糖を解離させる化学的方法がある。
ここに挙げた本発明のＥＤＣの抗体またはその他のターゲティング部分の標的の一部には、その細胞内または細胞上での位置を決定する複数のサブユニット、イソ型および／またはグリコシル化パターンがある。その発現は細胞型、細胞上での位置、細胞の位置および／または生理的および病的状態によって左右され得る。例えば、異常なグリコシル化はガンの顕著な特徴であり、糖タンパク質の炭水化物、糖脂質およびグリコサミノグリカンの含有量の変化が含まれる（参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００８；８（１）：２−２１を参照のこと）。具体的には、Ｎ−グリカンのベータ−１，６−ＧｌｃＮＡｃ−分岐がガン進行に直接関与するという証拠が多数存在する（参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９９；１４７３（１）：２１−３４を参照のこと）。また別の例として、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体中にみられるベータサブユニットのタイプ（１と２）とそのグリコシル化パターンが細胞型によって異なる（参照により本明細書に組み込まれるＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００８；８（１６）：３２３６−５６およびＡｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９７；２７２（１ Ｐｔ １）：Ｌ８５−９４を参照のこと）。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜結合イオンポンプのグリコシル化パターンが細胞に特異的な調節の必要性を満たすよう進化したと考えられており、異常なグリコシル化パターンが多数のガン細胞で同定されている。さらに、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜結合イオンポンプ複合体のガンマサブユニットイソ型５もグリコシル化膜タンパク質（ディスアドヘリンまたはＦＸＹＤ５とも称される）であり、これは実験的なガン転移を促進することが示されており、多数の異なるタイプのヒトガンの転移および生存の独立した予後指標となっている［Ｎａｍら，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２５５（２）１６１−９（２００７）を参照のこと］。さらに、患部組織または患部組織を取り囲む循環構造では、多数の細胞外標的にわずかな差がみられるか、これが過剰発現される。したがって、異常なグリコシル化または抗原発現の異常により生じた任意の標的抗原が本発明のＥＤＣターゲティング部分の標的となり得る。
シャペロンＣｏｓｍｃの体細胞変異が新たな糖ペプチドエピトープの形成を引き起こすことがあり、本発明のＥＤＣに使用するガン特異的抗体をこのエピトープに対して作製することができる（参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｉｅｔｉｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（５７９７）３０４−８（２００６）を参照のこと）。ここに挙げたグリコシル化の差を認識する抗体が作製されている。異常なグリコシル化を受けた細胞表面グリカンに対する特異的抗体の作製方法が２つの論文に記載されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００６；５５（１１）：１３３７−４７およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（５）：２０１８−２５を参照のこと）。しかし、糖にのみ高い親和性を示す抗体を作製することが困難な場合がある。腫瘍関連炭水化物抗原に対する免疫耐性の問題を克服するため、非天然の抗原性糖を細胞に与え、高親和性抗体が生じ得る新たなグリコシル化モチーフを作製することができる（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５（２００７）７５６１−７５６７を参照のこと）。このような非天然糖とそれが修飾するタンパク質に対して作製された抗体により、特異性の高い疾患標的抗体が生じ、これは本発明のＥＤＣの様々な実施形態に有用である。
ほかにも、患部組織で過剰発現する標的に対して抗体が作製されており、このような抗体は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合するタンパク質を対象とする場合、本発明のＥＤＣに有用である。ガンでは、このような抗原は通常、腫瘍関連抗原と称され、１群の正常な非突然変異体分子を形成している。例えば、転移するガン細胞で過剰発現する標的に対して抗体が作製されており、このような抗体は、この標的がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合している場合、本発明のＥＤＣに有用である。転移細胞には、他の組織または器官に移動して癌の範囲を広げる能力がある。
標的化という側面以外にも、本発明のＥＤＣのターゲティング部分は他の利点をもたらす。例えば、ターゲティング部分は血液脳関門を横切る輸送を促進し得る（例えば、抗体がこの輸送を促進し得る［Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３，８４ｒａ４３（２０１１）およびＳｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３，８４ｒａ４４（２０１１）］）；ターゲティング部分は治療薬のインビボ半減期を増大させ得る（３つのＩｇＧサブクラスの半減期は、ヒトでは約２０日である）；および／またはターゲティング部分は、循環構造または医薬希釈剤などの水溶液中での薬剤の溶解度を増大させ得る。
本発明のＥＤＣの様々な実施形態において、本発明のＥＤＣのターゲティング部分は次のように作用する：（ｉ）本発明の薬剤を標的付近または標的上に長時間維持する（その結合親和性による）、（ｉｉ）非内部移行性ターゲティング部分は受容体／抗原タイプのエンドサイトーシスによって細胞内に移行せず、したがってリソソーム系に到達しないことから、リソソーム酵素による分解を防ぐ、遅らせるおよび（ｉｉｉ）その細胞外濃度に直線的に依存して、液相エンドサイトーシスによる細胞内取込みを防ぐ。ターゲティング部分の非内部移行性は、当業者によって実験的に判定することができる。例として、非内部移行性抗体には、標的組織の細胞外構成要素の表面に存在する抗原およびエピトープ、例えば細胞外基質の抗原およびエピトープなどと相互作用し、かつリソソーム内に入って分解されることがない抗体がある。
本発明のＥＤＣの抗体は、上記定義に記載されている様々なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、修飾抗体、キメラ抗体または改良抗体を含み得る。例えば、現在、最新の代替戦略により、完全ヒト化抗体を作製し抗体の免疫原性を低減することが可能である。さらに、抗原結合Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび小型抗体（ｍｉｎｏｂｏｄｙ）を含めたより小型の抗体フラグメントを設計することが可能であり、また抗体を増強し抗体の親和性、安定性および発現レベルを増大させることも可能である（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３ Ｊａｎ；９（１）：１２９−３４を参照のこと）。
本発明の別の実施形態では、本発明のＥＤＣのターゲティング部分は抗体ではなく、代わりに、標的化という点で抗体と機能的に同等のペプチドもしくはタンパク質またはペプチド模倣物である。例えば、特に限定されないが、抗体を、コンビナトリアルタンパク質設計の方法を用いて所定の結合機能を持たせることができる多数の小型で堅固な非免疫グロブリン「足場」のいずれかに置き換えることができる。このような足場は様々な総説に記載されている（例えば、“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” ｉｎ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｊｕｎ；１３（３）：２４５−５５および“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９ Ｍａｙ；５３（Ｐｔ １）：１−２９を参照のこと）。
本発明のまた別の実施形態では、本発明のＥＤＣのターゲティング部分は抗体ではなく、代わりに、標的化という点で抗体と機能的に同等のＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド模倣物である。例えば、ＳＥＬＥＸ法を用いて、所定の結合機能を有するＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその改変物を同定することができる。アプタマーは、指数関数的濃縮ＳＥＬＥＸプロセスのようなリガンドの系統的進化によって単離されるＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはその改変物のポリマーである（ＨｉｃｋｅおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ，２０００，“Ｅｓｃｏｒｔ Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ａ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６（８），ｐｐ．９２３−９２８を参照のこと）。
通常、ターゲティング部分（またはその他の結合もしくはターゲティング部分）は、本発明のＥＤＣの形成に使用する前に（例えば、Ｌｏｗｒｙ法による測定で）９５重量％超まで、多くの場合９９超％まで精製する。通常、ターゲティング部分を少なくとも１回の精製段階によって調製する。目的とするターゲティング部分が入手できれば、のちのセクションで述べる様々なリンカーおよびリンカー技術のいずれかによって、それを治療薬と連結することができる。
本発明のＥＤＣのターゲティング部分としては、ガビリモマブまたはジラリムマブなどのＣＤ１４７に対する抗体が挙げられる。本発明のＥＤＣのほかのターゲティング部分としては、アデカツムマブ、シタツズマブボガトックスまたはカツマキソマブなどのＥｐＣＡＭ特異的抗体、ビバツズマブメルタンシンなどのＣＤ４４特異的抗体、デノスマブなどのＲＡＮＫＬ特異的抗体、フィギツムマブまたはロバツムマブなどのＩＧＦ−１受容体特異的抗体、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＲｅｏＰｒｏ、ＴｙｓａｂｒｉおよびＡｍｂｅｇｒｉｎとしても知られるＭＥＤＩ−５２２などのインテグリンならびにＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成する細胞外標的の細胞外エピトープに対して高い親和性を示すその他の抗体が挙げられる。
したがって、本発明のＥＤＣの作製に使用し得る多種多様な標的およびターゲティング部分が存在する。特に対象となるターゲティング部分は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接して存在する疾患特異的細胞外標的を標的とするものである。本発明のＥＤＣとしては、単一の薬剤または単独で作用する薬剤としては治療目的に使用するのに特異性が不十分なターゲティング薬剤（抗体および／または薬物）を含むＥＤＣが挙げられる。このような薬剤が本発明のＥＤＣにおいては治療適用される。
上に挙げた標的の多くのものに対する抗体ターゲティング部分が既に存在するものか、本明細書の開示を考慮して当業者が作製することができるものである。本明細書で示される通り、ＣＤ１４７（ＥＤＣ２）、ＣＤ４４（ＥＤＣ３）、ＣＤ９８（ＥＤＣ４）、ＣＤ８７、ＣＤ２３０およびＣＤ５６などの受容体を標的とする抗体を有するＥＤＣには、腫瘍学において抗ガン剤として有用な用途があり、本発明のＥＤＣに適した他の標的（および対応する抗体）が多数存在する（例えば、ＣＤ２９、ＣＤ７１、ＣＤ１６６およびＥｐＣＡＭ）。炎症については、本発明のＥＤＣに適した標的（および対応する抗体）としては、ＣＤ２８、ＰＬＡ２およびＴ細胞受容体が挙げられる。糖尿病については、本発明のＥＤＣに適した標的（および対応する抗体）としては、ＰＥ−ＮＭＴ、インスリン受容体（ＣＤ２２０）およびアンジオテンシンが挙げられる。さらに、ここに挙げた適応症は、本発明のＥＤＣが重要な新たな治療薬をもたらす多様な適応症の例に過ぎない。
したがって、本発明のＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接する標的と結合する多種多様なターゲティング部分のいずれも使用することができる。
ＩＶ．リンカー
本発明のＥＤＣを形成するため、安定なリンカーを介して治療薬をターゲティング部分とカップリングさせる。様々な実施形態において、リンカーは、通常はＥＤＣの薬物と結合したグリコシド（糖）残基を少なくとも１つ含む。リンカーは、ＥＤＣの一部としてではなく、別個のものとして概念化される場合、１つ以上の薬物を抗体と連結させてＥＤＣを形成するために使用することができる単官能性または多官能性部分である。ＥＤＣは、薬物との結合および抗体との結合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して都合よく調製することができる。例えば、システインチオールまたはアミン、例えば抗体のＮ末端またはアミノ酸側鎖、例えばリジンなどは、リンカー試薬または薬物−リンカー試薬（薬物とリンカーとから構成される）の官能基と結合を形成することができる。
本発明の方法に好ましいＥＤＣに使用するためのリンカーは一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および１つ以上のグリコシドから構成される。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は２〜３６個のグリコール単位を含む。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は２４個のグリコール単位を含む。様々な実施形態において、リンカーは単一のグリコシドを含む。様々な実施形態において、グリコシドを最初、薬剤の様々な部位で薬剤と結合させ、この薬剤−グリコシドを活性について試験する。様々な実施形態において、リンカーのグリコシド部分は３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシドおよび／または４−アミノ−キシロシドを含む。様々な実施形態において、ＥＤＣの最大限の活性にリンカーのグリコシド部分を必要とする。様々な実施形態において、リンカーを介して薬剤をグリコシドと結合させ、グリコシドは３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシドおよび４−アミノ−キシロシドからなる群より選択され、リンカーのＰＥＧ部分をグリコシドのアミノ基と結合させる。通常、本発明の製造方法によるＥＤＣの製造では、最初に薬物−リンカー試薬を形成し、次いで薬物−リンカー試薬を抗体と共有結合させて、ＥＤＣを形成する。薬剤がジゴキシゲニン、プロゲステロンまたはシラレニンである場合、グリコシドは４−アミノ−リボシドまたは４−アミノ−キシロシドである。薬剤がウアバインである場合、グリコシドは３−アミノ−リボシドまたは３−アミノ−キシロシドである。
本発明のＥＤＣに用いるリンカーは安定である。投与後、ＥＤＣは安定であり、無傷な状態を保持する、例えば、ターゲティング部分がリンカーを介して薬剤と連結した状態を保持する。リンカーは標的細胞の外側で安定であり、効果を発揮するのに未切断の状態を保持する。有効なリンカーは：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持する；（ｉｉ）複合体または薬剤の送達を可能にする；（ｉｉｉ）安定かつ無傷な状態を保持する、例えば、抗体および／または薬剤が安定かつ無傷な状態である限り切断されない；かつ（ｉｖ）ＥＤＣが無傷な状態のまま薬剤の細胞毒性、殺細胞効果または細胞増殖抑制効果を維持する。例として、安定なリンカーは、本発明のＥＤＣ中にある場合、標的組織の表面、標的細胞の表面または細胞外マトリックス中に存在する間、少なくとも４〜８時間以上、例えば８〜２４時間または１〜１０日以上の期間、最小（例えば、１０％未満）の切断を示すリンカーであり；非切断性リンカーは、さらに長い期間、例えば２０日以上もの長期間、これらの条件下で安定なものである（Ｄｕｒｃｙ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１０，２１，５−１３）。
本発明のＥＤＣで用いるリンカーは２段階で都合よく作製することができる。第一段階では、遊離第１アミンなどの活性な求核試薬を含むグリコシドと、ジギトキシゲニンまたはシラレニンなどのステロイド剤とを結合させる。第二段階では、二官能性ＰＥＧリンカーとグリコシドのアミンとを結合させる。この方法は、グリコシドおよび異なるリンカーの長さの様々な組み合わせを連続して付加できるという点で有利である。加えて、グリコシドには、本発明のリンカー部分に用いた場合に特定の利点があることが示されている。
安定なリンカーは、結合時に薬剤およびターゲティング部分がそれぞれの標的に結合し作用できるよう、治療薬とターゲティング部分との間に共有結合を形成する。安定なリンカーは単に、ターゲティング部分および薬剤上の反応性部位間で形成される共有結合であり得るが、本発明の安定なリンカーは通常、リンカースペーサー基、例えば、反復する一連のエチレングリコール単位およびアミノグリコシドを含む。リンカーを介してターゲティング部分を薬剤に結合させるために相補的反応性基を利用する。例えば、ターゲティング部分上のアクセス可能なスルフヒドリル基が活性なマレイミド基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成し得る。さらなる例には薬剤上のアクセス可能なアミンがあり、これはスクシンイミドエステルと反応して、安定なアミド結合を形成することができる。一端にマレイミドを有し、他端にスクシンイミドエステルを有する二官能性リンカーを用いて、薬物と抗体とを連結することができる。のちの実施例で例示するように、ＥＤＣは、アミノグリコシドをステロイド薬のヒドロキシル基と連結させ、Ｏ−グリコシド結合を形成することによって都合よく調製することができる。次いで、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド試薬をアミノグリコシドのアミノ基と連結させて、「リンカー試薬」を形成する。最後に、リンカー試薬中のマレイミドを抗体中のシステイン部分と共有結合させる。
したがって、ＥＤＣには通常、異なる化学リンカー（単一の共有結合とは対照的に）を使用する。このタイプのリンカーは通常、ターゲティング部分および／または治療薬をリンカーと共有結合させる連結試薬として機能し得る官能基を含む２つの「末端」を有する１つ以上の「リンカースペーサー基」からなる原子の直鎖またはポリマーである。好適なリンカーとしては、特に限定されないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、アルデヒド、酸、エステルおよび無水物、スルフィドリルまたはカルボキシル基、例えば、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体などを含めた、多種多様な官能基および部分を含み得るか、シアン化臭素、シアン化塩素、スクシンイミジルエステルまたはスルホン酸ハロゲン化物などから誘導され得るものである。
リンカーは、ターゲティング部分と薬物を物理的に連結することに加えて、有益な特性を本発明のＥＤＣに付与することができる。リンカーを用いて、薬剤に起因するＥＤＣの薬剤自己会合または凝集を最小限に抑えることができる。リンカーはこのほか、ＥＤＣの治療効果を向上させ得る。リンカーはほかにも、ＥＤＣの薬物動態を向上させるよう働き得る。ターゲティング部分と治療薬とを連結する場合、リンカー基は、本発明の化合物の生物学的耐性を高める機能、生物学的適合性を高める機能、免疫原性を低減する機能、毒性を低減する機能および／あるいは循環構造中での安定性を高める、または他の種類の破壊もしくは除去に対する安定性を高める機能、または本発明の化合物を非切断性にする機能など、他の機能を複数有し得る。したがって、ある実施形態では、安定なリンカーまたは非切断性リンカーは、生理学的条件下でターゲティング部分と治療薬との結合を維持するが、同時に有益な治療効果も有し得る。
安定な非切断性リンカーの１つの例がポリアルキレングリコールリンカーである。安定な非切断性リンカーのまた別の例が、ポリアルキレングリコールリンカーに結合したグリコシドである。ポリアルキレングリコールリンカーは、エーテル結合の形態で酸素によって一緒に結合したアルキレン部分を少なくとも２つ、通常３つ以上有する直鎖である。グリコシド結合ポリアルキレングリコールリンカーは、アミノグリコシドなどの糖が結合したポリアルキレングリコールの直鎖である。アルキレン基は置換されていることもあるが、通常は置換されておらず、任意の所望の数のアルキレン単位を含み得るが、通常、少なくとも２個または１００個以下のこのような単位、例えばエチレン、プロピレン、ヘキシレンなどを含み得る。１つの実施形態において、リンカーは２４のエチレングリコール反復単位からなり、ＰＥＧ２４型リンカーを形成する。このリンカーは、両端に結合した反応性基に応じて、長さが約９０〜１００オングストロームになる。一般にリンカーの長さは、約５０〜約５００オングストロームまたは約５０〜約２００オングストロームの範囲内にある。１つの実施形態において、リンカーは糖からなる。様々な実施形態において、前述のように、リンカーはアミノ糖を含む。ポリアルキレングリコール残基は、全て同じであるか長さおよび／または置換が異なるアルキレン反復単位を含み得る。様々な実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、（ＰＥＧ）３６二官能性リンカーを用いて構築される。特定の実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＳＭ（ＰＥＧ）２４を用いて構築される。特定の実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、アミノ−グリコシドを用いて構築される。特定の実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシドおよび／または４−アミノ−キシロシドを用いて構築される。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および１つ以上のグリコシドを用いて、ターゲティング部分と薬物とを連結する場合、ＥＤＣは免疫系による攻撃に抵抗することが可能性となり得る。タンパク質または小分子にＰＥＧを付加すると、一部のタンパク質または小分子治療薬の治療効果が向上することが示されている（参照により本明細書中に組み込まれる、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ：Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．（編）２００９およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ５５，Ｉｓｓｕｅ １０，２６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００３，Ｐａｇｅｓ １２６１−１２７７を参照のこと）。したがって、ＰＥＧにより血清半減期を増大させ、抗原性を低減することができる。
アミノグリコシドなどの糖を用いて、ポリアルキレングリコールを介して抗体と薬物とを連結する場合、ＥＤＣは、そのような糖のないＥＤＣと比べて免疫系による攻撃に抵抗する能力が向上する可能性がある。特定の実施形態では、リンカーの好ましいグリコシドは、３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシドおよび／または４−アミノ−キシロシドである。当業者は、グリコシドとリンカーの他の部分とを結合させるために使用し得る第一級アミンまたは求核剤を含む使用可能なグリコシドが多数存在することを理解するであろう。好ましいグリコシドは、天然に存在する酵素の基質ではないグリコシドである。タンパク質または小分子に糖を付加すると、抗体または小分子治療薬の治療効果が向上することが示されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８，２２６−２３４（Ｍａｒｃｈ ２００９）およびＥｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９を参照のこと）。したがって、糖により溶解度を増大させて凝集を低減し、抗原性を低減することができる。
本発明のリンカーのグリコシドは、ＤまたはＬ−ヘキソース、ペントース、デオキシヘキソース、デオキシペントース、デオキシ−ハロヘキソース、デオキシ−ハロペントース、デオキシ−アミノペントース、デオキシ−アミノヘキソース、テトロース、ヘテロ糖、カルボキシ糖、上記糖の誘導体、上記糖の少なくとも１つから誘導される二糖または上記糖の少なくとも１つから誘導される多糖を含み得る。適切な糖としては、例えば、Ｌ−リボース、Ｄ−リボース、Ｌ−フコース、Ｄ−フコース、２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、６−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、６−デオキシ−６−フルオロ−Ｄ−グルコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−リキソース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アロース、Ｄ−アロース、Ｌ−アルトロース、Ｄ−アルトロース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−キシロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グロース、Ｌ−マンノース、Ｄ−マンノース、Ｌ−イドース、Ｄ−イドース、Ｌ−ミカロース、６−ケト−Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミノース、メリビオース、ラクトース、マルトース、Ｄ−ガラクトフルクトース、Ｌ−タロース、Ｄ−タロース、６−デオキシ−６−アゾ−Ｄ−マンノース、Ｌ−グルコース、Ｄ−グルコースおよびこれらのアミノ−グリコシドが挙げられる。
抗体、リンカー部分および薬物の結合の順序はＥＤＣの製造において様々であり得るが、通常、製造プロセスは、まず薬物を合成し、次いでリンカーの糖部分を結合し、次にリンカーのＰＥＧ部分を結合し、最後に抗体を結合することによって進行する。当業者が理解するように、抗体は、薬物−リンカー試薬（またはリンカー）の共有結合のために複数の部位を提示し得る。カップリング条件を適切に変更することにより、用いる条件に応じて抗体当たりの薬物の平均数が異なるＥＤＣの製剤を作製することができる。本発明の様々な方法において、後述するように、この平均数は、ＥＤＣの最大限の有益な治療効果を達成するのに重要である。
本発明のＥＤＣを形成するため、安定なリンカーを介して治療薬とターゲティング部分とをカップリングさせる。リンカーは、１つ以上の共有結合を介してターゲティング部分と薬剤とを結合させるものであり、また安定なリンカーが必要であることから、リンカーは通常、ジスルフィド基もエステル基も含まない。リンカーは、１つ以上の薬剤をターゲティング部分と連結して本発明のＥＤＣを形成することができる官能性または多官能性部分である。ターゲティング部分と結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて、ＥＤＣを好都合に調製することができる。例えば、抗体タイプのターゲティング部分のシステインチオールまたはアミン、例えばＮ末端またはアミノ酸側鎖、例えばリジンなどが、リンカー試薬または薬物−リンカー試薬の官能基と結合を形成し得る。本発明のいくつかの実施形態では、薬物−リンカー薬剤を合成し、次いで、これを抗体またはその他のターゲティング部分とカップリングさせて、本発明のＥＤＣを形成する。のちの実施例に例示するように、本発明の有用な薬物−リンカー薬剤としては、薬物が強心配糖体のアグリコンなどのステロイドであり、リンカーがＰＥＧスペーサーアームと連結したグリコシドである薬物−リンカー薬剤が挙げられる。本発明の様々な実施形態において、リンカーまたはリンカー中のスペーサーアームは、長さが少なくとも５０オングストローム、少なくとも７５オングストロームまたは少なくとも９５オングストロームである。１つの実施形態において、リンカーは、長さが少なくとも９５オングストロームで２００オングストローム未満である。
本発明のＥＤＣに用いるリンカーは安定である。投与後、ＥＤＣは安定であり、無傷な状態を保持する、例えば、ターゲティング部分がリンカーを介して薬剤と連結した状態を保持する。リンカーは標的細胞の外側で安定であり、効果を発揮するのに未切断の状態を保持する。有効なリンカーは：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持する；（ｉｉ）複合体または薬剤の送達を可能にする；（ｉｉｉ）安定かつ無傷な状態を保持する、例えば、抗体および／または薬剤が安定かつ無傷な状態である限り切断されない；かつ（ｉｖ）ＥＤＣが無傷な状態のまま薬剤の細胞毒性、殺細胞効果または細胞増殖抑制効果を維持する。ＥＤＣの安定性は、質量分光測定法、ＨＰＬＣおよび分離／分析技術ＬＣ／ＭＳなどの標準的な分析技術によって測定することができる。
安定なリンカーは、結合時に薬剤およびターゲティング部分がそれぞれの標的に結合し作用できるよう、治療薬とターゲティング部分との間に共有結合を形成する。安定なリンカーは単に、ターゲティング部分および薬剤上の反応性部位間で形成される共有結合であり得るが、本発明の安定なリンカーは通常、リンカースペーサー基とグリコシドとを含む。リンカーを介してターゲティング部分を薬物−リンカー試薬に結合させるために反応性基を利用する。例えば、例えば、ターゲティング部分上のアクセス可能なスルフヒドリル基が活性なマレイミド基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成し得る。
リンカーは、ターゲティング部分と薬物を物理的に連結することに加えて、有益な特性を本発明のＥＤＣに付与することができる。リンカーを用いて、薬剤に起因するＥＤＣの薬剤自己会合または凝集を最小限に抑えることができる（例えば、分岐ペプチドリンカーのドキソルビシン部分に親水性のメトキシトリエチレングリコール鎖を導入することによって、免疫複合体生成物の凝集が大幅に減少した）。リンカーはこのほか、ＥＤＣの治療効果を向上させ得る（例えば、ドキソルビシンとＢＲ６４モノクローナル抗体間のリンカーの安定性を増大させると、有効性および効力が増大した）。リンカーはほかにも、ＥＤＣの薬物動態を向上させ得る（例えば、ポリ−エチレングリコールが抗体およびその他の分子の血清半減期を増大させ得る）。ほかにもリンカーが、薬剤またはターゲティング部分の化学反応性を増大させて、ターゲティング部分または薬剤のカップリング効率を増大させるよう働くことがある。化学反応性が増大するとほかにも、他の方法では使用に適さない部分または部分上の官能基の使用が容易になり得る。ターゲティング部分と治療薬とを連結する場合、リンカー基は、本発明の化合物の生物学的耐性を高める機能、生物学的適合性を高める機能、免疫原性を低減する機能、毒性を低減する機能および／あるいは循環構造中での安定性を高める、または他の種類の破壊もしくは除去に対する安定性を高める機能、または本発明の化合物を非切断性にする機能など、他の機能を複数有し得る。したがって、ある実施形態では、安定なリンカーまたは非切断性リンカーは、生理学的条件下でターゲティング部分と治療薬との結合を維持するが、同時に治療効果も有し得る。
本発明のＥＤＣに使用するリンカーは安定であり、様々な実施形態において非切断性である。あらゆる実施形態において、本発明のＥＤＣがその最大限の治療効果を発揮するためには、リンカーが無傷な状態を保持しなければならず、これは以下のことを必要とする：（ｉ）本発明の化合物のターゲティング部分と治療薬との間の連結が、ＥＤＣがその標的（複数可）を見つけて結合するのに十分な長い期間、循環構造中で安定な状態を保持すること；（ｉｉ）本発明のＥＤＣを様々な条件および温度の下で長期間保存している間、連結が安定な状態を保持すること；ならびに（ｉｉｉ）本発明のＥＤＣの安定性が当業者によって実験的に判定され得ること。例として、安定なリンカーは、本発明のＥＤＣ中にある場合、標的組織の表面、標的細胞の表面または細胞外マトリックス中に存在する間、少なくとも４〜８時間以上、例えば８〜２４時間または１〜１０日以上などの期間、最小（例えば、１０％未満）の切断を示すリンカーであり；非切断性リンカーは、これらの条件下でさらに長い期間、例えば２０日以上もの長期間、安定なものである（Ｄｕｒｃｙ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１０，２１，５−１３）。
安定な非切断性リンカーの１つの例が、アミド結合を介してグリコシドと結合したポリアルキレングリコールリンカーである。ポリアルキレングリコールリンカーは、エーテル結合の形態で酸素によって一緒に結合したアルキレン部分を少なくとも２つ、通常３つ以上有する直鎖である。アルキレン基は置換されていることもあるが、通常は置換されておらず、任意の所望の数のアルキレン単位を含み得るが、通常、少なくとも２個以上で５個以下、１０個以下、２５個以下、５０個以下または１００個以下のこのような単位、例えばエチレン、プロピレン、ヘキシレンなどを含み得る。１つの実施形態において、リンカーは２４のエチレングリコール反復単位からなり、ＰＥＧ２４型リンカーを形成する。このリンカーは、両端に結合した反応性基に応じて、長さが約９０〜１００オングストロームになる。１つの実施形態において、リンカーは糖からなる。１つの実施形態において、リンカーはアミノ糖からなる。ポリアルキレングリコール残基は、全て同じであるか長さおよび／または置換が異なるアルキレン反復単位を含み得る。様々な実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、（ＰＥＧ）３６二官能性リンカーまたはスペーサーアームを用いて構築される。特定の実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＳＭ（ＰＥＧ）２４を用いて構築される。
当然のことながら、本発明の有利な特性が実質的に損なわれないように１つ以上のアルキレン単位の任意の置換基を選択する。当業者は、本明細書の開示を考慮して、しかるべき選択を行うことができるであろう。このような置換基は、存在する場合、通常はヒドロキシル、アルコキシルまたは二置換アミノ部分である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および１つ以上のグリコシドを用いて、ターゲティング部分と薬物とを連結する場合、ＥＤＣは免疫系による攻撃に抵抗することが可能性となり得る。タンパク質または小分子にＰＥＧを付加すると、一部のタンパク質または小分子治療薬の治療効果が向上することが示されている（参照により本明細書中に組み込まれる、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ：Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．（編）２００９およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ５５，Ｉｓｓｕｅ １０，２６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００３，Ｐａｇｅｓ １２６１−１２７７を参照のこと）。したがって、ＰＥＧにより血清半減期を増大させ、頻繁な投薬の必要性を減じ、抗原性を低減することもできる。
薬物を抗体上に設計された部位特異的位置にリンカーを介してカップリングさせて、本発明のＥＤＣを作製することができる。例えば、翻訳後修飾を行って「スルファターゼモチーフ」とも称されるアミノ酸コンセンサス配列内のシステインをアルデヒド保有残基ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を用いて、アルデヒドタグを作製することができる。このモチーフを。アミノオキシまたはヒドラジド官能化プローブによる部位特異的標識のために、遺伝的にコードされた「アルデヒドタグ」として異種タンパク質内に組み込むことができる（Ｃｅｌｌ．２００３ Ｍａｙ １６；１１３（４）：４３５−４４；Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １７；１３０（３７）：１２２４０−１２２４１を参照のこと）。抗体の部位選択性の改変のまた別の例は、システインを介して行い、最初にファージＥＬＩＳＡ選択を用いて抗体表面上の反応性チオール基を特定するものである（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８ Ｍａｒ ２０；３３２（１−２）：４１−５２および米国特許出願公開第２００８０３０５０４４号を参照のこと）。抗体を部位特異的に標識するさらに別の方法は、抗体ポリペプチド鎖に組み込まれた非天然アミノ酸の使用によるものである（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２００６ ３５：２２５−４９を参照のこと）。
本発明の方法に従って多官能性リンカーまたはデンドリマーを使用し、複数の薬をターゲティング部分上の単一の結合部位に結合させることができる。この方法では、複数の薬剤を、上述のように設計し得るターゲティング部分上の単一の特定部位または反応性側鎖が位置する複数の部位に結合させることができる。薬物およびリンカーの数はいずれの場合も、少なくとも１つであり、上限は当業者により実験的に決定され得る。最適なリンカーおよび薬物の数を決定することは可能であるが、これが必要というわけではない。例えば、１つのリンカーに複数の治療薬が結合し（デンドリマー）、複数のリンカーを有するＥＤＣが治療薬の結合していないリンカーを一部有することがあり得る。
最適なリンカー長は、実験的測定によって、例えば、得られた本発明のＥＤＣの活性を測定するのに用いるアッセイで複数のリンカー長を試験することによって決定することができる。例えば、リンカー長が短すぎる（薬物とターゲティング部分が同時にその結合部分に到達しない）場合、その問題点を容易に特定し修正して本発明のＥＤＣを得ることができる。通常、リンカー長は約５０〜約５００オングストロームまたは約５０〜約２００オングストロームの範囲内に収まる。リンカーの長さおよび組成は、酵素およびその他の環境中の物質による分解を受け得る循環構造中でＥＤＣが安定な状態を保持するよう、またターゲティング部分がその抗原と結合する場所と薬剤がその標的に作用する場所からの距離を反映するよう選択する。上に挙げた必要条件を満たす多種多様なリンカーを入手する、または合成することが可能であり、これにより、特に本発明のＥＤＣに使用し得る多種多様なリンカー、治療薬およびターゲティング部分を考慮する場合、本発明により提供される極めて大きなクラスのＥＤＣが作出される。
したがって、本発明のＥＤＣは、多種多様な安定なリンカーまたは非切断性リンカーのいずれも用いることができる。
Ｖ．治療薬（薬物）
多種多様な治療薬が本発明のＥＤＣでの使用に適している。例えば、特に限定されないが、治療薬は抗腫瘍、抗血管新生または抗炎症治療活性を有する薬剤であり得る。好ましくは、治療薬（例えば薬物）がリンカーと結合する部位は、リンカーの結合が治療薬の活性を最小限度で干渉するか、一切干渉しない位置にある。本発明のＥＤＣに使用する薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合し近接している、またはその一部となっている標的と結合するか、別の方法で相互作用する。様々な実施形態において、本発明のＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットと結合するステロイド薬を有する。
通常、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの、例えばアルファサブユニットに直接作用する「非内部移行性治療薬」である。本発明の様々な実施形態において、薬剤または薬物は強心配糖体のアグリコンである。本発明の他の実施形態では、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと、それと会合している細胞表面経路シグナル伝達タンパク質との相互作用を阻害するよう作用する。
本開示では、主としてＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合しているタンパク質を標的とするターゲティング部分と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする治療薬とを含むＥＤＣについて本発明を説明するが、本発明はほかにも、逆のタイプのＥＤＣを提供することを当業者は理解するであろう。本発明のこの実施形態では、ターゲティング部分の標的はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼであり、薬剤はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合しているタンパク質に作用する。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットに特異的な適切な抗体およびその他のターゲティング部分ならびに上記アルファサブユニットと結合する適切な治療薬が、ＰＣＴ公開第２０１１／０２１８７０号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２８５８５号に記載されている。
薬物負荷は、ＥＤＣ中のターゲティング部分（例えば、抗体）当たりの平均治療薬数を指す。各リンカーが１つの治療薬と連結する場合、平均治療薬数はターゲティング部分上の平均リンカー数と等しくなる。薬剤負荷は通常、ターゲティング部分当たり１〜８薬剤の範囲内にあり、ターゲティング部分が抗体（Ａｂ）である場合、例えば、１、２、３、４、５、６、７および８の治療薬が抗体と共有結合する。したがって、ＥＤＣの組成物は、１〜８の範囲の薬物と結合した抗体の集まりを含む。結合反応から得られるＥＤＣ製剤の抗体当たりの平均薬物数は、質量分光測定法、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気泳動およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。特定のＥＤＣ製剤中の治療薬の平均値は、ＥＬＩＳＡによって測定することができる（Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２）。しかし、ＥＬＩＳＡを主体とした方法では抗体と結合した治療薬および／またはリンカーの位置を特定することはできない。いくつかの場合には、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって、均質なＥＤＣ（治療薬数は同じであるが、抗体上での位置は異なり得る）の分離、精製および特徴付けを行い得る。
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用するＥＤＣ標的化薬剤の有利な特性としては、次のものが挙げられる：（ｉ）ターゲティング部分がＥＤ５０値を小さくし得るため、効力が増大している；（ｉｉ）薬剤がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ全般ではなく、ターゲティング部分の標的と会合したＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを選択的に標的とするため、毒性が低下している；および／または（ｉｉｉ）抗体が結合薬剤の半減期値を増大させ得ること、抗体が薬物に対するＥＦＲ（透過性・滞留性亢進（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ））効果を増大させ得ることおよび抗体が特定の薬剤のタンパク質または脂質内への隔離を防ぎ得ることにより、薬物動態が向上している。
多くの場合、治療薬には、特定の適応症に指定された活性化の標的に関係のない副作用がみられる。このような副作用は、現象学的観察される複雑な事象であり、オフターゲット結合との直接的相互作用を含めた多数の分子シナリオに起因すると考えられている［Ｋｅｉｓｅｒ，ＭＪら，Ｎａｔｕｒｅ ４６２，１７５（２００９），Ｂｌａｇｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，３５３（２００６），Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １０，１４２１（２００５）］。特定の指定されたタンパク質または環境と複合せずに、続いて他の標的または同じ標的が活性化されると、有害な副作用が発生し得る。
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬剤が複数の生理学的標的を有し得ることが複数の論文で示唆されており［（ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０，１０：１２）および（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，１８，８７２−８８５）および（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １４，２１３０−２１４８，Ｊａｎｕａｒｙ １，２００９）を参照のこと］、このことは、許容できない副作用を伴わずにこのような薬物を使用することができないことを示している。しかし、本発明の方法およびＥＤＣにおいては、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが複数のタンパク質と複合体を形成する能力ならびに生じ得る様々な相互作用およびシグナルを利用して、多種多様な薬物および治療的介入を提供する。例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと特定のタンパク質との会合は細胞および疾患のタイプによって異なり、これにより、本発明のＥＤＣが多種多様な異なる細胞および疾患を標的にすることが可能となる。
本発明のこの重要な利益の証拠としては、強心配糖体が心臓、脳およびその他の器官に対して負の効果または正の効果を有することが知られているという事実が挙げられる。現時点で、これらの効果は薬剤の局所濃度および薬剤のタイプならびにＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの細胞における位置のみならず、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが会合するまたは複合体を形成するタンパク質に依存するものであることが知られている。したがって、会合しているタンパク質を標的とすることによって、本発明のＥＤＣを選択された細胞型または罹患細胞型にのみ方向付けることができる。
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを直接標的とすることが知られている強心配糖体などの薬物に加えて、本発明以前はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ以外のタンパク質と結合するか、これに影響を及ぼすと考えられていたが、現在は本開示を考慮し、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを介して作用をもたらすことがわかっている薬物が存在する。このような例の１つが、グリブリドとしても知られる薬物グリベンクラミドであり、これは２型糖尿病の治療に用いられる。酵素的におよび電気生理学的に測定されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性が、グリブリドによって抑制されることが示されている（Ｒｉｂａｌｅｔ，Ｂ．ら，Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６ Ｆｅｂ；１０７（２）：２３１−４１）。したがって、本発明のＥＤＣの他の実施形態では、薬剤はグリブリドまたはその誘導体である。また別の例が、本開示を考慮すれば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの第一細胞外ループと結合し、リン脂質Ｎ−メチルトランスフェラーゼをアップレギュレートすると考えられる薬剤プロゲステロンである（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２００８ Ｊａｎｕａｒｙ；７３（１）：２７−４０を参照のこと）。エストロゲンとプロゲステロンはともに、脳およびその他多数の組織内のＮａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼポンプに対して有意な阻害作用も示す（ＬａＢｅｌｌａら，Ｆｅｄ Ｐｒｏｃ ４４：２８０６−２８１１）。
したがって、本発明のＥＤＣの多くの実施形態では、薬剤はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの活性を調節するステロイドであるが、他の実施形態では、薬剤は別の化合物である。ステロイドの例としては、ジギトキシゲニン、シラレニンおよび副腎皮質ステロイドが挙げられる。他のこのような化合物の例としては、特に限定されないが、プロゲステロン、アンジオスタチン、ベルベリン、グリブリド、５−ヒドロキシデカノエート、ジメチルオキサリルグリシンおよびペリリルアルコールからなる群より選択される化合物が挙げられる（Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇｓ；７（２）：１３５−４１（２００７）；Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，９：３−１０，（２００２）；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｄｅｃ；３０６（１−２）：２３１−７（２００７）； Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０７（２）：２３１−４１（１９９６）；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８，２１９−２２４（１９９８）；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｄｅｃ；３０６（１−２）：２３１−７（２００７）；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４５：２９−３４（２０１０）；Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ７３（１）：２７−４０（２００８）を参照のこと）。様々な実施形態において、薬剤はチャンネル遮断剤であり、他の実施形態では、薬剤はチャンネル遮断剤ではない。
しかし、多くの実施形態では、ＥＤＣの薬物は強心配糖体のアグリコンである。適切な強心配糖体としては、例えば、特に限定されないが、ヒトでの使用が承認されている強心配糖体、臨床試験段階の強心配糖体ならびに参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２０１０／０１７４８０号、同第２０１１／０３１８７０号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２８５８５号に記載されている強心配糖体が挙げられる。強心配糖体（およびその他の薬剤）では、実際の治療効果とオフターゲット中毒性副作用を比較するのに治療指数という用語を使用する。有望な抗ガン剤の例にはジギトキシンがあり、同薬剤は強力な抗腫瘍活性を示すが、高い心臓毒性も示す（Ｇｏｌｄｉｎ．Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ １９８４；１：１１３４を参照のこと）。したがって、同薬剤単独では、ヒトにおいて抗ガン剤としての効果が認められていない。ジギトキシン、ジゴキシンまたはプロスシラリジンおよびそれらのアグリコンなどの様々な強心配糖体剤が、本発明の様々な実施形態において有用である。このような強心配糖体は、患者に心毒性作用を示す濃度においてではあるが、数種類の異なるタイプのガンに対して細胞毒性活性を示すことが報告されている［Ｆｅｌｔｈ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．７２，１９６９（２００９）を参照のこと］。強心配糖体は、何世紀もの間、鬱血性心不全や不整脈を治療するために処方されてきたジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）属、ストロファンシス（Ｓｔｒｏｐｈａｎｔｈｕｓ）属などの植物に由来する薬物の一種である。これらの状態では、強心配糖体がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合し、そのポンプ活性を阻害する。この１０年の間に実施された研究では、強心配糖体が抗ガン薬剤として活性を有することが示されている［Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら，（２００７）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７６：３２−５７およびＰＣＴ公開第２０１０／０１７４８０号］。
したがって、本発明の様々な実施形態において、ＥＤＣの治療薬は強心配糖体のアグリコンである。本発明の１つの実施形態では、薬剤はシラレニンである。別の実施形態では、薬剤はジギトキシゲニンである。本発明の別の実施形態では、薬剤は、Ｃ−３の位置にヒドロキシル、アミンまたは硫黄基を含むステロイドである。本発明の様々な実施形態において、ステロイドは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０１７４８０号で特定される化合物またはそのアグリコンである。適切なステロイド薬の非限定的な例としては、下記式Ｉのものならびにその薬剤的に許容されるエステル、誘導体、複合体、水和物、溶媒和物、プロドラッグおよび塩または上記のいずれかの混合物が挙げられ：


式中、ステロイド環は飽和、不飽和またはそれらの組合せのいずれかであり、Ｒは

である。
Ｒはほかにも、様々な副腎皮質ステロイドにみられる側鎖、例えばＣＨＯＣＨ３、Ｏ、ＯＨまたは分岐アルカンなどであり得る。ＲａはＣＨ３であり；ＲｂはＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたはＣＨＯであり；ＲｃはＨ、ＯＨまたはＣＨ３ＣＯＯであり；ＲｄはＨ、ＯＨまたはＣＨ３ＣＯＯ；ＲｅはＨであるか、基が存在せず；ＲｆはＨ、ＯＨであるか、またはＲｅがＨであるか、Ｒｅ、ＲｆおよびＲｇと結合している原子間にＣ＝Ｃが存在する場合、Ｒｆは基が存在せず；ＲｇはＨであるか、またはＲｅがＨであるか、Ｒｅ、ＲｆおよびＲｇと結合している原子間にＣ＝Ｃが存在する場合、Ｒｇは基が存在せず；ＲｈはＨまたはＯＨであり；ＸはＯ、ＳまたはＮ（ＯＲ’、ＳＲ’、ＮＲ’）であり；かつＲ’はアルキルまたはアリール基である。
ＶＩ．ＥＤＣの構築、スクリーニングおよび具体的な実施形態
本発明は、安定な（およびいくつかの実施形態では、非切断性の）リンカーを介して治療薬と連結されたターゲティング部分を含み、効果を発揮するのに薬物とターゲティング部分の解離を必要としないＥＤＣを提供する。本発明のＥＤＣは、（ｉ）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用し（複合体を形成し）、これに近接した細胞表面のシグナル伝達経路タンパク質を標的とするターゲティング部分と、（ｉｉ）安定なリンカーまたは非切断性リンカーと、（ｉｉｉ）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするか、または相互作用が結合により阻止されるか、別の方法で調節されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼまたは相互作用タンパク質上の部位を標的とする治療薬とを含む。本発明のＥＤＣはほかにも、（ｉ）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするターゲティング部分と、（ｉｉ）安定なリンカーまたは非切断性リンカーと、（ｉｉｉ）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用し、これに近接した細胞表面のシグナル伝達経路タンパク質を標的とするか、または相互作用が結合により阻止されるか、別の方法で調節されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ上の部位を標的とする治療薬とを含むまたは結合により相互作用が阻止されるか、別の方法で調節されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする治療薬とを含むＥＤＣを含む。上に挙げたいずれの場合も、ＥＤＣは（ターゲティング部分）−（リンカー）−（治療薬）と表される。
本発明のＥＤＣは、（１）ターゲティング部分の求核基または求電子基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合により抗体−リンカー中間体を形成し、次いで活性化した薬剤と反応させること；ならびに（２）薬剤の求核基および求電子基とリンカー試薬とを反応させて共有結合により薬物−リンカー中間体を形成し、次いでターゲティング部分の求核基または求電子基と反応させることを含めた当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を用いる複数の経路のいずれかによって調製することができる。結合方法（１）および（２）を様々なターゲティング部分、薬剤およびリンカーとともに用いて、本発明のＥＤＣを調製することができる。あるいは、薬物とリンカーを薬物−リンカー薬剤の形態で合成し、次いで、これを抗体とカップリングさせて、本発明のＥＤＣを作製することができる（下の実施例１を参照のこと）。この実施形態では、複数の段階でグリコシドまたはＰＥＧスペーサーアームなどのリンカーの小成分を各段階に用いて、リンカーと薬物とを結合させることができる。
抗体およびその他のターゲティング部分上の求核基としては、特に限定されないが、例えば（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステインおよび（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することができる。特定の抗体は、還元性鎖間ジスルフィド、例えばシステインブリッジを有する。抗体は、ＤＴＴ（クレランド試薬、ジチオトレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などの還元剤での処理によってリンカー試薬との結合について反応性にすることができる（Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）。したがって、理論的には、各システインジスルフィドブリッジが２つの反応性チオール求核試薬を形成することになる。リジンと２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応を介して抗体にさらなる求核基を導入することにより、アミンをチオールに変換することができる。
このほか、抗体を修飾し、リンカー試薬または薬物上の求核性置換基と反応することができる求電子部分を導入することによって、ＥＤＣを作製することができる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤によって酸化させ、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成することができる。得られたイミンシッフ塩基基は、安定な連結を形成することができるか、あるいは、これを例えばボロヒドリド試薬によって還元させ、安定なアミン結合を形成することができる。１つの実施形態において、グリコシル化抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとを反応させることよって、薬物上の適切な基と反応するカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基がタンパク質中に生じ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２３４−２４２）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含むタンパク質がメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、最初のアミノ酸に代わってアルデヒドが生じ得る（ＧｅｏｇｈｅｇａｎおよびＳｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５，３６２，８５２号）。このようなアルデヒドを薬物部分またはリンカー求核試薬と反応させることができる。
同様に、薬物部分上の求核基としては、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、コンビナトリアル合成およびスクリーニングによって本発明のＥＤＣを構築する。非切断性リンカーまたは安定なリンカーを介して連結したターゲティング部分と薬剤のライブラリーまたは組合せを構築してスクリーニングし、本発明の特定のＥＤＣを同定する。１つの実施形態において、単一の非内部移行性薬剤とターゲティング部分のライブラリーとを連結させ、特定の治療効果についてスクリーニングし、本発明のＥＤＣを同定する。１つの実施形態において、単一の非内部移行性ターゲティング部分と薬剤のライブラリーとを連結させ、特定の治療効果についてスクリーニングし、本発明のＥＤＣを同定する。１つの実施形態において、非内部移行性薬剤のライブラリーとターゲティング部分のライブラリーとを連結させ、特定の治療効果についてスクリーニングし、本発明のＥＤＣを同定する。
本明細書に記載のものに加えて、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用する近接標的を、本発明の１つの態様にしたがって多数の方法により同定することができる。１つのこのような方法では、抗体のライブラリーをＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合する薬物と結合させ、様々な活性、例えば細胞毒性、細胞増殖または所望のホルモンなどのタンパク質もしくは小分子の発現もしくは分泌などについてスクリーニングする。従来の酵母ツーハイブリッド法は、膜タンパク質間の相互作用を検出するのには適さないため、本発明の別の方法では、内在性膜タンパク質とそのパートナー（複数可）との間の相互作用の検出が可能な分割ユビキチン膜酵母ツーハイブリッド法を用いる（Ｏｈｎｏら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１ ３００：Ｃ１０４７−Ｃ１０５４）。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成する近接タンパク質はこのほか、本発明に従い、架橋実験によって、モデル系でその相互作用を試験することによって、またはモデル細胞において一方のタンパク質を除去し、その結果を分析する試験を行うことによって同定することができる。特異的抗体が入手可能な場合、標的タンパク質とその非共有結合タンパク質パートナーとの免疫沈降、例えば免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）が、標的タンパク質周辺の相互作用する可能性のあるタンパク質を同定するためによく用いられてきた技術である。Ｃｏ−ＩＰ法により、酵母、哺乳動物および他の多くの生物体で大規模なタンパク質相互作用データが得られており、これらの結果の多くを直交法で検証することによって、この方法の有用性が確認されている。化学的架橋を免疫沈降と組み合わせれば、盛んに再検討されてきたタンパク質−タンパク質相互作用のインビボ同定の別の戦略となる。架橋反応は、無傷細胞を用いて実施し、はるかに厳しいまたはストリンジェントな条件下でのちの精製段階の実施を可能にする安定な共有結合によりタンパク質−タンパク質相互作用を化学的に「凍結」させることができる。その結果、非特異的結合を大幅に減じることができる。さらに、架橋と組み合わせた免疫沈降は、膜タンパク質の相互作用を研究するのに極めて適したものである。膜タンパク質の分離と精製には通常、膜タンパク質間の相互作用を破壊することのある界面活性剤を使用する必要がある。したがって、膜タンパク質の免疫沈降の前に複合体を架橋剤で安定化させると、抗原と結合したタンパク質を同定できる可能性が大幅に増大する。
当業者には、会合した標的または複合体の標的を化学的に架橋する方法が公知である。例えば、試料を架橋試薬とインキュベートすることによって、タンパク質同士の接触を明らかにすることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣのいずれかによって、複合体を検出し分離することができる。標的が分離されれば、それを消化し、質量分光測定法により分析してフラグメントの分子質量を決定し、データベースに入力するか、Ｘ！Ｌｉｎｋ（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００７ Ｏｃｔ；６（１０）：３９０８−１７を参照のこと）などのコンピュータアルゴリズムによって、近接標的を形成する実際のタンパク質を明らかにすることができる。このほか、疎水性を増大させ免疫沈降と組み合わせ化学架橋剤を用いることが、細胞膜内のタンパク質−タンパク質相互作用をマッピングする実用的な戦略となる（Ｔａｎｇら，Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．，２０１０，６，９３９−９４７）。両タンパク質に対する蛍光色素のペアで標識した抗体を用いて、近接していることを確認することができる。標的と近接した薬物とターゲティング部分を見つけるこのタイプのプロセスは、同じタンパク質上に存在する標的について上に述べた通りのものになろう。
安定なリンカーおよび／または非切断性リンカーを介して薬物とターゲティング部分を互いに結合させることによって、本発明のＥＤＣを調製する。一般的に言えば、リンカーは長さが５０オングストローム以下、より一般的には長さが１００オングストロームであるが、５００オングストロームの長さであってもよい。次いで、すべて共有結合により互いに結合した薬物とリンカーとターゲティング部分とからなるＥＤＣを、当業者に公知の標準的なアフィニティー法、サイズ排除法、ろ過またはその他の方法を用いて、未結合の薬物、リンカーおよびターゲティング部分から分離精製する。
特定のＥＤＣが構築されれば、当業者に公知の様々な方法のいずれかを用いて、それをスクリーニングすることができる。薬物とターゲティング部分の標的が異なるタンパク質上にみられる場合、両標的が単に特定の細胞型上で近接しているだけである可能性があるため、複数のスクリーニングを実施して、特異性およびその近接した標的を有する細胞型を決定する。このようなスクリーニングとしては、特に限定されないが、当該技術分野で公知の様々なインビトロおよびインビボの方法が挙げられる。培地またはハイスループットスクリーニングフォーマットで連続して個別にまたは並行してＥＤＣをスクリーニングすることができる。疾患または障害の予防また治療処置への有用性についてＥＤＣをスクリーニングし得る速度は、合成速度またはデータの検出／測定／分析を含めたスクリーニング方法論によってのみ制限される。
一般的には、最初にインビトロスクリーニングを実施する。例えば、細胞培養液中で被験細胞、例えば、腫瘍関連抗原または受容体タンパク質を有する哺乳動物細胞をＥＤＣの抗体に曝露し、その細胞を約６時間〜約５日の期間培養し、細胞生存率（またはその他の特性）を測定することによって、最初にＥＤＣの細胞毒性または細胞増殖抑制活性を測定する。細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、ＥＤＣについて生存率、例えば、増殖（ＩＣ５０）、細胞毒性（ＥＣ５０）およびアポトーシス誘導（カスパーゼ活性化）を測定する。
インビボ試験について、腫瘍関連抗原および細胞表面受容体、例えばＨＥＲ２（米国特許第６，６３２，９７９号）の過剰発現を含めた疾患または障害の予防または治療処置として有望な抗体−薬物複合体（ＥＤＣ）のスクリーニングには、トランスジェニック動物および細胞系が特に有用である。有用なＥＤＣのスクリーニングには、候補となるＥＤＣを様々な用量でトランスジェニック動物に投与し、評価対象の疾患または障害に対するＥＤＣの効果を様々な時点でアッセイすることが含まれ得る。上記のものに代えてまたは加えて、該当する場合、疾患の誘導因子に曝露する前に、または曝露と同時に薬物を投与することができる。
本発明のＥＤＣは様々な実施形態で提供される。上で述べた通り、ＥＤＣのターゲティング部分の標的は通常、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するタンパク質であり、薬剤の標的はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼである。ターゲティング部分および治療薬は、２つが連結されている場合、目的とする状態の治療において、単独でまたは組み合わせて（２つの別個の連結されていない薬剤として）使用されるターゲティング部分または薬物よりも高い効果を示すという点で相乗的に作用する。したがって、本発明のＥＤＣのターゲティング部分の標的および薬剤の標的はともに細胞外にある。本発明のＥＤＣは、安定なリンカーまたは非切断性リンカーを介して薬剤と連結された非内部移行性ターゲティング部分を含む。したがって、本発明のＥＤＣは、治療効果を発揮するのに内部移行を必要としない。ターゲティング部分および薬剤がともに（複合体を形成している場合）リンカー切断を必要とせずにその標的に結合し作用できるよう、本発明のＥＤＣのリンカーを選択する。したがって、ＥＤＣのターゲティング部分と治療薬は同時に結合し、所望の治療効果を生じる。したがって、ＥＤＣのリンカーは、ターゲティング部分と薬剤のそれぞれの標的が一緒に複合体を形成している場合に両者が同時に結合できる長さである。安定なリンカーまたは非切断性リンカーによって連結されたＥＤＣのターゲティング部分と治療薬は、異なる標的に作用する。
様々な実施形態において、標的抗原は腫瘍細胞、間質細胞、腫瘍の内皮細胞、マクロファージ、好中球および単球などの細胞上に存在するものであるか、ガン、炎症性反応、糖尿病または疼痛に関連する抗原である。本発明のＥＤＣは、患者に投与され、血流によって運ばれ、標的細胞または抗原付近に来ると、ターゲティング部分を介して標的抗原と結合し、同時にまたは同期間に薬物の標的と結合し、所望の治療効果を生じる。様々な実施形態において、本発明のＥＤＣは、転移性の罹患細胞に関連し、そのような罹患細胞のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成している標的を認識する、ターゲティング部分を含む。
本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合しその正常な機能を妨害する薬剤と、安定なリンカーまたは非切断性リンカーと、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼイオン輸送体複合体と複合体を形成するタンパク質を認識するターゲティング部分とを含むＥＤＣを提供する。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼは、そのアルファ−、ベータ−およびガンマ−サブユニットの複数のイソ型の発現および差次的会合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）から生じる複雑な分子不均一性を特徴とする（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５（Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４）：Ｆ６３３−Ｆ６５０，１９９８中の総説を参照のこと）。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼは、細胞膜を通過する様々なカチオンの能動輸送に関与するＰ型ＡＴＰアーゼの広く分布するクラスに属する。現時点で、４つもの異なるアルファ−イソ型、３つの異なるベータ−イソ型および９つの異なるガンマ−イソ型が哺乳類細胞で同定されている。複合体のイソ型の構造が進化の過程で受けた厳しい制約とその発現の組織特異的な発生パターンは、異なるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体が細胞要件に応じるために異なる特性を進化させてきたことを示唆するものである。アルファ−サブユニットの異なるイソ型は、異なる細胞型において異なるレベルで発現され、異なる挙動を示す。アルファ−サブユニットには、カチオン、ＡＴＰ、Ｓｒｃキナーゼおよび様々な治療薬の結合部位が含まれている。一部の薬剤は、強心配糖体クラスの分子に由来するものである。したがって、本発明の様々な実施形態において、アルファ−サブユニットが本発明のＥＤＣの薬剤の標的としての役割を果たし、薬剤は強心配糖体または強心配糖体のアグリコンである。
特に、強心配糖体クラスの分子は、その抗不整脈効果のため、主に心不全の治療において治療的に用いられてきた。近年、このクラスの薬物には抗ガン活性もみられることが明らかにされたが、必要なレベルでは心臓毒性があるため、抗ガン薬としての使用は未だ承認されていない。したがって、このクラスの分子を心臓からガン細胞へ標的化することが有益である。したがって、本発明の１つの実施形態において、強心配糖体誘導体または強心配糖体のアグリコンが本発明のＥＤＣの薬物となる。１つの実施形態において、このようなＥＤＣは、強心配糖体クラスの小分子のメンバー（またはそのアグリコン部分）である薬物を含む。本発明の様々な実施形態において、強心配糖体または関連する薬剤を、安定なリンカーを介して、薬物をガン組織に対して標的化する抗体に結合させて、ガン治療に治療的に有用な本発明のＥＤＣを得る。
本発明の１つの実施形態において、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはその対応するアグリコンのシラレニンを、リンカーを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するタンパク質と結合する抗体に結合させる。１つの実施形態において、シラレニンアグリコンを、ＰＥＧスペーサーアームを有するグリコシドリンカーを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成する細胞表面シグナル伝達経路タンパク質と結合する抗体に結合させる。本発明の別の実施形態では、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはシラレニンを、リンカーを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接したタンパク質と結合する抗体に結合させる。本発明の別の実施形態では、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはシラレニンを、ＰＥＧリンカーまたはスペーサーアームを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するタンパク質と結合する抗体に結合させる。本発明の別の実施形態では、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはシラレニンを、ＰＥＧリンカーまたはスペーサーアームを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接したタンパク質と結合する抗体に結合させる。本発明の別の実施形態では、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはシラレニンを、ＰＥＧ２４リンカーまたはスペーサーアームを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するタンパク質と結合する抗体に結合させる。本発明の別の実施形態では、強心配糖体ＣＥＮ−０９−１０６またはシラレニンを、ＰＥＧ２４リンカーまたはスペーサーアームを介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接したタンパク質と結合する抗体に結合させる。
本発明はほかにも、抗炎症剤として、または他の疾患を治療するために用いることができる強心配糖体と連結されたターゲティング部分を含むＥＤＣを提供する。嚢胞性線維症患者の肺におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼサブユニットイソ型／モジュレータの分布およびレベルは、正常な肺のものとは異なるため、嚢胞性線維症過剰炎症に対する治療薬の標的となる。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合する強心配糖体は、ＮＦ−カッパＢ阻害剤の特異的リン酸化阻害により、培養ＣＦ上皮細胞からのＩＬ−８の過剰分泌を抑制することができる（参照により本明細書中に組み込まれるＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００４，１０１，７６９３−７６９８を参照のこと）。強心配糖体の治療的使用の可能性に関する総説では、肥満、腎疾患、偏頭痛、てんかん、ジストニア、パーキンソン症候群について検討されている（２００７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２６１；４４−５２）。したがって、上記すべての状態の治療に本発明のＥＤＣを使用することができる。
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用して細胞シグナル伝達経路を調節し得る本発明のＥＤＣのターゲティング部分の標的の例としては、以下のものが挙げられる：ＣＤ１４７、ＬＡＴ１、ＡＳＣＴ２、ＣＤ９８、ＰｒＰ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＴ１、インテグリン（例えば、ＣＤ２９（インテグリンベータ１））、ＣＤ１６６、ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）、ＣＤ７１、ＣＤ５６、ＣＤ８７、（ＴｆＲ１）、Ｓｅｌ−１、ＩＧＦＲ、ｃ−ＭＥＴ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＧｌｕＲ２、セロトニン輸送体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ＧＡＢＡＡ受容体、ＥＡＡＴ、ＴＬＲ４、Ｔ細胞受容体、ｍＴＮＦアルファ（膜貫通型）、ＰＬＡ２、ＲＡＮＫＬ、インスリン受容体、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシンＩＩ受容体、ＡＴＰ感受性Ｋチャンネル、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシン受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩｎｓＰ３Ｒ、ＲＳ１またはα−ｋｌｏｔｈｏ。さらに、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用し、特定の病的状態に関連する細胞シグナル伝達経路を調節し得る本発明のＥＤＣのターゲティング部分の標的の例としては、以下のものが挙げられる：ガン―ＣＤ１４７、ＬＡＴ１、ＡＳＣＴ２、ＣＤ９８、ＰＲＰ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＴ１、インテグリン（例えば、ＣＤ２９（インテグリンベータ１））、ＣＤ１６６、ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）、ＣＤ７１、ＣＤ５６、ＣＤ８７、（ＴｆＲ１）、Ｓｅｌ−１、ＩＧＦＲ、ｃ−ＭＥＴ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ；神経障害―ＣＤ１４７、ＰｒＰ、ＭＣＴ１、ＧｌｕＲ２、セロトニン輸送体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ＧＡＢＡＡ受容体、ＥＡＡＴ；炎症性障害（例えば、下痢、ヒト炎症性腸疾患、関節リウマチ）―ＴＬＲ４、Ｔ細胞受容体、ｍＴＮＦアルファ（膜貫通型）、ＰＬＡ２、ＲＡＮＫＬ；糖尿病／肥満症―インスリン受容体、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシンＩＩ受容体、ＡＴＰ感受性Ｋチャンネル；心血管疾患―インテグリン、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシン受容体；免疫抑制／免疫仲介性疾患／炎症―ＴＬＲ４、Ｔ細胞受容体、ＰＬＡ２、ＴＮＦ−アルファ、ＩｎｓＰ３Ｒ；虚血傷害―インテグリン、黄斑変性症：ＲＳ１；加齢／タンパク質欠損―α−ｋｌｏｔｈｏ；乾癬―ＣＤ１４７。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４：１０６１−１０７１，２００５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ ２０１０ ｖｏｌ．７ ｎｏ．３ １５７−１６９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１０，１０，２８７−３０６、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０８（１）：２３−３８，２００６、Ｊ ＢＩＯ ＣＨＥＭ ２８２（４５）：３２７９２−３２８０１，２００７、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ８７：５９３−６５８，２００７、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｍａｒ １５；２０（６）：１１３２−４２、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｄｅｃ；３（１２）：ｅ４２３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ７，２００７，２７（４５）：１２３３１−１２３４０、ＳｈａｋｉｂａｅｉおよびＭｏｂａｓｈｅｒｉ（２００３）Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ １８，３４３−３５１、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １７：１５０３−１５２０，２００６．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００ Ｄｅｃ ５；３９（４８）：１４８７７−８３．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７８，１１１９−１１２７（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ（１）２０１０）、Ｇｅｒｉａｔｒ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ｉｎｔ ２０１０；１０（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ８０−Ｓ８７、Ｃｌｉｎｉｃ Ｒｅｖ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｍｅｔａｂ（２００８）６：３１−３６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．３７，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １０，ｐｐ．２６２８７−２６２９５，１９９９、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８５ Ａｐｒ；２３８（１）：３１５−２４．、ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０，１０：１２、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８ Ｓｅｐ；２５５（３ Ｐｔ １）：Ｅ３４７−５２．、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｍａｙ １９８８ ２４５：６６４−６７２、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｓｅｐ；２９（９）：１３４９−５５．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ １１．、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９０：Ｆ２４１−Ｆ２５０，２００６、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ａｐｒ ２２；３６２（１６）：１４７７−９０、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．ＪＰＥＴ ２８５：８３５−８４３，１９９８、Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６ Ｆｅｂ；１０７（２）：２３１−４１．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２２：Ａ１６９６３、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９（２００８）６２−７０、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１）２０（１）：９０−１０３、Ｃｈｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０ １１１：１２５２−１２５９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｊｕｎｅ ２４，２００９，２９（２５）：８１４３−８１５５、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３７，ｉｓｓｕｅ １２，ｐａｇｅｓ １０５３−１０５６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０を参照のこと。本発明のＥＤＣのターゲティング部分の標的は、細胞外標的がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接している場合またはＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの複合体中に存在する場合を含め、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用する細胞外標的であり得る。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと上記標的の例を含めた細胞外標的との相互作用（例えば、近接しているか、複合体を形成している）を検出する方法および試薬が提供される。一般にこれらの方法では、抗体が細胞外標的、例えば目的とする細胞表面シグナル伝達経路に関与する標的などを標的とし、薬物がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とし、この２つが安定なリンカーまたは非切断性リンカーによって連結されている抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を用いる。次いで、このＡＤＣを適切な対照（抗体および薬物）とともにインビトロおよび／またはインビボで試験し、ＡＤＣが、目的とする１つ以上の細胞型に対して抗体または薬物のいずれか単独よりも強力かつ／または特異的な効果、例えば細胞毒性または細胞成長、増殖もしくは分化の阻害などを発揮するかどうかを判定する。ＡＤＣが抗体または薬物のいずれか単独よりも強力なまたは特異的な効果を発揮すると判定されれば、抗体が標的とする細胞外標的（例えば、細胞表面タンパク質）は、そのような目的とする細胞型（複数可）のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用するものと判定される。
したがって、薬物がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする本発明のＥＤＣのターゲティング部分の標的が多数存在する。本発明のＥＤＣは、例えば、特に限定されないが、一般に強心配糖体の場合のように、薬物が効果的ではあるが、その薬物の特異性にオフターゲット副作用、低活性、薬物動態不良、薬物耐性（例えば、ＭＤＲに仲介される薬物耐性）またはその他の問題点が存在する場合およびリンカーを介した薬物とターゲティング部分との結合が治療効果の改善を示す場合に有用である。本発明のＥＤＣは、薬剤とターゲティング部分が相乗的に作用して、所望の治療効果を増大させるものを含む。このほか本発明のＥＤＣは、例えば、特に限定されないが、同じく強心配糖体の場合のように、薬剤の特異性を高めるのが望ましい場合に有用である。これは、薬剤の標的が、多くの異なるタイプの正常細胞および罹患細胞上に、罹患細胞または目的とする細胞上でターゲティング部分の標的との複合体としてのみ、またはターゲティング部分の標的に近接してのみ存在し得る場合である。
本発明のＥＤＣはほかにも、罹患組織または標的組織領域の中または付近の細胞に選択的にみられる標的抗原の一部分またはサブユニットまたはイソ型を認識するターゲティング部分を含むものを含む。このような標的抗原は、罹患組織または標的組織領域内の突然変異した、異なる形で発現される、または異常なグリコシル化を受けたタンパク質（正常組織の同じタンパク質と比較して）であるものを含む。
様々な実施形態において、ＥＤＣは一般に研究目的に有用である。本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが多種多様な異なるタンパク質と会合して、多種多様な細胞に極めて重要な細胞シグナル伝達経路調節することから、数多くの疾患に関与するという発見によるものである。本開示は、このようなＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ／タンパク質相互作用の例を多数例示するものであるが、これより多くのものが確実に存在する。強心配糖体を目的とする抗体と連結するのに好都合な試薬および強心配糖体と既に連結されているＥＤＣは、例えば、本発明によって提供され、このような研究に使用することができる有用な試薬である。
本発明のＥＤＣはほかにも、タンパク質が細胞表面のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成するかどうかを決定するための方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞を本発明のＥＤＣと接触させて、ＥＤＣが細胞に対して、細胞をターゲティング部分または治療薬と接触させたときの効果とは異なる効果（例えば、細胞の生存率または増殖の低下）を示すかどうかを判定することを含み得る。ＥＤＣが細胞に対して、細胞をターゲティング部分または治療薬と接触させたときの効果とは異なる効果を示す場合、そのタンパク質はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成すると見なすことができる。
本発明の様々な実施形態では、ＥＤＣは一般にガン、嚢胞性線維症およびその他の多くの疾患の治療に有用である。ガン治療の対象となる疾患の例としては、乳ガン、結腸直腸ガン、肝臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、脳ガンおよび膵臓ガンが挙げられる。特に、次に挙げる腫瘍の１つの治療がもたらされ得る：Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めたリンパ腫、黒色腫、眼内黒色腫、皮膚黒色腫、結腸腺ガン、肝細胞ガン、腎細胞ガン、卵巣ガン腫、前立腺腺ガン、肝臓ガン、移行細胞ガン、膵臓腺ガン、肺ガン、乳ガンおよび結腸ガン。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ１４７と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬をからなるＥＤＣを提供する。実施例２では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、特に限定されないが小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、結腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、頭頸部ガン、黒色腫および骨髄腫を含めたガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ４４と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬とからなるＥＤＣを提供する。実施例３では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、特に限定されないが非小細胞肺ガンおよび膵臓ガンを含めたガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ９８と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬とからなるＥＤＣを提供する。実施例４では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、特に限定されないが非小細胞肺ガン、膵臓ガン、頭頸部ガン、小細胞肺ガンおよび骨髄腫を含めたガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ８７と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬とからなるＥＤＣを提供する。実施例５では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、特に限定されないが黒色腫を含めたガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ２３０と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬とからなるＥＤＣを提供する。実施例６では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、プリオン病、アルツハイマー病ならびに特に限定されないが、非小細胞肺ガンおよび黒色腫を含めたガンの治療に有用である。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＤ５６と結合する抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのアルファ−サブユニットと結合するステロイド薬とからなるＥＤＣを提供する。実施例７では、このようなＥＤＣを例示する。このＥＤＣは、特に限定されないが小細胞肺ガンを含めたガンの治療に有用である。
様々な実施形態において、本発明は、ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的との結合方法を提供し、この方法は標的を発現する細胞と、本明細書に開示されるＥＤＣとを接触させることを含む。
様々な実施形態において、本発明は、ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的との結合方法を提供し、この方法は、標的と結合させる効果のある量の本明細書に開示されるＥＤＣを対象に投与することを含む。
セクションＶＩＩＩでは、本発明の医薬製剤ならびにこれを投与して疾患およびその他の医学的状態を治療する方法について記載する。
ＶＩＩ．医薬製剤
本発明による化合物または製剤（例えば、本開示のＥＤＣを含む化合物または製剤）の投与は、治療薬について承認され、当該技術分野で一般に知られている任意の投与方法によって実施することができる。このようなプロセスとしては、特に限定されないが、例えば、非経口、経口、経鼻による全身投与または局所投与が挙げられる。非経口投与は一般に、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射によるか、潅流によって実施する。一般に、抗体ベースの治療薬は通常、静脈内に投与する。注射可能な組成物は、懸濁液もしくは液体溶液または液体中に即座に溶解させるのに適した固体形態のいずれかの標準的な形態で調製することができる。１つの実施形態において、非経口投与は、一定の投与レベルの維持を確保する徐放または持続放出系の装置を使用するものである。鼻腔内投与には、当業者に周知の適切な鼻腔内ビヒクルを使用することができる。経口投与は、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤（遅延放出性または持続放出性の製剤を含む）、丸剤、粉末剤、顆粒剤、エリキシル剤、着色剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤を用いて実施することができる。この形態での提供は、より具体的には腸管バリアの通過に適している。
本発明による化合物または製剤を投与する用量は、対象の種類、系統、年齢、体重、性別および医学的状態；治療される状態の重症度；投与方法；対象の腎機能および肝機能の状態ならびに使用する具体的な化合物または塩の性質を含めた様々な因子に応じて選択され、既知の試験プロトコルを用いて、あるいはインビボもしくはインビトロ試験または診断データから推定することによって、実験的に決定され得るものである。さらに、任意の特定の個体について、個体の必要性および製剤の投与を実施または管理する者による専門的な判断に従って、具体的な投与レジメンを経時的に調整するべきであることが理解される。例えば、通常の経験豊富な医師が、治療される医学的状態の進行を予防、妨害または停止させるための所望の化合物の有効量を容易に決定し処方するであろう。例として、非経口的に投与する場合、本発明による化合物の有効レベルは、体重１ｋｇ当たり約０．００２〜約５００ｍｇ、より具体的には体重１ｋｇ当たり約０．０２ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲で、毎日、毎週または隔週投与されるであろう。
本発明による化合物または製剤を１日１回の用量の形態で投与することも、総１日量を１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の用量（例えば、分割用量）で投与することもできる。このような用量を（例えば、患者に約２〜約２０用量、例えば約６用量の組成物または製剤が投与されるように）間欠的に、例えば、毎週または３週間毎に投与し得る。高用量の初回負荷量、次いで低用量を１つ以上投与し得る。例示的な投与レジメンは、初回負荷量、次いで毎週の維持量を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも有効であり得る。より具体的には、用量は、いくつかの実施形態において、１〜２０ｍｇｓ／平方メートル（ｍｇｓ／ｍ２）体表面積（ｂｓａ）の範囲内で類似したものとなり、この用量を毎週または２週間毎に投与することができる。固形腫瘍では、用量は、いくつかの実施形態ではこれより高く、例えば、初回量が２００〜６００ｍｇｓ／ｍ２ｂｓａまたは約１〜２０ｍｇｓ／ｋｇ（例えば、１２０分間の静脈内注入による投与を仮定して）および１５０〜３５０ｍｇｓ／ｍ２または１〜１０ｍｇｓ／ｋｇ（６０分間の静脈内注入による投与を仮定して）の範囲内にある。したがって、本発明による化合物の投与範囲は、１ｍｇｓ／ｍ２〜５００ｍｇｓ／ｍ２ｂｓａの毎日〜毎週の用量であり得る。
本発明による組成物または製剤は滅菌することができ、かつ／あるいは非毒性アジュバントおよび補助物質、例えば保存、安定化、湿潤または乳化のための薬剤、溶解を促進する薬剤ならびに浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤などを１つ以上含有し得る。さらに、これらは治療上の利点を提供する他の物質も含有し得る。組成物はそれぞれ、当業者に周知の混合、造粒またはコーティングの標準的プロセスによって調製される。
本明細書に記載の本発明の化合物または製剤は、同時に、逐次的に、第二の薬物と交互に、または他の治療法が無効である場合に投与することができる。したがって、第二の薬物の併用投与には、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与およびいずれかの順序での連続投与が含まれ、この場合、好ましくは両方の（または全ての）治療法がその生物学的活性を同時に発揮する時間がある。複数の第二の薬物を本発明の化合物と組み合わせて使用することができる。
本発明の別の実施形態において、前述の障害の治療に有用な物質を含む製品が提供される。１つの態様において、製品は、（ａ）本明細書に記載の化合物または製剤を含む容器（好ましくは、容器は、ＥＤＣと薬剤的に許容される担体または希釈剤とを容器内に含む）と、（ｂ）患者の障害を治療する指示を記載した添付文書とを含む。
このほか、本発明のＥＤＣの活性を評価する方法が本明細書に提供される。１つの方法では、ターゲティング部分を用いて、本発明のターゲティング部分の標的を認識することができるが、それは本明細書に開示されるもののうちの１つであることが最も好ましい。このような方法の１つが、腫瘍（肺ガンなど、ただし、あらゆる腫瘍タイプを含む）由来の患者組織をＥＤＣのターゲティング部分にのみ曝し、当該技術分野で公知の免疫組織学的方法によって結合を分析すること含む、本発明の抗体の標的の存在を評価する方法である。腫瘍組織内での本発明のＥＤＣの活性を評価する１つの方法が、腫瘍由来の患者組織を蛍光共鳴移動に供し、薬剤の標的とターゲティング部分の標的が近接しているかどうかを判定することを含むものである。この方法では、ターゲティング部分を１つのフルオロフォアで標識し、別のフルオロフォアで標識した薬剤標的に特異的な抗体（または類似物）が特異的な波長のエネルギーを吸収し、異なる（ただし、同様に特異的である）波長のエネルギーを再放出し得る。腫瘍組織内でのＥＤＣの活性を評価するまた別の方法は、ＥＤＣで処置した腫瘍（肺ガンなど、ただし、あらゆる腫瘍タイプを含む）由来の患者組織ＦＤＧ−ＰＥＴイメージングに供し、次いで、ターゲティング部分が単独でＦＤＧの組織内取込みを阻害するかどうかを判定することを含むものである。本発明のＥＤＣによるこの方法では、ＦＤＧ取込みの阻害と腫瘍増殖の遅延との間に相関がみられる。イメージングおよびＦＤＧ取込み阻害の判定を実施する方法は、当該技術分野で公知である。
本発明の治療用ＥＤＣは、治療される状態に適した任意の経路によって投与することができる。ＥＤＣは通常、非経口的に、例えば、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、ボーラス、腫瘍内注射または硬膜外投与する（Ｓｈｉｒｅら（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９３（６）：１３９０−１４０２）。ＥＤＣの医薬製剤は通常、薬剤的に許容される非経口ビヒクルを用いて単位用量の注射可能な形態で非経口投与用に調製される。所望の純度を有するＥＤＣを任意選択で、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬剤的に許容される希釈剤、担体、賦形剤または安定剤と混合する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）。
許容される非経口ビヒクル、希釈剤、担体、賦形剤および安定剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど；単糖類、二糖類およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含めたその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。例えば、国際公開第９７／０４８０１号（参照により本明細書中に明らかに組み込まれる）に凍結乾燥抗ＥｒｂＢ２抗体製剤が記載されている。ＥＤＣの例示的製剤は、トレハロース（２−（ヒドロキシメチル）−６−［３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラン−２−イル］オキシ−テトラヒドロピラン−３，４，５−トリオール；Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１；ＣＡＳ番号９９−２０−７）約１００ｍｇ／ｍｌおよび約０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）２０（ポリソルベート２０；ドデカン酸２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロフラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチルエステル；Ｃ２６Ｈ５０Ｏ１０；ＣＡＳ番号９００５−６４−５）を約ｐＨ６で含有する。
治療用ＥＤＣの医薬製剤は、ＥＤＣ作製プロセスでの不完全な精製および過剰な試薬、不純物および副生成物の不完全な分離またはバルクＥＤＣもしくは製剤化したＥＤＣ組成物を保存する際の時間／温度、加水分解もしくは分解の結果として、ある量の未反応薬物部分（Ｄ）、抗体（またはその他のターゲティング部分）−リンカー中間体（Ａｂ−Ｌ）および／または薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）を含有し得る。例えば、治療用ＥＤＣの医薬製剤は、検出可能な量の薬物−リンカーまたは様々な中間体を含有し得る。上記のものに代えてまたは加えて、治療用ＥＤＣの医薬製剤は、検出可能な量の連結していない遊離ターゲティング部分を含有し得る。インビトロ細胞増殖アッセイによって、薬物−リンカー複合体の殺細胞力が遊離型薬物に劣る場合があることが明らかなったことから、例示的製剤が薬剤リンカーの薬剤を最大１０％モル当量含有する可能性がある。
このほか、活性な医薬成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中に封入することができる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の好適な例としては、ＥＤＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態であるマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
インビボ投与のために使用する製剤は無菌でなければならず、これは無菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成される。
製剤には上記投与経路に適したものが含まれる。製剤は、単位投与形態で都合よく提供することができ、調剤分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。技術および製剤全般については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に記載されている。このような方法は、活性成分を１つ以上の副成分を構成する担体と結合させる段階を含む。一般に製剤は、活性成分を液体担体または微粉末固体担体またはその両方と均一かつ密に結合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製される。
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物として活性物質（ＥＤＣ）を含む。このような賦形剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁化剤ならびに天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散または湿潤剤が挙げられる。水性懸濁剤はこのほか、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸エチルまたはｎ−プロピルなどの１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の矯味矯臭剤およびスクロースまたはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含み得る。
ＥＤＣの医薬組成物は、無菌注射用水性または油性懸濁液などの無菌注射用製剤の形態であってよい。この懸濁液は、公知技術にしたがって、前述の適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。無菌注射用製剤このほか、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いた無菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタン−ジオール溶液などであってよく、また凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用し得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、従来通りに無菌固定油を溶媒または懸濁媒として用いることができる。この目的には、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を同様に注射製剤に使用してもよい。
単一投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式によって異なるものとなる。例えば、適切な体積の注入が約３０ｍＬ／ｈｒの速度で起こり得るよう、静注を目的とした水溶液が、溶液１ミリリットルあたり約３〜５００μｇの活性成分を含み得る。皮下（ボーラス）投与を、約１．５ｍｌ以下の総体積および１ｍｌあたり約１００ｍｇのＥＤＣの濃度で実施することができる。頻回および長期投与を必要とするＥＤＣには、予め充填されたシリンジまたは自動注射装置技術などによる皮下経路を用いることができる。
一般的に提案されるものとしては、投与１回当たりに投与されるＥＤＣの薬剤的に有効な初回量は約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、すなわち、約０．１〜２０ｍｇ／（ｋｇ患者体重・日）の範囲であり、使用される化合物の典型的な初回範囲は０．３〜１５ｍｇ／（ｋｇ・日）である。例えば、ヒト患者には、最初に患者の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇのＥＤＣを投与し得る。用量を最大耐性量（ＭＴＤ）まで増大させ得る。投薬スケジュールは約３週毎であり得るが、診断された状態または応答によっては、スケジュールがこれより高頻繁または低頻繁になり得る。用量は、約４周期以上などの複数周期で安全に投与することができるＭＴＤ以下となるよう、治療の過程でさらに調整することができる。
非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。
タンパク質治療薬の経口投与は一般に、消化管での吸収、加水分解または変性の制約によりバイオアベイラビリティが低いことから不利ではあるが、経口投与に適したＥＤＣの製剤を、それぞれが所定量のＥＤＣを含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として調製してもよい。
製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアル中に包装することができ、また使用直前に注射用の無菌液体担体、例えば水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席注射溶液および懸濁液は、すでに記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。例示的単位投与製剤は、活性成分の１日用量、単位１日分割用量またはその適切な一部分を含む。
本発明は、少なくとも１つの上記活性成分を獣医学的担体と一緒に含む獣医学的組成物をさらに提供する。獣医学担体は、組成物を投与する目的に有用な物質であり、それ以外では不活性なまたは獣医学分野で許容される固体、液体または気体物質であり得、活性成分と適合性がある。このような獣医学的組成物を非経口的に、経口的にまたは任意の他の所望の経路によって投与することができる。
本発明のＥＤＣをヒトまたは動物対象のガンおよび自己免疫状態などの様々な疾患または障害の治療に使用し得ることが考慮される。１つの実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は非ヒト動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、鳥など）である。状態また障害の例としては、良性または悪性腫瘍；白血病およびリンパ性悪性疾患；その他の障害、例えばニューロン、グリア、星状細胞、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔、炎症、血管新生および免疫の障害などが挙げられる。
動物モデルおよび細胞ベースのアッセイで同定されたＥＤＣ化合物を、腫瘍を有する高等霊長類およびヒト臨床試験でさらに試験することができる。ヒト臨床試験は、有効性を試験する臨床試験とほぼ同じようにデザインすることができる。既知の化学療法薬および／または細胞毒性薬を含む放射線療法および／または化学療法などの既知の治療レジメンと併用したＥＤＣの有効性を評価するべく、臨床試験をデザインし得る（Ｐｅｇｒａｍら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２２４１−２２５１）。１つの実施形態において、併用治療薬は、ベバシズマブ；カルボプラチン；シスプラチン；シクロホスファミド；ドセタキセル注射；ドキソルビシン；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビンＨＣＬ）；Ｈｙｃａｍｔｉｎ（塩酸トポテカン）；イホスファミド；Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）；イリノテカン注射；メトトレキセート注射；マイトマイシン；パクリタキセル；Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ、ＱＬＴ社；プレメトレキセド（Ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）；プロカルバジン；ストレプトゾシン；Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）；ビンブラシン（Ｖｉｎｂｌａｓｉｎｅ）；ビンクリスチン；および酒石酸ビノレルビンから選択される。
本明細書で治療されるガンの例としては、特に限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられる。このようなガンのさらに具体的な例としては、扁平細胞ガン（例えば、上皮扁平細胞ガン）、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫を含めた肺ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃腸ガンを含めた胃腸または胃ガン、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓ガン、グリア芽細胞腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝細胞ガン、乳ガン、結腸ガン、直腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガンまたは子宮ガン、唾液腺癌、腎臓ガンまたは腎ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン、肛門癌、陰茎癌ならびに頭頸部ガンが挙げられる。
疾患の予防または治療では、適切なＥＤＣの用量は、上記の治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、分子を予防目的、治療目的のいずれで投与するのか、これまでに受けた治療法、患者の病歴および抗体に対する応答ならびに主治医の判断によって決まる。分子は、一度にまたは一連の治療にわたって、適切に患者に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回以上の別々の投与によるか、持続注入によるかに関係なく、分子約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇを含め、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が患者に投与する初回の候補用量となる。典型的な１日量の範囲は、上に挙げた因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）またはそれ以上になり得る。患者に投与する例示的なＥＤＣの用量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。
本発明のＥＤＣを、併用療法としての複合医薬製剤または投薬レジメンにおいて、抗ガン特性を有する第二の化合物と組み合わせることができる。複合医薬製剤または投薬レジメンの第２の化合物は、好ましくは組合せのＥＤＣに対する相補的活性を有するため、互いに悪影響を及ぼさないものである。
第２の化合物は、化学治療剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、抗アンドロゲン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子治療ワクチン、抗血管新生剤および／または心臓保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）であり得る。このような分子は、好適には意図される目的に有効な量の組み合わせで存在する。ＥＤＣを含有する医薬組成物はこのほか、治療有効量の化学治療剤、例えばチューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡバインダーなどを有し得る。
他の治療レジメンと、本発明により確認される抗ガン剤の投与とを組み合わせてもよい。併用療法を同時または連続レジメンとして実施することができる。連続して投与する場合、併用を２回以上の投与で実施することができる。併用投与は、別個の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与ならびにいずれかの順序での連続投与を含み、この場合、両方の（または全ての）活性薬剤が同時にその生物学的活性を発揮する期間がある。
１つの実施形態において、本発明のＥＤＣによる治療は、異なる化学治療剤のカクテルの同時投与を含む、本明細書中で確認される抗ガン剤と１つ以上の化学治療剤または成長阻害剤との併用投与を含む。化学治療剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ））および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。このような化学治療剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って、または当業者により経験的に決定される通りに用いることができる。このような化学療法剤の調製および投薬スケジュールはこのほか、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）に記載されている。
抗ガン剤を抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストンなどの抗プロゲステロン（欧州特許第６１６８１２号）；またはフルタミドなどの抗アンドロゲンと、このような分子について公知の用量で組み合わせてもよい。治療されるガンがホルモン非依存性のガンである場合、患者に予め抗ホルモン療法を実施し、ガンがホルモン非依存性になったのち、抗ＥｒｂＢ２抗体（および任意選択で、本明細書に記載の他の薬剤）を患者に投与することができる。このほか、患者に心臓保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（治療法を原因とする心筋機能障害を予防または軽減するため）または１つ以上のサイトカインを同時投与することが有益であり得る。上記治療レジメンに加えて、患者にガン細胞の外科的切除および／または放射線療法を実施してもよい。
上記同時投与される薬剤のいずれかの適切な用量は、現在使用されているものであり、新たに確認された薬剤およびその他の化学治療剤または治療の複合作用（相乗効果）により、これより少なくなることがある。
併用療法は、一緒に使用される活性成分が、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計よりも大きい場合に達成される効果をもたらし得る。その効果は、活性成分が：（１）一緒に製剤化され、複合単位用量製剤の形で同時に投与されるか、送達される場合；（２）別個の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）ある他のレジメンによって送達される場合にもたらされ得る。交互療法で送達される場合、化合物が連続して、例えば別個のシリンジで異なる注射により投与または送達される場合に効果がもたらされ得る。一般に、交互療法では有効用量の各活性成分を連続して、例えば順次に投与するのに対して、併用療法では有効用量の２つ以上の活性成分を一緒に投与する。
また、本明細書に記載のＥＤＣ化合物のインビボ代謝産物も、このような産物が先行技術と比較して新規で非自明なものである限り本発明の範囲内にある。このような産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的切断などにより生じ得る。したがって、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物が生じるのに十分な時間だけ哺乳動物に接触させることを含むプロセスによって生成する新規な非自明の化合物を含む。
放射性標識したＥＤＣを調製し、それを検出可能な投与量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ超）でラット、マウス、モルモット、サルまたはヒトなど動物に投与し、代謝が生じるのに十分な時間（通常、約３０秒〜３０時間）を置き、尿、血液またはその他の生物試料からその変換産物を単離することによって代謝産物を同定することができる。このような産物は標識されているため、容易に単離される（その他のものは、代謝産物中でも存在し続けるエピトープと結合することが可能な抗体の使用によって単離される）。代謝産物の構造は、従来の方法、例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳまたはＮＭＲ分析によって決定される。一般に、当業者に周知の従来の薬物代謝実験と同じ方法で代謝産物の分析を行う。変換産物がインビボでほかにみられない限り、それはＥＤＣ化合物を治療投与するための診断検査において有用である。
代謝産物には、薬物部分と抗体とを連結する任意の結合の切断が生じるＥＤＣのインビボ切断による産物が含まれる。したがって、代謝的切断では、そのままの抗体または抗体フラグメントが生じ得る。抗体代謝産物は、リンカーの一部分または全部と連結したものであり得る。このほか代謝的切断では、薬物部分またはその一部分の生成が起こり得る。薬物部分の代謝産物は、リンカーの一部分または全部と連結したものであり得る。
別の実施形態では、ＥＤＣおよび上記障害の治療に有用な物質を含む製品または「キット」が提供される。製品は、容器と、容器上に添付されたラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジまたはブリスターパックが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されたものであり得る。容器は、状態を治療するために有効なＥＤＣ組成物を保持するものであり、また無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穴を開けることができるストッパーを有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤がＥＤＣである。ラベルまたは添付文書は、ガンなどの選択される状態の治療に組成物が使用されることを示すものである。例えば、ガンは、本発明のＥＤＣの標的の１つを過剰発現するものであり得る。ラベルまたは添付文書はほかにも、本発明のＥＤＣの標的の１つの過剰発現を特徴としないガンの治療に組成物を使用し得ること示すものであり得る。他の実施形態において、添付文書は、ホルモン非依存性ガン、前立腺ガン、結腸ガンまたは結腸直腸ガンの治療にもＥＤＣ組成物を使用し得ることを示すものであり得る。
製品は、化合物がその中に含まれた容器を含んでもよく、その化合物は本発明のＥＤＣを含む。この実施形態の製品は、ガンの治療にＥＤＣを使用し得ることを示す添付文書をさらに含み得る。上記のものに代えてまたは加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液などの薬剤的に許容される緩衝液を含む第二（または第三）の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含めた商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
以下の実施例では、本発明の有用な方法およびＥＤＣを例示する。
例示として提示する以下の実施例から、本発明のさらなる利点および特性が明らかになろうが、この実施例は限定するものとして解釈されるべきものではない。本発明は、実施例に具体的に記載するものとは別の方法で実施され得る。上記の教示を踏まえれば、本発明の多数の修正および変形が可能であり、したがって、これらは、ここに挙げる実施例に続く添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
実施例１：リンカー動作可能治療薬の合成、ＥＤＣの調製および生物活性の評価
本発明実施例では、チオール反応性形態（第Ａ部）の「リンカー動作可能」薬剤ＣＥＮ０１０−１０５および様々な本発明のＥＤＣを形成するためのステロイドシラレニンと抗体との結合（第Ｂ部）について記載する。本実施例ではほかにも、ＥＤＣ活性の評価に用い得る様々な方法について記載する（第Ｃ部）。
第Ａ部 「リンカー動作可能」薬剤の合成
本実施例では、ステロイド薬とリンカーとを結合させて、本明細書に記載の抗体と容易に結合し得る「リンカー動作可能」薬剤を作製するための合成プロトコルについて記載する。アミノ酸システインとチオール反応性形態の「リンカー動作可能」薬剤とを連結することによって、キャップの付いた「リンカー動作可能」薬剤も、インビボでのプロテアーゼによるＥＤＣ分解によって生成し得る潜在的なＥＤＣ分解産物の活性を調べるために使用することができる。
ＣＥＮ０１０−１０５は、シラレニンと、リンカーと、抗体との安定な共有結合を形成するのに使用する活性な基とを含む「リンカー動作可能」シラレニンである。ＣＥＮ０１０−１０５を調製するための一般的な合成段階は以下の通りである。

２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセトイミデート
１−アリル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（１１．９ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でジクロロメタン／メタノール（８０ｍＬ、９０：１０）に溶解し、この溶液にＰｄＣｌ２（０．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌し、セライトのパッドで濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７０：３０）で濾過した。得られた化合物（８．３８ｇ、２１．８３ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で乾燥ジクロロメタン（１７０ｍＬ）に溶解した。ＣＣｌ３ＣＮ（２１．９ｍＬ、２１８．３ｍｍｏｌ）を加え、次いで０℃でＤＢＵ（１．６３ｍＬ、１０．９１ｍｍｏｌ）を滴加した。反応物を０℃で１時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６０：４０〜４０：６０）で濾過し、２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド−１−トリクロロアセトイミデートを黄色油状物として得た（９．７ｇ、６５％）。この化合物をさらに精製することなく、次に進めた。Ｒｆ０．３７（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）。

シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド
２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセトイミデート（０．４８３ｇ、０．９１５ｍｍｏｌ）を、０℃、アルゴン下、活性化４Å分子篩（９０ｍｇ）の乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）懸濁液に加えた。次いで、この混合物にシラレニン（０．１８２ｇ、０．４７４ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（１７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃でさらに３０分間攪拌した。追加量（０．１８２ｇ、０．４７４ｍｍｏｌ）のシラレニンを加えた。反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。数滴のＥｔ３Ｎで反応を停止させた。混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７５：２５〜５０：５０）によって精製し、シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを白色粉末として得た（０．５２１ｇ、７６％）。Ｒｆ０．３５（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５０：５０）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ，０．６８（ｓ，３Ｈ），０．９０−２．１７（ｍ，２１Ｈ），２．３９−２．４４（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０，９．５Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．７９−３．８７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．１７−４．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−１），５．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ，Ｈ−２），５．３３（ｓ，１Ｈ），５，４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ−３），６，２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．６Ｈｚ），７．１８−７．１９（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．６Ｈｚ），７．９２−７．９７（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６．７，１９．０，２１．４，２５．８，２８．７，２８．８，３２．４，３２．８，３５．２，３７．６，４０．８，４２．９，４８．４，５０．２，５１．２，５９．２，６３．１，７１．６，７２．９，７６．１，８５．２，１００．０，１１５．５，１２１．７，１２２．８，１２８．５，１２８．６，１２９．１，１２９．５，１２９．９，１３０．１，１３３．４，１３３．６，１４６．９，１４７．６，１４８．７，１６２．５，１６５．３，１６５．７。

シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド
シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（０．３５１ｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（７ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で２日間攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９８：２〜９５：５）によって精製し、シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを黄色粉末として得た（４０ｍｇ、２４％）。Ｒｆ０．３１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ，０．７４（ｓ，３Ｈ），１．０３−２．２１（ｍ，２１Ｈ），２．５２−２．５７（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．２０（ｍ、２Ｈ），３．４０−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），５．３５（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．８Ｈｚ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．６Ｈｚ）。


シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド
シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１．６１ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（２．８ｍＬ、９０：１０）に溶解した。ポリマー結合型ＰＰｈ３（７９ｍｇ、３ｍｍｏｌ／ｇ）を加えた。反応混合物を４０℃で２時間攪拌した。次いで混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０〜８０：２０）によって精製し、シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを黄色粉末として得た（２３ｍｇ、５８％）。Ｒｆ０．２（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ，０．７４（ｓ，３Ｈ），１．０６−２．１９（ｍ，２１Ｈ），２．５２−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．７５−２．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．１４−３．２４（ｍ、２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３），３．６４−３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５ｂ），３．８７−３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５ａ），４．１９−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−１），５．３８（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．６Ｈｚ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．５；Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７．４，１９．６，２２．５，２６．８，２９．９，３０．１，３３．３，３３．６，３６．６，３８．８，４１．８，４３．５，４９．４，５１．７，５２．２，７５．３，７６．５，７８．９，７９．３，７９．８，８５．８，１０３．７，１１５．６，１２３．４，１２５．１，１４８．４，１４９．４，１５０．５，１６４．９。

ＣＥＮ０１０−１０５
室温でシラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１８．５ｍｇ、０．０３５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド（５０ｍｇ、０．０３５９ｍｍｏｌ）を加えた。次いでＥｔ３Ｎ（０．０２５ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５〜８０：２０）によって精製し、ＣＥＮ０１０−１０５を黄色油状物として得た（４８ｍｇ、７５％）。Ｒｆ０．６６（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）。ＨＰＬＣ分析［Ｌｕｎａ Ｃ１８、２５０×４６０ｍｍ、５μｍ、５％〜９５％のＡＣＮで３２分間、１ｍｌ／分］は、９５％超の純度の生成物を示した。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：Ｃ８７Ｈ１４７Ｎ３Ｏ３５［Ｍ＋Ｋ＋］＋の計算値は１８３２．９４５２、実測値は１８３２．９７７７であった。
第Ｂ部 イムノコンジュゲート（ＥＤＣおよび対照）の調製
抗体鎖間ジスルフィドの還元を含む以下の方法によって、実施例２〜９に記載するＥＤＣおよび対照複合体（ヒト細胞と結合しないマウスＩｇＧカッパの抗体４Ｆ１２を含む）を調製した。簡潔に述べれば、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を、１ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＬＬＣ）および８モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（カタログ番号：ＨＲ２−６５１、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の存在下、３７℃で２時間還元し、次いで、湿潤した氷に移した。次いで９．６当量のＣＥＮ０１０−１０５（「リンカー動作可能」薬剤）を加え、氷上で３０分間反応させた。ＣＥＮ０１０−１０５に対して１．５当量のＬ−システインを加えて反応を停止させ、室温で３０分間反応させた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０，０００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた遠心分離濃縮およびＤＰＢＳ緩衝液交換を繰り返すことにより、抗体複合体を非結合ＣＥＮ０１０−１０５から分離した。複合体をＰＢＳ中、２〜８℃、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で保存した。
以下に述べる方法によって、薬剤としてシラレニンを有するＥＤＣ（抗体当たりの薬剤数）の薬剤負荷を決定した。２８０ｎｍの±１０ｎｍ外側の波長における薬剤の吸光係数が一度決定されれば、ステロイド薬を含む任意のＥＤＣにこの方法を用いることができる。この方法は、２８０ｎｍおよびシラレニンの場合は２９９ｎｍの両方で複合体、抗体（Ａｂ）およびシラレニン（薬物）の吸光度を測定する必要がある。まず、遊離抗体の吸光度を２８０ｎｍ（Ａ２８０Ａｂ）および２９９ｎｍ（Ａ２９９Ａｂ）の両方で測定し、抗体定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ａｂ］を決定する。次に、遊離薬物の吸光度を２８０ｎｍ（Ａ２８０ｄｒｕｇ）および２９９ｎｍ（Ａ２９９ｄｒｕｇ）の両方で測定し、薬物定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｄｒｕｇ］を決定する。最後に、抗体薬物複合体の吸光度を測定する［Ａ２８０ＣｏｎｊおよびＡ２９９Ｃｏｎｊ］。２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数は２０４，０００Ｍ−１ｃｍ−１である。２９９ｎｍにおけるシラレニンのモル吸光係数は５６２３Ｍ−１ｃｍ−１である。次の方程式を解くことによって、複合体の薬剤負荷を求める。
［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ａｂ］＝Ａ２９９Ａｂ／Ａ２８０Ａｂ
［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｄｒｕｇ］＝Ａ２９９ｄｒｕｇ／Ａ２８０ｄｒｕｇ
Ａ２８０Ａｂ＊＝Ａ２８０Ｃｏｎｊ−（Ａ２９９Ｃｏｎｊ−［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ａｂ］×Ａ２８０Ｃｏｎｊ）／（［Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｒｕｇ］−［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ａｂ］）
Ａ２９９ｄｒｕｇ＊＝Ａ２９９−［Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ａｂ］×Ａ２８０Ａｂ
抗体濃度＝Ａ２８０Ａｂ＊／２０４，０００Ｍ−１ｃｍ−１
薬物濃度＝Ａ２９９ｄｒｕｇ＊／５６２３Ｍ−１ｃｍ−１
薬物負荷＝薬物濃度／抗体濃度
Ａ２９９ｄｒｕｇ＊＝ＥＤＣの薬物成分
Ａ２８０Ａｂ＊＝ＥＤＣの抗体成分
第Ｃ部 細胞毒性活性評価
細胞および培養条件：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から細胞系Ｈ４６０、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＰＡＮＣ−１、ＭＢ２３１、ＦａＤｕ、Ｈ６９およびＨ９２９を入手した。このほか、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（米国国立ガン研究所、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から悪性黒色腫細胞系ＬＯＸ ＩＭＶＩを入手した。これらの細胞系を推奨される培地配合で維持し、３〜４日毎に継代した。薬物部分が結合し、かつ／または特定のタンパク質とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体を形成する特定の標的の発現を活性化するため、推奨培地にホルボールエステル、様々な成長因子およびサイトカインなどの添加剤、例えばＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子、ヒト成長因子、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子などを加えて細胞を培養することができる。さらに、ヒト線維芽細胞のような他の細胞とともに細胞を培養することができる。さらに、フィブリノーゲンのような様々なタンパク質でマイクロタイタープレートをコーティングすることができる。
インビトロ細胞毒性評価：細胞を、組織培養処理済みの３８４ウェル白色マイクロタイタープレートの１ウェル当たり１２５０〜３３３３個の密度で完全培地２０μｌ中に播き、次いで、複合体または小分子薬剤添加の前に加湿インキュベーター内で３７℃、７％ＣＯ２で２４時間培養した。細胞生存率試験の前に、細胞を試験化合物の存在下で７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて細胞生存率試験を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いて、各細胞系に対する試験化合物のＥＣ５０値を決定した。
実施例２：ＥＤＣ２―ＣＤ１４７とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ２イムノコンジュゲートは、ヒトにおいて、ベイシジン（ＢＳＧ）の発現をコード化するＢＳＧ遺伝子によってコード化され、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）としても知られるタンパク質である分化のクラスター１４７（ＣＤ１４７）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。
次に挙げる４種類の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体と、実施例に記載のＣＥＮ０１０−１０とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：（１）クローンＨＩＭ６（マウスＩｇＧ１、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３０６２０６；（２）クローン１Ａ６Ａ８（マウスＩｇＧ１、κ）；（３）クローン２Ｃ４（マウスＩｇＧ１、κ）；および（４）クローン８Ｄ１２（マウスＩｇＧ１、κ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号１４−１４７２。
得られたモノクローナル抗体ＨＩＭ６、１Ａ６Ａ８、２Ｃ４および８Ｄ１２と結合したＥＤＣを、命名法ＥＤＣＸ．Ｙに従ってそれぞれＥＤＣ２．１，ＥＤＣ２．２，ＥＤＣ２．３およびＥＤＣ２．４と命名したが、ここで、Ｘはターゲティング薬剤が結合する標的（例えば、本実施例のＣＤ１４７）を指し、Ｙは使用する具体的なターゲティング薬剤（例えば、本実施例の１つの場合には、ｍＡｂクローンＨＩＭ６）のことである。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対する上に挙げたＥＤＣの細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、試験した９種類の細胞系でＣＤ１４７が発現し、この細胞表面タンパク質を標的とするＥＤＣが全般的にピコモル濃度の範囲で活性であることを示している。これらの結果は、細胞表面タンパク質ＣＤ１４７が一貫してＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成することを示すものである。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ１４７に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、実施例８で報告する被験ガンタイプ（大細胞肺ガン、結腸ガン、非小細胞肺ガン、膵臓ガン、乳ガン、頭頸部ガン、小細胞肺ガン、黒色腫および骨髄腫）を含めた多くのタイプのガンの治療に概ね有用である。
実施例３：ＥＤＣ３―ＣＤ４４とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ３イムノコンジュゲートは、ヒトにおいてＣＤ４４遺伝子によってコード化され、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｐｇｐ１、Ｈ−ＣＡＭおよびＨＵＴＣＨとしても知られる８０〜９５ｋＤの糖タンパク質である分化のクラスター４４（ＣＤ４４）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。
次に挙げる２種類の抗ＣＤ４４モノクローナル抗体と、実施例１に記載のＣＥＮ０１０−１０５とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：（１）クローンＩＭ７（ラットＩｇＧ２ｂ、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号１０３００２；および（２）クローンＢＪ１８（マウスＩｇＧ１、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３３８８０２。得られたＣＥＮ０１０−１０５とモノクローナル抗体ＩＭ７およびＢＪ１８とのＥＤＣをそれぞれ、ＥＤＣ３．１およびＥＤＣ３．２と命名した。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対する上に挙げたＥＤＣの細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、試験した全細胞系でＣＤ４４が発現し、この細胞表面タンパク質を標的とするＥＤＣが細胞系Ａ５４９およびＰＡＮＣ１では低ナノモル濃度の範囲で、また細胞系ＨＴ２９、ＭＢ２３１、ＦａＤｕ、Ｈ４６では１００ｎＭ未満で活性であることを示している。ＥＤＣ３．１およびＥＤＣ３．２は、全細胞型について対照複合体より低い活性を示した。これらの結果は、記載の条件下で培養した場合、細胞系Ａ５４９およびＰＡＮＣ１ではＣＤ４４がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成し、細胞系ＨＴ２９、ＭＢ２３１、ＦａＤｕ、Ｈ４６ではＣＤ４４が低レベルで発現するか、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと弱く（必ずしもそうではないが）複合体を形成することを示している。強い相互作用とは、ＥＤＣに対する細胞型の感受性が対照複合体の少なくとも１００倍の相互作用のことである。弱い相互作用とは、ＥＤＣに対する細胞型の感受性が対照複合体の１００倍には満たないが、少なくとも１０倍はある相互作用のことである。相互作用がみられない場合とは、ＥＤＣに対する細胞型の感受性が対照複合体の１０倍に満たない場合のことである。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ４４に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、実施例８に記載の被験ガンタイプ（非小細胞肺ガンおよび膵臓ガン）を含めた多くのタイプのガンの治療に概ね有用である。
実施例４：ＥＤＣ４―ＣＤ９８とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ４イムノコンジュゲートは、一緒に大型の中性アミノ酸輸送体（ＬＡＴ１）を形成するＳＬＣ３Ａ２とＳＬＣ７Ａ５とからなるヘテロ二量体糖タンパク質である分化のクラスター９８（ＣＤ９８）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。次に挙げる抗ＣＤ９８抗体と、実施例１に記載のＣＥＮ０１０−１０５とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：クローンＭＥＭ−１０８（マウスＩｇＧ１、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３１５６０２。得られた複合体をＥＤＣ４．１と命名した。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対するこのＥＤＣの細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、記載した条件下では、試験した全細胞系でＣＤ９が発現し、この細胞表面タンパク質を標的とするＥＤＣが、試験した細胞系のナノモル濃度の範囲において対照複合体未満のレベルで活性であることを示すものであり、このことは、ＣＤ９８が上記細胞系でＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成することを示している。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ９８に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、実施例８で報告する被験ガンタイプ（非小細胞肺ガン、頭頸部ガン、小細胞肺ガンおよび骨髄腫）を含めた多くのタイプのガンの治療に概ね有用である。
実施例５：ＥＤＣ５―ＣＤ８７とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ５イムノコンジュゲートは、ウロキナーゼ受容体またはｕＰＡＲとしても知られる分化のクラスター８７（ＣＤ８７）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。次に挙げる抗ＣＤ８７抗体と、実施例１に記載のＣＥＮ０１０−１０５とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：クローンＶＩＭ５（マウスＩｇＧ１、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３３６９０２。得られた複合体をＥＤＣ５．１と命名した。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対するこのＥＤＣの細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、細胞を培養するのに用いた条件下では、ＬＯＸ細胞でのみＣＤ８７が発現し、ＣＤ８７とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ５．１がこの細胞系に対して低ナノモル濃度の範囲で活性であることを示すものであり、このことは、ＣＤ９８がこの細胞系でＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成することを示している。
実施例８に記載の結果を得るのにＣＤ８７刺激因子は使用せず、またＣＤ８７は通常、休止細胞では検出可能なレベルで発現しない。したがって、ｕＰＡＲ系の活性が開始される前にＣＤ８７がアップレギュレートされる必要がある可能性がある。例えば、ＣＤ８７発現はホルボールエステルなどの薬剤（Ｌｕｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：５１７７−５１８１）、上皮細胞の形質転換ならびにＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−１、ＴＮＦアルファ（内皮細胞において）およびＧＭ−ＣＳＦ（マクロファージにおいて）などの様々な成長因子およびサイトカイン（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９１，１１３：１１９３−１２０１；Ｍａｎｄｒｉｏｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９７０９−９７１６；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １９９６，２０：３１９−３２６）によってインビトロで刺激される。さらに重要なことに、ｕＰＡＲは、これまでに調べられているほとんどのヒトガン腫において、特に腫瘍細胞自体、血管新生中の腫瘍関連内皮細胞およびマクロファージにおいてインビボでアップレギュレートされると考えられ（Ｐｙｋｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：１９１１−１５）、このことが腫瘍血管新生の誘発に関与している可能性がある（Ｌｅｗｉｓら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．１９９５，５７：７４７−７５１）。
したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ８７に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、実施例８に記載の被験ガンタイプ（黒色腫）を含めた多くのタイプのガンの治療に概ね有用である。さらに、ＥＤＣ５．１またはｕＰＡＲ特異的ターゲティング部分とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤とを用いて開発されたＥＤＣは、マクロファージが関与する炎症性疾患の治療に有用である。
実施例６：ＥＤＣ６―ＣＤ２３０とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ６イムノコンジュゲートは、主要プリオン関連タンパク質（ＰｒＰ）としても知られる分化のクラスター２３０（ＣＤ２３０）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。次に挙げる抗ＣＤ２３０抗体と、実施例１に記載のＣＥＮ０１０−１０５とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：クローン４Ｄ５（マウスＩｇＧ１、κ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号１４−９２３０−８２。得られた複合体をＥＤＣ６．１と命名した。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対するＥＤＣ６．１の細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、試験した全細胞系でＣＤ２３０が発現し、この細胞表面タンパク質を標的とするＥＤＣが、細胞系Ａ５４９およびＬＯＸに対して、ナノモル濃度の範囲において対照複合体レベル未満での活性であることを示すものであり、このことは、ＣＤ２３０が上記細胞系でＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成することを示している。この結果はほかにも、ＥＤＣ６．１がＰＡＮＣ１、ＭＢ２３１またはＦａＤｕ細胞に対して活性でないことを示しており、このことは、試験条件下では、ＣＤ２３０が上記細胞表面でＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成しないことを示している。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ２３０に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、実施例８に記載の被験ガンタイプ（非小細胞肺ガンおよび黒色腫）を含めた多くのタイプのガンの治療に概ね有用であると考えられる。さらに、プリオン特異的ターゲティング部分とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤とを用いて開発されたＥＤＣは、プリオンおよびプリオン関連タンパク質の蓄積によって引き起こされる神経学的異常の治療に有用である。
実施例７：ＥＤＣ７―ＣＤ５６とＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とするＥＤＣ
ＥＤＣ７イムノコンジュゲートは、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）としても知られる分化のクラスター５６（ＣＤ５６）を標的とする抗体と、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする薬物とを含むものである。
次に挙げる２種類の抗ＣＤ５６抗体と、実質的に実施例１に記載のようなＣＥＮ０１０−１０５とを結合させて、本発明のＥＤＣを調製した：（１）クローンＨＣＤ５６（マウスＩｇＧ１、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３１８３２４；および（２）クローンＭＥＭ−１８８（マウスＩｇＧ２ａ、κ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３０４６２２。得られた抗体ＨＣＤ５６およびＭＥＭ−１８８と結合したＣＥＮ０１０−１０５のＥＤＣをそれぞれ、ＥＤＣ６．１およびＥＤＣ６．２と命名した。
実施例１に記載の多数のガン細胞系に対する上に挙げたＥＤＣの細胞毒性活性をインビトロで評価し、その結果を実施例８の表１にまとめた（ＥＣ５０値をｎＭで表す）。この結果は、Ｈ６９細胞と称する小細胞肺ガン系細胞でのみＣＤ５６が発現し、この細胞表面タンパク質を標的とするＥＤＣがこの細胞系に対してピコモル濃度の範囲で活性であることを示すものであり、このことは、ＣＤ５６がこの細胞系でＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成することを示している。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する薬剤と結合させたＣＤ５６に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、小細胞肺ガンの治療に概ね有用であると考えられる。
実施例８．ＥＤＣのインビトロ細胞毒性
実施例９：動物モデルにおけるＥＤＣの有効性
ＥＤＣ２．２（実施例２を参照のこと）の有効性をＨＴ−２９ヒト結腸ガン異種移植モデルで明らかにした。簡潔に述べれば、ヒト結腸直腸腺ガン疾患モデルを確立するため、ＨＴ−２９異種移植片を有するマウス由来の腫瘍を細かく分割し、８ｍｍ３の断片をＨｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎｌｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の左脇腹の皮下に套管針により移植した。次いで、７個体からなるグループの腫瘍体積が平均約１００ｍｍ３になった時点で、ＥＤＣ２．２による処置を開始した。３日毎に１回、計４回の注射投与（ｑ３ｄ×４）のスケジュールを用いて、ビヒクル対照および１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＥＤＣ２．２を用いた処置を静注で実施した。ｑｄ×５で投与したパクリタキセル１５ｍｇ／ｋｇが陽性対照処置群としての役割を果たした。移植後６９日間および初回投与後４１日間にわたって、校正済みノギスを用いて各群の腫瘍体積を測定し、腫瘍移植の最初の日に対してプロットした。初回投与の４１日後、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＥＤＣ２．２では、腫瘍増殖がビヒクルと比較してそれぞれ５９％および６６％阻害された。最適投薬のパクリタキセルでは、腫瘍増殖がビヒクルと比較して８５％阻害された。したがって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用すると結合させたＣＤ１４７に対するターゲティング部分を用いたＥＤＣは、結腸ガンの治療に概ね有用であると考えられる。

Claims (26)

  1. 非切断性リンカーによって治療薬と連結されたターゲティング部分を含む細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）であって、前記ターゲティング部分がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合し、前記治療薬が前記Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する、細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）。
  2. 非切断性リンカーによって治療薬と連結されたターゲティング部分を含む細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）であって、前記ターゲティング部分が、抗体、エピトープ結合ペプチドまたはアプタマーからなる群より選択され、かつＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに近接した標的と結合し、前記治療薬が前記Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに作用する、細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）。
  3. 前記ターゲティング部分が細胞外標的と特異的に結合する、請求項２に記載のＥＤＣ。
  4. 前記ターゲティング部分が抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  5. 前記細胞外標的がＣＤ１４７、ＬＡＴ１、ＡＳＣＴ２、ＣＤ９８、ＰｒＰ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＴ１、インテグリン、ＣＤ１６６、ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）、ＣＤ７１、ＣＤ５６、ＣＤ８７、ＴｆＲ１、Ｓｅｌ−１、ＩＧＦＲ、ｃ−ＭＥＴ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＧｌｕＲ２、セロトニン輸送体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ＧＡＢＡＡ受容体、ＥＡＡＴ、ＴＬＲ４、Ｔ細胞受容体、ｍＴＮＦアルファ（膜貫通型）、ＰＬＡ２、ＲＡＮＫＬ、インスリン受容体、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシンＩＩ受容体、ＡＴＰ感受性Ｋチャンネル、ＰＥ−ＮＭＴ、アンジオテンシン受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩｎｓＰ３Ｒ、ＲＳ１およびα−ｋｌｏｔｈｏからなる群より選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  6. 前記細胞外標的が細胞表面シグナル伝達経路タンパク質である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  7. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ１４７と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  8. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ５６と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  9. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ４４と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  10. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ８７と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  11. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ９８と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  12. 前記ターゲティング部分が、ＣＤ２３０と特異的に結合する抗体である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  13. 前記治療薬がステロイドである、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  14. 前記治療薬がシラレニンである、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  15. 前記ターゲティング部分がＣＤ１４７と特異的に結合する抗体であり、前記治療薬がシラレニンであり、前記抗体がリンカーを介してシラレニンと共有結合している、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  16. 前記ターゲティング部分がＣＤ５６と特異的に結合する抗体であり、前記治療薬がシラレニンであり、前記抗体がリンカーを介してシラレニンと共有結合している、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  17. 前記ターゲティング部分がＣＤ８７と特異的に結合する抗体であり、前記治療薬がシラレニンであり、前記抗体がリンカーを介してシラレニンと共有結合している、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  18. 前記ターゲティング部分がＣＤ９８と特異的に結合する抗体であり、前記治療薬がシラレニンであり、前記抗体がリンカーを介してシラレニンと共有結合している、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  19. 前記ターゲティング部分がＣＤ２３０と特異的に結合する抗体であり、前記治療薬がシラレニンであり、前記抗体がリンカーを介してシラレニンと共有結合している、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  20. 抗体当たりの治療薬負荷が平均約１〜約６である、請求項２〜１９のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
  21. 薬剤的に許容されるビヒクル、ベクター、希釈剤および／または賦形剤と、治療有効量の請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣとを含む、医薬組成物。
  22. 疾患を治療する方法であって、前記疾患の治療を必要とする対象に、治療有効量の請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣを投与することを含んでなる、方法。
  23. 前記疾患がウイルス感染、ガン、転移、細胞アポトーシス障害、変性疾患、組織虚血、感染症またはウイルス性、細菌性もしくは真菌性、免疫媒介性の疾患、炎症障害および病的血管新生の群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. タンパク質が細胞表面のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと会合しているかどうかを判定する方法であって、細胞と請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＤＣとを接触させることと、前記ＥＤＣが前記細胞に対して、前記細胞と前記ターゲティング部分または前記治療薬との接触の効果とは異なる効果を有するかどうかを判定することとを含み、前記ＥＤＣが前記細胞に対して、前記ターゲティング部分または前記治療薬の効果とは異なる効果を有する場合、前記タンパク質がＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと複合体を形成している、方法。
  25. ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合させる方法であって、前記標的を発現する細胞と、請求項１または２に記載のＥＤＣとを接触させることを含んでなる、方法。
  26. ＮａＫ−ＡＴＰアーゼではない細胞外標的と結合させる方法であって、前記標的と結合させるのに有効な量の請求項１または２に記載のＥＤＣを対象に投与することを含む、方法。
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