BRPI0508670B1

BRPI0508670B1 - Proteínas buganina modificadas, citotoxinas, usos das referidas citotoxinas para o tratamento de câncer, composição farmacêutica, processo de preparação de produto farmacêutico, ácidos nucléicos e peptídeos de epítopo de célula t

Info

Publication number: BRPI0508670B1
Application number: BRPI0508670-1A
Authority: BR
Inventors: Matthew Baker; Francis J. Carr; Koen Hellendoorn; Jeannick Cizeau; Glen Christopher Macdonald; Joycelyn Entwistle; Denis Georges Bosc; Nicholas Ronald Glover
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2023-01-24
Also published as: US7339031B2; NO20064134L; EP1737961A4; MXPA06010716A; WO2005090579A1; JP2008500811A; US8716234B2; EP1737961A1; ES2424643T3; JP5025460B2; AU2005224942A1; IL177922A; NZ550339A; EA200601738A1; US20150018526A1; PT1737961E; CA2560278A1; DK1737961T3; PL1737961T3; US20050238642A1

Abstract

PROTEÍNAS DE BUGANINA MODIFICADA, CITOTOXINAS E MÉTODOS E USOS DELAS. São propostas formas modificadas de proteína buganina que têm uma atividade biológica e uma propensão reduzida para ativar células T humanas em comparação com a proteína buganina não modificada. Também são propostos peptídeos de epítopo de célula T de buganina, e peptídeos de epítopo de célula T modificados, que têm uma propensão reduzida para ativar células T humanas em comparação com o peptídeo de epítopo de células T não modificados. Também são propostas citotoxinas que compreendem um ligante que se liga a células cancerosas, e está ligado a proteínas de buganina modificada. Também são propostos métodos de inibição ou destruição de células cancerosas de mamíferos usando-se as citotoxinas e composições farmacêuticas para o tratamento de câncer humano.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A invenção se refere a proteínas de buganina modificada e a citotoxinas contendo as proteínas modificadas úteis como agentes terapêuticos contra câncer. Mais especificamente são removidos ou alterados os epítopos de células T para reduzir a imunogenicidade das toxinas de buganina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]Há muitos casos em que a eficácia de uma proteína terapêutica é limitada por uma reação imune indesejável à proteína terapêutica. Diversos anticorpos monoclonais murinos se mostraram promissores como terapias em uma série de situações mórbidas humanas, mas em determinados casos falharam devido à indução de graus significativos de uma resposta a anticorpo humano anti-murino (HAMA) [Schroff, R.W. et al. (1985) Câncer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. et al. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535] Para anticorpos monoclonais foi desenvolvida uma série de técnicas na tentativa de se reduzir à resposta a HAMA [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. Estas abordagens de DNA recombinante geralmente reduziram as informações genéticas murinas na construção final do anticorpo aumentando ao mesmo tempo as informações genéticas humanas na construção final. Não obstante, os anticorpos “humanizados” resultantes, em muitos casos, ainda obtiveram uma resposta imune em pacientes [Isaacs, J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al. (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

[003] A chave para a indução de uma resposta imune é a presença na proteína de peptídeos que podem estimular a atividade de células T por meio de apresentação em moléculas de MHC de classe II, os assim chamados “epítopos de células t”. Tais epítopos de células T são habitualmente definidos como qualquer sequência de resíduo de aminoácido com a capacidade de se ligar a moléculas de MHC de Classe II. Implicitamente, um “epítopo de célula T” significa um epítopo que quando se liga a moléculas de MHC pode ser reconhecido por um receptor de célula T (TCR) e que pode, pelo menos em princípio, produzir a ativação destas células T por recrutar um TCR para promover uma resposta de células T.

[004]As moléculas de MHC de Classe II são um grupo de proteínas extremamente polimórficas que representam um papel central na seleção e ativação de células T auxiliares. O grupo DR de antígenos a leucócitos humanos (HLA-DR) são o isótipo predominante deste grupo de proteínas; no entanto, os isótipos HLA-DQ e HLA-DP desempenham funções análogas. Na população humana, os indivíduos são portadores de dois a quatro alelos de DR, dois de DQ e dois alelos de DP. A estrutura de uma série de moléculas de dr foi solucionada e elas parecem consistir em um canal de ligação a peptídeo de extremidade aberta com uma série de bolsos hidrófobos que engatam com resíduos hidrófobos (resíduos bolsos) do peptídeo [Brown et al., (1993) Nature 364: 33; Stern et al (1994) Nature 368: 215]. O polimorfismo que identifica os diferentes alótipos da molécula de classe II contribui para uma ampla diversidade de diferentes superfícies de ligação para peptídeos dentro do canal de ligação a peptídeos e ao nível de população assegura uma flexibilidade máxima no tocante à capacidade de reconhecer proteínas estranhas e de montar uma resposta imune a organismo patogênicos.

[005]Uma resposta imune a uma proteína terapêutica prossegue por meio da via de apresentação de peptídeo de MHC de classe II. Aqui, as proteínas exógenas são engolidas e processadas para apresentação em associação com moléculas de MHC de classe II do tipo DR, DQ o DP. As moléculas de MHC de Classe II são expressam por células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) tais como macrófagos e células dendríticas dentre outras. O engate de um complexo peptídico de MHC de classe II por um receptor de célula T cognato na superfície da célula T, juntamente com a interligação de determinados outros co-receptores tais como a molécula de CD4, pode induzir um estado ativado no interior da célula T. A ativação leva a uma liberação de citocinas, ativando ainda mais outros linfócitos tais como células B para produzir anticorpos ou ativando células T exterminadoras como uma resposta imune celular integral.

[006] A identificação do epítopo de célula T é a primeira etapa para a eliminação do epítopo conforme foi reconhecido em WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232; WO 02/079232; e WO 02/079415. Nestas instruções, epítopos de células T previstos são removidos pelo uso de uma substituição criteriosa de aminoácidos no interior da proteína de interesse. Além das técnicas de computação, há métodos in vitro para a medição da capacidade de peptídeos sintéticos de se ligar a moléculas de MHC de classe II. Um método exemplar usa linhagens de células B de alótipo de MHC definido como uma fonte de superfície de ligação de MHC de classe II e pode ser aplicado à identificação de ligante a MHC de classe II [Marshall, K.W. et al. (1994) J. Immunol. 152: 4946-4956; O’Sullivan et al. (1990) J. Immunol. 1345: 1799-1808; Robadey C. et al (1997) J. Immunol. 159: 32383246]. No entanto, tais técnicas não são adaptadas para se testar uma multiplicidade de epítopos potenciais a uma ampla diversidade de alótipos de MHC, nem podem confirmar a capacidade que um peptídeo de ligação tem de funcionar como um epítopo de célula T.

[007]Entraram em uso também técnicas que exploram os complexos solúveis de moléculas de MHC recombinante em combinação com peptídeos sintéticos [Kern, F. et al (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. et al. (2001) TRENDS in Immunol. 22: 583-588]. Estes reagentes e procedimentos são usados para se identificar à presença de clones de células T de amostras de sangue periférico provenientes de pacientes humanos ou animais experimentais que são capazes de se ligar a complexos específicos MHC- peptídeo e que não são adaptados para testar uma multiplicidade de epítopos potenciais a uma ampla diversidade de alótipos de MHC.

[008]Os testes biológicos de ativação de células T oferecem uma opção prática para proporcionar uma leitura da capacidade de uma sequência de peptídeo/proteína de obter uma resposta imune. Exemplos deste tipo de abordagem incluem o trabalho de Petra et al. Usando ensaios de proliferação de células T para a proteína estafiloquinase bacteriana, seguidos por mapeamento de epítopo usando-se peptídeos sintéticos para estimular linhagens de células T [Petra, A.M. et al. (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. De modo análogo os ensaios de proliferação de células T usando peptídeos sintéticos da proteína da toxina do tétano resultaram na definição das regiões de epítopo imunodominante da toxina [Reece, J.C. et al. (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. WO 99/53038 divulga uma abordagem pela qual epítopos de células T em uma proteína de teste podem ser determinados usando-se subconjuntos isolados de células imunes humanas, promovendo-se sua diferenciação in vitro e cultura das células na presença de peptídeos sintéticos de interesse e medindo-se qualquer proliferação induzida nas células T cultivadas. A mesma técnica é também descrita por Stickler et al. [Stickler, M.M et al (2000) J. Immunotherapy 23: 654-660] em que nos dois casos o método é aplicado à detecção de epítopos de células T no interior de subtilisina bacteriana. Tal técnica exige uma aplicação cuidadosa de técnicas de isolamento de células e a cultura de células com múltiplos suplementos de citocina para se obter os sub conjuntos de células imunes desejadas (células dendríticas, células T CD4+ e ou CD8+) e não conduz a uma triagem de rápida passagem usando-se amostras de uma multiplicidade de doadores.

[009]Recentemente foi também proposta uma abordagem de combinação usando-se ensaios de proliferação de células T à base de populações e simulação in silico de ligação MHC peptídeo no projeto de proteínas desprovidas de epítopo [WO 03/104803].

[0010]Conforme ilustrado acima e como consequência, seria desejável se identificar e remover, ou pelo menos reduzir, epítopos de células T de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína principal terapeuticamente valioso, mas originalmente imunogênico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011]A invenção é concebida para se superar a realidade prática de que proteínas solúveis introduzidas com intenção terapêutica em seres humanos podem desencadear uma resposta imune que resulta no desenvolvimento de anticorpos no hospedeiro que se ligam à proteína solúvel. A presente invenção busca resolver este problema propondo proteínas buganina com uma propensão reduzida de provocar uma resposta imune. De acordo com os métodos descritos no presente, os inventores identificaram as regiões da molécula de buganina que compreende os epítopos críticos de células T que acionam as respostas imunes a esta proteína.

[0012]A presente invenção se refere a uma proteína buganina modificada em que a buganina modificada tem uma propensão reduzida de obter uma resposta imune. Em uma modalidade preferida, a buganina modificada tem uma propensão reduzida de ativar células T e a buganina modificada é modificada em um ou mais resíduos de aminoácidos e um epítopo de célula T. Os epítopos de células T são selecionados de preferência do grupo que consiste em: a) AKVDRKDLELGVYKL (região de epítopo R1, SEQ ID NO: 2), b) LGVYKLEFSIEAIHG (região de epítopo R2, SEQ ID NO: 3); e c) NGQEIAKFFLIVIQM (região de epítopo R3, SEQ ID NO: 4)).

[0013]A presente invenção também se refere a uma citotoxina que compreende uma porção de direcionamento ligada a uma proteína buganina modificada da invenção. Em uma modalidade, a porção de direcionamento é um ligante que se liga a uma célula cancerosa. Em uma outra modalidade, o ligante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a uma célula cancerosa. Em uma modalidade específica o anticorpo reconhece Ep-CAM ou antígeno associado a tumor. Em uma modalidade extremamente específica, a presente invenção propõe uma citotoxina compreende VB6-845 ou VB6-011.

[0014]Em um outro aspecto, a invenção propõe um método de se inibir ou destruir células cancerosas que compreende administração de uma citotoxina da invenção às células cancerosas.

[0015]A presente invenção também se refere a um método de se tratar câncer por administração de uma citotoxina da invenção a um animal que tenha necessidade dela.

[0016]Em um outro caso, é provido um processo para a preparação de um produto farmacêutico para o tratamento de um animal com câncer que compreende as etapas de se identificar epítopos de células T de buganina, de se modificar um ou mais resíduos de aminoácidos em um epítopo de célula T para preparar uma buganina modifica que tenha uma propensão reduzida para ativar células T; preparar-se uma citotoxina que tenha um ligante que se liga a câncer ligado a uma buganina modificada; e suspender-se a citotoxina em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0017]Em uma outra modalidade, a invenção propõe uma composição farmacêutica para o tratamento de um animal com câncer compreendendo a citotoxina da invenção e um veículo diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0018]As citotoxinas, composições e métodos da presente invenção podem ser usados para o tratamento de diversas formas de câncer tais como câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e não de célula pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

[0019]A invenção também propõe peptídeos de epítopo de célula T da proteína buganina e os peptídeos de epítopo de célula T modificados.

[0020]Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada que segue. Deve ficar subentendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são dados a titulo de ilustração somente, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da presente invenção ocorrerão aos versados na técnica com a leitura desta descrição detalhada.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

[0021]A invenção será agora descrita em relação aos desenhos em que:

[0022]A Figura 1 mostra os resultados de ensaios de atividade de proteínas buganina modificadas desprovidas de epítopo para célula T Bou156 (painel A) e Bou157 (painel B). Bou156 compreende as substituições V123A, D127A, Y133N, e I152A. Bou157 compreende as substituições V123A, D127A, Y133Q e I152A. Ambos os conjuntos de ensaio são conduzidos usando-se proteína do tipo nativo e uma buganina modificada desativada (Y70A) como controles. A atividade é expressa em forma de% de atividade de luciferase medida para a concentração de proteína buganina no ensaio.

[0023]A Figura 2 mostra os resultados do ensaio de proliferação de células T para três peptídeos sintéticos e amostras de 2 doadores diferentes de PBMC. Os peptídeos denominados Del-41, Del-44 e Del-50 foram testados a uma concentração final de 1 μM (painel A) e uma concentração final de 5 μM (painel B). Estes peptídeos derivam das regiões imunogênicas da molécula de buganina e contêm substituições projetadas para eliminar a sua imunogenicidade.

[0024]A Figura 3 ilustra VB6-8445, uma citotoxina de buganina modificada tendo um Fab anti-Ep-CAM, em que a de-buganina (Bou156) está ligada ao terminal C do domínio CH por meio de um linker furina. A Figura 3A ilustra a unidade dicistrônica que codifica as pro-sequências. A Figura 3B ilustra a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 15) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) das pro- sequências e a Figura 3C ilustra a proteína VB6-845 montada sem as sequências pelB.

[0025]A Figura 4 ilustra o mapa do vetor de expressão plING3302. As inserções dos exemplos foram ligadas no vetor 3302 usando-se sítios de restrição EcoRI e XhoI.

[0026]A Figura 5 ilustra a construção controle Fab anti-Ep-CAM sem a toxina vegetal de-buganina (VB5-845). A Figura 5A ilustra a unidade dicistrônica que codifica as pro-sequências. A Figura 5B ilustra a sequência que codifica o ácido nucléico (SEQ ID NO: 17) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) das pro-sequências e a Figura 5C ilustra a proteína VB5-845 sem as sequências pelB.

[0027]A Figura 6 ilustra a construção VB6-845-CL-de-buganina de Fab anti-Ep- CAM de-buganina, em que Bou156 é ligado ao terminal c do domínio CL. A Figura 6A ilustra as unidades dicistrônicas que codificam as pro-sequências, a Figura 6B ilustra a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 19) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) das pro-sequências e a Figura 6C ilustra a proteína VB6- 845-CL de-buganina montada sem as sequências pelB.

[0028]A Figura 7 ilustra a construção VB6-845-NVH-de-buganina de Fab anti-Ep- CAM de-buganina, em que Bou156 é ligado ao terminal N do domínio VH. A Figura 7A ilustra as unidades dicistrônicas que codificam as pro-sequências, a Figura 7B ilustra a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 21) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) das pro-sequências e a Figura 7C ilustra a proteína VB6- 845-NVH-de-buganina sem as sequências pelB.

[0029]A Figura 8 ilustra a construção VB6-845-NVL-de-buganina de Fab anti-Ep- CAM de-buganina, estando Bou156 ligada ao terminal N do domínio VL. A Figura 8A ilustra as unidades dicistrônicas que codificam as pro-sequências, a figura 8B ilustra a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 23) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) das pro-sequências e as Figura 8C ilustra a proteína VB6- 845-NVL-de-buganina montada sem as sequências pelB.

[0030]A Figura 9 é um Western blot ilustrando a expressão de VB6-845 (construção da Figura 3) e VB6-845-CL-de-buganina (Bou156) (construção da Figura 6) no sobrenadante de células E104 induzidas em escala laboratorial

[0031]A Figura 10 ilustra os resultados de estudos de reatividade por citometria de fluxo A Figura 10A ilustra a reatividade de VB6-845 (construção da Figura 3) e VB6-845- CL-de-buganina (construção da Figura 6) em linhagens de células positivas para Ep-CAM CAL 27 e OVCAR-3 e a linhagem de células negativa para Ep-CAM, A-375, ao passo que a Figura 10B ilustra os resultados dos mesmos testes conduzidos com VB6-845 (construção da Figura 3) e VB6-845-gelonina (construção da Figura 14C) e controle (PBS).

[0032]A Figura 11 é um gráfico ilustrando os resultados do ensaio de competição VB6-845 e ProxiniumTM em células NIH:OVCAR-3 e conforme descrito no Exemplo 7.

[0033]A Figura 12 é um gráfico ilustrando os resultados do ensaio isento de células do Exemplo 7.

[0034]A Figura 13 ilustra os resultados do ensaio de citotoxicidade de MTS do Exemplo 8 comparando a citotoxicidade de VB6-845 (construção da Figura 3), VB6-845- CL-de-buganina (construção da Figura 6) e de-buganina (Bou156) em células CAL27 (Figura 13A) e NIH:OVCAR3 (Figura 13B).

[0035]As Figuras 14A e B ilustram os resultados do ensaio de citotoxicidade de MTS do exemplo 8 comparando a citotoxicidade de VB6-845 (construção da Figura 3), de VB6-845-gelonina (construção da Figura 14C) e de gelonina em células CAL 27 (Figura 14A) e NIH:OVCAR3 (Figura 14B). A Figura 14C ilustra a sequência que codifica o ácido nucléico (SEQ ID NO: 25) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) da construção de VB6-845-gelonina.

[0036]A Figura 15 ilustra a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 27) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) das pro-sequências de VB6-011.

[0037]A Figura 16 ilustra os resultados do ensaio de citotoxicidade de MTS do Exemplo 9 mostrando a citotoxicidade de VB6-011 em células MB-435S.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038]Os inventores identificaram epítopos de células T em buganina e projetaram e produziram proteínas modificadas de buganina que têm uma propensão reduzida para ativar células T humanas em comparação com a proteína buganina não modificada. (A) Proteína Buganina Modificada

[0039]A presente invenção se refere a uma proteína buganina modificada em que a buganina foi modificada para ter uma propensão reduzida para obter uma resposta imune, de preferência uma resposta de célula T, em comparação com uma proteína buganina não modificada. A proteína buganina madura consiste em um único polipeptídeo de 250 aminoácidos com um peso molecular de aproximadamente 26.200 Da [Den Hartog et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 1772-1779; patente U.S. No. 6.680.296]. Buganina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) do tipo 1 originalmente isolada da planta Bougainvillea spectabilis Willd [Bolognesi et al (1997) Planta 203: 422-429]. As RIPs provenientes de plantas são RNA N-glicosidases que despurinam o RNA ribossômico principal de células, danificando, assim, os ribossomos e levando a uma cessação da síntese da proteína e a morte celular.

[0040]A sequência de aminoácidos da proteína buganina madura (ilustrada em código de uma única letra) é: YNTVSFNLGEAYEYPTFIODLRNELAKGTPVCOLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTS KKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQ KLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVD RGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPOCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSOISP DMGILKFKSSK [SEQ ID NO. 1].

[0041]O termo “proteína buganina não modificada” significa uma proteína buganina que não tenha sido modificada a fim de reduzir a sua propensão para obter uma resposta imune. A sequência de buganina do tipo nativo ou uma não modificada é mostrada na SEQ ID NO: 1. No entanto, os versados na técnica observarão que o termo “buganina não modificada” também inclui modificações de SEQ ID NO: 1, desde que tais modificações não reduzam a propensão para obter uma resposta imune. Exemplos de modificações que podem ser introduzidas em SEQ ID NO: 1 incluem fragmentos de peptídeos e substituições conservadoras de aminoácidos que não reduze a imunogenicidade da proteína.

[0042]O termo “proteína buganina modificada” significa uma proteína buganina que tenha sido modificada em comparação com a proteína de buganina não modificada (descrita acima) em que tal modificação reduz a propensão da buganina obter uma resposta imune. A proteína buganina modificada por também ser denominada buganina desimunizada. A “proteína buganina modificada” pode ser uma sequência modificada de comprimento total ou um fragmento modificado da proteína de buganina não modificada. A ”proteína buganina modificada” pode também conter outras alterações em comparação com a sequência de buganina do tipo nativo que não alteram a imunogenicidade do peptídeo. A proteína buganina modificada terá, de preferência, a mesma atividade biológica que a buganina não modificada.

[0043]O termo “propensão reduzida para obter uma resposta imune”, conforme empregado no presente, significa que a proteína buganina modificada é menos imunogênica que a buganina não modificada.

[0044]O termo “resposta imune” inclui tanto respostas imunes celulares como humorais. Em uma modalidade preferida, a buganina modificada tem uma propensão reduzida para ativar células T.

[0045]O termo “propensão reduzida para ativar células T humanas”, conforme empregado no presente, significa que a proteína buganina modificada tem uma propensão reduzida para ativar células T humanas, quando comparada com a proteína buganina não modificada. Os versados na técnica podem testar para verificar se uma buganina modificada tem uma propensão reduzida para ativar células T usando ensaios conhecidos na técnica incluindo a avaliação do índice de estimulação da proteína.

[0046]O termo “índice de estimulação”, conforme empregado no presente, se refere à medida da capacidade que a proteína buganina modificada ou não modificada tem de ativar células T humanas. A proteína buganina modificada ou não modificada, por exemplo, ou seus peptídeos, pode ser testada para a usa capacidade de obter uma resposta proliferativa em células T humanas cultivadas in vitro. Nos casos em que este tipo de abordagem é conduzido empregando-se células T humanas pré-imunes tiradas de doadores sadios, os inventores estabeleceram que na operação de tal ensaio, um índice de estimulação igual a 2,0 ou acima dele é uma medida útil de proliferação induzida. O índice de estimulação é convencionalmente derivado por divisão da contagem de proliferação (contagem por minuto de radioatividade, por exemplo, quando se estiver usando a incorporação de 3H-timidina) medida para o peptídeo de teste pela contagem medida em células que não entraram em contato com um peptídeo de teste.

[0047]Em uma modalidade, a invenção propõe uma proteína buganina modificada, tendo a proteína buganina modificada uma atividade biológica e tendo uma propensão reduzida para ativar células T humanas em comparação com uma proteína buganina não modificada.

[0048]Em uma outra modalidade, a invenção propõe uma proteína buganina modificada, tendo a proteína buganina modificada uma propensão reduzida para ativar células T humanas quando comparada a uma proteína buganina não modificada e tendo uma atividade biológica que é inferior à da proteína buganina não modificada. Em uma outra modalidade ainda, a invenção propõe uma proteína buganina modificada, tendo a proteína buganina modificada uma propensão reduzida para ativar células T humanas e nenhuma atividade biológica. Tais proteínas modificadas poderiam, por exemplo, ser usadas como controles em ensaios ou para tolerizar pacientes .

[0049]O termo “atividade biológica”, conforme empregado no presente, é a capacidade que a proteína buganina modificada ou não modificada tem de inibir a síntese da proteína em ribossomos, e que pode ser avaliada em uma série de modos. Deve-se observar que uma proteína buganina modificada continuará tendo uma atividade biológica mesmo se tal atividade for inferior à da proteína buganina não modificada, no entanto ela necessitaria ter algum nível de atividade detectável. A atividade biológica da proteína buganina modificada ou não modificada pode ser avaliada, por exemplo, identificando-se sua atividade de N-glicosidase, e especialmente com uma atividade suficiente para proporcionar uma inibição significativa de tradução da proteína. Um tal ensaio adequado envolve o teste da atividade das proteínas variantes de buganina em comparação com a buganina não modificada em um ensaio de síntese de proteína isenta de células. Co- incuba-se uma mistura de transcrição/tradução acopladas contendo metionina, o DNA que codifica a proteína luciferase da proteína repórter e diluições em série de proteína buganina não modificada e modificada. Os níveis de luciferase traduzida são facilmente detectados usando-se um contador de luminescência após a adição de um reagente de substrato. A luminescência medida é inversamente proporcional à atividade de N- glicosidase da buganina presente na reação. Habitualmente se provê um controle negativo tal como uma proteína buganina inativa, contendo uma substituição Y70A, por exemplo.

[0050]Em uma modalidade preferida, o peptídeo de buganina modificada é modificado em um ou mais epítopos de célula T na sequência da proteína buganina.

[0051]O termo “epítopo de célula T” significa uma sequência de aminoácidos que é capaz de se ligar ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) do tipo II, capaz de estimular células T e/ou também capaz de se ligar (sem necessariamente ativar de modo mensurável) as células T em complexo com MHC de classe II.

[0052]Em um aspecto, um método geral que pode ser usado na presente invenção levando a proteínas buganina modificadas compreendendo epítopos modificados para células T compreende as seguintes etapas: (i) determinação da sequência de aminoácidos da proteína ou parte dela; (ii) identificação de um ou mais epítopos potenciais de células T no interior da sequência de aminoácidos da proteína por métodos tais como a determinação da ligação dos peptídeos as moléculas de MHC usando-se técnicas in vitro ou in silico ou ensaios biológicos; (iii) projeto de novas variantes de sequência com um ou mais aminoácidos no interior dos epítopos de células T identificados potenciais modificados de tal modo, que se reduza substancialmente ou se elimine a atividade do epítopo das células T conforme determinado pela ligação dos peptídeos a moléculas de MHC usando-se técnicas in vitro ou in silico ou ensaios biológicos. Tais variantes de sequência são criadas de tal modo que se evite a criação de novos epítopos potenciais para células T pelas variações da sequência, a não ser que tais novos epítopos potenciais para células T sejam, por sua vez, modificados de um modo tal, que se reduza substancialmente ou se elimine a atividade do epítopo de células T; (iv) construção de tais variantes de sequência por técnicas de DNA recombinante e teste de tais variantes a fim de se identificar uma ou mais variantes com propriedades desejáveis de acordo com técnicas recombinantes bem conhecidas; e (v) opcionalmente repetição das etapas (ii) a (iv).

[0053]Em um exemplo, a etapa (iii) é conduzida pro substituição, adição ou deleção de resíduos de aminoácidos em qualquer um dos epítopos de células T na proteína buganina não modificada. Em um outro exemplo, o método de se produzir à proteína buganina modificada é feito com referência à sequência de proteína homóloga e/ou modelagem in silico.

[0054]A identificação de epítopos potenciais de células T de acordo com a etapa (ii) pode ser conduzida de acordo com os métodos descritos anteriormente na técnica. Métodos adequados são descritos em WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 e podem ser usados para se identificar à propensão de ligação de peptídeos derivados de buganina a uma molécula de MHC de classe II. A fim de se identificar peptídeos biologicamente relevantes, os inventores desenvolveram uma abordagem que explore os ensaios de proliferação de células T humanas ex vivo. Esta abordagem provou ser um método especialmente efetivo e envolveu o teste de sequências de peptídeos derivados de buganina sobrepostas em um esquema de modo a se fazer uma varredura e testar a sequência integral de buganina. Os peptídeos sintéticos são testados para a sua capacidade de obter uma resposta proliferativa em células T humanas cultivadas in vitro. Nos casos em que se conduz este tio de abordagem empregando-se células T humanas pré-imunes tiradas de doadores sadios, os inventores estabeleceram que na operação de um tal ensaio, um índice de estimulação igual ou superior a 2,0 é uma medida útil de proliferação induzida. O índice de estimulação é convencionalmente derivado pela divisão da contagem de proliferação (contagem por minuto de radioatividade, quando for usada a incorporação de 3H-timidina, por exemplo) medida para o peptídeo de teste pela contagem medida em células que não entraram em contato com um peptídeo de teste.

[0055]Consequentemente, nos estudos da presente invenção, 89 peptídeos 15- meros sintéticos (conforme relacionados na Tabela 1) foram usados em ensaios de proliferação de células T com PBMCs (células mononucleares de sangue periférico) provenientes de doadores pré-imunes (isto é, sem nenhuma sensibilização conhecida a buganina). Amostras de pbmc de 20 doadores foram selecionadas para se atingir uma cobertura ótima de alótipos de MHC de classe II. As PBMCs foram estimuladas com peptídeos individuais em culturas em triplicata durante 7 dias antes da proliferação ser avaliada pela incorporação de 3H-timidina. Todos os peptídeos foram diluídos a duas concentrações diferentes: 1 μM e 5 μM. Os índices de estimulação (SI) foram calculados como sendo a quantidade de 3H incorporado às células, dividida pela quantidade de 3H incorporada a controles com estimulação simulada.

[0056]Este método identificou as regiões mais imunogênicas da molécula de buganina em seres humanos. Consequentemente, em uma modalidade específica, a proteína buganina modificada é modificada em um ou mais resíduos de aminoácidos em um epítopo de célula T selecionado do grupo que consiste em: a) AKVDRKDLELGVYKL, denominada aqui região de epítopo R1 (SEQ ID NO: 2), b) LGVYKLEFSIEAIHG, denominada aqui região de epítopo R2 (SEQ ID NO: 3); e c) NGQEIAKFFLIVIQM, denominada aqui região de epítopo R3 (SEQ ID NO: 4)).

[0057]Estes epítopos de células T foram identificados com base em doação de SI>2 em duas ou mais amostras de PBMC de doadores. As sequências de peptídeos descritas acima representam a informação crítica necessária para a construção de proteínas modificadas de buganina em que um ou mais destes epítopos está comprometido.

[0058]Em uma modalidade da invenção, a proteína buganina modificada da invenção tem pelo menos um epítopo de célula T removido. Em uma outra modalidade, a proteína buganina modificada da invenção tem um dois ou três epítopos de célula T removidos. A invenção também contempla uma proteína buganina modificada em que 1 a 9 resíduos de aminoácidos são modificados, de preferência no epítopo de célula T. Em uma outra modalidade, são modificados de 1 a 5 resíduos de aminoácidos. O termo “modificado”, conforme empregado no presente, significa que os resíduos de aminoácidos são modificados por substituição, adição ou deleção, de preferência por substituição, mas a proteína buganina tem uma propensão reduzida de ativar células T humanas. Em uma outra modalidade, a proteína modificada tem uma atividade biológica. O mais preferível é que a proteína buganina modificada da invenção seja modificada por substituição em uma posição que corresponde a qualquer um dos aminoácidos especificados no interior das sequências (a), (b) ou (c) acima.

[0059]Uma modalidade da presente invenção compreende proteínas buganina para as quais os ligantes de MHC de classe II identificados no interior de qualquer uma das regiões de epítopos R1-R3 são modificados de tal modo, que seja eliminada a ligação ou que é de outro modo reduzido o número de alótipos de MHC aos quais o peptídeo possa se ligar. Os aminoácidos nas regiões R1 a R3 destinados a eliminar a ligação ou de outro modo reduzir o número de alótipos de MHC aos quais o peptídeo possa se ligar podem ser modificados por substituição, adição ou deleção.

[0060]Para a eliminação dos epítopos de célula T, as substituições são feitas em pontos apropriados no interior da sequência de peptídeo prevista como obtendo uma redução substancial ou eliminação da atividade do epítopo de célula T. Na prática, um ponto apropriado em uma modalidade corresponderá a um resíduo de aminoácido se ligando no interior de um dos bolsos propostos no interior do canal de ligação de MHC de classe II.

[0061]Em uma modalidade, é modificada a ligação no interior do primeiro bolso da clivagem na posição denominada P1 ou P1 de ancoragem do peptídeo. A qualidade de interação de ligação entre o resíduo de ancoragem de P1 do peptídeo e o primeiro bolsão do canal de ligação de MHC de classe II é reconhecida como sendo um determinante importante da afinidade de ligação geral do peptídeo como um todo. Uma substituição adequada nesta posição do peptídeo será para um resíduo que tenha uma menor propensão a se acomodar no interior do bolso, substituição para um resíduo mais hidrófilo, por exemplo. Os resíduos de aminoácidos no peptídeo nas posições que correspondem à ligação no interior de outras regiões de bolsos no interior da clivagem de ligação de MHC são também considerados e incidem no âmbito da presente invenção.

[0062]Fica subentendido que substituições, deleções ou adições de um único aminoácido no interior de um epítopo de célula T potencial dado são uma via preferida pela qual o epítopo pode ser eliminado. As combinações ou modificações (isto é, substituições, deleções e adições) no interior de um único epítopo devem ser contempladas e podem ser, por exemplo, especialmente apropriadas nos casos em que os epítopos individualmente definidos estão sobrepostos um ao outro como no caso da presente invenção em que as regiões R1 e R2 de epítopo se sobrepões de 5 resíduos. Além disso, tanto modificações de um único aminoácido no interior de um epítopo dado como em combinação no interior de um único epítopo podem ser efetuadas em posições que não correspondem aos “resíduos de bolsos” no tocante ao canal de ligação de MHC de classe II, mas em qualquer ponto no interior da sequência peptídica. As modificações podem ser feitas fazendo-se referência a uma estrutura homóloga ou a um método estrutural produzido usando-se técnicas in silico conhecidas na técnica e podem ser baseadas em características estruturais conhecidas da molécula de acordo com a presente invenção. Todas tais modificações incidem no âmbito da presente invenção.

[0063]As regiões de epítopo R1-R3 de buganina foram analisadas para indicação de ligantes de MHC de classe II abrangidos pelas suas sequências respectivas. Uma ferramenta de software que explora os esquemas descritos em WO 98;59244 e WO 02/069232 foi usada para esta análise. O software simula o processo de apresentação de antígeno no nível da interação de ligação do peptídeo a MHC de classe II para proporcionar uma contagem de ligação para qualquer sequência peptídica dada. Tal contagem é determinada para muitos dos alótipos predominantes de MHC de classe II existentes na população. Como este esquema é capaz de testar qualquer sequência peptídica, as consequências das substituições, adições ou deleções de aminoácidos no tocante à capacidade que um peptídeo tem de interagir com um canal de ligação de MHC de classe II pode ser previstas. Consequentemente, podem ser projetadas novas composições de sequências que conteriam números reduzidos de peptídeos capazes de interagir com MHC de classe II e assim funcionar como epítopos de célula T imunogênicos.

[0064]Com este esquema em uma modalidade das substituições da invenção, no interior da região de epítopo R1 compreendem alterações nas posições V123, D127 e/ou E129. De modo análogo, para a região de epítopo R2, em uma modalidade a substituição se encontra na posição Y133. Este resíduo incide na região de sobreposição entre R1 e R2, mas a substituição em Y133 é suficiente para eliminar o ligante de MHC de classe II relacionado com R2 e não é suficiente sozinho para eliminar os ligantes de MHC de classe II relacionados com R1. Para a região de epítopo R3, em uma modalidade da invenção, as substituições ocorrem nos resíduos E151 e/ou I152.

[0065]Em todos os casos, as substituições são a um ou mais resíduos de aminoácidos alternativos. A análise de R1 com o software de estimulação de MHC II indicou que os resíduos de aminoácidos 123, 127, 129, e 131 eram os resíduos cruciais neste epítopo para se ligar às moléculas de MHC II. O resíduo 123 é um sítio preferido para a mutação da região R1, pois ele se encontra na superfície da molécula, sempre distante do sítio ativo e é variável no alinhamento de sequências de RIP. Mesmo assim, nem todas as substituições resultam em uma molécula ativa, portanto é necessário se validar as mutações no ensaio de bioatividade. Portanto, no interior de R1, por exemplo, as substituições V123T, V123A e V123Q são exemplos de substituições alternativas preferidas. Foi observado que o resíduo 131 era totalmente conservado em RIP e, portanto, não é provável que seja adequado para mutação. O resíduo 127 e o 129 não são extremamente conservados, mas foi constatado que somente um número restrito de resíduos tinha um impacto sobre a ligação de MHC II. Os conjuntos de substituição: D127G, D127A, E129Q e E129G são também substituições preferidas. Para R2, foi mostrado que a o resíduo 133 é um candidato provável para a abolição da ligação de MHC II e sua localização aparente na superfície (conforme determinado por modelagem) combinada com o fato de que ele não é extremamente conservado sobre RIP o torna um bom candidato para mutação. Foi constatado que as substituições alternativas preferidas eram Y133N, Y133T, Y133A, Y133R, Y133D, Y133E, Y133Q, Y133G, Y133K, Y133H e Y13S. Para R3, os resíduos 152, 155 3 158 foram identificados com resíduos chave para ligação de MHC II. NO entanto os resíduos 155 e 158 são parte de um trecho hidrófobo extremamente conservado, sugerindo assim que sua mutação não produziria moléculas bioativas. Foi constatado que um resíduo precariamente conservado seria um candidato mais provável. Para R3, os conjuntos de substituição: I152Q e I152A são também substituições preferidas.

[0066]Consequentemente, a invenção propõe uma proteína buganina modificada, sendo a buganina modificada em um ou mais de X1, X2, X3, X4 ou X5 do seguinte modo: a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (região de epítopo R1, SEQ ID NO: 5) b) LGVX4KLEFSIEAIHG (região de epítopo R2, SEQ ID NO: 6); e c) NGQEX5AKFFLIVIQM (região de epítopo R3, SEQ ID NO: 7) em que de X1 a X5 pode consistir em qualquer aminoácido.

[0067]Em uma modalidade específica, X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S; e X5 é Q ou A (região de epítopo R1, SEQ ID NO: 8; região de epítopo R2, SEQ ID NO: 9; região epítopo R3, SEQ ID NO: 10).

[0068]Tomados em conjunto, um conjunto de substituições mais preferido pode ser compilado com base nos estudos de mapeamento de epítopo imunogênico usando-se ensaios de célula T ex vivo, as simulações de ligação de peptídeo a MHC in silico e as considerações estruturais a partir da análise de homologia entre sequências. Finalmente, se for preferida uma proteína bioativa, o ensaio de atividade in vitro pode então ser conduzido na proteína modificada que pode compreender uma ou múltiplas mutações.

[0069]Consequentemente, em uma outra modalidade, a invenção propõe um peptídeo de buganina modificada que compreende a sequência de aminoácidos: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTS KKTVKAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKL VNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEAIHGKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVV DRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHASSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQIS PDMGILKFKSSK em que X1 a X5 podem consistir em qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 11).

[0070]Em uma modalidade preferida, X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S; e X5 é Q ou A (SEQ ID NO: 12).

[0071]Em uma modalidade específica, a proteína buganina modificada compreende a sequência de aminoácidos: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTS KKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQL VNMKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRG LYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDM GILKFKSSK (SEQ ID NO: 13)

[0072]Em uma outra modalidade ainda, a proteína buganina modificada compreende a sequência de aminoácidos: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTS KKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQ KLVNAAKADRKALELGVQKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVD RGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISP DMGILKFKSSK (SEQ ID NO: 14).

[0073]Os resíduos sublinhados são resíduos substituídos deferentes da proteína buganina não modificada.

[0074]Conforme será evidente aos versados na técnica, poderia ser obtida uma multiplicidade de conjuntos alternativos de modificações com os quais se atinge o objetivo de se remover epítopos indesejáveis. As sequências resultantes, no entanto, permaneceriam amplamente homólogas às proteínas específicas descritas no presente documento e portanto, incidiriam no âmbito da presente invenção. Equivalentes químicos óbvios às sequências descrita na presente invenção também são contempladas como incidindo no âmbito da presente invenção. Tais equivalentes incluem proteínas que têm substancialmente a mesma função de um modo substancialmente igual.

[0075]Em uma outra modalidade, a proteína buganina modificada da invenção tem 1, 2, 3, 4, 5 ou mais modificações de aminoácidos nos epítopos de células T da proteína.

[0076]Em uma modalidade adicional a proteína buganina modificada da invenção, quando testada em um ensaio de célula T obtém um índice de estimulação reduzido em comparação com a proteína buganina não modificada.

[0077]Em uma outra modalidade da invenção, os epítopos de célula T da proteína buganina são mapeados usando-se um ensaio de célula T, sendo então modificados de modo tal que por re-teste no ensaio de célula T, a proteína buganina modificada obtém um índice de estimulação inferior ao da proteína buganina não modificada, sendo o índice de estimulação, de preferência, inferior a 2,0.

[0078]Será evidente aos versados na técnica que se a proteína buganina modificada tiver uma atividade biológica substancialmente reduzida ou ausente, ela pode necessitar de uma modificação adicional por substituição, adição ou deleção de resíduos de aminoácidos para se restaurar a atividade biológica da proteína buganina modificada. No entanto, tais proteínas de buganina modificadas que têm uma atividade substancialmente reduzida ou ausente incidem ainda no âmbito da presente invenção e têm utilidade como controles em ensaios, ou para tolerização.

[0079]Em uma modalidade, a proteína buganina modificada é mutada no resíduo de tirosina na posição 70 para produzir uma buganina inativa. Em uma modalidade específica, a tirosina na posição 70 é substituída com alanina. Em uma modalidade preferida, a buganina modificada tem a sequência: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLVTLQTIADDKRFVLVDITTTSK KTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKL VNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRG LYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDM GILKFKSSK [SEQ ID NO. 129].

[0080]Nos termos do plano da presente invenção, os epítopos são comprometidos por mutação para resultar em sequências que não são mais capazes de funcionar como epítopos de célula T. É possível se usar métodos de DNA recombinante para se atingir mutagênese direcionada das sequências alvo e muitas tais técnicas são disponíveis e conhecidas na técnica. Na prática, será produzido um número de proteínas de buganina modificada e serão testadas para a característica imune e funcional desejada. É especialmente importante quando se conduzem modificações na sequência da proteína que as alterações contempladas não introduzam novos epítopos imunogênicos. Este evento é evitado na prática re-testando-ses a sequência contemplada para a presença de epítopos e/ou de ligantes de MHC de classe II por qualquer meio adequado.

[0081]As proteínas de buganina modificada da invenção podem também conter ou ser usadas para se obter ou projetar “miméticos de peptídeos”. “Miméticos de peptídeos” são estruturas que servem como substitutos para peptídeos em interações entre moléculas (veja Morgan et al (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: 243-252 para uma resenha). Os miméticos de peptídeos incluem estruturas sintéticas que podem conter ou não aminoácidos e/ou ligações peptídicas mas que conservam as características funcionais e estruturais da proteína da invenção, incluindo a atividade biológica e a propensão reduzida de ativar células T humanas. Os miméticos de peptídeos também incluem peptóides, oligopeptóides (Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367).

[0082]Os miméticos de peptídeos podem ser projetados com base nas informações obtidas pela substituição sistemática de L-aminoácidos por D-aminoácidos, substituição de cadeias laterais com grupos que têm diferentes propriedades eletrônicas e pela substituição sistemática de ligações peptídicas com substituições de ligações amido. As restrições conformacionais locais podem também ser introduzidas para se determinar às exigências conformacionais para a atividade de um mimético peptídico candidato. Os miméticos podem incluir ligações amido isostéricas, ou D-aminoácidos para estabilizar ou promover as conformações de orientação inversa e para ajudar a estabiliza a molécula. Os análogos cíclicos de aminoácidos podem ser usados para restringir os resíduos de aminoácidos a estados conformacionais específicos. Os miméticos podem também incluir mímicos das estruturas secundárias das proteínas da invenção. Estas estruturas podem modelar a orientação tridimensional dos resíduos de aminoácidos nas conformações secundárias conhecidas de proteínas. Podem também ser usados os peptóides que são oligômeros de aminoácidos N-substituídos e podem ser usados como motivos para a geração de bibliotecas quimicamente diversas de molécula inéditas.

[0083]As moléculas da presente invenção podem ser preparadas em qualquer um de diversos modos, mas é conduzido de modo o mais preferível por exploração de métodos recombinantes rotineiros, É um procedimento relativamente direto o uso de sequências de proteínas e informações fornecidas no presente documento para se deduzir um polinucleotídeo (DNA) que codifica qualquer uma das sequências de proteína preferidas. Isto pode ser obtido empregando-se ferramentas de software para computador, tais como, por exemplo, a série de software DNSstar [DNAstar Inc., Madison, WI, USA] ou análogos. Qualquer tal sequência de DNA com a capacidade de codificar os polipeptídeos preferidos do presente documento ou homólogos significantes a eles, devem ser considerados como modalidades da presente invenção.

[0084]Como um plano geral, os genes que codificam qualquer uma das sequências preferidas de proteína buganina modificada podem ser produzidas usando-se síntese genética e clonadas em um vetor de expressão adequado. Por sua vez o vetor de expressão é introduzido em uma célula e células hospedeiras, e cultivado. As proteínas da invenção são purificadas a partir do meio de cultura e formuladas em uma preparação para administração terapêutica. Alternativamente, uma sequência genética de buganina de tipo nativo pode ser obtida seguindo-se, por exemplo, uma estratégia de clonagem de DNAc usando-se RNA preparado a partir de tecidos da raiz da planta Bougainvillea spectabilis Willd. O gene do tipo nativo pode ser usado como um gabarito para mutagênese e construção de sequências variantes preferidas. Neste sentido é especialmente conveniente se usar a estratégia de “PCR de prolongamento de sobreposição” conforme é descrito por Higuchi et al. [Higuchi et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7351], embora outras metodologias e sistemas possam ser facilmente aplicadas.

[0085]A atividade biológica da proteínas da invenção podem igualmente ser avaliada de muitos modos. Em uma modalidade, as moléculas de buganina modificada são identificadas com atividade de N-glicosidase, e especialmente com uma atividade suficiente para proporcionar uma inibição significativa de tradução da proteína. Um tal ensaio adequado envolve se testar a atividade das proteínas de buganina modificada em comparação com a buganina não-modificada em um ensaio de síntese de proteína isenta de células. Uma mistura de transcrição/tradução acopladas contendo metionina, co- incubam-se o DNA que codifica a proteína repórter luciferase e diluições em série de proteínas de buganina não modificada e modificada. Os níveis de luciferase traduzida são facilmente detectados usando-se um contador de luminescência acrescentando-se em seguida um reagente de substrato. A luminescência medida é inversamente proporcional à atividade de buganina N-glicosidase presente na reação. É habitual se prover um controle negativo tal como uma proteína buganina inativa contendo uma substituição Y70A, por exemplo.

[0086]A constituição das moléculas preferidas e ativas de buganina pode ser obtida por técnicas de DNA recombinante e isto inclui moléculas de buganina fundidas com o anticorpo desejado ou outras porções de direcionamento. Os métodos para a purificação e a manipulação de proteínas recombinantes incluindo proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica. As técnicas necessárias são explicadas completamente na literatura, tal como em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney,ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991).

[0087]As proteínas e peptídeos da invenção podem ser preparados usando-se métodos de DNA recombinante. As proteínas da invenção podem também ser preparadas por síntese química usando-se técnicas bem conhecidas na química de proteínas tais como síntese de fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154) ou síntese em solução homogênea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 51 I e II, Thieme, Stuttgart).

[0088]A presente invenção também propõe uma molécula de ácido nucléico purificado e isolado compreendendo uma sequência que codifica a proteína de buganina modificada ou peptídeos da invenção, de preferência uma sequência que codifica a proteína descrita no presente documento como SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.

[0089]O termo “isolado e purificado”, conforme empregado no presente se refere a um ácido nucléico substancialmente isento de material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizado. Um ácido nucléico “isolado e purificado” está também substancialmente isento de sequências que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (isto é, as sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucléico) a partir do qual é derivado o ácido nucléico.

[0090]O termo “ácido nucléico”, conforme empregado no presente se refere a uma sequência de monômeros nucleotídicos ou nucleosídicos consistindo em bases de ocorrência natural, açúcares e ligações inter-açúcares (espinha dorsal). O termo também inclui sequências modificadas ou substituídas que compreendem monômeros que não ocorrem naturalmente ou porções deles, que funcionem de modo análogo. As sequências de ácido nucléico da presente invenção podem consistir em ácidos ribonucléicos (RNA) ou desoxirribonucléicos (DNA) e podem conter bases que ocorrem naturalmente incluindo adenina, guanina, citosina, timidina e uracila. As sequências podem também conter bases modificadas tais como xantina, hipoxantina, 2-amino adenina, 6-metila, 2-propila, e outras alquiladeninas, 5-halo uracila, 5-halo citosina, 6-aza uracila, 6-aza citosina e 6-aza timina, pseudouracila, 4-tiouracila, 8-halo adenina, 8-amino adenina, 8-tiol adenina, 8-tio- alquiladeninas, 8-hidroxil adenina e outras adeninas 8-substituídas, 8-halo guaninas, 8- amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquil guaninas, 8-hidroxil guanina e outras guaninas 8- substituídas, outras aza e desaza uracilas, timidinas, citosinas, adeninas ou guaninas, 5- triflúor-metil uracila e 5-triflúor-citosina.

[0091]Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico purificado e isolado compreende uma sequência que codifica as proteínas ou peptídeos, de preferência SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14, da presente invenção, compreendendo: (a) a sequência de ácido nucléico, em que T pode também ser U; (b) sequências de ácidos nucléicos complementares a (a); (c) sequências de ácidos nucléicos que são homólogas a (a) ou (b); (d) um fragmento de (a) a (c) que tem pelo menos 15 bases, de preferência de 20 a 30 bases, e que se hibridizará a (a) a (c) em condições de hibridização drásticas; ou (e) uma molécula de ácido nucléico que difere de qualquer um dos ácidos nucléicos de (a) a (c) em sequências de códons devido à degeneração do código genético.

[0092]Além disso, deve se observar que a invenção inclui moléculas de ácidos nucléicos que compreendem sequências de ácidos nucléicos que têm uma homologia substancial entre sequências com as sequências de ácidos nucléicos que codificam as proteínas e peptídeos da invenção, e seus fragmentos. O termo “sequências que tem uma homologia substancial entre sequências” significa que essas sequências de ácidos nucléicos que têm variações de sequências ligeiras ou inconsequentes destas sequências, isto é, se as sequências funcionam substancialmente do mesmo modo para produzir proteínas funcionalmente equivalentes. As variações podem ser atribuídas a mutações locais ou a modificações estruturais.

[0093]As sequências de ácidos nucléicos que têm uma homologia substancial incluem sequências de ácidos nucléicos que tem uma identidade de pelo menos 80%, de preferência de 90% com a sequência de ácidos nucléicos que codifica as proteínas e peptídeos da invenção.

[0094]Um outro aspecto da invenção proporciona uma molécula de ácido nucléico, e fragmentos seus que têm pelo menos 15 bases, que se hibridizam a moléculas de ácido nucléico da invenção em condições de hibridização, de preferência em condições drásticas de hibridização. As condições drásticas adequadas que promovem a hibridização de DNA são conhecidas dos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 1989, 6.3.1-6.3.6. Pode ser empregado o seguinte, por exemplo: 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C. A drasticidade pode ser selecionada com base nas condições usadas na etapa de lavagem. A concentração de sal, por exemplo, na etapa de lavagem pode ser selecionada de um alto grau de drasticidade de aproximadamente 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode estar em condições extremamente drásticas, a aproximadamente 65°C.

[0095]Consequentemente, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção que têm uma sequência que codifica uma proteína ou peptídeo da invenção podem ser incorporadas de acordo com procedimentos conhecidos na técnica em um vetor de expressão adequado que assegure uma boa expressão da proteína ou peptídeo. Os vetores de expressão possíveis incluem, sem limitação, cosmídeos, plasmídeos, ou vírus modificados (retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adeno-associados, por exemplo), desde que o vetor seja compatível com a célula hospedeira usada. A expressão “vetores adequados para a transformação de uma célula hospedeira” significa que os vetores de expressão contêm uma molécula de ácido nucléico da invenção e sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras para serem usados para expressão, que são operativamente ligados à molécula de ácido nucléico. “Operativamente ligados” se destina a significar que o ácido nucléico é ligado ás sequências reguladoras de um modo que permite a expressão do ácido nucléico.

[0096]A invenção, portanto, contempla um vetor de expressão recombinante da invenção contendo uma molécula de ácido nucléico da invenção, ou um fragmento seu e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de proteína inserida. As sequências reguladoras adequadas podem ser derivadas de uma variedade de fontes, incluindo, genes bacterianos, fúngicos ou virais (Veja, as sequências reguladoras descritas em Goeddel, Gene Expression Techology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), por exemplo). A seleção de sequências reguladoras adequadas depende da célula hospedeira escolhida e pode ser facilmente efetuada pelos versados na técnica. Exemplos de tais sequências reguladoras incluem: um promotor e intensificador transcricional ou sequência de ligação a RNA polimerase, uma sequência de ligação ribossômica, inclusive um sinal de iniciação de tradução. Além disso, dependendo da célula hospedeira escolhida e do vetor empregado, outras sequências, tais como uma origem de replicação, sítios de restrição de DNA adicionais, intensificadores e sequências que conferem inducibilidade de transcrição podem ser incorporadas ao vetor de expressão. Deve se observar ainda que as sequências reguladoras necessárias podem ser fornecidas pela proteína nativa e/ou as regiões que a flanqueiam. Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem também conter um gene marcador selecionável que facilita a seleção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma molécula recombinante da invenção. Exemplos de genes marcadores selecionáveis são genes que codificam uma proteína tal como G418 e higromicina que conferem resistência a determinados medicamentos, β- galactosidase, cloramfenicol acetiltransferase ou luciferase de vaga-lume. A transcrição do gene marcador selecionável é monitorada pro alterações na concentração da proteína marcadora selecionável tal como β-galactosidase, cloramfenicol acetiltransferase ou luciferase de vaga-lume. Se o gene marcador selecionável codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos tal como resistência a neomicina, células transformantes podem ser selecionadas com G418. As células que têm incorporado o gene marcador selecionável sobreviverão, ao passo que outras células morrerão. Isto torna possível se visualizar e testar a expressão de vetores de expressão recombinantes da invenção e especialmente se determinar o efeito de uma mutação sobre a expressão e fenótipo. Deve se observar que os marcadores selecionáveis podem ser introduzidos em um veículo separado do ácido nucléico de interesse.

[0097]Os vetores de expressão recombinantes podem também conter genes que codificam uma porção de fusão que proporciona uma expressão aumentada da proteína recombinante; uma solubilidade aumentada da proteína recombinante; e um auxílio na purificação de uma proteína recombinante alvo atuando como um ligante na purificação por afinidade. Um sítio de clivagem proteolítica, por exemplo, pode ser acrescentado à proteína recombinante alvo para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão após a purificação da proteína de fusão.

[0098]Os vetores de expressão recombinantes podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir uma célula hospedeira transformada. O termo “célula hospedeira transformada” destina-se a incluir células procarióticas e eucarióticas que tenham sido transformadas ou transfectadas com um veículo de expressão recombinante da invenção. Os termos “transformadas com”, “transfectadas com”, “transformação” e “transfecção” se destinam a abranger a introdução de ácido nucléico (um vetor, por exemplo) em uma célula por uma ou mais técnicas possíveis conhecidas na técnica. As células procarióticas podem ser transformadas com ácido nucléico por eletroporação ou por transformação mediada por cloreto de cálcio, por exemplo. O ácido nucléico pode ser introduzido em células de mamíferos por técnicas convencionais tais como de co- precipitação por fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, lipofectina, eletroporação ou microinjeção. Os métodos adequados para a transformação e transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) e outros tais manuais de laboratório.

[0099]Outras células hospedeiras adequadas incluem uma ampla variedade de células hospedeiras procarióticas e eucarióticas. As proteínas da invenção podem ser expressas, por exemplo, em células bacterianas tais como E. coli, células de insetos (usando-se baculovírus), células de levedura ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas podem ser encontradas em Goeddel, Gene Expression Techology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

[00100]O ácido nucléico está “operativamente ligado” quando ele está colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucléico. O DNA para uma pré-sequência ou para líder secretor, por exemplo, está operativamente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso em forma de uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação a ribossomo está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver de tal modo posicionado que facilite a tradução. Geralmente, “ligado operativamente” significa que as sequências de DNA que estiverem sendo ligadas estão contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em quadro de leitura. No entanto, os intensificadores não precisam estar contíguos. A ligação é efetuada pro ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, são usados adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou linkers de acordo com prática convencional.

[00101]Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma buganina modificada com um número reduzido de epítopos de célula T potenciais, ligados operativamente a uma sequência de controle de expressão. Em diversas modalidades, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica as proteínas ou peptídeos da presente invenção, ou uma variante degenerada deles e compreenderá pelo menos o domínio de codificação de RIP do citado ácido nucléico ligado operativamente ao controle de expressão e sequências de seleção adequadas. A degeneração em relação a polinucleotídeos se refere ao fato bem reconhecido que no código genético muitos aminoácidos são especificados por mais de um códon. A degeneração do código é responsável por 20 aminoácidos diferentes codificados por 64 sequências tripletos possíveis das quatro bases diferentes que constituem DNA.

[00102]O termo “domínio que codifica RIP” ou “domínio de codificação da Proteína que Inativa Ribossomo”, conforme empregado no presente, significa o domínio funcional que dá a buganina a sua atividade biológica.

[00103]As moléculas de ácido nucléico da invenção podem também ser quimicamente sintetizadas usando-se técnicas padrão. Diversos métodos de se sintetizar quimicamente polidesóxi nucleotídeos já são conhecidos, incluindo a síntese de fase sólida, que, tal como a síntese de peptídeos, já foi totalmente automatizada em sintetizadores de DNA disponíveis no comércio (Veja, por exemplo, Itakura et al., patente U.S. No. 4.598.049; Caruthers et al., patente U.S. No. 4.458.066; e Itacura, patentes U.S. Nos. 4.401.796 e 4.373.071)

[00104]A invenção também propõe ácidos nucléicos que codificam proteínas de fusão compreendendo uma proteína inédita das invenção e uma proteína selecionada, ou uma proteína marcadora selecionável.

[00105]Um outro aspecto da invenção consiste em uma célula cultivada compreendendo pelo menos um dos vetores citados acima.

[00106]Um outro aspecto da invenção consiste em um método para se preparar a buganina modificada que compreende a cultura da célula mencionada acima em condições que permitam a expressão da buganina modificada a partir do vetor de expressão e a purificação da buganina a partir da célula.

(B) Citotoxinas de Buganina Modificada:

[00107]Conforme mencionado anteriormente, a buganina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) do tipo 1, que despurina o RNA ribossômico principal de células levando à cessação da síntese de proteína e à morte celular. Como tal, as buganinas modificadas da invenção podem ser usadas para se preparar citotoxinas. As citotoxinas que contém uma proteína buganina modificada são preferidas a citotoxinas contendo uma proteína buganina não modificada, uma vez que a primeira é menos imunogênica e terá uma menor probabilidade de ser destruída pelo sistema imune antes de atingir o seu alvo.

[00108]Consequentemente, a presente invenção também propõe uma citotoxina que compreende (a) uma porção direcionada ligada a (b) uma proteína buganina modificada da invenção.

[00109]O termo “proteína buganina modificada da invenção” é usado para facilitar a referência e inclui toda e qualquer proteína buganina modificada descrita no presente documento tais como as proteínas de buganina modificada descritas acima na Seção (A), assim como nas figuras e exemplos.

[00110]O termo “porção direcionada”, conforme empregado no presente, se refere a uma substância, meios ou técnica de se fornecer à proteína buganina modificada a uma célula alvo. Em uma modalidade, a porção direcionada é um anticorpo. Em uma modalidade, a porção direcionada poderia ser um lipossoma. Em uma modalidade, o lipossoma pode ser ligado a um anticorpo. Em uma outra modalidade, a porção direcionada é uma proteína capaz de direcionar uma interação de ligação específica a uma célula alvo específica. Tais porções de proteína incluem uma variedade de ligantes polipeptídicos para os quais há receptores de superfície de célula específicos e incluem, portanto, numerosas citocinas, hormônios peptídicos e polipeptídicos e outros modificadores de resposta biológica. Exemplos proeminentes incluem tais proteínas como o fator de crescimento epitelial vascular, fator de crescimento epidérmico, heregulina, as interleucinas, interferons, fator de necrose de tumor e outras moléculas de proteína e de glicoproteína. As proteínas de fusão destas e de outras moléculas com buganina da presente invenção podem ser contempladas e podem compreender a porção buganina modificada tanto na orientação de terminal N como de terminal C no tocante ao domínio de ligante à proteína. A porção direcionada pode ser ligada diretamente às proteínas da invenção ou através de um linker. Em uma modalidade, o linker é um linker peptídico ou um linker químico. Do mesmo modo, pode ser contemplada a reticulação química do ligante purificado à proteína buganina modificada e incide no âmbito da presente invenção.

[00111]Em uma modalidade preferida, a presente invenção propõe uma citotoxina que compreende (a) um ligante que se liga a uma célula cancerosa ligado a; (b) uma proteína buganina modificada da invenção.

[00112]O ligante pode ser qualquer molécula que possa se ligar a uma célula cancerosa incluindo, sem limitação, proteínas. Em uma modalidade, o ligante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que reconhece a superfície de uma célula cancerosa.

[00113]Consequentemente, as citotoxinas da presente invenção podem ser usadas para o tratamento de diversas formas de câncer tais como câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e não de célula pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

[00114]Em uma modalidade, o ligante que se liga à célula cancerosa compreende uma molécula de imunoglobulina completa que se liga à célula cancerosa. Quando um ligante que se liga à célula cancerosa é um anticorpo ou fragmento seu, a citotoxina pode ser denominada imunotoxina. Em uma outra modalidade, o ligante que se liga à célula cancerosa é um dímero de fragmentos de anticorpo de domínio único Fab, Fab’, scFv ou fragmentos Fv estabilizados por dissulfeto. Em uma outra modalidade, o anticorpo a câncer compreende um fragmento de anticorpo de cadeia pesada variável, de cadeia variável leve, Fab, Fab’, scFv, de domínio único, ou fragmento Fv estabilizado por dissulfeto. Porções do ligante que se liga à célula cancerosa podem ser derivadas de uma ou mais espécies, de preferência compreendendo porções derivadas das espécies humanas, sendo mais preferível completamente humanas ou humanizadas. As regiões projetadas para facilitar a purificação ou para a conjugação à toxina podem também ser incluídas na porção de ligação a célula cancerosa ou ser acrescentada a ela.

[00115]Em uma modalidade específica, o ligante que se liga à célula cancerosa reconhece Ep-CAM. Ep-CAM (Molécula de Adesão a Célula Epitelial, que é também conhecida com 17-1A, KSA, EGP-2 e GA733-2) é uma proteína de transmembrana que tem uma expressão extremamente alta em muitos tumores sólidos, inclusive em carcinomas do pulmão, da mama, do ovário, colorretal, e no carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço; mas que tem uma fraca expressão na maior parte de tecidos epiteliais normais.

[00116]Consequentemente, em uma modalidade, a invenção propõe uma citotoxina de buganina modificada direcionada a Ep-CAM que compreende (a) um ligante (tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a Ep-CAM na célula cancerosa, ligado a; (b) uma proteína buganina modificada que tem uma propensão reduzida para ativar células T em comparação com uma proteína buganina não modificada.

[00117]Em uma modalidade específica, a citotoxina compreende (a) um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo que se liga ao domínio extracelular do Ep-CAM humano e compreende sequências de região determinadora de complementaridade (CDR) derivadas de um anticorpo MOC-31 ligado a: (b) uma proteína buganina modificada que tem uma propensão reduzida para ativar células T quando comparada com uma proteína buganina não modificada.

[00118]As buganinas modificadas direcionadas a Ep-CAM, de acordo com a presente invenção, incluem, sem limitação, VB6-845 e suas variantes, outras citotoxinas que compreendem outras imunoglobulinas de cadeia simples ou dupla que se ligam seletivamente a Ep-CAM , ou suas variantes. O termo “VB6-845”, conforme empregado no presente, significa uma citotoxina que compreende uma versão Fab de um anticorpo scFv anti-Ep-CAM ligado a uma forma modificada de buganina, Bou 156 (SEQ ID NO: 13). A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos de VB6-845 é mostrada na Figura 3B (SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 15, respectivamente).

[00119]Em uma outra modalidade, o ligante que se liga à célula cancerosa reconhece um antígeno associado a tumor que é encontrado especificamente em células neoplásticas e não em células normais. Em uma modalidade preferida, o ligante é um anticorpo que se liga a antígeno associado com tumor. O anticorpo anti-antígeno associado a tumor reconhece especificamente células cancerosas provenientes de uma variedade ampla de cânceres, mas não reconhece células não cancerosas normais.

[00120]Consequentemente, em uma outra modalidade, a invenção propõe uma citotoxina que compreende (a) ligante (tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se ligada a antígeno associado a tumor na célula cancerosa ligado a; (b) uma proteína buganina modificada que tem uma propensão reduzida para ativar células T quando comparada com uma proteína buganina não modificada.

[00121]As buganinas modificadas direcionadas a antígeno associado a tumor adequadas, de acordo com a invenção, incluem, sem limitação, VB6-011 e suas variantes, outras citotoxinas que compreendem outras imunoglobulinas de cadeia simples ou dupla que se ligam seletivamente a antígeno associado a tumor ou variantes suas. O termo “VB6-011”, conforme empregado no presente, significa uma citotoxina que compreende uma versão Fab do anticorpo monoclonal humano H11 geneticamente ligado as uma forma modificada de buganina, BOU 156 (SEQ ID NO: 13). O anticorpo H11 foi obtido pela fusão de linfócitos de sangue periférico de um paciente de câncer de sexo masculino de 64 anos de idade fundido s com uma linhagem de células de mieloma humano para produzir hibridomas. O hibridoma NBGM1/H11 produz uma IgMk que foi reconstruída em um formato Fab para produzir VB6-011 (veja patente U.S. No. 6.207.153 o WO 97/4461 para detalhes sobre a preparação do hibridoma secretor de anticorpo H11). A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos de VB6-011 são mostradas na Figura 15 (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 27 respectivamente).

[00122]Em uma modalidade específica, não limitante, a citotoxina compreende VB6-845 (Figura 3B, SEQ ID NO: 16) ou VB6-011 (Figura 15, SEQ ID NO: 28). Em outras modalidades não limitantes, a citotoxina compreende uma variante de VB6-845 ou de VB6-011.

[00123]Uma variante de VB6-845 se liga ao mesmo epítopo Ep-CAM ou a um epítopo Ep-CAM substancialmente análogo que está ligado a VB6-845, e a variante pode inibir competitivamente a ligação de VB6-845 a Ep-CAM, em condições fisiológicas, pelo menos de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Uma variante de VB6-845 pode compreender a mesma buganina modificada que VB6-845, ou pode compreende uma buganina modificada diferente da invenção. Em uma outra modalidade não limitante, a citotoxina compreende uma porção que se liga a Ep-CAM compreendendo uma região variável de MOC31 ou uma variante sua. Em uma outra modalidade, a citotoxina compreende uma porção que se liga a Ep-CAM que compreende 4D5MOCB, ou uma variante sua. A ligação de qualquer uma destas citotoxinas a Ep-CAM pode ser reduzida de pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% por competição com o anticorpo MOC31 ou 4D5MOCB de referência em condições fisiológicas.

[00124]Uma variante de VB6-011 se liga ao mesmo epítopo de antígeno associado a tumor ou a um epítopo substancialmente similar de antígeno associado a tumor ao qual se liga VB6-011, e a variante pode inibir competitivamente a ligação de VB6-011 ao antígeno associado a tumor, em condições fisiológicas, de pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Uma variante de VB6-011 pode compreender a mesma buganina modificada que VB6-011, ou pode compreender uma buganina modificada diferente da invenção. Em uma outra modalidade não limitante, a citotoxina compreende uma porção que se liga a antígeno associado a tumor que compreende o anticorpo monoclonal H11, fragmentos que se ligam a antígeno H11, ou variantes suas. A ligação de qualquer uma destas citotoxinas a VB6-011 pode ser reduzida de pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% por competição com o anticorpo H11 de referência em condições fisiológicas.

[00125]Em uma modalidade preferida, a afinidade de ligação da porção que se liga a Ep-CAM da porção de ligação a antígeno associado a tumor é de pelo menos quatro ordens de magnitude, de preferência de pelo menos três ordens de magnitude, sendo mais preferível menos de duas ordens de magnitude da afinidade de ligação de VB6-845 ou VB6-011 respectivamente, conforme medidas por técnicas laboratoriais padrão. Em modalidades não limitantes, a porção que se liga a Ep-CAM pode bloquear competitivamente a ligação de um anticorpo anti-Ep-CAM conhecido, tal como, sem limitação, PANOREX® ou MT201, a Ep-CAM , em condições fisiológicas, de pelo menos 0,1%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Em modalidades não limitantes, a porção que se liga a antígeno associado a tumor pode bloquear de modo competitivo a ligação de um anticorpo anti-antígeno associado a tumor conhecido, tal como, sem limitação, H11, a antígeno associado a tumor, em condições fisiológicas, de pelo menos 0,l%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.

[00126]Os versados na técnica observarão que os resíduos que determinam a especificidade podem ser identificados. O termo “resíduo que determina a especificidade” também conhecido como “SDR” se refere a um resíduo que faz parte do parátopo de um anticorpo, especialmente resíduos de CDR, cuja substituição individual por alanina, independentemente de qualquer outra mutação, reduz a afinidade do anticorpo para o epítopo de um fator de pelo menos 10, de preferência de um fator de pelo menos 100, sendo mais preferível de um fator de pelo menos 1000. Esta perda de afinidade acentua a importância desse resíduo na capacidade do anticorpo de se ligar ao epítopo. Veja, por exemplo, Tamura et al., 2000, “Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immmunogenic antibody variant and retention of SDRs only,” J. Immunol. 164(3): 1532-1441.

[00127]Os efeitos de mutações simples ou múltiplas sobre a atividade de ligação, especialmente sobre a afinidade de ligação, podem ser avaliados simultaneamente para se avaliar a importância de uma série específica de aminoácidos na interação de ligação (a contribuição de CDR2 de cadeia leve ou pesada para a ligação, por exemplo). Os efeitos de uma mutação de aminoácido podem também ser avaliados em sequência para se avaliar a contribuição de um único aminoácido quando avaliado individualmente. Tais avaliações podem ser conduzidas, por exemplo, por varredura de saturação in vitro (veja, por exemplo, patente U.S. No. 6.180.341; Hilton et al., 1966, “Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor”, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708) e mutagênese direcionada a sítio (veja, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, “High- resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis”, Science 244: 1081-1085; Bass et al., 1991, “A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502). Na técnica de mutagênese por varredura de alanina, são introduzidas mutações únicas de alanina em resíduos múltiplos na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica para identificar os resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula.

[00128]Os sítios de ligante-receptor ou de outra interação biológica podem também ser identificados por análise física da estrutura conforme determinado, por exemplo, por ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou rotulação de foto-afinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo (veja, por exemplo, de Vos et al., 1992, “Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex”, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, “Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein” J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, “Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25 A resolution,” FEBS Lett. 309: 59-64). Além disso, a importância de aminoácidos individuais específicos ou de uma série de aminoácidos, pode ser avaliada por comparação com a sequência de aminoácidos de polipeptídeos relacionados ou sítios de ligação análogos.

[00129]Além disso, os versados na técnica observarão que um aumento de avidez pode compensar uma afinidade de ligação inferior. A avidez de uma citotoxina por um receptor de célula cancerosa é uma medida da intensidade da ligação da porção de ligação a Ep-CAM a Ep-CAM, que tem uma multiplicidade de sítios de ligação. A intensidade de ligação funcional entre Ep-CAM e a porção que se liga a Ep-CAM representa o somatório das intensidades de todas as ligações de afinidade, e deste modo um componente individual pode ser ligar com uma afinidade relativamente baixa, mas um multímero de tais componentes pode demonstrar um efeito biológico potente. Na verdade, a multiplicidade de interações entre os sítios de ligação a Ep-CAM e os epítopos de Ep- CAM pode apresentar um efeito biológico muito maior do que o aditivo, isto é, a vantagem da multivalência pode ser de muitas ordens de grandeza em relação à constante de equilíbrio.

[00130]De modo análogo, a avidez de uma citotoxina para um receptor de célula cancerosa é uma medida da intensidade da ligação da porção de ligação a antígeno associado a tumor ao antígeno associado a tumor, que pode ter uma multiplicidade de sítios de ligação. A intensidade de ligação funcional entre o antígeno associado a tumor e a porção de ligação a antígeno associado a tumor representa o somatório das intensidades de todas as ligações de afinidade, e, portanto, um componente individual pode se ligar com uma afinidade relativamente baixa, mas um multímero de tais componentes pode apresentar um efeito biológico potente. Na verdade, as interações múltiplas entre os sítios de ligação a antígeno associado a tumor e os epítopos de antígeno associado a tumor podem apresentar um efeito biológico muito maior do que o aditivo, isto é, a vantagem de multivalência pode ser de muitas ordens de grandeza em relação à constante de equilíbrio.

[00131]Em uma modalidade não limitante, a porção que se liga a Ep-CAM tem uma estrutura substancialmente análoga à de 4D5MOCB. A estrutura substancialmente análoga pode ser caracterizada por referência aos mapas de epítopo que refletem os pontos de ligação da porção da citotoxina que se liga a Ep-CAM a uma molécula de Ep- CAM. Em uma outra modalidade não limitante, os mapas de epítopo podem ser gerados para a porção que se liga a antígeno associado a tumor e uma estrutura substancialmente análoga pode ser caracterizada por referência a mapas de epítopos que refletem os pontos de ligação da porção de ligação a antígeno associado a tumor da citotoxina a uma molécula de antígeno associado a tumor.

[00132]As citotoxinas da presente invenção podem ser preparadas por sínteses químicas usando-se técnicas conhecidas na química de proteínas tal como a síntese de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154 (1964)) ou síntese em solução homogênea (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I e II, Thieme, Stuttgart (1987)). Em uma modalidade, o ligante que se liga a câncer e a buganina modificada são ambos proteínas e podem ser conjugados usando-se técnicas bem conhecidas na técnica. Há diversas centenas de reticuladores disponíveis que podem conjugar duas proteínas. (Veja, por exemplo, “Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking”. 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). O reticulador é geralmente selecionado com base nos grupos funcionais reativos disponíveis ou inseridos no ligante ou na toxina. Além disso, se não houver nenhum grupo reativo pode ser usado um reticulador foto-ativável. Em determinados casos, pode ser desejável se incluir um espaçador entre o ligante e a toxina. Os agentes reticuladores conhecidos na técnica incluem os agentes homo-bifuncionais: aldeído glutárico, dimetil adipimidato e Bis(diazobenzidina) e os agentes hetero-bifuncionais: m Maleimido benzoil-N-hidróxi succinimida e Sulfo-m Maleimido benzoil-N-hidróxi succinimida.

[00133]Uma proteína de fusão de ligante-toxina de buganina pode também ser preparado usando-se técnicas de DNA recombinante. Em tal caso, uma sequência de DNA que codifica o ligante que se liga a câncer é fundida a uma sequência de DNA que codifica a proteína buganina modificada, resultando em uma molécula de DNA quimérico. A sequência de DNA quimérico é transfectada para uma célula hospedeira que expressa a proteína de fusão de ligante-buganina. A proteína de fusão pode ser recuperada da cultura celular e purificada usando-se técnicas conhecidas na técnica.

[00134]Os anticorpos que têm especificidade para proteínas de superfície celular tais como Ep-CAM e antígeno associado a tumor podem ser preparados por métodos convencionais. Um mamífero (um camundongo, hamster, ou coelho, por exemplo) pode ser imunizado com uma forma imunogênica do peptídeo que obtém uma resposta de anticorpos no mamífero. As técnicas para se conferir imunogenicidade em um peptídeo incluem a conjugação a veículos ou a outras técnicas conhecidas na técnica. O peptídeo pode ser administrado na presença de um adjuvante, por exemplo. O progresso da imunização pode ser monitorado por detecção de títulos de anticorpos no plasma ou no soro. Os procedimentos ELISA ou outros imunoensaios padrão podem ser usados com o imunógeno como antígeno para se avaliar os níveis de anticorpos. Depois da imunização, pode se obter anti-soros, e, se for desejado, pode se isolar anticorpos policlonais dos soros.

[00135]Para se produzir anticorpos monoclonais, as células produtoras de anticorpos (linfócitos) podem ser coletadas de um animal imunizado e ser fundidas com células de mieloma por procedimentos padrão de fusão somática de células, imortalizando assim estas células e produzindo células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na técnica (a técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) assim como outras técnicas tais como a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), a técnica de EBV-hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., páginas 77-96 (1985)), e triagem de bibliotecas combinatórias de anticorpos (Huse et al., Science 246: 1275 (1989)). As células de hibridoma podem ser testadas imuno-quimicamente para a produção de anticorpos especificamente reativos com o peptídeo e os anticorpos monoclonais podem ser isolados.

[00136]O termo “anticorpo”, conforme empregado no presente, se destina a incluir anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (Fab e F(ab’)2, por exemplo, e anticorpos de uma única cadeia (scFv)), e anticorpos quiméricos que também reagem especificamente com um componente de superfície celular. Os anticorpos podem ser fragmentados usando-se técnicas convencionais e os fragmentos podem ser testados por utilidade do mesmo modo que foi descrito acima. Os fragmentos F(ab’)2, por exemplo, podem ser gerados por tratamento de anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab’)2 resultante pode ser tratado para reduzir pontes dissulfeto para produzir fragmentos Fab’. Os anticorpos de uma única cadeia combinam regiões que se ligam a antígeno de um anticorpo em uma cadeia de polipeptídeo única estavelmente dobrada. Os anticorpos de uma única cadeia podem ser gerados por tecnologia recombinante.

[00137]Os derivados de anticorpos quiméricos, isto é, moléculas de anticorpo que combinam uma região variável de animal não humano com uma região constante humana são também contemplados como incidindo no âmbito da invenção. As moléculas de anticorpo quimérico podem incluir, por exemplo, o domínio de ligação a antígeno proveniente de um anticorpo de um camundongo, rato ou de outra espécie com regiões constantes humanas. Podem ser usados métodos convencionais para se produzir anticorpos quiméricos contendo a região variável de imunoglobulina que reconhece um antígeno de superfície celular (Veja, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851(1985); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985), Cabilly et al., patente U.S. No. 4.816.567; Boss et al., patente U.S. No. 4.816.397; Tanaguchi et al., patente E.P. No. 171.496; patente européia No. 173.494, patente do Reino Unido No. GB2177096B). Espera-se que os anticorpos quiméricos sejam menos imunogênicos em um paciente humano do que o anticorpo correspondente não quimérico. Os anticorpos quiméricos podem ser estabilizados pelo método descrito em Pluckthun et al., WO 00/61635.

[00138]Os anticorpos monoclonais ou quiméricos que reagem especificamente contra componentes da superfície celular podem ser ainda mais humanizados por produção de quimeras de regiões humanas constantes, em que partes das regiões variáveis, especialmente regiões de estrutura conservada do domínio que se liga a antígeno, são de origem humana e somente as regiões hipervariáveis são de origem não humana. Tais moléculas de imunoglobulina podem ser produzidas por técnicas conhecidas na técnica, (Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312(1983); Kozbor et al., Immunology Today 4: 7279(1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16(1982), e publicação PCT WO92/06193 ou EP 239.400). Os anticorpos humanizados podem também ser produzidos comercialmente (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Grâ-Bretanha.) Além disso, pode se tornar os anticorpos monoclonais ou quiméricos que reagem especificamente contra componentes da superfície celular menos imunogênicos, reduzindo-se o número de seus epítopos potenciais de células T.

[00139]Anticorpos específicos, ou fragmentos destes anticorpos, que reagem contra componentes da superfície celular podem também ser gerados triando-se bibliotecas de expressão que codificam genes de imunoglobulina, ou porções deles, expressos em bactérias com componentes de superfície celular. Fragmentos Fab completos, regiões VH e regiões Fv, por exemplo, podem ser expressas em bactérias, usando-se bibliotecas de expressão de fagos. (Veja, por exemplo, Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); Hué et al., Science 246: 1275-1281 (1989); e McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)). Alternativamente, um camundongo SCID-hu, por exemplo, o modelo desenvolvido por Genpharm, pode ser usado para produzir anticorpos, ou fragmentos seus.

[00140]Em todos os casos em que uma proteína buganina modificada é produzida em fusão com uma sequência de anticorpo, é extremamente desejável se utilizar sequências de anticorpo em que tenham sido removidos os epítopos de célula T ou sequências capazes de se ligar a moléculas de MHC de classe II ou de estimular células T ou de se ligar a células T em associação com moléculas de MHC de classe II.

[00141]Uma outra modalidade da presente invenção, a proteína buganina modificada pode ser ligada a uma proteína que não é anticorpo, mas que é uma proteína capaz de direcionar uma interação de ligação específica a uma célula alvo específica. Tais porções protéicas incluem uma variedade de ligantes de polipeptídeos para os quais há receptores de superfície celular específicos e incluem, portanto, numerosas citocinas, hormônios peptídicos e polipeptídicos e outros modificadores de resposta biológica. Exemplos proeminentes incluem tais proteínas como fator de crescimento epitelial vascular, fator de crescimento epidérmico, heregulina, as interleucinas, interferons, fator de necrose de tumor e outras moléculas de proteína e de glicoproteína. As proteínas de fusão destas e de outras moléculas com buganina da presente invenção podem ser contempladas e podem compreender uma porção buganina modificada ou na orientação de terminal N ou terminal C em relação ao domínio de ligante de proteína. Do mesmo modo, pode ser contemplada a reticulação química do ligante purificado à proteína buganina modificada e incide no âmbito da presente invenção.

[00142]Em uma outra modalidade, a proteína buganina modificada da presente invenção pode ser usada como um complexo contendo um polímero hidrossolúvel tal como hidroxipropil-metacrilamida ou outros polímeros em que a proteína buganina modificada está em uma ligação covalente ao polímero ou em uma interação de ligação não covalente ao polímero. Tal modalidade pode ainda incluir um domínio de ligação a antígeno tal como um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo em combinação com o complexo polímero-buganina.

(C) Usos das Citotoxinas

[00143]As proteínas de buganina modificada da invenção podem ser usadas para inibir ou destruir especificamente células de mamíferos afetadas por câncer. É uma vantagem das citotoxinas da invenção o fato delas terem uma imunogenicidade menor, permitindo que RIP entre na célula e destrua efetivamente a célula cancerosa. Assim, a citotoxina pode ser usada para atingir especificamente células cancerosas. A buganina, uma vez no interior da célula cancerosa, despurina o RNA ribossômico principal, danificando assim os ribossomos e levando a uma cessação da síntese de proteínas e à morte celular.

[00144]Consequentemente, em uma modalidade a invenção propõe um método de inibição ou destruição de uma célula cancerosa que compreende a administração de uma citotoxina da invenção a um animal que tenha necessidade dela. A presente invenção também inclui o uso de uma citotoxina da invenção para inibir ou destruir uma célula cancerosa. A presente invenção inclui ainda um uso de uma citotoxina da invenção na fabricação de um medicamento para inibir ou destruir uma célula cancerosa. O tipo de células cancerosas que são inibidas ou destruídas por uma citotoxina será determinado pela especificada do antígeno ou da sua porção anticorpo.

[00145]Em uma outra modalidade, a invenção propõe um método de inibição ou de destruição de células cancerosas que compreende as etapas de se preparar uma citotoxina da invenção e de se administrar a citotoxina às células. O câncer pode ser qualquer tipo de câncer, incluindo, sem limitação, câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer renal, melanomas, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e não de célula pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

[00146]A capacidade das citotoxinas da invenção para seletivamente inibir ou destruir as células cancerosas animais pode ser facilmente testada in vitro usando-se linhagens de células cancerosas de animais. O efeito inibidor seletivo das citotoxinas da invenção pode ser determinado, por exemplo, demonstrando-se a inibição seletiva da proliferação celular em células cancerosas.

[00147]A toxicidade pode ser medida com base na viabilidade das células, podendo-se comparar a viabilidade de culturas de células normais e cancerosas expostas as citotoxinas, por exemplo. A viabilidade das células pode ser avaliada por técnicas conhecidas tal como por ensaios de exclusão de azul de tripano.

[00148]Em um outro exemplo, pode ser usada uma série de modelos para se testar a citotoxicidade das citotoxinas. Thomson, E.W. et al. (Breast Cancer Res. Treatment 31: 357-370 (1994)) descreveu um modelo para a determinação do caráter invasivo de células cancerosas do câncer da mama humano in vitro medindo-se a proteólise mediada por células do tumor da matriz extracelular e a invasão da membrana basal reconstituída por células tumorais (colágeno, laminina, fibronectina, Matrigel ou gelatina). Outros modelos aplicáveis de células cancerosas incluem células de adenocarcinoma ovariano cultivadas (Young, T.N. et al. Gynecol. Oncol. 62: 89-99 (1996); Moore, D. H. et al., Gynecol. Oncol. 65: 78-82 (1997)), Human follicular thyroid cancer cells (Demeure, M.J. et al., World J. Surg. 16: 770-776(1992)), linhagens de células de melanoma humano (A-2058) e de fibrossarcoma (HT-1080) (Mackay, A.R. et al. Lab. Invest. 70: 781-783(1994)), e linhagens de células escamosas do pulmão (HS-24) e de adenossarcoma (SB-3) (Spiess, E. et al. J. Histochem. Cytochem. 42: 917-929(1994)). Um sistema de teste in vivo, envolvendo a implantação de tumores e a medição do crescimento do tumor e a metástase em camundongos atímicos nus já foi também descrito (Thompson, E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31: 357-370 (1994); Shi, Y.E. et al., Cancer Res. 53: 1409-1415 (1993)).

[00149]A presente invenção também se refere a um método de tratamento de câncer que compreende a administração de uma quantidade efetiva de uma ou mais citotoxinas da presente invenção a um animal que tenha necessidade delas. A invenção inclui um uso de uma citotoxina da invenção para o tratamento de câncer. A invenção inclui ainda um uso de uma citotoxina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[00150]O termo “animal” inclui todos os membros do reino animal, incluindo seres humanos.

[00151]O termo “tratamento de câncer” ou “tratar câncer” se refere à inibição de replicação de células cancerosas, inibição da disseminação do câncer (metástase), inibição do crescimento do tumor, redução do número de células cancerosas ou do crescimento do tumor, redução na categoria maligna de um câncer ou a melhora de sintomas relacionados com câncer.

[00152]Em uma modalidade preferida, o animal é um ser humano. Em uma outra modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer renal, melanomas, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e não de célula pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

[00153]Os resultados clínicos dos tratamentos do câncer usando-se uma citotoxina da invenção são facilmente discerníveis pelos versados na técnica, tal como um clínico. Os testes médicos padrão para medir marcadores clínicos de câncer, por exemplo, podem ser fortes indicadores da eficácia do tratamento. Tais testes podem incluir, sem limitação, exame físico, balanças de desempenho, marcadores de doença, ECG de 12-guias, medições de tumor, biópsia tecidual, citoscopia, citologia, diâmetro mais longo dos cálculos de tumor, radiografia, imageamento digital do tumor, sinais vitais, peso, registro de eventos adversos, avaliação de episódios infecciosos, avaliação de medicações concomitantes, avaliação de dor, química do sangue ou do soro, urinálise, tomografia computadorizada, e análise farmacocinética. Além disso, podem se determinar os efeitos sinérgicos de uma terapia de combinação que compreende a citotoxina e um outro produto terapêutico anticancerígeno, por estudos comparativos com pacientes que estejam submetidos a monoterapia.

[00154]A remissão de tumores malignos pode ser avaliada usando-se critérios aceitos pelos versados na técnica. Veja, por exemplo, Therasse et al., 2000, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada”, J. Natl. Cancer Inst. 2 de fev; 92 (3): 205-16.

[00155]A dose efetiva de uma construção de citotoxina específica pode depender de diversos fatores, inclusive do tipo do câncer, do tamanho do tumor, do estágio do câncer, da toxicidade da citotoxina ao paciente, da especificidade de direcionamento a células cancerosas, assim como da idade, peso, e saúde do paciente.

[00156]As citotoxinas que compreendem a buganina modificada podem ser administradas por infusão i.v. durante um período de minutos a horas, dependendo da dose e da concentração da citotoxina no produto infundido.

[00157]Em uma modalidade, a citotoxina é infundida durante um período de 3 horas.

[00158]Em uma modalidade, a dose efetiva por administração i.v. da citotoxina pode variar de aproximadamente 1 a 100 mg/kg/dose. Em outras modalidades, a dose pode variar de aproximadamente 2 a 50 mg/kg/dose. Em modalidades específicas, a dose pode ser de aproximadamente 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 mg/kg/dose.

[00159]Em uma modalidade, a dose única é administrada aproximadamente toda semana, durante um período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas. A dose única pode ser administrada em semanas consecutivas ou, alternativamente, pode-se saltar uma ou mais semanas. Depois deste ciclo, um ciclo subsequente pode se iniciar aproximadamente 1, 2, 4, 6 ou 12 semanas mais tarde. O regime de tratamento pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais ciclos, sendo cada ciclo espaçado do outro de aproximadamente 1, 2, 4, 6 ou 12 semanas.

[00160]Em uma outra modalidade, a dose única é administrada todo mês durante um período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses consecutivos. Depois deste ciclo, um ciclo subsequente pode começar aproximadamente 1, 2, 4, 6, ou 12 meses mais tarde. O regime de tratamento pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais ciclos, sendo cada ciclo espaçado do outro de aproximadamente 1, 2, 4, 6 ou 12 meses.

[00161]Em uma modalidade específica não limitante, a dose efetiva da citotoxina varia de 1 a 50 mg/kg/tumor/dia, sendo administrado ao paciente uma única dose por dia. A dose única é administrada aproximadamente todo dia (opcionalmente pode-se saltar um ou mais dias) durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias consecutivos. Depois deste ciclo, um ciclo subsequente pode se iniciar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas mais tarde. O regime de tratamento pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais ciclos, sendo cada ciclo espaçado do outro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas.

[00162]O volume de injeção é de preferência de pelo menos uma quantidade efetiva, que é adequada ao tipo e/ou localização do tumor. O volume máximo de injeção em uma única dose pode estar entre aproximadamente 25% e 75% do volume do tumor, de aproximadamente um quarto, um terço ou três quartos do volume estimado do tumor alvo, por exemplo. Em uma modalidade específica não limitante, o volume máximo de injeção em uma única dose é de aproximadamente 30% do volume do tumor.

[00163]Em uma outra modalidade, a citotoxina é infundida durante 3 horas a uma taxa de 100 cc por hora com uma célula contendo de 1 a 10 mg de citotoxina/mL. A citotoxina será diluída em uma solução adequada fisiologicamente compatível.

[00164]A dose efetiva de um outro agente terapêutico contra câncer a ser administrado juntamente com um citotoxina durante um ciclo também varia de acordo com o modo de administração. O um ou mais agentes terapêuticos contra câncer podem ser fornecidos por via intratumoral, ou por outros modos de administração. Tipicamente, os agentes quimioterapêuticos são administrados sistemicamente. A dosagem e os regimes de tratamento padrão são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, as edições mais recentes do Merck Index e do Physician’s Desk reference; NCCN Practice Guidelines in Oncology).

[00165]A terapia de combinação com uma citotoxina pode sensibilizar o câncer ou tumor para a administração de um agente terapêutico adicional contra câncer. Consequentemente, a presente invenção contempla terapias de combinação para a prevenção, tratamento e/ou prevenção de recorrência de câncer que compreende a administração de uma quantidade efetiva de uma citotoxina antes, após, ou concomitantemente com uma dose reduzida de um agente terapêutico anticancerígeno. O tratamento inicial com uma citotoxina, por exemplo, pode aumentar a sensibilidade de um câncer ou tumor ao desafio subsequente com uma dose de agente terapêutico contra câncer. Esta dose está próxima, ou abaixo, da faixa baixa de dosagens padrão quando se administra somente o agente terapêutico anticancerígeno, ou na ausência de uma citotoxina. Quando se administra concomitantemente, a citotoxina pode ser administrada separadamente do agente terapêutico anticancerígeno, e opcionalmente por um modo diferente de administração.

[00166]Em uma outra modalidade, uma citotoxina é administrada em combinação com pelo menos um outro imunoterápico.

[00167]Em uma outra modalidade, uma citotoxina é administrada em combinação com um regime de terapia de radiação. A terapia pode também compreender cirurgia e/ou quimioterapia. A citotoxina pode ser administrada, por exemplo, em combinação com terapia de radiação e cisplatina (Platinol), fluoruracila (5-FU, Adrucil), carboplatina (Paraplatin) e/ou paclitaxel (Taxol). O tratamento com a citotoxina pode permitir o uso de doses mais baixas de radiação e/ou tratamentos de radiação menos frequentes, que podem, por exemplo, reduzir a incidência de dor de garganta grave que impede a função de deglutição e que resulta potencialmente em perda de peso ou desidratação.

[00168]Em uma outra modalidade, uma citotoxina é administrada em combinação com uma ou mais citocinas que incluem, sem limitação, uma linfocina, fatores de necrose de tumor, citocina semelhante ao fator de necrose de tumor, linfotoxina, interferon, proteína inflamatória de macrófago, fator estimulador de formação de colônia de granulócitos monócitos, interleucina (incluindo, sem limitação, interleucina-1, interleucina- 2, interleucina-6, interleucina 12, interleucina-15, interleucina-18) e uma variante sua, incluindo um sal farmaceuticamente aceitável seu.

[00169]Em uma outra modalidade ainda, uma citotoxina é administrada em combinação com uma vacina contra câncer incluindo, sem limitação, células ou tecidos autólogos, células ou tecidos não autólogos, antígeno carcino-embrionário, alfa- fetoproteína, gonadotropina coriônica humana, vacina BCG viva, proteínas de linhagem de melanócitos e antígenos mutados específicos a tumor.

[00170]Em uma outra modalidade ainda, uma citotoxina é administrada em associação com terapia hormonal. Os agentes terapêuticos hormonais incluem, sem limitação, um agonista hormonal, um antagonista hormonal (flutamida, tamoxifen, acetato de leuprolide (LUPRON), por exemplo) e esteróide (dexametasona, retinóide, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, desidro testosterona, glicocorticóide, mineralocorticóide, estrogênio, testosterona, progestina).

[00171]Em uma outra modalidade ainda, uma citotoxina é administrada em associação com um programa de terapia gênica para o tratamento ou prevenção do câncer.

[00172]Em uma outra modalidade ainda, uma citotoxina direcionada a Ep-CAM é administrada em combinação com um ou mais agentes que aumentam a expressão de Ep-CAM nas células tumorais de interesse. A expressão de Ep-CAM é, de preferência, aumentada de modo tal, que um número maior de moléculas de Ep-CAM seja expresso na superfície das células tumorais. O agente pode inibir os ciclos normais de endocitose de antígeno de Ep-CAM, por exemplo. Tal tratamento de combinação pode melhorar a eficácia clínica da citotoxina direcionada a Ep-CAM somente, ou em conjunto com outros agentes terapêuticos anticancerígenos ou com terapia de radiação. Em modalidades específicas, não limitantes, o agente que aumenta a expressão de Ep-CAM nas células tumorais é tartarato de vinorelbina (Navelbine) e/ou paclitax (axol). Veja, por exemplo, Thurmond et al., 2003 “Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism”. Cancer Immunol. Immunother. Julho; 52(7): 429-37.

[00173]A terapia de combinação pode, assim, aumentar a sensibilidade do câncer ou do tumor a citotoxina administrada e/ou ao agente terapêutico anticancerígeno adicional. Deste modo podem ser possíveis ciclos de tratamento mais curtos, reduzindo- se assim os eventos tóxicos. Consequentemente, a invenção propõe um método para o tratamento ou prevenção de câncer que compreende a administração a um paciente que tenha necessidade dele, de uma quantidade efetiva de uma citotoxina e de pelo menos um outro agente terapêutico anticancerígeno durante um ciclo de tratamento curto. A duração do ciclo pode variar de acordo com o agente terapêutico anticancerígeno específico. A invenção também contempla a administração contínua ou descontínua, ou então doses diárias divididas em diversas administrações parciais. Uma duração de ciclo apropriada para um agente terapêutico anticancerígeno específico será do conhecimento dos versados na técnica, e a invenção contempla a avaliação contínua de programas de tratamento ótimos para cada agente terapêutico anticancerígeno. Diretrizes específicas para os versados na técnica são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Therasse et al., 2000, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National cancer Institute of Canada”, J. Natl. Cancer Inst. 2 de fev; 92(3): 205-16.

[00174]Alternativamente, podem ser desejados ciclos de tratamento mais longos. Consequentemente, a duração do ciclo pode variar de aproximadamente 10 a 56, de 12 a 48, de 14 a 28, de 16 a 24 ou de 18 a 20 dias. A duração do ciclo pode variar de acordo com o agente terapêutico anticancerígeno específico em uso.

[00175]A presente invenção contempla pelo menos um ciclo, de preferência mais de um ciclo durante o qual um único agente terapêutico anticancerígeno ou uma série deles é administrado. Um número total adequado de ciclos e o intervalo entre os ciclos será do conhecimento dos versados na técnica. O número de ciclos pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou 21 ciclos. O intervalo entre os ciclos pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 dias. A invenção contempla a avaliação contínua de programas de tratamento ótimo para cada citotoxina e cada agente terapêutico anticancerígeno adicional.

[00176]Em uma outra modalidade, é proposto um processo para a preparação de um produto farmacêutico para o tratamento de um mamífero portador de câncer que compreende as etapas de se identificar os epítopos de células T de buganina que tem uma propensão reduzida para células T ativadas; preparação de uma citotoxina da invenção que tem um ou mais dos epítopos de células T e suspensão da proteína em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00177]A invenção também propõe uma composição farmacêutica para o tratamento de um mamífero com câncer que compreende uma citotoxina da invenção e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00178]As citotoxinas da invenção podem ser formuladas em composições farmacêuticas para administração a pacientes em uma forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. “Forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo” significa uma forma da substância a ser administrada em que qualquer efeito tóxico é superado pelos efeitos terapêuticos. As substâncias podem ser administradas a organismos vivos incluindo seres humanos e animais. A administração de uma quantidade terapeuticamente ativa das composições farmacêuticas da presente invenção é definida como uma quantidade efetiva a dosagens e durante períodos de tempo necessários para atingir o resultado desejado: Uma quantidade terapeuticamente ativa de uma substância, por exemplo, pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e capacidade do anticorpo de obter uma resposta desejada no indivíduo. O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ótima. Diversas doses divididas, por exemplo, podem ser administradas diariamente ou então a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

[00179]A substância ativa pode ser administrada de um modo conveniente tal como por injeção (subcutânea, intravenosa, intramuscular etc.), administração oral, inalação, administração transdérmica (tal como em forma de creme ou unguento tópico etc.) ou aplicações de supositórios. Dependendo da via de administração, a substância ativa pode ser revestida por um material para proteger o composto da ação de enzimas, de ácidos e contra outras condições naturais que possam inativar o composto.

[00180]As composições descritas no presente documento podem ser preparadas por métodos conhecidos por si para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que podem ser administradas a pacientes, de modo tal, que uma quantidade efetiva da substância ativa seja combinada em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Com base nisso, as composições incluem, embora não exclusivamente, soluções das substâncias em associação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes e são contidas em soluções tamponadas com um pH adequado e isoosmóticas com os fluidos fisiológicos.

[00181]As composições farmacêuticas podem ser usadas em métodos para o tratamento de animais, incluindo mamíferos, de preferência seres humanos, portadores de câncer. Prevê-se que as composições serão especialmente úteis para o tratamento de pacientes com câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e não de célula pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B. A dosagem e o tipo de citotoxina a ser administrada dependerão de uma variedade de fatores que podem ser facilmente monitorados em pacientes humanos. Tais fatores incluem a etiologia e a gravidade (categoria e estágio) de neoplasia.

[00182]As composições farmacêuticas adaptadas para a administração direta incluem, sem limitação, pós liofilizados ou soluções ou suspensões injetáveis estéreis aquosas ou não aquosas que podem ainda conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam as composições substancialmente isotônicas com o sangue de um receptor destinado. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As soluções e suspensões para injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis. A citotoxina pode ser fornecida, por exemplo, mas não como limitação, em forma de um pó liofilizado que é reconstituído com água estéril ou solução salina antes da administração ao paciente.

[00183]As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem composições essencialmente quimicamente inertes e não tóxicas que não interferem na eficácia da atividade biológica da composição farmacêutica. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, sem limitação, água, soluções salinas, soluções de glicerol etanol, cloreto de N-(1(2,3-dioleilóxi)propil)N,N,N- trimetil amônio (DOTMA), diolesil fosfotidil etanolamina (DOPE) e lipossomos. Tais composições devem conter uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto, juntamente com uma quantidade adequada de veículo, de modo a proporcionar a forma para a administração dieta ao paciente.

[00184]Em uma outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma citotoxina e um ou mais agentes terapêuticos anticancerígenos adicionais, opcionalmente em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00185]A composição pode se encontra na forma de um sal farmaceuticamente aceitável que inclui, sem limitação, aqueles formados com grupos amino livres, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico e os formados com grupos carboxila livres tais como os derivados de hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[00186]Na medida em que esta invenção se refere a buganina modificada, as composições contendo tais proteínas de buganina modificada ou fragmentos de proteínas de buganina modificada e composições correlatas devem ser consideradas como incidindo no âmbito da invenção. Um exemplo pertinente neste sentido poderia ser o desenvolvimento de estratégias de indução de tolerância mediada por peptídeo em que um ou mais dos peptídeos descritos é administrado a um paciente com uma intenção imunoterapêutica. Consequentemente, as moléculas de peptídeos sintéticos, por exemplo, uma ou mais daqueles que compreendem ta totalidade ou parte de qualquer uma das regiões de epítopos R1 - R3 conforme definido acima. Tais peptídeos são considerados modalidades da invenção.

[00187]Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a métodos para o tratamento terapêutico de seres humanos usando as composições de buganina modificada. Para a administração a um individuo, qualquer uma das composições modificadas seria produzida para ter de preferência, um grau de pureza de 80% e ser isenta de pirógenos e de outros contaminantes.

[00188]A presente invenção também propõe um kit que compreende uma quantidade efetiva de uma citotoxina, opcionalmente em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos anticancerígenos, juntamente com instruções para o seu uso para o tratamento do câncer. (D) Peptídeos de epítopo de célula T

[00189]Uma modalidade adicional da invenção consiste em um peptídeo de epítopo de célula T. Em um exemplo, o peptídeo de epítopo de célula T é capaz de obter um índice de estimulação acima de 1,8 em um ensaio de célula T, sendo mais preferível acima de 2,0. O peptídeo de epítopo de célula T da invenção é capaz de se ligar a MHC de classe II.

[00190]Em uma modalidade da invenção, o peptídeo de epítopo de célula T compreende pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos provenientes de qualquer uma das sequências de R1, R2 ou R3 (acima). Em uma outra modalidade, a sequência de peptídeo de epítopo de célula T tem uma identidade de aminoácidos acima de 90% com qualquer um das sequências de peptídeo R1, R2 ou R3; sendo mais preferível que o peptídeo de epítopo de célula T tenha uma identidade de aminoácidos de mais de 80% com qualquer uma das sequências de peptídeo R1, R2 ou R3.

[00191]O termo “peptídeo”, conforme empregado no presente, é um composto que inclui dois ou mais aminoácidos. Os aminoácidos são ligados entre si por uma ligação peptídica (definida no presente abaixo). Há 20 aminoácidos diferentes de ocorrência natural envolvidos na produção biológica de peptídeos, e qualquer número deles pode ser ligado em qualquer ordem para formar uma cadeia ou anel peptídico. Os aminoácidos de ocorrência natural empregados na produção biológica de peptídeos têm todos as configuração L. Os peptídeos sintéticos podem ser preparados empregando-se métodos sintéticos convencionais, utilizando-se L-aminoácidos, D-aminoácidos ou diversas combinações de aminoácidos das duas configurações diferentes. Alguns peptídeos contêm somente algumas unidades de aminoácidos. Os peptídeos curtos, tais com os que têm menos de dez unidades de aminoácidos, são às vezes denominados “oligopeptídeos”. Outros peptídeos contêm um grande número de resíduos de aminoácidos, até 100 ou mais, por exemplo, e são denominados “polipeptídeos”. Por convenção, um “polipeptídeo” pode ser considerada qualquer cadeia peptídica contendo três ou mais aminoácidos, ao passo que um “oligopeptídeo” é geralmente considerado como um tipo especial de polipeptídeo “curto”. Assim, conforme empregado no presente, fica subentendido que qualquer referência a um “polipeptídeo” também inclui um oligopeptídeo. Além disso, qualquer referência a um “peptídeo” inclui polipeptídeos, oligopeptídeos e proteínas. Cada arranjo diferente de aminoácidos forma polipeptídeos ou proteínas diferentes. O número de polipeptídeos - e, portanto, o número de proteínas diferentes - que podem ser formados é praticamente ilimitado.

[00192]Uma outra modalidade da invenção consiste no uso dos peptídeos de epítopo de célula T da invenção para produzir as proteínas de buganina modificada da invenção e peptídeos de epítopo de célula T modificados.

[00193]Uma outra modalidade da invenção consiste em um peptídeo de epítopo de célula T modificado que é modificado de modo tal, que o peptídeo de epítopo de célula T modificado tem uma propensão reduzida para ativar células T humanas do que o peptídeo de epítopo de célula T que não foi modificado. Em um exemplo, os peptídeos de epítopo de célula T modificados da invenção contêm modificações tais, que, quando eles forem testados em um ensaio de célula T, obtém-se um índice de estimulação reduzido em comparação com o peptídeo de epítopo de célula T que não foi modificado.

[00194]Em uma modalidade da invenção, o peptídeo de epítopo de célula T modificado tem a seguinte sequência: AKX1DRKX2LX3LGVX4KL

[00195]em que pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 é modificado a partir da sequência não modificada, do seguinte modo: X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; e X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO: 8).

[00196]Em uma outra modalidade da invenção o peptídeo de epítopo de célula T modificado tem a seguinte sequência: LGVX4KLEFSIEAIHG em que X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO: 9)

[00197]Em uma outra modalidade da invenção, o peptídeo de epítopo de célula T modificado tem a seguinte sequência: NGQEX5AKFFLIVIQM em que X5 é Q ou A (SEQ ID NO: 10).

[00198]A invenção também propõe moléculas de ácido nucléico que codificam os peptídeos de epítopos de células T ou peptídeos de epítopos de células T modificados da presente invenção.

[00199]As figuras, listas de sequências e exemplos a seguir são dados para auxiliar na compreensão da presente invenção. Deve ficar subentendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem que haja desvio do espírito da invenção.

[00200]Os exemplos não limitantes a seguir são ilustrativos da presente invenção: EXEMPLOS

Exemplo 1: Método de mapeamento de epítopos em buganina usando-se ensaios de proliferação de células T humanas pré-imunes

[00201]Foram sintetizados peptídeos que cobrem a sequência da proteína buganina madura, conforme descrito por Den Hartog et al. [ibid]. O comprimento de cada peptídeo é de 15 aminoácidos e peptídeos sucessivos se sobrepõem com 12 resíduos. A sequência destes peptídeos e a sua numeração são indicadas na TABELA 1.

[00202]Os peptídeos foram usados em ensaios de proliferação de células T com PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) provenientes de doadores pré- imunes (isto é, nenhuma sensibilização conhecida a buganina). PBMC de 20 doadores foram selecionadas para se obter uma cobertura ótima de alótipos de MHC de classe II. A cobertura alotípica é superior a 85%. Os alótipos de HLA-DR são apresentados na TABELA 2.

[00203]As PBMCs foram estimuladas com peptídeos individuais em culturas em triplicata durante 7 dias antes da proliferação ser avaliada por incorporação de 3H-timidina (3H-Thy). Todos os peptídeos forma testados a duas concentrações diferentes (1 μM e 5 μM). Os índices de estimulação (S.I.) foram calculados como a quantidade de 3H incorporado, dividida pela quantidade de 3H incorporado em células de controle com estimulação simulada.

[00204]As camadas leucocitárias provenientes de sangue humano armazenadas durante menos de 12 horas foram obtidas do National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, Reino Unido). Ficoll-paque foi obtido de Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, Reino Unido). O meio AIM V isento de soro para a cultura dos linfócitos humanos primários e contendo L-glutamina, 50 μg/mL de estreptomicina, 10 μg/mL de gentamicina e 0,1% de albumina sérica humana foi obtido de Gibco-BRL (Paisley, Reino Unido). Os peptídeos sintéticos foram obtidos de Eurosequence (Groningen, Países Baixos) e Babraham Technix (Cambridge, Reino Unido).

[00205]Os eritrócitos e leucócitos foram separados do plasma e plaquetas por uma suave centrifugação das camadas leucocitárias. A fase de cima (contendo plasma e plaquetas) foi removida e descartada. Os eritrócitos e leucócitos foram diluídos a 1:1 em solução salina tamponada com fosfato (BPS) antes de serem dispostos sobre 15 mL de ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham, Reino unido). A centrifugação foi conduzida de acordo com as condições recomendadas pelos fabricantes e as PBMCs foram coletadas da interface soro ± PBS/ficoll paque. As PBMCs foram misturadas com PBS (1:1) e coletadas por centrifugação. O sobrenadante foi removido e descartado e a pelota de PBMC ressuspensa em 50 mL de PBS. As células foram novamente reduzidas à pelota por centrifugação e o sobrenadante de PBS foi descartado. As células foram ressuspensas, usando-se 50 mL de meio AIM V e neste ponto contadas e tiveram a sua viabilidade avaliada usando-se exclusão de corante de azul tripano. As células foram novamente coletadas por centrifugação e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas para armazenamento criogênico a uma densidade de 3 x 107 por mL. O meio de armazenagem foi 90% (v/v) de soro AB humano inativado por calor (Sigma, Poole, Reino Unido) e 10% (v/v) de DMSO (Sigma, Poole, Reino Unido). As células foram transferidas para um recipiente de congelamento regulado (Sigma) e colocadas a -70°C de um dia para o outro. Quando era necessário o seu uso, as células eram rapidamente descongeladas em um banho-maria a 37°C antes de serem transferidas para 10 mL de meio AIM V pré-aquecido.

[00206]As PBMCs foram estimuladas com antígenos de proteína e de peptídeo em uma placa de fundo chato de 96 cavidades a uma densidade de 2 x 105 PBMC por cavidade. As PBMCs foram incubadas durante 7 dias a 37°C antes de serem pulsadas com 3H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, Reino Unido). Dois peptídeos de controle denominados C-32 e C-49 que tinham provado anteriormente serem imunogênicos e uma Hemocianina de Molusco (KLH) de antígeno potente de proteína integral não recuperável foram usados em no ensaio de cada doador. C-32 = sequência PKYVKQNTLKLAT de resíduos 307-319 de hemaglutinina Flu (SEQ ID NO: 127). C-49 = sequência KVVDQIKKISKPVQH de Chlamydia HSP60 (SEQ ID NO: 128).

[00207]Os peptídeos foram dissolvidos em DMSO até uma concentração final de 10 mM, sendo então estas soluções de estoque diluídas a 1/500 em meio AIM V (concentração final 20 μM). Os peptídeos foram acrescentados a uma placa de fundo chato de 96 cavidades para resultar em uma concentração final de 1 a 5 μM em 100 μM. A viabilidade de PBMCs descongeladas foi avaliada por exclusão de corante de azul de tripano, as células foram então ressuspensas a uma densidade de 2 x 106 células/mL, e transferiram-se 100 μL (2 x 105 PBMC/cavidade) para cada cavidade contendo peptídeos. As culturas em cavidades em triplicata foram testadas a cada concentração de peptídeo. As placas foram incubadas durante 7 dias em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37°C. As células foram pulsadas durante 18-21 horas com 1 μCi de 3H-Thy/cavidade antes de serem coletadas em esteiras de filtro. Os valores em CPM foram determinados usando-se um contador de placa de beta topo de microplaca Wallac (Perkin Elmer). Os resultados foram expressos como índices de estimulação, derivados pela divisão da contagem de proliferação (contagens por minuto de radioatividade, por exemplo) medida até o peptídeo de teste pela contagem medida em células que não entraram em contato com um peptídeo de teste.

[00208]A compilação dos resultados do ensaio acima indica a presença de quatro epítopos de células T correspondendo aos peptídeos 41, 44, e 50 na região madura processada da proteína e peptídeo 88 na forma não processada. Como o epítopo no peptídeo 88 não faz parte da proteína madura, ele é ignorado dentro do esquema da presente invenção.

[00209]Para o peptídeo 41 (denominada região de epítopo R1) havia quatro doadores com resposta a este peptídeo; doadores 4, 5, 10, 11. Os Sis para eles a 5 μM foram 3,6, 4,9, 2,1 e 2,0 respectivamente.

[00210]Para o peptídeo 44 (denominada região de epítopo R2) havia dois doadores com resposta a este peptídeo; doadores 4 (SI = 3,5) e 11 (SI = 2,3). Os peptídeos vizinhos 43 e 45 induziram uma proliferação de baixo nível de célula T, uma vez que os dois peptídeos se sobrepõem com 12 aminoácidos ao peptídeo 44.

[00211]Para o peptídeo 50 havia dois doadores com resposta a este peptídeo; doadores 4 (SI = 2,9) e 14 (SI = 2,0). O peptídeo 51 induziu uma proliferação de nível inferior de célula T no doador 14 (SI > 1,9).

[00212]Os tipos de tecidos para todas as amostras de PBMC foram testados usando-se um sistema de reagente disponível no comércio (Dynal, Wirral, Reino Unido). Os ensaios foram conduzidos de acordo com os protocolos, reagentes auxiliares padrão e sistemas de eletroforese sobre agarose recomendados por fornecedores. As especificidades alotípicas de cada uma das amostras de doadores com resposta são dadas na TABELA 2.

Exemplo 2: Clonagem de buganina a partir de Bougainvillea spectabilis

[00213]RNA total foi extraído das folhas de Bougainvillea spectabilis usando-se o sistema ‘SV Total RNA Isolation System’ e protocolos fornecidos pelo fornecedor (Promega, Southampton, Reino Unido). Tecido foliar fresco foi triturado em um pó fino sob nitrogênio líquido, e usaram-se aproximadamente 50 mg de tecido triturado para o isolamento de RNA. A qualidade e quantidade de RNA foram testadas por visualização sobre gel de agarose a 1%, e o gene de buganina foi amplificado a partir de RNA total usando-se “Access RT-PCR System” (Promega), usando-se aproximadamente 1 μg de RNA por reação e com os iniciadores específicos genéticos OL 10322 e OL 1033. As sequências de iniciadores são dadas na TABELA 3 abaixo. Esta reação gerou um fragmento de 1242 bp abrangendo a sequência líder nativa e a sequência de buganina de comprimento total. Este fragmento foi clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega), seguindo-se as instruções do kit, e denominado pBou1. A sequência foi confirmada por sequenciamento de DNA.

[00214]O gene de buganina foi transferido para pET21a (Novagen, Nottingham, Reino unido) por clonagem de PCR usando-se o plasmídeo pBou1 como um gabarito. Uma sequência líder pelB (pectato liase) foi acrescentada na extremidade 5’ e uma sequência codificando um identificador de histidina 6x foi acrescentada à extremidade 3’ da sequência de codificação da buganina. A líder pelB foi amplificada do vetor pPMI-his [Molloy, P. et al., (1995) J. Applied Bacteriology, 78: 359-365] usando-se iniciador OL 1322 (incorporando um sítio Nde1) e iniciador OL 1067. O fragmento buganina-his foi amplificado a partir de pBou1 usando-se OL 1068 e OL 1323 (incorporando um sítio Not1). A sequência líder pelB foi fundida em quadro ao fragmento buganina-his usando-se PCR de sobreposição e o fragmento resultante foi clonado em pGEM-T-Easy (Promega). Depois da confirmação da sequência, o fragmento pelB-buganina-his foi clonado como um fragmento Nde1-Not1 em pET21a digerido com Nde1-Not1. Este clone foi denominado pBou32.

Exemplo 3: Construção de proteínas de buganina mutante

[00215]Uma série de proteínas de buganina modificada (mutante) foi projetada usando-se os dados fornecidos pelo procedimento de mapeamento de epítopo de célula T e o uso de software capaz de simular a ligação de peptídeos com o canal de ligação de MHC de classe II humano. Esta última abordagem é descrita com detalhes em outro documento [WO 02/069232]. Genes variantes foram construídos e as proteínas mutantes foram testadas para atividade funcional. Em geral, foram primeiro construídas e testadas proteínas “mutantes singelas” contendo uma substituição de aminoácido cada, sendo então combinados os genes para proteínas ativas modificadas para produzir proteínas modificadas por múltiplas substituições.

[00216]Os genes mutantes foram construídos usando-se procedimento de PCR de sobreposição em que o códon de aminoácido mutante é introduzido no gene usando- se um mutante em um “iniciador de sobreposição”. O esquema é bem compreendido na técnica e é descrito em detalhes em outro documento [Higuchi et al. (1900) Nucl. Acids Res. 16: 7351]. Foi construído e testado para a conservação da atividade funcional um total de 37 proteínas modificadas de mutante singelo. Além disso, foi também construído, e testado em todos os ensaios, um controle negativo de proteína modificada contendo uma substituição Y70A. Uma das 37 proteínas modificadas de “mutante singelo” na verdade continha duas substituições diretamente adjacentes (E151T e I152E) e é contada no presente documento como sendo um mutante singelo. As substituições testadas e os valores de atividade correspondente são dados na TABELA 4.

[00217]Foi construído e testado para conservação da atividade um total de 11 proteínas modificadas com múltiplas substituições. As substituições testadas e os valores de atividade correspondentes são dados na TABELA 5.

[00218]A TABELA 6 descreve as sequências das proteínas modificadas por substituição. A TABELA 7 relaciona algumas sequências específicas.

[00219]Em todos os casos, as proteínas foram purificadas e testadas de acordo com os procedimentos descritos em exemplos 4 e 5 abaixo.

Exemplo 4: Exemplo e purificação de proteína buganina

[00220]O plasmídeo pBou32 foi transformado em células competentes BL21(DE3) (Novagen) seguindo-se instruções dos fabricantes, e foi selecionado sobre placas de LB (Invitrogen, Paisley, Reino unido) contendo 50 μg/mL de carbenicilina. Uma colônia fresca proveniente desta transformação foi usada para inocular 5 mL de caldo 2xYT (Invitrogen), sem antibiótico, e esta foi cultivada com agitação a 250 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente, e as células foram ressuspensas em 5 mL de 2xYT fresco acrescido de 1 mM de IPTG. Esta cultura foi incubada a 30°C com agitação a 300 rpm durante 1,5 hora, sendo as células coletadas por centrifugação e o sobrenadante descartado.

[00221]A pelota de células foi ressuspensa em 1 mL de PEB2 (50 mM de Tris-HCl pH 8, 20% de sacarose, 1 mg/mL de lisozima, 1 x comprimido de Inibidor Completo de Protease (Roche, Lewes, Reino Unido), e incubada sobre gelo durante 1 hora com uma suave agitação. Os detritos celulares foram centrifugados a 14.000 rpm a 4°C e a pelota foi descartada. O sobrenadante resultante é agora denominado “fração periplásmica”. A proteína buganina foi purificada a partir da fração periplásmica por cromatografia de coluna de afinidade com níquel usando-se “coluna de rotação” disponível no comércio e as instruções do fabricante (Qiagen, Crawley, Reino Unido). O material resultante foi submetido à diálise contra 4 litros de solução salina tamponada com fosfato (0,138 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, pH 7,4) de um dia para o outro a 4°C usando-se um ”Slyde-A- Lyzer” com um limiar de peso molecular de 10.000 (Pierce, Chester, Reino Unido). Depois da diálise, a concentração da proteína foi estimada usando-se um kit Micro BCA Assay Kit (Pierce), e amostras armazenadas a -20°C.

[00222]A concentração da proteína buganina foi subsequentemente determinada usando-se um sistema de ensaio à base de ELISA. Resumindo, gerou-se anti-soro contra buganina (Genovac, Friburgo, Alemanha), através de imunização genética de dois ratos com um plasmídeo que expressava buganina. Para ELISA, a buganina recombinante é capturada sobre placas revestidas com Ni-agarose por meio do seu identificador His e subsequentemente detectada com o anti-soro de rato e um anticorpo secundário Fc antirato conjugado a HRP (Sigma, Poole, Reino Unido). Como padrão foi usada, em cada determinação, uma preparação grande de buganina do tipo nativo expressa em E. coli e quantificada usando-se o ensaio de proteína total.

EXEMPLO 5: Ensaio de atividade de buganina

[00223]A atividade de proteínas de buganina nativa e de modificada (mutante) foi testada medindo-se sua capacidade de inibir a síntese de proteína em um ensaio de síntese de proteína isento de células.

[00224]Uma mistura de 10 μL de mistura TNT Coupled Transcription/Translation (Promega), 20 μM de metionina, 120 ng de DNA de pT7 luciferase (Promega) e diluições em série de proteína buganina do tipo nativo e mutante em um volume final de 12,5 μL foi incubada a 30°C durante uma hora, quando a reação foi interrompida com a adição de 100 μL de reagente de ensaio de luciferase “SteadyGlow” (Promega) A atividade de luciferase foi medida usando-se um contador de luminescência Wallac. A proteína buganina ativa é detectada em forma de uma redução em atividade de luciferase medida. Cada proteína buganina modificada foi testada em pelo menos 5 concentrações, cada ponto de dados em duplicata. Os controles positivos e negativos foram incluídos em cada experimento.

[00225]Os resultados para proteínas de mutante singelo são mostradas na TABELA 4. Os resultados para proteína de buganina modificada por múltiplas mutações são mostradas na TABELA 5. Em cada caso, os resultados são expressos em relação à atividade da proteína nativa. Todos os ensaios foram conduzidos com a inclusão de uma proteína buganina mutante inativa com uma substituição Y70A.

[00226]Além disso, os resultados de ensaio de luciferase podem ser lançados em gráfico mostrando a % de atividade de luciferase em relação ao controle contra a concentração de proteína de buganina acrescentada. Exemplos de tais gráficos são mostrados na Figura 1 ilustrando os resultados conforme determinados para duas diferentes proteínas buganina com múltiplas mutações.

Exemplo 6: Ensaio de sequências de variantes de buganina para perda de epítopos de células T

[00227]A proteína modificada por múltiplas mutações denominada Bou156 foi selecionada para testes adicionais usando-se um ensaio de imunogenicidade. Esta variante contém as substituições V123A, D127A, Y133N e I152A. Os testes de imunogenicidade envolvem o uso de células vivas que podem ser danificadas quando se testa empregando-se proteína buganina integral, portanto estes ensaios foram conduzidos usando-se peptídeos sintéticos que compreendem as substituições incorporadas à variante Bou156. Os peptídeos testados são relacionados na TABELA 8. Os ensaios foram conduzidos de acordo com os procedimentos descritos no exemplo 1 (acima) usando-se um conjunto de doadores de PBMC de 20 indivíduos. Os peptídeos foram testados em triplicada para cada amostra de doador a duas concentrações diferentes finais de peptídeo (1 μM e 5 μM).

[00228]Os resultados são expressos em forma de SI por peptídeo por amostra de doador e são apresentados na Figura 2. Del-41 é o peptídeo de sequência AKADRKALELGVNKL (SEQ ID NO: 29). Del-44 é o peptídeo de sequência LGVNKLEFSIEAIHG (SEQ ID NO: 30). Del-50 é o peptídeo de sequência NGQEAAKFFLIVIQM (SEQ ID NO: 31). Nenhum dos peptídeos modificados induziu uma resposta de célula T em qualquer um dos doadores (S.I. < 2). Por outro lado o peptídeo de controle imunogênico estimulou as células T de 6 doadores (S.I. > 2).

Exemplo 7: VB6-845: a construção recombinante de um anticorpo Fab específico a Ep-CAM para um fornecimento ótimo de buganina desimunizada (De-buganina)

[00229]Para este exemplo e para o Exemplo 8, a buganina desimunizada usada é Bou156.

[00230]As citotoxinas direcionadas a tumor são compostas pela região variável de um anticorpo ligada a uma toxina bacteriana, fúngica ou vegetal. O presente estudo ilustra o fato de que as construções de buganina desimunizada da invenção que compreende a buganina desimunizada ligada a uma porção de direcionamento têm uma imunogenicidade reduzida, ainda que continuem conservando a sua atividade biológica. A TABELA 12 demonstra a ligação do anticorpo Ep-CAM a diversos tipos de tumores e mostra assim que ele pode ser usado para o tratamento destes tipos de cânceres. Construção de Buganina Desimunizada: Porção direcionada a Ep-CAM ligada a de-buganina.

[00231]VB6-845, uma versão Fab de um anticorpo scFv anti-Ep-CAM foi geneticamente ligada a uma forma desimunizada de buganina (de-buganina), Bou156, uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) do tipo 1 potente derivada de plantas para criar uma construção anticorpo-toxina VB6-845. A Figura 3 ilustra a construção VB6-845. A Figura 3A ilustra a unidade dicistrônica do pro-VB6-845, com sequências líderes pelB. A sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) e a sequência de codificação de ácido nucléico (SEQ ID NO: 15) são dadas na figura 3B. A Figura 3C ilustra a proteína VB6-845 montada que é descrita abaixo com mais detalhes. O teste desta construção ilustra o fato de que a construção conservou sua atividade biológica (citotoxicidade) e a especificidade de porção direcionada (anticorpo de Ep-CAM). Orientação da construção de buganina desimunizada

[00232]Para se determinar à orientação anticorpo-de-buganina ótima, diversas formas de uma unidade de expressão dicistrônica foram geradas, expressas e tiveram a potência testada. Em cada caso, a unidade dicistrônica foi clonada no vetor pING3302 (Figura 4) sob o controle do promotor araBAD induzível por arabinose e transformada em E104 de E. coli. Depois da indução, a presença de sequência líder pelB direcionou a secreção da proteína de fusão Fab-de-buganina para dentro do sobrenadante de cultura. O linker clivável permitiu que a de-buganina se clivasse da porção de direcionamento e exercesse sua atividade biológica. Em uma modalidade, o linker é um linker de furina, embora os versados na técnica observarão que outros linkers cliváveis poderiam ser adequados. Os linkers preferidos poderiam ser selecionados com base na especificidade alvo e no ambiente. Uma amostra das construções produzidas é preparada e testada do seguinte modo:

[00233]Figura 3: VB6-845, em que a de-buganina (Bou156) está ligada ao terminal C do domínio CH por meio de um linker de furina. A Figura 3A ilustra a unidade dicistrônica das pro-sequências, Figura 3B ilustra a sequência de codificação do ácido nucléico (SEQ ID NO: 15) e a sequência de aminoácidos das pro-sequências (SEQ ID NO: 16) e a figura 3C ilustra a proteína VB6-845 montada sem as sequências de pelB.

[00234]A Figura 5 ilustra a construção de controle Fab anti-Ep-CAM sem a toxina vegetal, de-buganina (VB6-845). A Figura 5A ilustra a umidade dicistrônica das pro- sequências. A Figura 5 ilustra a sequência de codificação do ácido nucléico (SEQ ID NO: 17) e a sequência de aminoácidos das pro-sequências (SEQ ID NO: 18) e a Figura 5C ilustra a proteína VB6-845 sem as sequências de pelB.

[00235]A Figura 6 ilustra a construção Fab anti-Ep-CAM de-buganina, VB6-845- CL-de-buganina, em que a Bou156 é ligada ao terminal C do domínio CL. A Figura 6A ilustra a unidade dicistrônica das pro-sequências. A Figura 6B ilustra a sequência de codificação do ácido nucléico (SEQ ID NO: 19) e a sequência de aminoácidos das pro- sequências (SEQ ID NO: 20) e a Figura 6C ilustra a proteína VB6-845-CL-de-buganina sem as sequências de pelB.

[00236]A Figura 7 ilustra a construção Fab anti-Ep-CAM de-buganina, VB6-845- 0NVH-de-buganina, em que Bou156 é ligado ao terminal N do domínio VH. A Figura 7A ilustra as unidades dicistrônicas das pro-sequências, Figura 7B ilustra a sequência de codificação do ácido nucléico (SEQ ID NO: 21) e a sequência de aminoácidos das pro- sequências (SEQ ID NO: 22) e a Figura 7C ilustra a proteína montada VB6-845-NVH-de- buganina sem as sequências de pelB.

[00237]A Figura 8 ilustra a construção Fab anti-Ep-CAM, VB6-845-NVL-de- buganina, em que Bou156 é ligada ao terminal N do domínio VL. A Figura 8A ilustra a unidade dicistrônica das pro-sequências. A Figura 8B ilustra a sequência de codificação do ácido nucléico (SEQ ID NO: 23) e a sequência de aminoácidos das pro-sequências (SEQ ID NO: 24) e a figura 8C ilustra a proteína montada VB6-845-NVL-de-buganina sem as sequências de pelb.

[00238]Em uma modalidade, a molécula de de-buganina é ligada à extremidade do terminal C das cadeias pesada ou leve. A configuração ótima compreende a sequência líder de pelB adjacente ao domínio VH-CH com um identificador de afinidade de histidina no terminal N como a primeira unidade. Imediatamente em seguida estava a segunda unidade compreendendo o domínio pelB-VL-CL ligado à de-buganina por um linker sensível a protease (Figura 6). Para as construções em que a de-buganina estava reposicionada na extremidade do terminal N, a análise por Western blot não mostrou nenhum produto detectável e somente a de-buganina ligada ao terminal C (construções das Figuras 3 e 6) produziu uma proteína solúvel intacta (Figura 9), com boas propriedades de ligação a linhagens de células positivas para Ep-CAM, conforme ilustrado nos testes de reatividade detectados por citometria de fluxo. Na análise por Western Blot, a Figura 9 ilustra a expressão de VB6-845 e de VB6-845-CL-de-buganina no sobrenadante das células E104 induzidas em escala laboratorial. Uma alíquota do sobrenadante, 16 microlitros, em condições não redutores, foi carregada sobre um gel de acrilamida de SDS-PAGE e analisada por Western blot usando-se ou um anticorpo de coelho policlonal anti-4D5 seguido por um anticorpo caprino anti-coelho (1/2000) ou um anticorpo caprino anti-humano Kappa de cadeia leve -HRP (1/1000) para confirmar a identidade e o tamanho da proteína recombinante. A seta indica a VB6-845 de comprimento total (construção da Figura 3) e VB6-845-CL-de-buganina (construção da Figura 6). O Western blot da sobrenadante de cultura de E104 não induzidas não revelou nenhuma faixa correspondente que demonstrasse a especificidade dos anticorpos (não mostrado).

[00239]Os resultados dos testes de reatividade com VB6-845 (Figura 3) e com VB6-845-CL-de-buganina (Figura 6) a linhagens de células positivas para Ep-CAM, CAL 27 e NIH:OVCAR-3 em comparação com um controle (linhagem de células negativas para Ep-CAM, A-375) são ilustrados na Figura 10A. Os resultados foram comparáveis aos mesmos testes de reatividade conduzidos com uma outra construção anti-Ep-CAM, VB6- 845-gelonina, em que a de-buganina é substituída com outra toxina vegetal, gelonina (Veja a Figura 14C mostrando sua sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) e a sequência de ácido nucléico (SEQ ID NO: 25)). Os resultados do teste de reatividade com a construção de gelonina são ilustrados na figura 10B. A adição de um segundo domínio de de-buganina na molécula com a orientação ótima não resultou no produto.

[00240]Os testes de citometria de fluxo foram conduzidos incubando-se as construções ou o controle com 0,45 x 106 células durante uma hora no gelo. Depois de lavagem, as construções que se ligaram à superfície celular foram detectadas com anti- buganina de coelho (para a Figura 10A) e anti identificador His murino (Figura 10B) durante uma hora no gelo. As células foram lavadas e incubadas com IgG ovino anticoelho conjugada com FITC (Figura 10A) e IgG ovino anti-murino conjugada a FITC (Figura 10B) durante 30 minutos sobre gelo. Subsequentemente as células foram lavadas, ressuspensas em PBS com FCS a 5% contendo iodeto de propídio para a avaliação da ligação de anticorpo por citometria de fluxo. Não foi detectado nenhum desvio em fluorescência média depois de incubação com VB6-845 e VB6-845-CL-de-buganina com A-375. Por outro lado, um desvio nítido em fluorescência média foi observado com linhagens de células positivas para Ep-CAM, CAL 27 e NIH:OVCAR-3 (Figura 10A). Conforme declarado acima, os resultados obtidos com VB6-845 eram análogos ao obtidos com a construção de gelonina (Figura 10B).

Especificidade para Ep-CAM

[00241]Um ensaio de competição de cinco (construção da Figura 3) com ProxiniumTM, um formato scFv de VB6-845, mas contendo a exotoxina A de Pseudomonas, demonstrou que a especificidade de VB6-845 a Ep-CAM permaneceu inalterada quando construída em um formato Fab (Figura 11).

[00242]A Figura 11 ilustra os resultados da citometria de fluxo do ensaio de competição com VB6-845 a 1 e 10 μg/mL e a concentração aumentada de ProxiniumTM variando de 0 a 100 μg/mL foram incubadas com NIH-OVCAR-3 células (linhagem de células tumorais positiva para Ep-CAM). Depois de 1 hora de incubação a 4°C, as células foram lavadas e a VB6-845 que se ligou foi detectada com anti-buganina de coelho biotinilada seguida por estreptavidina-cicromo. O mesmo experimento foi conduzido com 4B5-PE que é usado como um controle negativo. As condições de reação eram as mesmas indicadas na Figura 11. Potência (atividade biológica)

[00243]Além disso, ensaios isentos de células (Figura 12) e MTS (Figura 13A e b) demonstraram que a de-buganina conservou sua potência quando conjugada ao fragmento Fab. O ensaio MTS usado para medir a potência foi conduzido usando-se técnica padrão conhecida na técnica e conforme descrito com mais detalhes abaixo no Exemplo 8. Usando-se linhagens de células positivas para Ep-CAM, CAL 27 e NIH:OVCAR-3, o IC50 de VB6-845 foi de 3 a 4 nM e de 2 a 3 nM, respectivamente. No caso de VB6-845-CL-de-buganina, a potência foi medida a 1 a 2 nM para CAL 27 e 0,6 a 0,7 nM contra NIH:OVCAR-3. O desenvolvimento da construção Fab anti-Ep-CAM, compreendendo um fragmento de anticorpo direcionado a tumor humano ligado a uma buganina desimunizada permitiria a repetição da administração sistêmica deste medicamento e, portanto, produzir um benefício clínico maior. Coleta das construções

[00244]As construções podem ser isoladas das culturas de células por técnicas conhecidas na técnica. Se um identificador His for colocado no terminal N da construção de peptídeo, por exemplo, a construção Fab-proteína buganina pode ser purificada usando-se um método de captura de Ni2+ quelante. A título de exemplo, pode ser usado o protocolo abaixo.

[00245]Condução da fermentação descontínua de variantes de VB6-845 conduzida em um fermentador CHEMAP de 15 L usando-se o meio TB. Com uma DO600 de 20 (meio-log), a cultura é induzida com uma mistura de alimentação e indutor contendo 50% de glicerol e 200 g/L de L-arabinose. 30 horas após a indução, coleta-se a cultura, centrifuga-se a 8000 rpm durante 30 min e purificam-se as variantes de VB6-845 usando- se colunas de CM sefarose e sefarose Quelante Carregada com Metal seguida por uma coluna de exclusão por tamanho. Resumindo, concentra-se o sobrenadante e se diafiltra o mesmo contra 20 mM de fosfato de sódio pH 6,9 ± 0,1. O sobrenadante concentrado diafiltrado é então aplicado sobre uma coluna de CM sefarose equilibrada com fosfato de sódio a 20mM, NaCl a 25 mM, pH 6,9 ± 0,1. A coluna é lavada com fosfato de sódio a 10mM, NaCl a 25 mM, pH 6,9 ± 0,1, a VB6-845 que se ligou é subsequentemente eluída com fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,5 ± 0,1. O eluato de CM sefarose é ajustado para conter uma concentração final de 0,25% de Triton-X100 e é aplicado a uma coluna de sefarose quelante carregada. A coluna de sefarose quelante é então lavada com 3 tampões de lavagem diferentes a começar com fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM, Triton-X100 a 0,25%, pH 7,5 ± 0,1 seguido por fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM, imidazol a 10 mM pH 7,5 ± 0,1. A VB6-845 é então eluída com fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM e imidazol a 250 mM pH 7,5 ± 0,1 e coletada em frações de 2 mL. A absorvência a A280 é determinada para cada fração e as frações com o material combinado são aplicadas sobre uma coluna de exclusão por tamanho S200 a fim de se obter um grau de pureza de >80%. Em uma modalidade, para se aumentar à pureza da proteína e remover a endotoxina, a fração SEC combinada é diluída 5 vezes com NaPO4 a 20 mM, pH 7,5 e passada através de uma coluna de Q-sefarose de 15 mL de fluxo rápido equilibrada com NaPO4 a 20 mM, NaCl a 25 mM pH 7,5 a uma taxa de fluxo de aproximadamente 5 mL/min. Depois da aplicação da amostra através da coluna, a coluna é lavada com 10 CV de tampão de equilíbrio e a lavagem é combinada com a corrente inicial que passa através de Q-sefarose. O eluente é concentrado até ~10 vezes com o emprego de uma membrana MWCO de 30 kDa (Membrana Sartorius hydrosart] para se obter uma concentração final de 7,5 mg/mL. Tween-80 é então acrescentado até uma concentração final de 0,1%. O produto final é esterilizado por filtração e armazenado a - 80°C. Amostras a cada etapa do processo são analisadas por Western blot depois de se submeter a imuno-absorção com o anticorpo anti-4D5. A pureza é confirmada por tingimento com azul coloidal. O nível de expressão de variantes de VB6-845 é determinado por análise de Western blot e ELISA.

Exemplo 8: A caracterização funcional e biológica de VB6-845, um anticorpo Fab recombinante específico a Ep-CAM, ligado geneticamente a buganina desimunizada (de- buganina).

[00246]Os agentes quimioterapêuticos são agentes extremamente citotóxicos que frequentemente representam o padrão de terapia no tratamento de muitos dos cânceres de tumores sólidos. A ação citotóxica destes medicamentos tem como alvo células, tanto normais como tumorais, que se dividem com rapidez, criando assim uma variedade de efeitos colaterais clínicos adversos. VB6-845 é um anticorpo Fab ligado a uma forma desimunizada da toxina buganina derivada de buganina. Ao contrário de agentes quimioterapêuticos que são desprovidos de especificidade definida direcionada a tumor, VB6-845 restringe seu efeito citolítico a alvos tumores positivos a Ep-CAM somente. Neste estudo, a análise de citometria de fluxo e a citotoxicidade foram medidas para se avaliar a potência e a seletividade de VB6-845. Citometria de Fluxo

[00247]As linhagens de células tumorais usadas neste estudo foram adquiridas de ATCC e foram propagadas seguindo-se a recomendações de ATCC exceto pelas linhagens de células C-41, TOV-112D que foram cultivadas em RPMI 1640 ou DMEM suplementado com FCS a 10%, respectivamente. As células tumorais foram coletadas quando apresentavam 60-70% de confluência e com uma viabilidade de mais de 90%. As células epiteliais mamárias humanas normais (HMEC) foram adquiridas de CAMBREX e mantidas em meio especificada de acordo com o procedimento fornecido por CAMBREX. As células foram coletadas quando apresentavam 70% de confluência e com uma viabilidade de mais de 90%.

[00248]As linhagens de células ginecológicas provenientes de indicações de câncer endometrial, ovariano e cervical foram testadas para ligação a VB6-845 em citometria de fluxo (Tabela 9). Dez microgramas/mL de VB6-845 foram acrescentados a cada linhagem de células (3 x 105 células) e incubados durante 2 horas as 4°C. Usaram- se, como controles negativo e positivo de linhagens de células, A-375 e CAL 27 respectivamente. Depois de se lavar fora o material que não se ligou, acrescentou-se um anticorpo anti-Histidina monoclonal murino (Amersham Pharmacia, Cat # 27471001) diluído a 1/800 em PBS contendo 10% de FCS e incubou-se durante outra hora a 4°C. Subsequentemente, acrescentou-se IgG anti-murino rotulado com FITC (The Binding Site, Cat # AF271) diluído a 1/100 em PBS com FCS a 10% e incubou-se durante 30 minutos a 4°C. Finalmente, analisaram-se as células em um FACS Calibur depois de se tingir com iodeto de propídio para se excluir as células mortas. Citotoxicidade

[00249]O nível de destruição para VB6-845 nas células relacionadas no estudo de citometria de fluxo é conforme indicado na Tabela 10, e indicava que a construção conservou sua atividade de citotoxicidade de de-buganina contra linhagens de células positivas para Ep-CAM. A citotoxicidade era comparável à outra variante Fab de VB6-845 contendo uma toxina diferente derivada de planta, gelonina (Figura 14). A Figura 14A compara a citotoxicidade de gelonina, construção Fab anti-Ep-CAM-gelonina (VB6-845- Gelonina) e a construção Fab anti-Ep-CAM-de-buganina (Bou156)(VB6-845) em células CAL 27 (Figura 14A) e NIH:OVCAR-3 (Figura 14B). A sequência do ácido nucléico e de aminoácidos da construção VB6-845-gelonina é ilustrada na Figura 14C.

[00250]Para se estudar a especificidade e a seletividade de VB6-845 (construção da Figura 3), a atividade citotóxica de VB6-845 (90% de pureza) foi testada contra linhagens de células positivas para Ep-CAM (NIH:OVCAR-3) e negativas para Ep-CAM (HMEC, DAUDI, A-375) (Tabela 11) juntamente com 17 medicamentos quimioterapêuticos (LKB Laboratories Inc.).

[00251]O ensaio MTS foi conduzido usando-se técnicas padrão conhecidas na técnica. Mais especificamente, semearam-se 50 microlitros de células (2 x 104 células/mL) por cavidade e incubaram-se as placas a 37°C sob CO2 a 5% durante 2 horas. Em seguida acrescentaram-se 50 microlitros de medicamento reforçado (isto é, a construção a ser testada ou o controle) ao meio de cultura a concentrações crescentes. O meio de cultura, com ou sem células, foi usado como controle positivo e negativo respectivamente. As placas foram deixadas a 37°C sob CO2 a 5% durante 5 dias. No dia 5, a inibição da proliferação das células foi avaliada acrescentando-se 20 microlitros de reagente de MTS (Promega, Cat# G5430). As placas foram novamente incubadas a 37°C sob CO2 a 5% durante 2 horas e as DOs foram lidas a 490 nm usando-se um espectrofotômetro de leitor de placas. Os valores de fundo foram subtraídos dos valores das amostras obtidos para cada concentração e os resultados foram expressos em forma de porcentagem de células viáveis. Os valores de IC50 para cada medicamento foram calculados para cada linhagem de células.

[00252]Quando se testou a citotoxicidade contra NIH: OVCAR-3, um carcinoma ovariano positivo para Ep-CAM, usando-se um painel de agentes quimioterapêuticos padrão, VB6-845 mostrou ser mais potente do que 12 dos 17 medicamentos testados (Tabela 11). Embora 5 quimioterapêuticos fossem mais citotóxicos, eles também mostraram ser muito mais tóxicos por serem desprovidos de qualquer capacidade de destruição específica a células. Dos cinco agentes quimioterapêuticos recomendados para o tratamento de câncer ovariano (Paclitaxel, Carboplatina, Cisplatina, Doxorubicina e Topotecan), somente dois (Paclitaxel e Topotecan) eram mais citotóxicos. Embora VB6- 845 demonstrasse uma atividade citolítica extremamente potente na faixa de 1 a 2 nM, a destruição potente foi restrita exclusivamente à linhagem de células tumorais NIH:OVCAR-3 positivas para Ep-CAM. Embora alguma destruição de linhagens de células negativas para Ep-CAM tenha ocorrido com VB6-845, o efeito citotóxico foi de pelo menos 220 vezes maior e foi no máximo >1000 vezes menos tóxico. VB6-845 representa, portanto, um tratamento potente direcionado a anticorpo, alternativo para agentes quimioterapêuticos que, quando combinado com o perfil de toxicidade menor, parece muito promissor no tratamento de muitos tipos diferentes de tumores sólidos. Exemplo 9: VB6-011: construção recombinante de um anticorpo Fab específico a antígeno associado a tumor para o fornecimento ótimo de buganina desimunizada (De- buganina).

[00253]As citotoxinas direcionadas a tumor são compostas pela região variável de um anticorpo ligado a uma toxina bacteriana, fúngica ou vegetal. O presente estudo ilustra o fato de que as construções de buganina desimunizada da invenção, compreendendo buganina desimunizada ligada a uma porção direcionada tem uma imunogenicidade reduzida, embora continuem conservando a sua atividade biológica. A TABELA 13 demonstra a ligação do anticorpo a antígeno associado a tumor a diversos tipos de tumores e mostra, assim, que ele pode ser usado para o tratamento destes tipos de câncer. Construção de Buganina Desimunizada: Porção direcionada a antígeno associado a tumor ligada a de-buganina.

[00254]O anticorpo H11, um anticorpo monoclonal que reconhece o antígeno associado a tumor, foi geneticamente ligado a uma forma desimunizada de buganina (de- buganina), Bou156, uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) do tipo I potente, derivada de planta para criar a construção anticorpo-toxina VB6-011. A Figura 15 ilustra a sequência que codifica o ácido nucléico e a sequência de aminoácidos. O teste desta construção ilustra o fato de que a construção conservou sua atividade biológica (citotoxicidade). Potência (atividade biológica)

[00255]O ensaio MTS demonstrou que de-buganina conservou sua potência quando conjugada ao fragmento Fab (Figura 16). O ensaio MTS usado para medir a potência foi conduzido usando-se técnica padrão conhecida na técnica, e conforme é mais detalhadamente descrito no Exemplo 8. Citotoxicidade

[00256]Para se estudar a especificidade e seletividade de VB6-011, a atividade citotóxica foi testada contra células MB-425S. O ensaio MTS foi conduzido usando-se técnicas padrão conhecidas na técnica. Mais especificamente, 50 microlitros de células (2 x 104 células/mL) foram semeados por cavidade e as placas foram incubadas a 37°C sob CO2 a 5% durante 2 horas. Em seguida 50 microlitros do medicamento reforçado (isto é, a construção a ser testada ou o controle) foram acrescentados ao meio de cultura a concentrações crescentes. O meio de cultura, com ou sem células, foi usado como controle positivo e negativo, respectivamente. As placas foram deixadas a 37°C sob CO2 a 5% durante 5 dias. No dia 5 a inibição da proliferação das células foi avaliada acrescentando-se 20 microlitros de reagente de MTS (Promega, Cat# G5430). As placas foram novamente incubadas a 37°C sob CO2 a 5% durante 2 horas e as DOs foram lidas a 490 nm usando-se o espectrofotômetro de leitor de placas. Os valores de fundo foram subtraídos dos valores de amostra obtidos a cada concentração e os resultados foram expressos em forma de uma porcentagem de células viáveis. Os resultados mostram que o valor IC50 de VB6-011 é de 360 nM.

[00257]Embora a presente invenção tenha sido descrita fazendo-se referência ao que atualmente são considerados os exemplos preferidos, deve ficar subentendido que a invenção não é limitada aos exemplos descritos. Pelo contrário, a invenção se destina a abranger diversas modificações e arranjos equivalentes que incidam no espírito e âmbito das reivindicações apensas.

[00258]Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes são incorporados integralmente ao presente documento a título de referência na mesma medida em que cada publicação, patente ou pedido de patente individual teria sido se tivesse sido específica e individualmente indicado como tendo sido incorporado integralmente ao presente documento a título de referência.

Peptídeos da sequência de buganina. Os resíduos sublinhados não estão presentes na proteína madura.

Alótipos de MHC de doadores de PBMC

Sequências de iniciadores usados na construção do gene de buganina do tipo nativo Tabela 4 Variantes de buganina de uma única substituição construídas e testadas

1 Atividade no ensaio de Luciferase: ++ = igual ou superior à da proteína WT. + = dentro de duas vezes a atividade WT. ± = dentro de 3 vezes a atividade WT. -- = inferior a um terço da atividade WT. WT = proteína do tipo nativo. 2 * ID do Clone. Designação para variantes funcionalmente ativas somente Tabela 5 Variantes de buganina com múltiplas substituições construídas e testadas

* Atividade em ensaio de Luciferase: ++ = igual ou superior à da proteína WT. + = dentro de duas vezes a atividade de WT. ± = dentro de 3 vezes a atividade WT. -- = inferior a um terço da atividade de WT. WT = proteína do tipo nativo.

* A numeração começa no resíduo 1 do quadro de leitura de buganina e exclui, portanto, a sequência líder PelB incluída ma maioria das construções.

Tabela 8 Peptídeos de buganina modificada e do tipo nativo testados adicionalmente em ensaios de célula T.

*resíduo substituído (mutante) sublinhado. Tabela 9 Ligação de VB6-845 a linhagens de células ginecológicas por citometria de fluxo Resultados são expressos em forma de um fator de aumento em MF ± erro médio padrão

Tabela 10 Citotoxicidade mediada por VB6-845 por meio de ensaios MTS

Tabela 11 Especificidade e seletividade de VB6-845 em comparação com Quimioterápicos

Tabela 12: Indicações de Células Tumorais para VB6-845

Tabela 13 Indicações de Células Tumorais para VB6-011

1N indica o número de linhagens de células testadas por indicação 2 Valores indicam a média calculada a partir da soma do fator de aumento médio em fluorescência média em relação ao anticorpo de controle a partir de todas as linhagens em cada indicação. Um valor zero significaria que não houve nenhuma reatividade mensurável em relação à atividade do controle.

Claims

1. Proteína buganina modificada CARACTERIZADA pelo fato de que a dita buganina modificada tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparada à buganina não modificada (SEQ ID NO: 1), em que a dita buganina tem uma substituição de amino ácido de um ou mais de X1, X2, X3, X4 ou X5 em um epítopo de célula T selecionado do grupo consistindo em: a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (região de epítopo R1, SEQ ID NO: 8) b) LGVX4KLEFSIEAIHG (região de epítopo R2, SEQ ID NO: 9); e c) NGQEX5AKFFLIVIQM (região de epítopo R3, SEQ ID NO: 10); em que: X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S; e X5 é Q ou A.

2. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína buganina modificada compreende: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV LVDITTTSKKTVKAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEAIH GKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLN LENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGIL KFKSSK em que: X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S; e X5 é Q ou A (SEQ ID NO: 12).

3. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que X1 é A.

4. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que X2 é A.

5. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que X4 é N.

6. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que X5 é A.

7. Proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a seguinte sequência: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIH GKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVL NLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK (SEQ ID NO: 13).

8. Citotoxina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma porção de direcionamento da proteína ligada a uma proteína buganina modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Citotoxina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ligante que se liga a uma célula cancerosa ligada a uma proteína buganina modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a uma célula cancerosa.

11. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a Ep-CAM na superfície da célula cancerosa.

12. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a Ep-CAM é um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo que se liga ao domínio extracelular de Ep-CAM humano e compreende sequências de região determinante de complementaridade derivadas de um anticorpo MOC-31.

13. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16.

14. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a um antígeno associado a tumor na superfície da célula cancerosa.

15. Citotoxina, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28.

16. Uso de uma citotoxina como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer renal, melanomas, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e de célula não pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

18. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a citotoxina, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 15, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

19. Processo para preparação de um produto farmacêutico para o tratamento de um animal com câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) a identificação de epítopos de célula T de buganina; (b) modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos em um epítopo de célula T para preparar uma buganina modificada tendo uma propensão reduzida para ativar as células T como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (c) preparação de uma citotoxina que tem um ligante que se liga ao câncer ligado à buganina modificada; e (d) suspensão da citotoxina em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer da mama, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer renal, melanomas, câncer gastrintestinal, câncer da próstata, câncer do pulmão de célula pequena e de célula não pequena, sarcomas, gliomas, linfomas de célula T e de célula B.

21. Ácido nucleico que codifica uma proteína buganina modificada, CARACTERIZADO pelo fato de que a buganina modificada tem uma propensão reduzida para provocar uma resposta imune, em comparação com a proteína buganina não modificada (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácidos da proteína buganina modificada é como definida por: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLV DITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFP GVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX 1DRKX 2LX 3LGVX 4KLEFSIEAIHGKT INGQEX 5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLE NNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILK FKSSK (SEQ ID NO: 11), em que X1 a X5 pode ser qualquer aminoácido, desde que a sequência de aminoácidos da proteína buganina modificada não seja idêntica à proteína buganina não modificada (SEQ ID NO: 1), em que a dita proteína buganina modificada inibe a síntese de proteínas nos ribossomos.

22. Ácido nucleico que codifica uma proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que: X1 é T ou A ou Q; X2é G ou A; X3é Q ou G; X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S; e X5é Q ou A (SEQ ID NO: 12).

23. Ácido nucleico que codifica uma proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a buganina modificada é como definida pela seguinte sequência: (SEQ ID NO: 13) YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIH GKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVL NLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK.

24. Ácido nucleico que codifica uma proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a buganina modificada é selecionada do grupo que consiste em: X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 130); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 131); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 132); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 133); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 134); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 135); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 136); X4é N, e X5é I (SEQ ID NO: 137); X4é T, e X5é I (SEQ ID NO: 138); X4é A, e X5é I (SEQ ID NO: 139); X4é R, e X5é I (SEQ ID NO: 140); X4é D, e X5é I (SEQ ID NO: 141); X4é E, e X5é I (SEQ ID NO: 142); X4é Q, e X5é I (SEQ ID NO: 143); X4é G, e X5é I (SEQ ID NO: 144); X4é H, e X5é I (SEQ ID NO: 145); X4é K, e X5é I (SEQ ID NO: 146); X4é V, e X5é I (SEQ ID NO: 147); X4é Y, e X5é Q (SEQ ID NO: 148); X4é Y, e X5é A (SEQ ID NO: 149); X4é Q, e X5é Q (SEQ ID NO: 150); X4é N, e X5é A (SEQ ID NO: 151); X4é Q, e X5é A (SEQ ID NO: 152); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 153); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 154); X4é y, e X5é I (SEQ ID NO: 155); X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 156); em que X1é Q, X2é D, X3é G, X4é y, e X5é I (SEQ ID NO: 157); em que X1é A, X2é D, X3é G, X4é Y, e X5é I (SEQ ID NO: 158); e em que X1é A, X2é A, X3é E, X4é Q, e X5é A (SEQ ID NO: 14).

25. Ácido nucleico que codifica uma proteína buganina modificada, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a buganina modificada é como definida pela seguinte sequência: YNTVSFN LG EAYE YPTFIQDL RN ELAKGT P VCQ L PVT LOTI ADD KRF V L VDITTTSKKTVKVAID VTD VAWG YQ D K WDG KDRAVF L DK V PTVAT SKLF PGVTNRVT LTFDGSYQ KLVNAÁKVD R KE> LELG VYKL E FSIEAIH G KTJNGQE IAKF F LMQMVSEAARF KYIETE WDRG L YGS F KPN F KVL N LEN N WGDISDAIH KSS PQCTT1N PAI ,Q LISP S N D P WWNK VSQI SP D MGILKFKSSK [SEQ ID NO 129].

26. Ácido nucleico que codifica uma citotoxina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15.

27. Ácido nucleico que codifica uma citotoxina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27.

28. Peptídeo de epítopo de célula T, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparado com o epítopo de célula T não modificado compreendendo uma sequência modificada que compreende: AKX1DRKX2LX3LGVX4K em que pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 é modificado a partir da sequência não modificada como segue: X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; e X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO: 8).

29. Peptídeo de epítopo de célula T, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparado com o epítopo de célula T não modificado, compreendendo uma sequência modificada que compreende: LGVX4KLEFSIEAIHG em que X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO: 9).

30. Peptídeo de epítopo de célula T, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparado com o epítopo de célula T não modificado, compreendendo uma sequência modificada que compreende: NGQEX5AKFFLIVIQM em que X5 é Q ou A (SEQ ID NO: 10).

31. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que codifica um peptídeo de epítopo de célula T que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparado com o epítopo de célula T não modificado compreendendo uma sequência modificada que compreende: AKX1DRKX2LX3LGVX4K, em que pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 é modificado a partir da sequência não modificada como segue: X1 é T ou A ou Q; X2 é G ou A; X3 é Q ou G; e X4é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO:8).

32. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que codifica um peptídeo de epítopo de célula T que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune em comparação com o epítopo de célula T não modificado compreendendo uma sequência modificada que compreende: LGVX4KLEFSIEAIHG, em que X4 é N ou D ou T ou A ou R ou Q ou E ou G ou H ou K ou S (SEQ ID NO: 9).

33. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que codifica um peptídeo de epítopo de célula T que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune em comparação com o epítopo de célula T não modificado compreendendo uma sequência modificada que compreende: NGQEX5AKFFLIVIQM, em que X5 é Q ou A (SEQ ID NO: 10).

34. Proteína buganina modificada, CARACTERIZADA pelo fato de que tem uma propensão reduzida para ativar uma resposta imune comparada a uma buganina não modificada (SEQ ID NO: 1), compreendendo a sequência: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLVTLQTIADDKRFVLV DITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFP GVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQ EIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDI SDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK [SEQ ID NO. 129].