EA010803B1 - Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения - Google Patents
Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA010803B1 EA010803B1 EA200601738A EA200601738A EA010803B1 EA 010803 B1 EA010803 B1 EA 010803B1 EA 200601738 A EA200601738 A EA 200601738A EA 200601738 A EA200601738 A EA 200601738A EA 010803 B1 EA010803 B1 EA 010803B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cancer
- modified
- cell
- protein
- buganin
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 251
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 231
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 title claims abstract description 114
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 181
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 180
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 150
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 126
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 96
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 227
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 86
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 51
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 51
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 48
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 48
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 42
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 29
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 29
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 17
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 15
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 15
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 12
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 8
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 8
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 claims description 2
- 102000045551 human EPCAM Human genes 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GFABGVSRKCKLKA-ONBPZOJHSA-N 2-[(2s,5r)-5-[(1r)-2-[4-(2-benzamidoethyl)phenoxy]-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]propan-2-yl acetate Chemical class O1[C@H](C(C)(C)OC(=O)C)CC[C@]1(C)[C@H](O)COC(C=C1)=CC=C1CCNC(=O)C1=CC=CC=C1 GFABGVSRKCKLKA-ONBPZOJHSA-N 0.000 claims 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 91
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 44
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 56
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 42
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 28
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 28
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 24
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 20
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 17
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 16
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- -1 cyclic amino acid Chemical class 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 6
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 6
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 108010081181 calcium-binding protein (brain) Proteins 0.000 description 4
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 4
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 4
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000004172 quinoline yellow Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 3
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241001325209 Nama Species 0.000 description 2
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 2
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007828 protein synthesis assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102220114368 rs397517248 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 2,8-diamino-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N=C(N)N2 WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS([O-])(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 0.000 description 1
- YUJSWFZLUCHGFO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-azidophenyl)aniline Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 YUJSWFZLUCHGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 5-(trifluoromethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound FC(F)(F)C1=CNC(=O)NC1=O LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2h-1,2,4-triazin-3-one Chemical compound NC=1C=NNC(=O)N=1 SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSPYSWLZOPCOLO-UHFFFAOYSA-N 6-azauracil Chemical compound O=C1C=NNC(=O)N1 SSPYSWLZOPCOLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-2-methylhex-2-enamide Chemical compound NC(=O)C(C)=CCCCO YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-6,8-diamine Chemical compound C1=NC(N)=C2NC(N)=NC2=N1 PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 240000004246 Agave americana Species 0.000 description 1
- 241001182632 Akko Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101100273868 Anopheles gambiae CecC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 101150001015 BOP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000954177 Bangana ariza Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000219475 Bougainvillea Species 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 101100059604 Ceratitis capitata CEC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- YIICVSCAKJMMDJ-UHFFFAOYSA-N L-vasicine Natural products C1=CC=C2N=C3C(O)CCN3CC2=C1 YIICVSCAKJMMDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000879966 Mus musculus Eosinophil cationic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000740206 Mus musculus Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- YIICVSCAKJMMDJ-SNVBAGLBSA-N Peganine Chemical compound C1=CC=C2N=C3[C@H](O)CCN3CC2=C1 YIICVSCAKJMMDJ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- YIICVSCAKJMMDJ-JTQLQIEISA-N Peganine Natural products C1=CC=C2N=C3[C@@H](O)CCN3CC2=C1 YIICVSCAKJMMDJ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100489921 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ABF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001362551 Samba Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical class [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000004191 allura red AC Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 108700004675 bleomycetin Proteins 0.000 description 1
- QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N bleomycin A5 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCNCCCCN)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N 0.000 description 1
- 229960004395 bleomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 239000004126 brilliant black BN Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117229 cialis Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002003 electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001752 female genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N leuprolide Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010339 medical test Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N tadalafil Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@@H]2C3=C(C4=CC=CC=C4N3)C[C@H]3N2C(=O)CN(C3=O)C)=C1 WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N vinblastine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004982 vinblastine sulfate Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002166 vinorelbine tartrate Drugs 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-IWWDSPBFSA-N vinorelbinetartrate Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC(C23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-IWWDSPBFSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
- A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Рассматриваются модифицированные формы белка буганина, обладающие биологической активностью и пониженной способностью активировать человеческие Т-клетки по сравнению с немодифицированным белком буганином. Рассматриваются также пептиды Т-клеточного эпитопа в буганине и модифицированные пептиды Т-клеточного эпитопа в буганине, которые обладают пониженной способностью активировать человеческие Т-клетки по сравнению с немодифицированным пептидом Т-клеточного эпитопа. Рассматриваются также цитотоксины, содержащие лиганд, связанный с раковыми клетками и присоединенный к модифицированным белкам буганинам. Рассматриваются также способы ингибирования или разрушения раковых клеток млекопитающего с использованием цитотоксинов и фармацевтических композиций для лечения рака человека.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к модифицированным белкам буганинам и к цитотоксинам, содержащим указанные модифицированные белки, используемые в качестве терапевтического противоракового средства. В частности, для снижения иммуногенности буганиновых токсинов Т-клеточные эпитопы удаляют или модифицируют.
Предшествующий уровень техники
Во многих случаях эффективность терапевтического белка ограничена нежелательной иммунной реакцией на терапевтический белок. Некоторые мышиные моноклональные антитела обнаруживают терапевтические свойства при ряде патологических состояний человека, но в некоторых случаях эти свойства нарушаются из-за индуцирования значительных уровней антимышиного антитела у человека (НАМА) [8сйго!к Β.ν. е! а1. (1985) Сапсег Век. 45:879-885; 8йате1ег О.Ь. е! а1., (1985) 1. 1ттипо1. 135:15301535]. Что касается моноклональных антител, то для снижения НАМА-ответа был разработан ряд способов |\УО 89/09622; ЕР 0239400; ЕР 0438310; XVО 91/06667]. Обычно такие способы рекомбинантных ДНК позволяют снижать иммуногенность мышиного антитела за счет уменьшения мышиной генной последовательности в конечной конструкции антитела и увеличения человеческой генной последовательности в этой конструкции. Но несмотря на это, полученные гуманизованные антитела в некоторых случаях все же вызывают иммунный ответ у пациентов [1кааск Ι.Ό. (1990) 8ет. 1ттипо1. 2:449, 456; ВеЬе11о Р.В. е! а1. (1999) Тгап5р1ап1айоп 68:1417-1420].
Принцип индукции иммунного ответа основан на присутствии в данном белке пептидов, которые могут стимулировать активность Т-клеток путем презентации на молекулах МНС класса II так называемых Т-клеточных эпитопов. Такие Т-клеточные эпитопы обычно определяются как любая последовательность аминокислотных остатков, обладающих способностью связываться с молекулами МНС класса II. Более точно, Т-клеточный эпитоп означает эпитоп, который при связывании с молекулами МНС может распознаваться Т-клеточным рецептором (ТСВ) и который может, по меньшей мере, в принципе, активировать Т-клетки путем связывания с ТСВ и, тем самым, стимулировать Т-клеточный ответ.
Молекулы МНС класса II представляют собой группу в высокой степени полиморфных белков, которые играют основную роль в отборе и активации хелперных Т-клеток. Группа человеческих лейкоцитарных антигенов ΌΒ (НЬА-ΌΒ) представляет собой группу белков преобладающего изотипа, однако, изотипы НЬА-Эр и НЬА-ЭР обладают аналогичными функциями. Что касается человека, то он имеет два-четыре аллеля ΌΒ, два аллеля изотипа ΌΟ и два аллеля изотипа ΌΡ. Была выявлена структура ряда молекул ΌΒ, и было установлено, что они представляют собой незамкнутый пептидсвязывающий участок с рядом гидрофобных карманов, которые связаны между собой гидрофобными остатками (остатками карманов) пептида [Вготеп е! а1. (1993) Ыа1иге 364:33; 8!егп е! а1. (1994) Ыа1иге 368:215]. Полиморфизм, идентифицирующий различные аллотипы молекулы класса II, играет определенную роль во внесении широкого разнообразия различных связывающих поверхностей для пептидов в пептидсвязывающем участке и на уровне всей популяции обеспечивает максимальную гибкость в отношении способности распознавать чужеродные белки и вырабатывать иммунный ответ на действие патогенных микроорганизмов.
Иммунный ответ на терапевтический белок вырабатывается в результате презентации пептида МНС класса II. При этом экзогенные белки поглощаются и подвергаются процессингу для презентации вместе с молекулами МНС класса II типа ΌΒ, ЭР или ΌΡ. Молекулы МНС класса II экспрессируются специальными антигенпрезентирующими клетками (АПК), такими как макрофаги и дендритные клетки и т.п. Образование комплекса пептидов МНС класса II с когнатным Т-клеточным рецептором на поверхности Т-клетки, наряду с перекрестным связыванием некоторых других корецепторов, таких как молекулы СЭ4, может индуцировать активацию Т-клеток. Такая активация приводит к высвобождению цитокинов, а затем к активации других лимфоцитов, таких как В-клетки, и, тем самым, к продуцированию антител или к активации Т-клеток-киллеров в качестве полного клеточного иммунного ответа.
Идентификация Т-клеточного эпитопа представляет собой первую стадию элиминации эпитопа, как описано в \νθ 98/52976; \νθ 00/34317; \νθ 02/069232; \νθ 02/079232 и \νθ 02/079415. В этих заявках предсказанные Т-клеточные эпитопы удаляют путем соответствующих аминокислотных замен в представляющем интерес белке. Для определения способности связывания синтетических пептидов с молекулами МНС класса II, помимо компьютерных способов, применяются способы ш νίΙΐΌ. В репрезентативном способе В-клеточные линии с определенным аллотипом МНС используются в качестве источника поверхности связывания с МНС класса II, и эти клеточные линии могут применяться для идентификации лиганда МНС класса II [МаткйаН Κ.ν. е! а1., (1994) 1. Iттиηо1. 152:4946-4956; О’8иШуап е! а1. (1990) 1. Iттипо1. 145:1799-1808; ΒоЬаάеу С. е! а1. (1997) 1. ^типок 159:3238-3246]. Однако такие способы непригодны ни для скрининга множества потенциальных эпитопов на предмет обширного выявления разнообразия аллотипов МНС, ни для подтверждения способности связывающего белка действовать как Т-клеточный эпитоп.
Также применяют способы, в которых используют растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами [Кет Б. е! а1. (1998) Ыа!иге МеФсше 4:975-978; Ктеок ν.ν. е! а1. (2001) ΤΒΕΝΏ8 ш ^типок 22:583-588]. Эти реагенты и процедуры используют для идентификации присутствия Т-клеточных клонов, присутствующих в пробах периферической крови че
- 1 010803 ловека или экспериментального животного и способных связываться с конкретными комплексами МНСпептид, но указанные реагенты и процедуры не применимы для скрининга множества потенциальных эпитопов на предмет выявления обширного разнообразия аллотипов МНС.
Биологические анализы на активацию Т-клеток открывают возможности практического определения способности тестируемой последовательности пептида/белка вырабатывать иммунный ответ. Примеры таких способов приводятся в работе Реба с1 а1., в которой описаны анализы на пролиферацию Тклеток с использованием бактериальной протеин-стафилокиназы, с последующим картированием эпитопов с использованием синтетических пептидов для стимуляции Т-клеточных линий |Ре1га А.М. е1 а1. (2002) 1. 1ттипо1. 168:155-161]. Аналогичным образом, анализы на пролиферацию Т-клеток с использованием синтетических пептидов белка столбнячного токсина позволяют определить иммунодоминантные области эпитопов указанного токсина [Неесе ЕС. е! а1. (1993) 1. 1ттипо1. 151:6175-6184]. В \νϋ 99/53038 описан способ, в котором Т-клеточные эпитопы в тестируемом белке могут быть определены с использованием выделенных субпопуляций человеческих иммунных клеток путем стимуляции их дифференцировки ίη νίίτο и культивирования в присутствии представляющих интерес синтетических пептидов и измерения любой индуцированной пролиферации культивированных Т-клеток. Тот же самый способ описан также в публикации 8бск1ег е! а1. [8бск1ег М.М. е! а1. (2000) 1. 1ттипоб1егару 23:654-660], где в обоих случаях данный способ применяется для детекции Т-клеточных эпитопов в бактериальном субтилизине. Для проведения такого способа требуется тщательное выделение клеток и культивирование клеток с множеством других цитокинов, с получением нужных субпопуляций иммунных клеток (дендритных клеток, СГО4'- и/или СГО8'-Т-клеток), но этот способ не позволяет проводить быстрый крупномасштабный скрининг множества образцов, взятых у донора.
За последние годы был значительно усовершенствован комбинированный способ, проводимый с помощью анализов на пролиферацию Т-клеточной популяции и ίη бЕсо стимуляции связывания пептидов МНС для конструирования дефицитных по эпитопам белков [ν0 03/104803].
Из всего выше- и нижесказанного следует, что может оказаться желательным идентифицировать и удалять или, по меньшей мере, снижать число Т-клеточных эпитопов из основных терапевтически ценных, но по своей природе иммуногенных пептидов, полипептидов или белков.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является практическая реализация способа, в котором растворимые белки, вводимые человеку в терапевтических целях, могут стимулировать вырабатывание иммунного ответа, приводящего к продуцированию у хозяина антител, которые связываются с указанным растворимым белком. Указанная цель настоящего изобретения может быть достигнута путем получения белков буганина с пониженной способностью вырабатывать иммунный ответ. В соответствии с описанными здесь способами авторами настоящего изобретения были идентифицированы области молекулы буганина, содержащей Т-клеточные эпитопы, стимулирующие вырабатывание иммунных ответов на этот белок.
Настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где модифицированный буганин обладает пониженной способностью вырабатывать иммунный ответ. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный буганин обладает пониженной способностью активировать Тклетки, и этот модифицированый буганин является модифицированным в одном или нескольких положениях аминокислотных остатков в Т-клеточном эпитопе. Т-клеточные эпитопы предпочтительно выбирают из группы, состоящей из:
a) ΑΚ\ΌΕΚΙ)ΕΕΕΕι\ΎΚΕ (область Н1 эпитопа, 8ΕΟ ГО N0:2);
b) ΕΟνΥΚΕΕΕδΙΕΑΙΗΟ (область Н2 эпитопа, 8ΕΟ ГО N0:3);
c) ΝΟρΕΙΑΚΡΕΠνίρΜ (область Н3 эпитопа, 8ΕΟ ГО N0:4).
Настоящее изобретение также относится к цитотоксину, содержащему нацеливающий фрагмент, присоединенный к модифицированному белку буганину согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанным нацеливающим фрагментом является лиганд, связывающийся с раковой клеткой. В другом варианте изобретения указанным лигандом является антитело или фрагмент антитела, которые связываются с раковой клеткой. В конкретном варианте изобретения указанное антитело распознает ЕрСАМ или опухолеассоциированный антиген. В своем наиболее конкретном варианте настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему νΒ6-845 или νΒ6-011.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковых клеток, включающему в себя введение цитотоксина согласно изобретению в раковые клетки.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака путем введения цитотоксина согласно изобретению животному, нуждающемуся в таком введении.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического средства для лечения рака у животного, где указанный способ включает в себя стадии идентификации Тклеточных эпитопов буганина, модификации одного или нескольких аминокислотных остатков в Тклеточном эпитопе для получения модифицированного буганина, обладающего пониженной способностью к активации Т-клеток; получения цитотоксина, который имеет связывающийся с раковой клеткой лиганд, присоединенный к модифицированному буганину, и суспендирования указанного цитотоксина в фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе.
- 2 010803
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения животного, страдающего раком, где указанная композиция содержит цитотоксин согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
Цитотоксины, композиции и способы согласно изобретению могут быть использованы для лечения различных форм рака, таких как рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы, Т-клеточные и Вклеточные лимфомы.
Настоящее изобретение также относится к пептидам Т-клеточного эпитопа белка буганина и к модифицированным пептидам Т-клеточного эпитопа согласно изобретению.
Другие отличительные признаки и преимущества согласно изобретению будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения. Однако следует отметить, что подробное описание и конкретные примеры вариантов предпочтительного осуществления изобретения приводятся лишь в иллюстративных целях, и в него могут быть внесены различные изменения и модификации, которые не выходят за рамки существа и объема изобретения и которые будут очевидны специалистам из подробного описания изобретения.
Краткое описание графического материала
Настоящее изобретение описано со ссылками на графический материал, где на фиг. 1 приведены результаты анализов на активность дефицитных по Т-клеточным эпитопам модифицированных белков буганинов Вои156 (панель А) и Вои157 (панель В). Вои156 имеет замены У123А, Ό127Α, Υ133Ν и Ι152Α. Вои157 имеет замены У123А, Ό127Α, Υ133Ρ и Ι152Α. Обе серии анализов проводят с использованием белка дикого типа и неактивного модифицированного буганина (Υ70Α) в качестве контроля. В этом анализе активность выражена в % измеряемой люциферазной активности по отношению к концентрации белка буганина.
На фиг. 2 приведены результаты анализа на пролиферацию Т-клеток для трех синтетических пептидов и для 2 различных образцов МКПК, взятых у донора. Пептиды, обозначенные Эс1-41. Эе1-44 и Эе150, были протестированы при конечной концентрации 1 мкМ (панель А) и при конечной концентрации 5 мкМ (панель В). Эти пептиды происходят от иммуногенных областей молекулы буганина и имеют замены, введенные для элиминации их иммуногенности.
На фиг. 3 проиллюстрирован УВ6-845, модифицированный буганиновый цитотоксин, содержащий ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ, где де-буганин (Вои156) присоединен к С-концу домена СН посредством фуринового линкера. На фиг. 3А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 3В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (БЕЦ ΙΌ N0:15) и аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ N0:16) пропоследовательностей, а на фиг. 3С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 4 проиллюстрирована карта экспрессирующего вектора ρΙΝΟ3302. Репрезентативные вставки были лигированы в вектор 3302 с использованием рестрикционных сайтов ЕсоШ и Х1ю1.
На фиг. 5 проиллюстрирована контрольная конструкция ЕаЬ-фрагмента антитела против Ер-САМ, не содержащая растительного токсина, де-буганина (УВ5-845). На фиг. 5А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 5В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (БЕЦ Ш N0:17) и аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ N0:18) пропоследовательностей, а на фиг. 5С проиллюстрирован собранный белок УВ5-845, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 6 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845-Сь-де-буганин, где Вои156 присоединен к С-концу домена Сь. На фиг. 6А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 6В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (БЕЦ ΙΌ N0:19) и аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ N0:20) пропоследовательностей, а на фиг. 6С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845-Сь-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 7 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845^Ун-де-буганин, где Вои156 присоединен к С-концу домена Ун. На фиг. 7А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 7В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (БЕЦ ΙΌ N0:21) и аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ N0:22) пропоследовательностей, а на фиг. 7С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845^Ун-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 8 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845^Уь-де-буганин, где Вои156 присоединен к Оконцу домена Уь. На фиг. 8А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 8В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (БЕЦ ΙΌ N0:23) и аминокислотная последовательность (БЕр ΙΌ N0:24) пропоследовательностей, а на фиг. 8С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845^Уь-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
- 3 010803
На фиг. 9 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ экспрессии УВ6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3) и УВ6-845-СЬ-де-буганин (Вои156) (конструкции, представленной на фиг. 6) в супернатанте индуцированных клеток Е104 в лабораторном масштабе.
На фиг. 10 представлены результаты исследований реактивности с помощью проточной цитометрии. На фиг. 10А проиллюстрирована реактивность УВ6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3) и УВ6-845-СЬ-де-буганина (конструкции, представленной на фиг. 6) в Ер-САМ-позитивных клеточных линиях САЬ 27 и ОУСАК.-3 и в Ер-САМ-негативной клеточной линии А-375, а на фиг. 10В проиллюстрированы результаты тех же самых тестов, проведенных с использованием УВ6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), УВ6-845-гелонина (конструкции, представленной на фиг. 14С) и контроля (РВ8).
На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий результаты конкурентного анализа, проводимого с использованием УВ6-845 и Ргохшшт™ в клетках Ы1Н:ОУСАВ-3, как описано в примере 7.
На фиг. 12 представлен график, иллюстрирующий результаты бесклеточного анализа, описанного в примере 7.
На фиг. 13 представлены результаты МТ8-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8, в котором сравнивают цитотоксичность УВ6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), УВ6-845-СБде-буганина (конструкции, представленной на фиг. 6) и де-буганина (Вои156) в клетках САЬ 27 (фиг. 13А) и Ы1Н:ОУСАВ-3 (фиг. 13В).
На фиг. 14А и В представлены результаты МТ8-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8, в котором сравнивают цитотоксичность УВ6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), УВ6-845гелонина (конструкции, представленной на фиг. 14С) и гелонина в клетках САЬ 27 (фиг. 14А) и ΝΙΗОУСАК.-3 (фиг. 14В). На фиг. 14С проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ΙΌ NО:25) и аминокислотной последовательности (8ЕО ΙΌ NО:26) указанной конструкции УВ6-845-гелонина.
На фиг. 15 проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО Ш NО:27) и аминокислотной последовательности (8ЕО ΙΌ NО:28) пропоследовательностей УВ6-011.
На фиг. 16 представлены результаты МТ8-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8 и указывающего на цитотоксичность УВ6-011 в клетках МВ-4358.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения были идентифицированы Т-клеточные эпитопы в буганине и были сконструированы модифицированные белки буганина, которые по сравнению с немодифицированным белком буганином обладают пониженной способностью активировать человеческие Т-клетки.
(А) Модифицированные белки буганины.
Настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный буганин был модифицирован в целях снижения его способности вызывать иммунный ответ, а предпочтительно Тклеточный ответ, по сравнению с немодифицированным белком буганином. Зрелый белок буганина представляет собой один полипептид, состоящий из 250 аминокислот и имеющий молекулярную массу приблизительно 26200 Да |Эсп На Под с1 а1. (2002) Еиг. 1. ВюсНст. 269:1772-1779; патент США № 6680296]. Буганин представляет собой инактивирующий рибосому белок типа 1 (ШР), впервые выделенный из растения ВоидашуШеа хрссШЬПЕ УШб (бугенвиллея замечательная) |Во1одпс51 с1 а1. (1997) Р1ап1а 203:422-429]. ШР, выделенные из растений, представляют собой ΡΗΚ-Ν-гликозидазы, которые депуринизируют главную рибосомную РНК клеток, что приводит к разрушению рибосом, прекращению синтеза белка и гибели клеток.
Аминокислотная последовательность зрелого белка буганина (обозначенная однобуквенным кодом) представляет собой
ЪТО1ТТТЗККТ7КУА1ОУТПУУт№У0ОКТОСКОРЛУЕЬОК7РТУАТ
КЪРРСУТНРУТЬТРПСЗ УОКЬтаААКУОЕКОЬЕЪСУУКЪЕРЗ ΙΕΑΙΗ
ΘΚΤΙΝΟΟΕΙΑΚΕΕ1ιΐνΐΟΜν3ΕΑΑΚΕΚΥΙΕΤΕννΏΗ(3ΙυΥ<38ΕΚΡΝΕΚνΐι
ΝΣΕΝΝΗΟϋΙ 3ΟΑΙΗΚ33 РОСТТΙΝΡΑΙ01.13 Ρ3ΝΏ ΡΗννΝΚνΒΟΙ3 ΡΏ
МС1ЬКЕКЗЗК [ЗЕО Ю N0:1]
Термин немодифицированный белок буганин означает белок буганин, который не был модифицирован для снижения его способности вызывать иммунный ответ. Последовательность буганина дикого типа или немодифицированного буганина представлена в 8ЕО ΙΌ NО:1. Однако для специалиста в данной области очевидно, что термин немодифицированный буганин также включает в себя модификации в 8ЕО ΙΌ NО:1, при условии, что такие модификации не снижают его способности вызывать иммунный ответ. Примерами модификаций, которые могут быть внесены в 8ЕО ΙΌ NО:1, являются замены пептидных фрагментов и консервативных аминокислот, которые не снижают иммуногенности данного белка.
Термин модифицированный белок буганин означает белок буганин, который по сравнению с немодифицированным белком буганином является модифицированным (как описано выше), где указанные модификации снижают способность данного буганина вызывать иммунный ответ. Модифицированный
- 4 010803 белок буганин может также называться буганином, лишенным иммуногенных свойств. Модифицированный белок буганин может представлять собой полноразмерную последовательность или модифицированный фрагмент немодифицированного белка буганина. Модифицированный белок буганин по сравнению с последовательностью буганина дикого типа может также содержать и другие модификации, которые не влияют на иммуногенность пептида. Модифицированный белок буганин предпочтительно обладает такой же биологической активностью, что и немодифицированный буганин.
Используемый здесь термин пониженная способность к вырабатыванию иммунного ответа означает, что данный модифицированный белок буганин является менее иммуногенным, чем немодифицированный буганин.
Термин иммунный ответ включает в себя как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный буганин обладает пониженной способностью к активации Т-клеток.
Используемый здесь термин пониженная способность к активации человеческих Т-клеток означает, что модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток по сравнению с немодифицированным белком буганином. С помощью известных анализов, включая оценку индекса стимуляции белка, специалист в данной области может определить, обладает ли модифицированный буганин пониженной способностью к активации Т-клеток.
Используемый здесь термин индекс стимуляции означает степень способности модифицированного или немодифицированного белка буганина к активации человеческих Т-клеток. Так, например, модифицированный или немодифицированный белок буганин или его пептиды могут быть протестированы на их способность вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых ίη νίίτο. При осуществлении этого способа с использованием необученных человеческих Т-клеток, взятых у здоровых доноров, авторами настоящего изобретения было установлено, что при проведении такого анализа индекс стимуляции, равный или превышающий 2,0, является ценным показателем индуцированной пролиферации. Индекс стимуляции обычно вычисляют путем деления величины уровня пролиферации (например, количества радиоактивности в минуту в случае включения 3Н-тимидина), измеренной для тестируемого пептида, на величину, измеренную для клеток, не контактируемых с тестируемым пептидом.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает биологической активностью и пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин обладает меньшей способностью к активации человеческих Т-клеток и более низкой биологической активностью, чем немодифицированный белок буганин. В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток и не обладает биологической активностью. Такие модифицированные белки могут быть, например, использованы в качестве контроля в анализах или в целях сообщения данному индивидууму толерантности к этому белку.
Используемый здесь термин биологическая активность означает способность модифицированного или немодифицированного белка буганина ингибировать синтез белка на рибосомах, которая может быть оценена различными способами. Следует отметить, что модифицированный белок буганин будет сохранять биологическую активность, даже если такая активность ниже активности немодифицированного белка, однако, при этом необходимо, чтобы он имел определенный уровень детектируемой активности. Так, например, биологическая активность модифицированного или немодифицированного белка буганина может быть оценена путем идентификации его Ν-гликозидазной активности, а в частности, активности, достаточной для обеспечения значимого уровня ингибирования трансляции белка. Одни из таких подходящих анализов включает в себя тестирование активности различных белков буганинов по сравнению с немодифицированным буганином в бесклеточном анализе синтеза белка. Для этого осуществляют совместное инкубирование метионинсодержащей смеси для транскрипции/трансляции, ДНК, кодирующей репортерный белок люциферазу, и серийные разведения немодифицированного и модифицированного белка буганина. Уровни транслированной люциферазы могут быть легко детектированы с использованием прибора для регистрации люминесценции после добавления реагента-субстрата. Измеренная люминесценция обратно пропорциональна Ν-гликозидазной активности буганина, присутствующей в реакции. При этом обычно используют негативный контроль, такой как неактивный белок буганин, содержащий, например, замену Υ70Α.
В предпочтительном варианте изобретения модифицированный пептид буганина является модифицированным в одном или нескольких Т-клеточных эпитопах в последовательности белка буганина.
Термин Т-клеточный эпитоп означает аминокислотную последовательность, способную связываться с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса II, стимулировать Т-клетки и/или также связываться (необязательно с измеримой активацией Т-клеток) в комплексе с МНС класса II.
В одном из аспектов изобретения общий способ, который может быть применен в настоящем изо
- 5 010803 бретении, позволяет получить модифицированные Т-клеточные эпитопы, содержащие модифицированные белки буганины, где указанный способ включает в себя следующие стадии:
(ί) определение аминокислотной последовательности указанного белка или его части;
(ίί) идентификацию одного или нескольких потенциальных Т-клеточных эпитопов в аминокислотной последовательности белка соответствующими способами, такими как определение связывания пептидов с молекулами МНС с применением ίη νίίτο или ίη δίΐίοο способов или с помощью биологических анализов;
(ίίί) конструирование новых вариантов последовательностей с модифицированными одной или несколькими аминокислотами в идентифицированных потенциальных Т-клеточных эпитопах, где такие модификации приводят к значительному снижению или элиминации активности Т-клеточного эпитопа, определяемой по связыванию пептидов с молекулами МНС с применением ίη νίίτο или ίη δίΐίοο способов или с помощью биологических анализов. Такие варианты последовательностей конструируют так, чтобы в них не образовывались новые потенциальные Т-клеточные эпитопы, если только эти новые потенциальные Т-клеточные эпитопы не будут, в свою очередь, модифицированы таким образом, чтобы при этом значительно снижалась или элиминировалась активность Т-клеточного эпитопа;
(ίν) конструирование таких вариантов последовательностей способами рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для идентификации одного или нескольких вариантов с желаемыми свойствами в соответствии с хорошо известными способами рекомбинантных ДНК; и (ν) необязательно, повторение стадий (ίί)-(ίν).
В одном из примеров стадию (ίίί) осуществляют путем замены, добавления или делеции аминокислотных остатков в любом из Т-клеточных эпитопов в немодифицированном белке буганине. В другом примере указанный способ получения модифицированного белка буганина осуществляют с использованием гомологичной последовательности белка и/или ίη δίΐίοο моделирования.
Идентификация потенциальных Т-клеточных эпитопов в стадии (ίί) может быть осуществлена способами, ранее описанными в литературе. Подходящие способы описаны в документах XVО 98/59244; \νϋ 98/52976; νϋ 00/34317; νϋ 02/069232 и могут быть использованы для идентификации способности связывания происходящих от буганина пептидов с молекулой МНС класса II. Для идентификации биологически релевантных пептидов авторами настоящего изобретения был разработан способ проведения ех νίνο анализов на пролиферацию человеческих Т-клеток. Этот способ, как было подтверждено, является особенно эффективным и включает в себя тестирование перекрывающихся последовательностей происходящих от буганина пептидов по схеме, подходящей для сканирования и тестирования полноразмерной последовательности буганина. Синтетические пептиды тестируют на их способность вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых ίη νίίτο. При осуществлении этого способа с использованием необученных человеческих Т-клеток, взятых от здоровых доноров, авторами настоящего изобретения было установлено, что в этом анализе индекс стимуляции, равный или превышающий 2,0, является ценным показателем индуцированной пролиферации. Индекс стимуляции обычно вычисляют путем деления величины уровня пролиферации (например, количества радиоактивности в минуту в случае включения 3Н-тимидина), измеренной для тестируемого пептида, на величину, измеренную для клеток, не контактировавших с тестируемым пептидом.
В соответствии с этим в настоящих исследованиях, в анализах на пролиферацию Т-клеток с применением МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови), взятых у неиммунизованных доноров (т.е. не подвергавшихся сенсибилизации буганином), было использовано 89 синтетических 15-мерных пептидов (указанных в табл. 1). Для достижения оптимального охвата аллотипов МНС класса II брали образцы МКПК от 20 доноров. МКПК стимулировали отдельными пептидами в культурах в трех повторах в течение 7 дней, после чего оценивали пролиферацию по включению 3Н-тимидина. Все пептиды разводили при двух различных концентрациях: 1 и 5 мкМ. Индексы стимуляции (М) вычисляли как количество 3Н, включенного в клетки, деленное на количество 3Н, включенного в контроль, стимулированный миметиком.
Этот способ позволяет идентифицировать наибольшее число иммуногенных областей молекулы буганина у человека. В соответствии с этим в конкретном варианте изобретения модифицированный белок буганин является модифицированным в одном или нескольких аминокислотных остатках в Т-клеточном эпитопе, выбранном из группы, состоящей из:
a) ЛКУОВКОЬЕЬСУУКВ, называемого здесь областью К1 эпитопа (8ЕС Ю N0:2);
b) ЕСУУКЕЕЕЕИЕЛШС. называемого здесь областью В2 эпитопа (8ЕС Ю N0:3);
c) NС^ЕIΑКЕЕ^IVI^Μ, называемого здесь областью К3 эпитопа (8ЕС Ю N0:4).
Эти Т-клеточные эпитопы были идентифицированы на основании величины 8П2 в одном или нескольких образцах МКПК, взятых от донора. Вышеописанные пептидные последовательности представляют собой очень важную информацию, необходимую для конструирования модифицированных белков буганинов, в которых нарушены функции одного или нескольких из таких эпитопов.
В одном из вариантов изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет по меньшей мере один делетированный Т-клеточный эпитоп. В другом варианте изобретения указанный модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет один, два или три делетированных Т
- 6 010803 клеточных эпитопа. Настоящее изобретение относится также к модифицированному белку буганину, где 1-9 аминокислотных остатков модифицированы, предпочтительно, в Т-клеточном эпитопе. В другом варианте изобретения модифицированы 1-5 аминокислотных остатков. Используемый здесь термин модифицированный относится к аминокислотным остаткам, которые были модифицированы путем замены, добавления или делеции, а предпочтительно путем замены, и такой модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток. В другом варианте изобретения указанный модифицированный белок обладает биологической активностью. Более предпочтительно указанный модифицированный белок буганин согласно изобретению модифицируют путем замены в положении, соответствующем любой из аминокислот, определяемых в вышеуказанных последовательностях (а), (Ь) или (с).
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к белкам буганинам, для которых лиганды МНС класса II, идентифицируемые в любом из эпитопов К1-К3, модифицируют для предотвращения связывания либо каким-либо иным способом снижения числа аллотипов МНС, с которыми может связываться этот пептид. Аминокислоты в областях К1-К3 могут быть модифицированы путем замены, добавления или делеции для предотвращения связывания либо снижения каким-либо иным способом числа аллотипов МНС, с которыми может связываться этот пептид.
Для элиминации Т-клеточных эпитопов аминокислотные замены осуществляют в соответствующих положениях предсказанной пептидной последовательности в целях достижения значительного уровня снижения или элиминации активности Т-клеточного эпитопа. Практически, в одном из вариантов изобретения соответствующим положением является аминокислотный остаток, связывающийся в одном из карманов, находящихся в антигенсвязывающей бороздке молекулы МНС класса II.
В одном из вариантов изобретения осуществляют модификацию связывания в первом кармане бороздки в так называемом положении Р1 или в положении якоря Р1 данного пептида. Качество связывания между остатком якоря Р1 данного пептида и первым карманом антигенсвязывающей бороздки молекулы МНС класса II считается главным фактором общей аффинности связывания для полноразмерного пептида. Подходящей заменой для остатка, который плохо соответствует данному карману, является, например, замена более гидрофильным остатком в этом положении пептида. В настоящем изобретении рассматриваются также аминокислотные остатки пептида в положениях связывания в других областях кармана в антигенсвязывающей бороздке МНС, и эти аминокислотные остатки входят в объем изобретения.
Следует отметить, что одиночные аминокислотные замены, делеции или добавления в данном потенциальном Т-клеточном эпитопе являются предпочтительным способом элиминации данного эпитопа. Могут рассматриваться и комбинированные модификации (т. е. замены, делеции и добавления) в одном эпитопе, и эти модификации, например, могут быть особенно подходящими, если отдельно определяемые эпитопы перекрываются друг с другом, как в данном случае, где области эпитопов К.1 и К2 перекрываются по 5 остаткам. Кроме того, отдельные аминокислотные модификации в данном эпитопе или комбинированные модификации в одном эпитопе могут быть осуществлены в положениях, не являющихся остатками кармана в антигенсвязывающей бороздке МНС класса II, т.е. они могут быть осуществлены в любом положении пептидной последовательности. Эти модификации могут быть введены на основании гомологичной структуры, либо они могут быть введены структурным способом с использованием ίη δίΐίεο техники, известной специалистам, и могут быть созданы на основе из известных структурных особенностей молекулы согласно изобретению. Все указанные модификации входят в объем настоящего изобретения.
Области К1-К3 эпитопов буганина были проанализированы на признаки лигандов МНС класса II в их соответствующих последовательностях. Этот анализ был осуществлен с помощью компьютерной программы с использованием схем, описанных в \УО 98/59244 и в XVО 02/069232. Такая компьютерная программа имитирует презентацию антигена на уровне связывания пептида с МНС класса II и позволяет оценивать уровень связывания для любой конкретной пептидной последовательности. Такую оценку проводят для многих преобладающих аллотипов МНС класса II, имеющихся в данной популяции. Поскольку эта схема позволяет тестировать любую пептидную последовательность, то заранее можно предсказать последствия проведения аминокислотных замен, добавлений или делеций в отношении способности данного пептида взаимодействовать со связывающей бороздкой молекулы МНС класса II. Следовательно, могут быть получены новые композиции последовательностей, содержащие уменьшенное число пептидов, способных взаимодействовать с МНС класса II, и, тем самым, функционировать как иммуногенные Т-клеточные эпитопы.
В одном из вариантов изобретения в этой схеме замены в области К1 эпитопа представляют собой замены в положениях У123, Ό127 и/или Е129. Аналогичным образом в одном из вариантов изобретения для области К2 эпитопа, указанная замена осуществлена в положении Υ133. Этот остаток находится в области перекрывания К1 и К2, но для элиминации лиганда МНС класса II, связанного с К2, достаточной является замена в положении Υ133, однако, этой замены недостаточно для элиминации лигандов МНС класса II, связанных с К1. В одном из вариантов изобретения для области К3 эпитопа были сделаны замены в остатках Е151 и/или в Н52.
Во всех случаях замены присутствуют в одном или в нескольких альтернативных аминокислотных
- 7 010803 остатках. Анализ К1, проведенный с помощью компьютерной программы для стимуляции МНС класса II, показал, что аминокислотные остатки 123, 127, 129 и 131 являются остатками, которые в этом эпитопе играют ключевую роль в связывании с молекулами МНС II. Остаток 123 представляет собой предпочтительное положение для мутации области К1, поскольку он находится на поверхности молекулы, удаленной от активного центра, и является вариабельным, как было определено при выравнивании последовательности К1Р. Тем не менее, не все замены приводят к получению активной молекулы, а поэтому необходимо подтвердить мутации с помощью анализа на биологическую активность. Так, например, в К.1 замены У123Т, У123А и У123О являются примерами предпочтительных альтернативных замен. Было обнаружено, что остаток 131 является абсолютно консервативным в ШР, а поэтому он является мало подходящим для мутации. Остатки 127 и 129 не являются высококонсервативными, однако, было обнаружено, что на связывание с МНС II влияет только ограниченное число остатков. Предпочтительными заменами являются также серии замен в положениях Ό127Ο, Б127А, Е129О и Е129О. Было показано, что для К2 остаток 133 является возможным кандидатом для предотвращения связывания с МНС II, и его явная поверхностная локализация (как было определено путем моделирования), наряду с тем фактом, что он не является высококонсервативным по всему ШР. делает его хорошим кандидатом на мутацию. Было обнаружено, что предпочтительными альтернативными заменами являются замены в положениях Υ133Ν, Υ133Τ, Υ133Α, Υ133Κ, Υ133Ό, Υ133Ε, Υ133Ρ, Υ133Ο, Υ133Κ, Υ133Η и Υ1338. Для К3 аминокислотные остатки 152, 155 и 158 были идентифицированы как остатки, играющие ключевую роль в связывании с МНС II. Однако остатки 155 и 158 являются частью в высокой степени консервативной гидрофобной последовательности, что позволяет предположить, что их модификация не приводит к получению биологически активных молекул. Было обнаружено, что более подходящим кандидатом является низкоконсервативный остаток. Для К3 предпочтительными заменами также являются серии замен П52О и П52А.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный буганин модифицирован в одном или нескольких остатках X1, X2, X3, X4 или X5, а именно:
a) ΑΚX1^КΚX2^X3^ΟУX4Κ^ (области К1 эпитопа, 8ЕО II) N0:5);
b) ^ΟУX4Κ^ΕΕ8IΕΑIΗΟ (области К2 эпитопа, 8ЕО II) N0:6);
c) N6^ΕX5ΑΚББ^IУI^Μ (области К3 эпитопа, 8ЕО II) N0:7), где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту.
В конкретном варианте изобретения X1 представляет собой Т, А или О; X2 представляет собой О или А; X3 представляет собой О или Ο; X4 представляет собой Ν, Ό, Т, А, К, О, Е, О, Н, Κ или 8; а X5 представляет собой О или А (область К1 эпитопа, 8Е0 ГО N0:8; область К2 эпитопа, 8Е0 ГО N0:9; область К3 эпитопа, 8Е0 ГО N0:10).
Наиболее предпочтительные замены, взятые вместе, могут быть осуществлены на основании исследований по картированию иммуногенных эпитопов с помощью Т-клеточных анализов ех νίνο путем имитации связывания пептидов с МНС ίη кШсо и структурного анализа, основанного на гомологии последовательностей. И, наконец, если биологически активный белок является предпочтительным, то может быть затем осуществлен анализ на ίη νίίτο активность модифицированного белка, который может содержать одну или множество мутаций.
В соответствии с этим в другом своем варианте настоящее изобретение относится к модифицированному пептиду буганина, содержащему аминокислотную последовательность
ΥΝΤν3ΡΝΣΟΕΑΥΕΥΡΤΡΙΟΟΣΚΝΕΣΑΚ3ΤΡνθΟΣΡνΤΣΟΤΙΑΏυΚΚΡν
ΙΛΤϋΙТТТ5ΚΚΤνκνΑΙΏνΤΟνΥννΘΥΟΏΚΗϋΟΚΟΚΑνΓΓΟΚνΡΤνΑΤ
5ΚΣΡΡ(3νΤΝΚνΤΣΤΡΟ<33Υ0Κ£νΝΑΑΚΧ1ΠΚΚΧ2Ι1Χ3ΙΧ3νΧ<ΚΣΕΡ3ΙΕΑ ΙΗσΚΤΙΝαθΕΧ5ΑΚΡΓΟΐνΐαΜν3ΕΑΆΚΓΚΥΙΕΤΕννθΕ(3ΣΥ<33ΡΚΡΝΡ
ΚνΣΝΣΕΝΝΝ6ΟΙ3ϋΑΙΗΚ33Ρ0ΟΤΤΙΝΡΑΣ0ΣΙ3Ρ3ΝΟΡΝννΝΚν30Ι
3ΡϋΜ0ΙΣΚΡΚ33Κ где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту (8Е0 ГО N0:11).
В предпочтительном варианте изобретения X1 представляет собой Т, А или О; X2 представляет собой О или А; X3 представляет собой О или Ο; X4 представляет собой N Ό, Т, А, К, О, Е, О, Н, Κ или 8; а X5 представляет собой О или А (8Е0 ГО N0:12).
В конкретном варианте изобретения модифицированный белок буганин содержит аминокислотную последовательность
ΥΝΤνδΡΝΣΰΕΑΥΕΥΡΤΡΙΟϋΣΚΝΕΣΑΚΟΤΡνΟΟΣΡνΤΣΟΤΙΑϋΟΚΚΡν
ΣνΏΙΤΤΤΞΚΚΤνκνΑΙΏνΤΟνΥννσΥΟΟΚΗϋαΚΏΚΑνΕΣϋΚνΡΤνΑΤ
3ΚΣ ΡΡθνΤΝΚνΤΣΤΡΏ03 Υ0ΚΣνΝΑΑΚΑΏΕΚΑΣΕΣθνΝΚΣΕΡ3ΙΕΑΙΗ
ΘΚΤΙΝΟΰΕΑΑΚΡΡΣΐνΐΟΜν3ΕΑΑΚΡΚΥΙΕΤΕννΏΚσΣΥ(33ΡΚΡΝΡΚνΣ
ΝΣΕΝΝΗΟΌ13ΏΑΙΗΚ33 РОСТТΙΝΡΑΣΟΣΙ 3Ρ3ΝΟΡΗννΝΚν3013 РО
ΜΟΙΣΚΡΚ85Κ (ЗЕО Ιϋ N0:13).
- 8 010803
В еще одном варианте изобретения модифицированный белок буганин содержит аминокислотную последовательность
УЖУЗРЫЬСЕАУЕУРТР10ПЬ1ШЕ1ЛКаТРУС0ЬРУТЬ0Т1АООККГ7
ΕνΌΙΤΤΤ3ΚΚΤνκνΆΙΏντηνΥνν<3Υ0ΌΚ№αΚΟΚΑνΡΏϋΚνΡΤνΑΤ
ЗКЬГРОУТЫКУТЬТРОСЗУОКЬУИААКАОККАЬЕЬаУОКЬЕРЗХЕАГН
ОКТ1ЫО0ЕААКГРЫ VIОМУЗЕААЙРКУ1ЕТЕЙТОЙСЬУСЗРКРЫРКУЬ
ΝΒΕΝΝΜα0Ι5ΏΑΙΗΚ53Ρ0στΤΙΝΡΑΣ0ΕΙ3Ρ3ΝΟΡΜννΝκν3(2Ι8₽η
МО1ЪКРКЗЗК (ЗЕО Ю N0:14).
Подчеркнутые остатки представляют собой замененные остатки, отличающиеся от остатков немодифицированного белка буганина.
Как очевидно для каждого специалиста, может быть введено множество альтернативных серий модификаций, что позволяет удалять нежелательные эпитопы. Однако полученные последовательности должны быть в общих чертах гомологичными описанным здесь специфическим белкам, а поэтому они входят в объем настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения входят также очевидные химические эквиваленты последовательностей, описанных в настоящем изобретении. Такими эквивалентами являются белки, которые обладают аналогичной функцией и действуют, по существу, по тому же самому механизму.
В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных модификаций в Т-клеточных эпитопах белка.
В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению, при его тестировании в Т-клеточном анализе, имеет более низкий индекс стимуляции по сравнению с немодифицированным белком буганином.
В другом варианте изобретения Т-клеточные эпитопы белка буганина картируют с помощью Тклеточного анализа, а затем модифицируют, в результате чего, после повторного тестирования в Тклеточном анализе, указанный модифицированный белок буганин, по сравнению с немодифицированным белком буганином, имеет более низкий индекс стимуляции, а предпочтительно индекс стимуляции, составляющий менее чем 2,0.
Для специалиста в данной области очевидно, что если модифицированный белок буганин обладает, по существу, пониженной биологической активностью или вообще не обладает такой активностью, то для восстановления биологической активности такого модифицированного белка буганина может потребоваться его дополнительная модификация, проводимая путем замены, добавления или делеции аминокислотных остатков. Однако модифицированные белки буганины, которые, по существу, обладают пониженной биологической активностью или вообще не обладает такой активностью, также входят в объем настоящего изобретения и могут быть использованы в качестве контроля в анализах или в целях сообщения толерантности.
В одном из вариантов изобретения указанный модифицированный буганин мутирован в положении 70 тирозинового остатка, в результате чего этот буганин является инактивированным. В конкретном варианте изобретения тирозин в положении 70 заменен аланином. В предпочтительном варианте изобретения указанный модифицированный буганин имеет последовательность
ΥΝΤν3 ΡΝΙΖ3ΕΑΥΕΥΡΤΓΙООЬНМЕЬАКОТРЧСОЬРУТЬОТ1АВЙКР.РУ
ΕνΟΙΤΤΤΒΚΚΤνκνΑΙϋνΊΤίνΑννΟΥΟΟΚΝΌσΚΏΚΑνΡΏυκνΡΤνΑΤ
ЗКЬРРОТтаКУТЬТРОСЗУОКЬУКААКТОККОЬЕЬСУУКЪЕРЗТЕАТН (3ΚΤΙΝ<30ΕΙΑΚΡΡΕΐνΐ0Μν5ΕΑΑΚΡΚΥΙΕΤΕννΏΚ3ΒΥ<33ΡΚΡΝΡΚνΐ Μ,ΕΝΝΝΟΟΙ30ΑΙΗΚ53ΡΟΟΤΤΙΝΡΑΟΟΕΙ3Ρ3ΝΏΡΚΓννΝΚν30Ι3ΡΟ МСШКРКЗЗК [ЗЕО Ιϋ N0:129] .
В схеме настоящего изобретения эпитопы разрушаются под действием мутации, приводящей к образованию последовательностей, которые уже не способны функционировать как Т-клеточные эпитопы. Для осуществления направленного мутагенеза последовательностей-мишеней могут быть применены способы рекомбинантных ДНК, и многие из этих способов являются доступными и хорошо известны специалистам. На практике могут быть продуцированы различные модифицированные белки буганины, которые могут быть протестированы на нужные иммунные и функциональные свойства. Особенно важно, чтобы при осуществлении модификации белковой последовательности, в которую вносят рассматриваемые изменения, в нее не были введены новые иммуногенные эпитопы. Практически этого можно избежать путем повторного тестирования рассматриваемой последовательности на присутствие эпитопов и/или лигандов МНС класса II любым подходящим способом.
Модифицированные белки буганины согласно изобретению могут также содержать пептидымиметики, либо они могут быть использованы для получения или конструирования пептидовмиметиков. Пептиды-миметики представляют собой структуры, которые служат в качестве заменителей пептидов при их взаимодействии с молекулами (см. Могдап с( а1. (1989) Апп. Керойз. Мей. Сйет.
- 9 010803
24:243-252). Пептидами-миметиками являются синтетические структуры, которые могут содержать, а могут и не содержать, аминокислотные и/или пептидные связи, но которые при этом сохраняют структурные и функциональные признаки белка согласно изобретению, включая биологическую активность и пониженную способность активировать человеческие Т-клетки. Пептидами-миметиками также являются пептоиды, олигопептоиды (81топ е! а1. (1972) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сЕ, И8Л, 89:9367).
Пептиды-миметики могут быть сконструированы на основе информации, полученной путем систематической замены Ь-аминокислот Ό-аминокислотами, путем замены боковых цепей группами, имеющими различные электронные свойства, и путем систематической замены пептидных связей амидными связями. Для определения конформационных требований к активности кандидата на пептид-миметик могут быть введены также локальные конформационные затруднения. Такие миметики могут включать в себя изостерические амидные связи или Ό-аминокислоты для стабилизации или стимуляции конформации с обратно направленными витками и для облегчения стабилизации данной молекулы. Для ограничения аминокислотных остатков конкретными конформационными состояниями могут быть использованы циклические аминокислотные аналоги. Указанными миметиками могут быть также имитаторы вторичных структур белков согласно изобретению. Эти структуры могут служить моделью 3-мерной ориентации аминокислотных остатков, с образованием известных вторичных конформаций белков. Могут быть использованы также пептоиды, которые представляют собой олигомеры Ν-замещенных аминокислот, и эти пептоиды могут быть использованы в качестве мотивов для генерирования химически разнообразных библиотек новых молекул.
Молекулы согласно изобретению могут быть получены любыми способами, но наиболее предпочтительно рутинными рекомбинантными способами. Существует относительно простая процедура, в которой анализируют последовательности белка и на основе имеющейся информации получают полинуклеотид (ДНК), кодирующий любую из предпочтительных последовательностей белка. Это может быть достигнуто, например, с использованием компьютерных программ, таких как пакет программ ΌΝδδίατ [ΌΝΑδίαΓ 1пс, Майкоп. ^1, И8А] или аналогичных программ. Любая такая ДНК-последовательность, способная кодировать предпочтительные полипептиды согласно изобретению или их важные гомологи, должна рассматриваться как вариант настоящего изобретения.
В соответствии с общей схемой, гены, кодирующие любые предпочтительные модифицированные последовательности белка буганина, могут быть получены путем генного синтеза и клонированы в подходящий экспрессирующий вектор. Этот экспрессирующий вектор, в свою очередь, вводят в клеткухозяина, и клетки отбирают и культивируют. Белки согласно изобретению выделяют из культуральной среды и на их основе получают препарат для терапевтического введения. Альтернативно, генная последовательность буганина дикого типа может быть получена, например, в соответствии со стратегией клонирования кДНК с использованием РНК, выделенной из тканей корней растения ВоидашуШеа крес!аЬ1кк ^УН1й. Ген дикого типа может быть использован в качестве матрицы для мутагенеза и конструирования предпочтительных вариантов последовательностей. В этом отношении особенно удобно применять стратегию ПЦР с перекрывающимся удлинением, как описано ШдисЫ е! а1. [ШдисЫ е! а1. (1988) ШсШс Ас1йк Кек. 16:7351], хотя могут быть с успехом использованы и другие методики и системы.
Биологическая активность белков согласно изобретению с равным успехом может быть оценена многими способами. В одном из вариантов изобретения модифицированные молекулы буганина идентифицируют по Ν-гликозидазной активности, а в частности, по активности, достаточной для значительного ингибирования трансляции белка. Один из таких подходящих анализов включает в себя тестирование активности модифицированных белков буганинов по сравнению с немодифицированным буганином в бесклеточном анализе синтеза белка. Для этого осуществляют совместное инкубирование метионинсодержащей смеси для транскрипции/трансляции ДНК, кодирующей репортерный белок люциферазу и серийные разведения немодифицированного и модифицированного белка буганина. Уровни транслированной люциферазы могут быть легко детектированы с использованием прибора для регистрации люминесценции после добавления реагента-субстрата. Измеренная люминесценция обратно пропорциональна Ν-гликозидазной активности буганина, присутствующей в реакции. При этом обычно используют негативный контроль, такой как, например, неактивный белок буганин, содержащий замену Υ70Α.
Конструирование предпочтительных и активных молекул буганина может быть осуществлено способами рекомбинантных ДНК, и такое конструирование включает связывание молекул буганина с нужным антителом или с другими нацеливающими молекулами. Способы очистки и модификации рекомбинантных белков, включая гибридные белки, хорошо известны специалистам. Необходимые способы подробно описаны в литературе, например, в Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, кесопй еййюп (8ашЬгоок е! а1., 1989); О11допис1еоййе 8уп!кек1к (М.1. Сай ей., 1984); Ашта1 Се11 Си1!иге (К.1. Ггеккпеу ей., 1987); Ме!койк ίη Епхуто1оду (Асайетю Ргекк, 1пс.); НапйЬоок оГ Ехрептеп!а1 1ттипо1оду (И.М. \Уей & С.С. В1аскте11, ейк.); Сепе ТгапкГег Уес!огк Гог МаттаНап Се11к (ГМ. МШег & М.Р. Са1ок, ейк., 1987); Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Г.М. АикиЬе1 е! а1., ейк., 1987); РСК: Тке Ро1утегаке скат Кеас!юп (МиШк е! а1., ейк., 1994); Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду (ГЕ. Сокдап е! а1., ейк., 1991).
Белки и пептиды согласно изобретению могут быть получены способами рекомбинантных ДНК. Белки согласно изобретению могут быть также получены способами химического синтеза, хорошо из
- 10 010803 вестными специалистам в области химии белков, такими как твердофазный синтез (МепгДе1б, 1964, 1. Ат. С’Нет. Аккос. 85:2149-2154) или синтез в гомогенном растворе (НоиЬеиетеу1, 1987, МеИобк οί Огдашс СйеткДу, еб., Е. \Уапкс11. Уо1. 15 I апб II, ТЫете, 8!ибдаг1).
Настоящее изобретение также относится к очищенной и выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую модифицированные белки буганины или их пептиды согласно изобретению, а предпочтительно последовательность, кодирующую белок, описанный здесь как 8ЕС ГО N0:13 или 8ЕС ГО N0:14.
Используемый здесь термин выделенный и очищенный относится к нуклеиновой кислоте, по существу, не содержащей клеточного материала или культуральной среды, при ее продуцировании способами рекомбинантных ДНК, или химических предшественников или других химических веществ, при ее продуцировании способом химического синтеза. Выделенная и очищенная нуклеиновая кислота также, по существу, не содержит последовательностей, обычно фланкирующих природную нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных у 5'- и З'-концов данной нуклеиновой кислоты), от которой происходит данная нуклеиновая кислота.
Используемый здесь термин нуклеиновая кислота означает последовательность нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящих из природных оснований, сахаров и связей между сахарами (в остове). Этот термин также включает модифицированные или замененные последовательности, содержащие неприродные мономеры или их части, имеющие аналогичную функцию. Последовательностями нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть рибонуклеиновые (РНК) или дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), и эти последовательности могут содержать природные основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Эти последовательности могут также содержать модифицированные основания, такие как ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азаурацил, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенины, 8-гидроксиаденин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8гидроксигуанин и другие 8-замещенные гуанины, другие аза- и деазаурацилы, тимидины, цитозины, аденины или гуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.
В одном из вариантов изобретения очищенная и выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую белки или пептиды, а предпочтительно 8ЕС ГО N0:13 или 8ЕЭ ГО N0:14 согласно изобретению, где указанная последовательность включает:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, где Т может также представлять собой И;
(b) последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные последовательности (а);
(c) последовательности нуклеиновой кислоты, гомологичные последовательностям (а) или (Ь);
(б) фрагмент (а)-(с), который составляет по меньшей мере 15 оснований, а предпочтительно 20-30 оснований, и который гибридизуется с последовательностями (а)-(с) в жестких условиях гибридизации; или (е) молекулу нуклеиновой кислоты, отличающуюся от любой из нуклеиновых кислот (а)-(с) последовательностями кодонов вследствие вырожденности генетического кода.
Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие значительную гомологию с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими белки и пептиды согласно изобретению и их фрагменты. Термин последовательности, имеющие значительную гомологию с данными последовательностями означает последовательности нуклеиновой кислоты, которые имеют незначительные или не играющие важной роли отличия от этих последовательностей, т.е. последовательности, имеющие, по существу, ту же самую функцию и продуцирующие функционально эквивалентные белки. Указанные отличия могут быть обусловлены локальными мутациями или структурными модификациями.
Последовательностями нуклеиновой кислоты, имеющими значительную гомологию, являются последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80%, а предпочтительно на 90% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белки и пептиды согласно изобретению.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты и к ее фрагментам, имеющим по меньшей мере 15 оснований, которые гибридизуются с молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению в условиях гибридизации, а предпочтительно в жестких условиях гибридизации. Соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, известны специалистам или могут быть описаны в руководстве Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1ш ^11еу & 8опк, ΚΥ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Так, например, гибридизация может быть проведена с использованием 6,0ххлорида натрия/цитрата натрия (88С) примерно при 45°С, с последующей промывкой 2,0х88С при 50°С. Жесткость условий гибридизации может быть выбрана исходя из условий, используемых в стадии промывки. Так, например, концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана в соответствии с условиями высокой жесткости, т.е. примерно 0,2х88С при 50°С. Кроме того, температура стадии промывки может также соответствовать условиям высокой жесткости, т.е. составлять примерно 65°С.
- 11 010803
В соответствии с этим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, имеющие последовательность, кодирующую белок или пептид согласно изобретению, могут быть встроены в соответствии с известными процедурами в подходящий экспрессирующий вектор, гарантирующий хорошую экспрессию белка или пептида. Подходящими экспрессирующими векторами являются, но не ограничиваются ими, космиды, плазмиды или модифицированные вирусы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), при условии, что такой вектор будет совместимым с используемой клеткой-хозяином. Выражение векторы, подходящие для трансформации клеткихозяина означает, что данные экспрессирующие векторы содержат молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению и регуляторные последовательности, отобранные из клеток-хозяев, используемых для экспрессии, и функционально присоединенные к данной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин функционально присоединенный означает, что данная нуклеиновая кислота присоединена к регуляторным последовательностям так, чтобы осуществлялась ее экспрессия.
Поэтому в настоящем изобретении рассматривается рекомбинантный экспрессирующий вектор согласно изобретению, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее фрагмент, и регуляторные последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции встроенной последовательности белка. Подходящие регуляторные последовательности могут происходить от различных источников, включая бактериальные, грибковые или вирусные гены (см., например, регуляторные последовательности, описанные в публикации Соеббе1, Сеие Ехртеккюп Тес1шо1оду: МеПюбк ίη Епхуто1оду 185, Асабетэс Ргекк, 8ап О|едо. СА (1990)). Выбор соответствующих регуляторных последовательностей зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко осуществлен средним специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются транскрипционный промотор и энхансер или последовательность, связывающаяся с РНК-полимеразой, и последовательность, связывающаяся с рибосомой, включая сигнал инициации трансляции. Кроме того, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в экспрессирующий вектор могут быть введены и другие последовательности, такие как ориджин репликации, дополнительные ДНКрестрикционные сайты, энхансеры и последовательности, сообщающие индуцибельность транскрипции. Также следует отметить, что необходимые регуляторные последовательности могут поставляться природным белком и/или его фланкирующими областями.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут также содержать селективный маркерный ген, который облегчает выбор клеток-хозяев, трансформированных или трансфецированных рекомбинантной молекулой согласно изобретению. Примерами селективных маркерных генов являются гены, кодирующие белок, такой как С418 и гигромицин, который сообщает резистентность к некоторым лекарственным средствам, β-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу или люциферазу светляков. Мониторинг транскрипции селективного маркерного гена проводят по изменению концентрации селективного маркерного белка, такого как β-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза или люцифераза светляков. Если селективный маркерный ген кодирует белок, сообщающий резистентность к антибиотикам, такую как резистентность к неомицину, то клетки-трансформанты могут быть отобраны с использованием С418. Клетки, включающие селективный маркерный ген, будут выживать, а другие клетки будут погибать. Это позволяет осуществлять визуализацию и анализ на экспрессию рекомбинантных экспрессирующих векторов согласно изобретению, а в частности, определять влияние мутации на экспрессию и фенотип. Следует отметить, что селективные маркеры могут быть введены в отдельный вектор, состоящий из представляющей интерес нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут также содержать гены, кодирующие гибридную молекулу, которая обеспечивает повышенную экспрессию рекомбинантного белка, повышенную растворимость рекомбинантного белка и облегчает очистку нужного рекомбинантного белка благодаря своему действию в качестве лиганда при проведении аффинной очистки. Так, например, в нужный рекомбинантный белок может быть введен сайт протеолитического расщепления для отделения данного рекомбинантного белка от гибридной молекулы после очистки гибридного белка.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки-хозяева для продуцирования трансформированной клетки-хозяина. Термин трансформированная клетка-хозяин включает прокариотические и эукариотические клетки, которые были трансформированы или трансфицированы рекомбинантным экспрессирующим вектором согласно изобретению. Термины трансформированный, трансфицированный, трансформация и трансфекция относятся к введению нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку одним из многих возможных способов, известных специалистам. Прокариотические клетки могут быть трансформированы нуклеиновой кислотой, например, путем электропорации или трансформации, опосредуемой хлоридом кальция. Нуклеиновая кислота может быть введена в клетки млекопитающих стандартными способами, такими как копреципитация фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекция, опосредуемая ΌΕΑΕ-декстраном, способ с использованием липофектина, электропорация или микроинжекция. Подходящие способы трансформации и трансфекции клетокхозяев можно найти в руководстве 8ашЬтоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2ηά Εάίΐίοη, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк (1989)) и в других лабораторных руководствах.
- 12 010803
Подходящими клетками-хозяевами являются прокариотические и эукариотические клетки-хозяева широкого ряда. Так, например, белки согласно изобретению могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Е.со11, клетки насекомых (с использованием бакуловирусов), дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева можно найти в публикации СоеббеГ Сепе Ехргеккюп Тес11по1оду: МеШобк ίη Епхушо1оду 185, Асабетю Рге§8, 8ап Όίβ^ο, СА (1991).
Нуклеиновая кислота считается функционально присоединенной, если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально присоединена к ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде пре-белка, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально присоединен к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию последовательности, или сайт связывания с рибосомой функционально присоединен к кодирующей последовательности, если его расположение облегчает трансляцию. Вообще говоря, термин функционально присоединенный означает, что присоединенные ДНК-последовательности являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности они являются смежными и сохраняют рамку считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Присоединение осуществляется путем лигирования в подходящих рестрикционных сайтах. Если такие сайты отсутствуют, то в соответствии с общепринятой практикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
В некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный буганин с низким числом потенциальных Тклеточных эпитопов, и функционально присоединенную к последовательности регуляции экспрессии. В различных вариантах изобретения экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки или пептиды согласно изобретению, или их вырожденный вариант и может содержать, по меньшей мере, КГР-кодирующий домен указанных нуклеиновых кислот, функционально присоединенных к подходящим последовательностям регуляции экспрессии и последовательностям для отбора. Вырожденность полинуклеотидов является хорошо известным фактом, означающим, что многие аминокислоты данного генетического кода кодируются более чем одним кодоном. Вырожденность данного кода приводит к тому, что 20 различных аминокислот кодируются 64 возможными последовательностями-триплетами, имеющими три из четырех возможных оснований, составляющих ДНК.
Используемый здесь термин КГР-кодирующий домен или домен, кодирующий белок, инактивирующий рибосому означает функциональный домен, который сообщает буганину его биологическую активность.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также химически синтезированы стандартными способами. Различные способы химического синтеза полидезоксинуклеотидов являются известными, включая твердофазный синтез, который, подобно пептидному синтезу, полностью автоматизирован и проводится на коммерчески доступных ДНК-синтезаторах (см., например, Иакига еί а1., патент США № 4598049; СагиШега еί а1., патент США № 4458066 и [(акига, патенты США № 4401796 и 4373071).
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим гибридные белки, содержащие новый белок согласно изобретению и выбранный белок, или селективный маркерный белок.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к культивированной клетке, содержащей по меньшей мере один из вышеупомянутых векторов.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного буганина, включающему культивирование вышеупомянутой клетки в условиях, способствующих экспрессии модифицированного буганина в экспрессирующем векторе и выделение указанного буганина из этой клетки.
(В) Модифицированные цитотоксины буганины.
Как упоминалось ранее, буганин представляет собой инактивирующий рибосому белок типа 1 (ШР), который депуринизирует главную рибосомную РНК клеток, что приводит к прекращению синтеза белка и к гибели клеток. Сами модифицированные буганины согласно изобретению могут быть использованы для получения цитотоксинов. Цитотоксины, содержащие модифицированный белок буганин, являются более предпочтительными по сравнению с цитотоксинами, содержащими немодифицированный белок буганин, поскольку первые цитотоксины являются менее иммуногенными и, по всей вероятности, менее подвержены разрушению под действием иммунной системы до того, как они достигнут нужной цели.
В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к цитотоксину, содержащему (а) нацеливающую молекулу, присоединенную к (Ь) модифицированному белку буганину согласно изобретению.
Термин модифицированный белок буганин согласно изобретению используется для удобства и включает любые и все описанные здесь модифицированные белки буганины, такие как модифицированные белки буганины, описанные выше в разделе (А), а также на фигурах и в примерах.
Используемый здесь термин нацеливающая молекула означает вещество, средство или способ доставки модифицированного белка буганина в клетку-мишень. В одном из вариантов изобретения ука
- 13 010803 занной нацеливающей молекулой является антитело. В одном из вариантов изобретения указанной нацеливающей молекулой может быть липосома. В одном из вариантов изобретения указанная липосома может быть присоединена к антителу. В другом варианте изобретения указанной нацеливающей молекулой является белок, способный обеспечивать специфическое связывание с конкретной клеткой-мишенью. Такие белковые молекулы включают различные полипептидные лиганды, для которых имеются специфические рецепторы на клеточной поверхности, а поэтому они включают различные цитокины, пептидные и полипептидные гормоны и другие модификаторы биологических ответов. Характерными примерами являются такие белки, как васкулярный эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, герегулин, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли и другой белок и молекулы гликопротеина. Могут также рассматриваться гибридные белки этих и других молекул с буганином согласно изобретению, и эти белки могут содержать модифицированную молекулу буганина либо в Ν-концевой, либо в С-концевой ориентации по отношению к домену белкового лиганда. Указанная нацеливающая молекула может быть присоединена к белкам согласно изобретению непосредственно или посредством линкера. В одном из вариантов изобретения указанным линкером является пептидный линкер или химический линкер. Аналогичным образом, в настоящем изобретении может рассматриваться химическое перекрестное связывание очищенного лиганда с модифицированным белком буганином, и такое связывание входит в объем изобретения.
В своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему (а) лиганд, который связывается с раковой клеткой, и (Ь) связанный с этим лигандом модифицированный белок буганин согласно изобретению.
Лигандом может быть любая молекула, которая может связываться с раковой клеткой, включая, но не ограничиваясь ими, белки. В одном из вариантов изобретения указанным лигандом является антитело или фрагмент антитела, которые распознают поверхность раковой клетки.
В соответствии с этим цитотоксины согласно изобретению могут быть использованы для лечения различных форм рака, таких как рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы, Т-клеточные и Вклеточные лимфомы.
В одном из вариантов изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, содержит полноразмерную молекулу иммуноглобулина, которая связывается с раковой клеткой. Если лигандом, связывающимся с раковой клеткой, является антитело или его фрагмент, то цитотоксин может быть назван иммунотоксином. В другом варианте изобретения лигандом, связывающимся с раковой клеткой, является димер ЕаЬ-фрагмента, ЕаЬ'-фрагмента, 8сΕν-фрагмента, фрагмента однодоменного антитела или дисульфидстабилизированных Εν-фрагментов. В другом варианте изобретения противораковое антитело содержит вариабельную тяжелую цепь, вариабельную легкую цепь, ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент, 8сΕν-фрагмент, фрагмент однодоменного антитела или дисульфид-стабилизированный Εν-фрагмент. Части лиганда, связывающегося с раковой клеткой, могут происходить от одного или нескольких видов, предпочтительно они включают части, происходящие от человека, а наиболее предпочтительно эти части является полностью человеческими или гуманизованными. Области, сконструированные для облегчения очистки или для конъюгирования с токсином, могут быть также включены в часть, связывающуюся с раковой клеткой, либо они могут быть присоединены к ней.
В конкретном варианте изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, распознает ЕрСАМ. Ер-САМ (адгезивная молекула эпителиальных клеток, также известная как 17-1А, К8А, ЕСР-2 и СА733-2) представляет собой трансмембранный белок, который в высокой степени экспрессируется во многих солидных опухолях, включая карциномы легких, молочной железы, яичника, ободочной кишки и плоскоклеточную карциному головы и шеи, но слабо экспрессируется в большинстве нормальных эпителиальных тканей.
В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному цитотоксину буганину, конъюгированному с нацеливающей молекулой Ер-САМ, где указанный цитотоксин включает (а) лиганд (такой, как антитело или фрагмент антитела), который связывается с Ер-САМ на раковой клетке; и (Ь) связанный с этим лигандом модифицированный белок буганин, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки.
В конкретном варианте изобретения указанный цитотоксин содержит (а) гуманизованное антитело или фрагмент антитела, которые связываются с внеклеточным доменом человеческого Ер-САМ и включают последовательности гипервариабельной области (ΟΌΚ), происходящие от антитела МОС-31 и присоединенные к (Ь) модифицированному белку буганину, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки.
Подходящими модифицированными буганинами, конъюгированными с Ер-САМ, согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, УВ6-845 и их варианты, другие цитотоксины, содержащие другие одноцепочечные или двухцепочечные иммуноглобулины, которые селективно связываются с ЕрСАМ, или их варианты. Используемый здесь термин УВ6-845 означает цитотоксин, который содержит
- 14 010803
ЕаЬ-вариант 5сР\'-антитела против Ер-САМ, связанного с модифицированной формой буганина, Вои156 (8ΕΟ ΙΌ N0:13). Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность νΒ6-845 показаны на фиг. 3В (8Ε0 ΙΌ N0:16 и 8Ε0 ΙΌ N0:15, соответственно).
В другом варианте изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, распознает опухолеассоциированный антиген, который присутствует только на опухолевых клетках, но отсутствует в нормальных клетках. В предпочтительном варианте изобретения указанным лигандом является антитело, которое связывается с опухолеассоциированным антигеном. Антитело против опухолеассоциированного антигена специфически распознает раковые клетки широкого ряда, но не распознает нормальные нераковые клетки.
В соответствии с другим своим вариантом настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему (а) лиганд (такой, как антитело или фрагмент антитела), который связывается с опухолеассоциированным антигеном на раковой клетке; (Ь) и связанный с этим антигеном модифицированный белок буганин, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки.
Подходящими модифицированными буганинами, конъюгированными с опухолеассоциированным антигеном, согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, νΒ6-011 и их варианты, или другие цитотоксины, содержащие другие одноцепочечные или двухцепочечные иммуноглобулины, которые селективно связываются с опухолеассоциированным антигеном, или их варианты. Используемый здесь термин νΒ6-011 означает цитотоксин, который содержит ЕаЬ-вариант моноклонального человеческого антитела Н11, генетически связанного с модифицированной формой буганина, Βοи156 (8Ε0 ΙΌ N0:13). Антитело Н11 было получено путем слияния лимфоцитов периферической крови, взятых у 64летнего пациента-мужчины, страдающего раком, с человеческой миеломной клеточной линией с образованием гибридомы. Гибридома NΒ6Μ1/Η11 продуцирует ΙβΜ|.:. который был реконструирован в ЕаЬ с получением νΒ6-011 (см. патент США № 6207153 или ν0 97/44461, где подробно описано получение гибридомы, секретирующей антитело Н11). Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность νΒ6-011 показаны на фиг. 15 (8Ε0 ΙΌ N0:28 и 8Ε0 ΙΌ N0:27, соответственно).
В конкретном неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин содержит νΒ6-845 (фиг. 3В, 8Ε0 ΙΌ N0:16) или νΒ6-011 (фиг. 15, 8Ε0 ΙΌ N0:28). В других неограничивающих вариантах изобретения указанный цитотоксин содержит вариант νΒ6-845 или νΒ6-011.
Вариант νΒ6-845 связывается с тем же самым эпитопом Ер-САМ или, по существу, с аналогичным эпитопом Ер-САМ, который связывается с νΒ6-845, и этот вариант может конкурентно ингибировать по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание νΒ6845 с Ер-САМ в физиологических условиях. Вариант νΒ6-845 может содержать такой же модифицированный буганин, как и νΒ6-845, либо он может содержать другой модифицированный буганин согласно изобретению. В другом неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин содержит ЕрСАМ-связывающую часть, включающую вариабельную область М0С31 или ее вариант. В еще одном варианте изобретения указанный цитотоксин содержит Ер-САМ-связывающую часть, включающую 4^5Μ0СΒ, или ее вариант. Уровень связывания любого из этих цитотоксинов с Ер-САМ может быть снижен по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% путем конкурентного связывания с исходным антителом М0С31 или 4^5Μ0СΒ в физиологических условиях.
Вариант νΒ6-011 связывается с тем же самым эпитопом опухолеассоциированного антигена, или, по существу, с аналогичным эпитопом опухолеассоциированного антигена, который связывается с νΒ6011, и этот вариант может конкурентно ингибировать по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание νΒ6-011 с опухолеассоциированным антигеном в физиологических условиях. Вариант νΒ6-011 может содержать такой же модифицированный буганин, как и νΒ6-011, либо он может содержать другой модифицированный буганин согласно изобретению. В другом неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин включает часть, связывающуюся с опухолеассоциированным антигеном и содержащую моноклональное антитело Η11, антигенсвязывающие фрагменты Η11 или его варианты. Уровень связывания любого из этих цитотоксинов с νΒ6-011 может быть снижен по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% путем конкурентного связывания с исходным антителом Η11 в физиологических условиях.
В предпочтительном варианте изобретения аффинность связывания Ер-САМ-связывающей части или части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, составляет по меньшей мере четыре порядка величины, предпочтительно по меньшей мере три порядка величины, более предпочтительно менее чем два порядка величины аффинности связывания νΒ6-845 или νΒ6-011, соответственно, как было измерено стандартными лабораторными способами. В неограничивающих вариантах изобретения Ер-САМ-связывающая часть может конкурентно блокировать по меньшей мере на 0,1, 1, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание известного анти-Ер-САМ антитела, такого как, но не ограничивающегося ими, РΑN0ΚΕX® или МТ201, с Ер-САМ в физиологических условиях. В неограничивающих вариантах изобретения часть, связывающаяся с опухолеассоциированным антигеном, может конкурентно блокировать по меньшей мере на 0,1, 1, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание известного антитела против опухолеассоциированного
- 15 010803 антигена, такого как, но не ограничивающегося ими, Н11, с опухолеассоциированным антигеном в физиологических условиях.
Для специалиста в данной области очевидно, что могут быть идентифицированы специфичностьопределяющие остатки. Термин специфичность-определяющий остаток, также известный как δΌΚ, означает остаток, который образует часть паратопа антитела, а в частности, остатки ΟΌΚ, где их отдельные замены аланином, независимо от любых других мутаций, приводят к снижению аффинности антитела по отношению к эпитопу по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, а более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз. Такая потеря аффинности указывает на то, что эти остатки играют важную роль в способности антитела связываться с эпитопом. См., например, Татига с1 а1., 2000, 81гис1ига1 согге1а1е8 οΓ ап апЧЧсагстота апЧЧЬоЛу: |ЛепйПсаЛоп οΓ 8ресШсЧЧу-ЛеЧегтЧшпд ге81Лие8 (8ΌΚ§) апЛ Йсус1ортсп1 οΓ а тЧшта11у ЧттиподепЧс апЧЧЬоЛу уапап1 Ьу геЧепЧюп οΓ 8ΌΚ оп1у, Ч. Iттиηο1. 164(3):1432-1441.
Влияние одной или множества мутаций на активность связывания, а в частности, на аффинность связывания, может быть определено одновременно для оценки роли конкретного набора аминокислот в связывании (например, роли СЭК2 легкой или тяжелой цепи в связывании). Влияние мутации аминокислот может быть также оценено по отдельности для оценки роли одной аминокислоты в связывании. Такая оценка может быть проведена, например, путем сканирования насыщения ш νίίτο (см., например, патент США № 6180341; НЛЧоп с1 а1., 1996, 8а1игаКоп ти1адепе818 οΓ Чйе νδΧνδ тойЧ οΓ Чйе егуЧйгороЧеЧЧп гесерЧог, Ч. Βίο1. Сйет. 271:4699-4708) и сайт-направленного мутагенеза (см., например, СиппЧпдйат апЛ \Vе118. 1989, Шдй-ге8о1иЛоп ерйоре таррЧпд οΓ йСН-гесерЮг тЧегасЧюп8 Ьу а1ашпе-8саппЧпд тиЧадепе818, 8с1епсе 244:1081-1085; Вазе е1 а1., 1991, А 8у8ЧетаЧЧс тиЧаЧЧопа1 апа1у818 οΓ йогтопе-ЬшЛЧпд ЛеЧегтЧпап18 т Чйе йитап дго\\Чй йогтопе гесерЧог, Ргос. ЫаЧ1. АсаЛ. δα. И8А 88:4498-4502). При аланинсканирующем мутагенезе во множество положений остатков молекулы вводят одиночные аланиновые мутации, и полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность для идентификации аминокислотных остатков, играющих решающую роль в активности данной молекулы.
Сайты связывания лиганда с рецептором или других биологических взаимодействий могут быть также идентифицированы путем проведения физического анализа структуры, определенной, например, с помощью ядерного магнитного резонанса, кристаллографии, электронной дифракции или фотоаффинного мечения, в комбинации с мутацией предполагаемого сайта контактирования аминокислот (см., например, Ле Уоз е1 а1., 1992, Нитап дго\\Чй йогтопе апЛ ехЧгасе11и1аг ЛотаЧп οΓ йз гесерЮг: сгу8Ча1 8ЧгисЧиге οΓ Чйе сотр1ех, 8аепсе 255:306-312; 8тйй е1 а1., 1992, Нитап ЧпЧеЛеикт 4. Тйе 8о1ийоп 8ЧгисЧиге οΓ а Чоигйейх ЬипЛ1е ргоЧет, Ч. Мо1. Βίο1. 224:899-904; V1οЛаνе^ еЧ а1., 1992, Сгу8Ча1 8ЧгисЧиге οΓ йитап гесотЬЧпапЧ тЧеЛеикт-4 аЧ 2.25 А ге8о1ийоп, ΡΕΒδ ЬеЧЧ. 309:59-64). Кроме того, важность конкретных отдельных аминокислот или серий аминокислот может быть оценена путем их сравнения с аминокислотной последовательностью родственных полипептидов или аналогичных сайтов связывания.
Кроме того, для специалиста в данной области очевидно, что повышенная авидность может компенсировать пониженную аффинность связывания. Авидность цитотоксина по отношению к рецептору раковой клетки является параметром силы связывания Ер-САМ-связывающих частей с Ер-САМ, который имеет множество сайтов связывания. Сила функционального связывания Ер-САМ и Ер-САМсвязывающей части представляет собой суммарную силу всех аффинных связей, и, таким образом, отдельный компонент может связываться с относительно низкой аффинностью, а мультимер таких компонентов может демонстрировать сильный биологический эффект. Действительно, множество взаимодействий между Ер-САМ-связывающими сайтами и эпитопами Ер-САМ могут давать гораздо больший эффект, чем аддитивный биологический эффект, т. е. преимущество поливалентности может давать величину, которая на много порядков превышает величину константы равновесия.
Аналогичным образом, авидность цитотоксина по отношению к рецептору раковых клеток представляет собой параметр силы связывания опухолеассоциированного антигена с частями, связывающимися с таким опухолеассоциированным антигеном, который может иметь множество сайтов связывания. Сила функционального связывания опухолеассоциированного антигена и части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, представляет собой суммарную силу всех аффинных связей, а это значит, что отдельный компонент может связываться с относительно низкой аффинностью, тогда как мультимер таких компонентов может демонстрировать сильный биологический эффект. Действительно, несколько взаимодействий между сайтами, связывающимися с опухолеассоциированным антигеном, и эпитопами опухолеассоциированного антигена могут давать гораздо больший эффект, чем аддитивный биологический эффект, т. е. преимущество поливалентности может давать величину, которая во много порядков превышает величину константы равновесия.
В одном из неограничивающих вариантов изобретения Ер-САМ-связывающая часть имеет структуру, по существу, аналогичную структуре 4Ό5ΜΟΟΒ. В основном, аналогичная структура может быть охарактеризована путем сравнения с эпитопными картами, которые иллюстрируют участки связывания Ер-САМ-связывающей части цитотоксина с молекулой Ер-САМ. В другом неограничивающем варианте изобретения могут быть построены эпитопные карты для части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, и, по существу, аналогичная структура может быть охарактеризована путем ее сравне
- 16 010803 ния с эпитопными картами, иллюстрирующими сайты, в которых антигенсвязывающая часть цитотоксина связывается с молекулой опухолеассоциированного антигена.
Цитотоксины согласно изобретению могут быть получены с помощью химического синтеза способами, хорошо известными специалистам в области химии белков, такими как твердофазный синтез (МегпДе1б, Е Αт. СНет. Αδ^^ 85:2149-2154 (1964)) или синтез в гомогенном растворе (НоиЬеиетеу1, Мебюбк о£ 0гдап1с СНет181гу, еб. Е. ХУапкск Уо1. 15Ι апб II, ТЫете, Б1и11даг1 (1987)). В одном из вариантов изобретения связывающийся с раковой клеткой лиганд и модифицированный буганин, оба представляют собой белки, и эти белки могут быть конъюгированы способами, хорошо известными специалистам. Существует несколько сотен доступных перекрестносшивающих линкеров, посредством которых могут быть конъюгированы два белка (см., например, СНетМгу о£ Рго1ет Соищдабоп апб СгоккНпктд, 1991, БНапк ^опд, СЕС Ргекк, Αпп Α^Ьо^). Перекрестносшивающий линкер обычно выбирают исходя из реакционноспособных функциональных групп, находящихся на лиганде или токсине или встроенных в них. Кроме того, если реакционноспособные группы отсутствуют, то может быть использован фотоактивируемый перекрестносшивающий линкер. В некоторых случаях может оказаться желательным включение спейсера между лигандом и токсином. Известными перекрестносшивающими агентами являются гомобифункциональные агенты: глутаральдегид, диметиладипимидат и бис(диазобензидин), и гетеробифункциональные агенты: м-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимид и сульфо-м-малеимидобензоил-№ гидроксисукцинимид.
Гибридный белок лиганд-буганиновый токсин может быть также получен способами рекомбинантных ДНК. В этом случае ДНК-последовательность, кодирующую лиганд, связывающийся с раковой клеткой, присоединяют к ДНК-последовательности, кодирующей модифицированный белок буганин, в результате чего получают химерную молекулу ДНК. Химерную ДНК-последовательность трансфицируют в клетку-хозяина, которая экспрессирует гибридный белок лиганд-буганин. Гибридный белок может быть выделен из клеточной культуры и очищен способами, известными специалистам.
Антитела, обладающие специфичностью к белкам клеточной поверхности, таким как Ер-САМ и опухолеассоциированный антиген, могут быть получены стандартными способами. Млекопитающее (например, мышь, хомячок или кролик) может быть иммунизовано иммуногенной формой пептида, который вырабатывает гуморальный ответ у млекопитающего. Способами сообщения иммуногенности пептиду являются его конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам. Так, например, этот пептид может быть введен в присутствии адъюванта. Мониторинг процесса иммунизации может быть проведен путем детекции титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть применены стандартный Е^IБΑ-анализ или другие процедуры иммуноанализа с использованием иммуногена в качестве антигена. После иммунизации может быть получена антисыворотка, и из этой сыворотки, если это необходимо, выделяют поликлональные антитела.
Для продуцирования моноклональных антител, антителопродуцирующие клетки (лимфоциты) могут быть взяты у иммунизованного животного и подвергнуты слиянию с миеломными клетками в соответствии со стандартными процедурами слияния соматических клеток, и, тем самым, иммортализации этих клеток с получением гибридомных клеток. Указанные способы (например, гидридомная технология, впервые разработанная КоЫег и МбкШп (№11иге 256:495-497 (1975)), а также другие способы, такие как технология получения человеческой В-клеточной гибридомы (КохЬог е1 а1., 1ттипо1. Тобау 4:72 (1983)), технология получения ЕВУ-гибридомы для продуцирования человеческих моноклональных антител (Со1е е1 а1., Мопос1опа1 Αпί^Ьоб^е8 ΐπ Сапсег ТНегару Α1Επ Е., В1188, 1пс., радек 77-96 (1985)) и скрининг комбинаторных библиотек антител (Нике е1 а1., Баепсе 24 6:1275 (1989)) хорошо известны специалистам. Гибридомные клетки могут быть скринированы иммунохимическим способом на продуцирование антител, специфически реагирующих с пептидом, и могут быть выделены моноклональные антитела.
Используемый здесь термин антитело включает моноклональные антитела и поликлональные антитела, фрагменты антител (например, ЕаЬ и Е(аЬ')2, одноцепочечные антитела (ксЕу)) и химерные антитела, которые также специфически реагируют с компонентом клеточной поверхности. Антитела могут быть фрагментированы стандартными способами, и такие фрагменты могут быть скринированы на их эффективность способом, описанным выше. Так, например, Е(аЬ')2-фрагменты могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Полученный Е(аЬ')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с получением ЕаЬ'-фрагментов. Одноцепочечные антитела объединяют с антигенсвязывающими областями антитела на одной полипептидной цепи, имеющей стабильную укладку. Одноцепочечные антитела могут быть получены способами рекомбинантных ДНК.
Производные химерных антител, т.е. молекулы антител, в которых объединены вариабельная область животного, не являющегося человеком, и человеческая константная область, также входят в объем настоящего изобретения. Молекулы химерного антитела могут включать, например, антигенсвязывающий домен, происходящий от антитела мыши, крысы или другого животного, и человеческие константные области. Для получения химерных антител, содержащих вариабельную область иммуноглобулина, распознающую антиген клеточной поверхности, могут быть применены стандартные способы (см., например, Моткоп е1 а1., Ргос. №И. Αсаб. Бск, ^Α, 81:6851 (1985); Такеба е1 а1., №11иге 314:452 (1985), СаЬШу е1 а1., патент США № 4316567; Вокк е1 а1., патент США № 4816497; ТападисЫ е1 а1., патент Е.Р.
- 17 010803 № 171496; европейский патент № 173494, патент Великобритании № СВ 2177096В). Считается, что химерные антитела являются менее иммуногенными для человека, чем соответствующее нехимерное антитело. Химерные антитела могут быть стабилизированы способом, описанным Р1иск11шп с1 а1., АО 00/61635.
Моноклональные или химерные антитела, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть затем гуманизованы путем продуцирования химер человеческих константных областей, в которых части вариабельных областей, а в частности, консервативных каркасных областей антигенсвязывающего домена, происходят от человеческого антитела, и только гипервариабельные области не являются человеческими. Такие молекулы иммуноглобулина могут быть получены способами, известными специалистам (см., например, Тепд е1 а1., Ргос. ЫаП. Асаб. 8ск, И8Л, 80:7308-7312 (1983); ΚοζϋοΓ е1 а1., 1ттипо1оду Тобау 4:7279 (1983); О1ккоп е1 а1., Мей. Епхуто1., 92:3-16 (1982), и публикацию РСТ АО 92/06193 или ЕР 239400). Гуманизованные антитела могут быть также коммерчески доступными (8со1деп Ытйеб, 2 Но11у Роаб. ТМскепНат, М1бб1екех, Сгеа1 Вгйат.). Кроме того, моноклональные или химерные антитела, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть сделаны менее иммуногенными путем уменьшения числа их потенциальных Т-клеточных эпитопов.
Специфические антитела или фрагменты антител, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть продуцированы путем скрининга экспрессионных библиотек, кодирующих гены иммуноглобулина или их части, экспрессируемые в бактериях, с компонентами клеточной поверхности. Так, например, полноразмерные ЕаЬ-фрагменты, УН-области и Εν-области могут быть экспрессированы в бактериях с использованием фаговых экспрессионных библиотек (см., например, Аагб е1 а1., Мише 341:544-546 (1989); Нике е1 а1., 8с1еисе 246:1275-1281 (1989) и МсСайейу е1 а1., Мише 348:552554 (1990)). Альтернативно, для продуцирования антител или их фрагментов может быть использована мышь 8СГО-ЙИ, например модель, выведенная Сепрйагт.
Во всех случаях, где модифицированный белок буганин получают путем присоединения к последовательности антитела, наиболее желательно использовать последовательности антител, из которых были удалены Т-клеточные эпитопы или последовательности, способные связываться с молекулами МНС класса II или способные стимулировать Т-клетки или связываться с Т-клетками в ассоциации с молекулами МНС класса II.
В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин может быть присоединен в белку, который не является антителом, но который при этом способен обеспечивать специфическое связывание на конкретной клетке-мишени. Такими белковыми молекулами являются различные полипептидные лиганды, для которых имеются специфические рецепторы на клеточной поверхности, и различные цитокины, пептидные и полипептидные гормоны и другие модификаторы биологических ответов. Репрезентативными примерами являются такие белки, как васкулярный эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, герегулин, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли и другой белок и молекулы гликопротеина. Могут также рассматриваться гибридные белки этих и других молекул с буганином согласно изобретению, и эти белки могут содержать модифицированную молекулу буганина либо в Ν-концевой, либо в С-концевой ориентации по отношению к домену лиганда белка. Аналогичным образом, в настоящем изобретении может рассматриваться химическое перекрестное связывание очищенного лиганда с модифицированным белком буганином, и такое связывание входит в объем изобретения.
В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению может быть использован в виде комплекса, содержащего водорастворимый полимер, такой как гидроксипропилметакриламид или другие полимеры, в которых модифицированный белок буганин присоединен в указанному полимеру посредством ковалентной или нековалентной связи. Указанный вариант может дополнительно включать антигенсвязывающий домен, такой как антитело или фрагмент антитела в комбинации с комплексом полимер-буганин.
(С) Применение цитотоксинов.
Модифицированные белки буганины согласно изобретению могут быть использованы для специфического ингибирования или разрушения клеток млекопитающих, пораженных раком. Преимущество цитотоксинов согласно изобретению заключается в том, что они являются менее иммуногенными, что позволяет ЫР проникать в клетку и эффективно уничтожать такую раковую клетку. Так, например, цитотоксин может быть использован для специфической доставки в раковые клетки. Буганин, после проникновения в раковую клетку, депуринизирует главную рибосомную РНК, что приводит к разрушению рибосом, к прекращению синтеза белка и к гибели клеток.
В соответствии с одним из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковой клетки, включающему введение цитотоксина согласно изобретению животному, нуждающемуся в этом. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению для ингибирования или разрушения раковой клетки. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению в целях изготовления лекарственного средства для ингибирования или разрушения раковой клетки. Тип раковых клеток, которые были ингибированы или разрушены под действием цитотоксина, может быть определен по антигенной специфичности части антитела против этого цитотоксина.
- 18 010803
В другом варианте изобретения настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковых клеток, включающему стадии получения цитотоксина согласно изобретению и введения этого цитотоксина в клетки. Указанным раком может быть рак любого типа, включая, но не ограничиваясь им, рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак печени, рак почек, меланомы, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы, Т-клеточные и В-клеточные лимфомы.
Способность цитотоксинов согласно изобретению селективно ингибировать или разрушать раковые клетки животного может быть легко протестирована ίη νίίτο с использованием раковых клеточных линий животного. Селективное ингибирующее действие цитотоксинов согласно изобретению может быть определено, например, путем выявления селективного ингибирования пролиферации раковых клеток.
Токсичность может быть измерена исходя из жизнеспособности клеток, например, может быть проведено сравнение жизнеспособности культур нормальных и раковых клеток, обработанных данными цитотоксинами. Жизнеспособность клеток может быть оценена известными способами, такими как анализ на исключение трипановым синим.
В другом примере для тестирования цитотоксичности цитотоксинов может быть применен ряд моделей. В работе ТПотрзоп Е.^. с1 а1. (Вгеаз! Сапсег Вез. Тгеа1теп1 31:357-370 (1994)) была описана модель для определения инвазивности раковых клеток человеческой молочной железы ίη νίίτο путем измерения опосредуемого опухолевой клеткой протеолиза внеклеточного матрикса (коллагена, ламинина, фибронектина, матригеля или желатина) и опухолевой инвазии через реконструированную базальную мембрану. Другими подходящими моделями раковых клеток являются культивированные клетки аденокарциномы яичника (Уоипд Τ.Ν. е1 а1., Супесок Опсо1. 62:89-99 (1996); Мооге Ό.Η. е1 а1. Супесо1. Опсо1. 65:78-82 (1997)), человеческие фолликулярные раковые клетки щитовидной железы (Эетеиге М.1. е1 а1., \Уог1б 1. 8игд. 16:770-776 (1992)), клеточные линии человеческой меланомы (А-2058) и фибросаркомы (НТ-1080) (Маскау А.В. е1 а1., ЬаЬ. 1птез1. 70:781-78 3 (1994)) и клеточные линии плоскоклеточного рака легких (Η8-24) и аденокарциномы (8В-3) (8р1езз Е. е1 а1., 1. Н1з1осйет. Су1ос11ет. 42:917-929 (1994)). Была также описана ш νί\Ό тест-система, включающая имплантацию опухолей и измерение роста опухоли и метастазов у бестимусных голых мышей (ТПотрзоп Е.^. е1 а1., Вгеаз1 Сапсег Вез. Тгеа1теп1 31:357-370 (1994); 8Ы Υ.Ε. е1 а1., Сапсег Вез. 53:1409-1415 (1993)).
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение эффективного количества одного или нескольких цитотоксинов согласно изобретению животному, нуждающемуся в таком введении. Настоящее изобретение относится к использованию цитотоксина согласно изобретению для лечения рака. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для лечения рака.
Термин животное охватывает всех членов царства животных, включая человека.
Термин лечение рака или лечить рак означает ингибирование репликации раковых клеток, подавление распространение рака (метастазов), ингибирование роста опухоли, снижение числа раковых клеток или замедление роста опухоли, снижение степени злокачественности рака или ослабление ассоциированных с раком симптомов.
В предпочтительном варианте изобретения указанным животным является человек. В другом варианте изобретения указанное раковое заболевание выбирают из рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака печени, рака почек, меланомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака предстательной железы, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, саркомы, глиомы, Т-клеточных и В-клеточных лимфом.
Клинические эффекты лечения рака с использованием цитотоксина согласно изобретению могут быть легко оценены специалистом в данной области, например врачом. Так, например, стандартные медицинские тесты для измерения клинических индикаторов рака могут служить убедительным свидетельством эффективности лечения. Такими тестами могут быть, без ограничений, физическое обследование, оценка по соответствующей шкале эффективности, выявление маркеров, являющихся показателями заболевания, ЭКГ в 12 отведениях, измерение размера опухоли, биопсия ткани, цитоскопия, цитология, вычисление наибольшего диаметра опухоли, радиография, компьютерная визуализация опухоли, определение показателей жизненно важных функций, определение массы, регистрация побочных реакций, выявление вспышек инфекции, оценка сопутствующего лечения лекарственными средствами, оценка болей, биохимический анализ крови или сыворотки, анализ мочи, компьютерно-томографическое сканирование и фармакокинетический анализ. Кроме того, синергические эффекты комбинированной терапии, включающей лечение цитотоксином и другими противораковыми терапевтическими средствами, могут быть определены путем сравнительных исследований пациентов, подвергающихся монотерапии.
Ремиссия злокачественных опухолей может быть оценена в соответствии с критериями, обычно используемыми специалистами. См., например, ТПегаззе е1 а1., 2000, №\ν дшбеБпез 1о еνа1иаίе 1Не гезропзе 1о 1геа1теп1 ш зоБб 1итогз. Еигореап ОгдашхаПоп Гог Везеагсй апб ТгеаГтепГ оГ Сапсег, №бопа1 Сапсег 1пзШи1е оГ 1Не ИшГеб 81а1ез, №бопа1 Сапсег 1пз111и(е оГ Сапаба, 1. №11. Сапсег. 1пз1. ЕеЬ. 2; 92(3):205-16.
Эффективная доза специфической конструкции цитотоксина может зависеть от различных факто
- 19 010803 ров, включая тип рака, размер опухоли, стадию развития рака, токсичность цитотоксина для пациента, специфичность доставки в раковые клетки, а также возраст, массу и состояние здоровья пациента.
Цитотоксины, содержащие модифицированный буганин, могут быть введены путем внутривенного (ί.ν.) вливания в течение периода времени от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от дозы и концентрации цитотоксина в инфузате.
В одном из вариантов изобретения указанный цитотоксин вводят в течение 3 ч.
В одном из вариантов изобретения эффективная доза при ί.ν. введении цитотоксина может составлять в пределах примерно от 1 до 100 мг/кг/дозу. В других вариантах изобретения такая доза может составлять в пределах примерно от 2 до 50 мг/кг/дозу. В конкретных вариантах изобретения такая доза может составлять по меньшей мере примерно 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 мг/кг/дозу.
В одном из вариантов изобретения разовую дозу вводят примерно каждую неделю в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Разовая доза может быть введена каждую неделю, либо альтернативно, она может быть введена с перерывом в одну или несколько недель. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 4, 6 или 12 недель. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 4, 6 или 12 недель.
В другом варианте осуществления изобретения разовую дозу вводят каждый месяц в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев подряд. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 4, 6 или 12 месяцев. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 4, 6 или 12 месяцев.
В конкретном неограничивающем варианте изобретения эффективная доза цитотоксина составляет примерно 1-50 мг/кг/опухоль/день, где пациенту вводят разовую дозу в день. Такую разовую дозу вводят приблизительно каждый день (указанная доза может вводиться с перерывами, но необязательно, в один или несколько дней) в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней подряд. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель.
Объем инъекции предпочтительно представляет собой, по меньшей мере, эффективное количество, которое является подходящим для данного типа и/или локализации опухоли. Максимальный объем инъекции в разовой дозе может составлять примерно 25-75% от объема опухоли, например приблизительно одну четверть, одну треть или три четверти от измеренного объема опухоли-мишени. В конкретном неограничивающем варианте изобретения максимальный объем инъекции в разовой дозе составляет приблизительно 30% от объема опухоли.
В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в течение 3 ч при скорости введения 100 см3/ч в виде раствора, содержащего 1-10 мг цитотоксина/мл. Этот цитотоксин может быть разведен в подходящем физиологически совместимом растворе.
Эффективная доза другого противоракового терапевтического средства, вводимого вместе с цитотоксином во время проведения данного цикла, также варьируется в зависимости от способа введения. Одно или несколько противораковых терапевтических средств могут быть введены непосредственно в опухоль или другими способами введения. Обычно химиотерапевтические средства вводят системно. Стандартная доза и схемы лечения известны специалистам (см., например, последние издания Мегск Шбех и Рйуыаап'к Эекк КеГегепсе; Ν^Ν Ргасбсе Сшбейпек ш Опсо1оду).
Комбинированная терапия с использованием цитотоксина может повышать чувствительность рака или опухоли к введению другого противоракового терапевтического средства. В соответствии с этим в настоящем изобретении рассматривается комбинированная терапия для предупреждения, лечения и/или предотвращения рецидивов рака, включающая введение эффективного количества цитотоксина до введения, одновременно с введением или после введения пониженной дозы противоракового терапевтического средства. Так, например, предварительное лечение цитотоксином может повышать чувствительность рака или опухоли к последующему введению дозы противоракового терапевтического средства. При отдельном введении противоракового терапевтического средства или при его введении в отсутствии цитотоксина эта доза может быть примерно равна нижнему пределу интервала стандартных доз либо она может быть ниже этого предела. При одновременном введении данный цитотоксин может быть введен отдельно от противоракового терапевтического средства и, необязательно, другим способом введения.
В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации по меньшей мере с одним другим иммунотерапевтическим средством.
В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с лучевой терапией. Такая терапия может включать хирургическое вмешательство и/или химиотерапию. Так, например, цитотоксин может быть введен в комбинации с лучевой терапией и с цисплатином (Р1абпо1), фторурацилом (5-БИ, АбгисП). карбоплатином (Рагар1а!ш) и/или с паклитакселом (Тахо1). При лечении цитотоксином могут быть использованы более низкие дозы лучевой терапии и/или менее частое проведение лучевой терапии, что может, например, снизить число случаев тяжелого поражения горла, которое затрудняет процесс
- 20 010803 глотания и, возможно, приводит к нежелательной потере массы или к обезвоживанию.
В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с одним или несколькими цитокинами, которыми являются, но не ограничиваются ими, лимфокин, факторы некроза опухоли, цитокин, подобный фактору некроза опухоли, лимфотоксин, интерферон, макрофагальный белок воспаления, гранулоцитарный-моноцитарный колониестимулирующий фактор, интерлейкин (включая, но не ограничиваясь ими, интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-6, интерлейкин-12, интерлейкин-15, интерлейкин-18) и его вариант, включая их фармацевтически приемлемые соли.
В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с противораковой вакциной, включая, но не ограничиваясь ими, аутологичные клетки или ткани, неаутологичные клетки или ткани, карциноэмбриональный антиген, альфа-фетопротеин, человеческий хорионический гонадотропин, живую вакцину БЦЖ, белки линии дифференцировки меланоцитов и мутированные опухолеспецифические антигены.
В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с гормональной терапией. Г ормональными терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, гормональный агонист, гормональный антагонист (например, флутамид, тамоксифен, ацетат лейпролида (БИРКОК)) и стероид (например, дексаметазон, ретиноид, бетаметазон, кортизол, кортизон, преднизон, дегидротестостерон, глюкокортикоид, минералокортикоид, эстроген, тестостерон, прогестин).
В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с генотерапией для лечения или предупреждения рака.
В другом варианте изобретения Ер-САМ-конъюгированный токсин вводят в комбинации с одним или несколькими агентами, которые повышают уровень экспрессии Ер-САМ в представляющих интерес опухолевых клетках. Уровень экспрессии Ер-САМ, предпочтительно, повышают так, чтобы на поверхности опухолевой клетки экспрессировалось большее число молекул Ер-САМ. Так, например, указанный агент может ингибировать нормальные циклы эндоцитоза антигена Ер-САМ. Такое комбинированное лечение может повышать клиническую эффективность Ер-САМ-конъюгированного цитотоксина, вводимого отдельно или в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами или с лучевой терапией. В конкретных неограничивающих вариантах изобретения агентом, повышающим уровень экспрессии Ер-САМ в опухолевых клетках, является тартрат винорелбина (№уе1Ьше) и/или паклитакс (Τιχο1). См., например, Τΐιιιηηοηά е1 а1., 2003, Абеηοса^с^ηοта се1к ехрю^еб ίη νίίτο ίο №-П'е1Ьте οτ Τιχο1 тсгеаке Ер-САМ ехрге55ЮГ1 РйгоидН а ηονе1 тесйаткт. Сапсег Iттиηο1. [ттигюРйег. Л.11; 52 (7):429-37.
Таким образом, комбинированная терапия может повышать восприимчивость рака или опухоли к вводимому цитотоксину и/или к дополнительному противораковому терапевтическому средству. А поэтому могут быть проведены более короткие циклы лечения, что позволяет снижать токсическое воздействие. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества цитотоксина и по меньшей мере одного другого противоракового терапевтического средства для проведения короткого цикла лечения. Время проведения такого цикла может варьироваться в зависимости от конкретного использования противоракового терапевтического средства. В настоящем изобретении также рассматривается непрерывное или периодическое введение или ежедневное введение дробных доз. Продолжительность соответствующего цикла лечения рака конкретным терапевтическим средством может быть определена специалистом, и в настоящем изобретении предусматривается непрерывный мониторинг оптимальных схем лечения для каждого противоракового терапевтического средства. Существуют конкретные руководства, известные специалистам. См., например, Тйегакке еР а1., 2000, №\ν дшбе1те§ ίο еνа1иаРе Ле ге^рюще ίο РгеаРтегИ ίη κοίίά ίитο^8. Еи^οреаη ОгдашхаРюн £ογ Кекеагсй апб ТгеаРтеШ ο£ Сатсег, Νιί^οηа1 Саг1сег ЛЛРиРе ο£ Не ИшРеб 81а1ек, №-Июг1а1 Самег ЛШШе ο£ Самба, ί. №111. Сапсег. ПъР. ЕеЬ 2; 92 (3):205-16.
Альтернативно, может оказаться желательным проведение более длительных циклов лечения. В соответствии с этим продолжительность такого цикла может варьироваться приблизительно от 10 до 56, от 12 до 48, от 14 до 28, от 16 до 24 или от 18 до 20 дней. Продолжительность цикла лечения может варьироваться в зависимости от конкретно используемого противоракового терапевтического средства.
В настоящем изобретении рассматривается по меньшей мере один цикл, а предпочтительно более чем один цикл, в течение которого вводят одно противораковое терапевтическое средство или набор терапевтических средств. Подходящее общее число циклов и интервалы между циклами могут быть определены специалистом. Число циклов может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 циклов. Интервалы между циклами могут составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дней. В настоящем изобретении предусматривается непрерывный мониторинг оптимальных схем лечения для каждого цитотоксина и для дополнительного противоракового терапевтического средства.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического препарата для лечения млекопитающего, страдающего раком, где указанный способ включает стадии идентификации Т-клеточных эпитопов буганина, обладающего пониженной способностью к активации Тклеток; получения цитотоксина согласно изобретению, имеющего один или несколько Т-клеточных эпито
- 21 010803 пов; и суспендирования белка в фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения млекопитающего, страдающего раком, где указанная композиция содержит цитотоксин согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
Цитотоксины согласно изобретению могут быть получены в виде фармацевтических композиций для введения индивидууму в биологически совместимой форме, подходящей для введения ш у1уо. Термин биологически совместимая форма, подходящая для введения ш у1уо означает форму вводимого вещества, терапевтическое действие которого превышает любое его токсическое действие. Эти вещества могут быть введены ш у1уо в организм человека и животных. Терапевтически активное количество фармацевтических композиций согласно изобретению определяют как эффективное количество, вводимое в соответствующих дозах и в течение периода времени, необходимого для достижения желаемого результата. Так, например, терапевтически активное количество вещества может варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность антитела вырабатывать нужный ответ у индивидуума. Схема введения доз может быть скорректирована для достижения оптимального терапевтического ответа. Так, например, несколько дробных доз могут быть введены ежедневно, либо такая доза может быть пропорционально снижена, если этого требует состояние пациента, подвергаемого терапии.
Активное вещество может быть введено подходящим способом, таким как инъекция (подкожная, внутривенная, внутримышечная и т.п.), пероральное введение, ингаляция, чрескожное введение (такое, как нанесение крема или мази и т.п.) или введение суппозиториев. В зависимости от способа введения активное вещество может быть покрыто материалом, защищающим соединение от воздействия ферментов, кислот и других природных условий, которые могут инактивировать такое соединение.
Описанные здесь композиции могут быть получены способами, известными рег ке для приготовления фармацевтически приемлемых композиций, которые могут быть введены индивидуумам, и в которых эффективное количество активного вещества присутствует в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители описаны, например, в руководстве Веш1пд1оп'к Рйатшасеибса1 8с1епсек (Веш1пд1оп'к Рйатшасеибса1 8с1епсек, Маск РиЬйкЫпд Сошрапу, ЕакФп, РА, И8А 1985). В соответствии с этим такие композиции включают, но не ограничиваются ими, растворы веществ в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и содержатся в забуференных растворах, имеющих подходящий рН и обладающих изоосмотическими свойствами, сообщаемыми физиологическими жидкостями.
Фармацевтические композиции могут быть использованы в способах лечения животных, включая млекопитающих, а предпочтительно человека, страдающих раком. При этом предполагается, что указанные композиции могут быть, в частности, использованы для лечения пациентов, страдающих раком ободочной кишки, раком молочной железы, раком яичника, раком поджелудочной железы, раком головы и шеи, раком мочевого пузыря, раком желудочно-кишечного тракта, раком предстательной железы, мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легких, саркомой, глиомой, Т-клеточными и В-клеточными лимфомами. Доза и тип вводимого цитотоксина зависит от ряда факторов, которые могут быть легко установлены при обследовании человека. Такими факторами являются этиология и тяжесть (степень и стадия) опухолевого заболевания.
Фармацевтическими композициями, адаптированными для прямого введения, являются, но не ограничиваются ими, лиофилизованные порошки или водные или безводные стерильные растворы или суспензии для инъекций, которые могут также содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворимые вещества, которые делают данные композиции, по существу, изотоничными с кровью данного реципиента. Другими компонентами, которые могут присутствовать в таких композициях, являются, например, вода, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Растворы и суспензии для непосредственного введения инъекций могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул или таблеток. Цитотоксин может быть введен различными способами, без каких-либо конкретных ограничений, например, в виде лиофилизованного порошка, который перед введением пациенту разводят в стерильной воде или в физиологическом растворе.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Подходящими фармацевтически приемлемыми носителями являются, по существу, химически инертные и нетоксичные композиции, которые не оказывают негативного влияния на биологическую активность фармацевтической композиции. Примерами подходящих фармацевтических носителей являются, но не ограничиваются ими, вода, физиологические растворы, растворы глицерина, этанол, хлорид М-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-Н,М,М-триметиламмония (ООТМА), диолезилфосфотидилэтаноламин (ПОРЕ) и липосомы. Такие композиции должны содержать терапевтически эффективное количество соединения вместе с подходящим количеством носителя, используемым в приготовлении лекарственной формы для непосредственного введения пациенту.
В другом варианте изобретения фармацевтическая композиция содержит цитотоксин и один или несколько дополнительных противораковых терапевтически средств, необязательно, в фармацевтически приемлемом носителе.
- 22 010803
Данная композиция может быть получена в форме фармацевтически приемлемых солей, которыми являются, но не ограничиваются ими, соли, образованные свободными аминогруппами с кислотами, например с соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотами и т.п., и соли, образованные свободными карбоксильными группами с основаниями, например, с гидроксидами натрия, калия, аммония, кальция и железа (3), с изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т. п.
Поскольку настоящее изобретение относится к модифицированному буганину, то композиции, содержащие такие модифицированные белки буганины или фрагменты модифицированных белков буганинов, и родственные им композиции, также входят в объем настоящего изобретения. В этой связи подходящим примером может служить разработка стратегий индуцирования опосредуемой пептидом толерантности, где один или несколько описанных пептидов вводят пациенту в целях иммунотерапии. В соответствии с этим молекулы синтетических пептидов, например одна или несколько таких молекул, содержат все области К1-К3 эпитопа, определенные выше, или часть любой из этих областей. Такие пептиды рассматриваются как варианты настоящего изобретения.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам терапевтического лечения человека с использованием композиций модифицированных буганинов. Для введения индивидууму любая из модифицированных композиций должна иметь чистоту предпочтительно по меньшей мере 80% и не должна содержать пирогенов и других примесей.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему эффективное количество цитотоксина, необязательно, в комбинации с одним или несколькими другими противораковыми терапевтическими средствами, и инструкции по его применению для лечения рака.
(Ό) Пептиды Т-клеточных эпитопов.
Другим вариантом настоящего изобретения является пептид Т-клеточного эпитопа. Одним из примеров может служить пептид Т-клеточного эпитопа, который в Т-клеточном анализе способен обеспечивать индекс стимуляции более чем 1,8, а более предпочтительно более чем 2,0. Пептид Т-клеточного эпитопа согласно изобретению способен связываться с МНС класса II.
В одном из вариантов изобретения пептид Т-клеточного эпитопа содержит по меньшей мере 9 смежных аминокислотных остатков любой из последовательностей К1, К.2 или К3 (см. выше).
В другом варианте изобретения аминокислотная последовательность пептида Т-клеточного эпитопа более чем на 90% идентична любой одной из аминокислотных последовательностей пептида К1, К2 или К3, а более предпочтительно аминокислотная последовательность пептида Т-клеточного эпитопа более чем на 80% идентична любой одной из аминокислотных последовательностей пептида К1, К2 или К3.
Используемый здесь термин пептид означает соединение, которое включает две или более аминокислоты. Эти аминокислоты связаны между собой пептидной связью (как определено ниже). В природе существует 20 различных аминокислот, участвующих в биологическом продуцировании пептидов, и любые из них могут быть присоединены в любом порядке с образованием пептидной цепи или пептидного кольца. Все природные аминокислоты, участвующие в биологическом продуцировании пептидов, имеют Ь-конфигурацию. Синтетические пептиды могут быть получены стандартными способами синтеза с использованием Ь-аминокислот, Ό-аминокислот или различных комбинаций аминокислот в двух различных конфигурациях. Некоторые пептиды содержат всего несколько аминокислот. Короткие пептиды, например, пептиды, имеющие менее десяти аминокислот, иногда называются олигопептидами. Другие пептиды содержат большое число аминокислотных остатков, например до 100 или более, и такие пептиды называются полипептидами. Для удобства под термином полипептид может подразумеваться любая пептидная цепь, содержащая три или более аминокислот, а под термином олигопептид обычно подразумевается конкретный тип короткого полипептида. Таким образом, очевидно, что используемый здесь термин полипептид включает понятие олигопептид. Кроме того, если упоминается термин пептид, то под этим термином также подразумеваются полипептиды, олигопептиды и белки. При каждом различном расположении аминокислот образуются различные полипептиды или белки. Число полипептидов, а следовательно, и число различных белков, которые могут быть образованы, является практически неограниченным.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к использованию пептидов Тклеточного эпитопа согласно изобретению в целях получения модифицированных белков буганинов согласно изобретению и модифицированных пептидов Т-клеточного эпитопа.
Другим вариантом согласно изобретению является модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа, который модифицирован так, что он обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток по сравнению с немодифицированным пептидом Т-клеточного эпитопа. Одним из примеров могут служить модифицированные пептиды Т-клеточного эпитопа согласно изобретению, содержащие модификации, которые, как было обнаружено при их тестировании в Т-клеточном анализе, дают более низкий индекс стимуляции, чем немодифицированный пептид Т-клеточного эпитопа.
В одном из вариантов изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность:
- 23 010803
АКХ1ПККХ2ЬХ3ЪС7Х4КЪ, где по меньшей мере один из X1, X2, X3 и X4 является модифицированным, по сравнению с немодифицированной последовательностью, и где
X1 представляет собой Т, А или Ц;
X2 представляет собой С или А;
X3 представляет собой О или С;
X4 представляет собой Ν, Ό, Т, А, К, Ц, Е, С, Н, К или δ (δΕΟ ΙΌ N0:8).
В другом варианте изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность:
ЪСУХ4КЬЕРЗΙΕΑΙΗΟ, где X4 представляет собой Ν, Ό, Т, А, К, Ц, Е, С, Н, К или δ (δΕΟ ΙΌ N0:9).
В другом варианте изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность:
где X5 представляет собой О или А (δΕΟ ΙΌ N0:10).
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим пептиды Т-клеточных эпитопов или модифицированные пептиды Т-клеточных эпитопов согласно изобретению.
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводится графический материал, список последовательностей и примеры. При этом следует отметить, что в описанные здесь процедуры могут быть внесены модификации, не выходящие за пределы существа изобретения.
Нижеследующие неограничивающие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Способ картирования эпитопов в буганине с помощью анализов на пролиферацию необученных человеческих Т-клеток.
Пептиды, охватывающие последовательность зрелого белка буганина, были синтезированы как описано Осп НаПод с1 а1. [1Ыб]. Каждый пептид имеет длину в 15 аминокислот, и следующие друг за другом пептиды перекрываются в 12 остатках. Последовательность этих пептидов и их нумерация указаны в табл. 1.
Эти пептиды были использованы в анализах на пролиферацию Т-клеток, проводимых с применением МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови), взятых от неиммунизованных доноров (т.е. от доноров, которые, как известно, не подвергались сенсибилизации буганином). Для забора МКПК и получения оптимального набора аллотипов МНС класса ΙΙ было отобрано 20 доноров. Набор аллотипов был взят в 85% избытке. Аллотипы НЬА-ОК указаны в табл. 2.
МКПК стимулировали отдельными пептидами в культурах с тремя повторностями в течение 7 дней, после чего оценивали пролиферацию путем включения 3Н-тимидина (3Н-Тйу). Все пептиды тестировали в двух различных концентрациях (1 и 5 мкМ). Индексы стимуляции (δΙ) вычисляли как количество 3Н, включенного в клетки, деленное на количество 3Н, включенного в контроль, стимулированный миметиком.
Лейкоцитарную пленку человеческой крови, хранящуюся менее 12 ч, закупали у фирмы ΝοΙίοηοΙ Βίοοά δβτνίεβ (АббепЬгоокк Нокрйа1, СашЬпбде, ИК). Фиколл-пак закупали у фирмы Атегкйат Рйагтас1а Вю1сс11 (Атегкйат, ИК). Бессывороточную среду А1М V для культивирования первичных человеческих лимфоцитов, содержащую Ь-глутамин, 50 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентомицина и 0,1% альбумин человеческой сыворотки, закупали у фирмы С1Ьсо-ВКЕ (Ра1к1еу, ИК). Синтетические пептиды закупали у фирмы Еигокецпепсе (Сгошпдеп, Тйе №1йег1апбк) и ВаЬгайат Тесйшх (СатЬпбде, ИК).
Эритроциты и лейкоциты были выделены из плазмы и тромбоцитов путем мягкого центрифугирования лейкоцитарной пленки. Верхнюю фазу (содержащую плазму и тромбоциты) снимали и отбрасывали. Эритроциты и лейкоциты разводили 1:1 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ΡΒδ), а затем наносили слоями на 15 мл реагента фиколл-пак (Атегкйаш Рйагтас1а, Атегкйат ИК). Центрифугирование проводили в условиях, рекомендованных производителями, и МКПК собирали из сыворотки + области границы раздела ΡΒδ/фиколл-пак. МКПК смешивали с ΡΒδ (1:1) и собирали путем центрифугирования. Супернатант удаляли и отбрасывали, и осадок МКПК ресуспендировали в 50 мл ΡΒδ. Клетки снова осаждали путем центрифугирования и супернатант ΡΒδ отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали с использованием 50 мл среды А1М V, после чего клетки подсчитывали и их жизнеспособность анализировали путем исключения красителем трипановым синим. Затем клетки снова собирали путем центрифугирования и супернатант отбрасывали. Клетки ресуспендировали для их хранения в криогенных условиях при плотности 3х107/мл. Среда для хранения представляет собой 90%-ную (об./об.) термоинактивированную человеческую сыворотку АВ ^1дта, Ροο1е, ИК) и 10% (об./об.) ДМСО (δίβαη, Ροο1е, ИК). Клетки переносили в контейнер с регулируемым замораживанием (δίβίικι) и оставляли на ночь при температуре -70°С. Перед их использованием клетки быстро оттаивали в водяной бане при 37°С, а затем переносили в 10 мл предварительно нагретой среды А1М V.
- 24 010803
МКПК стимулировали белковыми и пептидными антигенами в 96-луночном плоскодонном планшете при плотности 2x10 МКПК на лунку. МКПК инкубировали в течение 7 дней при 37°С, а затем вводили 3Н-Т11у (Ашег8Ьаш-РЬагшас1а, Ашегкйаш, ИК). В анализах для каждого донора использовали два контрольных пептида, обозначаемых С-32 и С-49, которые, как было предварительно показано, являются иммуногенными, и активный полноразмерный белок, а именно не воскресший антиген гемоцианин лимфы улитки (КЬН). С-32 = последовательность ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΕΑΤ гемаглютинина вируса гриппа, остатки 307-319 (8ЕО ГО N0:127). С-49 последовательность КVV^^IККI8КРV^Η от Н8Р 60 СЫашуФа (8ЕО ГО N0:128).
Пептиды растворяли в ДМСО до конечной концентрации 10 мМ, а затем эти маточные растворы разводили 1/500 в среде ΑΣΜ V (конечная концентрация 20 мкМ). Пептиды добавляли в плоскодонный 96-луночный планшет до конечной концентрации 1 и 5 мкМ в 100 мкл. Жизнеспособность оттаянных МКПК оценивали путем исключения красителем трипановым синим, а затем клетки ресуспендировали при плотности 2х106 клеток/мл, и 100 мкл (2х105 МКПК/лунку) переносили в каждую лунку, содержащую пептиды. Культуры в лунках с тремя повторностями анализировали при каждой концентрации пептида. Планшеты инкубировали в течение 7 дней в атмосфере повышенной влажности при 5% С02 и при 37°С. Клетки подвергали импульсному мечению 1 мкКи 3Н-Т1у/лунку в течение 18-21 ч, а затем собирали на фильтровальных слоях. Величины им/мин определяли с использованием бета-счетчика для верхней части микропланшета \Уа11ас (Регкт-Е1шег). Результаты выражали как индексы стимуляции, определенные путем деления величины уровня пролиферации (например, число импульсов радиоактивности в минуту), измеренной для тестируемого пептида, на соответствующую величину, измеренную в клетках, не контактировавших с указанным тестируемым пептидом.
Интерпретация результатов вышеописанного анализа указывает на присутствие четырех Тклеточных эпитопов, соответствующих пептидам 41, 44 и 50, в зрелой процессированной области белка, и пептиду 88 в непроцессированной форме. Поскольку эпитоп в пептиде 88 не является частью зрелого белка, то он был исключен из схемы настоящего изобретения.
Для пептида 41 (обозначаемого областью К1 эпитопа) имелись четыре донора, восприимчивых к этому пептиду, т.е. доноры 4, 5, 10 и 11. Индексы стимуляции (8.Г) для этих пептидов при 5 мкМ составляли 3,6; 4,9; 2,1 и 2,0, соответственно.
Для пептида 44 (обозначаемого областью К2 эпитопа) имелись два донора, восприимчивых к этому пептиду: доноры 4 (8.1=3,5) и 11 (8.1=2,3). Соседние пептиды 43 и 45 индуцировали более низкий уровень пролиферации Т-клеток, поскольку оба этих пептида перекрывались с пептидом 44 в 12 аминокислот.
Для пептида 50 имелись 2 донора, восприимчивых к этому пептиду: доноры 4 (8.1=2,9) и 14 (8.1=2,0). Пептид 51 индуцировал более низкий уровень пролиферации Т-клеток у донора 14 (8.к>1,9).
Типы тканей для всех образцов МКПК анализировали с использованием коммерчески доступной системы реагентов (Эупа1, ^1гга1, ИК). Анализы проводили в соответствии с протоколами, рекомендованными поставщиками, с использованием стандартных вспомогательных реагентов и систем электрофореза в агарозном геле. Аллотипическая специфичность каждого из образцов, взятых от восприимчивых доноров, приводится в табл. 2.
Пример 2. Клонирование буганина, выделенного из ВоидайкШеа крес(аЬШк.
Полноразмерную РНК выделяли из листьев ВоидаикШеа крес(аЬШк с использованием системы выделения полноразмерной РНК '8ν и протокола, прилагаемого поставщиком (Ргошеда 8ои(йашр(оп, ИК). Ткань свежих листьев измельчали в тонкодисперсный порошок в жидком азоте, и приблизительно 50 мг измельченной ткани использовали для выделения РНК. Качество и количество РНК оценивали путем визуализации на 1% агарозном геле, и ген буганина амплифицировали из полноразмерной РНК с помощью ОТ-ПЦР-системы Ассекк КТ-РСК 8ук(еш (Ргошеда) с использованием приблизительно 1 мкг РНК на реакционную смесь и геноспецифических праймеров 0Ь1032 и 0Ь1033. Последовательности праймеров приводятся ниже в табл. 3. Эта реакция генерировала 1242 п.н.-фрагмент, включающий нативную лидерную последовательность и полноразмерную последовательность буганина. Этот фрагмент клонировали в вектор рСЕМ-Т Еаку (Ргошеда) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору, и обозначали рВои1. Последовательность подтверждали путем секвенирования ДНК.
Ген буганина переносили в рЕТ21а (Nονадеη, №Шпдйаш, ИК) путем ПЦР-клонирования с использованием плазмиды рВои1 в качестве матрицы. Лидерную последовательность ре1В (пектат-лиазы) присоединяли в 5'-концу, а последовательность, кодирующую 6 х гистидиновую метку, присоединяли к 3'концу буганин-кодирующей последовательности. Лидерную последовательность ре1В амплифицировали из вектора рРММик [Мо11оу Р. е( а1. (1995) I. Аррйеб Вас(епо1оду, 78:359-365] с использованием праймера 0Ь1322 (вводящего Ме1-сайт) и праймера 0Ь1067. Фрагмент буганин-Ык амплифицировали из рВои1 с использованием праймеров 0Ь1068 и 0Ь1323 (вводящих ШП-сайт). Лидерную последовательность ре1В присоединяли в той же рамке считывания к фрагменту буганин-Ηίκ посредством ПЦР с перекрыванием, и полученный фрагмент клонировали в вектор рСЕМ-Т Еаку (Ргошеда). После подтверждения последовательности фрагмент ре1В-буганин-Ык клонировали в виде NάеI-NοίI-фрагмента в Ше^оИ
- 25 010803 гидролизованный вектор рЕТ21а. Этот клон обозначали ρΒοи32.
Пример 3. Конструирование мутантных белков буганинов.
Ряд модифицированных (мутантных) белков буганинов был сконструирован с использованием данных, полученных путем картирования Т-клеточных эпитопов и с использованием компьютерной программы, позволяющей имитировать связывание пептидов со связывающим участком человеческой молекулы МНС класса ΙΙ. Последний способ подробно описан в литературе [ν0 02/069232]. Были сконструированы варианты генов, и мутантные белки были протестированы на функциональную активность. В общих чертах, сначала были сконструированы и протестированы белки с одиночной мутацией, каждый из которых содержал одну аминокислотную замену, а затем гены, кодирующие активные модифицированные белки, объединяли с получением модифицированных белков с множеством замен.
Мутантные гены конструировали посредством ПЦР с перекрыванием, где кодон, кодирующий мутантную аминокислоту, был встроен в ген с использованием мутанта в перекрывающемся праймере. Эта процедура хорошо известна специалистам и подробно описана в литературе [ШдисЫ е! а1. (1900) №с1. Ααάδ. Нек. 16:7351]. Всего было сконструировано 37 модифицированных белков с одиночной мутацией, и эти белки были протестированы на остаточную функциональную активность. Кроме того, был также сконструирован модифицированный белок негативного контроля, содержащий замену Υ70Α, и этот белок был протестирован во всех анализах. Один из этих 37 модифицированных белков с одиночной мутацией в действительности содержал две непосредственно смежные замены (Е151Т и Ι152Ε), но рассматривался здесь как одиночный мутант. Протестированные замены и соответствующие величины активности представлены в табл. 4.
Всего было сконструировано 11 модифицированных белков с множеством замен, и эти белки были протестированы на остаточную активность. Протестированные замены и соответствующие величины активности представлены в табл. 5.
В табл. 6 представлены последовательности модифицированных белков с заменами. В табл. 7 указаны некоторые специфические последовательности.
Во всех случаях белки были очищены и проанализированы в соответствии с процедурами, описанными ниже в примерах 4 и 5.
Пример 4. Экспрессия и очистка белка буганина.
Плазмиду ρΒοи32 трансформировали в Β^21(^Ε3)-компетентные клетки (Nονадеη) в соответствии с инструкциями производителя и отбирали на ΕΒ-планшетах (ΙηνίίΐΌ^η, Ра181еу, υΚ), содержащих 50 мкг/мл карбенициллина. Свежую колонию, полученную после этой трансформации, использовали для инокуляции 5 мл 2χΥΤ-бульона (ΙηνίίΐΌ^η), не содержащего антибиотиков, и эту культуру выращивали со встряхиванием при 250 об/мин при 37°С до достижения 0Ό600=1,5-2,0. Затем культуру центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, и клетки ресуспендировали в 5 мл свежего 2χΥΤ+1 мМ ΙΡΤΟ. Эту культуру инкубировали при 30°С со встряхиванием при 300 об/мин в течение 1,5 ч, и клетки собирали центрифугированием, а супернатант удаляли.
Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл РЕВ2 (50 мМ Трис-НС1, рН 8, 20% сахароза, 1 мг/мл лизоцима, 1хтаблетка всех ингибиторов протеазы (Восйе, Ее^ек, υΚ), и инкубировали на льду в течение 1 ч при легком перемешивании. Клеточный дебрис центрифугировали при 14000 об/мин при 4°С, и осадок отбрасывали. Полученный супернатант называли здесь периплазматической фракцией. Белок буганин выделяли из указанной периплазматической фракции с помощью аффинной колоночной хроматографии на никеле, проводимой на коммерчески доступной центрифужной колонке в соответствии с инструкциями производителя (Οίη^η, Сгает1еу, υΚ). Полученный материал диализовали против 4 л забуференного фосфатом физиологического раствора (0,138М №С1, 0,0027М ЕСТ рН 7,4) в течение ночи при 4°С с отсечкой молекулярной массы 10000 на устройстве ЗПбе-А-Еухег (Рпесе, Сйе8!ег, υΚ). После диализа оценивали концентрацию белка с использованием набора для анализа Мюго ΒСΑ (Р1егсе), и образцы хранили при -20°С.
Затем концентрацию белка буганина определяли с использованием системы ΕΕΙδΑ-анализа. Вкратце, антисыворотку против буганина (Сенотас, ЕгеФигд, Сегтану) получали путем генетической иммунизации двух крыс плазмидой, экспрессирующей буганин. Для ΕΕΙ8Α рекомбинантный буганин иммобилизовывали на планшетах, покрытых №-агарозой, посредством его Ηίκ-метки, а затем детектировали с использованием крысиной антисыворотки и второго ПХ-конъюгированного антитела против крысиного Ес (81дта, Роо1е, υΚ). Для каждого определения в качестве стандарта использовали большой препарат буганина дикого типа, экспрессированного в Ε^Η, и количественно оцененного с помощью анализа на общий белок.
Пример 5. Анализ на активность буганина.
Активность белков буганина дикого типа и модифицированных (мутантных) белков тестировали путем определения их способности ингибировать синтез белка в бесклеточном анализе синтеза белка.
Смесь, содержащую 10 мкл ΤΚΤ вместе со смесью для транскрипции/трансляции (Рготеда), 20 мкМ метионина, 120 нг ДНК люциферазы рТ7 (Рготеда) и серийные разведения белка дикого типа (νΤ) и мутантного белка буганина в конечном объеме 12,5 мкл, инкубировали при 30°С в течение 1 ч, а
- 26 010803 затем реакцию прекращали добавлением 100 мкл реагента для анализа на люциферазу 81сабуС1о\у (Рготсда). Люциферазную активность измеряли с использованием люминесцентного счетчика Уа11ас. Активный белок буганин детектировали по снижению измеренной люциферазной активности. Каждый модифицированный белок буганин тестировали по меньшей мере в 5 концентрациях, и каждое частное значение получали в дубликате. В каждый эксперимент был включен позитивный и негативный контроль.
Результаты для белков с одиночной мутацией представлены в табл. 4. Результаты для модифицированных белков буганинов с множественными мутациями представлены в табл. 5. В каждом случае результаты представлены как величины по отношению к активности белка дикого типа. Все анализы проводили с включением неактивного мутантного белка буганина с заменой У70А.
Кроме того, исходя из результатов люциферазного анализа, может быть построен график зависимости % люциферазной активности по отношению к контролю от концентрации добавленного белка буганина. Примеры таких графиков представлены на фиг. 1, где приводятся результаты, полученные для двух различных белков буганинов с множественными мутациями.
Пример 6. Анализ последовательностей вариантов буганина на потерю Т-клеточных эпитопов.
Модифицированный белок с множественными мутациями, обозначенный Вои156, отбирали для проведения дополнительного тестирования с помощью анализа на иммуногенность. Этот вариант содержал замены У123А, Ό127Λ. Υ133Ν и П52А. Тест на иммуногенность предусматривает использование живых клеток, которые могут быть повреждены при тестировании с применением целого белка буганина, а поэтому эти анализы проводили с использованием синтетических пептидов, содержащих замены, введенные в вариант Вои156. Протестированные пептиды приводятся в табл. 8. Эти анализы проводили в соответствии с процедурами, описанными в примере 1 (см. выше), с использованием пула МКПК, взятого у 20 индивидуумов-доноров. Пептиды тестировали с тремя повторностями для каждого образца, взятого у донора, при двух различных конечных концентрациях пептидов (1 и 5 мкМ).
Результаты выражали как величину δΙ/пептид на образец, взятый у донора, и эти результаты приводятся на фиг. 2. Эс1-41 представляет собой пептидную последовательность АКАПВКАЕЕЬбУХКЬ (8ЕО ΙΌ NО:29). Эс1-44 представляет собой пептидную последовательность ^СVNΚ^ЕΕ8IЕΛIΗС (8ЕО ΙΌ NО:30). Эс1-50 представляет собой пептидную последовательность N6^ЕААΚЕЕ^IVI^М (8ЕО ΙΌ NО:31). Ни один из модифицированных пептидов не индуцировал Т-клеточный ответ у любого из доноров (8.Ι.<2). В отличие от этого, иммуногенный контрольный пептид стимулировал Т-клетки у 6 доноров (8.Ι.>2).
Пример 7. УВ6-845: рекомбинантное конструирование Ер-САМ-специфического антитела ЕаЬ для оптимальной доставки буганина, лишенного иммуногенных свойств (де-буганина).
В этом примере и в примере 8 используемым лишенным иммуногенных свойств буганином является Вои156.
Нацеленные на опухоль цитотоксины состоят из вариабельной области антитела, присоединенного к бактериальному, грибковому или растительному токсину. В настоящем исследовании было показано, что конструкции лишенного иммуногенных свойств буганина согласно изобретению, содержащие указанный неиммоногенный буганин, присоединенный к нацеливающей молекуле, обладают пониженной иммуногенностью, но при этом сохраняют биологическую активность. В табл. 12 продемонстрировано связывание антитела против Ер-САМ с опухолями нескольких типов, и, таким образом, было показано, что оно может быть использовано для лечения рака таких типов.
Конструкция лишенного иммуногенных свойств буганина: направленная на Ер-САМ нацеливающая молекула, присоединенная к де-буганину.
УВ5-845, ЕаЬ-вариант ксЕу-антитела против Ер-САМ был генетически присоединен к неиммуногенной форме буганина (де-буганина) Вои156, т.е. к активному инактивирующему рибосому (К1Р) растительному белку типа Ι, для создания конструкции антитело-токсин УВ6-845. На фиг. 3 проиллюстрирована конструкции УВ6-845. На фиг. 3А проиллюстрирована бицистронная единица про-УВ6-845 с лидерными последовательностями рс1В. Аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ NО:16) и кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ΙΌ NО:15) представлены на фиг. 3В. На фиг. 3С проиллюстрирован сконструированный белок УВ6-845, более подробно описанный ниже. Тестирование этой конструкции показало, что данная конструкция сохраняет свою биологическую активность (цитотоксичность) и специфичность нацеливающей молекулы (антитела против Ер-САМ).
Ориентация конструкции, содержащей лишенный иммуногенных свойств буганин.
Для определения оптимальной ориентации конструкции антитело-де-буганин, были созданы, экспрессированы и протестированы на активность несколько форм бицистронных экспрессионных единиц.
В каждом случае бицистронную единицу клонировали в вектор ρΙΝΟ3302 (фиг. 4) под контролем индуцируемого арабинозой промотора агаВАЭ и трансформировали в Е104 Е.со11. После индуцирования присутствующая лидерная последовательность рс1В направляет секрецию гибридного белка ЕаЬ - дебуганин в супернатант культуры. Расщепление линкера приводит к отщеплению де-буганина от нацеливающей молекулы и сообщает ему биологическую активность. В одном из вариантов изобретения указанным линкером является фуриновый линкер, хотя для специалиста в данной области очевидно, что
- 27 010803 могут быть использованы и другие расщепляемые линкеры. Предпочтительные линкеры могут быть выбраны исходя из специфичности мишени и ее окружения. Образец конструкций получали и тестировали, как описано ниже.
На фиг. 3 проиллюстрирован УВ6-845, где де-буганин (Вои156) присоединен к С-концу домена СН посредством фуринового линкера. На фиг. 3А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 3В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:15) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:16) пропоследовательностей, а на фиг. 3С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 5 проиллюстрирована контрольная конструкция ЕаЬ-фрагмента антитела против Ер-САМ, не содержащая растительного токсина, де-буганина (УВ5-845). На фиг. 5А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 5В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:17) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:18) пропоследовательностей, а на фиг. 5С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 6 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845-Сь-де-буганин, где Вои156 присоединен к С-концу домена С На фиг. 6А проиллюстрирована бицистронная единица пропоследовательностей, на фиг. 6В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:19) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:20) пропоследовательностей, а на фиг. 6С проиллюстрирован собранный белок УВ6845-Сь-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 7 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845-ЫУН-де-буганин, где Вои156 присоединен к Ν-концу домена УН. На фиг. 7А проиллюстрированы бицистронные единицы пропоследовательностей, на фиг. 7В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:21) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:22) пропоследовательностей, а на фиг. 7С проиллюстрирован собранный белок УВ6845-ЫУН-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
На фиг. 8 проиллюстрирована конструкция, содержащая ЕаЬ-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, УВ6-845-ЫУь-де-буганин, где Вои156 присоединен к Ν-концу домена Уь. На фиг. 8А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 8В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:23) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:24) пропоследовательностей, а на фиг. 8С проиллюстрирован собранный белок УВ6-845-ЫУь-де-буганин, не содержащий последовательностей ре1В.
В одном из вариантов изобретения молекула де-буганина присоединена к С-концу тяжелой или легкой цепи. Оптимальная конфигурация состоит из лидерной последовательности ре1В, смежной с доменом УН-СН с Ν-концевой гистидиновой аффинной меткой в качестве первого звена. Непосредственно за этим звеном расположено второе звено, содержащее домен ре1В-Уъ-Сь, присоединенный к дебуганину посредством чувствительного к протеазе линкера (фиг. 6). Вестерн-блот-анализ, проведенный для конструкций, в которых де-буганин был снова расположен у Ν-конца, не выявил детектируемого продукта, и только С-концевой де-буганин (конструкции на фиг. 3 и 6) давал интактный растворимый белок (фиг. 9), который обладал хорошей способностью связываться с Ер-САМ-позитивными клеточными линиями, как было проиллюстрировано в тестах на реактивность, детектированную с помощью проточной цитометрии. Вестерн-блот-анализ, проиллюстрированный на фиг. 9, указывал на экспрессию УВ6-845 и УВ6-845-СЬ-де-буганина в супернатанте индуцированных клеток Е104 в лабораторном масштабе. Аликвоту супернатанта, 16 мкл, в невосстанавливающих условиях загружали на ДСНакриламидный гель и анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием либо кроличьего поликлонального антитела против 4Ό5, а затем козьего антикроличьего антитела (1/2000), либо козьего ПХ-конъюгированного антитела против каппа-цепи человеческого иммуноглобулина (1/1000), для подтверждения идентичности и размера рекомбинантного белка. Стрелки указывают на полноразмерный УВ6-845 (конструкция на фиг. 3) и УВ6-845-СЬ-де-буганин (конструкция на фиг. 6). Вестерн-блотанализ супернатанта неиндуцированной культуры Е104 не выявил соответствующих полос, что указывает на специфичность антител (данные не приводятся).
Результаты тестов на реактивность УВ6-845 (фиг. 3) и УВ6-845-СЬ-де-буганин (фиг. 6) в Ер-САМпозитивных клеточных линиях САЬ 27 и NIН:ΟУСΑК-3 по сравнению с контролем (Ер-САМ-негативной клеточной линией А-375) проиллюстрированы на фиг. 10А. Эти результаты были сравнимы с результатами такого же теста на реактивность, но проводимого с другой анти-Ер-САМ конструкцией, УВ6-845гелонином, где де-буганин был заменен другим растительным токсином гелонином (см. фиг. 14С, где представлены его аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:26) и последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО ΝΟ:25)). Результаты теста на реактивность с использованием гелониновой конструкции приводятся на фиг. 10В. Присоединение второго домена де-буганина к указанной молекуле в оптимальной ориентации не приводило к продуцированию продукта.
Тесты с помощью проточной цитометрии проводили путем инкубирования конструкций или кон- 28 010803 троля с 0,45х106 клеток на льду в течение 1 ч. После промывки конструкции, связанные с клеточной поверхностью, детектировали с использованием кроличьего антитела против буганина (фиг. 10А) или мышиного антитела против Н1к-метки (фиг. 10В) в течение 1 ч на льду. Клетки промывали и инкубировали с ФИТЦ-конъюгированным овечьим антителом против кроличьих !§С (фиг. 10 А) и ФИТЦконъюгированным овечьим антителом против мышиных !§С (фиг. 10В) в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали, ресуспендировали в РВ8, 5% БС8, содержащем иодид пропидия, для оценки связывания антитела с помощью проточной цитометрии. После инкубирования УВ6-845 и УВ6-845-СЬ-дебуганина с А-375 не было детектировано какого-либо изменения средней интенсивности флуоресценции. В противоположность этому, заметное изменение средней интенсивности флуоресценции наблюдалось для Ер-САМ-позитивных клеточных линий, САЬ 27 и NIН:ОVСАΒ-3 (фиг. 10А). Как указывалось выше, результаты, полученные для УВ6-845, были аналогичны результатам для гелониновой конструкции (фиг. 10В).
Специфичность к Ер-САМ.
Конкурентный анализ, проводимый с использованием УВ6-845 (конструкция на фиг. 3) и Ргох1шит™, ксБν-формата УВ6-845, содержащего эндотоксин А Ркеиботопак, продемонстрировал, что при конструировании БаЬ-формата специфичность УВ6-845 к Ер-САМ не изменялась (фиг. 11).
На фиг. 11 представлены результаты конкурентного анализа, проводимого с помощью проточной цитометрии, где УВ6-845 при концентрации 1 и 10 мкг/мл и РгохШит™ в повышенной концентрации, в пределах от 0 до 100 мкг/мл, инкубировали с клетками NIН:ОVСАΒ-3 (Ер-САМ-позитивной опухолевой клеточной линией). После инкубирования в течение 1 ч при 4°С клетки промывали, и связанный УВ6845 детектировали с использованием биотинилированного кроличьего антитела против буганина, а затем с использованием стрептавидина-цитохрома. Аналогичный эксперимент проводили для 4В5-РЕ, который был использован в качестве негативного контроля. Условия реакции указаны на фиг. 11.
Эффективность (биологическая активность).
Кроме того, бесклеточный анализ (фиг. 12) и МТ8-анализ на цитотоксичность (фиг. 13А и В) продемонстрировали, что де-буганин сохранял свою активность при конъюгировании с БаЬ-фрагментом. МТ8-анализ проводили для измерения активности известным стандартным способом, и этот анализ более подробно описан ниже в примере 8. При использовании Ер-САМ-позитивных клеточных линий, САЬ 27 и NIН:ОVСАΒ-3, Κ'\0 для УВ6-845 составляла 3-4 нМ и 2-3 нМ, соответственно. В случае УВ6-845Съ-де-буганина, измеренная активность для САЬ 27 составляла 1-2 нМ, а для NIН:ОVСАΒ-3 она составляла 0,6-0,7 нМ. Разработка БаЬ-конструкции против Ер-САМ, содержащей фрагмент антитела, для доставки в человеческую опухоль, присоединенный к лишенному иммуногенных свойств буганину, позволяет проводить повторное системное введение этого лекарственного средства и, тем самым, повышает его клиническую эффективность.
Получение конструкций.
Конструкции могут быть выделены из клеточных культур известными способами. Так, например, если Н1к-метка присутствует у Ν-конца пептидной конструкции, то белок БаЬ-буганин может быть очищен способом иммобилизации на хелатообразующем Νί2+. В качестве примера может быть использован описанный ниже протокол.
Ферментацию вариантов УВ6-845 с подпиткой проводили в 15-литровом ферментере СНЕМАР с использованием среды ТВ. При ОЬ600=20 (в средней логарифмической фазе роста), культуру индуцировали смесью питательного вещества и индуктора, содержащего 50% глицерин и 200 г/л Ь-арабинозы. Через 30 ч после индуцирования культуру собирали, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин, и варианты УВ6-845 очищали с использованием СМ-сефарозы и на колонках с сефарозой, образующей хелатный комплекс с металлом, а затем на эксклюзионной колонке. Вкратце, супернатант концентрировали и подвергали диафильтрации против 200 мМ фосфата натрия, рН 6,9±0,1. Затем подвергнутый диафильтрации концентрированный супернатант наносили на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия, 25 мМ №С1, рН 6,9±0,1. Колонку промывали 20 мМ фосфатом натрия, 25 мМ №С1, рН 6,9±0,1, а затем связанный УВ6-845 элюировали 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №С1, рН 7,5±0,1. Элюат СМ-сефарозы доводили до конечной концентрации 0,25% Тритона Х-100 и наносили на колонку с сефарозой, образующей хелатный комплекс. Затем колонку с сефарозой, образующей хелатный комплекс, промывали 3 различными промывочными буферами, сначала 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №С1, 0,25% тритоном Х-100, рН 7,5±0,1, а затем 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №С1, рН 7,5±0,1, и, наконец, 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №1С1 и 10 мМ имидазолом, рН 7,5±0,1. Затем связанный УВ6-845 элюировали 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №С1, 250 мМ имидазолом, рН 7,5±0,1, и собирали в 2 мл-фракции. Оптическую плотность при А280 определяли для каждой фракции, и фракции, содержащие объединенный материал, подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке 8200 до достижения чистоты фракций >80%. В одном из вариантов изобретения для повышения чистоты белка и для удаления эндотоксина объединенную фракцию 8ЕС 5-кратно разводили 20 мМ NаΡО4, рН 7,5, и пропускали через 15-миллилитровую колонку Бак! Б1оте с Р-сефарозой, уравновешенную 20 мМ NаΡО4, 25 мМ №С1, рН 7,5, при скорости потока примерно 5 мл/мин. После нанесения образца на колонку эту
- 29 010803 колонку промывали 10 колоночными объемами уравновешивающего буфера и промывку объединяли с исходной промывкой, полученной с проточной колонки с 6-сефарозой. Выходящий поток концентрировали примерно до 10х с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (М^СО) 30 кДа (мембраны Байопик Нубгокай) до достижения конечной концентрации 7,5 мг/мл. Затем добавляли твин80 до конечной концентрации 0,1%. Конечный продукт подвергали стерильной фильтрации и хранили при -80°С. После иммуноблоттинга с использованием анти-4Э5 антитела образцы в каждой стадии данной процедуры анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа. Чистоту подтверждали путем окрашивания коллоидным синим. Уровень экспрессии вариантов УВ6-845 определяли с помощью Вестерн-блотанализа и ЕМБА.
Пример 8. Функциональная и биологическая характеризация УВ6-845, т.е. рекомбинантного ЕрСАМ-специфического ЕаЬ-антитела, генетически присоединенного к лишенному иммуногенных свойств буганину (де-буганину).
Химиотерапевтическими средствами являются в высокой степени цитотоксические агенты, которые представляют собой стандартные лекарственные средства, часто применяемые для лечения многих солидных раковых опухолей. Цитотоксическое действие этих лекарственных средств заключается в индуцировании быстрого деления клеток как нормальных, так и опухолевых, и приводит к развитию ряда негативных побочных клинических эффектов. УВ6-845 представляет собой ЕаЬ-фрагмент антитела, связанный с неиммуногенной формой растительного токсина буганина. В отличие от химиотерапевтических средств, которые не обладают специфичностью к определенным опухолям, действие УВ6-845 ограничено цитолитическим действием лишь на Ер-САМ-позитивные опухоли-мишени. В этом исследовании для оценки активности и селективности УВ6-845 проводили проточный цитометрический анализ и анализ на цитотоксичность.
Проточная цитометрия.
Опухолевые клеточные линии, применяемые в данном исследовании, закупали в АТСС и размножали в соответствии с рекомендациями АТСС, за исключением клеточных линий С-41, Т0У-112О, которые культивировали в КРМI 1640 или в ЭМЕМ с добавлением 10% ЕСБ, соответственно. Опухолевые клетки собирали при конфлюентности 60-70% с жизнеспособностью выше 90%. Эпителиальные клетки здоровой молочной железы человека (НМЕС) закупали у САМВКЕХ и поддерживали в специальной среде в соответствии с процедурой, рекомендованной САМВКЕХ. Клетки собирали при конфлюентности 70% с жизнеспособностью выше 90%.
Клеточные линии, взятые у женщин с симптомами рака эндометрия, яичника и шейки матки, тестировали на связывание с УВ6-845 с помощью проточной цитометрии (табл. 9). 10 мкг/мл УВ6-845 добавляли к каждой клеточной линии (3х105 клеток) и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. А-375 и САЕ 27 использовали в качестве клеточных линий негативного и позитивного контроля, соответственно. После отмывки несвязанного материала добавляли мышиное моноклональное антигистидиновое антитело (Атегайат Рйагтааа, Са! # 27471001), разведенное 1/800 в РВ8, содержащем 10% ЕСБ, и инкубировали еще 1 ч при 4°С. Затем добавляли ФИТЦ-меченное антитело против мышиных !дС (Тйе Втбшд Бйе, Са!# АЕ271), разведенное 1/100 в РВБ-10% ЕСБ, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. И, наконец, после окрашивания иодидом пропидия для идентификации погибших клеток клетки анализировали на устройстве ЕАСБ СайЬиг.
Цитотоксичность.
Уровень ингибирования УВ6-845 в клетках, используемых в исследовании с помощью проточной цитометрии, указанный в табл. 10, показал, что эта конструкция сохраняла цитотоксическую активность де-буганина против Ер-САМ-позитивных клеточных линий. Такая цитотоксичность была сравнима с цитотоксичностью другого ЕаЬ-варианта УВ6-845, содержащего другой растительный токсин, а именно гелонин (фиг. 14). На фиг. 14А проиллюстрировано сравнение цитотоксичности гелонина, конструкции анти-Ер-САМ ЕаЬ-фрагмент - гелонин (УВ6-845 гелонин) и конструкции анти-Ер-САМ ЕаЬ-фрагмент - де-буганин (Вои156) (УВ6-845) в клетках САЬ 27 (фиг. 14А) и №Н:0УСАК-3 (фиг. 14В). Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность конструкции УВ6-845-гелонин представлены на фиг. 14С.
Для исследования специфичности и селективности УВ6-845 (конструкция на фиг. 3), цитотоксическую активность УВ6-845 (90% чистоты) тестировали против Ер-САМ-позитивной (№Н:0УСАК-3) и Ер-САМ-негативной клеточных линий (НМЕС, □ЛиОк А-375) (табл. 11) наряду с 17 химиотерапевтическими лекарственными средствами (ЬКБ ЬайогаЮпек Шс.).
МТБ-анализ осуществляли стандартными способами, известными специалистам. Более конкретно, 50 мкл клеток (2х104 клеток/мл) высевали на лунки и планшеты и инкубировали при 37°С в 5% С02 в течение 2 ч. Затем в культуральную среду с возрастающими концентрациями путем впрыска добавляли 50 мкл лекарственного средства (т.е. тестируемой конструкции или контроля). В качестве позитивного и негативного контроля использовали культуральную среду, содержащую или не содержащую клетки, соответственно. Планшеты оставляли на 5 дней при 37°С в атмосфере 5% С02. На 5-й день ингибирование пролиферации клеток оценивали добавлением 20 мкл реагента МТБ (Рготеда, Са!# 65430). Затем план
- 30 010803 шеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 2 ч и ΟΌ регистрировали при 490 нм с использованием спектрофотометра для считывания планшетов. Из величин, полученных для каждой концентрации в образцах, вычитали фоновые значения, и результаты выражали как процент жизнеспособных клеток. Величины 1С50 для каждого лекарственного средства вычисляли для каждой клеточной линии.
В анализе на цитотоксичность против ΝΙΗ:0νί.ΆΒ-3 и Ер-САМ-позитивной карциномы яичника, проводимом с использованием панели стандартных химиотерапевтических средств, было показано, что νΒ6-845 является более активным, чем 12 из 17 протестированных лекарственных средств (табл. 11). Хотя 5 химиотерапевтических средств имели большую цитотоксичность, однако, было также обнаружено, что их гораздо более высокая токсичность обусловлена отсутствием какой-либо клеточноспецифической цитолитической активности. Из пяти химиотерапевтических средств, рекомендованных для лечения рака яичника (паклитаксела, карбоплатина, цисплатина, доксорубицина и топотекана), только два средства (паклитаксел и топотекан) обладали большей цитотоксичностью. νΒ6-845 обладает высокой цитолитической активностью в пределах от 1 до 2 нМ, и при этом эта высокая цитолитическая активность ограничена исключительно Ер-САМ-позитивной опухолевой клеточной линией NIН:ΟVСΑΚ-3. Хотя Ер-САМ-негативная клеточная линия в определенной степени также подвергается цитолизу под действием νΒ6-845, однако, это цитотоксическое действие было по меньшей мере в 220 раз и, по большей части, в 1000 раз менее токсичным. Таким образом, νΒ6-845 представляет собой эффективное доставляемое антителом лекарственное средство, альтернативное химиотерапевтическому средству, которое, при его использовании в комбинации со средством с меньшим профилем токсичности, является в высокой степени перспективным для лечения многих солидных опухолей различных типов.
Пример 9. νΒ6-011: рекомбинантное конструирование опухолеассоциированного антигенспецифичного БаЬ-антитела для оптимальной доставки лишенного иммуногенных свойств буганина (дебуганина).
Нацеленные на опухоль цитотоксины состоят из вариабельной области антитела, связанного с бактериальным, грибковым или растительным токсином. Настоящее исследование продемонстрировало, что лишенные иммуногенных свойств конструкции буганина согласно изобретению, содержащие лишенный иммуногенных свойств буганин, присоединенный к нацеливающей молекуле, обладают пониженной иммуногенностью, но при этом сохраняют свою биологическую активность. В табл. 13 продемонстрировано связывание антитела против опухолеассоциированного антигена с опухолями некоторых типов и, таким образом, показано, что это антитело может быть использовано для лечения рака указанных типов.
Лишенная иммуногенных свойств буганиновая конструкция: нацеливающая молекула против опухолеассоциированного антигена, связанная с де-буганином.
Антитело Н11, а именно моноклональное антитело, распознающее опухолеассоциированный антиген, было генетически присоединено к неиммуногенной форме буганина (де-буганина), Вои156, т.е. к активному растительному инактивирующему рибосому белку (К1Р) типа I, в результате чего была получена конструкция антитело - токсин νΒ6-011. На фиг. 15 проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность. Тестирование этой конструкции показало, что данная конструкция сохраняет свою биологическую активность (цитотоксичность).
Эффективность (биологическая активность).
МТ8-анализ продемонстрировал, что де-буганин сохранял свою активность при его конъюгировании с БаЬ-фрагментом (фиг. 16). МТ8-анализ, применяемый для определения активности, проводили стандартным способом, известным специалистам и более подробно описанным в примере 8.
Цитотоксичность.
Для исследования специфичности и селективности конструкции νΒ6-011 эту конструкцию тестировали на цитотоксическую активность против клеток МВ-4358. МТ8-анализ осуществляли стандартными способами, известными специалистам. Более конкретно, 50 мкл клеток (2х104 клеток/мл) высевали на лунки, и планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 2 ч. Затем в культуральную среду с возрастающими концентрациями путем впрыска добавляли 50 мкл лекарственного средства (т.е. тестируемой конструкции или контроля). В качестве позитивного и негативного контроля использовали культуральную среду, содержащую или не содержащую клетки, соответственно. Планшеты оставляли на 5 дней при 37°С в атмосфере 5% СО2. На 5-й день ингибирование пролиферации клеток оценивали путем добавления 20 мкл реагента МТ8 (Ргошеда, Са!# С5430). Затем планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 2 ч, и ОЭ регистрировали при 490 им с использованием спектрофотометра для считывания планшетов. Из величин, полученных для образцов с каждой концентрацией, вычитали фоновые значения, и результаты выражали как процент жизнеспособных клеток. Результаты показали, что величина 1С50 для νΒ6-011 составляет 350 нМ.
Хотя настоящее изобретение описано на предпочтительных примерах его осуществления, однако, оно не ограничивается описанными примерами. Наоборот, в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации и в нем могут быть использованы эквивалентные системы, не выходящие за рамки существа и объема прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка во всей
- 31 010803 своей полноте были конкретно и отдельно введены в настоящее описание посредством ссылки. Таблица 1
Пептид Ν- | Положение первой аминокислоты | 5ЕС ΙΠ N0 | Последовательность | Пеп- тид № | Положе ние первой аминокислоты | 5ΕΏ ΙΏ N0 | Последовательность |
1 | 1 | 32 | ΥΝΤν£ΡΝΕΘΕΑΥΕΥΡ | 46 | 136 | 77 | ΕΓ3ΙΕΑΙΗ(3ΚΤΙΝ60 |
2 | 4 | 33 | УЙРРЬОЕАУЕУРТЕ! | 47 | 139 | 78 | ΙΕΑΙΗΘΚΤΙΝΟΟΕΙΑ |
3 | 7 | 34 | ΝΏΟΕΆΥΕΥΡΊΤIОСЬ | 46 | 142 | 79 | ΙΗΟΚΊΊΝαΟΞΙΑΚΓΕ |
4 | 10 | 35 | ΕΑΥΕΥΡΤΡΙΟΟΣΡΝΕ | 49 | 145 | 80 | ΚΤΙΝΟΏΕΙΑΚΕΡΏΐν |
5 | 13 | 36 | ΕΥΡΤΡΙΟηΐ,ΚΝΕΙΑΚ | 50 | 148 | 81 | ΝΟΟΕΙΑΚΓΡΕΙVIОМ |
6 | 16 | 37 | ΤΡI ΟϋβΚΝΕΕιΑΚΟΤΡ | 51 | 151 | 82 | ΕΙΑΚΡΡΕΐνΐ£Μν5Ε |
7 | 19 | 38 | ООЬКЫЕЬАКОТРУСО | 52 | 154 | 83 | ΚΡΡΣίνίβΜνδΕΑΑΚ |
8 | 22 | 39 | ΚΝΕΙΑΚαΤΡνΟΟΙΡν | 53 | 157 | 84 | ЫУЮМУЗЕААКРКУ |
9 | 25 | 40 | ЬАКСЗТРУСаЬРУТЪа | 54 | 160 | 85 | ΙΟΜνδΕΑΑΗΓΚΥΙΕΤ |
10 | 28 | 41 | <ЗТРУС(2ЬРУТЬОТ1А | 55 | 163 | 86 | ν3ΕΑΑΚΕΚΥΙΕΤΕνν |
11 | 31 | 42 | УСОЬРУТЬОТ ΙΑΏϋΚ | 56 | 166 | 87 | ΑΆΚΡΚΥΙΕΤΞννπκσ |
12 | 34 | 43 | ΕΡνΤΣΟΤΙΑΡΏΚΕΡν | 57 | 169 | 88 | ρκγίΕΤΕννυκσΕΥσ |
13 | 37 | 44 | ТЬ0Т1АВРКЕГ7Ь7П | 58 | 172 | 89 | ГЕТЕУУСКСЬУСЗРК |
14 | 40 | 45 | ΤΙΑϋϋΚΚΡνίνΠΙΤΤ | 59 | 175 | 90 | ЕУУБЕЗЬУСЗРКРЫР |
15 | 43 | 46 | ΒΏΚΚΡνΤΛ?Τ)ΙΤΤΤ$Κ | 60 | 178 | 91 | ϋκσι,γσδΡΚΡΝΓκνι, |
16 | 46 | 47 | ΗΕνί,νϋΙ ΤΤΤ5ΚΚΤ0 | 61 | 181 | 92 | ЬУСЗРКРМГКУШЬЕ |
17 | 49 | 48 | ΏνΌΙΤΤΤδΚΚΤνκνΑ | 62 | 184 | 93 | ΕΡΚΡΝΡΚνί,ΝΣΕΝΝΗ |
18 | 52 | 49 | ιτττεκκτνκνΑϊΌν | 63 | 187 | 94 | РЫЕК7Ы1ЬЕН1’ШСЕ’1 |
19 | 55 | 50 | Τ8 ΚΚΤνκνΑΙΟντην | 64 | 190 | 95 | ΚνίιΝΙιΞΝΝΝΟΏ 13ΌΑ |
20 | 58 | 51 | ΚΤνΚνΑΙΌνΤΌνΥνν | 65 | 193 | 96 | ЫЬЕШМСП15 ΏΑΙΗΚ |
21 | 61 | 52 | ΚνΑΙΌνΤΟνΥννΟΥβ | 65 | 196 | 97 | ΝΝΗ00Ι3ΏΑΙΗΚ33Ρ |
22 | 64 | 53 | ΐηντϋνγνναγοπκκ | 67 | 199 | 98 | ΟΟΙ8ϋΑΙΗΚ£3Ρς>ΟΤ |
23 | 67 | 54 | ΤΏνΥννΟΥΟϋΚΝΟΟΚ | 68 | 202 | 99 | 3ΟΑΙΗΚ55Ρ£σΓΓΙΝ |
24 | 70 | 55 | γνναγοϋκκϋακηΡΑ | 69 | 205 | 100 | IΗΚ3 3 ΡφσΤΤΙΝΡΑΕ |
25 | 73 | 56 | ОТОПКИКЭНЖАУРЬ | 70 | 208 | 101 | 58ΡςθΤΊΊΝΡΑ1φΕΙ |
26 | 76 | 57 | ОКНОаКПКАУРЪОКУ | 71 | 211 | 102 | ОСТТШРАЬОЫЗРЗ |
27 | 79 | 58 | ΌαΚΕΚΑνΡΙ,ϋΚνΡΤν | 72 | 214 | 103 | Τ ХЫРАЪОЬ15 Ρ 3Νϋ Ρ |
28 | 82 | 59 | ΌΚΆνΡΒΌΚνΡΤνΑΤδ | 73 | 217 | 104 | ΡΆΙφΕΙΕΡΞΝΟΡΝνν |
29 | 85 | 60 | УРЬОКУРТУАТЗКЪР | 74 | 220 | 105 | 2Ъ1 ΞΡ8ΝΌΡΝννΝΚν |
30 | 88 | 61 | ΌκνρτνΑτεκΕΕΡαν | 75 | 223 | 106 | 3Ρ8ΝΕΡΝννΝΚν50Ι |
31 | 91 | 62 | ΡΤ УАТЗ КЬЕ ΡΟνΤΝΕ | 75 | 226 | 107 | ΝΏΡΗννΝΚν3£ΐ3ΡΌ |
32 | 94 | 63 | АТВКЬРР'З'/ТКЕУТЬ | 77 | 229 | 108 | ΗννΝΚν5ζ)Ι£ΡϋΜ(3Ι |
33 | 97 | 64 | ΚΣΡΡΟνΤΝΡνΤΕΤΕΏ | 78 | 232 | 109 | ЫКУ5С13РПИС1ЪКГ |
34 | 100 | 65 | ΡΟνΤΝΚνΤΕΤΡϋΟΞΥ | 79 | 235 | 110 | ЗО15РРМС1ЬКРКЗЗ |
35 | 103 | 66 | тыкутьтросеуокь | 80 | 238 | 111 | ЗРПМа1ЬКЕК53КЪТ |
36 | 106 | 67 | νΤΣΤΡΌΘ3Υ0ΚΕνΝΑ | 81 | 240 | 112 | МСШСРКЗЗКЬТОРА |
37 | 109 | 68 | ТРОЗЗУОКЬУИААКУ | 82 | 243 | 113 | ЬКРК35КЬТСГАТМ1 |
38 | 112 | 69 | СБУОКЬУЫААКТОКК | 83 | 246 | 114 | Κ38ΚΙ.Τ0ΡΑΤΜΙΚ3Α |
39 | 115 | 70 | СКЬУШААКУПНКПЬЕ | 84 | 249 | 115 | КЪТ£ГАТМ1Н5А1УЕ |
40 | 118 | 71 | νΝΑΑΚνϋΚΚΏΕΕΙΌν | 85 | 252 | 116 | ΟΕΑΤΜΙΕΒΑΐνΕΌΕΟ |
41 | 121 | 72 | АКУПРКБЪЕШУУКЬ | 86 | 255 | 117 | ТМ1КЗА1УЕСЬОЙОЕ |
- 32 010803
42 | 124 | 73 | ВККОЬЕЬОТУКЬЕЕЗ | 37 | 258 | 118 | КЗА1УЕОЫХЗЕЕЬЕ1 |
43 | 127 | 74 | ОЬЕШУУКЬЕГ£1ЕА | 88 | 261 | 119 | 1УЕБЫЮГЕЪЕ1ЬЕР |
44 | 130 | 75 | 1ХЗ\ГУКЪЕЕ81ЕА1НС | 89 | 264 | 120 | БЬПСОЕЬЕТЬЕРША |
45 | 133 | 76 | УКЪЕЕЗТЕАГНСКТ! |
Пептиды последовательности буганина.
Подчеркнутые остатки отсутствуют в зрелом белке.
Таблица 2
Донор № | Номер донорного депозита | Аллотип | |
1 | ВС63 | ϋΚΒ1*04, | ΏΚΒ1*07, ϋΕΒ4*01 |
2 | ВС8 6 | ϋΚΒ1*04, | ϋΒΒ1*15, ϋΕΒ5 |
3 | ВС90 | ϋΚΒ1*07, | ϋΚΒΙ+15, ВЕВ4*01, СЕВ5 |
4 | ВС134 | ϋΕΒ1*01, | ΌΕΒ1*03, ϋΚΒ3 |
5 | ВС167 | ϋΕΒ1*01, | ϋΚΒ1*07 и ϋΕΒ4*01 |
6 | ВС216 | ϋΕΒ1*14, | ΟΚΒ1*15, ΒΡ.Β3, ΏΕΒ5 |
7 | ВС217 | ΏΕΒ1*04, | ΏΚΒ1*12, ЭР.ВЗ, ϋΕΒ4*01 |
8 | ВС23 3 | ΏΕΒ1*04, | ϋΚΒ1*11 И ϋΚΒ3, ϋΕΒ4*01 |
9 | ВС241 | ΒΕΒ1*07, | ΌΚΒ1*11, ΒΚΒ3, ϋΚΒ4*01 |
10 | ВС24 6 | ΌΕΒ1*01, | ΟΚΒ1+13 И ϋΚΒ3 |
11 | ВС262 | ϋΚΒ1*03, | ϋΚΒ1*07, ΟΕΒ3, ϋΕΒ4*01 |
12 | ВС292 | ϋΕΒ1*07, | ϋΚΒ1*13, ΏΕΒ3, ΟΕΒ4*01 |
13 | ВС293 | ϋΚΒ1*04, | ΒΚΒ1*10, ΟΕΒ4*01 |
14 | ВС231 | ϋΚΒ1*03 ϋΚΒ3 | или ϋΕΒ1*03, ϋΕΒ1*13 и |
15 | ВСЗ 01 | ϋΚΒ1*07, | ΏΕΒ1*14, ΏΕΒ3 |
16 | ВСЗ 2 6 | ϋΚΒ1*03, | ΟΕΒ1*15, ΏΕΒ3, ΕΡ.Β5 |
17 | ВС316 | ϋΕΒ1*13, | ΟΕΒ1*15, ϋΕΒ3, ΒΚΒ5 |
18 | ВС321 | ϋΚΒ1*01, | ΡΕΒ1*15, ϋΕΒ5 |
19 | ВСЗ 8 2 | ϋΚΒ1*04, | ΏΕΒ1*08, ϋΚΒ4*01 |
20 | ВСЗ 36 | ϋΕΒ1*Ο1, | ΏΚΒ1*11, ϋΚΒ3 |
Аллотипы МНС донорных МКПК.
Таблица 3
Праймер | 3ΕΏ ΙΟ ΝΟ | Последовательность |
ОЫ032 | 121 | САТТАСАААССТСТАССААСТТТ |
ОЫОЗЗ | 122 | ТТАСААДАСТАСАТААСТААТСТС |
ОЫ322 | 123 | САТАТАСАТАТСАААТАССТАТТСССТАСС |
ОЫ067 | 124 | ТСАСАСАСТаТТСТАСССТССТТСОССАСССАСТАА |
01Д068 | 125 | ОСТеСССААССАеССТАСААСАСТОТСТСАТТТААС |
ОЫ323 | 126 | соАотессессестсААтеетсАтаетвАтоетет |
Последовательности праймеров, используемых для конструирования гена буганина дикого типа (^Т).
- 33 010803
Таблица 4
Сконструированные и протестированные варианты буганина с одиночной заменой
Мутация | Мутации нуклеотидов | Люциферазная активность в анализе* | Клон 10** |
Негативный контроль | |||
Υ70Α | ТАТ - СОТ | -- | ВоиУ70А |
Область К1 эпитопа (пептид 41) | |||
У123Т | СТС - АСС | +/- | Вои2 |
У123А | СТС - СОТ | ++ | ВоиЗ |
571230 | СТО - САТ | -- | - |
У123Е | СТС - САА | -- | - |
νΐ23α | СТС - ссс | -- | - |
νΐ23Η | СТС - САС | -- | - |
У123К | СТС - ААС | -- | - |
νΐ23Ν | СТС - ААС | -- | - |
νΐ23Ρ | СТС - ССТ | -- | - |
νΐ230 | СТС - САА | ++ | Вой 4 |
νΐ23Κ | СТС - АСА | -- | - |
νΐ235 | СТС ’ ТСА | -- | - |
О127С | САТ - ССС | ++ | Вой 5 |
ϋ127Α | САТ - ССТ | ++ | Воиб |
Ε129Κ | САА - ДАС | -- | - |
Ε129Κ | САА - АСА | - | |
Ε1290 | САА - САА | +/- | Вои7 |
Е129С | САА - ССС | ++ | ВоиЕ |
Область Ρ2 эпитопа (пептид 44) | |||
Υ133Ρ | ТАС - ССС | -- | - |
Υ133Ν | ТАС - ААС | + + | Вой 9 |
Υ133Τ | ТАС - АСА | ++ | ВоиЮ |
Υ133Α | ТАС - ССТ | ++ | воин |
Υ133Κ | ТАС - АСА | ++ | Вои12 |
Υ133ϋ | ТАС - САТ | ++ | Вои13 |
Υ133Ε | ТАС - САА | +/- | Вои14 |
Υ1330 | ТАС - САА | ++ | Вой! 5 |
Υ133Ο | ТАС - ССС | ++ | Вои16 |
Υ133Η | ТАС - САС | + 4- | Вой 17 |
Υ133Κ | ТАС - ААС | + + | Вои18 |
Υ1333 | ТАС - ТСА | + + | Вои19 |
Область КЗ эпитопа (пептид 50) | |||
Е151Т Ι132Ε | САСАТА - АСССАА | -- | - |
11520 | АТА - САА | + + | ВОи20 |
Ι152Α | АТА - ССА | + + | Вои21 |
Ι152Ε | АТА - САА | -- | - |
Р155Р | ТТС - ССА | - | |
Е155Н | ТТС - САС | - | |
Ι158Ρ | АТТ - ССА | - - | - |
* Люциферазная активность в анализе:
+ + = аналогичная или выше активности белка ^Т. + = в 2 раза выше активности ^Т. +/- = в 3 раза выше активности ^Т. - = менее чем одна треть активности ^Т. \УТ = белок дикого типа.
** Клон ГО. Обозначения только для функционально активных вариантов.
- 34 010803
Таблица 5 Сконструированные и протестированные варианты буганина с множественными заменами
Клон ГО | Область В1 | Область Β2 эпитопа (пептид 44) | Область ВЗ эпитопа (пептид 51) | Лициферазная активность в анализе | |
эпитопа 4: | (пептид ί) | ||||
Вои143 | 71230 | Υ133£ | Ι152Ο | ++ | |
Вои144 | νΐ23Α | Υ133Ν | Ι152Α | ++ | |
Вои145 | νΐ23Α | Υ133Ώ | Ι152Α | ++ | |
Вои146 | VI2 ЗА | О127С | ++ | ||
Вои147 | νΐ23Α | Ό1Ξ7Α | ++ | ||
Вои148 | νΐ23Ο | ϋ127Ο | ++ | ||
Вои149 | νΐ23Ω | Ώ127Α | ++ | ||
ВО11150 | Ч123О | Е129С | + | ||
Вои151 | νΐ23Α | Е129С | + | ||
ВО11156 | νΐ23Α | Ώ127Α | Υ133Ν | Ι152Α | ++ |
Вои157 | νΐ23Α | ϋ127Α | Υ1330 | Ι152Α | ++ |
* Люциферазная активность в анализе ++ = аналогичная или выше активности белка ^Т. + = в 2 раза выше активности ^Т. +/- = в 3 раза выше активности ^Т. - = менее чем одна треть активности ^Т. \¥Т = белок дикого типа.
Таблица 6
Клон 10 | Замена(ы)* | Белок |
Вои32 | ИТ | ЗЕО Ю Νο 1 |
Вой!56 | νΐ23Α, ϋ127Ά, Υ133Ν, Ι152Α | ЗЕО ΙΟ Νο 13 |
Вои157 | νΐ23Α, Ώ127Α, Υ133Ο, Ι152Α | ЗЕО Ю Νθ 14 |
Вои143 | νΐ230, Υ1330, 11520 | |
Вои144 | νΐ23Α, Υ133Ν, Ι152Α | |
Вои145 | νΐ23Α, Υ1330, Ι152Α | |
Вои14б | νΐ23Α, 01270 | |
Вои147 | νΐ23Α, Ώ127Α | |
Вои148 | νΐ230, 01270 | |
Вои14 9 | νΐ230, ϋ127Α | |
Вои150 | νΐ230, Е129С | |
Вои151 | У123А, Е129С |
- 35 010803
Вои2 | У123Т | |
ВоиЗ | VI2 ЗА | |
Воч4 | У123С2 | |
Вои5 | Б127О | |
Вой 6 | Б127А | |
Вои7 | Е1290 | |
Вой 8 | Е129С | |
Вой 9 | Υ133Κ | |
ВоиЮ | Υ133Τ | |
Воин | Υ13 3Α | |
Бои! 2 | Υ133Κ | |
Вои13 | Υ133Ο | |
Вои14 | Υ133Ε | |
Вои15 | Υ133<2 | |
Вои16 | Υ133Ο | |
Вои17 | Υ133Η | |
Вои18 | Υ133Κ | |
Вои19 | Υ1333 | |
Вои2 0 | 11520 | |
Вои21 | Ι152Α |
* Нумерация начинается с остатка 1 буганина с сохранением рамки считывания, а поэтому в данном случае отсутствует лидерная последовательность Ре1В, включенная в большинство конструкций.
Таблица 7
8ЕС ΙΡ ΝΟ~~ΐ
Протеин ΥΝΤνεΡΝΙ^ΕΑΥΕΥΡΤΡΙΟΟΕΕΝΕΓΤ^αΤΡνσΟΒΡνΤΙΟΤΓΑΓϋΚΚΓνΣνΓΙΤΤΤΘΚΚΤνκνΑΙΡνΊ’Ώνγ ννβΥΟϋΚΚϋΘΚΏΕΑνΡΒϋΚνΡΤνΑΤε ΚΣΡΡΟνΤΝΚνΊΤΤΡϋΟΞ γςκυνΝΆΑΚνΟΕΚϋΏΕΕΘνΥΚΓΕΡδ ΙΕ А1НакТ1Ы(30Е1АКРГЬ1У10ИУЗЕААК?КУ1ЕТЕУТОКаЬ¥С5РКРМЕКУИаЕ№ТЖ5О15ОА1ЕК55Р 0СТТ1КРАЪ0Ь13Р5НОРН\ГУМКУ3013РСМа1ЬКГКЗЗК
5Ε0~ΙΡ~^Η0~η ' ' ' '
Протеин
ΥΝΤν5ΡΝΓΧ;ΕΑΥΕΥΡΤΡΙ0ϋΣΚΝΕΙΛΚσΤΡνϋ0ΣΡνΤΣ0ΤΙΆΣ>ΟΚΗΡνΕνΓΙΤΤΤ5ΚΚΤνκνΑΙΏνΓθνΥ ννΟΥΟΡΚνΠΧϊΚΓΚΑνΡΕΟΚνΡΤνΑΤΞ КЬРРСУТНКУТЬТРРСЗ УО^УНААКАРНКАЬЕЬОТККЪЕРЗ ΙΕ ΑΙΗσΚΤΙΝσ0ΕΑΑΚΚΡΡΐνΐ0Μν5ΕΑΑΕΡΚΪ·ΤΕΤΕννΠΕ^Υα5ΡΚΡΝΡΚνΕΝΕΞΝΝΜσΏΙ5ΏΑΙΗΚ55Ρ 0СТТ1НРАЬ0Ь15Р5КРРИУУИКУ5ф18₽РМ31ЬКРК55К
Таблица 8
Модифицированные пептиды и пептиды дикого типа, дополнительно протестированные в Т-клеточных анализах
Пептид № | Положение первой аминокислоты в буганине | Последовательность* | ВЕС 10 НО: |
ϋβΙ-41 | 121-135 | АКАЦЕКАЬЕЬСУЫКЬ | 29 |
Эе1-44 | 130-144 | ЬСтаКЬЕ Е51ΕΑΙ НС | 30 |
0е1-50 | 149-163 | ИаОЕААКРГЫУЮМ | 31 |
* Замененный (мутантный) остаток подчеркнут.
- 36 010803
Таблица 9 Связывание УВ6-845 с клеточной линией женских половых органов, определяемое с помощью проточной цитометрии.
Результаты выражены как кратность увеличения в МЕ (средней интенсивности флуоресценции)±ср.кв.от.
Показания | Клеточные линии | УВ6-845 (кратность увеличения МР±ср.кв.от.) |
Эндометрий | НЕС-1-А | 42,3+0,9 |
КЬ95-2 | 4,9+0,7 | |
εκ-υτ-ι | 1,1±0,1 | |
Яичник | ΝΙΗ:ОУ САЛ-3 | 33,б±б,0 |
ЗК-ОУ-З | 4,3+1,0 | |
ТОУ-112С | 1,1±1,0 | |
Шейка матки | НТ-3 | 29,1+1,2 |
С-41 | 6,8+0,6 | |
С-ЗЗА | 1,1±0,0 | |
Меланома | А-375 | 1,1±0,1 |
Таблица 10
УВ6-845-опосредуемая цитотоксичность, определяемая в МТ8-анализе
Показания | Клеточная линия | 1С50 нМ УВб-845 с 70%-ной чистотой |
Эндометрий | НЕС-1-А | 43 |
КЬЕ | >100 | |
КД95-2 | 100 | |
Яичник | ΝΙΗ:ОУСАК-3 | 3,4 |
Саоу-3 | 1,3 | |
ЗК-ОУ-З | >100 | |
Шейка матки | М3751 | 0,43 |
НТ-3 | 23 | |
МЕ-180 | 37 | |
С-41 | 1, 7 | |
Меланома | А-375 | >100 |
Таблица 11
Специфичность и селективность УВ6-845 по сравнению с химиотерапевтическими средствами
1С50 пм | ||||
ΝΙΗ;ОУСАК-3 | А-375 | ОАЦО1 | НМЕС | |
Паклитаксел | <10’6 | 4,9х10’6 | <10-ί | <10'6 |
Доцетаксел | <10'6 | <10'6 | <10‘6 | <10’ё |
Винкристин | 4,4х106 | <10‘6 | <10'6 | <10'6 |
Сульфат винбластина | 1,1х10'6 | <10'ь | <10-ь | <10'6 |
Топотекан | 0,071 | 1,5 | 0,009 | 4,1 |
УВ6-845 (90% чистоты) | 1 | >1000 | >1000 | 220 |
- 37 010803
Доксорубицин | 3 | 2,8 | 16х10е | 16 | |
Митомицин С | 28 | 14 | 2,8 | 50 | |
Сульфат блеомицина | 30 | 170 | 22 | 600 | |
Блеомицин А5 | 150 | 290 | 130 | 1000 | |
Иринотекан | 180 | 900 | 190 | 1000 | |
Этопозид | 210 | 280 | 1,7 | 600 | |
Метотрексат | >1000 | 6 | 3,6 | 41 | |
Хлорамбуцил | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | |
Фторурацил | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | |
Циклофосфамид | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | |
Цисплатин | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | |
Карбоплатин | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 |
Таблица 12
Показания νΒ6-845 для опухолевых клеток
Показания | Ν1 | Связывание для зсЕч 845 (1дС)2 |
Желудок | 3 | 148,9 |
Яичник | 2 | 84,1 |
Пищевод | 3 | 72,4 |
Мочевой пузырь | 14 | 59,6 |
Предстательная железа | 5 | 50,1 |
Шейка матки | 3 | 37,5 |
Эндометрий | 1 | 23,8 |
Легкие | 3 | 16,4 |
Голова и шея | 2 | 11,4 |
Почки | 3 | 9,4 |
Поджелудочная железа | 3 | 5,5 |
Меланома | 3 | 1,6 |
1 N означает число протестированных клеточных линий на показание 2 Среднее кратное увеличение средней интенсивности флуоресценции по сравнению с контрольным антителом для всех клеточных линий в каждом показании.
Таблица 13 Показания νΒ6-011 для опухолевых клеток
Показания | Ν1 | Связывание для тАЬ 011 (1дС)^ |
Молочная железа | 3 | 16,9 |
Предстательная железа | 3 | 15,1 |
Меланома | 3 | 14,0 |
Легкие | 3 | 13,1 |
Яичник | 2 | 11,1 |
Толстая кишка | 3 | 8,7 |
Почки | 3 | 6,9 |
Печень | 2 | 6,5 |
Поджелудочная железа | 3 | 4,2 |
Голова и шея | 2 | 2,9 |
1 N означает число протестированных клеточных линий на показание 2 Величины означают среднее, вычисленное как сумма среднего кратного увеличения средней интенсивности флуоресценции по сравнению с контрольным антителом для всех клеточных линий в каждом показании. Величина ноль должна означать недетектируемую реактивность по сравнению с контрольной активностью.
Claims (34)
1. Модифицированный белок буганин, который обладает пониженной способностью к активации иммунного ответа.
2. Модифицированный буганин по п.1, обладающий пониженной способностью к активации Тклеток и модифицированный по одному или нескольким аминокислотным остаткам в Т-клеточном эпитопе.
3. Модифицированный буганин по п.2, являющийся модифицированным по одному или нескольким аминокислотным остаткам в Т-клеточном эпитопе, выбранном из группы, состоящей из:
б) ΑΚ\ΌΗΚΙ)Ι.Η.(.,\ΎΚΙ. (область Н1 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:2);
е) 1,(.ιΑΥΚΕ1ΤΑΕΑΙ11С (область Н2 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:3);
ί) М..А)1 ΑΑΚ1ΑΑΙ\Ί(')\1 (область Н3 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:4).
4. Модифицированный буганин по п.3, являющийся модифицированным по одному или нескольким из X1, X2, X3, X4 или X5, представленным ниже:
a) ΑΚ.\Ι)ΗΚ.\Ί..\1.(.ιΑ.\Κ1. (область Н1 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:5);
b) 1,С1А.\А1 ААЛАЛП1С (область Н2 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:6);
c) NС^ΕX5ΑΚΡΡ^IVI^Μ (область Н3 эпитопа, ЛА) ΙΌ N0:7), где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту.
5. Модифицированный буганин по п.4, где
X1 представляет собой Т, А или О;
X2 представляет собой С или А;
X3 представляет собой О или С;
X4 представляет собой N Ό, Τ, Α, Н, О, Ε, С, Н, Κ или Л;
X5 представляет собой О или Α (8Ε0 ΙΌ N0:8; 8Ε0 ΙΌ N0:9; 8Ε0 ΙΌ N0:10).
6. Модифицированный белок буганин по п.1, где аминокислотная последовательность модифицированного белка буганина содержит ¥ЫТУ8ГЫЬ6ЕАУЕУРТЕ10ОЬКЫЕЬАКСТРУС0ЬРУТЦ2Т1АООККГУ
Εν0ΙΤΤΤ5ΚΚΤνκνΑΙϋνΤ0νΥνν6Υ00ΚΝΟ6Κ0ΕΑνΓΕ0ΚνΡΤνΑΤ
8КЬЕРСУТМНУТЬТЕ[Х35У0КЬУНААКХ1ОККХ21>Х3ЬСУХ4КЬЕГ81Е
ΑΙΗΟΚΤΙΝ60ΕΧ5ΆΚΕΕΙ,ΐνΐ0Μν5ΕΑΑΚΕΚΥΙΕΤΕννθΚ6ΕΥΰ5ΓΚΡΝ
ΕΚνΕΝΕΕΝΝΚ6ΟΙ3ΟΑΙΗΚ33Ρ00ΤΤΙΝΡΑΕ0ΕΙ3Ρ3ΝΟΡΗννΝΚν5Ο
18Р0МС1ЬКЕК88К (ЗЕО Ю N0:11) где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту.
7. Модифицированный буганин по п.6, где
X1 представляет собой Т, А или О;
X2 представляет собой С или А;
X3 представляет собой О или С;
X4 представляет собой N Ό, Τ, Α, Н, О, Ε, С, Н, Κ или Л;
X5 представляет собой О или Α (8Ε0 ΙΌ N0:12).
8. Модифицированный белок буганин по п.1, содержащий нижеследующую последовательность: ΥΝΤνΒΓΝΕΟΕΑΥΕΥΡΤΓΙβΟΙΚΝΕΕΑΚΟΤΡνΟΟΕΡνΤΕΟΤΙΑΟΟΚΚΓν
Εν0ΙΤΤΤ3ΚΚΤνκνΑΙϋνΤθνγνν0Υ00ΚΗΡ0Κ0ΚΑνΓΕ0ΚνΡΤνΑΤ
3ΚΕΓΡενΤΝΚνΤΕΤΓΟΟ3Υ0ΕνΝΑΑΚΑΟΚΚΑΕΕΕ3νΝΚΕΕΕ3ΙΕΑΙΗ ΰΚΤΙΝ6ΟΕΑΑΚΕΈΕΐνΐ<2Μν3ΕΑΑΚΕΚΥΙΕΤΕννϋΚ6ΕΥΟ5ΕΚΡΝΡΚνΣ
ΝΕΕΝΝΝΟΟΙ30ΑΙΗΚ33ΡΟΟΤΤΙΝΡΑΕ<2Ι,Ι5Ρ3ΝΟΡΙΐννΝΚν30Ι3ΡΟ
МС1БКЕК88К (5Ε0 Ю N0:13).
9. Цитотоксин, содержащий (а) нацеливающий фрагмент, присоединенный к (Ь) модифицированному белку буганину по любому из пп.1-8.
10. Цитотоксин, содержащий (а) лиганд, который связывается с раковой клеткой, присоединенной к (Ь) модифицированному белку буганину по любому из пп.1-8.
11. Цитотоксин по п.10, где лигандом является антитело или фрагмент антитела, который связывается с раковой клеткой.
12. Цитотоксин по п.11, где антитело или фрагмент антитела связывается с Ер-САМ на поверхности раковой клетки.
13. Цитотоксин по п.12, где антитело или фрагмент антитела, который связывается с Ер-САМ, представляет собой гуманизованное антитело или фрагмент антитела, который связывается с внеклеточным доменом человеческого Ер-САМ и содержит последовательности гипервариабельной области, происходящие от антитела МОС-31.
- 39 010803
14. Цитотоксин по п.12, где вариабельной областью лиганда, связывающегося с раковой клеткой и присоединенного к модифицированному белку буганину, является 4Э5МОСВ.
15. Цитотоксин по п.14, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ^:16.
16. Цитотоксин по п.11, где антитело или фрагмент антитела связывается с опухолеассоциированным антигеном на поверхности раковой клетки.
17. Цитотоксин по п.16, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ^:28.
18. Применение цитотоксина по любому из пп.9-17 в производстве лекарственного средства для ингибирования или разрушения раковой клетки.
19. Применение по п.18, где раковая клетка выбрана из группы, состоящей из клеток рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака печени, рака почек, меланомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака предстательной железы, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, саркомы, глиомы, Т-клеточных и Вклеточных лимфом.
20. Применение цитотоксина по любому из пп.9-17 в производстве лекарственного средства для лечения рака.
21. Применение по п.20, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака печени, рака почек, меланомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака предстательной железы, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, саркомы, глиомы, Т-клеточных и В-клеточных лимфом.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая цитотоксин по любому из пп.9-17 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
23. Способ получения фармацевтической композиции для лечения животного, страдающего раком, где указанный способ включает в себя:
(a) идентификацию Т-клеточных эпитопов буганина;
(b) модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков в Т-клеточном эпитопе для получения модифицированного буганина, обладающего пониженной способностью к активации Т-клеток;
(c) получение цитотоксина, имеющего лиганд, связывающийся с раковой клеткой и присоединенный к модифицированному буганину; и (б) суспендирование цитотоксина в фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе.
24. Способ по п.23, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака печени, рака почек, меланомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака предстательной железы, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, саркомы, глиомы, Т-клеточных и В-клеточных лимфом.
25. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный буганин по любому из пп.1-8.
26. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая цитотоксин по пп.9-17.
27. Пептид Т-клеточного эпитопа, состоящий из последовательности:
(a) АКУПККОЬЕШУ^^КЬ (область К1 эпитопа, 8ЕО ΙΌ ^:2);
(b) ^^34^4^86^1 Ю (область К2 эпитопа, 8ЕО ΙΌ ^:3) или (c) ХСОЕ^КЕЕБЛУ^М (область К3 эпитопа, 8ЕО ΙΌ ^:4).
28. Пептид Т-клеточного эпитопа по п.27, имеющий модифицированную последовательность, содержащую
АКХ1ЭККХ2ЬХ3ЬС7Х'1К, где по меньшей мере один из X1, X2, X3 и X4 модифицирован из немодифицированной последовательности, такой как К, следующим образом:
X1 представляет собой Т, А или Ц;
X2 представляет собой С или А;
X3 представляет собой О или С;
X4 представляет собой Ν, Ό, Т, А, К, Ц, Е, С, Н, К или 8 (8ЕЦ ΙΌ NО:8).
29. Пептид Т-клеточного эпитопа по п.27, имеющий модифицированную последовательность, содержащую
ЬСУХ4КЬЕГ31ЕА1НС, где X4 представляет собой Ν, Ό, Т, А, К, Ц, Е, С, Н, К или 8 (8ЕЦ ΙΌ NО:9).
30. Пептид Т-клеточного эпитопа по п.27, имеющий модифицированную последовательность, содержащую
Ν&2ΕΧ5ΑΚΕΕΤΐνΐ<2Μ, где X5 представляет собой О или А (8ЕЦ ΙΌ NО:10).
- 40 010803
31. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид Т-клеточного эпитопа по любому из пп.27-30.
32. Модифицированный белок буганин, который модифицирован по тирозиновому остатку в положении 70.
33. Модифицированный белок буганин по п.32, где указанный тирозин заменен аланином.
34. Модифицированный белок буганин по п.32, имеющий последовательность ΥΝΤν3ΕΝΙ,ΟΕΑΥΕΥΡΤΓΙΟϋΙ,ΚΝΕ1ιΑΚΟΤΡνθ01.ΡνΤΕζ)ΤΙΑΕΟΚΕίΕν
ΕνΟΙΤΤΤΕΚΚΤνκνΑΙΟνΤϋνΑννΟΥΟΟΚνίΟΟΚΟΗΑνΓΙΟΚνΡΤνΑΤ
ЗКЬЕРСУТЫЕУТЬТЕОСЗУ0КЬ7НААК70ККОЬЕЬЭТУКЬЕГ31ЕА1Н
0ΚΤΙΝΰΏΕΙΑΚΕΓΕΐνΐΰΜν3ΕΑΑΡΕΚΥΙΕΤΕνν0ΚαΕΥ05ΓΚΡΝΕΚνΕ
МЬЕММИСОТЗОА1НКЗЗРССТТ1МРАЬ0ЕТЗРЗМОРЖг7ЫКУ52:ЗРО
МСХЬКГКЗЗК [ЗЕО Ю N0:129].
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55458004P | 2004-03-19 | 2004-03-19 | |
US63057104P | 2004-11-26 | 2004-11-26 | |
PCT/CA2005/000410 WO2005090579A1 (en) | 2004-03-19 | 2005-03-18 | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200601738A1 EA200601738A1 (ru) | 2007-04-27 |
EA010803B1 true EA010803B1 (ru) | 2008-12-30 |
Family
ID=34993709
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200601738A EA010803B1 (ru) | 2004-03-19 | 2005-03-18 | Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7339031B2 (ru) |
EP (1) | EP1737961B1 (ru) |
JP (1) | JP5025460B2 (ru) |
KR (1) | KR101165867B1 (ru) |
AU (1) | AU2005224942B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0508670B1 (ru) |
CA (1) | CA2560278C (ru) |
DK (1) | DK1737961T3 (ru) |
EA (1) | EA010803B1 (ru) |
ES (1) | ES2424643T3 (ru) |
HK (1) | HK1102306A1 (ru) |
IL (1) | IL177922A (ru) |
MX (1) | MXPA06010716A (ru) |
NO (1) | NO338293B1 (ru) |
NZ (1) | NZ550339A (ru) |
PL (1) | PL1737961T3 (ru) |
PT (1) | PT1737961E (ru) |
WO (1) | WO2005090579A1 (ru) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4988333B2 (ja) | 2003-04-30 | 2012-08-01 | ユニバーシティー オブ チューリッヒ | 免疫毒素を用いる癌を処置するための方法 |
AU2005252275B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-07-21 | Viventia Bio Inc. | Tumor specific antibody |
EP1844074B1 (en) | 2005-02-03 | 2013-04-24 | Antitope Limited | Human antibodies and proteins |
ES2395103T3 (es) * | 2005-12-21 | 2013-02-08 | Viventia Biotechnologies Inc. | Variantes de Scratch asociados al cáncer |
JP2009520468A (ja) * | 2005-12-23 | 2009-05-28 | ヴィヴェンティア バイオテック インコーポレーティッド | 融合タンパク質ライブラリーの作製法およびスクリーニング法、ならびにそれらの使用 |
WO2008052322A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Viventia Biotech Inc. | Immunotoxγn fusions comprising an antibody fragment and a plant toxin linked by protease cleavable linkers |
EP2450369A1 (en) * | 2007-01-30 | 2012-05-09 | Epivax, Inc. | Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof |
CA2684330A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Viventia Biotech Inc. | Optimized nucleotide sequences of vb6-845 for expression of recombinant proteins |
US8252897B2 (en) * | 2007-06-21 | 2012-08-28 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
US8318472B2 (en) | 2007-09-27 | 2012-11-27 | Viventia Biotechnologies Inc. | Optimized nucleic acid sequences for the expression of VB4-845 |
WO2009110944A1 (en) | 2008-02-29 | 2009-09-11 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
US9388397B2 (en) | 2013-02-15 | 2016-07-12 | Research Development Foundation | Deimmunized gelonin molecules and therapies |
CA2902905A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Claude Geoffrey Davis | Modified toxins |
CN105188762A (zh) * | 2013-04-12 | 2015-12-23 | 维文蒂阿生物公司 | 用于肝细胞癌检测和治疗的组合物和方法 |
KR102068519B1 (ko) | 2013-07-01 | 2020-01-21 | 삼성전자주식회사 | 저장 장치, 그것의 쓰기 방법 및 읽기 방법 |
SG11201602170XA (en) * | 2013-10-02 | 2016-04-28 | Viventia Bio Inc | Anti-epcam antibodies and methods of use |
US20160060358A1 (en) * | 2014-08-28 | 2016-03-03 | California Institute Of Technology | Induction of antigen-specific tolerance |
US10576163B2 (en) | 2015-03-12 | 2020-03-03 | Viventia Bio Inc. | Methods of treatment for EpCAM positive bladder cancer |
US10583198B2 (en) | 2015-03-12 | 2020-03-10 | Viventia Bio Inc. | Dosing strategies for targeting EPCAM positive bladder cancer |
WO2016187571A2 (en) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Viventia Bio Inc. | Her2 immunotoxins and methods of using the same |
AU2018347796A1 (en) | 2017-10-10 | 2020-05-07 | Medicenna Therapeutics, Inc. | IL-4-fusion formulations for treatment of central nervous system (CNS) tumors |
CN112823023B (zh) * | 2018-08-10 | 2024-04-12 | 桑福德伯纳姆普利斯医学发现研究所 | 肿瘤相关巨噬细胞的结合分子及使用方法 |
JP7124034B2 (ja) * | 2020-11-05 | 2022-08-23 | 株式会社天柳 | 嚥下困難者用食品組成物の製造方法 |
JP7488928B1 (ja) | 2023-03-01 | 2024-05-22 | 積水フーラー株式会社 | ホットメルト接着剤 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998058678A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Tanox Pharma B.V. | Anti-cd40l immunotoxins for the treatment of diseases |
WO2002069232A2 (en) * | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
WO2003103715A1 (en) * | 2002-06-11 | 2003-12-18 | Merck Patent Gmbh | Modified byrodin 1 with reduced immunogenicity |
US6680295B1 (en) * | 1994-09-22 | 2004-01-20 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method and pharmaceutical composition for prevention and treatment of brain damage |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6121416A (en) * | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
DE69833755T2 (de) | 1997-05-21 | 2006-12-28 | Biovation Ltd. | Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen |
AU8040898A (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-21 | Tanox Pharma B.V. | Type-1 ribosome-inactivating protein |
ATE352559T1 (de) | 1998-12-08 | 2007-02-15 | Biovation Ltd | Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen |
WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
DK1512004T3 (da) | 2002-06-11 | 2006-06-06 | Merck Patent Gmbh | Fremgangsmåde til kortlægning og eliminering af T-celleepitoper |
CA2424255A1 (en) * | 2003-03-26 | 2004-09-26 | Claudio Di Paolo | Immunotoxins |
US7696322B2 (en) * | 2003-07-28 | 2010-04-13 | Catalent Pharma Solutions, Inc. | Fusion antibodies |
AU2005252275B2 (en) * | 2004-06-10 | 2011-07-21 | Viventia Bio Inc. | Tumor specific antibody |
JP5143566B2 (ja) * | 2004-12-21 | 2013-02-13 | ヴィヴェンティア バイオテクノロジーズ インコーポレーティッド | 癌特異的抗体および細胞表面タンパク質 |
EP1844074B1 (en) * | 2005-02-03 | 2013-04-24 | Antitope Limited | Human antibodies and proteins |
-
2005
- 2005-03-18 NZ NZ550339A patent/NZ550339A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-03-18 ES ES05728983T patent/ES2424643T3/es active Active
- 2005-03-18 EA EA200601738A patent/EA010803B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-03-18 JP JP2007503165A patent/JP5025460B2/ja active Active
- 2005-03-18 PL PL05728983T patent/PL1737961T3/pl unknown
- 2005-03-18 PT PT57289837T patent/PT1737961E/pt unknown
- 2005-03-18 WO PCT/CA2005/000410 patent/WO2005090579A1/en active Application Filing
- 2005-03-18 AU AU2005224942A patent/AU2005224942B2/en active Active
- 2005-03-18 MX MXPA06010716A patent/MXPA06010716A/es active IP Right Grant
- 2005-03-18 CA CA2560278A patent/CA2560278C/en active Active
- 2005-03-18 EP EP05728983.7A patent/EP1737961B1/en active Active
- 2005-03-18 KR KR1020067021711A patent/KR101165867B1/ko active IP Right Grant
- 2005-03-18 US US11/084,080 patent/US7339031B2/en active Active
- 2005-03-18 DK DK05728983.7T patent/DK1737961T3/da active
- 2005-03-18 BR BRPI0508670-1A patent/BRPI0508670B1/pt active IP Right Grant
-
2006
- 2006-09-06 IL IL177922A patent/IL177922A/en active IP Right Grant
- 2006-09-13 NO NO20064134A patent/NO338293B1/no unknown
-
2007
- 2007-09-27 HK HK07110463.0A patent/HK1102306A1/xx unknown
-
2008
- 2008-01-09 US US11/971,660 patent/US7750136B2/en active Active
-
2010
- 2010-05-21 US US12/784,820 patent/US8716234B2/en active Active
-
2014
- 2014-04-01 US US14/242,181 patent/US20150018526A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6680295B1 (en) * | 1994-09-22 | 2004-01-20 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method and pharmaceutical composition for prevention and treatment of brain damage |
WO1998058678A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Tanox Pharma B.V. | Anti-cd40l immunotoxins for the treatment of diseases |
WO2002069232A2 (en) * | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
WO2003103715A1 (en) * | 2002-06-11 | 2003-12-18 | Merck Patent Gmbh | Modified byrodin 1 with reduced immunogenicity |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
DEN HARTOG, M.T. et al. Cloning and expression of cDNA coding for bouganin. Eur J Biochem. March 2002, Vol. 269, No. 6, pages 1772-9. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1737961A1 (en) | 2007-01-03 |
WO2005090579A1 (en) | 2005-09-29 |
US20080219994A1 (en) | 2008-09-11 |
NZ550339A (en) | 2009-11-27 |
JP5025460B2 (ja) | 2012-09-12 |
EP1737961B1 (en) | 2013-05-08 |
IL177922A0 (en) | 2006-12-31 |
AU2005224942A1 (en) | 2005-09-29 |
CA2560278A1 (en) | 2005-09-29 |
JP2008500811A (ja) | 2008-01-17 |
HK1102306A1 (en) | 2007-11-16 |
NO338293B1 (no) | 2016-08-08 |
KR20070000494A (ko) | 2007-01-02 |
US20050238642A1 (en) | 2005-10-27 |
US20150018526A1 (en) | 2015-01-15 |
MXPA06010716A (es) | 2007-02-21 |
AU2005224942B2 (en) | 2011-08-11 |
US8716234B2 (en) | 2014-05-06 |
US7750136B2 (en) | 2010-07-06 |
US7339031B2 (en) | 2008-03-04 |
ES2424643T3 (es) | 2013-10-07 |
IL177922A (en) | 2011-06-30 |
PT1737961E (pt) | 2013-08-26 |
EP1737961A4 (en) | 2008-12-17 |
NO20064134L (no) | 2006-11-08 |
CA2560278C (en) | 2012-11-20 |
DK1737961T3 (da) | 2013-08-05 |
BRPI0508670B1 (pt) | 2023-01-24 |
US20100254964A1 (en) | 2010-10-07 |
BRPI0508670A (pt) | 2007-08-14 |
KR101165867B1 (ko) | 2012-07-13 |
PL1737961T3 (pl) | 2013-12-31 |
EA200601738A1 (ru) | 2007-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA010803B1 (ru) | Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения | |
JP7280827B2 (ja) | Axlまたはror2に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法 | |
CN107636014B (zh) | 抗癌融合多肽 | |
US7892827B2 (en) | Compound with affinity for the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA-4) | |
JP6560682B2 (ja) | 小細胞肺癌に対する標的療法 | |
CN110520522A (zh) | 功能化红系细胞 | |
EP3747899A2 (en) | High avidity binding molecules recognizing mage-a1 | |
CN110418802A (zh) | 细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法 | |
US5770445A (en) | Glucagon receptor proteins, peptides, and antibodies | |
JPH09502174A (ja) | 細胞表面受容体hekに結合するサイトカイン | |
CN101534849A (zh) | 对胎盘生长因子(pigf)介导的肿瘤转移和/或血管生成的抑制 | |
EA020465B1 (ru) | ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | |
WO2016191305A1 (en) | Btn3a ectodomain proteins and methods of use | |
JPH10512440A (ja) | サイトカイン”lerk−7” | |
EA017995B1 (ru) | Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами | |
US5776725A (en) | Recombinant production of glucagon receptors | |
JP2021527673A (ja) | キメラ抗原受容体細胞療法と併用するil−10剤の組成およびその使用方法 | |
Insug et al. | Role of SA–Lea and E-selectin in metastasis assessed with peptide antagonist | |
CN113045659A (zh) | 抗cd73人源化抗体 | |
JP2022548777A (ja) | マウスおよびヒト線維芽細胞活性化タンパク質(fap)と交差反応するイヌ線維芽細胞活性化タンパク質に対するモノクローナル抗体 | |
ZA200608696B (en) | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof | |
WO2023066389A1 (zh) | 靶向pd-1的双特异性抗体、及其制备和应用 | |
US20230366884A1 (en) | Biomarker methods and uses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |