ES2424643T3 - Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas - Google Patents
Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2424643T3 ES2424643T3 ES05728983T ES05728983T ES2424643T3 ES 2424643 T3 ES2424643 T3 ES 2424643T3 ES 05728983 T ES05728983 T ES 05728983T ES 05728983 T ES05728983 T ES 05728983T ES 2424643 T3 ES2424643 T3 ES 2424643T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cancer
- bouganin
- protein
- modified
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 264
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 246
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 title claims description 114
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 title claims description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 85
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 140
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 21
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 182
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 176
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 162
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 101
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 92
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 86
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 70
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 63
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 38
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 31
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 17
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 15
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 11
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 11
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 11
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 claims description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 10
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 206010027540 Microcytosis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 7
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims description 7
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 7
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 claims description 7
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 claims description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 239000004172 quinoline yellow Substances 0.000 claims description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 claims 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 228
- 241001316288 Bougainvillea spectabilis Species 0.000 description 110
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 41
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 41
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 35
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 26
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 21
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 101150034979 DRB3 gene Proteins 0.000 description 13
- 101100278514 Oryza sativa subsp. japonica DRB2 gene Proteins 0.000 description 13
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 12
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 101100117565 Oryza sativa subsp. japonica DRB4 gene Proteins 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 9
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 Cyclic amino acid Chemical class 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 6
- 101150082328 DRB5 gene Proteins 0.000 description 6
- 102220545976 Dihydropyrimidinase_Y70A_mutation Human genes 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100117569 Oryza sativa subsp. japonica DRB6 gene Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 6
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 6
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 6
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 6
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 5
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000002794 lymphocyte assay Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007828 protein synthesis assay Methods 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 3
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 2
- APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 4-[5-[3-(carboxymethoxy)phenyl]-3-(4,5-dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)tetrazol-3-ium-2-yl]benzenesulfonate Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=C(OCC(O)=O)C=CC=2)=NN1C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N leuprolide acetate Chemical compound CC(O)=O.CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940086322 navelbine Drugs 0.000 description 2
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N vinorelbine ditartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 2,8-diamino-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N=C(N)N2 WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS([O-])(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 0.000 description 1
- YUJSWFZLUCHGFO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-azidophenyl)aniline Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 YUJSWFZLUCHGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 5-(trifluoromethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound FC(F)(F)C1=CNC(=O)NC1=O LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2h-1,2,4-triazin-3-one Chemical compound NC=1C=NNC(=O)N=1 SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZWMZFQOHTWGQE-UHFFFAOYSA-N 6-azathymine Chemical compound CC1=NNC(=O)NC1=O XZWMZFQOHTWGQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSPYSWLZOPCOLO-UHFFFAOYSA-N 6-azauracil Chemical compound O=C1C=NNC(=O)N1 SSPYSWLZOPCOLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-2-methylhex-2-enamide Chemical compound NC(=O)C(C)=CCCCO YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-6,8-diamine Chemical compound C1=NC(N)=C2NC(N)=NC2=N1 PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100373139 Caenorhabditis elegans mig-14 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001495184 Chlamydia sp. Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710147220 Ent-copalyl diphosphate synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 1
- 101000738180 Euglena gracilis Chaperonin CPN60, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010016935 Follicular thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 101150008132 NDE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102100022501 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010061360 Type 1 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940064305 adrucil Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000004191 allura red AC Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 108700004675 bleomycetin Proteins 0.000 description 1
- QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N bleomycin A5 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCNCCCCN)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N 0.000 description 1
- 229960004395 bleomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000004126 brilliant black BN Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000002788 crimping Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000002003 electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 102000045551 human EPCAM Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940087857 lupron Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 229930000184 phytotoxin Natural products 0.000 description 1
- 229940037129 plain mineralocorticoids for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940063179 platinol Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002473 ribonucleic acid immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 208000030901 thyroid gland follicular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 229940100611 topical cream Drugs 0.000 description 1
- 229940100615 topical ointment Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N vinblastine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004982 vinblastine sulfate Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
- A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Una proteína bouganina modificada en donde dicha bouganina modificada tiene una propensión reducida paraactivar una respuesta inmunitaria en comparación con una bouganina no modificada, en donde dicha bouganinatiene una sustitución de aminoácidos de uno o más de X1, X2, X3, X4 o X5 en un epítopo de linfocitos T seleccionadodel grupos que consiste en: a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 8) b) LGVX4KLEFSIEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 9); y c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 10) en donde: X1 es T o A o Q; X2 es G o A; X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S; y X5 es Q o A.
Description
Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas
Campo de la invención
La invención se refiere a proteínas bouganina modificadas y a citotoxinas que contienen las proteínas modificadas útiles como agentes terapéuticos contra el cáncer. Específicamente, los epítopos de linfocitos T se retiran o modifican para reducir la inmunogenicidad de las toxinas bouganina.
Antecedentes de la invención
Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmunitaria no deseada contra la proteína terapéutica. Se ha demostrado que diversos anticuerpos monoclonales de ratón son terapias prometedoras en diversos entornos de enfermedades humanas pero en algunos casos han fallado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta de anticuerpos antimurinos (HAMA) [Schroff, R. W. y col (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. y col (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. Para anticuerpos monoclonales, se han desarrollado diversas técnicas en intentos de reducir la respuesta HAMA [documentos WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. Estas estrategias de ADN recombinante han reducido generalmente la información genética de ratón en la construcción de anticuerpo final mientras que aumenta la información genética humana en la construcción final. No obstante, los anticuerpos “humanizados” resultantes han inducido aún, en algunos casos, una respuesta inmunitaria en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P. R. y col (1999) Transplantation 68: 1417-1420].
La clave para la inducción de una respuesta inmunitaria es presencia dentro de la proteína de péptidos que pueden estimular la actividad de linfocitos T mediante la presentación de moléculas del MHC de clase II, denominadas “epítopos de linfocitos T”. Dichos epítopos de linfocitos T se definen normalmente como cualquier secuencia de restos de aminoácidos con la capacidad de unirse a moléculas del MHC de Clase II. Implícitamente, un “epítopo de linfocito T” significa un epítopo que cuando está unido a moléculas del MHC puede reconocerse por un receptor de linfocitos T (TCR), y que puede, al menos en principio, causar la activación de estos linfocitos T acoplándose a un TCR para promover una respuesta de linfocitos T.
Las moléculas del MHC de Clase II son un grupo de proteínas muy polimórficas que desempeñan una función principal en la selección y activación de linfocitos T auxiliares. El grupo antigénico leucocitario humano DR (HLA-DR) es el isotipo predominante de este grupo de proteínas; sin embargo, los isotipos HLA-DQ y HLA-DP realizan funciones similares. En a la población humana, los individuos portan de dos a cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos alelos DP. La estructura de diversas moléculas DR se ha resuelto y estas aparecen como un péptido de extremos abiertos que se une al surco con diversos bolsillos hidrófobos que acoplan restos hidrófobos (restos de bolsillo) del péptido [Brown y col (1993) Nature 364: 33; Stern y col (1994) Nature 368: 215]. El polimorfismo que identifica los diferentes alotipos de las moléculas de clase II contribuye a una amplia diversidad de diferentes superficies de unión para péptidos dentro del surco de unión a péptidos y el nivel de población garantiza la máxima flexibilidad con respecto a la capacidad para reconocer proteínas extrañas y provocar una respuesta inmunitaria frente a organismos patógenos.
Una respuesta inmunitaria contra una proteína terapéutica se realiza mediante la ruta de presentación del péptido del MHC de clase II. En este caso, proteínas exógenas se absorben y procesan para la presentación en asociación con las moléculas del MHC de clase II de tipo DR, DQ o DP. Las moléculas del MHC de Clase II se expresan por células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, tales como macrófagos y células dendríticas entre otras. El acoplamiento de un complejo peptídico MHC de clase II por un receptor de linfocito T afín sobre la superficie del linfocito T, junto con la unión cruzada de determinados otros correceptores tales como la molécula CD4, puede inducir un estado activado dentro del linfocito T. La activación conduce a la liberación de citocinas activando adicionalmente otros linfocitos tales como linfocitos B para producir anticuerpos o linfocitos citolíticos T activadores como una respuesta inmunitaria celular completa.
La identificación del epítopo de linfocitos T es la primera etapa para la eliminación epitópica como se reconoce en los documentos WO98/52976; WO00/34317; WO02/069232; WO02/079232; y WO02/079415. En estas enseñanzas, se retiran epítopos de linfocitos T predichos por el uso de sustitución de aminoácidos sensata dentro de la proteína de interés. Junto con técnicas informáticas, existen procedimientos in vitro para medir la capacidad de péptidos sintéticos de unirse a moléculas del MHC de clase II. Un procedimiento ejemplar utiliza líneas de linfocitos B de alotipo MHC definido como una fuente de superficie de unión de MHC de clase II y puede aplicarse a identificación de ligandos de MHC de clase II [Marshall K. W. y col. (1994) J. Immunol. 152: 4946-4956; O’Sullivan y col (1990) J. Immunol.
145: 1799-1808; Robadey C. y col (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. Sin embargo, dichas técnicas no están adaptadas para la exploración de múltiples epítopos posibles con respecto a una amplia diversidad de alotipos de MHC, ni pueden confirmar la capacidad de un péptido de unión para actuar como un epítopo de linfocitos T.
Las técnicas para aprovechar complejos solubles de moléculas MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos también han comenzado a usarse [Kern, F. y col (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. y col (2001) TRENDS in lmmunol. 22: 583-588]. Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones
de linfocitos T a partir de muestras de sangre periférica de sujetos humanos o en animales experimentales que pueden unir complejos peptídicos MHC particulares y no están adaptados para la exploración de múltiples epítopos posibles con respecto a una amplia diversidad de alotipos de MHC.
Los ensayos biológicos de activación de linfocitos T ofrecen una opción práctica para proporcionar una lectura de la capacidad de una secuencia peptídica/proteica de ensayo para suscitar una respuesta inmunitaria. Como ejemplos de este tipo de estrategias se incluyen el trabajo de Petra y col. usando ensayos de proliferación de linfocitos T con respecto a la proteína bacteriana estafiloquinasa, seguido de mapeo epitópico usando péptidos sintéticos para estimular líneas de linfocitos T [Petra, A. M. y col (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. De manera similar, ensayos de proliferación de linfocitos T utilizando péptidos sintéticos de la proteína de la toxina del tétano han dado como resultado la definición de regiones epitópicas inmunodominantes de la toxina [Reece J. C. y col (1993) J. Immunol. 151: 61756184]. El documento WO99/53038 desvela una estrategia mediante la cual epítopos de linfocitos T en una proteína de ensayo puede determinarse usando subconjuntos aislados de células inmunitarias humanas, promoviendo su diferenciación in vitro y cultivo de las células en presencia de péptidos sintéticos de interés y mediciones de cualquier proliferación inducida en los linfocitos T cultivados. La misma técnica también la describen Stickler y col. [Stickler, M. M. y col (2000) J. Immunotherapy 23: 654-660], en la que en ambos casos el procedimiento se aplica a la detección de epítopos de linfocitos T dentro de la subtilisina bacteriana. Dicha técnica requiere aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento celular y de cultivo celular con complementos de citocinas múltiples para obtener los subconjuntos celulares inmunitarios deseados (células dendríticas, linfocitos T CD4+ y o CD8+) y no conduce a una rápida selección de alto rendimiento usando muestras de donantes múltiples.
Recientemente también se ha avanzado una estrategia de combinación que usa ensayos de proliferación de linfocitos T basados en población y en simulación por ordenador de la unión de MHC peptídica en el diseño de proteínas empobrecidas para epítopo [documento WO 03/104803].
Como se ha expuesto anteriormente y como una consecuencia de los mismos, sería deseable identificar y retirar o al menos reducir epítopos de células de linfocitos T de un péptido, polipéptido o proteína principal terapéuticamente valioso pero originalmente inmunogénico.
Sumario de la invención
La invención se diseña para superar la realidad práctica de que las proteínas solubles introducidas con intención terapéutica en seres humanos pueden desencadenar una respuesta inmunitaria dando como resultado el desarrollo de anticuerpos huésped que se unen a la proteína soluble. La presente invención intenta abordar esto proporcionando proteínas bouganina con una propensión reducida para suscitar una respuesta inmunitaria. De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, los autores de la invención han identificado las regiones de la molécula bouganina que comprende los epítopos de linfocitos T críticos que conducen las respuestas inmunitarias a esta proteína.
La presente invención se refiere a una proteína bouganina modificada en la que la bouganina modificada tiene una propensión reducida para suscitar una respuesta inmunitaria en la que dicha bouganina tiene una sustitución de aminoácidos de uno o más de X1, X2, X3, X4 o X5 en un epítopo de linfocito T seleccionado del grupo que consiste en:
a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 8)
b) LGVX4KLEFSJEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 9); y
c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 10) en la que:
X1 es T o A o Q;
X2 es G o A;
X3 es Q o G;
X4 es N o D o T o A o R o Q o E o Go Ho K o S; y
X5 es Q o A.
En una realización preferida, la bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar linfocitos T y la bouganina modificada está modificada en uno o más restos de aminoácidos en un epítopo de linfocito T. Los epítopos de linfocitos T en los que se introducen las sustituciones de aminoácidos se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en:
a) AKVDRKDLELGVYKL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 2),
b) LGVYKLEFSIEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 3); y
c) NGOEIAKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 4).
La presente invención también proporciona una citotoxina que comprende un resto diana unido a una proteína bouganina modificada de la invención. En una realización, el resto diana es un ligando que se une a una célula cancerosa. En una realización adicional, el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a una célula cancerosa. En una realización particular, el anticuerpo reconoce Ep-CAM o un antígeno asociado a tumor. En una realización más particular, la presente invención proporciona una citotoxina que comprende VB6-845 o VB6-01
1.
En otro aspecto, la invención proporciona un uso de una citotoxina de la invención en la fabricación de un medicamento para inhibir o destruir células cancerosas. En otras palabras, la invención proporciona una citotoxina de la invención para su uso en la inhibición o destrucción de células cancerosas.
La presente invención también se refiere a un uso de una citotoxina de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otras palabras, la invención proporciona una citotoxina de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.
Adicionalmente, se proporciona un proceso para preparar una composición farmacéutica para tratar a un animal con cáncer que comprende las etapas de identificar epítopos de linfocitos T de la bouganina, modificar uno o más restos de aminoácidos en un epítopo de linfocito T para preparar una bouganina modificada de acuerdo con la presente invención que tiene una propensión reducida para activar linfocitos T; preparar una citotoxina que tenga un ligando de unión a cáncer unido a una bouganina modificada, y suspender la citotoxina en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un animal con cáncer que comprende la citotoxina de la invención y un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las citotoxinas, composiciones y usos de la presente invención pueden usarse para tratar diversas formas de cáncer tal como cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer microcítico y no microcítico pulmonar, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.
La invención también proporciona péptidos epitópicos de linfocitos T modificados de la invención como se define por las reivindicaciones 25 a 27.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indiquen realizaciones preferidas de la invención se proporcionan únicamente a modo de ilustración.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describirá ahora en relación a los dibujos en los que:
La Figura 1 muestra resultados de ensayos de actividad de las proteínas bouganina modificadas empobrecidas de epítopo de linfocitos T Bou156 (panel A) y Bou157 (panel B). Bou156 comprende las sustituciones V123A, D127A, Y133N e I152A. Bou157 comprende las sustituciones V123A, D127A, Y133Q e I152A. Ambos conjuntos de ensayo se realizaron usando la proteína de tipo silvestre y una bouganina modificada inactivada (Y70A) como controles. La actividad se expresó como % de actividad luciferasa medida frente a la concentración de la proteína bouganina en el ensayo. La Figura 2 muestra los resultados de ensayo de proliferación de linfocitos T para tres péptidos sintéticos y 2 muestras donantes de PBMC diferentes. Los péptidos denominados Del-41, Del-44 y Del-50 se sometieron a ensayo a una concentración final de 1 μM (panel A) y una concentración final de 5 μM (panel B). Estos péptidos derivan de las regiones inmunogénicas de la molécula de bouganina y contienen sustituciones diseñadas para eliminar su inmunogenicidad. La Figura 3 ilustra VB6-845, una citotoxina bouganina modificada que tiene un Fab anti-Ep-CAM, en el que la de-bouganina (Bou156) está unida al extremo C del dominio CH mediante un engarce de furina. La Figura 3A ilustra la unidad dicistrónica que codifica las secuencias pro, la Figura 3B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 15) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 16) de las secuencias pro y la Figura 3C ilustra la proteína VB6-845 ensamblada sin las secuencias peIB. La Figura 4 ilustra el mapa del vector de expresión pING3302. Los insertos de los ejemplos se ligaron en el vector 3302 usando los sitios de restricción EcoRI y Xhol. La Figura 5 ilustra la construcción de control Fab anti-Ep-CAM, sin la toxina vegetal, de-bouganina (VB5-845). La Figura 5A ilustra la unida dicistrónica que codifica las secuencias pro, la Figura 5B ilustra la secuencia que codifica el ácido nucleico (SEC ID Nº: 17) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 18) de las secuencias pro y la Figura 5C ilustra la proteína VB5-845 ensamblada sin las secuencias peIB. La Figura 6 ilustra la construcción de-bouganina Fab anti-Ep-CAM VB6-845-CL-de-bouganina, en el que el Bou156 está unido en el extremo C del dominio CL. La Figura 6A ilustra las unidades dicistrónicas que codifican las secuencias pro, la Figura 6B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 19) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 20) de las secuencias pro y la Figura 6C ilustra la proteína VB6-845-CL-debouganina ensamblada sin las secuencias pelB. La Figura 7 ilustra la construcción Fab anti Ep-CAM, de-bouganina, VB6-845-NVH-de-bouganina, en la que Bou156 está unido al extremo N del dominio VH. La Figura 7A ilustra las unidades dicistrónicas que codifican las secuencias pro, la Figura 7B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 21) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 22) de las secuencias pro y la Figura 7C ilustra la proteína VB6-845-NVH-de-bouganina ensamblada sin las secuencias pelB.
La Figura 8 ilustra la construcción Fab anti Ep-CAM, de-bouganina, VB6-845-NVL-de-bouganina, en la que Bou156 está unido al extremo N del dominio VL. La Figura 8A ilustra las unidades dicistrónicas que codifican las secuencias pro, la Figura 8B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 23) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 24) de las secuencias pro y la Figura 8C ilustra la proteína VB6-845-NVL-de-bouganina ensamblada sin las secuencias pelB. La Figura 9 es una Transferencia de Western que ilustra la expresión de VB6-845 (construcción de la Figura 3) y VB6-845-CL-de-bouganina (Bou156) (construcción de la Figura 6) en el sobrenadante de células E104 inducidas a escala de laboratorio. La Figura 10 ilustra los resultados de los estudios de reactividad de citometría de flujo. La Figura 10A ilustra la reactividad de VB6-845 (construcción de la Figura 3) y VB6-845-CL-de-bouganina (construcción de la Figura 6) en líneas celulares Ep-CAM-positivas CAL 27 y OVCAR-3 y la línea celular Ep-CAM-negativa A-375, mientras que la Figura 10B, ilustra los resultados de los mismos ensayos realizados con VB6-845 (construcción de la Figura 3) y VB6-845-gelonina (construcción de la Figura 14C) y control (PBS). La Figura 11 es un gráfico que ilustra los resultados del ensayo de competencia-V6-845 y Proxinium™ en células NIH:OVCAR-3 y como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 12 es un gráfico que ilustra los resultados del ensayo acelular del Ejemplo 7. La Figura 13 ilustra los resultados del ensayo de citotoxicidad MTS del Ejemplo 8 comparando la citotoxicidad de VB6-845 (construcción de la Figura 3), VB6-845-CL-de-bouganina (construcción de la Figura 6) y debouganina (Bou156) en células CAL 27 (Figura 13A) y NIH:OVCAR3 (Figura 13B). Las Figuras 14A y B ilustran los resultados del ensayo de citotoxicidad MTS del Ejemplo 8 que compara la citotoxicidad de VB6-845 (construcción de la Figura 3), VB6-845-gelonina (construcción de la Figura 14C) y gelonina en células CAL 27 (Figura 14A) y NIH:OVCAR3 (Figura 14B). La Figura 14C ilustra la secuencia que codifica el ácido nucleico (SEC ID Nº: 25) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 26) de la construcción VB6-845-gelonina. La Figura 15 ilustra la secuencia que codifica el ácido nucleico (SEC ID Nº: 27) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 28) de las secuencias pro de VB6-011. La Figura 16 ilustra los resultados del ensayo de citotoxicidad MTS del Ejemplo 9 que muestra la citotoxicidad de VB6-011 en células MB-435S.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la invención han identificado epítopos de linfocitos T en bouganina, y han diseñado y realizado proteínas bouganina modificadas que tienen una propensión reducida para activar linfocitos T humanos en comparación con la proteína bouganina no modificada.
(A) Proteínas bouganina modificadas
La presente invención se refiere a una proteína bouganina modificada en la que la bouganina se ha modificado para tener una propensión reducida a suscitar una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta a linfocitos T, en comparación con una proteína bouganina no modificada. La proteína bouganina madura es un polipéptido sencillo de 250 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 26.200 Da [Den Hartog y col (2002) Eur. J. Biochem. 269: 1772-1779; Patente de Estados Unidos Nº 6.680.296]. La bouganina es una proteína inactivadora de ribosomas de tipo 1 (RIP) aislada originalmente de la planta Bougainvillea spectabilis Willd [Bolognesi y col (1997) Planta 203: 422-429]. Las RIP de plantas son ARN N-glucosidasas que despurinan los ARN ribosómicos principales de las células, por lo tanto lesionando los ribosomas y conduciendo a un cese de la síntesis de proteínas y muerte celular.
La secuencia de aminoácidos de la proteína bouganina madura (representada en un código de una letra) es:
La expresión “proteína bouganina modificada” significa una proteína bouganina que no se ha modificado para reducir su propensión a suscitar una respuesta inmunitaria. La secuencia de la bouganina natural o una no modificada se muestra en SEC ID Nº: 1. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que la expresión “bouganina no modificada” también incluye modificaciones de la SEC ID Nº: 1 siempre que dichas modificaciones no reduzcan la propensión para suscitar una respuesta inmunitaria. Como ejemplos de modificaciones que pueden realizarse con la
SEC ID Nº: 1 se incluyen fragmentos peptídicos y sustituciones de aminoácidos conservativas que no reducen la inmunogenicidad de la proteína.
La expresión “proteína bouganina modificada” significa una proteína bouganina que se ha modificado en comparación con la proteína bouganina no modificada (descrita anteriormente) en la que dicha modificación reduce la propensión de la bouganina a suscitar una respuesta inmunitaria. La proteína bouganina modificada también puede denominarse bouganina desinmunizada. La “proteína bouganina modificada” puede ser una secuencia de longitud completa modificada o un fragmento modificado de la proteína bouganina no modificada. La “proteína bouganina modificada” también puede contener otros cambios en comparación con la secuencia de bouganina natural que no modifica la inmunogenicidad del péptido. La proteína bouganina modificada tendrá preferentemente la misma actividad biológica que la bouganina no modificada.
La expresión “propensión reducida para suscitar una respuesta inmunitaria” como se usa en el presente documento significa que la proteína bouganina modificada es menos inmunogénica que la bouganina no modificada.
La expresión “respuesta inmunitaria” incluye respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales. En una realización preferida, la bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar linfocitos T.
La expresión “propensión reducida para activar linfocitos T humanos” como se usa en el presente documento significa que la proteína bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos en comparación con la proteína bouganina no modificada. Un experto en la técnica puede ensayar si una proteína modificada tiene una propensión reducida o no para activar linfocitos T usando ensayos conocidos en la técnica que incluyen evaluar el índice de estimulación de la proteína.
La expresión “índice de estimulación” como se usa en el presente documento se refiere a medir la capacidad de la proteína bouganina modificada o no modificada para activar linfocitos T humanos. Por ejemplo, la proteína bouganina modificada o no modificada, o péptidos de la misma, pueden ensayarse con respecto a su capacidad para provocar una respuesta proliferativa en linfocitos T humanos cultivados in vitro. Cuando este tipo de estrategias se realiza usando linfocitos T humanos sin tratar extraídos de donantes sanos, los autores de la invención han establecido que en la operación de dicho ensayo, un índice de estimulación igual a o mayor de 2,0 es una medición útil de proliferación inducida. El índice de estimulación deriva convencionalmente por división de la puntuación de proliferación (por ejemplo recuentos por minuto de radiactividad si se usa incorporación de 3H-timidina) medido en el péptido de ensayo mediante la puntuación medida en células no puestas en contacto con un péptido de ensayo.
En una realización, la invención proporciona una proteína bouganina modificada en la que la proteína bouganina modificada tiene una actividad biológica y tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos en comparación con una proteína bouganina no modificada.
En otra realización, la invención proporciona una proteína bouganina modificada, en el que la proteína bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos en comparación con una proteína bouganina no modificada y tiene actividad biológica que es menor que la proteína bouganina no modificada. En otra realización adicional, la invención proporciona una proteína bouganina modificada en la que la proteína bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos y no actividad biológica. Dichas proteínas modificadas pueden, por ejemplo, usarse como controles, en ensayos o para hacer sujetos tolerantes.
La expresión “actividad biológica” como se usa en el presente documento es la capacidad de la proteína bouganina modificada o no modificada para inhibir la síntesis de proteína en ribosomas, que puede evaluarse de diversas maneras. Debe observarse que una proteína bouganina modificada tendrá aún una actividad biológica incluso si dicha actividad disminuye en comparación con la de la proteína no modificada, sin embargo será necesario tener algún nivel de actividad detectable. Por ejemplo, la actividad biológica de la proteína bouganina modificada o no modificada puede evaluarse identificando su actividad N-glucosidasa, y en particular con suficiente actividad para proporcionar una inhibición significativa de la traducción de la proteína. Un ensayo adecuado de este tipo implica ensayar la actividad de las proteínas bouganina variantes en comparación con la bouganina no modificada en un ensayo de síntesis de proteína acelular. Una mezcla de transcripción/traducción acoplada que contiene metionina, un ADN que codifica la proteína indicadora luciferasa y diluciones en serie de la proteína bouganina no modificada y modificada se coincuban. Los niveles de luciferasa traducida se detectan fácilmente usando un contador luminiscente después de la adición de un reactivo de sustrato. La luminiscencia medida es inversamente proporcional a la actividad N-glucosidasa de la bouganina presente en la reacción. Es habitual proporcionar un control negativo tal como una proteína bouganina inactiva, por ejemplo que contenga una sustitución Y70A.
En una realización preferida, el péptido bouganina modificado se modifica en uno o más epítopos de linfocitos T en la secuencia de la proteína bouganina.
El término “epítopo de linfocitos T” significa una secuencia de aminoácidos que puede unirse al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, que puede estimular linfocitos T y/o también puede unirse (sin necesariamente activación medible) a linfocitos T en el complejo con MHC de clase II.
En un aspecto, un procedimiento general que puede usarse en la presente invención que conduce a las proteínas bouganinas modificadas que comprenden epítopos de linfocitos T modificados comprende las siguientes etapas:
- (i)
- determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína o parte de la misma;
- (ii)
- identificar uno o más posibles epítopos de linfocitos T dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante procedimientos tales como determinación de la unión de los péptidos a moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos;
(iii) diseñar variantes de secuencia nueva con uno o más aminoácidos en los posibles epítopos de linfocitos T identificados modificados de tal manera que reduzcan sustancialmente o eliminen la actividad del epítopo de linfocito T como se determina mediante la unión de los péptidos a moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos. Dichas variantes de secuencia se crean de tal manera que se impide la creación de nuevo potencial de epítopos de linfocitos T mediante variaciones de secuencia a menos que dichos nuevos epítopos de linfocitos T potenciales se modifiquen a su vez de tal manera que se reduzca sustancialmente o se elimine la actividad del epítopo de linfocito T;
- (iv)
- construir dichas variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinante y ensayar dichas variantes para identificar una o más variantes con propiedades deseables de acuerdo con técnicas recombinantes bien conocidas; y
- (v)
- opcionalmente repetir las etapas (ii) a (iv).
En un ejemplo, la etapa (iii) se realiza por sustitución, adición o deleción de restos de aminoácidos en cualquiera de los epítopos de linfocitos T en la proteína bouganina no modificada. En otro ejemplo, el procedimiento para elaborar la proteína bouganina modificada se realiza con referencia a la secuencia de proteína homóloga y/o modelación in silico.
La identificación de posibles epítopos de linfocitos T de acuerdo con la etapa (ii) puede realizarse de acuerdo con los procedimientos descritos previamente en la técnica. Se desvelan procedimientos adecuados en los documentos WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; WO02/069232 y pueden usarse para identificar la propensión de unión de los péptidos derivados de bouganina a una molécula MHC de clase II. Para identificar péptidos biológicamente relevantes, los autores de la invención han desarrollado una estrategia que aprovecha los ensayos de proliferación de linfocitos T humanos ex vivo. Esta estrategia se ha demostrado que es un procedimiento particularmente eficaz y se ha implicado en el ensayo de las secuencias peptídicas derivadas de bouganina solapantes en un esquema para explorar y ensayar toda la secuencia de bouganina. Los péptidos sintéticos se ensayan con respecto a su capacidad para suscitar una respuesta proliferativa en linfocitos T humanos cultivados in vitro. Cuando este tipo de estrategia se realiza usando linfocitos T humanos sin tratar extraídos de donantes sanos, los autores de la invención han establecido que en la operación de tal ensayo, un índice de estimulación igual a o mayor de 2,0 es una medida útil de proliferación inducida. El índice de estimulación deriva convencionalmente por división de la puntuación de proliferación (por ejemplo recuentos por minutos de radiactividad si se usa incorporación de 3H-timidina) medido en el péptido de ensayo mediante la puntuación medida en células no puestas en contacto con un péptido de ensayo.
Por consiguiente, en los estudios de la presente invención, se usan 89 péptidos sintéticos de 15 oligómeros, (como se indica en la Tabla 1) en la proliferación de linfocitos T en ensayos con PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de donantes sin tratar (es decir sin sensibilización conocida a la bouganina). Se seleccionaron 20 muestras de PBMC de donantes para conseguir una cobertura óptima en alotipos del MHC de clase II. Las PBMC se estimularon con péptidos individuales en cultivos por triplicado durante 7 días antes de que se evaluase la proliferación por incorporación de 3H-timidina. Todos los péptidos se diluyeron a dos concentraciones diferentes: 1 μM y 5 μM. Los índices de estimulación (IE) se calcularon como la cantidad de 3H incorporado a las células, dividido entre la cantidad de 3H incorporado en controles simulados estimulados.
Este procedimiento ha identificado las regiones más inmunogénicas de la molécula de bouganina en seres humanos. Por consiguiente, en una realización específica, la proteína bouganina modificada está modificada en uno o más restos de aminoácidos en un epítopo de linfocitos T del grupo que consiste en:
a) AKVDRKDLELGVYKL, denominada en el presente documento región epitópica R1 (SEC ID Nº: 2);
b) LGVYKLEFSIEAIHG, denominada en el presente documento región epitópica R2 (SEC ID Nº: 3); y
c) NGQEIAKFFLIVIQM, denominada en el presente documento región epitópica R3 (SEC ID Nº: 4).
Estos epítopos de linfocitos T se han identificado basándose en el IE dado > de 2 en dos o más muestras PBMC donantes. Las secuencias peptídicas desveladas anteriormente representan la información crítica necesaria para la construcción de proteínas bouganina modificadas en las que uno o más de estos epítopos está comprometido.
En una realización de la invención, la proteína bouganina modificada de la invención tiene al menos un epítopo de linfocitos T eliminado. En otra realización, la proteína bouganina modificada de la invención tiene uno, dos o tres epítopos de linfocitos T eliminados. La invención también contempla una proteína bouganina modificada en la que se modifican de 1 a 9 restos de aminoácidos, preferentemente en el epítopo de linfocitos T. En otra realización, se modifican de 1 a 5 restos de aminoácidos. El término “modificado” como se usa en el presente documento significa que los restos de aminoácidos se han modificado por sustitución, adición o deleción, preferentemente por sustitución, pero la proteína bouganina tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos. En otra realización la proteína modificada tiene actividad biológica. Más preferentemente la proteína bouganina modificada
de la invención se modifica por sustitución en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos especificados en las secuencias (a), (b) o (c) anteriores.
Una realización de la presente invención comprende proteínas bouganina para las cuales los ligandos de MHC de clase II identificados dentro de cualquiera de los epítopos R1 – R3 se modifican de tal manera que se elimina la unión o de otra manera se reduce la cantidad de alotipos MHC a los que puede unirse el péptido. Los aminoácidos en las regiones R1 a R3 para eliminar la unión o de otra manera reducir el número de alotipos de MHC a los que puede unirse el péptido pueden modificarse por sustitución, adición o deleción.
Para la eliminación de epítopos de linfocitos T, se realizan sustituciones de aminoácidos en puntos apropiados dentro de la secuencia peptídica predicha para conseguir una reducción o eliminación sustancial de la actividad del epítopo de linfocitos T. En la práctica, un punto apropiado iguala en una realización a una unión de un resto de aminoácido en uno de los bolsillos proporcionados en el surco de unión a MHC de clase II.
En una realización, la unión en el primer bolsillo de la hendidura en la posición denominada P1 o anclaje P1 del péptido se modifica. La calidad de la interacción de unión entre el resto de anclaje P1 del péptido y el primer bolsillo del surco de unión a MHC de clase II se reconoce como un determinante principal de afinidad de unión global para el péptido completo. Una sustitución apropiada en esta posición del péptido será para un resto menos fácilmente acomodado en el bolsillo, por ejemplo, sustitución en un resto más hidrófilo. Los restos de aminoácidos en el péptido en las posiciones que se consideran idénticas a unirse con otras regiones del bolsillo dentro de la hendidura de unión a MHC también se consideran y se encuentran bajo el ámbito de la presente invención.
Se entiende que las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos sencillos dentro de un posible epítopo de linfocitos T son una vía preferida mediante la cual el epítopo puede eliminarse. Las combinaciones de modificaciones (es decir, sustituciones, deleciones y adiciones) dentro de un solo epítopo puede contemplarse y por ejemplo pueden ser particularmente apropiadas cuando epítopos individualmente definidos están en solapamiento entre sí como es el caso presente en las que las regiones R1 y R2 epitópicas solapan en 5 restos. Además, modificaciones de aminoácidos sencillos dentro de un epítopo proporcionado o en combinación con un solo epítopo pueden realizarse en las posiciones que se considera que no son idénticas con los “restos del bolsillo” con respecto al surco de unión de MHC de clase II, pero en cualquier punto con la secuencia peptídica. Pueden realizarse modificaciones con referencia a una estructura homóloga o procedimiento estructural producido usando técnicas in silico conocidas en este campo y pueden basarse en rasgos estructurales conocidos de la molécula de acuerdo con la presente invención. Todas dichas modificaciones pueden encontrarse dentro del ámbito de la presente invención.
Las regiones R1 y R3 epitópicas de la bouganina se analizaron con respecto a la indicación de los ligandos de MHC de clase II incluidas dentro de sus respectivas secuencias. Para este análisis se usó una herramienta informática que aprovechaba los esquemas indicados en los documentos WO 98/59244 y WO 02/069232. El programa informático estimula el proceso de la presentación de antígenos a nivel de la interacción de unión del péptido de MHC de clase II para proporcionar una puntuación de unión para cualquier secuencia peptídica proporcionada. Dicha puntuación se determina para muchos de los alotipos predominantes de MHC de clase II existentes en la población. Dado que este esquema puede ensayar cualquier secuencia peptídica, las consecuencias de las sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un péptido para interaccionar con un surco de unión a MHC de clase II pueden predecirse. Por consiguiente, pueden diseñarse nuevas composiciones de secuencia que contengan números de péptidos reducidos capaces de interaccionar con MHC de clase II y por lo tanto actuar como epítopos de linfocitos T inmunogénicos.
Bajo este esquema en una realización de la invención sustituciones dentro de la región R1 epitópica comprenden cambios en las posiciones V123, D127 y/o E129. De manera similar para la región R2 epitópica, en una realización la sustitución es en una posición Y133. Este resto se encuentra dentro de la región de solapamiento entre R1 y R2 pero la sustitución en Y133 es suficiente para eliminar el ligando de MHC de clase II relacionado con R2 y no es suficiente para eliminar por sí mismo los ligandos de MHC de clase II relacionados con R1. Para la región R3 epitópica, en una realización de la invención las sustituciones son los restos E151 y/o 1152.
En todos los casos las sustituciones son con respecto a uno o más restos de aminoácidos alternativos. El análisis de R1 con el programa informático de estimulación de MHC II indicó que los restos de aminoácidos 123, 127, 129 y 131 eran restos clave en este epítopo para la unión a moléculas de MHC II. El resto 123 es un sitio preferido para la mutación de la región R1 porque está en la superficie de la molécula, lejos del sitio activo y es variable en el alineamiento de secuencia RIP. Sin embargo, no todas las sustituciones produjeron una molécula activa, de ahí la necesidad de validar mutaciones en el ensayo de bioactividad. Por tanto, por ejemplo, dentro de R1, las sustituciones V123T, V123A y V123Q son ejemplos de sustituciones alternativas preferidas. Se descubrió que el resto 131 está absolutamente conservado en RIP y por lo tanto probablemente no es adecuado para la mutación. Los restos 127 y 129 no están muy conservados pero se encontró que solamente un número de restos limitados tenían un impacto sobre la unión de MHC II. Los conjuntos de sustituciones: D127G, D127A, E129Q y E129G también son sustituciones preferidas. Para R2, se observó que el resto 133 era posiblemente un candidato para anular la unión a MHC II y su localización de superficie aparente (según se determina por modelado) combinado con el hecho de que no está muy conservado a través de RIP hace que sea un buen candidato para la mutación. Se encontró que las sustituciones alternativas preferidas eran Y133N, Y133T, Y133A, Y133R, Y133D, Y133E, Y133Q, Y133G, Y133K, Y133H y Y133S. Para R3, los
restos de aminoácidos 152, 155 y 158 se identificaron como restos clave para la unión a MHC II. Sin embargo, los restos 155 y 158 son parte de un tramo hidrófobo altamente conservado lo que sugiere que su mutación podría no dar moléculas bioactivas. Se encontró que los restos mal conservados eran un candidato más probable. Para R3, los conjuntos de sustituciones: I152Q e I152A también eran sustituciones preferidas.
5 Por consiguiente, la invención proporciona una proteína bouganina modificada en la que la bouganina se modifica en una o más de X1, X2, X3, X4 o X5 de la siguiente manera:
a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región R1 epitópica, SEC ID Nº: 5);
b) LGVX4KLEFSIEAIHG (región R2 epitópica, SEC ID Nº: 6); y
c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región R3 epitópica, SEC ID Nº: 7)
10 en la que X1 a X5 pueden ser cualquier aminoácido.
En una realización específica X1 es T o A o Q; X2 es G o A; X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S; y X5 es Q o A (región R1 epitópica, SEC ID Nº: 8; región R2 epitópica, SEC ID Nº: 9; región R3 epitópica, SEC ID Nº: 10).
Considerado en su conjunto puede recopilarse un conjunto de sustituciones más preferido basándose en estudio de
15 mapeo epitópico inmunogénico usando ensayos de linfocitos T ex vivo, simulaciones de unión al péptido de MHC in silico y consideraciones estructurales a partir de análisis de homología de secuencia. Finalmente, si se prefiere una proteína bioactiva, puede realizarse entonces un ensayo de actividad in vitro en la proteína modificada que puede comprender una o más mutaciones múltiples.
Por consiguiente en otra realización la invención proporciona un péptido de bouganina modificado que comprende la 20 secuencia de aminoácidos:
en la que X1 a X5 pueden ser cualquier aminoácido (SEC ID Nº: 11). En una realización preferida X1 es T o A o Q; X2 es G o A; X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S; y X5 es Qo A (SEC ID Nº: 12). 25 En una realización específica, la proteína bouganina modificada comprende la secuencia de aminoácidos:
En otra realización adicional, la proteína bouganina modificada comprende la secuencia de aminoácidos:
Los restos subrayados son restos sustituidos diferentes de la proteína bouganina modificada.
Como será obvio para el experto en la materia, puede llegarse a conjuntos alternativos de modificaciones en los que se consigue el objetivo de eliminar epítopos no deseados. Sin embargo, las secuencias resultantes permanecerían ampliamente homólogas con las proteínas específicas desveladas en el presente documento y por lo tanto se encontrarían dentro del ámbito de la presente invención. Las equivalencias químicas obvias con respecto a las secuencias desveladas por la presente invención también se contempla que se encuentran dentro del ámbito de la presente invención. Dichos equivalentes incluyen proteínas que realizan sustancialmente la misma función sustancialmente de la misma manera.
En otra realización la proteína bouganina modificada de la invención tiene 1, 2, 3, 4, 5 o más modificaciones de aminoácidos en los epítopos de linfocitos T de la proteína.
En una realización adicional, la proteína bouganina modificada de la invención cuando se somete a ensayo en un ensayo con linfocitos T provoca un índice de estimulación reducido en comparación con la proteína bouganina no modificada.
En una realización adicional de la invención, los epítopos de linfocitos T de la proteína bouganina se mapean usando un ensayo de linfocitos T y después se modifican de tal manera que basándose en el reensayo, en el ensayo de linfocitos T la proteína bouganina modificada suscita un índice de estimulación menor que el de la proteína bouganina no modificado, preferentemente el índice de estimulación es menor de 2,0.
Será evidente para un experto en la técnica que si la proteína bouganina modificada tiene actividad biológica sustancialmente reducida o no tiene, puede ser necesaria una modificación adicional por sustitución, adición o deleción de restos de aminoácidos para reestablecer la actividad biológica de la proteína bouganina modificada. Sin embargo, dichas proteínas bouganinas modificadas que se han reducido sustancialmente o no tienen actividad biológica aún se incluyen dentro del ámbito de la invención y tienen utilidad como controles en ensayos o para la tolerización.
En una realización, la bouganina modificada está mutada en el resto tirosina en la posición 70 para producir una bouganina inactiva. En una realización específica, la tirosina en la posición 70 se sustituye con alanina. En una realización preferida, la bouganina modificada tiene la secuencia:
Bajo el esquema de la presente invención, los epítopos están comprometidos por mutación para dar como resultado secuencias que ya no pueden actuar como epítopos de linfocitos T. Es posible usar procedimientos de ADN recombinante para conseguir mutagénesis dirigida de las secuencias diana y muchas de estas técnicas se encuentran disponibles y son bien conocidas en la técnica. En la práctica, se producirán diversas proteínas bouganina modificadas y se ensayarán para las características funcionales inmunitarias deseadas. Es
particularmente importante cuando se realizan modificaciones de la secuencia de proteína que los cambios contemplados no introduzcan nuevos epítopos inmunogénicos. Este acontecimiento se impide en la práctica reensayando la secuencia contempladas con respecto a la presencia de epítopos y/o de ligandos de MHC de clase II mediante cualquier medio adecuado.
Las proteínas bouganina modificadas de la invención también pueden contener o pueden usarse para obtener o diseñar “peptidomiméticos”. Los “peptidomiméticos” son estructuras que sirven como sustitutos para péptidos en interacciones entre moléculas (Véase Morgan y col (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: 243-252 para una revisión). Los peptidomiméticos incluyen estructuras sintéticas que pueden o no contener enlaces de aminoácidos y/o peptídicos pero conservan las características estructurales y funcionales de la proteína de la invención incluyendo la actividad biológica y una propensión reducida para activar linfocitos T humanos. Los peptidomiméticos también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simon y col (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89: 9367).
Los peptidomiméticos pueden diseñarse basándose en información obtenida por reemplazo sistemático de aminoácidos L por aminoácidos D, el reemplazo de cadenas laterales con grupos que tienen diferentes propiedades electrónicas y por reemplazo sistemático de enlaces peptídicos con reemplazos de enlace amida. Las limitaciones con formaciones locales también pueden incluirse para determinar requisitos conformacionales para la actividad de un peptidomimético candidato. Los miméticos pueden incluir enlaces amida isostéricos, o aminoácidos D para estabilizar o promover conformaciones de giro inverso y ayudar a estabilizar la molécula. Pueden usarse análogos de aminoácidos cíclicos para limitar restos de aminoácidos a estados particulares conformacionales. Los miméticos también pueden incluir miméticos de las estructuras secundarias de las proteínas de la invención. Estas estructuras pueden modelar la orientación tridimensional de restos de aminoácidos en las conformaciones secundarias conocidas de las proteínas. También pueden usarse peptoides que son oligómeros de aminoácidos N-sustituidos y pueden usarse como motivos para la generación de bibliotecas químicamente diversas de nuevas moléculas.
Las moléculas de la presente invención pueden prepararse en cualquiera de las diversas formas pero más preferentemente se realizan aprovechando los procedimientos recombinantes rutinarios. Es un procedimiento relativamente fácil el uso de secuencias de proteínas e información proporcionada en el presente documento para deducir un polinucleótido (ADN) que codifica cualquiera de las secuencias de proteína preferidas. Esto puede conseguirse por ejemplo usando herramientas informatizadas tales como el conjunto informático DNSstar [DNAstar Inc, Madison, WI, Estados Unidos] o similar. Cualquiera de dichas secuencias de ADN con la capacidad de codificar los polipéptidos preferidos de la presente invención u homólogos significativos de los mismos, debe considerarse como realizaciones de la presente invención.
Como un esquema general, los genes que codifican cualquiera de las secuencias de proteína de bouganina modificadas preferidas pueden prepararse usando genes sintéticos y clonarse en un vector de expresión adecuado. En su lugar, el vector de expresión se introduce en una célula huésped y las células se seleccionan y se cultivan. Las proteínas de la invención se purifican del medio de cultivo y se formulan en una preparación para administración terapéutica. Como alternativa, puede obtenerse una secuencia génica de bouganina de tipo silvestre por ejemplo después de una estrategia de clonación de ADNc usando ARN preparado de tejidos radiculares de la planta Bougainvillea spectabilis Willd. El gen natural puede usarse como un molde para secuencias de variante preferidas para mutagénesis y construcción. En este sentido, es particularmente conveniente el uso de la estrategia de “PCR de extensión solapante” como describen Higuchi y col [Higuchi y col (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7351] aunque pueden aplicarse fácilmente otras metodologías y sistemas.
La actividad biológica de las proteínas de la invención puede también evaluarse de muchas maneras. En una realización, las moléculas de bouganina modificadas se identifican con actividad N-glucosidasa y en particular con una suficiente actividad para proporcionar inhibición significativa de la traducción de las proteínas. Un ensayo de este tipo adecuado implica ensayar la actividad de las proteínas bouganina modificadas en comparación con bouganinas no modificadas en un ensayo de síntesis de proteínas acelular. Una mezcla de transcripción/traducción acoplada que contiene metionina, un ADN que codifica la proteína indicadora luciferasa y diluciones en serie de proteínas bouganina no modificadas y modificadas se coincuban. Los niveles de luciferasa traducida se detectan fácilmente usando un contador de luminiscencia después de la adición de un reactivo de sustrato. La luminiscencia medida es inversamente proporcional a la actividad N-glucosidasa de la bouganina presente en la reacción. Es usual proporcionar un control negativo tal como una proteína bouganina inactiva que contenga por ejemplo una sustitución Y70A.
La constitución de las moléculas de bouganina preferidas y activas puede conseguirse por técnicas de ADN recombinante y estas incluyen moléculas de bouganina fusionadas con el anticuerpo deseado u otros restos diana. Los procedimientos para purificar y manipular proteínas recombinantes que incluyen proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica. Se explican técnicas necesarias completamente en la bibliografía, tal como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición (Sambrook y col., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology” (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel y col., eds., 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis y col., eds., 1994); “Current Protocols in Immunology” (J. E. Coligan y col., eds., 1991).
Las proteínas y péptidos de la invención pueden prepararse usando un procedimiento de ADN recombinante. Las proteínas de la invención también pueden prepararse por síntesis química usando técnicas bien conocidas en la química de proteínas tal como síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart).
La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que comprende una secuencia que codifica las proteínas o péptidos de bouganina modificados de la invención, preferentemente una secuencia que codifica la proteína descrita en el presente documento como SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 14.
La expresión “aislado y purificado” como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Un ácido nucleico “aislado y purificado” está también sustancialmente libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) a partir del cual deriva el ácido nucleico.
La expresión “ácido nucleico” como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos o monómeros nucleosídicos que consisten en bases de origen natural o azúcares y enlaces interazúcar (estructurales). El término también incluye secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros que no son de origen natural o partes de los mismos que actúan de manera similar. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) y pueden contener bases de origen natural que incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas tales como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo, 2-propilo, y otras alquil adeninas, 5halo uracilo, 5-halo citosina, 6-aza uracilo, 6-aza citosina y 6-aza timina, pseudo uracilo, 4-tiouracilo, 8-halo adenina, 8-amino adenina, 8-tiol adenina, 8-tio-alquil adeninas, 8-hidroxil adenina y otros adeninas 8 sustituidas, 8-halo guaninas, 8-amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquil guaninas, 8-hidroxil guanina y otras guaninas 8 sustituidas, otros uracilos aza o deaza, timidinas, citosinas, adeninas o guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluoro citosina.
En una realización, la molécula de ácido nucleico purificada y aislada comprende una secuencia que codifica las proteínas o péptidos, preferentemente la SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 14 de la invención, que comprende
- (a)
- la secuencia de ácidos nucleicos en la que T también puede ser U;
- (b)
- las secuencias de ácido nucleico complementarias a (a);
- (c)
- las secuencias de ácido nucleico que son homólogas a (a) o (b);
- (d)
- un fragmento de (a) a (c) que tiene al menos 15 bases, preferentemente de 20 a 30 bases, y que se hibridará con (a) a (c) en condiciones de hibridación rigurosas; o
- (e)
- una molécula de ácido nucleico que difiere de cualquiera de los ácidos nucleicos de (a) a (c) en las secuencias de codón debido a la degeneración del código genético.
Además, se apreciará que la invención incluye moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico que tienen homología sustancial de secuencia con las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas y péptidos de la invención y fragmentos de los mismos. La expresión “secuencias que tienen homología sustancial de secuencia” significa las secuencias de ácido nucleico que tienen unas variaciones de secuencia ligeras
o inconsecuentes a partir de estas secuencias, es decir las secuencias actúan substancialmente de la misma manera para producir proteínas funcionalmente equivalentes. Las variaciones pueden atribuirse a mutaciones locales o modificaciones estructurales.
Las secuencias de ácido nucleico que tienen homología sustancial incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen al menos una identidad del 80 %, preferentemente del 90 % con la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas y péptidos de la invención.
Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico y fragmentos de la misma que tienen al menos 15 bases, que se hibridan con moléculas de ácido nucleico de la invención en condiciones de hibridación, preferentemente condiciones de hibridación rigurosas. Los expertos en la técnica conocen condiciones rigurosas apropiadas que promueven la hibridación del ADN o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, puede emplearse lo siguiente: cloruro de sodio 6,0/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido por un lavado de 2,0 x SSC a 50 ºC. La rigurosidad puede seleccionarse basándose en las condiciones usadas en la etapa de lavado. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de una elevada rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 ºC. Además, la temperatura de la etapa de lavado puede ser a condiciones de alta rigurosidad, aproximadamente 65 ºC.
Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención tienen una secuencia que codifica una proteína o un péptido de la invención que puede incorporarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión apropiado que garantice la buena expresión de la proteína o polipéptido. Como posibles vectores de expresión se incluyen pero sin limitación, cósmidos, plásmidos o virus modificados (por ejemplo retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), siempre que el vector sea compatible con la célula huésped usada. La expresión de “vectores adecuados para la transformación de una célula huésped” significa que los
vectores de expresión contienen una molécula de ácido nucleico de la invención y secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped para usar para la expresión, que están unidos operativamente a la molécula de ácido nucleico. Por “unida operativamente” se entiende que el ácido nucleico está unido a secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión del ácido nucleico.
Por lo tanto la invención contempla un vector de expresión recombinante de la invención que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, o un fragmento de la misma, y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de proteína insertada. Las secuencias reguladoras adecuadas podían derivar de diversas fuentes incluyendo genes bacterianos, fúngicos o virales (por ejemplo véase las secuencias reguladoras descritas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). La selección de secuencias reguladoras apropiadas es dependiente de la célula huésped seleccionada y puede conseguirse fácilmente por un experto habitual en la técnica. Como ejemplos de dichas secuencias reguladoras incluyen: un promotor transcripcional y un potenciador o una secuencia de unión a ARN polimerasa, una secuencia de unión ribosómica, que incluye una señal de inicio de la traducción. Adicionalmente, dependiendo de la célula huésped seleccionada y del vector empleado, pueden incorporarse otras secuencias tales como un origen de replicación, sitios adicionales de restricción de ADN, potenciadores y secuencias que confieren inducibilidad de la transcripción en el vector de expresión. También se apreciará que las secuencias reguladoras necesarias pueden proporcionarse por la proteína natural y/o sus regiones flanqueantes.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención también pueden contener un gen marcador de selección que facilita la selección de células huésped transformadas o transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Son ejemplos de genes marcadores de selección los genes que codifican una proteína tal como G418 e higromicina que confiere resistencia a determinados fármacos, β-galactosidasa, acetiltransferasa cloranfenicol o luciferasa de luciérnaga. La transcripción del gen marcador de selección se controla por cambios en la concentración de la proteína marcadora de selección tal como β-galactosidasa, acetiltransferasa cloranfenicol o luciferasa de luciérnaga. Si el gen marcador de selección codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos tal como resistencia a neomicina, pueden seleccionarse células transformantes con G418. Las células que tienen incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras morirán. Esto hace que sea posible visualizar y someter a ensayo con respecto a la expresión de vectores de expresión recombinantes de la invención y en particular determinar el efecto de una mutación sobre la expresión y fenotipo. Se apreciará que los marcadores de selección pueden introducirse en un vector individual del ácido nucleico de interés.
Los vectores de interés recombinantes también pueden contener genes que codifican un resto de fusión que proporcione una mayor expresión de la proteína recombinante; una mayor solubilidad de la proteína recombinante y ayudar en la purificación de una proteína recombinante diana actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Por ejemplo, puede añadirse un sitio de escisión proteolítico a la proteína recombinante diana para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a purificación de la proteína de fusión.
Pueden introducirse vectores de expresión recombinantes en células huésped para producir una célula huésped transformada. Se pretende que la expresión “célula huésped transformada” incluya células procariotas y eucariotas que se han transformado o transfectado con un vector de expresión recombinante de la invención. Se pretende que las expresiones “transformado con”, “transfectado con”, “transformación” y “transfección” incluyan la introducción de ácido nucleico (por ejemplo un vector) en una célula mediante cualquiera de muchas posibles técnicas conocidas en la materia. Las células procariotas pueden transformarse con ácido nucleico por ejemplo mediante electroporación o transformación mediada con cloruro de calcio. Puede introducirse ácido nucleico en células de mamífero mediante técnicas convencionales tales como fosfato cálcico o precipitación con cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE dextrano, lipofectina, electroporación o microinyección. En Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio pueden encontrarse procedimientos adecuados para la transformación y transfección de células huésped.
Las células huésped adecuadas incluyen una amplia diversidad de células procariotas y eucariotas. Por ejemplo, las proteínas de la invención pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando baculovirus), células de levadura o células de mamífero. En Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991) pueden encontrarse otras células huésped adecuadas.
Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o una secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado para facilitar la traducción. Generalmente, la expresión “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contigua en una fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. El engarce se consigue mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o engarzadores oligonucleotídicos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.
En algunas realizaciones el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una bouganina modificada con un número reducido de epítopos de linfocitos T posibles unidos operativamente a una secuencia de control de expresión. En diversas realizaciones el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas o péptidos de la invención, o una variante degenerada de la misma y comprenderá al menos el dominio que codifica la RIP de dichos ácidos nucleicos unidos operativamente con un control de expresión adecuado y secuencias de selección. La degeneración en relación a polinucleótidos se refiere al hecho de que se reconocerá que en el código genético se especifican muchos aminoácidos en más de un codón. La degeneración del código representa 20 aminoácidos diferentes codificados por 64 secuencias triplete posibles de las cuatro diferentes bases que comprenden ADN.
El término “domino que codifica RIP” o “dominio que codifica la Proteína Inactivadora de Ribosomas” como se usa en el presente documento significa el dominio funcional que proporciona a la bouganina su actividad biológica.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden sintetizarse químicamente usando técnicas convencionales. Se conocen diversos procedimientos para la síntesis química de polidesoxinucleótidos incluyendo síntesis en fase sólida que, al igual que la síntesis peptídica, se ha automatizado por completo en sintetizadores de ADN disponibles en el mercado (véase, por ejemplo Itakura y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.598.049; Caruthers y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066; e Itakura Patente de Estados Unidos Nº 4.401.796 y 4.373.071).
La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden una nueva proteína de la invención y una proteína seleccionada o una proteína marcadora de selección.
Otro aspecto de la presente invención es una célula cultivada que comprende al menos uno de los vectores mencionados anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para preparar la bouganina modificada que comprende cultivar la célula mencionada anteriormente en condiciones que permitan la expresión de la bouganina modificada del vector de expresión y purificar la bouganina de la célula.
(B) Citotoxinas bouganina modificadas:
Como se ha mencionado anteriormente, la bouganina es una proteína inactivadora ribosómica de tipo 1 (RIP) que despurina el principal ARN ribosómico de células conduciendo al cese de la síntesis de proteínas y la muerte celular. Como tales, las bouganinas modificadas de la invención pueden usarse para preparar citotoxinas. Las citotoxinas que contienen una proteína bouganina modificada se prefieren sobre citotoxinas que contienen una proteína bouganina no modificada ya que la primera es menos inmunogénica y probablemente destruirá menos el sistema inmunitario antes de que alcance su diana.
Por consiguiente, la presente invención también proporciona una citotoxina que comprende (a) un resto diana unido a
(b) una proteína bouganina modificada de la invención.
La expresión “proteína bouganina modificada de la invención” se usa para facilidad de referencia e incluye cualquiera y todas las proteínas bouganinas modificadas descritas en el presente documento tal como las proteínas bouganinas modificadas descritas anteriormente en la Sección (A) así como en las figuras y ejemplos.
La expresión “resto diana” como se usa en el presente documento se refiere a un sustrato, medios, o técnicas de administración de la proteína bouganina modificada a una célula diana. En una realización el resto diana es un anticuerpo. En una realización, el resto diana puede ser un liposoma. En una realización el liposoma puede unirse a un anticuerpo. En otra realización el resto diana es una proteína que puede dirigir una interacción de unión específica con una célula diana particular. Dichos restos de proteína incluyen una diversidad de ligandos polipeptídicos para los cuales existen receptores de superficie celular específicos e incluyen por lo tanto numerosas citocinas, hormonas peptídicas y polipeptídicas y otros modificadores de la respuesta biológica. Ejemplos destacables incluyen dichas proteínas como factor de crecimiento epitelial vascular, factor de crecimiento epidérmico, herregulina, las interleucinas, interferones, factor de necrosis tumoral y otras moléculas de proteínas y glucoproteínas. Las proteínas de fusión de estas y otras moléculas con bouganina de la presente invención pueden contemplarse y puede comprender el resto de bouganina modificado bien en la orientación en el extremo N o bien en el extremo C con respecto al dominio del ligando de la proteína. El resto diana puede unirse directamente a las proteínas de la invención o a través de un engarce. En una realización, el engarce es un engarce peptídico o un engarce químico. Del mismo modo, la reticulación química del ligando purificado con la proteína bouganina modificada puede contemplarse y se encuentra dentro del ámbito de la presente invención.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una citotoxina que comprende (a) un ligando que se une a una célula cancerosa unida a; (b) una proteína bouganina modificada de la invención.
El ligando puede ser cualquier molécula que se una a una célula cancerosa que incluya, pero sin limitación, proteínas. En una realización, el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce la superficie de una célula cancerosa.
Por consiguiente, las citotoxinas de la presente invención pueden usarse para tratar diversas formas de cáncer tales como cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.
En una realización, el ligando que se une a una célula cancerosa comprende una molécula de inmunoglobulina completa que se une a la célula cancerosa. Cuando un ligando de unión a la célula cancerosa es un anticuerpo o un fragmento del mismo, a la citotoxina se la puede denominar inmunotoxina. En otra realización, el ligando que se une a la célula cancerosa es un dímero de fragmentos de anticuerpo Fab, Fab’, scFv, de un solo dominio o fragmentos FV estabilizados con puentes disulfuro. En otra realización, el anticuerpo contra el cáncer comprende una cadena pesada variable, una cadena ligera variable, un fragmento de anticuerpo de un solo dominio Fab, Fab’, scFv o un fragmento Fv estabilizado con puentes disulfuro. Las partes del ligando que se une a la célula cancerosa puede derivar de una o más especies, preferentemente comprendiendo las partes derivadas de la especie humana y más preferentemente son completamente humanas o humanizadas. Las regiones diseñadas para facilitar la purificación o para la conjugación con la toxina también pueden incluirse o añadirse en la parte de unión a la célula cancerosa.
En una realización particular, el ligando de unión a la célula cancerosa reconoce Ep-CAM. Ep-CAM (por Molécula de Adhesión Celular Epitelial, también conocida como 17-1A, KSA, EGP-2 y GA733-2) es una proteína transmembrana que se expresa altamente en muchos tumores sólidos, incluyendo carcinomas de pulmón, de mama, ovario, colorrectal y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, pero expresada débilmente en la mayoría de los tejidos epiteliales normales.
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona una citotoxina bouganina modificada dirigida a Ep-CAMque comprende (a) un ligando (tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que se une a Ep-CAM sobre la célula cancerosa unida a (b) una proteína bouganina modificada que tiene un propensión reducida para activar linfocitos T en comparación con una proteína bouganina no modificada.
En una realización específica, la citotoxina comprende (a) un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo que se une al dominio extracelular de Ep-CAM humano y comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un anticuerpo MOC-31 unido a: (b) una proteína bouganina modificada que tiene una propensión reducida para activar linfocitos T en comparación con una proteína bouganina no modificada.
Las bouganinas modificadas dirigidas a Ep-CAM adecuadas de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, VB6-845 y variantes de la misma, otras citotoxinas que comprenden otras inmunoglobulinas de cadena sencilla o doble que se unen selectivamente a Ep-CAM o variantes de las mismas. La expresión “VB6-845” como se usa en el presente documento significa una citotoxina que comprende una versión Fab de un anticuerpo scFv anti-Ep-CAM unido a una forma modificada de bouganina, Bou 156 (SEC ID Nº: 13). La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la VB6-845 se observa en la Figura 3B (SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 15, respectivamente).
En otra realización, el ligando que se une a la célula cancerosa reconoce un antígeno asociado a tumores que se encuentra específicamente en células neoplásicas y no en células normales. En una realización preferida, el ligando es un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumor. El anticuerpo anti antígeno asociado a tumor reconoce específicamente células cancerosas de una amplia diversidad de cánceres pero no reconoce células normales no cancerosas.
Por consiguiente en otra realización, la invención proporciona una citotoxina que comprende (a) un ligando (tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un antígeno asociado a tumor en la célula cancerosa unida a; (b) una proteína bouganina modificada que tiene una proporción reducida para activar linfocitos T en comparación con una proteína bouganina no modificada.
Las bouganinas modificadas dirigidas a antígenos asociados con tumores adecuados de la invención incluyen, sin limitación, VB6-011 y sus variantes, otras citotoxinas que comprenden otras inmunoglobulinas de cadena sencilla o doble que se unen selectivamente a antígenos asociados con tumores o variantes de los mismos. El término “VB6011” como se usa en el presente documento significa una citotoxina que comprende una versión Fab del anticuerpo monoclonal humano H11 vinculado genéticamente a una forma modificada de bouganina, BOU 156 (SEC ID Nº: 13). El anticuerpo H11 se obtiene por la fusión de linfocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer de 64 años fusionados con una línea celular de mieloma humana para producir hibridomas. El hibridoma NBGM1/H11 produce una IgMk que se remodificó por ingeniería genética en un formato Fab para elaborar VB6-011 (véanse los documentos US 6.207.153 o WO 97/44461 para más detalle de la preparación del hibridoma secretor del anticuerpo H11). La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de VB6-011 se muestra en la Figura 15 (SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 27, respectivamente).
En una realización no limitante específica, la citotoxina comprende VB6-845 (Figura 3B, SEC ID Nº: 16) o VB6-011 (Figura 15, SEC ID Nº: 28). En otras realizaciones no limitantes, la citotoxina comprende una variante de VB6-845 o VB6
011.
Una variante VB6-845 se une al mismo epítopo Ep-CAM o a un epítopo EP-CAM sustancialmente similar que está unido mediante VB6-845, y la variante pueden inhibir de manera competitiva la unión de VB6-845 con Ep-CAM en
condiciones fisiológicas en al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %. Una variante VB6-845 puede comprender la misma bouganina modificada que VB6-845 o puede comprender una bouganina diferente modificada de la invención. En otra realización no limitante, la citotoxina comprende una parte de unión a Ep-CAM que comprende la región variable de MOC31, o una variante de la misma. En otra realización adicional, la citotoxina comprende una parte de unión a Ep-CAM que comprende 4D5MOCB o una variante de la misma. La unión de cualquiera de estas citotoxinas a Ep-CAM puede reducirse al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % por competición con el anticuerpo MOC31 o 4D5MOCB de referencia en condiciones fisiológicas.
Una variante VB6-011 se une al mismo epítopo antigénico asociado con tumor o a un epítopo antigénico asociado con tumor sustancialmente similar que está unido mediante VB6-011, y la variante puede inhibir competitivamente la unión de VB6-011 con un antígeno asociado a tumor en condiciones fisiológicas en al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %. Una variante VB6-011 puede comprender la misma bouganina modificada que VB6-011 o puede comprender una bouganina modificada diferente de la invención. En otra realización no limitante, la citotoxina comprende una parte de unión a antígeno asociada a tumor que comprende el anticuerpo monoclonal H11, fragmentos de unión a antígeno H11 o variante de los mismos. La unión de cualquiera de estas citocinas a VB6-011 puede reducirse al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % por competición con el anticuerpo H11 de referencia en condiciones fisiológicas.
En una realización preferida, la afinidad de unión de la parte de unión a Ep-CAM o la parte de unión a antígeno asociado a tumor es al menos cuatro órdenes de magnitud, preferentemente al menos tres órdenes de magnitud, más preferentemente menos de dos órdenes de magnitud de la afinidad de unión de VB6-845 o VB6-011 respectivamente medido por técnicas de laboratorio convencionales. En realizaciones no limitantes, la parte de unión a Ep-CAM puede bloquear competitivamente la unión de un anticuerpo anti-Ep-CAM conocido tal como, pero sin limitación, PANOREX®
o MT201, a Ep-CAM en condiciones fisiológicas, al menos el 0,1 %, 1 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %. En realizaciones no limitantes, la parte de unión a antígeno asociada a tumor puede bloquear competitivamente la unión de un anticuerpo de la unión de un anticuerpo anti antígeno asociado a tumor, tal como, pero sin limitación, H11, a un antígeno asociado a tumor, en condiciones fisiológicas en al menos el 0,1 %, 1 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %.
El experto en la técnica podrá apreciar que pueden identificarse restos determinantes de especificidad. La expresión “restos determinantes de especificidad” conocidos también como “SDR” se refiere a un resto que forma parte del parátopo de un anticuerpo, particularmente restos CDR, la sustitución individual mediante la cual alanina, independientemente de cualquier otra mutación, disminuye la afinidad del anticuerpo por el epítopo en al menos 10 veces, preferentemente al menos 100 veces, más preferentemente al menos 1000 veces. Esta pérdida de afinidad destaca la importancia del resto en cuanto a la capacidad del anticuerpo para unirse al epítopo. Véase, por ejemplo, Tamura y col., 2000, “Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only,” J. Immunol. 164(3): 1432-1441.
El efecto de mutaciones sencillas o múltiples sobre la actividad de unión, particularmente sobre la afinidad de unión, puede evaluarse al mismo tiempo para evaluar la importancia de una serie particular de aminoácidos sobre la interacción de unión (por ejemplo, la contribución de la CDR2 de cadena ligera o pesada a la unión). Los efectos de una mutación de aminoácidos también pueden evaluarse secuencialmente para evaluar la contribución de un solo aminoácido cuando se evalúa individualmente. Dichas evaluaciones pueden realizarse, por ejemplo, mediante una exploración de saturación in vitro (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.180.341; Hilton y col., 1996, “Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor,” J Biol Chem. 271: 4699-4708) y mutagénesis dirigida (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, “High-resolution epitope mapping of hGHreceptor interactions by alanine-scanning mutagenesis,” Science 244: 1081-1085; Bass y col., 1991, “A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor,” Proc Natl Acad Sci. USA
88: 4498-4502). En la técnica de mutagénesis mediante exploración de alanina, se introducen mutaciones sencillas de alanina en restos múltiples en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo con respecto a la actividad biológica para identificar restos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula.
También pueden identificarse sitios de receptor a ligando u otras interacciones biológicas mediante análisis físico de estructura determinado mediante, por ejemplo, resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje con fotoafinidad, junto con la mutación de supuestos aminoácidos de sitios de contacto (véase, por ejemplo de Vos y col., 1992, “Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex,” Science 255: 306-312; Smith y col., 1992, “Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein,” J Mol Biol. 224: 899-904; Wlodaver y col., 1992, “Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25 A revolution,” FEBS Lett. 309: 59-64). Adicionalmente, la importancia de aminoácidos individuales particulares o series de aminoácidos, pueden evaluarse por comparación con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos relacionado o sitios de unión a análogos.
Adicionalmente, el experto en la materia podrá apreciar que el aumento de avidez puede compensar una afinidad de unión menor. La avidez de una citotoxina por un receptor de una célula cancerosa es una medida de la fuerza de la unión de la parte de unión a Ep-CAM de Ep-CAM, que tiene múltiples sitios de unión. La fuerza de unión funcional entre Ep-CAM y la parte de unión a Ep-CAM representa la suma de la fuerza de todas las uniones de afinidad y por tanto un componente individual puede unirse con relativamente baja afinidad, pero un multímero de dichos componentes puede demostrar un fuerte efecto biológico. De hecho, las interacciones múltiples entre los sitios de unión a Ep-CAM y epítopos Ep-CAM pueden demostrar ser mucho mayores que el efecto biológico aditivo es decir la ventaja de multivalencia puede ser de muchos órdenes de magnitud con respecto a la constante de equilibrio.
De manera similar, la avidez de una citotoxina por un receptor de células cancerosas es una medida de la fuerza de la parte de unión a antígeno asociada a tumor de un antígeno asociado a tumor, que puede tener sitios de unión múltiples. La fuerza de unión funcional entre un antígeno asociado a tumor y la parte de unión a antígeno asociado a tumor representa la suma de la fuerza de todos los enlaces de afinidad y por tanto un componente individual puede unirse con relativamente baja afinidad, aunque un multímero de dichos componentes puede demostrar un fuerte efecto biológico. De hecho, las interacciones múltiples entre sitios de unión a antígeno asociados a tumor y epítopos de antígeno asociados a tumor pueden demostrar ser mucho mayores que el efecto biológico aditivo, es decir, la ventaja de multivalencia puede ser de muchos órdenes de magnitud con respecto a la constante del equilibrio.
En una realización no limitante, la parte de unión a Ep-CAM tiene una estructura sustancialmente similar a la de 4D5MOCB. La estructura sustancialmente similar puede caracterizarse por referencia a mapas epitópicos que reflejan los puntos de unión de la parte de unión a Ep-CAM de citotoxinas con una molécula Ep-CAM. En otra realización no limitante, los mapas epitópicos pueden generarse para la parte de unión a antígeno asociada con tumor y una estructura sustancialmente similar puede caracterizarse por referencia a mapas epitópicos que reflejen los puntos de unión de la parte de unión a antígeno asociada a tumor de la citotoxina con una molécula de antígeno asociada a tumor.
Las citotoxinas de la presente invención pueden prepararse mediante síntesis química usando técnicas bien conocidas en la química de proteínas tales como síntesis en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154 (1964)) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart (1987)). En una realización, el ligando de unión a cáncer y la bouganina modificada son ambos proteínas y pueden conjugarse usando técnicas bien conocidas en la materia. Existen varios cientos de reticulantes disponibles que pueden conjugar dos proteínas. (Véase por ejemplo “Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”. 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). El reticulante se selecciona generalmente basándose en grupos funcionales reactivos disponibles o insertados en el ligando o toxina. Además, si no hay grupos reactivos, puede usarse un reticulante fotoactivable. En determinados casos, puede ser deseable incluir un espaciador entre el ligando y la toxina. Los agentes reticulantes conocidos en la técnica incluyen los agentes homobifuncionales: glutaraldehído, dimetiladipimidato y Bis(diazobencidina) y los agentes heterobifuncionales: m Maleimidobenzoil-N-Hidroxisuccinimida y Sulfo-m Maleimidobenzoil-N-Hidroxisuccinimida.
También puede prepararse una proteína de fusión a toxina bouganina-ligando usando técnicas de ADN recombinantes. En este caso, una secuencia de ADN que codifica el ligando de unión a cáncer se fusiona con una secuencia de ADN que codifica la proteína bouganina modificada dando como resultado una molécula de ADN quimérica. La secuencia de ADN quimérica se transfecta en una célula huésped que expresa la proteína de fusión ligando-bouganina. La proteína de fusión puede recuperarse del cultivo celular y purificarse usando técnicas conocidas en la materia.
Pueden prepararse anticuerpos que tengan especificidad por proteínas de superficie celular tales como Ep-CAM y antígeno asociados a tumores mediante procedimientos convencionales. Un mamífero (por ejemplo un ratón, hámster o conejo) puede inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido que suscita una respuesta de anticuerpo en el mamífero. Las técnicas para conferir inmunogenicidad en un péptido incluyen conjugación a vehículos u otras técnicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, el péptido puede administrarse en presencia de adyuvantes. El progreso de la inmunización puede monitorizarse por detección de titulaciones de anticuerpos en plasma o suero. Pueden usarse procedimientos de ELISA convencionales u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. Después de la inmunización, puede obtenerse antisuero y, si se desea, los anticuerpos policlonales aislarse de los sueros.
Para producir anticuerpos monoclonales, células productoras de anticuerpos (linfocitos) pueden extraerse de un animal inmunizado y fusionarse con células de mieloma mediante procedimientos de fusión celular somática convencionales inmortalizando así estas células y proporcionando células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia, por ejemplo, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (Nature
256: 495-497 (1975)) así como otras técnicas tales como la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor y col., Immunol. Today 4: 72 (1983)), la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., páginas 77-96 (1985)) y exploración de bibliotecas de anticuerpos combinatorias (Huse y col., Science 246: 1275 (1989)). Las células de hibridoma pueden explorarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con el péptido y los anticuerpos monoclonales pueden aislarse.
El término “anticuerpo” como se usa en el presente documento pretende incluir anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab y F(ab’)2, y anticuerpos monocatenarios (scFv)) y anticuerpo quiméricos que también reaccionan específicamente con un componente de la superficie de la célula. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y los fragmentos pueden explorarse con respecto a la utilidad de la misma manera que la descrita anteriormente. Por ejemplo, los fragmentos F(ab’)2 pueden generarse tratando un anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab’)2 resultante puede tratarse para reducir puentes disulfuro para producir fragmentos Fab’. Los anticuerpos monocatenarios combinan las regiones de unión a antígeno de un anticuerpo en una cadena polipeptídica plegada de forma estable. Los anticuerpos monocatenarios pueden generarse por tecnología recombinante.
Los derivados de anticuerpos quiméricos, es decir moléculas de anticuerpo que se combinan con una región variable de animal no humano y una región constante humana también se contemplan dentro del alcance de la invención. Las moléculas de anticuerpo quiméricas pueden incluir, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de un ratón, rata u otras especies, con regiones constantes humanas. Pueden usarse procedimientos convencionales para fabricar anticuerpos quiméricos que contengan la región variable de inmunoglobulina que reconozca un antígeno de la superficie celular (Véase, por ejemplo Morrison y col., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851 (1985); Takeda y col., Nature 314: 452 (1985), Cabilly y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Boss y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.397; Tanaguchi y col., Patente E.P. Nº. 171.496; Patente Europea Nº 173.494, Patente del Reino Unido Nº GB 2177096B). Se espera que los anticuerpos quiméricos sean menos inmunogénicos en un sujeto humano que el anticuerpo no quimérico correspondiente. Los anticuerpos quiméricos pueden estabilizarse mediante el procedimiento descrito en Pluckthun y col., documento WO 00/61635.
Los anticuerpos monoclonales o quiméricos especialmente reactivos contra componentes de la superficie celular pueden adicionalmente humanizarse produciendo quimeras con región constante humana en cuyas partes de las regiones variables, particularmente las regiones marco conservadas del dominio de unión a antígeno, son de origen humano y solo las regiones hipervariables son de origen no humano. Dichas moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse mediante técnicas conocidas en la materia, (por ejemplo Teng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312 (1983); Kozbor y col., Immunology Today 4: 7279 (1983); Olsson y col., Meth. Enzymol., 92: 3-16 (1982), y Publicación PCT WO92/06193 o documento EP 239.400). Los anticuerpos humanizados también pueden producirse comercialmente (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña). Además, anticuerpos monoclonales o quiméricos específicamente reactivos contra componentes de la superficie celular pueden hacerse menos inmunogénicos reduciendo su número de posibles epítopos de linfocitos T.
Los anticuerpos específicos o fragmentos de anticuerpo reactivos contra componentes de la superficie celular también pueden generarse explorando bibliotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulina, o partes de las mismas, que se expresan en bacterias con componentes de superficie celular. Por ejemplo, fragmentos Fab completos, regiones VH y regiones Fv pueden expresarse en bacterias usando fagotecas de expresión (Véase por ejemplo Ward y col., Nature 341: 544-546 (1989); Huse y col., Science 246: 1275-1281 (1989); y McCafferty y col., Nature 348: 552-554 (1990)). Como alternativa, un SCID-hu de ratón, por ejemplo el modelo desarrollado por Genpharm, puede usarse para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.
En todos los casos en los que se crea una proteína de bouganina modificada en la fusión con una secuencia de anticuerpo es más deseable utilizar secuencias de anticuerpo en las que se han eliminado los epítopos de linfocitos T o secuencias que pueden unirse a moléculas de MHC de clase II o estimular linfocitos T o unirse a linfocitos T en asociación con moléculas de MHC de clase II.
En una realización adicional de la presente invención, la proteína bouganina modificada puede unirse con una proteína no anticuerpo incluso una proteína capaz de dirigir una interacción de unión específica con una célula diana particular. Dichos restos de proteína incluyen una diversidad de ligandos polipeptídicos para los cuales existen receptores de superficie celular específicos e incluyen por lo tanto numerosas citocinas, hormonas peptídicas y polipéptidos y otros modificadores de la respuesta biológica. Ejemplos destacables incluyen proteínas tales como factor de crecimiento epitelial vascular, factor de crecimiento epidérmico, herregulina, interleucinas, interferones, factor de necrosis tumoral y otras proteínas y moléculas de glucoproteína. Las proteínas de fusión de estas y otras moléculas con la bouganina de la presente invención pueden contemplarse y pueden comprender el resto de bouganina modificado en orientación del extremo N o extremo C con respecto al dominio ligando de la proteína. Del mismo modo, el entrecruzamiento químico del ligando purificado con la proteína bouganina modificada puede contemplarse y se encuentra dentro del ámbito de la presente invención.
En una realización adicional la proteína bouganina modificada de la presente invención puede usarse como un complejo que contiene un polímero hidrosoluble tal como hidroxipropilmetacrilamida u otros polímeros en los que la proteína bouganina modificada está en unión covalente con el polímero o en una interacción de unión no covalente con el polímero. Dicha realización puede incluir adicionalmente un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo en combinación con el complejo de bouganina polimérico.
(C) Usos de las citotoxinas
Las proteínas bouganinas modificadas de la invención pueden usarse para inhibir específicamente o destruir células de mamífero afectadas por cáncer. Es una ventaja de la citotoxinas de la invención que son menos inmunogénicas lo que permite que la RIP entre en la célula y destruya eficazmente células cancerosas. Por tanto, la citotoxina puede usarse para dirigir específicamente células cancerosas. La bouganina, una vez en la célula cancerosa, depura el ARN ribosómico principal, dañando por lo tanto los ribosomas y conduciendo al cese de la síntesis de proteínas y la muerte celular.
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un procedimiento para inhibir o destruir una célula cancerosa que comprende administrar una citotoxina de la invención a un animal que lo necesite. La presente invención también incluye un uso de una citotoxina de la invención para inhibir o destruir una célula cancerosa. La presente invención incluye adicionalmente un uso de la citotoxina de la invención en la preparación de un medicamento para inhibir o destruir una célula cancerosa. El tipo de células cancerosas que se inhiben o destruyen por una citotoxina se determinará por la especificidad de antígeno de su parte de anticuerpo.
En una realización, la invención proporciona un procedimiento para inhibir o destruir células cancerosas que comprenden las etapas de preparar una citotoxina de la invención y administrar la citotoxina a las células. El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluyendo, pero sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.
La capacidad de las citotoxinas de la invención para inhibir selectivamente o destruir células cancerosas animales puede ensayarse fácilmente in vitro usando líneas celulares de cáncer de animales. El efecto inhibidor selectivo de las citotoxinas de la invención puede determinarse, por ejemplo, demostrando la inhibición selectiva de proliferación celular en las células cancerosas.
La toxicidad puede medirse basándose en la viabilidad celular, por ejemplo la viabilidad de cultivos celulares normales y cancerosos expuestos a las citotoxinas puede compararse. La viabilidad puede evaluarse mediante técnicas conocidas tales como ensayos de exclusión con azul tripano.
En otro ejemplo, pueden usarse diversos modelos para ensayar la citotoxicidad de las citotoxinas. Thompson, E. W. y col. (Breast Cancer Res. Treatment 31: 357-370 (1994)) han descrito un modelo para la determinación de invasividad de células cancerosas de mama humanas in vitro midiendo la proteólisis mediada por células tumorales de la matriz extracelular y la invasión de células tumorales de la membrana basal reconstituida (colágeno, laminina, fibronectina, Matrigel o gelatina). Otros modelos de células cancerosas aplicables incluyen células de adenocarcinoma de ovario cultivadas (Young, T. N. y col. Gynecol. Oncol. 62: 89-99 (1996); Moore, D. H. y col. Gynecol. Oncol. 65: 78-82 (1997)), células de cáncer tiroideo folicular humano (Demeure, M. J. y col., World J. Surg.
16: 770-776 (1992)), línea celulares de melanoma humano (A-2058) y fibrosarcoma (HT-1080) (Mackay, A. R. y col. Lab. Invest - 70: 781-783 (1994)), y líneas celulares escamosas de pulmón (HS-24) y adenocarcinoma (SB-3) (Spiess, E. y col. J. Histochem. Cytochem. 42: 917-929 (1994)). También se ha descrito un sistema de ensayo in vivo que implica la implantación de tumores y medición del crecimiento tumoral y metástasis en ratones desnudos atímicos (Thompson, E. W. y col., Breast Cancer Res. Treatment 31: 357-370 (1994); Shi, Y. E. y col., Cancer Res. 53: 14091415 (1993)).
La presente invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de una o más citotoxinas de la presente invención a un animal que lo necesite. La invención incluye un uso de una citotoxina de la invención para tratar el cáncer. Adicionalmente la invención incluye un uso de una citotoxina de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
El término “animal” incluye todos los miembros del reino animal incluyendo seres humanos.
La expresión “tratamiento del cáncer” o “tratar cáncer” se refiere a la inhibición de la replicación de células cancerosas, inhibición de dispersión de cáncer (metástasis), inhibición de crecimiento tumoral, reducción del número de células cancerosas o crecimiento tumoral, disminución del grado de malignidad de un cáncer o mejora de síntomas relacionados con cáncer.
En una realización preferida, el animal es un ser humano. En otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas y linfomas de linfocitos T y B.
Los resultados clínicos de los tratamientos contra el cáncer usando una citotoxina de la invención son fácilmente reconocibles por un experto en la técnica relevante, tal como un médico. Por ejemplo, los ensayos médicos convencionales para medir marcadores clínicos de cáncer pueden ser indicadores fuertes de la eficacia del tratamiento. Dichos ensayos pueden incluir, sin limitación, examen físico, escalas de rendimiento, marcadores de enfermedades, ECG de 12 cables, mediciones tumorales, biopsia tisular, citoscopia, citología, mayor diámetro de
cálculos de tumor, radiografía, formación digital de imágenes de tumores, signos vitales, peso, recuerdo de acontecimientos adversos, valoración de episodios infecciosos, valoración de medicaciones simultáneas, valoración del dolor, química de suero o sangre, análisis de orina, exploración CT, y análisis farmacocinético. Además, pueden determinarse efectos sinérgicos de una terapia de combinación que comprende la citotoxina y otra terapia contra el cáncer mediante estudios comparativos con pacientes que se someten a monoterapia.
La remisión de tumores malignos puede evaluarse usando criterios aceptados por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Therasse y col., 2000, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada,” J Natl Cancer Inst. 2 Feb; 92(3): 205-16.
La dosis eficaz de una construcción de citotoxina específica puede depender de diversos factores incluyendo el tipo de cáncer, el tamaño del tumor, la fase del cáncer, la toxicidad de la citotoxina contra el paciente, la especificidad del direccionamiento a las células cancerosas así como la edad, el peso y la salud del paciente.
Las citotoxinas que comprenden la bouganina modificada pueden administrarse mediante infusión i.v. durante un periodo de minutos a horas, dependiendo de la dosis y de la concentración de la citotoxina en la infusión.
En una realización, la citotoxina se infunde durante un periodo de 3 horas.
En una realización, la dosis eficaz mediante administración i.v. de la citotoxina puede variar de aproximadamente 1 a 100 mg/kg/dosis. En otras realizaciones, la dosis puede variar de aproximadamente 2 a 50 mg/kg/dosis. En realizaciones específicas, la dosis puede ser al menos aproximadamente de 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 mg/kg/dosis.
En una realización, la dosis individual se administra aproximadamente cada semana durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas. La dosis individual puede administrarse en semanas consecutivas o, como alternativa, pueden saltarse una o más semanas. Después de este ciclo, un ciclo posterior puede comenzar aproximadamente 1, 2, 4, 6
o 12 semanas después. El régimen de tratamiento puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más ciclos, separándose cada ciclo aproximadamente 1, 2, 4, 6 o 12 semanas.
En otra realización la dosis individual se administra cada mes durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses consecutivos. Después de este ciclo, un ciclo consecutivo puede comenzar aproximadamente 1, 2, 4, 6 o 12 meses después. El régimen de tratamiento puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más ciclos, separándose cada ciclo aproximadamente 1, 2, 4, 6 o 12 meses.
En una realización no limitante particular, la dosis eficaz de la citotoxina es entre aproximadamente 1 y 50 mg/kg/tumor/día, en la que al paciente se le administra una dosis individual al día. La dosis individual se administra aproximadamente cada día (de uno o más días pueden opcionalmente saltarse) durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días consecutivos. Después de este ciclo, puede comenzar un ciclo posterior aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,
o 6 semanas después. El régimen de tratamiento puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, o 6 o más ciclos, separándose cada ciclo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas.
El volumen de inyección preferentemente es al menos una cantidad eficaz, que es apropiada con el tipo y/o localización del tumor. El volumen de inyección máximo en una sola dosis puede estar entre aproximadamente el 25 % y el 75 % del volumen tumoral, por ejemplo aproximadamente un cuarto, un tercio o tres cuartos del volumen tumoral diana calculado. En una realización específica no limitante, el volumen de inyección máximo en una dosis individual es de aproximadamente el 30 % del volumen tumoral.
En otra realización, la citotoxina se infunde durante 3 horas a una tasa de 100 cm3 por hora con una solución que contiene de 1 a 10 mg de citotoxina/ml. La citotoxina se diluirá en una solución fisiológicamente compatible adecuada.
La dosis eficaz de otra terapia contra el cáncer a administrar junto con una citotoxina durante un ciclo también varía de acuerdo con el modo de administración. La una o más terapias contra el cáncer pueden administrarse por vía intratumoral o mediante otros modos de administración. Normalmente, los agentes quimioterapéuticos se administran sistémicamente. En la técnica se conocen dosificaciones y regímenes de tratamiento convencionales (véase, por ejemplo, las últimas ediciones del Merck Index y el Physician’s Desk Reference; NCCN Practice Guidelines in Oncology)).
La terapia de combinación con una citotoxina puede sensibilizar el cáncer o el tumor para la administración de una terapia de cáncer adicional. Por consiguiente, la presente invención contempla terapias de combinación para prevenir, tratar y/o prevenir la recurrencia de cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de una citotoxina antes, después o simultáneamente con una dosis reducida de un agente terapéutico contra el cáncer. Por ejemplo, el tratamiento inicial con una citotoxina puede aumentar la sensibilidad de un cáncer o tumor contra una exposición posterior con una dosis de agente terapéutico contra el cáncer. Esta dosis es próxima a, o por debajo de, el intervalo inferior de dosificaciones convencionales cuando el agente terapéutico contra el cáncer se administra en solitario o en ausencia de una citotoxina. Cuando se administra simultáneamente, la citotoxina puede administrarse separada de la terapia contra el cáncer y opcionalmente mediante un modo de administración diferente.
En otra realización, se administra una citotoxina en combinación con al menos otro agente inmunoterapéutico.
En otra realización, se administra una citotoxina en combinación con un régimen de radioterapia. La terapia también puede comprender cirugía y/o quimioterapia. Por ejemplo, la citotoxina puede administrarse en combinación con radioterapia y cisplatino (Platinol), fluorouracilo (5-FU, Adrucil), carboplatino (Paraplatino) yo paclitaxel (Taxol). El tratamiento con la citotoxina permite el uso de dosis inferiores de radiación y/o tratamiento de radiación menos frecuentes, que pueden por ejemplo reducir la frecuencia de angina grave que impide la función de deglución posiblemente dando como resultado una pérdida de peso o deshidratación no deseadas.
En otra realización, se administra una citotoxina en combinación con una o más citocinas que incluyen, sin limitación, una linfocina, factores de necrosis tumoral, citocina similar al factor de necrosis tumoral, linfotoxina, interferón, proteína inflamatoria de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos, interleucina (incluyendo sin limitación, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15, interleucina-18), y sus variantes, incluyendo una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
En otra realización adicional, se administra una citotoxina en combinación con una vacuna contra el cáncer que incluye, sin limitación, células o tejidos autólogos, células o tejidos no autólogos, antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, gonadotropina coriónica humana, vacuna viva BCG, proteínas de linaje melanocítico y antígenos específicos mutados tumorales.
En otra realización adicional, se administra una citotoxina en asociación con terapia hormonal. Los agentes terapéuticos hormonales incluyen sin limitación, un agonista hormonal, un antagonista hormonal (por ejemplo, flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolide (LUPRON)) y esteroides (por ejemplo, dexametasona, retinoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, deshidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógenos, testosterona, progestina).
En otra realización adicional, se administra una citotoxina en asociación con un programa de terapia génica para tratar o prevenir el cáncer.
En otra realización adicional, se administra una citotoxina dirigida a Ep-CAM en combinación con uno o más agentes que aumentan la expresión de Ep-CAM en las células tumorales de interés. Preferentemente la expresión de Ep-CAM aumenta de tal manera que un mayor número de moléculas Ep-CAM se expresen sobre la superficie de las células tumorales. Por ejemplo, el agente puede inhibir los ciclos normales de endocitosis de antígeno Ep-CAM. Dicho tratamiento de combinación puede mejorar la eficacia clínica de la citotoxina dirigida a Ep-CAM en solitario, o con otras terapias cancerosas o radioterapia. En realizaciones no limitantes específicas, el agente que aumenta la expresión de Ep-CAM en las células tumorales es el tartrato de vinorrelbina (Navelbine) y/o paclitax (Taxol). Véase, por ejemplo Thurmond y col., 2003, "Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism." Cancer Immunol Immunother. Jul; 52(7): 429-37.
La terapia de combinación puede por tanto aumentar la sensibilidad del cáncer o tumor para administrar la citotoxina y/o agentes terapéuticos contra el cáncer adicionales. De esta manera, pueden ser posibles ciclos de tratamiento más cortos reduciendo por lo tanto los acontecimientos tóxicos. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una citotoxina y al menos otro agente terapéutico contra el cáncer durante un ciclo de tratamiento corto. La duración del ciclo puede variar de acuerdo con el agente terapéutico contra el cáncer específico que se use. La invención también contempla administración continua o discontinua, o dosis diarias divididas en diversas administraciones parciales. Una duración de ciclo apropiada de un agente terapéutico contra el cáncer específico se apreciará por los expertos en la técnica y la invención contempla la valoración continuada de programas de tratamiento óptimos para cada agente terapéutico contra el cáncer. En la técnica se conocen guías específicas para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Therasse y col., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada," J Natl Cancer Inst. 2 Feb; 92(3): 205-16.
Como alternativa, pueden desearse ciclos de tratamiento más largos. Por consiguiente, la duración del ciclo puede variar de aproximadamente 10 a 56, de 12 a 48, de 14 a 28, de 16 a 24 o de 18 a 20 días. La duración del ciclo puede variar de acuerdo con el agente terapéutico contra el cáncer específico en uso.
La presente invención contempla al menos un ciclo, preferentemente más de un ciclo durante el cual se administra un solo agente terapéutico contra el cáncer o series de agentes terapéuticos. Un número total de ciclos apropiado y el intervalo entre los ciclos se apreciarán por un experto en la materia. El número de ciclos puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 ciclos. El intervalo entre ciclos puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días. La invención contempla la evaluación continua de regímenes de tratamiento óptimos para cada citotoxina y agentes terapéuticos contra el cáncer adicionales.
En otra realización, se proporciona un procedimiento para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero con cáncer que comprende las etapas de identificar epítopos de linfocitos T de bouganina que tienen una propensión reducida por linfocitos T activados; preparar una citotoxina de la invención que tenga uno o más de los epítopos de linfocitos T y suspender la proteína en un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptables.
La invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero con cáncer que comprende una citotoxina de la invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Las citotoxinas de la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas para la administración a sujetos de una forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo. Por “forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo” se entiende una forma de la sustancia a administrar en la que se sobrepasa cualquiera de los efectos tóxicos por los efectos terapéuticos. Las sustancias pueden administrarse a organismos vivos incluyendo seres humanos y animales. La administración de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se define como una cantidad eficaz a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para conseguir el resultado deseado: por ejemplo una cantidad terapéuticamente activa de una sustancia puede variar de acuerdo con factores tales como patología, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo para suscitar una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diversas dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente como se indica mediante las exigencias de la situación terapéutica.
La sustancia activa puede administrarse de una manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc.), administración oral, inhalación, administración transdérmica (tal como una crema tópica o pomada, etc.) o aplicaciones de supositorio. Dependiendo de la vía de administración, la sustancia activa puede revestirse de un material para proteger el compuesto de la acción de las enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse por procedimientos en sí mismos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden administrarse a sujetos tal como una cantidad eficaz de la sustancia activa combinada en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente adecuado. Se describen vehículos adecuados, por ejemplo, en Remington Pharmaceutical Sciences (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., Estados Unidos 1985). Basándose en esto, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y contenidos en soluciones tampón con un pH adecuado e isoosmótico con los fluidos fisiológicos.
Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en procedimientos para tratar animales incluyendo mamíferos, preferentemente seres humanos con cáncer. Se prevé que las composiciones sean particularmente útiles para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B. La dosificación y tipo de citotoxina a administrar dependerá de diversos factores que pueden fácilmente controlarse en sujetos humanos. Dichos factores incluyen la etiología y gravedad (grado y fase) de neoplasia.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración directa incluyen sin limitación polvos liofilizados
o soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas o no acuosas, que adicionalmente pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que las composiciones sean sustancialmente isotónicas con la sangre del receptor deseado. Otros componentes que pueden estar presentes en dichas composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerinas y aceites vegetales, por ejemplo. Pueden prepararse soluciones o suspensiones de inyección improvisada a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. Las citotoxinas pueden proporcionarse, por ejemplo, pero sin ningún tipo de limitación, como un polvo liofilizado que se reconstituye con agua estéril o solución salina antes de la administración al paciente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen composiciones esencialmente químicamente inertes y no tóxicas que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de la composición farmacéutica. Como ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones salinas, soluciones de glicerol, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), diolesilfosfotidil-etanolamina (DOPE) y liposomas. Dichas composiciones deben contener una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración directa al paciente.
En otra realización, una composición farmacéutica comprende una fitotoxina y uno o más agentes terapéuticos contra el cáncer adicionales opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable que incluye, sin limitación, aquellas formas con grupos amino libres tales como los derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como los derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
En la medida en que la presente invención se refiere a bouganina modificada, composiciones que contienen dichas proteínas bouganinas modificadas o fragmentos de proteínas bouganinas modificadas y composiciones relacionadas
deberían considerarse dentro del ámbito de la invención. Un ejemplo pertinente en cuanto a esto debe ser el desarrollo de estrategias de inducción a la tolerancia mediadas por péptidos en las que uno o más de los péptidos desvelados se administran a un paciente con una intención inmunoterapéutica. Por consiguiente, moléculas peptídicas sintéticas, por ejemplo una o más de las que comprenden toda o parte de cualquiera de las regiones epitópicas R1 – R3 como se ha definido anteriormente. Dichos péptidos se consideran realizaciones de la invención.
En un aspecto adicional de la presente invención se refiere a procedimientos para el tratamiento terapéutico de seres humanos usando las composiciones de bouganina modificada. Para la administración a un individuo, debe producirse cualquiera de las composiciones modificadas preferentemente al menos con una pureza del 80 % y sin pirógenos y otros contaminantes.
La presente invención también proporciona un kit que comprende una cantidad eficaz de una citotoxina, opcionalmente en combinación con uno o más agentes terapéuticos contra el cáncer junto con instrucciones para el uso de los mismos para el tratamiento del cáncer.
(D) Péptidos de epítopos de linfocitos T
Una realización adicional de la invención es un péptido del epítopo de linfocitos T. En un ejemplo, el péptido de epítopo de linfocitos T es capaz de suscitar un índice de estimulación mayor de 1,8 en un ensayo con linfocitos T, más preferentemente mayor de 2,0. El péptido de epítopo de linfocitos T de la invención puede unirse al MCH de clase II.
En una realización de la invención el péptido del epítopo de linfocito T comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de R1, R2 o R3 (anteriores). En otra realización, la secuencia peptídica del epítopo de linfocito T tiene una identidad de aminoácidos mayor del 90 % con una cualquiera de las secuencias peptídicas R1, R2 o R3; más preferentemente, el péptido del epítopo de linfocitos T tiene una identidad de aminoácidos mayor del 80 % con cualquiera de las secuencias peptídicas R1, R2 o R3.
El término “péptido” como se usa en el presente documento es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos están unidos entre sí por un enlace peptídico (definido en el presente documento más adelante). Existen 20 aminoácidos de origen natural diferentes implicados en la producción biológica de péptidos, y cualquier cantidad de ellos puede unirse en cualquier orden para formar una cadena o un anillo peptídico. Los aminoácidos de origen natural empleados en la producción biológica de péptidos tienen todos la configuración L. Los péptidos sintéticos pueden prepararse empleando procedimientos sintéticos convencionales, utilizando L aminoácidos, D aminoácidos o diversas combinaciones de aminoácidos de las dos diferentes configuraciones. Algunos péptidos solo contienen algunas unidades de aminoácidos. Los péptidos cortos, por ejemplo los que tienen menos de diez unidades de aminoácidos, se denominan algunas veces “oligopéptidos”. Otros péptidos contienen una gran cantidad de restos de aminoácidos, por ejemplo hasta 100 o más, y se denominan “polipéptidos”. Por convención, un “polipéptido” puede considerarse como cualquier cadena peptídica que contenga tres o más aminoácidos, mientras que un “oligopéptido” normalmente se considera como un tipo particular de polipéptido “corto”. Por tanto, como se usa en el presente documento, se entiende que cualquier referencia a un “polipéptido” también incluye un oligopéptido. Además, cualquiera referencia a un “péptido” incluye polipéptidos, oligopéptidos y proteínas. Cada disposición diferente de aminoácidos forma diferentes polipéptidos o proteínas. El número de polipéptidos y por lo tanto el número de diferentes proteínas que pueden formarse es prácticamente ilimitado.
Otra realización de la invención es el uso de péptidos de epítopos de linfocitos T de la invención para preparar las proteínas bouganina modificadas de la invención y péptidos de epítopos de linfocitos T modificados.
Una realización adicional de la invención es un péptido de epítopos de linfocitos T modificado tal como el péptido de epítopos de linfocitos T modificado que tiene una propensión reducida para activar linfocitos T humanos en comparación con el péptido de epítopo de linfocito T no modificado. En un ejemplo, los péptidos de epítopo de linfocitos T modificados de la invención contienen modificaciones de tal manera que cuando se someten a ensayo en un ensayo de linfocitos T suscitan un índice de estimulación reducido en comparación con el péptido del epítopo de linfocitos T no modificado.
En una realización de la invención el péptido del epítopo de linfocito T modificado tiene la siguiente secuencia: AKX1 DRKX2LX3LGVX4KL
en la que al menos uno de X1 , X2 , X3 y X4 se modifica de la secuencia no modificada, de la siguiente manera:
X1 es T o A o Q;
X2 es G o A;
X3 es Q o G; y
X4 es N o D o T o A o R o Q o Eo Go Ho Ko S (SEC ID Nº: 8).
En otra realización de la invención el péptido del epítopo de linfocito T modificado tiene la siguiente secuencia:
LGVX4KLEFSIEAIHG
en la que X4 es N o Do T o A o R o Q o E o G o H o K o S (SEC ID Nº: 9).
En una realización adicional de la invención el péptido de epítopo de linfocito T modificado tiene la siguiente
secuencia:
NGQEX5AKFFLIVIQM
en la que X5 es Q o A (SEC ID Nº: 10).
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de epítopo de linfocito T o péptidos de epítopo de linfocitos T modificados de la invención.
Las siguientes figuras, listados de secuencias y ejemplos se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención.
Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Procedimiento para el mapeo de epítopos en bouganina usando ensayos de proliferación de linfocitos T humanos sin tratar
Se sintetizaron péptidos que incluyen la secuencia de la proteína bouganina madura, como describen Den Hartog y col [mencionado anteriormente]. La longitud de cada péptido es de 15 aminoácidos y sucesivos péptidos se solapan en 12 restos. La secuencia de estos péptidos y su numeración se indican en la TABLA 1.
Los péptidos se usaron en ensayos de proliferación de linfocitos T con PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de donantes sin tratar (es decir sin sensibilización conocida a bouganina). Se seleccionaron 20 PBMC donantes para conseguir una cobertura óptima de todos los alotipos de MHC de clase II. La cobertura alotípica es un exceso del 85 %. Los alotipos HLA-DR se muestran en la TABLA 2.
Las PBMC se estimularon con péptidos individuales en cultivos por triplicado durante 7 días antes de evaluar la proliferación mediante incorporación de 3H-timidina (3H-Thy). Todos los péptidos se sometieron a ensayo a dos concentraciones diferentes (1 μM y 5 μM). Los índices de estimulación (I.E.) se calcularon como la cantidad de 3H incorporada, dividido entre la cantidad de 3H incorporada en células control estimuladas de modo simulado.
Se obtuvieron capas leucocíticas de sangre humana conservada durante menos de 12 horas del National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, RU). El Ficoll-paque se obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, RU). Los medios AIM V aséricos para el cultivo de linfocitos humanos primarios y que contenían Lglutamina, estreptomicina 50 μg/ml, gentamicina 10 μg/ml y albúmina de suero humano al 0,1 % procedían de Gibco-BRL (Paisley, RU). Los péptidos sintéticos se obtuvieron de Eurosequence (Groningen, Países Bajos) y Babraham Technix (Cambridge, RU).
Los eritrocitos y leucocitos se separaron del plasma y las plaquetas centrifugando suavemente las capas leucocíticas. La fase superior (que contenía el plasma y las plaquetas) se retiró y se desechó. Los eritrocitos y leucocitos se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato 1:1 (PBS) antes de estratificarse sobre una ficoll-paque de 15 ml (Amersham Pharmacia, Amersham RU). La centrifugación se realizó de acuerdo con las condiciones recomendadas por los fabricantes y las PBMC se recogieron de la interfaz de suero+PBS/ficoll paque. Las PBMC se mezclaron con PBS (1:1) y se recogieron por centrifugación. El sobrenadante se retiró y se descartó y el sedimento de PBMC se resuspendió en PBS a 50 ml. Las células se sedimentaron de nuevo por centrifugación y se descartó el sobrenadante de PBS. Las células se resuspendieron usando 50ml de medio AIM V y en este momento se realizó el recuento y la viabilidad se evaluó usando una exclusión de colorante de azul tripano. De nuevo las células se recogieron por centrifugación y el sobrenadante se desechó. Las células se resuspendieron para la conservación criogénica a una densidad de 3 x 107 por ml. El medio de conservación fue suero humano AB termoinactivado 90 % v/v (Sigma, Poole, RU) y DMSO al 10 % (v/v) (Sigma, Poole, RU). Las células se transfirieron a un envase de congelación regulado (Sigma) y se colocó a -70 ºC durante una noche. Cuando se requirieron para su uso, las células se descongelaron rápidamente en un baño con agua a 37 ºC antes de transferir al medio AIM V precalentado de 10 ml.
Las PBMC se estimularon con antígenos de proteína y péptidos en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 2 x 105 PBMC por pocillo. Las PBMC se incubaron durante 7 días a 37 ºC antes de pulsar con 3H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, RU). Dos péptidos de control denominados C-32 y C-49 que previamente habían demostrado que eran inmunogénicos y una potente proteína completa de Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) de antígeno sin recuerdo se usó en cada ensayo del donante. C-32 = secuencia PKYVKQNTLKLAT de restos de hemaglutinina gripal 307-319 (SEC ID Nº: 127). C-49 = secuencia KVVDQIKKISKPVQH de Clamidia HSP 60 (SEC ID Nº: 128).
Los péptidos se disolvieron en DMSO a una concentración final de 10 mM. Estas soluciones madre se diluyeron después a 1/500 en medios AIM V (concentración final 20 μM). Los péptidos se añadieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano para proporcionar una concentración final de 1 y 5 μM en 100 μl. La viabilidad de las PBMC descongeladas se evaluó mediante exclusión con colorante azul tripano, después las células se resuspendieron a una densidad de 2 x 106 células/ml, y se transfirieron 100 μl (2 x 105 PBMC/pocillo) a cada pocillo que contenía los péptidos. Se ensayaron cultivos de los pocillos por triplicado a cada concentración peptídica. Las placas se incubaron durante 7 días en una atmósfera húmeda de CO2 al 5 % a 37 ºC. Las células se impulsaron durante 18-21
horas con 1 μCi 3H-Thy/pocillo antes de recoger sobre alfombrillas de filtro. Se determinaron los valores de CPM usando un contador de placa beta top de Wallac microplate (Perkin Elmer). Los resultados se expresaron como índices de estimulación, derivados de la división de la puntuación de proliferación (por ejemplo recuentos por minuto de radiactividad) medido en el péptido de ensayo por la puntuación medida en células no puestas en contacto con un péptido de ensayo.
El resumen de los resultados del ensayo anterior indica la presencia de cuatro epítopos de linfocitos T, correspondientes a los péptidos 41, 44 y 50 en la región procesada madura de la proteína y el péptido 88 en la forma no procesada. Dado que el epítopo en el péptido 88 no forma parte de la proteína madura, este se ignora en el esquema de la presente invención.
Para el péptido 41 (denominado región epitópica R1), hay cuatro donantes sensibles a este péptido, los donantes 4, 5, 10 y 11. Los I.E. para estos a 5 μM son 3,6, 4,9, 2,1 y 2,0 respectivamente.
Para el péptido 44 (denominado región epitópica R2). Existen dos donantes sensibles a este péptido; los donantes 4
(I.E. = 3,5) y 11 (I.E. = 2,3). Los péptidos 43 y 45 colindantes indujeron un menor nivel de proliferación de linfocitos T dado que ambos péptidos se solapan en 12 aminoácidos con el péptido 44.
Para el péptido 50 hubo 2 donantes sensibles a este péptido; los donantes 4 (I.E. = 2,9) y 14 (I.E. = 2,0). El péptido 51 indujo un menor nivel de proliferación de linfocitos T en el donante 14 (I.E. > 1,9).
Los tipos tisulares para todas las muestras PBMC se ensayaron usando un sistema de reactivo disponible en el mercado (Dynal, Wirral, RU). Los ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos recomendados por el proveedor y reactivos auxiliares convencionales y sistema de electroforesis con agarosa. En la TABLA 2 se muestran las especificidades alotípicas de cada una de las muestras de los donantes sensibles.
Ejemplo 2: Clonación de la bouganina procedente de Bougainvillea spectabilis
Se extrajo ARN total de las hojas de Bougainvillea spectabilis usando el sistema de aislamiento de ARN Total SV y protocolos proporcionados por el fabricante (Promega, Southampton, RU). Tejido foliar reciente se molió hasta convertirlo en un polvo fino con nitrógeno líquido y se usaron aproximadamente 50 mg de tejido molido para el aislamiento de ARN. La calidad y cantidad de ARN se comprobó visualizando sobre un gel de agarosa al 1 % y el gen de bouganina se amplificó a partir del ARN total usando el sistema ’Access RT-PCR System’ (Promega) usando aproximadamente 1 μg de ARN por reacción y con los cebadores específicos de genes OL1032 y OL1033. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la siguiente TABLA 3. Esta reacción generó un fragmento de 1242 pb que incluyen la secuencia líder nativa y la secuencia de bouganina de longitud completa. Este fragmento se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega), siguiendo las instrucciones del kit y se denominó pBou1. La secuencia se confirmó por secuenciación de ADN.
El gen de bouganina se transfirió al pET21a (Novagen, Nottingham, RU) por clonación con PCR usando como molde el plásmido pBou1. Se añadió la secuencia líder A pelB (pectato liasa) al extremo 5’, y se añadió una secuencia que codifica una etiqueta de 6 histidinas en el extremo 3’ de la secuencia codificante de la bouganina. La secuencia líder pelB se amplificó a partir del vector pPMI-his [Molloy, P. y col, (1995) J. Applied Bacteriology, 78: 359-365] usando el cebador OL1322 (que incorpora un sitio Nde1) y el cebador OL1067. El fragmento de bouganina-his se amplificó de pBou1 usando OL1068 y OL1323 (que incorpora un sitio Not1). La secuencia líder peIB se fusionó en fase con el fragmento de bouganina-his usando PCR solapante y el fragmento resultante se clonó en pGEM-T Easy (Promega). La confirmación de la secuencia posterior del fragmento peIB-bouganina-his se clonó como un fragmento Nde1-Not1 en pET21a digerido con Nde1-Not1. Este clon se denominó pBou32.
Ejemplo 3: Construcción de proteínas bouganina mutantes
Se diseñaron diversas proteínas bouganina modificadas (mutantes) usando los datos proporcionados por el procedimiento del mapeo de epítopo de linfocitos T y se usó un programa informático que podía simular la unión de péptidos con el surco de unión a MHC de clase II humano. Esta última estrategia se describe con detalle en otro sitio [documento WO 02/069232]. Se construyeron genes variantes y las proteínas mutantes se ensayaron con respecto a la actividad funcional. En general, las proteínas “de un solo mutante” que contienen cada una una sustitución de aminoácidos se construyeron en primer lugar y se ensayaron, después los genes de proteínas modificadas activas se combinaron para producir proteínas modificadas múltiples sustituidas.
Se construyeron genes mutantes usando un procedimiento de PCR solapante en el que el codón de aminoácido mutante se introdujo en el gen mediante el uso de un mutante en “cebador de solapamiento”. El esquema es bien conocido en la técnica y se describe con detalla en otro sitio [Higuchi, y col (1900) Nucl. Acids Res. 16: 7351]. Un total de 37 proteínas modificadas de un solo mutante se construyeron y se ensayaron con respecto a la actividad funcional conservada. Además, en todos los análisis también se construyó y se ensayó una proteína modificada como control negativo que contenía una sustitución Y70A. Una de las 37 proteínas modificadas “de un solo mutante” de hecho contenía dos sustituciones directamente adyacentes (E151T e I152E) y se contaron en el presente documento como un solo mutante. Las sustituciones ensayadas y los valores de actividad correspondientes se proporcionan en la TABLA 4.
Se construyó un total de 11 proteínas modificadas de múltiple sustitución y se ensayaron con respecto a la actividad conservada. Las sustituciones ensayadas y los valores de actividad correspondientes se proporcionan en la TABLA 5.
La TABLA 6 describe las secuencias de las proteínas modificadas por sustitución. La TABLA 7 enumera algunas secuencias específicas.
En todos los casos, las proteínas se purificaron y ensayaron de acuerdo con los procedimientos indicados en los ejemplos 4 y 5 más adelante.
Ejemplo 4: Expresión y purificación de la proteína bouganina
El plásmido pBou32 se transformó en líneas competentes BL21(DE3) (Novagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se seleccionó en placas LB (Invitrogen, Paisley, RU) que contenían carbenicilina 50 μg/ml. Para inocular 50 ml de caldo 2xYT (Invitrogen) se usó una colonia reciente de esta transformación, sin antibiótico, y esto se cultivó con agitación de 250 rpm a 37 ºC hasta alcanzar una DO600 = 1,5-2,0. Después el cultivo se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente, y las células se resuspendieron en 5 ml de IPTG 1 mM más 2xYT reciente. Este cultivo se incubó a 30 ºC en agitación a 300 rpm durante 1,5 horas y las células se recogieron por centrifugación y el sobrenadante se desechó.
El sedimento celular se resuspendió en 1 ml de PEB2 (Tris-HCl 50 mM pH8, sacarosa al 20 %, lisozima 1 mg/ml, 1x Comprimido de Inhibidor de Proteasa Completo (Roche, Lewes, RU) y se incubó en hielo durante 1 hora con suave agitación. El residuo celular se centrifugó a 14.000 rpm a 4 ºC y el sedimento se desechó. El sobrenadante resultante se denominó ahora ‘fracción periplásmica’. La proteína bouganina se purificó de la fracción periplásmica mediante cromatografía de columna con afinidad de níquel usando una “columna centrífuga” disponible en el mercado y siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen, Crawley, RU). El material resultante se dializó frente a 4 litros de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 0,138 M, KCl 0,0027 M, pH 7,4) durante una noche a 4 ºC usando un ’Slide-A-Lyzer’ de límite de peso molecular 10.000 (Pierce, Chester, RU). Después de diálisis, la concentración de proteína se calculó usando el Kit de Ensayo Micro BCA (Pierce) y las muestras se conservaron a 20 ºC.
La concentración de proteína bouganina se determinó adicionalmente usando un sistema de ensayo basado en ELISA. Brevemente, se generó antisuero contra bouganina (Genovac, Friburgo, Alemania) mediante la inmunización genética de dos ratas con un plásmido que expresaba bouganina. Para el ELISA, se capturó la bouganina recombinante en placas revestidas con Ni-agarosa mediante su etiqueta de histidina y posteriormente se detectó con el antisuero de rata y un anticuerpo anti Fc de rata conjugado con HRP secundario (Sigma, Poole, RU). Como un patrón, en cada determinación se usó una gran preparación de bouganina de tipo silvestre expresada en E. coli y se cuantificó usando el ensayo de proteína total.
Ejemplo 5: Ensayo de actividad de bouganina
La actividad de las proteínas bouganina de tipo silvestre y modificadas (mutantes) se ensayó midiendo su capacidad para inhibir la síntesis de proteínas en un ensayo de síntesis de proteína acelular.
Una mezcla de 10 μl de mezcla de Transcripción/Traducción Acoplada a TNT (Promega), metionina 20 μM, 120 ng de ADN luciferasa de pT7 (Promega) y diluciones en serie de proteína bouganina de tipo silvestre mutante en un volumen final de 12,5 μl se incubaron a 30 ºC durante una hora, después de lo cual la reacción se detuvo por la adición de 100 μl de reactivo de ensayo luciferasa ‘SteadyGlow’ (Promega). La actividad luciferasa se midió usando un contador de luminiscencia Wallac. La proteína bouganina activa se detectó como una disminución en la actividad luciferasa medida. Cada proteína bouganina modificada se sometió a ensayo al menos en 5 concentraciones, con cada punto de dato por duplicado. Los controles positivos y negativos se incluyeron en cada experimento.
En la TABLA 4 se muestran los resultados de proteínas mutantes sencillas. Los resultados de proteínas bouganina modificada mutantes múltiples se muestran en la TABLA 5. En cada caso los resultados se expresan con respecto a la actividad de la proteína de tipo silvestre. Todos los ensayos se realizaron con la inclusión de una proteína bouganina mutante inactiva con una sustitución Y70A.
Además, los resultados del ensayo luciferasa pueden representarse gráficamente mostrando el % de actividad luciferasa con respecto al control frente a la concentración de proteínas de la bouganina añadida. Ejemplos de dichas representaciones gráficas se muestran en la Figura 1 que representa los resultados determinados mediante dos proteínas bouganina mutantes múltiples diferentes.
Ejemplo 6: Ensayo de secuencias de bouganina variante para la pérdida de epítopos de linfocitos T.
La proteína modificada múltiple denominada Bou156 se seleccionó para ensayar adicionalmente usando un ensayo de inmunogenicidad. Esta variante contiene las sustituciones V123A, D127A, Y133N e I152A. El ensayo de inmunogenicidad implica el uso de células vivas que pueden resultar dañadas ensayando el uso de la proteína bouganina completa, por lo tanto esos ensayos se realizaron usando péptidos sintéticos que comprendían las sustituciones incorporadas en la variante Bou156. Los péptidos ensayados se indican en la TABLA 8. Los ensayos se
realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 1 (anterior) usando un grupo de donantes PBMC de 20 individuos. Los péptidos se ensayaron por triplicado para cada muestra de donante a dos concentraciones peptídicas finales diferentes (1 μM y 5 μM).
Los resultados se expresan como IE por péptido por muestra donante y se muestran en la Figura 2. Del-41 es la secuencia peptídica AKADRKALELGVNKL (SEC ID Nº: 29). Del-44 es la secuencia peptídica LGVNKLEFSIEAIHG (SEC ID Nº: 30). Del-50 es la secuencia peptídica NGQEAAKFFLIVIQM (SEC ID Nº: 31). Ninguno de los péptidos modificados indujeron una respuesta de linfocitos T en ninguno de los donantes (IE<2). En cambio, un péptido de control inmunogénico estimuló linfocitos T de 6 donantes (IE>2).
Ejemplo 7: VB6-845: modificación genética recombinante de un anticuerpo Fab específico de Ep-CAM para la administración óptima de bouganina des-inmunizada (De-bouganina).
Para este ejemplo y el Ejemplo 8, la bouganina des-inmunizada usada es Bou156.
Las citotoxinas que se dirigen a tumores se componen de la región variable de un anticuerpo unido a una toxina bacteriana, fúngica o vegetal. El presente estudio ilustra que las construcciones de bouganina desinmunizadas de la invención, que comprenden bouganina desinmunizada unida a un resto diana tienen inmunogenicidad reducida, aunque aún conservan su actividad biológica. La TABLA 12 demuestra la unión del anticuerpo Ep-CAM a diversos tipos de tumores y por tanto muestra que este puede usarse para tratar estos tipos de cánceres.
Construcción de bouganina desinmunizada: resto de direccionamiento dirigido a Ep-CAM unido a de-bouganina
VB5-845, una versión Fab de un anticuerpo scFv anti-Ep-CAM, se unió genéticamente a una forma desinmunizada de bouganina (de-bouganina), Bou 156, una fuerte proteína inactivadora de ribosomas (RIP) de tipo I derivada de plantas, para crear la construcción anticuerpo-toxina VB6-845. La Figura 3 ilustra la construcción VB6-845. La Figura 3A ilustra la unidad dicistrónica de la pro-VB6-845, con las secuencias líder pelB. La secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 16) y la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 15) se proporcionan en la Figura 3B. La Figura 3C ilustra la proteína VB6-845 ensamblada, que se describe más adelante con más detalle. El ensayo de esta construcción, ilustra que la construcción conserva su actividad biológica (citotoxidad) y la especificidad del resto diana (anticuerpo Ep-CAM).
Orientación de la construcción de bouganina desinmunizada
Para determinar la orientación óptica del anticuerpo-de-bouganina, se generaron diversas formas de una unidad de expresión dicistrónica, se expresaron y se ensayaron con respecto a la fuerza.
En cada caso, la unida dicistrónica se clonó en el vector pING3302 (Figura 4) bajo el control del promotor araBAD inducible por arabinosa y transformado en E. coli E104. Después de la inducción, la presencia de la secuencia líder peIB dirigió la secreción de la proteína de fusión Fab-de-bouganina en el sobrenadante de cultivo. El engarce escindible permitió que la de-bouganina se escindiera desde el resto diana y ejerciera su actividad biológica. En una realización, el engarce es un engarce de furina, aunque un experto en la técnica apreciará que pueden ser adecuados otros engarces escindibles. Los engarces preferidos podrían seleccionarse basándose en su especificidad diana, y entorno. Un ejemplo de las construcciones fabricadas y ensayadas son las siguientes:
Figura 3: VB6-845, en el que la de-bouganina (Bou156) está unida al extremo C del dominio CH mediante un engarce de furina. La Figura 3A ilustra la unidad dicistrónica de las secuencias pro, la Figura 3B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 15) y la secuencia de aminoácidos de las secuencias pro (SEC ID Nº: 16) y la Figura 3C ilustra la proteína VB6-845 ensamblada sin las secuencias peIB.
La Figura 5 ilustra la construcción anti-Ep-CAM Fab de control sin la toxina vegetal, de-bouganina (VB5-845). La Figura 5A ilustra la unidad dicistrónica de las secuencias pro, la Figura 5B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 17) y la secuencia de aminoácidos de las secuencias pro (SEC ID Nº: 18) y la Figura 5C ilustra la proteína VB6-845 ensamblada sin las secuencia peIB.
La Figura 6 ilustra la construcción Fab anti-Ep-CAM de bouganina, VB6-845-CL-de-bouganina, en la que la Bou156 está unida en el extremo C del dominio CL. La Figura 6A ilustra la unidad dicistrónica de las secuencias pro, la Figura 6B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 19) y la secuencia de aminoácidos de las secuencias pro (SEC ID Nº: 20) y la Figura 6C ilustra la proteína VB6-845-CL-de-bouganina ensamblada sin las secuencias peIB.
La Figura 7 ilustra la construcción Fab anti Ep-CAM, de-bouganina, VB6-845-NVH-de-bouganina, en la que Bou156 está unido al extremo N del dominio VH. La Figura 7A ilustra las unidades dicistrónicas de las secuencias pro, la Figura 7B ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 21) y la secuencia de aminoácidos de las secuencias pro (SEC ID Nº: 22) y la Figura 7C ilustra la proteína VB6-845-NVH-de-bouganina ensamblada sin las secuencias peIB.
La Figura 8 ilustra la construcción Fab anti-Ep-CAM VB6-845-NVL-de-bouganina, en la que Bou156 está unida al extremo N del dominio VL. La Figura 8A ilustra la unidad dicistrónica de las secuencias pro, la Figura 8B ilustra la
secuencia codificante de ácido nucleico (SEC ID Nº: 23) y la secuencia de aminoácidos de las secuencias pro (SEC ID Nº: 24) y la Figura 8C ilustra la proteína VB6-845-NVL-de-bouganina ensamblada sin las secuencias peIB.
En una realización, la molécula de-bouganina está unida al extremo C terminal de las cadenas pesada o ligera. La configuración óptima comprendía una secuencia líder peIB adyacente al dominio VH-CH con una etiqueta de afinidad de histidina N terminal como la primera unidad. Inmediatamente después va la segunda unidad que comprende el dominio peIB-VL-CL unido a la de-bouganina por un engarce sensible a proteasa. (Figura 6) Para las construcciones en las que la de-bouganina se recolocó en el extremo N terminal, el análisis de transferencia de Western no mostró ningún producto detectable y solo la de-bouganina unida a extremo C (construcciones de las Figuras 3 y 6) produjo una proteína soluble intacta (Figura 9) con buenas propiedades de unión a las líneas celulares Ep-CAM positivas, como se ilustra en los ensayos de reactividad detectados por citometría de flujo. En el análisis de transferencia de Western, la Figura 9 ilustra la expresión de VB6-845 y VB6-845 CL-de-bouganina en el sobrenadante de células E104 inducidas a escala de laboratorio. Una parte alícuota del sobrenadante, 16 microlitros, en condiciones no reductoras, se cargó en un gel de acrilamida SDS-PAGE y se analizó mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-4D5 policlonal de conejo, seguido por un anticuerpo anti-conejo (1/2000) de cabra o un anticuerpo anti-cadena ligera Kappa humana conjugado con HRP (1/1000) de cabra, para confirmar la identidad y tamaño de la proteína recombinante. La flecha indica la VB6845 (construcción de la Figura 3) de longitud completa y la VB6-845-CL-de-bouganina (construcción de la Figura 6). El análisis de transferencia de Western del sobrenadante de cultivo de células E104 no inducidas no reveló bandas correspondientes lo que demuestra la especificidad de los anticuerpos (no mostrado).
Los resultados de los ensayos de reactividad con VB6-845 (Figura 3) y VB6-845-CL-de-bouganina (Figura 6) con respecto a las líneas celulares Ep-CAM positivas CAL 27 y NIH:OVCAR-3 en comparación con un control (línea celular Ep-CAM-negativa, A-375) se ilustran en la Figura 10A. Los resultados fueron comparables a los mismos ensayos de reactividad realizados con otra construcción anti-Ep-CAM, VB6-845-gelonina, en el que la de-bouganina está sustituida por otra toxina vegetal, la gelonina (Véase Figura 14C que muestra su secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 26) y secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº: 25). Los resultados del ensayo de reactividad con la construcción de gelonina se ilustran en la Figura 10B. La adición de un segundo dominio de de-bouganina en la molécula con la orientación óptima no produjo ningún producto.
Se realizaron ensayos de citometría de flujo incubando las construcciones o el control con 0,45 x 106 células durante una hora en hielo. Después de lavado, las construcciones unidas a la superficie celular se detectaron con un antibouganina de conejo (de la Figura 10A) o anti etiqueta His de ratón (Figura 10B) durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se incubaron con anti IgG de conejo de cabra conjugado con FITC (Figura 10A) y anti (IgG) de ratón de oveja conjugado con FITC (Figura 10B) durante 30 minutos en hielo. Posteriormente las células se lavaron, se resuspendieron en PBS FCS al 5 % que contenía yoduro de propidio para evaluar la unión del anticuerpo por citometría de flujo. No se detectaron cambios en la mediana de la fluorescencia después de incubación con VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina con A-375. Por otro lado, se observó un cambio notable en la mediana de la fluorescencia con líneas celulares Ep-CAM positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3 (Figura 10A). Como se ha indicado anteriormente, los resultados con VB6-845 fueron similares con la construcción de gelonina (Figura 10B).
Especificidad de Ep-CAM
Un ensayo de competencia de VB6-845 (construcción de la Figura 3) con Proxinium™, un formato scFv de VB6-845, pero que contenía exotoxina A de Pseudomonas, demostró que la especificidad Ep-CAM de VB6-845 permanecía sin modificar cuando se modificaba genéticamente en un formato Fab (Figura 11).
La Figura 11 ilustra los resultados de citometría de flujo del ensayo de competencia, con VB6-845 a 1 y 10 μg/ml y concentración en aumento de Proxinium™, que variaba de 0 a 100 μg/ml, cuando se incubó con células NIH:OVCAR-3 (línea celular tumoral Ep-CAM positiva). Después de 1 hora de incubación a 4 ºC, las células se lavaron y la VB6-845 unida se detectó con un anti-bouganina de conejo biotinilado seguido de estreptavidina-citocromo. Se realizó el mismo experimento con 4B5-PE que se usó como un control negativo. Las condiciones de la reacción fueron como se indica en la Figura 11.
Fuerza (actividad biológica)
Adicionalmente, ensayos acelulares (Figura 12) y con MTS (Figura 13A y B) demostraron que la de-bouganina conservaba su fuerza cuando se conjugaba con el fragmento Fab. El ensayo con MTS para medir la fuerza se realizó usando técnicas convencionales conocidas en la materia, y como se describe más detalladamente a continuación en el Ejemplo 8. Usando las líneas celulares Ep-CAM-positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3, el valor CI50 de VB6-845 fue de 3 a 4 nM y de 2 a 3 nM, respectivamente. En el caso de VB6-845-CL-de-bouganina, la fuerza se midió a de 1 a 2 nM para CAL 27 y de 0,6 a 0,7 nM frente a NIH:OVCAR-3. El desarrollo de la construcción Fab anti-Ep-CAM, que comprende un fragmento de anticuerpo diana tumoral humano unido a una bouganina desinmunizada debería permitir repetir la administración sistémica de este fármaco y producir un beneficio clínico mayor.
Recogida de las construcciones
Las construcciones pueden aislarse de los cultivos celulares por técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, si una etiqueta His se coloca en el extremo N de la construcción peptídica, la proteína Fab-bouganina puede
purificarse usando un procedimiento de captura quelante con Ni 2+. Como un ejemplo se usó el siguiente protocolo.
La realización de la fermentación de alimentación discontinua de variantes VB6-845 se realizó en un fermentador CHEMAP de 15 l usando medio TB. A una DO600 de 20 (semi-log), el cultivo se indujo con una mezcla de alimentación e inductor que contenía glicerol al 50 % y L-arabinosa 200 g/l. A las 30 horas postinducción, el cultivo se recogió, se centrifugó a 8000 rpm durante 30 minutos y las variantes VB6-845 se purificaron usando sepharose CM y columnas de sepharose quelantes cargadas con metal seguido de una columna de exclusión de tamaño. Brevemente, el sobrenadante se concentró y se diafiltró frente a fosfato sódico 20 mM pH 6,9 ± 0,1. El sobrenadante concentrado diafiltrado se aplicó después sobre una columna de sepharose CM equilibrada con fosfato sódico 20 mM, NaCl 25 mM, pH 6,9 ± 0,1. La columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, NaCl 25 mM, pH 6,9 ± 0,1, VB6-845 unido se eluyó posteriormente con fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,5 ± 0,1. El eluado de sepharose CM se ajustó para conseguir una concentración final de Tritón-X100 a 0,25 % y se aplicó a una columna de sepharose quelante cargada. La columna de sepharose quelante se lavó después con 3 tampones de lavado diferentes comenzando con fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, tritón-X100 al 0,25 %, pH 7,5 ± 0,1 seguido de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ± 0,1 y seguido de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, imidazol 10 mM, pH 7,5 ± 0,1. Después VB6845 unido se eluyó con fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, imidazol 250 mM pH 7,5 ± 0,1 y se recogió en fracciones de 2 ml. Se determinó la absorbancia a A280 para cada fracción y las fracciones con material agrupado se aplicaron sobre una columna de exclusión de tamaño S200 para obtener una pureza de >80 %. En una realización, para aumentar la pureza de la proteína y extraerla y retirar la endotoxina, la fracción SEC agrupada se diluyó 5 veces con NaPO4 20 mM, pH 7,5 y se hizo pasar a través de una columna de flujo rápido de 15 ml Q-sepharose equilibrada con NaPO4 20 mM, NaCl 25 mM pH 7,5 a un caudal de aproximadamente 5 ml/min. Después de la aplicación de la muestra a través de la columna, la columna se lavó con 10CV de tampón de equilibrio y el lavado se agrupó con el flujo continuo de Qsepharose inicial. El eluyente se concentró a ∼10 veces mediante el uso de una membrana de MWCO de 30 kDa (membrana Sartorius hidrosart) para conseguir una concentración final de 7,5 mg/ml. Después, se añadió Tween-80 a una concentración final de 0,1 %. El producto final se filtró de manera estéril y se conservó a -80 ºC. Las muestras en cada una de las etapas del proceso se analizaron mediante transferencia de Western después de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-4D5. La pureza se confirmó mediante tinción con azul coloidal. El nivel de expresión de variantes VB6-845 se determinó mediante análisis de transferencia de Western y ELISA.
Ejemplo 8: Caracterización funcional y biológica de VB6-845, un anticuerpo Fab específico de Ep-CAM recombinante genéticamente unido con la Bouganina des-inmunizada (de-bouganina).
Los agentes quimioterapéuticos son agentes muy citotóxicos que a menudo representan el patrón de cuidado en el tratamiento de muchos de los cánceres tumorales sólidos. La acción citotóxica de estos fármacos diana rápidamente divide las células, normales y tumorales, creando así diversos efectos secundarios clínicos adversos. VB6-845 es un anticuerpo Fab unido a una forma desinmunizada de la toxina derivada de planta bouganina. A diferencia de los agentes quimioterapéuticos que carecen de especificidad diana tumoral definida, VB6-845 limita su efecto citolítico contra dianas tumorales Ep-CAM positivas en solitario. En este estudio, el análisis de citometría de flujo y citotoxicidad se midieron para evaluar la fuerza y selectividad de VB6-845.
Citometría de flujo
En este estudio se usaron líneas celulares tumorales adquiridas de la ATCC y se propagaron siguiendo las recomendaciones de la ATCC excepto para las líneas celulares C4I, TOV-112D que se cultivaron en RPMI 1640 o DMEM complementado con FCS al 10 %, respectivamente, Las células tumorales se recogieron a una confluencia de 60-70 % con una viabilidad de más del 90 %. Las células epiteliales mamarias normales humanas (HMEC) se adquirieron en CAMBREX y se conservaron en medios específicos de acuerdo con el procedimiento proporcionado por CAMBREX. Las células se recogieron a una confluencia del 70 % con una viabilidad de más del 90 %.
Las líneas celulares ginecológicas de indicios de cáncer endometrial, de ovario y de cuello uterino se ensayaron con respecto a la unión de VB6-845 en citometría de flujo (Tabla 9). Se añadieron diez microgramos/ml de VB6-845 a cada línea celular (3 x 105 células) y se incubó durante 2 horas a 4 ºC. Se usaron como controles de líneas celulares positivas y negativas A-375 y CAL 27, respectivamente. Después de lavar el material no unido, se añadió un anticuerpo anti-Histidina monoclonal de ratón (Amersham Pharmacia, Cat Nº 27471001) diluido 1/800 en PBS que contenía FCS al 10 % y se incubó durante 1 hora más a 4 ºC. Posteriormente, se añadió un anti-IgG de ratón marcado con FITC (The Binding Site, Cat Nº AF271) diluido 1/100 en PBS-FCS al 10 % y se incubó durante 30 minutos a 4 ºC. Finalmente, las células se analizaron en una FACS Calibur después de tinción con yoduro de propidio para dejar salir las células muertas.
Citotoxicidad
El nivel de destrucción de VB6-845 en células indicadas en el estudio de citometría de flujo es como se indica en la Tabla 10, que indica que la construcción conservó su actividad citotóxica de-bouganina contra líneas celulares Ep-CAM positivas. La citotoxicidad fue comparable a otra variante Fab VB6-845 que contenía una toxina diferente derivada de planta, gelonina (Figura 14). La Figura 14A compara la citotoxicidad de la gelonina, la construcción Fab anti-Ep-CAM gelonina (VB6-845-Gelonina) y la construcción Fab anti-Ep-CAM-de-bouganina (Bou156) (VB6-845) en células CAL 27 (Figura 14A) y NIH:OVCAR-3 (Figura 14B). La secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de la construcción VB6
845-gelonina se ilustra en la Figura 14C.
Para estudiar la especificidad y selectividad de VB6-845 (Construcción de la Figura 3), la actividad citotóxica de VB6-845 (pureza del 90 %) se ensayó frente a las líneas celulares Ep-CAM-positivas (NIH:OVCAR-3) y Ep-CAMnegativas (HMEC, DAUDI, A-375) (Tabla 11) junto con 17 fármacos quimioterapéuticos (LKB Laboratories Inc.).
Se realizaron ensayos con MTS usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Más particularmente, se sembraron 50 microlitros de células (2 x 104 células/ml) por pocillo y las placas se incubaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 2 horas. Después, se añadieron 50 microlitros de fármaco incorporado (es decir la construcción a ensayar o control) al medio de cultivo a concentraciones en aumento. Se usó medio de cultivo, sin o con células, como controles positivos y negativos, respectivamente. Las placas se dejaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 5 días. El día 5, la inhibición de la proliferación celular se evaluó añadiendo 20 microlitros de reactivo MTS (Promega, Cat Nº G5430). Después las placas se incubaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 2 horas y las DO se leyeron a 490 nm usando el espectrómetro lector de placas. Se restaron los valores de fondo de los valores de la muestra obtenidos para cada concentración y los resultados se expresaron como un porcentaje de células viables. Los valores CI50 para cada fármaco se calcularon para cada línea celular.
Cuando se ensayó con respecto a la citotoxicidad contra NIH:OVCAR-3, un carcinoma de ovario Ep-CAM-positivo, usando un panel de agentes quimioterapéuticos convencionales, VB6-845 mostró que era más fuerte que 12 de los 17 fármacos ensayados. (Tabla 11). Aunque 5 agentes quimioterapéuticos fueron más citotóxicos, también mostraron que era bastante más tóxicos ya que carecían de cualquier destrucción específica de célula. De los 5 agentes quimioterapéuticos recomendados para el tratamiento del cáncer de ovario (Paclitaxel, Carboplatino, Cisplatino, Doxorrubicina y Topotecán), solo dos (Paclitaxel y Topotecán) eran más citotóxicos. Aunque VB6-845 demostró una actividad citolítica altamente fuerte en el intervalo de 1 a 2 nM, la fuerza de destrucción se limitó exclusivamente a la línea celular tumoral Ep-CAM positiva NIH:OVCAR-3. Aunque se mostró alguna destrucción de las líneas celulares Ep-CAM-negativas con VB6-845, el efecto citotóxico fue al menos 220 veces y a lo sumo >1000 veces menos tóxico. Por tanto VB6-845 representa una alternativa de tratamiento fuerte dirigida contra anticuerpos de agentes quimioterapéuticos que cuando se combinan con el perfil citotóxico más bajo, es más prometedor en el tratamiento de muchos tipos diferentes de tumores sólidos.
Ejemplo 9: VB6-011: la modificación por ingeniería genética recombinante de un anticuerpo Fab específico de antígeno asociado a tumor para la administración óptima de la bouganina des-inmunizada (De-bouganina).
Las citotoxinas que se dirigen a tumores están formadas por la región variable de un anticuerpo unido a una toxina bacteriana, fúngica o vegetal. El presente estudio ilustra que las construcciones de bouganina desinmunizada de la invención, comprenden bouganina desinmunizada unida a un resto diana tienen una inmunogenicidad reducida, aunque conservan su actividad biológica. La TABLA 13 demuestra la unión del anticuerpo antigénico asociado a tumor de diversos tipos de tumores y por tanto muestra que puede usarse para tratar estos tipos de cánceres.
Construcción de bouganina des-inmunizada: resto de dirección dirigido a antígeno asociado a tumor unido a debouganina
El anticuerpo H11, un anticuerpo monoclonal que reconoce antígenos asociados a tumores, se engarzó genéticamente a una forma desinmunizada de bouganina (de-bouganina), Bou 156, una fuerte proteína inactivadora de ribosomas (RIP) de tipo I derivada de plantas, para crear la construcción anticuerpo-toxina VB6-011. La Figura 15 ilustra la secuencia codificante de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos. El ensayo de esta construcción, ilustra que la construcción conserva su actividad biológica (citotoxicidad).
Fuerza (actividad biológica)
El ensayo con MTS demostró que la de-bouganina conservó su fuerza cuando se conjugaba con el fragmento Fab (Figura 16). El ensayo con MTS usado para medir la fuerza se realizó usando una técnica convencional conocida en la materia y como se describe con más detalle en el Ejemplo 8.
Citotoxicidad
Para estudiar la especificidad y selectividad de VB6-011, se ensayó la actividad citotóxica contra células MB-435S. El ensayo con MTS se realizó usando técnicas convencionales conocidas en la materia. Más particularmente, se sembraron 50 microlitros de células (2 x 104 células/ml) por pocillo y las placas se incubaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 2 horas. Después, se añadieron 50 microlitros de fármaco añadido (es decir construcción a ensayar o control) al medio de cultivo a concentraciones en aumento. El medio de cultivo, con o sin células, se usó como controles positivo y negativo, respectivamente. Las placas se dejaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 5 días. El día 5, la inhibición de la proliferación celular se evaluó añadiendo 20 microlitros de reactivo MTS (Promega, Cat Nº G5430). Después las placas se incubaron adicionalmente a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 2 horas y las DO se leyeron a 490 nm usando el espectrofotómetro del lector de placa. Los valores de fondo se restaron de los valores de la muestra obtenidos para cada concentración y los resultados se expresaron como un porcentaje de células viables. Los resultados muestran que el valor CI50 de VB6-011 es de 350 nM.
Tabla 1
- Péptido Nº
- Posición del primer aminoácido SEC ID Nº Secuencia Péptido Posición del primer aminoácido SEC ID Nº Secuencia
- 1
- 1
- 32 YNTVSFNLGEAYEYP 46 136 77 EFSIEAIHGKTINGQ
- 2
- 4 33 VSFNLGEAYEYPTFI 47 139 78 IEAIHGKTINGQEIA
- 3
- 7 34 NLGEAYEYPTFIQDL 48 142 79 IHGKTINGQEIAKFF
- 4
- 10 35 EAYEYPTFIQDLRNE 49 145 80 KTINGQEIAKFFLIV
- 5
- 13 36 EYPTFIQDLRNELAK 50 148 81 NGQEIAKFFLIVIQM
- 6
- 16 37 TFIQDLRNELAKGTP 51 151 82 EIAKFFLIVIQMVSE
- 7
- 19 38 QDLRNELAKGTPVCQ 52 154 83 KFFLIVIQMVSEAAR
- 8
- 22 39 RNELAKGTPVCQLPV 53 157 84 LIVIQMVSEAARFKY
- 9
- 25 40 LAKGTPVCQLPVTLQ 54 160 85 IQMVSEAARFKYIET
- 10
- 28 41 GTPVCQLPVTLQTIA 55 163 86 VSEAARFKYIETEVV
- 11
- 31 42 VCQLPVTLQTIADDK 56 166 87 AARFKYIETEVVDRG
- 12
- 34 43 LPVTLQTIADDKRFV 57 169 88 FKYIETEVVDRGLYG
- 13
- 37 44 TLQTIADDKRFVLVD 58 172 89 IETEVVDRGLYGSFK
- 14
- 40 45 TIADDKRFVLVDITT 59 175 90 EVVDRGLYGSFKPNF
- 15
- 43 46 DDKRFVLVDITTTSK 60 178 91 DRGLYGSFKPNFKVL
- 16
- 46 47 RFVLVDITTTSKKTV 61 181 92 LYGSFKPNFKVLNLE
- 17
- 49 48 LVDITTTSKKTVKVA 62 184 93 SFKPNFKVLNLENNW
- 18
- 52 49 ITTTSKKTVKVAIDV 63 187 94 PNFKVLNLENNWGDI
- 19
- 55 50 TSKKTVKVAIDVTDV 64 190 95 KVLNLENNWGDISDA
- 20
- 58 51 KTVKVAIDVTDVYVV 65 193 96 NLENNWGDISDAIHK
- 21
- 61 52 KVAIDVTDVYVVGYQ 66 196 97 NNWGDISDAIHKSSP
- 22
- 64 53 IDVTDVYVVGYQDKW 67 199 98 GDISDAIHKSSPQCT
- 23
- 67 54 TDVYVVGYQDKWDGK 68 202 99 SDAIHKSSPQCTTIN
- 24
- 70 55 YVVGYQDKWDGKDRA 69 205 100 IHKSSPQCTTINPAL
- 25
- 73 56 GYQDKWDGKDRAVFL 70 208 101 SSPQCTTINPALQLI
- 26
- 76 57 DKWDGKDRAVFLDKV 71 211 102 QCTTINPALQLISPS
- 27
- 79 58 DGKDRAVFLDKVPTV 72 214 103 TINPALQLISPSNDP
- 28
- 82 59 DRAVFLDKVPTVATS 73 217 104 PALQLISPSNDPWVV
- 29
- 85 60 VFLDKVPTVATSKLF 74 220 105 QLISPSNDPWVVNKV
- 30
- 88 61 DKVPTVATSKLFPGV 75 223 106 SPSNDPWVVNKVSQI
- 31
- 91 62 PTVATSKLFPGVTNR 76 226 107 NDPWVVNKVSQISPD
- 32
- 94 63 ATSKLFPGVTNRVTL 77 229 108 WVVNKVSQISPDMGI
- 33
- 97 64 KLFPGVTNRVTLTFD 78 232 109 NKVSQISPDMGILKF
- 34
- 100 65 PGVTNRVTLTFDGSY 79 235 110 SQISPDMGILKFKSS
- 35
- 103 66 TNRVTLTFDGSYQKL 80 238 111 SPDMGILKFKSSKLT
- 36
- 106 67 VTLTFDGSYQKLVNA 81 240 112 MGILKFKSSKLTQFA
- 37
- 109 68 TFDGSYQKLVNAAKV 82 243 113 LKFKSSKLTQFATMI
- 38
- 112 69 GSYQKLVNAAKVDRK 83 246 114 KSSKLTQFATMIRSA
- 39
- 115 70 QKLVNAAKVDRKDLE 84 249 115 KLTQFATMIRSAIVE
- 40
- 118 71 VNAAKVDRKDLELGV 85 252 116 QFATMIRSAIVEDLD
- 41
- 121 72 AKVDRKDLELGVYKL 86 255 117 TMIRSAIVEDLDGDE
- 42
- 124 73 DRKDLELGVYKLEFS 87 258 118 RSAIVEDLDGDELEI
- 43
- 127 74 DLELGVYKLEFSIEA 88 261 119 IVEDLDGDELEILEP
- 44
- 130 75 LGVYKLEFSIEAIHG 89 264 120 DLDGDELEILEPNIA
- 45
- 133 76 YKLEFSIEAIHGKTI
- Péptidos de la secuencia de bouganina. Los restos subrayados no están presentes en la proteína madura
Tabla 2
- Donante Nº
- Código de almacenamiento de donante Alotipo
- 1
- BC63 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01
- 2
- BC86 DRB1*04, DRB1*15, DRB5
- 3
- BC90 DRB1*07, DRB1*15, DRB4*01, DRB5
- 4
- BC134 DRB1*01, DRB1*03, DRB3
- 5
- BC167 DRB1*01, DRB1*07 y DRB4*01
- 6
- BC216 DRB1*14, DRB1*15, DRB3, DRB5
- 7
- BC217 DRB1*04, DRB1*12, DRB3, DRB4*01
- 8
- BC233 DRB1*04, DRB1*11 y DRB3, DRB4*01
- 9
- BC241 DRB1*07, DRB1*11, DRB3, DRB4*01
- 10
- BC246 DRB1*01, DRB1*13 y DRB3
- 11
- BC262 DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4*01
- 12
- BC292 DRB1*07, DRB1*13, DRB3, DRB4*01
- 13
- BC293 DRB1*04, DRB1*10, DRB4*01
- 14
- BC231 DRB1*03 o DRB1*03, DRB1*13 y DRB3
- 15
- BC301 DRB1*07, DRB1*14, DRB3
- 16
- BC326 DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DRB5
- 17
- BC316 DRB1*13,DRB1*15,DRB3,DRB5
- 18
- BC321 DRB1*01,DRB1*15, DRB5
- 19
- BC382 DRB1*04,DRB1*08,DRB4*01
- 20
- BC336 DRB1*01, DRB1*11, DRB3
- Alotipos MHC de donantes PBMC
Tabla 3
Cebador SEC ID Nº Secuencia
OL1032 121 CATTACAAACGTCTACCAAGTTT OL1033 122 TTACAAAAGTAGATAAGTAATGTG OL1322 123 GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACG OL1067 124 TGACACAGTGTTGTACGCTGGTTGGGCAGCGAGTAA OL1068 125 GCTGCCCAACCAGCGTACAACACTGTGTCATTTAAC OL1323 126 CGAGTGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGGTGT
Secuencias de cebadores usados en la construcción del gen de bouganina de tipo silvestre (WT)
Tabla 4
- Las variantes de bouganina de sustitución sencilla construidas y ensayadas.
- Mutación
- Mutaciones de Nucleótidos Actividad en el ensayo luciferasa* Clon ID**
- Control negativo
- Y70A
- TAT-GCT BouY70A
- Región Epitópica R1 (péptido 41)
- V123T
- GTG-ACG +/- Bou2
- V123A
- GTG-GCT ++ Bou3
- V123D
- GTG-GAT -- -
- V123E
- GTG-GAA -- -
- V123G
- GTG-GGC -- -
- V123H
- GTG-CAC -- -
- V123K
- GTG-AAG -- -
- V123N
- GTG-AAC -- -
- V123P
- GTG-CCT -- -
- V123Q
- GTG-CAA ++ Bou4
- V123R
- GTG-AGA -- -
- V123S
- GTG-TCA -- -
- D127G
- GAT-GGC ++ Bou5
- D127A
- GAT-GCT ++ Bou6
- E129K
- GAA-AAG -- -
- E129R
- GAA-AGA -- -
- E129Q
- GAA-CAA +/- Bou7
- E129G
- GAA-GGC ++ Bou8
- Región Epitópica R2 (péptido 44)
- Y133P
- TAC-CCC -- -
- Y133N
- TAC-AAC ++ Bou9
- Y133T
- TAC-ACA ++ Bou10
- Y133A
- TAC-GCT ++ Bou11
- Y133R
- TAC-AGA ++ Bou12
- Y133D
- TAC-GAT ++ Bou13
- Y133E
- TAC-GAA +/- Bou14
- Y133Q
- TAC-CAA ++ Bou15
- Y133G
- TAC-GGC ++ Bou16
- Y133H
- TAC-CAC ++ Bou17
- Y133K
- TAC-AAG ++ Bou18
- Y133S
- TAC-TCA ++ Bou19
- Región Epitópica R3 (péptido 50)
- E151T I152E
- GAGATA-ACGGAA -- -
- I152Q
- ATA-CAA ++ Bou20
- I152A
- ATA-GCA ++ Bou21
- I152E
- ATA-GAA -- -
- F155P
- TTC- CCA -- -
- F155H
- TTC-CAC -- -
- I158P
- ATT-CCA -- -
- *Actividad en el ensayo Luciferasa: ++ = la misma o mayor que la de la proteína de tipo silvestre (WT). + = dentro de 2 veces de actividad de tipo silvestre (WT). +/- = dentro de 3 veces de actividad de tipo silvestre (WT). -= menos de un tercio de actividad de tipo silvestre (WT). WT = Proteína de tipo silvestre. ** Clon ID. Denominaciones solo de variantes funcionalmente activas.
Tabla 5
- Las variantes de bouganina de sustitución múltiple construidas y ensayadas.
- Clon ID
- Región Epitópica R1 (péptido 41) Región Epitópica R2 (péptido 44) Región Epitópica R3 (péptido 51) Actividad en ensayo luciferasa
- Bou143
- V123Q Y133Q I152Q ++
- Bou144
- V123A Y133N I152A ++
- Bou145
- V123A Y133Q I152A ++
- Bou146
- V123A D127G ++
- Bou147
- V123A D127A ++
- Bou148
- V123Q D127G ++
- Bou149
- V123Q D127A ++
- Bou150
- V123Q E129G +
- Bou151
- V123A E129G +
- Bou156
- V123A D127A Y133N I152A ++
- Bou157
- V123A D127A Y133Q I152A ++
- *Actividad en ensayo Luciferasa: ++ = la misma o mayor que la de la proteína de tipo silvestre (WT). + = dentro de 2 veces de actividad de tipo silvestre (WT). +/- = dentro de 3 veces de actividad de tipo silvestre (WT). -= menos de un tercio de actividad de tipo silvestre (WT). WT = Proteína de tipo silvestre.
Tabla 6
- Clon ID
- Sustitución o sustituciones* Proteína
- Bou32
- WT SEC ID Nº 1
- Bou156
- V123A, D127A, Y133N, I152A SEC ID Nº 13
- Bou157
- V123A, D127A, Y133Q, I152A SEC ID Nº 14
- Bou143
- V123Q, Y133Q, I152Q
- Bou144
- V123A, Y133N, I152A
- Bou145
- V123A, Y133Q, I152A
- Bou146
- V123A, D127G
- Bou147
- V123A, D127A
- Bou148
- V123Q, D127G
- Bou149
- V123Q, D127A
- Bou150
- V123Q, E129G
- Bou151
- V123A, E129G
- Bou2
- V123T
- Bou3
- V123A
- Bou4
- V123Q
- Bou5
- D127G
- Bou6
- D127A
- Bou7
- E129Q
- Bou8
- E129G
- Bou9
- Y133N
- Bou10
- Y133T
- Bou11
- Y133A
- Bou12
- Y133R
- Bou13
- Y133D
- Bou14
- Y133E
- Bou15
- Y133Q
- Bou16
- Y133G
- Bou17
- Y133H
- Bou18
- Y133K
- Bou19
- Y133S
- Bou20
- I152Q
- Clon ID
- Sustitución o sustituciones* Proteína
- Bou21
- I152A
- * La numeración comienza desde el resto 1 de la fase de lectura de la bouganina y por lo tanto excluye una secuencia líder PeIB incluida en la mayoría de las construcciones.
Tabla 7
SEC ID Nº 1
Proteína
SEC ID Nº 13
Proteína
Tabla 8
- Péptidos modificados y de tipo silvestre (WT) de la Bouganina ensayada adicionalmente en ensayos con linfocitos T
- Péptido número
- Posición del primer aminoácido dentro de la bouganina Secuencia* SEC ID Nº
- DeI-41
- 121-135 AKADRKALELGVNKL 29
- DeI-44
- 130-144 LGVNKLEFSIEAIHG 30
- DeI-50
- 149-163 NGQEAAKFFLIVIQM 31
- *Los restos (mutantes) sustituidos se subrayan.
Tabla 9
- Unión de VB6-845 a líneas celulares ginecológicas por citometría de flujo. Los resultados se expresan como un factor de aumento en MF ± ETM.
- Indicación
- Líneas celulares VB6-845 (factor de aumento MF ETM)
- Endometrial
- HEC-1-A 42,3 ± 0,9
- RL95-2
- 4,9 ± 0,7
- SK-UT-1
- 1,1 ± 0,1
- Ovario
- NIH:OVCAR-3 33,6 ± 6,0
- SK-OV-3
- 4,3 ± 1,0
- TOV-112G
- 1,1 ± 0,1
- Cervical
- HT-3 29,1 ± 1,2
- C-4I
- 6,8 ± 0,6
- C-33A
- 1,1 ± 0,0
- Melanoma
- A-375 11 ± 0,1
Tabla 10
- Citotoxicidad mediada por VB6-845 mediante ensayo con MTS
- Indicación
- Línea celular CI60 nM VB6-845 pureza 70 %
- Endometrial
- HEC-1-A 43
- KLE
- >100
- RL95-2
- 100
- Ovario
- NIH-OVCAR-3 3,4
- Caov-3
- 1,3
- SK-OV-3
- >100
- Cervical
- MS751 0,43
- HT-3
- 23
- ME-180
- 37
- C-4I
- 1,7
- Melanoma
- A-375 >100
Tabla 11
- Especificidad y selectividad de VB6-845 frente a agentes quimioterapéuticos
- CI50 nM DAUDI NIH:OVCAR-3 A-375 HMEC
- Paclitaxel
- <10 -6 4,9x10 -6 <10 -6 <10 -6
- Docetaxel
- <10 -6 <10 -6 <10 -6 <10 -6
- Vincristina
- 4,4x10 -6 <10 -6 <10 -6 <10 -6
- Sulfato Vinblastina
- 1,1x10 -6 <10-6 <10 -6 <10 -6
- Topotecán
- 0,071 1,5 0,009 4,1
- VB6-845 (pureza 90 %)
- 1 >1000 >1000 220
- Doxorrubicina
- 3 2,8 16x10 -6 16
- Mitomicina C
- 28 14 2,8 50
- Sulfato de Bleomicina
- 30 170 22 600
- Bleomicina A5
- 150 290 130 1000
- Irinotecán
- 180 900 190 1000
- Etopósido
- 210 280 1,7 600
- Metotrexato
- >1000 6 3,6 41
- Clorambucilo
- >1000 >1000 >1000 >1000
- Fluorouracilo
- >1000 >1000 >1000 >1000
- Ciclofosfamida
- >1000 >1000 >1000 >1000
- Cisplatino
- >1000 >1000 >1000 >1000
- Carboplatino
- >1000 >1000 >1000 >1000
Tabla 12: indicaciones de células tumorales VB6-845
- INDICACIONES
- N1 Unión para scFv 845 (IgG)2
- Gástrico
- 3 148,9
- Ovario
- 2 84,1
- Esofágico
- 3 72,4
- Vejiga
- 14 59,6
- Próstata
- 5 50,1
- Cervical
- 3 37,5
- Endometrial
- 1 23,8
- Pulmón
- 3 16,4
- Cabeza y cuello
- 2 11,4
- Riñón
- 3 9,4
- Páncreas
- 3 5,5
- Melanoma
- 3 1,6
- 1N indica el número de líneas celulares ensayadas por indicación. 2 Factor de aumento medio en mediana de fluorescencia sobre el anticuerpo control de todas las líneas celulares en cada indicación.
Tabla 13: indicaciones de células tumorales VB6-011
- INDICACIONES
- N1 Unión para mAb 011 (IgG)2
- Mama
- 3 16,9
- Próstata
- 3 15,1
- Melanoma
- 3 14,0
- Pulmón
- 3 13,1
- Ovario
- 2 11,1
- Colon
- 3 8,7
- Riñón
- 3 6,9
- Hígado
- 2 6,5
- Páncreas
- 3 4,2
- Cabeza y cuello
- 2 2,9
- 1N indica el número de líneas celulares ensayadas por indicación. 2 Los valores indican la media calculada a partir de la suma de la media del factor de aumento en la mediana de fluorescencia sobre el anticuerpo control de todas las líneas celulares en cada indicación. Un valor cero significaría reactividad no medible con respecto a la actividad control
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> BAKER, Matthew CARR, Francis J. HELLENDOORN, Koen CIZEAU, Jeannick MACDONALD, Glen
Christopher ENTWISTLE, Joycelyn BOSC, Denis Georges GLOVER, Nicholas Ronald
5
<120> PROTEÍNAS BOUGANINA MODIFICADAS, CITOTOXINAS Y PROCEDIMIENTOS Y USOS DE LAS MISMAS
<130> 10241-43 10
<140>
<141>
<150> US 60/554,580 15 <151>
<150> US 60/630.571
<151> 20 <160> 129
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1 25 <211> 250
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis Willd
<400> 1 30
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 3
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 25
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 30
<400> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<210> 7 50 <211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<220> 55 <221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 7 60
<210> 8
<211> 15
5 <212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 10 <222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser T o A o Q
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 15 <222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser G o A
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 20 <222> (9)..(9)
<223> Xaa puede ser Q o G
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 25 <222> (13)..(13)
<223> Xaa puede ser N o D oT o A o R o Q o E o G o H o K o S
<400> 8
<210> 9
<211> 15
<212> PRT 35 <213> Bougainvillea spectabilis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4) 40 <223> Xaa puede ser N o D oT o A o R o Q o E o G o H o K o S
<400> 9
- 45
- <210> 10
- <211> 15
- <212> PRT
- <213> Bougainvillea spectabilis
- 50
- <220>
- <221> MISC_FEATURE
- <222> (5)..(5)
- <223> Xaa puede ser Q o A
- 55
- <400> 10
<210> 11
<211> 250
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
5
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (127)..(127)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15
<220>
<221> misc_feature
<222> (129)..(129)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(133)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 25
<220>
<221> misc_feature
<222> (152)..(152)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 30
<400> 11
<210> 12
<211> 250
5 <212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <222> (123)..(123)
<223> Xaa puede ser T o A o Q
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 5 <222> (127)..(127)
<223> Xaa puede ser G o A
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 10 <222> (129)..(129)
<223> Xaa puede ser Q o G
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 15 <222> (133)..(133)
<223> Xaa puede ser N o D oT o A o R o Q o E o G o H o K o S
<220>
- <221>
- MISC_FEATURE 20 <222> (152)..(152)
<223> Xaa puede ser Q o A
<400> 12
<210> 13
<211> 250
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 13
<210> 14
<211> 250
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 14
<210> 15
<211> 2404
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845 10
<400> 15
<210> 16
<211> 750
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845 10
<400> 16
<210> 17
<211> 1618
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB5-845 10
<400> 17
<210> 18
<211> 488
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB5-845 10
<400> 18
<210> 19
<211> 2404
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-CL-de-bouganina 10
<400> 19
<210> 20
<211> 750
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-CL-de-bouganina 10
<400> 20
<210> 21
<211> 2404
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-NVH-de-bouganina 10
<400> 21
<210> 22
<211> 750
<212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-NVH-de-bouganina
10 <400> 22
<210> 23
<211> 2404
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-NVL-de-bouganina 10
<400> 23 <210> 24
<211> 750
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-NVL-de-bouganina 10
<400> 24
<210> 25
<211> 2407
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> VB6-845-gelonina
<400> 25
<210> 26
<211> 751
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-845-gelonina 10
<400> 26
<210> 27
<211> 2431
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-011 10
<400> 27
<210> 28
<211> 759
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VB6-011 10
<400> 28
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 29
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 30
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 31
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 32
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 33
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 35
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 36
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 37
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 38
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 39
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 40
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 41
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 42
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 43
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 44
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 45
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 46
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 47
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 48
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 49
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 50
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 51
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 52
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 53
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 54
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 55
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 56
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 57
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 58
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 60
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 61
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 62
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 63
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 64
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 65
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 66
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 67 <210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 68
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 69
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 70
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 71
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 72
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 73 <210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 74
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 75
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 76
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 77
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 78
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 79 <210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 80
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 81
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 82
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 83
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 84
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 85 <210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 86
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 87
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 88
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 89
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 90
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 91 <210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 92
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 93
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 94
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 95
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 96
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 97 <210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillæa spectabilis
<400> 98
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 99
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 100
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 101
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 102
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 103 <210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 104
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 105
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 106
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 107
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 108
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 109 <210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 110
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 111
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 112
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 113
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 114
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 115 <210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 116
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 117
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 118
<210> 119
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 119
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 120
<210> 121
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador OL1032
<400> 121
cattacaaac gtctaccaag ttt 23 <210> 128
- <210> 122 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador OL1033
- <400> 122 ttacaaaagt agataagtaa tgtg
- 24
- <210> 123 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador OL1322
- <400> 123 gatatacata tgaaatacct attgcctacg
- 30
- <210> 124 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador OL1067
- <400> 124 tgacacagtg ttgtacgctg gttgggcagc gagtaa
- 36
- <210> 125 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador OL1068
- <400> 125 gctgcccaac cagcgtacaa cactgtgtca tttaac
- 36
- <210> 126 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador OL1323
- <400> 126 cgagtgcggc cgctcaatgg tgatggtgat ggtgt
- 35
- <210> 127 <211> 13 <212> PRT <213> Virus de la gripe
- <400> 127
<211> 15
<212> PRT
<213> Chlamydia sp.
<400> 128
<210> 129
<211> 250
<212> PRT
<213> Bougainvillea spectabilis
<400> 129
Claims (27)
- REIVINDICACIONES1. Una proteína bouganina modificada en donde dicha bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con una bouganina no modificada, en donde dicha bouganina tiene una sustitución de aminoácidos de uno o más de X1, X2, X3, X4 o X5 en un epítopo de linfocitos T seleccionado5 del grupos que consiste en:a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 8) b) LGVX4KLEFSIEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 9); y c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 10) en donde:X1 es T o A o Q;10 X2 es G o A; X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o Q o E o Go Ho K o S; y X5 es Q o A.
- 2. Una proteína bouganina modificada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína 15 bouganina modificada comprende:en donde:X1 es T o A o Q; X2 es G o A;20 X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o a o E o G o H o K o S; y X5 es Qo A (SEC ID Nº: 12).
-
- 3.
- Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X1 es A.
-
- 4.
- Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X2 es A.
- 25 5. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X4 es N.
-
- 6.
- Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X5 es A.
-
- 7.
- Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la bouganina modificada comprende la siguiente secuencia
- 30 8. Una citotoxina que comprende
- (a)
- un resto diana unido a;
- (b)
- una proteína bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 9. Una citotoxina que comprende
- (a)
- un ligando que se une a una célula cancerosa unida a;
- (b)
- una proteína bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7
-
- 10.
- La citotoxina de la reivindicación 9, en la que el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a una célula cancerosa.
-
- 11.
- La citotoxina de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a Ep-CAM en la superficie de la célula cancerosa.
-
- 12.
- La citotoxina de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM es un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo que se une al dominio extracelular de Ep-CAM-humana y comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad derivadas de un anticuerpo MOC-31.
-
- 13.
- La citotoxina de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 16.
-
- 14.
- La citotoxina de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a un antígeno asociado a tumor en la superficie de la célula cancerosa.
-
- 15.
- La citotoxina de la reivindicación 14, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 28.
-
- 16.
- Un uso de una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en la fabricación de un medicamento para inhibir o destruir una célula cancerosa.
-
- 17.
- Una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para su uso en la inhibición o la destrucción de una célula cancerosa.
-
- 18.
- Un uso de una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
-
- 19.
- Una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15 para su uso en el tratamiento del cáncer.
-
- 20.
- El uso de la reivindicación 16 o 18, o la citotoxina para su uso de la reivindicación 17 o 19, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.
-
- 21.
- Una composición farmacéutica que comprende la citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
-
- 22.
- Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un animal con cáncer que comprende
- (a)
- identificar epítopos de linfocitos T de la bouganina;
- (b)
- modificar uno o más restos de aminoácidos en un epítopo de linfocitos T para preparar una bouganina modificada que tenga una propensión reducida para activar linfocitos T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
- (c)
- preparar una citotoxina que tenga un ligando de unión a cáncer unido a la bouganina modificada; y
- (d)
- suspender la citotoxina en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
-
- 23.
- El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.
-
- 24.
- Una molécula de ácido nucleico que codifica una bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
-
- 25.
- Una molécula de ácido nucleico que codifica una citotoxina de acuerdo con la reivindicación 8-15.
-
- 26.
- Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: AKX1DRKX2LX3LGVX4KL en la que al menos uno de X1, X2, X3 y X4 está modificado desde la secuencia no modificada de las siguiente manera:
X1 es T o A o Q; X2 es G o A; X3 es Q o G; yX4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S (SEC ID Nº: 8). - 27. Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: LGVX4KLEFSIEAIHG5 en la que X4 es N o Do T o A o R o Q o E o G o H o K o S (SEC ID Nº: 9).
- 28. Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: NGQEX5AKFFLIVIQM en la queX5 es Q o A (SEC ID Nº: 10).10 29. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido epitópico de linfocitos T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
- 30. Una proteína bouganina modificada que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con la bouganina no modificada que comprende la secuencia:FIGURA 1Las figuras ilustran la expresión de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina en el sobrenadante de células E104 inducidas a escala de laboratorio (matraz agitador). Una parte alícuota del sobrenadante, 16 μl, se cargó en condiciones no reductoras en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE y se analizó por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-4D5 policlonal de conejo, seguido de un anticuerpo anti-conejo de cabra (1/2000), o anti cadena L-Kappa humana de cabra conjugado con HRP (1/1000), para confirmar la identidad y el tamaño de la proteína recombinante. La flecha indica la longitud completa de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina. La transferencia de Western del sobrenadante del cultivo E104 no inducido reveló bandas no correspondientes lo que demuestra la especificidad de los anticuerpos.Reactividad de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina, detectada por citometría de flujo. La reactividad y la especificidad de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina se evaluaron con las líneas celulares Ep-CAM-positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3 y la línea celular Ep-CAM negativa A-375. Brevemente, se incubaron VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina con 0,45 x 106 células durante una hora en hielo. Después del lavado, VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina unidas a la superficie celular se detectaron con anti-bouganina de conejo durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se incubaron con anti IgG de conejo de oveja conjugado con FITC durante 30 minutos en hielo. Posteriormente, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS con FCS al 5 % que contenía yoduro de propidio para evaluar la unión de los anticuerpos por citometría de flujo.No se detectaron cambios en la fluorescencia media después de incubación con VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina con A-375. Por otro lado, se observó un cambio en la fluorescencia media con las líneas celulares Ep-CAM positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3.Reactividad de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845.La actividad biológica de VB6-845-gelonina se comparó con VB6-845 por citometría de flujo. La reactividad y la especificidad de VB6-845-gelonina y VB6-845 se evaluaron con las líneas celulares Ep-CAM-positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3 y la línea celular Ep-CAM negativa A-375. Brevemente, VB6-845-gelonina y VB6-845 se incubaron con 0,45 x 106 células durante una hora en hielo. Después del lavado, la VB6-845-gelonina y VB6-845 unidas a la superficie celular se detectaron con una etiqueta anti His de ratón durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se incubaron con anti IgG de ratón de oveja conjugado con FITC durante 30 minutos en hielo. Posteriormente, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS con FCS al 5 %, que contenía yoduro de propidio para evaluar la unión de los anticuerpos por citometría de flujo.Condiciones:
- -
- 0,3 x 106 células/grupo.
- -
- concentraciones de VB6-845 y Proxinium mezcladas en iguales volúmenes.
- -
- 1 h de incubación en hielo.
- -
- dilución 1/200 de anti-bouganina de conejo-biotina como 2º Ab-1 hora en hielo.
- -
- fluorocromo – dilución 1/120 de estreptavidina – citocromo – 1/2 h en hielo.
- -
- 100 % unido – 0 μg/ml de Proxinium.
Ensayo de competencia entre VB6-845 y Proxinium' por citometría de flujo: VB6-845 a 1 y 10 μg/ml y concentraciones en aumento de Proxinium' que variaban de 0 a 100 μg/ml, se incubaron con células NIH:OVCAR-3. Después de 1 hora de incubación a 4 ºC, las células se lavaron y la unión de VB6-845 se detectó con un anti-bouganina de conejo biotinilado seguido por estreptavidina-citocromo. Se realizó el mismo experimento con 4B5-PE que se usó como un control negativo.Las proteínas VB6-845 y de-bouganina purificadas, a diversas concentraciones se incubaron a 30 ºC durante 90 minutos con la siguiente mezcla:Lisado de reticulocitos de conejo Flexi 35 μl Mezcla de aminoácidos, sin leucina 1 μl 3H-leucina 5 μl Cloruro de potasio 1,4 μl RNasin 1 μl ARN control luciferasa, 1 mg/ml 1 μl Hasta un volumen final de 50 μl Después de completarse la reacción de traducción, se tomó una muestra de 2 μl, se mezcló con 98 μl de NaOH 1 M/H2O2 al 2 % y se incubó a 37 ºC durante 10 minutos. La proteína traducida se precipitó con la adición de TCA al 25 % enfriado con hielo/casaminoácidos al 2 % y se incubó en hielo durante 30 minutos. Después el precipitado se recogió en un filtro de fibra de vidrio Whatman GF/C (prehumedecido con TCA enfriado al 5 %) por centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos. El filtro se aclaró 3 veces con TCA al 5 % enfriado con hielo y una vez con acetona. Después de secar el filtro, se añadió mezcla de centelleo y los recuentos se determinaron en un contador de centelleo líquido.Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células CAL 27 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0,1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.Citotoxicidad in vitro de VB6-845-CL-de-bouganina. Ensayo con MTS de VB6-845-CL-de-bouganina en comparación con VB6-845: se incubaron células NIH:OVCAR-3 con una concentración equimolar de VB6-845-CL-de-bouganina, VB6-845 y bouganina que variaba de 100 a 0,1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor de CI50.Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células CAL 27 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0,1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células NIH:OVCAR-3 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0,1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor de CI50.Citotoxicidad in vitro de VB6-011. Ensayo con MTS de VB6-011: se incubaron células MB-435S con diferentes concentraciones de VB6-011 que variaban de 100 nM a 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55458004P | 2004-03-19 | 2004-03-19 | |
US554580P | 2004-03-19 | ||
US63057104P | 2004-11-26 | 2004-11-26 | |
US630571P | 2004-11-26 | ||
PCT/CA2005/000410 WO2005090579A1 (en) | 2004-03-19 | 2005-03-18 | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2424643T3 true ES2424643T3 (es) | 2013-10-07 |
Family
ID=34993709
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES05728983T Active ES2424643T3 (es) | 2004-03-19 | 2005-03-18 | Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7339031B2 (es) |
EP (1) | EP1737961B1 (es) |
JP (1) | JP5025460B2 (es) |
KR (1) | KR101165867B1 (es) |
AU (1) | AU2005224942B2 (es) |
BR (1) | BRPI0508670B1 (es) |
CA (1) | CA2560278C (es) |
DK (1) | DK1737961T3 (es) |
EA (1) | EA010803B1 (es) |
ES (1) | ES2424643T3 (es) |
HK (1) | HK1102306A1 (es) |
IL (1) | IL177922A (es) |
MX (1) | MXPA06010716A (es) |
NO (1) | NO338293B1 (es) |
NZ (1) | NZ550339A (es) |
PL (1) | PL1737961T3 (es) |
PT (1) | PT1737961E (es) |
WO (1) | WO2005090579A1 (es) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004096271A1 (en) | 2003-04-30 | 2004-11-11 | Uwe Zangemeister-Wittke | Methods for treating cancer using an immunotoxin |
JP5026268B2 (ja) | 2004-06-10 | 2012-09-12 | ヴィヴェンティア バイオテクノロジーズ インコーポレーティッド | 腫瘍特異的抗体 |
EP1844074B1 (en) | 2005-02-03 | 2013-04-24 | Antitope Limited | Human antibodies and proteins |
CA2633131A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Viventia Biotech Inc. | Novel cancer-associated antigen |
AU2006329208B2 (en) * | 2005-12-23 | 2012-03-08 | Viventia Bio Inc. | Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof |
WO2008052322A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Viventia Biotech Inc. | Immunotoxγn fusions comprising an antibody fragment and a plant toxin linked by protease cleavable linkers |
EP2450366A1 (en) * | 2007-01-30 | 2012-05-09 | Epivax, Inc. | Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof |
CA2684330A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Viventia Biotech Inc. | Optimized nucleotide sequences of vb6-845 for expression of recombinant proteins |
US8252897B2 (en) | 2007-06-21 | 2012-08-28 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
WO2009039630A1 (en) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Viventia Biotech Inc. | Optimized nucleic acid sequences for the expression of vb4-845 |
US8470314B2 (en) | 2008-02-29 | 2013-06-25 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
US9388397B2 (en) | 2013-02-15 | 2016-07-12 | Research Development Foundation | Deimmunized gelonin molecules and therapies |
CA2902905A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Claude Geoffrey Davis | Modified toxins |
CA2909153A1 (en) * | 2013-04-12 | 2014-10-16 | Viventia Bio Inc. | Compositions and methods for detection and treatment of hepatocellular carcinoma |
KR102068519B1 (ko) | 2013-07-01 | 2020-01-21 | 삼성전자주식회사 | 저장 장치, 그것의 쓰기 방법 및 읽기 방법 |
WO2015048901A1 (en) * | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Viventia Bio Inc. | Anti-epcam antibodies and methods of use |
US20160060358A1 (en) * | 2014-08-28 | 2016-03-03 | California Institute Of Technology | Induction of antigen-specific tolerance |
JP6847846B2 (ja) | 2015-03-12 | 2021-03-24 | セセン バイオ,インコーポレイテッド | Epcam陽性膀胱癌を標的とする投薬戦略 |
CA2979394A1 (en) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | Viventia Bio Inc. | Methods of treatment for epcam positive bladder cancer |
WO2016187571A2 (en) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Viventia Bio Inc. | Her2 immunotoxins and methods of using the same |
CA3078434A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-18 | Medicenna Therapeutics, Inc. | Il-4-fusion formulations for treatment of central nervous system (cns) tumors |
US20210299212A1 (en) * | 2018-08-10 | 2021-09-30 | Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute | Bindng molecules to tumor associated macrophages and methods of use |
JP7124034B2 (ja) * | 2020-11-05 | 2022-08-23 | 株式会社天柳 | 嚥下困難者用食品組成物の製造方法 |
JP7488928B1 (ja) | 2023-03-01 | 2024-05-22 | 積水フーラー株式会社 | ホットメルト接着剤 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6680295B1 (en) | 1994-09-22 | 2004-01-20 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method and pharmaceutical composition for prevention and treatment of brain damage |
US6121416A (en) * | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
DE69833755T2 (de) | 1997-05-21 | 2006-12-28 | Biovation Ltd. | Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen |
US6680296B1 (en) * | 1997-06-06 | 2004-01-20 | Tanox Pharma B.V. | Type-1 ribosome-inactivating protein |
AU8132998A (en) * | 1997-06-20 | 1999-01-04 | Tanox Pharma B.V. | Anti-cd40l immunotoxins for the treatment of diseases |
CN1202128C (zh) | 1998-12-08 | 2005-05-18 | 拜奥威神有限公司 | 修饰蛋白的免疫原性 |
WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
MXPA04012209A (es) | 2002-06-11 | 2005-02-25 | Merck Patent Gmbh | Metodo para mapear y eliminar epitopos de linfocitos t. |
MXPA04012210A (es) * | 2002-06-11 | 2005-02-25 | Merck Patent Gmbh | Birodina i modificada con inmunogenicidad reducida. |
CA2424255A1 (en) * | 2003-03-26 | 2004-09-26 | Claudio Di Paolo | Immunotoxins |
US7696322B2 (en) * | 2003-07-28 | 2010-04-13 | Catalent Pharma Solutions, Inc. | Fusion antibodies |
JP5026268B2 (ja) | 2004-06-10 | 2012-09-12 | ヴィヴェンティア バイオテクノロジーズ インコーポレーティッド | 腫瘍特異的抗体 |
ES2421558T3 (es) * | 2004-12-21 | 2013-09-03 | Viventia Biotech Inc | Anticuerpos específicos de cáncer y proteínas de superficie celular |
EP1844074B1 (en) * | 2005-02-03 | 2013-04-24 | Antitope Limited | Human antibodies and proteins |
-
2005
- 2005-03-18 US US11/084,080 patent/US7339031B2/en active Active
- 2005-03-18 CA CA2560278A patent/CA2560278C/en active Active
- 2005-03-18 BR BRPI0508670-1A patent/BRPI0508670B1/pt active IP Right Grant
- 2005-03-18 DK DK05728983.7T patent/DK1737961T3/da active
- 2005-03-18 NZ NZ550339A patent/NZ550339A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-03-18 KR KR1020067021711A patent/KR101165867B1/ko active IP Right Grant
- 2005-03-18 JP JP2007503165A patent/JP5025460B2/ja active Active
- 2005-03-18 AU AU2005224942A patent/AU2005224942B2/en active Active
- 2005-03-18 PL PL05728983T patent/PL1737961T3/pl unknown
- 2005-03-18 WO PCT/CA2005/000410 patent/WO2005090579A1/en active Application Filing
- 2005-03-18 ES ES05728983T patent/ES2424643T3/es active Active
- 2005-03-18 MX MXPA06010716A patent/MXPA06010716A/es active IP Right Grant
- 2005-03-18 EA EA200601738A patent/EA010803B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-03-18 PT PT57289837T patent/PT1737961E/pt unknown
- 2005-03-18 EP EP05728983.7A patent/EP1737961B1/en active Active
-
2006
- 2006-09-06 IL IL177922A patent/IL177922A/en active IP Right Grant
- 2006-09-13 NO NO20064134A patent/NO338293B1/no unknown
-
2007
- 2007-09-27 HK HK07110463.0A patent/HK1102306A1/xx unknown
-
2008
- 2008-01-09 US US11/971,660 patent/US7750136B2/en active Active
-
2010
- 2010-05-21 US US12/784,820 patent/US8716234B2/en active Active
-
2014
- 2014-04-01 US US14/242,181 patent/US20150018526A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL177922A0 (en) | 2006-12-31 |
JP5025460B2 (ja) | 2012-09-12 |
US20100254964A1 (en) | 2010-10-07 |
US7339031B2 (en) | 2008-03-04 |
KR101165867B1 (ko) | 2012-07-13 |
NZ550339A (en) | 2009-11-27 |
MXPA06010716A (es) | 2007-02-21 |
KR20070000494A (ko) | 2007-01-02 |
BRPI0508670B1 (pt) | 2023-01-24 |
CA2560278C (en) | 2012-11-20 |
DK1737961T3 (da) | 2013-08-05 |
IL177922A (en) | 2011-06-30 |
BRPI0508670A (pt) | 2007-08-14 |
HK1102306A1 (en) | 2007-11-16 |
EA010803B1 (ru) | 2008-12-30 |
NO20064134L (no) | 2006-11-08 |
CA2560278A1 (en) | 2005-09-29 |
EP1737961A4 (en) | 2008-12-17 |
US20050238642A1 (en) | 2005-10-27 |
US7750136B2 (en) | 2010-07-06 |
WO2005090579A1 (en) | 2005-09-29 |
AU2005224942A1 (en) | 2005-09-29 |
EP1737961A1 (en) | 2007-01-03 |
EA200601738A1 (ru) | 2007-04-27 |
AU2005224942B2 (en) | 2011-08-11 |
US20150018526A1 (en) | 2015-01-15 |
PL1737961T3 (pl) | 2013-12-31 |
JP2008500811A (ja) | 2008-01-17 |
US8716234B2 (en) | 2014-05-06 |
PT1737961E (pt) | 2013-08-26 |
US20080219994A1 (en) | 2008-09-11 |
EP1737961B1 (en) | 2013-05-08 |
NO338293B1 (no) | 2016-08-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2424643T3 (es) | Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas | |
ES2526219T3 (es) | Procedimientos de tratamiento de cáncer usando una inmunotoxina | |
RU2758139C2 (ru) | Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf | |
ES2747273T3 (es) | Anticuerpos anti-EpCAM y métodos de uso | |
KR20060136464A (ko) | 변형 부가닌 단백질, 그 세포독소 및 이의 생산방법과 용도 | |
JP2019503709A (ja) | ヒト化抗cd73抗体 | |
US20100215670A1 (en) | Immunotoxin Fusions Comprising An Antibody Fragment and a Plant Toxin Linked by Protease Cleavable Linkers | |
JP6242484B2 (ja) | 特定の改善されたヒト二重特異性EGFRvIII抗体結合分子 | |
EA012622B1 (ru) | Биспецифичные гибридные антитела с увеличенным периодом полувыведения из сыворотки | |
JP6154895B2 (ja) | ヒト二重特異性EGFRvIII抗体結合分子 | |
US8273550B2 (en) | Antibodies against a cancer-associated epitope of variant HnRNPG and uses thereof | |
ZA200608696B (en) | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof | |
WO2016187585A1 (en) | Deimmunized linker and methods of use | |
WO2020249757A1 (en) | Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha | |
AU2016202118A1 (en) | Carrier immunoglobulins and uses thereof | |
WO2016187571A2 (en) | Her2 immunotoxins and methods of using the same | |
Harvill | Properties of an IgG3-IL-2 fusion protein: Enhanced binding to the IL-2R alpha subunit and stimulation of LAK activity in vitro; improved half-life; adjuvant properties and anti-tumor activity in vivo |