MXPA04012210A - Birodina i modificada con inmunogenicidad reducida. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a la modificacion de la broidina 1 para resultar en proteinas de briodina 1 que son substancialmente no inmunogenicas o menos inmungenicas que cualesquiera de sus contrapartes no modificadas cuando se usan in vivo. La invencion se refiere adicionalmente e los peptidos de epitopo de celula T derivados de la proteina no modificada por medio del cual es posible crear variantes de briodina 1 modificadas con inmunogenicidad reducida.

Description

BIRODINA I MODIFICADA CON INMUNOGENICIDAD REDUCIDA Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos para ser administrados especialmente en humanos y en particular, para el uso terapéutico. Los polipéptidos son polipéptidos modificados por medio de los cuales las modificaciones resultan en una tendencia reducida del polipéptido para producir una respuesta inmune luego de la administración al sujeto humano. La invención se refiere en particular, a la modificación de birodina 1 para resultar en proteínas de birodina 1 que son sustancialmente no inmunogénicas o menos inmunogénicas que cualquier contraparte no modificada cuando se usa in vivo. La invención se refiere además a péptidos epítopos de células T derivados de dicha proteína no modificada por medio de los cuales es posible crear variantes de birodina 1 modificada con inmunogenicidad reducida. Antecedentes de la Invención Existen muchos ejemplos por medio de los cuales la eficacia de una proteína terapéutica se limita por una reacción inmune no deseada para la proteína terapéutica. Varios anticuerpos monoclonales de ratón han demostrado ser una promesa como una terapia en diversas situaciones de la enfermedad, pero que en ciertos casos ha fracasado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta del REF: 159623 anticuerpo anti-murino de humano (HA A) [Schroff, R. W. et al (1985) Cáncer Res. 45:879-885; Shawler, D.L. et al (1985) J. Iwmunol. 135:1530-1535]. Para los anticuerpos monoclonales, se han desarrollado una diversidad de técnicas en un intento por reducir la respuesta HAMA [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667] . Estas metodologías de ADN recombinantes han reducido generalmente la información genética del ratón en el constructo del anticuerpo final, mientras se incrementa la información genética de humano en el constructo final. No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes han producido, en varios casos, una respuesta inmune en pacientes [Issacs J.D. (1990) Sem. Iwmunol. 2: 449,456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417-1420] . Los anticuerpos no son la única clase de molécula de polipéptido administrados como un agente terapéutico contra el cual una respuesta inmune puede acoplarse. Aun las proteínas de origen humano y las mismas secuencias de aminoácidos como se presentan dentro del humano, pueden inducir incluso una respuesta inmune en humanos. Ejemplos notables incluyen el uso terapéutico del factor que estimula la colonia de granulocitos-macrófagos [ adhwa, M. et al (1999) Clin. Cáncer Res. 5: 1353-1361] e interferón alfa 2 [Russo, D. et al (1996) Bri . J. Hae . 94: 300-305; Stein, R. et al (1998) New Engl . J. Med. 318: 1409-1413] entre otros.

Un factor principal en la inducción de una respuesta inmune es la presencia dentro de los péptidos de proteína que pueden estimular la actividad de células T vía la presentación de moléculas MHC clase II llamadas "epítopos de células T" . Tales epítopos de células T potenciales se definen comúnmente como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos con la capacidad para enlazar moléculas MHC clase II. Tales epítopos de células T pueden medirse para establecer una unión MHC. Implícitamente, un "epítopo de células T" significa un epítopo que cuando se enlaza a las moléculas MHC, puede ser reconocido mediante un receptor de células T (TCR) , y que puede, al menos en principio, provocar la activación de estas células T mediante el acoplamiento de un TCR para promover una respuesta de células T. Se entiende sin embargo usualmente, que ciertos péptidos que se encuentran para enlazar moléculas MHC clase II pueden retenerse en una secuencia de proteína debido a que tales péptidos se reconocen como "mismos" dentro del organismo en el cual se administra la proteína final. Se sabe que ciertos péptidos de estos epítopos de células T pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de las células, y posteriormente presentarse mediante moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) para impulsar la activación de las células T. Para los péptidos presentados mediante la clase II de MHC, tal activación de células T pueden dar lugar entonces, por ejemplo, a una respuesta del anticuerpo mediante la estimulación directa de células B para producir tales anticuerpos. Las moléculas MHC clase II son un grupo de proteínas altamente polimórficas que juegan un papel central en la selección y activación de las células T auxiliadoras. El grupo DR antígeno de leucocitos de humano (HLA-DR) es el isotipo predominante de este grupo de proteínas y es el principal enfoque de la presente invención. Sin embargo, los isotipos HLA-DQ y HLA-DP realizan funciones similares, dentro de la presente es igualmente aplicable a éstos. La molécula DR clase II MHC se elabora de una cadena alfa y beta que se inserta a sus terminaciones C a través de la membrana celular. Cada hetero-dímero posee un dominio que enlaza un ligando que enlaza a péptidos que varían entre 9 y 20 aminoácidos en longitud, a pesar de que el canal de enlace pueda acomodar un máximo de 11 aminoácidos . El dominio que enlaza ligandos está compuesto de 1 a 85 aminoácidos de la cadena alfa y 1 a 94 aminoácidos de la cadena beta. Las moléculas DQ han demostrado recientemente tener una estructura homologa y las proteínas de la familia DP se espera que sea muy similar. En humanos, se conocen aproximadamente 70 diferentes alotipos del isotipo DR, para DQ existen 30 diferentes alotipos y para DP se conocen 47 alotipos diferentes. Cada individuo produce de dos a cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos alelos DP. La estructura de una diversidad de moléculas DR ha sido resuelta y tales estructuras apuntan a un canal de enlace de péptido de extremo abierto con un número de cavidades hidrofóbicas que se acoplan a los residuos hidrofóbicos (residuos de las cavidades) del péptido [Brown et al Nature (1993) 364 : 33; Stern et al (1994) Nature 368 : 215] . El polimorfismo que identifica los diferentes alotipos de la molécula clase II, contribuye a una amplia diversidad de superficies de enlace diferentes para los polipéptidos dentro del canal de enlace de péptido y a nivel de la población asegura la flexibilidad máxima con respecto a la habilidad para reconocer proteínas extranjeras y acoplar una respuesta inmune a los organismos patogénicos. Existe una cantidad considerable de polimorfismo dentro del dominio del ligando con distintas "familias" dentro de las diferentes poblaciones geográficas y grupos étnicos. Este polimorfismo afecta las características de enlace del dominio de enlace del péptido, así, las diferentes -"familias" de. moléculas DR tendrán especificidades para los péptidos con diferentes propiedades de secuencia, a pesar de que puede haber algún traslape. Esta especificidad determina el reconocimiento de epítopos de células Th (respuesta de células T clase II) que son responsables finalmente de conducir la respuesta del anticuerpo a los epítopos de la célula B presentes en la misma proteína a partir de la cual se deriva el epítopo de célula Th. Así, la respuesta inmune para una proteína en un individuo está influenciada fuertemente por el reconocimiento del epítopo de la célula T, que es una función de la especificidad que enlaza péptidos del alotipo HLA-DR del individuo. Por consiguiente, para identificar epítopos de células T dentro de una proteína o péptido en el contexto de una población global, es deseable considerar las propiedades de enlace como un conjunto diverso de alotipos HLA-DR como sea posible, cubriendo así como sea posible un alto porcentaje de la población mundial. Una respuesta inmune para una proteína terapéutica actúa vía la trayectoria de presentación del péptido clase II MHC . Aquí, las proteínas exógenas se sumergen y procesan para la presentación asociadas con las moléculas MHC clase II del tipo DR, DQ o DP. Las moléculas MHC clase II se expresan mediante células que presentan antígenos (APC) , tales como macrófagos y células dendríticas entre otros. El acoplamiento de un complejo de péptido clase II MHC mediante un receptor cognado de células T en la superficie de la célula T, junto con el enlace cruzado de otros co-receptores tales como la molécula CD4, pueden inducir un estado activado dentro de la células T. La activación conduce a la liberación de citocinas que activan además a otros linfocitos tales como células B para producir anticuerpos o activar células asesinas T como una respuesta inmune celular completa. La habilidad de un péptido para enlazar una molécula clase II MHC dada para la presentación en la superficie de un APC depende de diversos factores muy notables en su secuencia primaria. Esto influenciará tanto su tendencia para el desdoblamiento proteolítico como también su afinidad para enlazarse dentro de la hendidura que enlaza al péptido de la molécula clase II MHC. La molécula clase II MHC/comple o del péptido en la superficie APC presenta una cara de enlace para un receptor de células T particular (TCR, por sus siglas en inglés) capaz de reconocer determinantes proporcionados tanto por los residuos expuestos del péptido y las moléculas MHC clase II . En el arte, existen procedimientos para identificar péptidos sintéticos capaces de enlazar moléculas MHC clase II (por ejemplo, W098/52976 y O00/34317) . Tales péptidos no pueden funcionar como epítopos de células T en todas las situaciones, particularmente, in vivo debido a las trayectorias del proceso u otro fenómeno. La identificación del epftopo de las células T es la primera etapa para la eliminación del epítopo. La identificación y eliminación de los epítopos de células T potenciales a partir de proteínas ha sido previamente descrita. En el arte, los métodos han sido proporcionados para permitir la detección de epítopos de células T usualmente mediante medios de escaneo computacionales para reconocer las porciones de secuencia en epítopos de células T determinados experimentalmente o alternativamente usando técnicas computacionales para predecir péptidos que enlazan moléculas MHC clase II, en particular, péptidos que enlazan DR particulares. La W098/52976 y WO00/34317 enseña las metodologías computacionales de hilado para identificar secuencias de polipéptido con el potencial para enlazar un subconjunto de alotipos DR clase II MHC. En estas enseñanzas, los epítopos de células T predichas se eliminan mediante el uso de la sustitución de aminoácidos juiciosa dentro de la secuencia primaria del anticuerpo terapéutico o proteína sin anticuerpos de ambas derivaciones humana y no humana. Se han usado en el arte otras técnicas que aprovechan los complejos solubles de moléculas MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos y capaces de enlazar clones de células T a partir de muestras de sangre periférica de humano o sujetos animales experimentales [CER , F. et al (1998) Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. et al (2001) TRENDS in Immunol . 22:583-588]. Estos y otros esquemas incluyen por ejemplo, el uso de proteínas completas o repetidos sintéticos, o moléculas variantes para la proteína de interés, pueden separarse por exclusión para moléculas con habilidad alterada para enlazar o estimular células T pueden igualmente ser aprovechadas en una estrategia para la identificación del epítopo. Como se detalló arriba y como consecuencia de lo mismo, sería deseable identificar y remover o al menos reducir los epítopos de células T a partir de un péptido, polipéptido o proteína dados, en principio terapéuticamente valiosos, pero originalmente inmunogénicos . Una de estas moléculas terapéuticamente valiosas es birodina 1. La presente invención proporciona formas modificadas de birodina 1 con uno o más epítopos de células T retirados. La secuencia de la proteína birodina 1 dada por Gawlak et al [gawlak, S. et al (1997) Biochemistry 36:3095-3103] se describe en el código de una sola letra como sigue: DVSFRLSGATTTSYGVFIKNLREALPYERKVYNIPLLRSSISGSGRYTLLHLTNYADETIS VAVDVTNVYIMGYLAGDVSFFNEASATEAAKFVFKDAKKKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRE NIPLGLPALDSAITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLA TISLENNWSALSKQIQIASTNNGQFESPWLIDGNNQRVSITNASARWTSNIALLLNRNN IAAIGEDISMTLIGFEHGLYGI La proteína birodina 1 es un polipéptido sencillo de 267 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 29,000 Da. La birodina 1 es un tipo de proteína que inactiva al ribosoma tipo 1 (RIP, por sus siglas en inglés) aislado originalmente a partir de las raíces de la planta Bryonia dionica (US , 5541110] . Existe un interés considerable en este y otros RIP a causa de su toxicidad para las células vivas.

En las formas recombinantes particulares en fusión con los dominios objetivo de células específicas (por ejemplo, los anticuerpos) tienen un valor potencial en muchas áreas terapéuticas en donde la muerte selectiva de poblaciones de células particulares es un resultado deseado. Es un objetivo particular de la presente invención, proporcionar proteínas de birodina 1 modificadas en las cuales las características inmunes se modifican por medio de números reducidos de epítopos de células T potenciales . Se han proporcionado otras moléculas de birodina, en particular, la birodina 1 recombinante particular [US, 5541110; 113,5932447], pero estas enseñanzas no reconocen la importancia de los epítopos de células T para las propiedades inmunogénicas de la proteína ni se han concebido para influenciar directamente dichas propiedades en una forma específica y controlada, de acuerdo al esquema de la presente invención. En contraste, la solicitud de patente PCT WO00/34317 publicada el 15 de junio del 2000 describe una molécula de birodina 1 modificada que incluye sustituciones en las posiciones 5, 6, 18, 27, 111, 164, 216, 222, 237 y 24.9. Las sustituciones han sido seleccionadas en base a una herramienta de coincidencia de porciones in silico y no se dirigen a la mayoría de los epítopos del clase II MHC biológicamente pertinentes detectados en un ensayo biológico que sirven para la primera vez descrita aquí. Por otra parte, cuando la presente invención describe secuencias que van a considerarse como epítopos biológicamente relevantes en la molécula del sujeto, los inventores han reconocido ampliamente secuencias idénticas en proteínas relacionadas principalmente la cc-tricosantina, ct-momorcarina y ß-momorcarina que de acuerdo con la homología estructural son epítopos relevantes también en estas proteínas. Existe una necesidad continua de análogos de birodina 1 con propiedades mejoradas. Las mejoras deseadas incluyen esquemas alternativos y modalidades para la expresión y purificación de dicho terapéutico, pero también y especialmente, mejoras en las propiedades biológicas de la proteína. Existe una necesidad particular por mejorar las características in vivo cuando se administran al sujeto humano. A este respecto, es altamente deseable proporcionar birodina 1 con potencial ausente o reducido para inducir una respuesta inmune en el sujeto humano. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona formas modificadas de birodina 1, en la cual las características inmunes se modifican por .medio de números reducidos de epítopos de células T potenciales. La invención describe secuencias identificadas dentro de la secuencia primaria de birodina 1 en virtud del potencial de enlace de clase II MHC. Esta descripción pertenece específicamente a la proteína de birodina 1 que comprende inclusive de un pro-péptido N-terminal de 267 aminoácidos. La presente invención describe las principales regiones de la secuencia primaria birodina 1 que es inmunogénica en el hombre y que por medio de la cual proporciona la información crítica requerida para dirigir la modificación de la secuencia, para eliminar o reducir la efectividad inmunogénica de estos sitios. En una modalidad, los péptidos sintéticos que comprenden dichas regiones pueden proporcionarse en una composición farmacéutica para el propósito de promover una respuesta tolerogénica para la molécula completa. En una modalidad adicional, las moléculas de birodina 1 modificadas dentro de las regiones epítopo descritas en la presente, pueden usarse en composiciones farmacéuticas. En resumen, la invención se refiere a las siguientes cuestiones : . usar un panel de péptidos sintéticos en un ensayo de células T nuevas para trazar las regiones inmunogénicas de la birodina 1; . las secuencias del péptido derivado de la birodina 1 se encuentran para evocar un índice de estimulación mayor de alrededor de 2 en un ensayo de células T nuevas; . una molécula que comprende de una versión modificada de la secuencia de aminoácidos de birodina 1 capaz de evocar un índice de estimulación menor al valor evocado por una secuencia de aminoácidos de birodina 1 del tipo silvestre en un ensayo de proliferación de células T usando células de un donador sensible a la birodina 1; una molécula modificada que tiene la actividad biológica de birodina 1 y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula no modificada que tiene la misma actividad biológica cuando se usa in vivo; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde la pérdida de inmunogenicidad se logra eliminando uno o más epítopos de células T derivados de la molécula no modificada originalmente; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde la pérdida de inmunogenicidad se logra mediante la reducción en números de alotipos MHC capaces de enlazar péptidos derivados de la molécula; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde los epítopos de células T son secuencias de péptido o ; ligandos clase II MHC que muestran la habilidad para estimular o enlazar células T vía la presentación en la clase II; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde las secuencias de péptidos se seleccionan del grupos como se detalla en la figura 1; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde los residuos de 1 a 9 aminoácidos, preferiblemente un residuo de aminoácidos en cualquiera de los epítopos de células T presente originalmente se altera; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde la alteración de los residuos de aminoácido se sustituyen, adicionan o eliminan de los residuos de aminoácidos presentes originalmente mediante otros residuos de aminoácido en posiciones específicas; . una molécula especificada según las circunstancias, en donde, si es necesario, además de la alteración adicional usualmente por sustitución, adición o eliminación de aminoácidos específicos se conduce para restaurar la actividad biológica de la molécula; . una molécula de péptido del anterior que comparte más de 90% de identidad del aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido de la FIGURA 1; . una molécula de péptido del anterior que comparte más de 80% de identidad del aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido de la FIGURA 1; . secuencias de péptido como las anteriores capaces de enlazar MHC clase II; una molécula de birodina 1 especificada según las circunstancias, en donde uno o más de las sustituciones del aminoácido se conduce en una posición que corresponde a cualquiera de los aminoácidos especificados dentro de la FIGURA 1; una molécula de birodina 1 especificada según las circunstancias, en donde la alteración se conduce en uno o más residuos de cualquiera o todas las cadenas de los residuos contiguos de las secuencias (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) de abajo, en donde dichas secuencias se derivan a partir de la secuencia de birodina 1 tipo silvestre cuando se usa un código de letra sencillo; (a) = RYTLLHLTNYADETISVAVDV (Rl) , (b) = ATEAAKFVFKDAKKK (R2), (c) = ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA (R3) , (d) = ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA R4), (e) = ATISLE NWSALSKQIQIAST (R5) , una molécula de péptido que comprende de 13 a 15 residuos consecutivos de cualquiera de las secuencias (a) , (b) , (c) , (d) o (e) anteriores; . una molécula de péptido que comprende al menos de 9 residuos consecutivos de cualquiera de las secuencias (a) , (b) , (c). , (d) o (e) anteriores; . una molécula de péptido del anterior que comparte más de 90% en identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido derivadas a partir de a) , (b) , (c) , (d) o (e) anteriores; . una molécula de péptido del anterior que comparte más de 80% en identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido derivadas a partir de a) , (b) , (c) , (d) o (e) anteriores; . secuencias de péptido como las anteriores capaces de enlazar MHC clase II; una molécula de birodina 1 especificada según las circunstancias, en donde uno o más de las sustituciones de aminoácido se conducen en una posición que corresponde a cualquiera de los aminoácidos especificados dentro de cualquiera de las secuencias (a) , (b) , (c) , (d) o (e) anteriores ; una molécula de birodina 1 especificada según las circunstancias, en donde uno o más de las sustituciones de aminoácido se conducen en una posición que corresponde a cualquiera de los aminoácidos especificados dentro de cualquiera de las secuencias (a), y o (e) anteriores; una molécula de birodina 1 especificada según las circunstancias, en donde uno o más de las sustituciones de aminoácido se conducen en una posición que corresponde a cualquiera, de los aminoácidos especificados dentro de la secuencia (a) y o (e) y sustituciones adicionales hechas dentro de la secuencia (c) y o (d) anteriores; . una secuencia de péptido que consiste al menos de 9 residuos de aminoácido consecutivos de cualquiera de las secuencias (a) , (b) , (c) , (d) o (e) como las especificadas anteriormente y su uso para la elaboración de birodina 1, oc-tricosantina, a-momorcarina o ß-momorcarina, que tienen sustancialmente menos o ninguna inmunogenicidad que cualquier molécula no modificada que tiene la actividad biológica de un RIP de tipo silvestre cuando se usa in vivo; . una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los péptidos o péptidos modificados de arriba, que tienen la actividad de enlazar HC clase II; una secuencia de ADN o molécula que codifica cualquiera de las moléculas modificadas especificadas definidas arriba y abajo; una composición farmacéutica que comprende una molécula modificada que tiene actividad biológica de birodina 1; . una composición farmacéutica definida arriba y/o en las reivindicaciones, opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente; . un método para fabricar una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la birodina 1 definida en cualquiera de ' las reivindicaciones que comprenden las siguientes etapas: (i) determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o parte del mismo; (ii) identificar uno o más epítopos de células T potenciales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante cualquier método que incluya la determinación del enlace de péptidos a las moléculas que usan técnicas in vi tro o in silico o ensayos biológicos; (iii) diseñar nuevas variantes de secuencia con uno o más aminoácidos dentro de los epítopos de células T potenciales identificados, modificados en tal forma que se reduzca sustancialmente o elimine la actividad del epítopo de células T determinada por el enlace de los péptidos a las moléculas MHC que usan técnicas in vi tro o in silico o ensayos biológicos; (iv) construir tales variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinantes y probar dichas variantes para identificar una o más variantes con propiedades deseables; y (v) repetir opcionalmente las etapas (ii) a (iv).; . un método especificado según las circunstancias, en donde la etapa (iii) se lleve a cabo mediante la sustitución, adición o eliminación de 1 a 9 residuos de aminoácidos en cualquiera de los epítopos de células T presentes originalmente ; . un método especificado según las circunstancias, en donde la alteración se hace con respecto a una secuencia de proteína homologa y/o técnicas de modelación in silico; un método especificado según las circunstancias, en donde la etapa (ii) de arriba se lleva a cabo mediante las siguientes etapas: (a) seleccionar una región del péptido que tiene una secuencia del residuo del aminoácido conocido; (b) traslapar en forma secuencial muestras de segmentos de residuos de aminoácidos de tamaño uniforme predeterminado y constituidos mediante al menos tres residuos de aminoácidos a partir de la región seleccionada; (c) calcular el registro de enlace de la molécula clase II MHC para cada dicho segmento de muestra sumando los valores asignados para cada cadena lateral del residuo de aminoácidos hidrofóbicos presente en dicho segmento de residuo de aminoácidos probados; y (d) identificar al menos uno de dichos segmentos adecuados para la modificación, en base al registro de enlace de la molécula de clase II MHC calculado, para cambiar el registro de enlace clase II MHC completo para el péptido sin reducir sustancialmente la utilidad terapéutica del péptido; la etapa (c) se lleva a cabo preferible usando una función de registro Bóhm modificada que incluye de 12 a 6 términos de energía conformacional de ligando y términos repulsivos de la energía del ligando-proteína de van der Waal mediante (1) proporcionar una primer base de datos de los modelos de la molécula clase II MHC; (2) proporcionar una segunda base de datos de las estructuras de péptido autorizada para dichos modelos de la molécula clase II MHC; (3) seleccionar un modelo de la primera base de datos; (4) seleccionar una estructura de péptido permitida de la segunda base de datos; (5) identificar las cadenas laterales del residuo de aminoácidos presentes en cada segmento probado; (6) determinar el valor de afinidad de enlace para todas las cadenas laterales en cada segmento probado; y repetir las etapas (1) a través de (5) para cada modelo y cada estructura; . un péptido de epítopo de células T 13mero que tiene una actividad de enlace clase II MHC potencial y creada a partir de birodina 1 no modificada, seleccionada a partir del grupo como se describe en la FIGURA 1 y su uso para la fabricación de birodina 1 que tiene sustancialmente menos o ninguna inmunogenicidad que cualquier molécula no modificada con la misma actividad biológica cuando se usa in vivo; . una secuencia de péptido que consiste de al menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos de un péptido de epítopo de células T 13 mero derivados a partir de cualquiera de las secuencias en la FIGURA 1 y su uso para la fabricación de birodina 1 que tienen sustancialmente menos o ninguna inmunogenicidad que cualquier molécula no modificada y que tiene la actividad biológica de una molécula de birodina cuando se usa in vivo. . una molécula de birodina 1 de la estructura de acuerdo con la fórmula I : X°DVSFRLSGATTTSYGVFIKNLREALPYERKVYNIPLLRSSISGSGRYX1X2LX3 LTX4X5ADETX6SVAX7DX8TNWIMGYLAGDVSYFFNEASATEAAKX9X10FKDAKKKX1:LTL PYSGNYERX12QTX13AX14X15X16X17ENX18PLGX19PAX0DSAX21TTX22YX23X24TASSAAS AX25X26X27X28IQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLATX29SX30E N SAX31SX32QX3 3QX34AST GQFESP LIDGMMQRVSITNASARVVTSNIALLLNRN IAAIGEDIS TLI GFEHGLYGI en donde Xo es hidrógeno o una porción objetivo tal como un dominio del anticuerpo; XI es más preferiblemente A, pero G y P se consideran también; X2 es más preferiblemente M, pero A, G, P e I se consideran también; X3 es más preferiblemente A, pero G y P se consideran también; X4 es más preferiblemente P pero Y se considera también; Xs es más preferiblemente T pero S se considera también; X6 es P; X7 es más preferiblemente A pero P y G se consideran también; X8 es más preferiblemente A pero G y P se consideran también; X9 es más preferiblemente A pero P, G, H, D, E, N, Q, K, R, S y T se consideran también; X10 es más preferiblemente A pero P y G se consideran también; XII es más preferiblemente A pero G y P se consideran también; X12 es más preferiblemente A pero P, S, T, H y K se consideran también; X13 es T; X14 es H; X15 es S; X16 es más preferiblemente A, pero S, T, P, N, D, E, G, H, K y Q se consideran también; X17 es T; X18 es más preferiblemente A pero P se consideran también; X19 es más preferiblemente A, pero I, F, G, M, P, V, e Y se consideran también; X20 es más preferiblemente F pero P y se consideran también; x21 es más preferiblemente A pero P y G se consideran también; X22 es más preferiblemente G pero A y P se consideran también; X23 es más preferiblemente G pero A y P se consideran también; X24. es más preferiblemente A pero P y G se consideran también; X25 es más preferiblemente A pero P, G, S y T se consideran también; X26 es más preferiblemente A pero I, M, S, T, P y G se consideran también; X27 es más preferiblemente A pero G y P se consideran también; X28 es más preferiblemente S pero A, G, P, T, H, D, N, Q, K y R se consideran también; X29 es más preferiblemente T pero A, G, S, P, H, K, R, D, E, N y Q se consideran también; X30 es más preferiblemente A pero G, S, T, P, K, R, H, D, E, N y Q se consideran también; X31 es Q; X32 es más preferiblemente H pero D, E, F, L, N, P, S, W e Y se consideran también; X33 es más preferiblemente T pero A, G, P, D, E, H, K, R, N, Q, S y T se consideran también; X34 es más preferiblemente D, y por medio de los cuales se excluyen simultáneamente Xx= T, X2 = L, X3 = H, X4 = N, X5 = Y, Xe = I, X7 = V, X8 = V, X9 = F, X10 = V, X11 = V, X12 = L, X13 = A, X14 = G, X15 = K, X16 = I, X17 = R, X18 = I, X19 = L, X20 = L, X21 = I, X22 = L, X23 = Y, X24 = Y, X25 = L, X26 = L , X27 = V, X28 = L, X29 = I, X30 = L, X31 - L , X32 = K, X33 = I Y X34 = I se excluyen. El término "epítopo de células T" significa de acuerdo a lo que se comprende en esta invención, una secuencia de aminoácidos que es capaz de enlazar MHC clase II, capaz de estimular células T y/o también enlazar células T (sin activar una medida necesariamente) en el complejo con MHC clase II . El término "péptido" como se usa aquí y en las reivindicaciones anexas es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos se enlazan juntos mediante un enlace de péptido (definido aquí abajo) . Existen 20 aminoácidos que se presentan naturalmente involucrados en la producción biológica de péptidos y cualquier número de ellos pueden enlazarse en cualquier orden para formar un anillo o cadena de péptido. Los aminoácidos que se presentan naturalmente empleados en la producción biológica de todos los péptidos tienen la configuración L. Los péptidos sintéticos pueden prepararse empleando métodos sintéticos convencionales, utilizando aminoácidos L, ácidos D-amino o varias combinaciones de aminoácidos de dos configuraciones diferentes. Algunos péptidos contienen solamente unas pocas unidades de aminoácidos. Los péptidos cortos, por ejemplo, que tienen menos de diez unidades de aminoácidos, son referidos algunas veces como "oligonucleótidos" . Otros péptidos contienen un gran número de residuos de aminoácidos, por ejemplo, de hasta 100 o más, y son referidos como "polipéptidos" . Por convención, un "polipéptido" puede considerarse como cualquier cadena de péptido que contiene tres o más aminoácidos, considerando que un "oligopéptido" se considera usualmente como un tipo particular de polipéptido "corto". Así, como se usa aquí, se comprende que cualquier referencia para un "polipéptido" también incluye un oligopéptido . Además, cualquier referencia para un "péptido" incluye polipéptidos , oligopéptidos y proteínas. Cada arreglo diferente de aminoácidos forman diferentes polipéptidos o proteínas. El número de polipéptidos, y así, el número de diferentes proteína, que pueden formarse es prácticamente ilimitado. "Carbón alfa (C ) " es el átomo de carbono del componente (CH) carbono-hidrógeno que está en la cadena de péptido. Una "cadena lateral" es un grupo colgante para Ca, que puede comprender una porción, o grupo complejo o simple, que tiene dimensiones que pueden variar significativamente comparadas a las dimensiones del péptido. La invención puede aplicarse a cualquier especie de molécula de birodina 1 con sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos primarias como aquellas descritas aquí e incluirían por lo tanto, moléculas de birodina 1 derivadas mediante medios de ingeniería genética u otros procesos y puede contener más o menos que 267 residuos del aminoácido . La invención se concibe para superar la realidad práctica que introduce proteínas solubles con un propósito terapéutico para activar en el hombre una respuesta inmune, que resulta en el desarrollo de anticuerpos hospedadores que enlazan a la proteína soluble. La presente invención persigue dirigirse a esto, proporcionando proteínas de birodina 1 con una tendencia alterada para producir una respuesta inmune en la administración al hospedador humano. De acuerdo con los métodos descritos aquí, los inventores han descubierto las regiones de la molécula de birodina 1 que comprenden epítopos de células T críticas que conducen las respuestas inmunes para esta proteína. El método general de la presente invención que conduce a la birodina 1 modificada comprende las siguientes etapas: (a) determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o parte de la misma; (b) identificar uno o más epítopos de las células T potenciales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante cualquier método que incluye la determinación de los enlaces de los péptidos para las moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos ; (c) designar nuevas variantes de secuencia con uno o más aminoácidos dentro de los epítopos de células T potenciales identificadas modificados de tal forma para reducir o eliminar sustancialmente la actividad del epítopo de la célula T determinada mediante el enlace de los péptidos para las moléculas MHC usando técnicas in vitro e in vivo o ensayos biológicos. Tales variantes de secuencia se crean de tal forma, que se evita la creación de nuevos epítopos de células T potenciales mediante las variaciones de secuencia a menos que tales epítopos de células T potenciales nuevas son a su vez, modificadas de tal forma que se reduzca o elimine sustancialmente la actividad del epítopo de células T; y (d) construir tales variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinantes y probar dichas variantes para identificar una o más variantes con propiedades deseables de acuerdo a las técnicas recombinantes bien conocidas . la identificación de epítopos de células T potenciales de acuerdo a la etapa (b) pueden llevarse a cabo de acuerdo a los métodos descritos previamente en el arte. Los métodos adecuados se describen en WO 98/59244; O 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 y pueden usarse para identificar la tendencia de enlace de los péptidos derivados de birodina 1 para una molécula clase II MHC. En la práctica, las composiciones incluidas en la presente invención se han derivado de la aplicación convenida de los ensayos de proliferación de células T de humano ex vivo y una herramienta de software que aprovecha el esquema descrito en la WO 02/069232 y que es una modalidad de la presente invención . El software simula el proceso de la presentación del antígeno en el nivel de interacción de enlace clase II MHC de péptido para proporcionar un registro de enlace para cualquier secuencia de péptido dada. Tal registro se determina mediante cualquiera de los alotipos clase II MHC predominantes existentes en la población. Como este esquema es capaz de probar cualquier secuencia de péptido, pueden predecirse las consecuencias de las sustituciones, adiciones 0 eliminaciones de aminoácidos con respecto a la habilidad de un péptido para interactuar con un canal de enlace clase II MHC. En consecuencia, las nuevas composiciones de secuencia pueden ser diseñadas para contener números reducidos de péptidos capaces de interactuar con la clase II MHC y en consecuencia funciona como epítopos de células T inmunogénicas . Cuando el ensayo biológico que usa cualquier muestra del donador dado puede evaluar el enlace a un máximo de 4 alotipos DR, el proceso in silico puede probar la misma secuencia de péptido usando simultáneamente <40 alotipos. En la práctica, esta metodología es capaz de dirigir el diseño de nuevas variantes de secuencia que están comprometidas por su capacidad para interactuar con los alotipos MHC múltiples.

A modo de ejemplo en esta metodología in silico, los resultados de un análisis conducido en la secuencia completa de . birodina 1 se proporcionan como la FIGURA 1. Allí dentro se listan secuencias de péptido 13mero derivadas de birodina 1 detectadas por tener la capacidad para enlazar uno o más alotipos clase II MHC con un registro de enlace significativo. Tomados en su totalidad, este conjunto de datos de péptidos 13mero se considera que proporciona con un alto grado de certeza, el universo de ligandos de clase MHC permisibles para la proteína de birodina 1. Por razones tales como el requerimiento para el proceso proteolítico del polipéptido de birodina 1 completo y otras etapas fisiológicas que conducen a la presentación de los péptidos de birodina 1 in vivo, estaría claro que un subconjunto relativamente menor del repertorio completo de los péptidos tendrá una relevancia biológica última. Para identificar tales péptidos biológicamente relevantes, los inventores han desarrollado una metodología que aprovecha los ensayos de proliferación de células T de humano ex vivo. Esta metodología ha probado ser un método particularmente efectivo y se describe aquí como una modalidad de la invención. El método pude aplicarse para probar parte de la secuencia, por ejemplo, un subconjunto de péptidos de birodina 1 tales como todos o algunos de aquellos listados en la FIGURA 1; o el método puede aplicarse para probar la secuencia completa. En los presentes estudios, el método ha involucrado la prueba de traslapar las secuencias de péptido derivadas de birodina 1 en un esquema para escasear y probar la secuencia de birodina 1 completa (que incluye péptidos que representan el pro-péptido N-terminal) . Los péptidos sintéticos se prueban por su capacidad para evocar una respuesta proliferativa en la célula T de humano cultivada in vitro. Cuando este tipo de metodología se conduce usando células T de humano nuevas tomadas a partir de donadores saludables, los inventores han establecido que en la operación de tal ensayo, un índice de estimulación igual o mayor que 2.0 es una medida útil de la proliferación inducida. El índice de estimulación se deriva convencionalmente mediante la división del registro de proliferación (por ejemplo, cuentas por minuto de radioactividad si se usa la incorporación de 3H-timidina) medida por el péptido de prueba mediante el registro medido en las células no contactadas con un péptido de prueba. Los presentes estudios han descubierto algunas de las secuencias de 32 péptidos capaces de evocar una respuesta proliferativa significativa (es decir., SI>2.0) en células T derivadas de al menos un donador. Dentro de este conjunto de péptidos, un subconjunto adicional de péptidos han sido identificados que evocan una respuesta proliferativa significativa en 2 o más muestras del donador individual y para algunas de estas respuestas la magnitud de las respuestas han sido de hecho significativamente más altas que SI=2.0. Se prefiere más, proporcionar una molécula de birodina 1 en la cual la modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) se conduce dentro de las regiones inmunogénicas de la molécula precursora, Los inventores han descubierto en la presente que la mayoría de las regiones inmunogénicas de la molécula de birodina 1 en el hombre se confinan al menos 5 regiones R1-R5 que abarcan los residuos 46-66; 88-102; 136-162 y 178-204 que comprenden respectivamente secuencias de aminoácido; Rl) = RYTLLHLTNYADETISVAVDV, R2) = ATEAAKFVFKDAKKK, R3) = ERLQTAAGKI E IPLGLPALDSA, R4) = ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA, R5) = ATISLENNWSALSKQIQIAST, Estas regiones se han identificado sobre la base de dar SI > 2 en una o más muestras PBMC de donadores. Por ejemplo, la región Rl de epítopo se demostró que es reactivo en 6 muestras diferentes del donador que representa más del 28% de las muestras del donador separadas por exclusión. De manera similar, los epítopos R2 y R3 reaccionaron con 3 muestras del donador (14%) probadas, R4 con 5(24%) de las muestras del donador y R5 con 4 (19%) de donadores probadas. Tomadas juntas, las regiones R1-R5 reaccionaron con 10 de las 21 (48%) muestras PBMC del donador probadas, cubriendo un rango amplio de especificidades alotípicas. Las principales modalidades preferidas de la presente invención comprenden moléculas de birodina 1 para las cuales los lígandos de clase II MHC identificados dentro de cualquiera de los epítopos R1-R5 se alteran como para eliminar el enlace o reducir de otra manera los números de los alotipos MHC a los cuales se puede enlazar el péptido. Cuando los epítopos potenciales múltiples se identifican y en particular cuando se encuentra que un número de secuencias de péptido son capaces de estimular células T en ensayos biológicos, se puede tener conocimiento de las características estructurales de la proteína con relación a su tendencia para evocar una respuesta inmune vía la trayectoria de presentación clase II MHC. Por ejemplo, cuando la estructura cristalina de la proteína de interés se conoce, el registro del factor B cristalográfico puede analizarse mediante la evidencia de desórdenes estructurales dentro de la proteína, un parámetro sugerido para correlacionarse con la proximidad a los epítopos de péptido inmunodominantes biológicamente relevantes [Dai G. et al (2001) J". Biologica.1 Chem. 276: 41913-41920]. Cuando se conduce un análisis en el modelo de la estructura cristalina de la birodina 1 [PDB ID: 1BRY, Gawlak, S.L., et al (1997) Biochemistry 36: 3095] sugiere una probabilidad alta para epítopos inmunodominantes múltiples con al menos 4 zonas discretas trazadas en la posición media de áreas con registros de factor B promedio de arriba. De estas 4 áreas, se trazaron 3 de los límites N-terminal de péptido mostraron evocar una respuesta proliferativa en el ensayo de la célula T nuevas del ejemplo 2.

Estos datos tomados junto con los datos para los números de donadores nuevas que responden a los péptidos particulares permiten una clasificación predicha de la mayoría de las regiones inmunodominantes de la molécula. Sin embargo, se reconoce que en la práctica, cada una de estas regiones se consideran inmunogénicas en el hombre y por lo tanto, requieren una modificación bajo el esquema de la invención. Por consiguiente, con respecto a las cadenas de secuencia definidas arriba R1-R5, las secuencias pueden clasificarse en el orden {R1,R5}, {R3,R4}, R2 ; en donde {R1,R5} se consideran la mayoría de las secuencias inmunogénicas y R2 relativamente menos inmunogénicas. La clasificación igual se atribuye a aquellas secuencias en corchetes. En esta base las composiciones más preferidas de birodina 1 bajo el esquema de la presente, involucran las modificaciones dentro de las regiones Rl y R5 epítopo. Las composiciones que contienen modificaciones adicionales dentro de las regiones R3 y R4 del epítopo se desean también y opcionalmente también sustituciones adicionales dentro de la región R2 del epítopo. Las secuencias de péptido descritas aquí, representan la información crítica requerida para la construcción de las moléculas de birodina 1 modificadas en las cuales uno o más de estos epítopos se comprometen, bajo el esquema de la presente, los epítopos se comprometen mediante la mutación para resultar en secuencias no muy prolongadas para funcionar como epí opos de células T. Es posible usar métodos de ADN recombinante para lograr la mutagénesis deseada de las secuencias objetivo y muchas de tales técnicas se encuentran disponibles y son bien conocidas en el arte. En la práctica, un número de variantes de proteínas de birodina 1 se producirán y probarán para las características funcionales e inmunes deseadas . En donde el objetivo de esta invención es modificar las secuencias de aminoácido de al menos uno o más de los péptidos listados arriba de la FIGURA 1, es más preferido modificar la secuencia de una o más de las regiones epítopo Rl - R5 identificadas arriba. Existen aquí modificaciones adecuadas descritas que logran el objetivo de reducir o eliminar las capacidades de la secuencia de repetido del sujeto para funcionar como un epítopo de células T, el cual puede resultar en una molécula de birodina 1 con un potencial inmunogénico reducido cuando se administra como un terapéutico al hospedador humano. Para la eliminación de los epítopos de células T, las sustituciones de aminoácidos se hacen preferiblemente en puntos apropiados dentro de la secuencia de péptidos predicha para lograr una reducción sustancial o eliminación de la actividad del epítopo de células T. En la práctica, un punto apropiado igualará preferentemente un residuo de aminoácido que se enlaza dentro de una de las cavidades proporcionadas dentro del canal de enlace clase II MHC. Se prefiere además, alterar el enlace dentro de la primer cavidad de la hendidura llamada Pl o posición de anclaje Pl del péptido. La calidad de interacción de enlace entre el residuo de anclaje Pl del péptido y la primera cavidad del canal de enlace clase II MHC se reconoce porque es un determinante principal de la afinidad de enlace total para el péptido completo. Una sustitución apropiada en la posición del péptido será para un residuo que no es muy fácil de acomodar dentro de la cavidad, por ejemplo, la sustitución para un residuo más hidrofílico. Las combinaciones de sustitución dentro de un epítopo simple pueden contemplarse y por ejemplo, pueden ser particularmente apropiadas cuando los epítopos definidos individualmente se encuentran traslapados entre sí. Por otra parte, las sustituciones de aminoácidos ya sea sencillas dentro de un epítopo dado o en combinación dentro de un epítopo sencillo, pueden elaborarse en posiciones no equitativas a los "residuos de las cavidades" con respecto a los canales de enlace clase II MHC, pero en cualquier punto dentro de la secuencia de péptido. Las sustituciones pueden elaborarse con -respecto a una estructura homologa o método estructural producido usando técnicas in silico conocidas en el arte y pueden basarse en las características estructurales conocidas de la molécula, de acuerdo a esta invención. Todas las sustituciones caen dentro del alcance de la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos distintas a los péptidos identificados anteriormente, pueden contemplarse particularmente cuando se elaboran en combinación con sustituciones elaboradas dentro de un péptido listado. Por ejemplo, puede contemplarse un cambio para restaurar la estructura o actividad biológica de la molécula variante. Tales cambios y cambios compensatorios incluyen la eliminación o adición de residuos de aminoácidos particulares a partir del polipéptido de birodina 1 que resulta en una variante con actividad deseada en combinación con cambio en cualquiera de los péptidos descritos que caen dentro del alcance de la presente. Un ejemplo de tal conjunto de modificaciones preferidas se proporciona mediante la ruptura de la región epítopo Rl . La eliminación completa de todos los ligandos MHC posibles dentro de esta región se logra mediante el conjunto de sustituciones que comprenden los cambios; T49A, L50M, H52A, N55P, Y56T, I6iP, V65A y V67A. Tales cambios preferidos ya sea aislados o en combinación, son una modalidad de la invención.

¦ De manera similar, un conjunto preferido de modificaciones que logran la ruptura del epítopo R2 se proporciona mediante el conjunto de sustitución F99A, V10oA y Vxos . Tales cambios preferidos ya sea aislados o en combinación, son una modalidad de la invención.

Los conjuntos de sustitución alternativa de la región R3 del epítopo se definen en base al conocimiento de las características estructurales de la molécula. Sería altamente deseable construir una molécula de birodina 1 que contenga una sustitución en el residuo de leucina 115 (Li15) , como este residuo puede funcionar como un anclaje Pl para un ligando clase II MHC identificado dentro del epítopo R3. Un conjunto preferido de sustituciones comprenderían en consecuencia Ln5A, I 122A , Ii26A L130A, L133F y I137A. Sin embargo, como LU5 se localiza en el fondo de la hendidura de enlace para la actividad RIP, esta sustitución puede comprometer la actividad funcional de la molécula. Un conjunto alternativo de sustituciones pueden definirse de manera que sirvan para interrumpir los ligandos MHC significativos dentro del epítopo R3 y que mantienen aún el Li15. En consecuencia, estas sustituciones comprenden An8T, Gi2oH, K121S y 123T y se elaborarían alternativamente para los cambios duales Ln5A y I122A. Todos los cambios son una modalidad de la invención. Para la región del epítopo R4 , un conjunto de sustitución preferida comprende los cambios Li40G, Y142G , Y143A en combinación con L152A, L153A, Vi54A y L155S . Todos los cambios ya sea aislados o en combinación son una modalidad de la invención . Un ejemplo adicional de un conjunto de modificaciones preferidas se proporciona mediante la ruptura de la región del epítopo R5 usando los cambios que comprenden I i7T , Li89A, LigsQ , K197H, I200T e I202D . Todos los cambios ya sea aislados o en combinación son una modalidad de la invención. Para casi todas las sustituciones preferidas de arriba, los aminoácidos alternativos pueden considerarse en cualquier posición dada. Sin embargo, las elecciones del residuo alternativo son ilimitadas y están confinadas a residuos que satisfacen ampliamente los objetivos de reducir o eliminar la interacción del péptido MHC potencial y también se acomodan dentro de la estructura de la molécula; por ejemplo, se evitan choques en la cadena lateral significativos para las mayoría de los rotámeros y/o electrostática u otros contactos preservados o elaborados. Ejemplos de la selección de residuos alternativos que se pueden considerar, se proporcionan en la estructura de birodina 1 descrita en la fórmula 1. A partir de lo anterior, se puede observar que de acuerdo a esta invención, puede producirse y probarse una diversidad de variantes de proteínas de birodina 1 para las características funcionales e inmunes deseadas, y todas esas proteínas funcionales son modalidades de la presente invención. Por otra parte, las modificaciones dirigidas han demostrado que las secuencias de péptido no son capaces de enlazar moléculas MHC clase II con la misma afinidad como la secuencia de péptido (wt) progenitora o "tipo silvestre" que usan la herramienta de enlace clase II MHC in silico predecible de WO02/069232. Las moléculas preferidas de esta invención pueden prepararse en cualquiera de varias formas pero es preferible que se conduzcan aprovechando los métodos recombinantes de rutina. El procedimiento es relativamente fácil para usar las secuencias de proteínas y la información proporcionada en la presente para deducir un polinucleótido (ADN) que codifique cualquiera de las secuencias de proteína preferidas. Esto puede lograrse por ejemplo, usando una herramienta del software de computadora tal como una serie de software DNAstar [DNAstar Inc, Madison, WI, USA] o similar. Cualquier secuencia de ADN con la capacidad de codificar los polipéptidos preferidos de la presente u homólogos significativos de los mismos, deberán considerarse como modalidades de esta invención. Como un esquema general, los genes que codifican cualquiera de las secuencias de proteína de birodina 1 preferidas puede elaborarse usando síntesis del gen y clonarse en un vector de expresión adecuado. A su vez, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora y células seleccionadas y cultivadas. Las moléculas preferidas se purifican a partir del medio de cultivo y formuladas en una preparación para la administración terapéutica. Alternativamente, una secuencia de gen de birodina 1 tipo silvestre puede obtenerse por ejemplo, siguiendo una estrategia de clonación de cADN usando ARN preparado a partir de tejidos raíz de la planta Bryonia. El gen tipo silvestre puede usarse como una plantilla para la mutagénesis y construcción de secuencias de variantes preferidas. Se considera particularmente conveniente usar la estrategia de "PCR de extensión de traslape" descrita por Higuchi et al [Higuchi et al (1998) Nucleic Acids Res. 16:7351] aunque podrían ser aplicadas fácilmente otras metodologías y sistemas. La constitución de la molécula de birodina 1 preferida puede lograrse mediante las técnicas de ADN recombinantes, esto incluye las moléculas de birodina 1 fusionadas con dominios de región variable del anticuerpo deseado u otras porciones objetivo. Los métodos para purificar y manipular proteínas recombinantes que incluyen proteínas de fusión son bien conocidos en el arte. Las técnicas necesarias se explican completamente en la literatura tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Cultura" (R.I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" (Academia Press, Inc.); "handbook of Experimental Immunology" (D. M. eir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Millar & M.P. Calos. eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds . , 1987); "PCR: The polymerase Chain Reaction" , (Mullís et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds. , 1991) . Como estará claro por las personas expertas en el arte, múltiples conjuntos alternativos de sustituciones podrían presentarse en los cuales se logre el objetivo de eliminar un epítopo no deseado. Sin embargo, las secuencias resultantes podrían reconocerse por ser cercanamente homologas con las composiciones descritas en la presente y caer por lo tanto, dentro del alcance de la presente invención. Hasta donde esta invención se refiere para modificar a la birodina 1, las composiciones que contiene tales proteínas de birodina modificadas o fragmentos de proteínas de birodina modificadas y composiciones modificadas deberán considerarse dentro del alcance de la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a los ácidos nucleicos que codifican entidades de birodina modificadas. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a los métodos para el tratamiento terapéutico de humanos que usan las proteínas de birodina 1 modificadas. En este aspecto, la proteína de birodina 1 modificada puede enlazarse con una molécula del anticuerpo o fragmento de una molécula del anticuerpo. El enlace puede ser por medio de una ligadura cruzada o anticuerpo de birodina 1 como una proteína de fusión recombinante . La molécula de fusión puede contener el dominio de birodina 1 recombinante con el dominio del anticuerpo orientado hacia el término N de la molécula de fusión a pesar de que puede contemplarse la orientación opuesta. Las especificidades del anticuerpo deseado para enlazar a la molécula de birodina 1 modificada de la presente incluye aquellas dirigidas hacia internalizar los determinantes de antígeno. Ejemplos de esta clase de antígenos son raros pero podrían incluir el antígeno A33 [Heath, J. K. et al (1997) Proc. Nati, Acad. Sci . U.S.A. 94: 469-474] y el antígeno GA733-1 [US, 5, 840, 854] . El antígeno carcinoembriónico puede contemplarse para usarse y puede ser dirigido mediante cualquiera de los números anticuerpos, pero puede incluir MFE23 [chester, K.A. et al (1994) Lancet 343: 455], A%B7 [WO92/010159] , T84.66 [US , 5 , 081 , 235] MN-4 [Hansen, H.J. et al (1993) Cáncer 71: 3478-3485], COL-1 [US, 5 , 472 , 693] y otros. Otras especificaciones deseadas incluyen anticuerpos dirigidos a los antígenos que no se internalizan y esto puede incluir antígenos tales como el antígeno de glicoproteína de 40kDa reconocidos por el anticuerpo KS1/4 [Sperarman et al (1987) J. Pharmacol . Exp . Therapeutics 241: 695-703] y otros anticuerpos. Otros antígenos tales como el receptor del factor de crecimiento epidermal (HERI) o receptores relacionados tales como HER2 pueden seleccionarse que incluyen anticuerpos anti-GD2 tales como el anticuerpo 14.18 [US ,4,675,287; EP 0 192 657], o anticuerpos para el antígeno de membrana específica de próstata [US ,6,107,090] , el receptor IL-2 [US, 6, 013 , 256] , el determinante de Lewis Y, glicoproteínas de mucina u otros pueden contemplarse. En todos los casos en donde se elabora una proteína de birodina 1 modificada en fusión con una secuencia del anticuerpo, se desea usar secuencias del anticuerpo en las cuales han sido eliminados los epítopos de las células T, o secuencias capaces de enlazar moléculas MHC clase II, o estimular células T o enlazar a las células T en asociación con las moléculas MHC clase II. Una modalidad adicional de la presente invención, la proteína de birodina 1 modificada puede enlazarse a una proteína sin anticuerpo incluso, una proteína capaz de dirigir una interacción de enlace específico a una célula objetivo particular. Tales porciones de proteína incluyen una variedad de ligandos de polipéptido que son receptores de superficie celular e incluyen por lo tanto, numerosas citocinas, péptidos y hormonas del polipéptido y otros modificadores de respuesta biológica. Ejemplos prominentes incluyen tales proteínas como el factor de crecimiento epitelial vascular, factor de crecimiento epidermal, heregulina, las interleucinas , interferones , factor de necrosis de tumor y otra proteína y moléculas de glicoproteína . Las proteínas de fusión de estas y otras moléculas con birodina 1 de la presente invención pueden contemplarse y pueden comprender la porción de birodina 1 modificada ya sea en la orientación N-terminal o C-terminal con respecto al dominio del ligando de la proteína. Igualmente, el reticulado químico del ligando purificad para la proteína de birodina 1 modificada puede contemplarse dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad adicional, la proteína de birodina 1 modificada de la presente puede usarse como un complejo que contiene un polímero soluble en agua tal como hidroxipropilmetacrílamida u otros polímeros en donde la proteína de birodina 1 modificada colocada en el polímero o en una interacción de enlace no covalente con el polímero. Tal modalidad puede incluir además un dominio de enlace de antígeno tal como un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo en combinación con el complejo de birodina 1 del polímero . En un aspecto adicional, la invención se refiere a los métodos para el tratamiento terapéutico usando preparaciones farmacéuticas que comprenden moléculas derivadas o repetidos con identidad de secuencia o identidad de parte con las secuencias descritas aquí. En una aspecto todavía adicional, la mayoría de los epítopos inmunogénicos aquí descritos y que se relacionan a la molécula de birodina 1, demuestran también estar presentes dentro de la secuencia primaria de un número de otros tipos de proteínas RIP 1 de los cuales la birodina 1 es un ejemplo. Así, las proteínas a- tricosantina (1TCS) , a-momorcarina (1M0M) y ß-momorcarina (1CF5) y otros pueden mostrar un análisis de secuencia de proteína para contener elementos de secuencia con identidad o casi una identidad para las regiones inmunogénicas de la molécula de birodina 1. La figura 3 describe las comparaciones de secuencia entre los epítopos principales de birodina 1 y los elementos de secuencia de 1TCS, 1MOM y proteínas 1CF5. En cuanto a la presente invención, se refiere a los peptidos y secuencias modificadas derivadas de la proteína de birodina 1, en donde las secuencias sustancialmente similares o idénticas se identifican dentro de otras proteínas, estas se consideran que caen también dentro del alcance de la presente. Esto es particularmente verdadero para algunos de los conjuntos de mutaciones preferidas identificadas aquí. Por ejemplo, los cambios dentro de R2 y R3 implementados en la secuencia de birodina 1 pueden aplicarse para eliminar los ligandos clase II MHC de las regiones equivalentes dentro de la secuencia ITCS. Igualmente, los cambios Rl en la birodina 1 que comprenden una o más de las sustituciones T49A, L50M, H52A, N55P, Y56T, I6iP, V65A y V67A pueden aplicarse a las regiones equivalentes con las proteínas ITC y 1CFS . En lo precedente, la numeración que corresponde a la secuencia de birodina 1. Una proporción de los cambios R4 y R5 pueden implementarse también dentro de las proteínas RIP 1TCS, 1CF5 y 1M0M y también se encuentran dentro del alcance de la invención. Hasta donde esta invención se refiere con respecto a la birodina 1, las composiciones que contienen tales proteínas de birodina 1 modificadas o fragmentos de proteínas de birodina 1 modificadas y composiciones relacionadas deberán considerarse dentro del alcance de la invención. Un ejemplo pertinente a este respecto podría desarrollarse mediante estrategias de inducción de tolerancia mediada por el péptido en donde uno o más de los péptidos descritos se administran a un paciente con un intento inmunoterapéutico . Por consiguiente, las moléculas de los péptidos sintéticos, por ejemplo, uno o más de aquellos listados en la FIGURA 1 o más preferiblemente secuencias que comprenden todo o parte de cualquiera de las regiones Rl - R5 del epítopo definidas arriba. Tal péptido se considera una modalidad de la invención. • . · . En otro aspecto la presente invención se refiere a los ácidos nucleicos que codifican las entidades de la birodina 1 modificada . Breve descripción de las figuras La invención se ilustrará ahora mediante los ejemplos experimentales anteriores. La invención se ilustra adicionalmente mediante las figuras descritas a continuación: La FIGURA 1 proporciona una lista de secuencias de péptido en la birodina 1 con una actividad de enlace clase II MHC de humano potencial, los péptidos son 13 -meros, los aminoácidos se identifican usando un código de letras sencillo . La FIGURA 2 proporciona una tabla de las secuencias de péptido 15-mero de la birodina 1 analizadas usando el ensayo de células T in vitro de humano nuevas del EJEMPLO 2. Se indica el péptido ID# y la posición del residuo del péptido N-terminal dentro de la secuencia de birodina 1. La FIGURA 3 indica los elementos de secuencia Rl, R2 , R3 , R4 y R5 de la secuencia de birodina 1 (1BRY) que proporciona un índice de estimulación de 2.0 o mayor en las preparaciones PBMC a partir de 2 o más donadores PBMC que usan el ensayo de células T in vitro de humano nuevas del EJEMPLO 2. Las secuencias correspondientes de las proteínas relacionadas a-tricosantina (1TCS) , a-momorcarina (1MOM) y ß-momorcarina (1CF5) se muestran debajo de cada secuencia de birodina 1. Las secuencias son idénticas a la birodina 1 excepto cuando se indica. Los aminoácidos se describen usando un código de letra sencillo. La FIGURA 4 muestra el porcentaje de las respuestas del donador para los péptidos de birodina 1 individuales. El número total de los 85 peptidos se probaron usando las preparaciones PBMC de 21 muestras del donador. Una respuesta positiva se toma como un SI>2, las regiones del epítopo se identifican cuando las respuestas positivas se observan en 2 o más donadores . Las FIGURAS 5A a 5D muestran el trazo del índice de estimulación representativo (SI) a partir de los ensayos de proliferación de células T de humano nuevas. Las respuestas se muestran para concentraciones de 1 µ? y 5uM de péptido. Cada pico es la media de un ensayo por triplicado. La figura 5A muestra las respuestas PBMC a partir de 3 muestras del donador para los péptidos de birodina 1 abarcados dentro de la región Rl del epítopo. La figura 5B muestra las respuestas PBMC de 2 muestras del donador 2 a los péptidos de birodina 1 abarcados dentro de la región 2 del epítopo. La figura 5C muestra las respuestas PBMC de 2 muestra de donadores para los péptidos de birodina 1 abarcados dentro de la región R3 del epítopo. La figura 5D muestra las respuestas pBMC de 3 muestras de donadores para los péptidos de birodina 1 abarcados dentro de la región R5 dentro del epítopo. La FIGURA 6 es una descripción de los ligandos clase II MHC identificados dentro del epítopo de región Rl . Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del EJEMPLO 1. En este caso el perfil de enlace de 18 alotipos DR de humano se muestran en columnas. Los ligandos detectados son 13 -mero y el número 1 de residuos de cada 13 -mero se identifican mediante un bloque teñido. La intensidad de la interacción de enlace (alto, medio o bajo) para cada péptido con respecto a cada uno de los alotipos 18 se indica de acuerdo a la clave mostrada. La FIGURA 7 es una descripción de los ligandos clase II MHC identificados dentro de la región 2 del epítopo. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del EJEMPLO 1. En este caso, el perfil de enlace de 18 alotipos DR de humano se muestra en columnas. Los ligandos detectados son 13-mer y un número de residuos de cada 13-mer se identifica mediante un bloque teñido. La intensidad e la interacción de enlace (alto, medio o bajo) para cada péptido con respecto a cada uno de los 18 alotipos se indican de acuerdo a la clave mostrada. La FIGURA 8 es una descripción de los ligandos clase II MHC identificados dentro de la región R3 del epítopo. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del EJEMPLO 1. En este caso, el perfil de enlace de los 18 alotipos DR de humano se muestra en columnas. Los ligandos detectados son 13 -mero y el número del residuo 1 de cada 13-mero se identifica mediante un bloque teñido. La intensidad de la interacción de enlace (alto, medio o bajo) para cada péptido con respecto a cada uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo a la calve mostrada. La FIGURA 9 es una descripción de los ligandos clase II MHC identificados dentro de la región R4 del epítopo. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del EJEMPLO 1. En este caso, el perfil de enlace de 18 alotipos Dr de humano se muestra en columnas. Los ligandos detectados son 13 -meros y el número de residuos de 1 de cada 13 -meros se identifica mediante un bloque teñido. La intensidad de la interacción de enlace (alto, medio o bajo) para cada péptido con respecto a cada uno de los alotipos se indica de acuerdo a la clave mostrada. La figura 10 es una descripción de los ligandos clase II MHC identificados dentro de la región R5 del epítopo. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del EJEMPLO 1. En este caso, el perfil de enlace de los 18 alotipos Dr de humano se muestra en columnas. Los ligandos detectados son 13 -mero y el número del residuo 1 de cada 13-raero se identifica mediante un bloque teñido. La intensidad de interacción de enlace (alto, medio o bajo) para cada péptido con respecto a cada uno de los alotipos se indica de acuerdo a la clave mostrada. Descripción Detallada de la invención La fórmula 1 describe una estructura de birodina 1 más preferida que ofrece sustituciones alternativas que podrían considerarse para la incorporación en una molécula de birodina 1 con un potencial inmunogénico reducido. EJEMPLO 1 Método para identificar epítopos en la birodina 1 que usan un sistema in silico para conducir el análisis de enlace MHC de péptido. Existe un número de factores que juegan papeles importantes para determinar la estructura total de una proteína o polipéptido. Primero, el enlace del péptido, es decir, el enlace que une los aminoácidos en la cadena al mismo tiempo, es un enlace covalente. Este enlace es una estructura plana, esencialmente una amida sustituida. Una "amida" es cualquier grupo de compuestos orgánicos que contienen los grupos -CONH- . El enlace de péptido plano que enlaza Ca de aminoácidos adyacentes puede presentarse como descrito abajo: Debido a que el 0=C y los átomos C-N yacen en un plano relativamente rígido, la rotación libre no se presenta alrededor de estos ejes. Aquí, un plano específicamente descrito mediante la línea interrumpida se refiere algunas veces como una "amida" o "péptido plano" en donde yace el átomo de oxígeno (0) , carbono (C) , nitrógeno (N) e hidrógeno (H) de la estructura del péptido. En las esquinas opuestas de este plano de amida se localizan los átomos C . Puesto que no existe sustancialmente una rotación alrededor de los átomos 0=C y C-N en el péptido o plano de amida, una cadena de polipéptido comprende una serie de enlaces de péptido planos que unen los átomos Ca. Un segundo factor que juega un papel importante para definir la estructura total o conformación de un polipéptido 0 proteína es el ángulo de rotación de cada plano de amida alrededor del enlace Ca común. Los términos "ángulo de rotación" y "ángulo de torsión" se hacen con respecto a los términos equivalentes. Asumiendo que los átomos O, C, N y H permanecen en el plano de amida (que es usualmente una suposición válida, a pesar de que existen algunas desviaciones moderadas de la configuración plana de estos átomos para algunas conformaciones) , estos ángulos de rotación definen la conformación de la estructura del polipéptido N y R, es decir, la estructura como existe entre los residuos adyacentes. Estos dos ángulos se conocen como f y ?. Un conjunto de los ángulos, f1# ??, en donde el subíndice 1 representa un residuo particular de una cadena del polipéptido, define efectivamente así, la estructura secundaria del polipéptido. Las convenciones usadas para definir los ángulos f y ?, es decir, los puntos de referencia en los cuales los planos de amida forman un ángulo de grado cero y al definición de que el ángulo es f, y que el ángulo es ?, para un polipéptido dado, se definen en la literatura. Ver por ejemplo, Ramachandran et al. Adv. prot . Chem. 23:283-437 (1968) en las páginas 285-94, cuyas páginas se incorporan aquí por referencia. El presente método puede aplicarse a cualquier proteína, y se basa en parte al descubrimiento que en humanos los canales de enlace de la molécula clase II MHC de la posición de anclaje de cavidad 1 primaria tiene un pozo específicamente diseñado para cadenas laterales de aminoácidos particulares. La especificidad de esta cavidad se determina mediante la identidad del aminoácido en la posición 86 de la cadena beta de la molécula clase II MHC. Este sitio se localiza en el fondo de 1 cavidad 1 y determina el tamaño de la cadena lateral que puede acomodarse por esta cavidad. Marshall, K.W. , J. Immunol . , 152:4946-4956 (1994). Si este residuo es una glicina, entonces todos los aminoácidos aromáticos y alifáticos hidrofóbicos (alifáticos hidrofóbicos son: valina, leucina, isoleucina, metionina y aromáticos son: fenilalanina, tirosina y triptofano) pueden acomodarse en la cavidad, se prefieren las cadenas laterales aromáticas. Si este residuo de cavidad es una valina, entonces la cadena lateral de este aminoácido sobresale de la cavidad y restringe el tamaño de las cadenas laterales de péptido que pueden acomodarse tal que solamente las cadenas laterales alifáticas hidrofóbicas puedan acomodarse. Por consiguiente, en una secuencia del residuo de aminoácido, dondequiera que un aminoácido con un alifático hidrofóbico o cadena lateral aromática se encuentre, existe el potencial para un epítopo de células T restringidas clase II MHC presente. Sin embargo, si la cadena lateral es un alifático hidrofóbico, se asocia probablemente dos veces con el epítopo de células T a una cadena lateral aromática (asumiendo aproximadamente incluso una distribución de los tipos de cavidad 1 a través de la población global) . Un método computacional que abarca la presente invención perfila la posibilidad de regiones de péptido que contienen epítopos de células T como sigue: (1) Se escanea la secuencia primaria de un segmento de péptido de longitud predeterminada y se identifican todas las cadenas laterales aromáticas y alifáticas hidrofóbicas presentes. (2) las cadenas laterales alifáticas hidrofóbicas se les asigna un valor más grande para las cadenas laterales aromáticas; preferiblemente, alrededor de dos veces el valor asignado a las cadenas laterales aromáticas; por ejemplo, un valor de 2 para una cadena alifática lateral hidrofóbica y un valor de 1 para una cadena lateral aromática. (3) Los valores determinados que van a estar presentes se suman para cada traslape de segmento del residuo de aminoácido (ventana) de longitud uniforme predeterminada dentro del péptido y el valor total para un segmento particular (ventana) se asigna a una residuo de aminoácido sencillo en una posición intermedia del segmento (ventana) , preferiblemente para un residuo aproximadamente en el punto medio del segmento probado (ventana) . Este procedimiento se repite para cada muestra probada que traslapa el segmento del residuo de aminoácido (ventana). Así, se asigna un valor para cada residuo de aminoácido del péptido que relaciona la probabilidad de un epítopo de células T que esta presente en el segmento particular (ventana) . (4) Los valores calculados y asignados descritos en la etapa 3 de arriba, pueden trazarse contra las coordenadas del aminoácido de la secuencia de residuos del aminoácido completo que va a valorarse. (5) Todas las porciones de la secuencia que tienen un registro de un valor predeterminado, por ejemplo, un valor de 1, se estiman probablemente para contener un epítopo de células T y puedan modificarse si se desea. Este aspecto particular de la presente invención proporciona un método general mediante el cual pueden describirse las regiones del péptido probablemente contienen epítopos de células T. Las modificaciones del péptido en estas regiones tienen el potencial para modificar las características de enlace del tipo MHC.

De acuerdo a otro aspecto de la presente invención, los epítopos de células T pueden predecirse con mayor exactitud mediante el uso de un método computacional sofisticado que toma en cuenta las interacciones de los péptidos con modelos de los alelos de clase II MHC . La predicción computacional de los epítopos de células T presentes dentro de un péptido de acuerdo a este aspecto particular, contempla la construcción de modelos de al menos 42 alelos clase II MHC basados en las estructuras de todas las moléculas MHC clase II conocidas y un método para el uso de estos modelos en la identificación computacional de los epítopos de células T, la construcción de colecciones de estructuras de péptidos para cada modelo, para permitir la variabilidad conocida en las posiciones (C ) de carbón alfa de la estructura del péptido relativo, la construcción de colecciones de conformaciones de cadenas de aminoácidos para cada apilamiento de la estructura con cada modelo, para cada una de las 20 alternativas de aminoácidos en posiciones críticas para la interacción entre el péptido y la molécula clase II MHC, y el uso de estas colecciones de estructuras y conformaciones de cadena lateral en conjunto cón una función de registro para seleccionar la estructura óptima y la conformación de cadena lateral para una cavidad de péptido particular con una molécula clase II MHC y la derivación de un registro de enlace a partir de esta interacción . Los modelos de las moléculas MHC clase II pueden derivarse vía la modelación homologa de un número de estructuras similares encontradas en el banco de datos de la proteína Brookhaven ("PDB") . Estos pueden elaborarse mediante el uso de software de modelación homologa semiautomática (Modeller, Sali A. & Blundel TL., 1993. J. Mol. Biol . 234 : 779-815) que incorpora una función de combinación de pares base simulada, en conjunto con la minimización de la energía del campo de fuerza CHARMm (disponible de Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca) . Pueden utilizarse también los métodos de modelación alternativos. El presente método difiere significativamente de otros métodos computacionales que usan colecciones de datos de enlace derivados experimentalmente de cada uno de los aminoácidos alternativos en cada posición en el canal de enlace para un conjunto pequeño de moléculas MHC clase II (Marshall, K.W., et al., Biomed. Pept. proteins Nucleic Acids, 1 (3 ) : 157 - 162 ) (1995) u otros métodos computacionales que usan datos de enlace experimentales similares para definir las características de enlace de tipos particulares de cavidades de enlace dentro del canal, usando nuevamente un subconjunto relativamente pequeño de moléculas MHC clase II y después "mezclar y hacer coincidir" los tipos de cavidades a partir de esta colección de cavidades para crear artificialmente además, moléculas MHC clase II "virtuales" (Sturniolo T. , et al., Nat. Biotech, 1_7(6): 555-561 (1999). Ambos métodos previos sufren la principal desventaja que, debido a la complejidad de los ensayos y la necesidad de sintetizar un gran número de variantes de péptido, solo un número pequeño de moléculas MHC clase II pueden escasearse experimentalmente . Por lo tanto, el primer método previo puede hacer solamente predicciones para un número pequeño de moléculas MHC clase II. El segundo método previo, hace una suposición de que una cavidad alineada con aminoácidos similares en una molécula tendrá las mismas características cuando en el contexto de un alelo de clase II diferente padezca además de desventajas adicionales en las que solo aquellas moléculas MHC clase II pueden ser creadas "virtualmente" , que contienen cavidades contenidas dentro de la colección de cavidades. Usando la metodología de modelación descrita aquí, puede deducirse la estructura de cualquier número y tipo de moléculas MHC clase II, por consiguiente, los alelos pueden seleccionarse específicamente para ser representativos de la población global. Además, el número de. moléculas MHC clase II escaneadas pueden ser incrementado mediante la elaboración de modelos adicionales para generar datos adicionales vía la experimentación del complejo . El uso de una colección de la estructura permite la variación en las posiciones de los átomos Ca de varios péptidos escaneados cuando se hacen ingresar al dique con moléculas MHC clase II particulares. Esto contrasta de nuevo con los métodos computacionales previos descritos anteriormente que cuentan con el uso de estructuras de péptido simplificadas para escanear enlaces de aminoácidos de cavidades particulares. Estas estructuras simplificadas no son probablemente representativas de las conformaciones de la estructura encontradas en los péptidos "reales" que conducen a una inexactitud en la predicción del enlace del péptido. La presente colección de la estructura, se crea mediante la superposición de la estructura de todos los péptidos enlazados a las moléculas MHC clase II encontradas dentro del banco de datos de la proteína y se observa la desviación media cuadrática de la raíz (RMS) entre los átomos Ca de cada uno de los once aminoácidos localizados dentro del canal de enlace. A pesar de que la colección puede derivarse de un número pequeño de estructuras de humano y de ratón disponibles adecuadas (generalmente 13) para permitir la posibilidad de incluso una mayor variabilidad, la figura RMS para cada posición C- se incrementa mediante el 50%. La posición promedio Ca de cada aminoácido se determina entonces y una esfera se dibuja alrededor de este punto cuyo radio es igual a la desviación RMS en la posición plus 50%. Esta esfera representa todas las posiciones Ca permitidas.

Al trabajar con Ca, la desviación RMS menor (que es la cavidad 1 del aminoácido como se mencionó arriba, equivalente a la posición 2 de los 11 residuos en el canal de enlace) , la esfera se cuadricula en tres dimensiones y cada vértice dentro de la rejilla se usa entonces como una localización posible para un Ca en el aminoácido. El plano de amida posterior que corresponde al enlace de péptido para el aminoácido posterior se une sobre cada uno de estos Ca y los ángulos f y ? se hacen girar en una etapa prudente en un conjunto de intervalos para colocar el Ca subsiguiente. Si el Ca subsiguiente cae dentro de la "esfera de posiciones permitidas" para este Ca entonces la orientación del dipeptido se acepta, considerando que cae fuera de la esfera después de que el dipeptido se rechaza. Este proceso se repite entonces para cada una de las posiciones Ca subsecuentes tal que el péptido crece a partir de la cavidad 1 Ca "semilla" hasta que los nueve Ca precedentes han sido colocados a partir de todas las permutaciones posibles de los Ca precedentes. El proceso se repite entonces una vez más para la cavidad 1 precedente del Ca sencillo para crear una colección de posiciones Ca de .la estructura localizada dentro del canal de enlace. El número de estructuras generadas depende de varios factores: El tamaño de las "esferas de posiciones permitidas"; la fineza o pureza de la "esfera primaria" en la posición de la cavidad 1; la fineza de la etapa prudente de rotación de los ángulos f y ? usados para la posición subsiguiente Cot. Usando este procedimiento, una gran colección de estructuras puede crearse. Para colecciones de estructuras muy grandes, lo más probable es que el ajuste óptimo se encontrará para un péptido particular dentro del canal de enlace de una molécula clase II MHC. Considerando que todas las estructuras no serán adecuadas para apilarse con todos los modelos de las moléculas MHC clase II debido a los ruidos con aminoácidos que pueden acomodarse por medio de ese alelo. El uso de la colección de la estructura junto con los modelos de las moléculas MHC clase II crea una base de datos exhaustiva que está conformada de cadenas laterales permitidas para cada uno de los aminoácidos en cada posición del canal de enlace para cada una de las moléculas MHC clase II apiladas con cada una de las estructuras permitidas. Este conjunto de datos se genera usando una función de traslape estérica simple en donde una molécula clase II MHC se apilan con una estructura y una cadena lateral de aminoácidos se injerta en la estructura en la posición desead. Cada uno de los enlaces girables de la cadena lateral se hace girar en la etapa prudente a intervalos establecidos y las posiciones se aceptan o rechazan de acuerdo al siguiente criterio: La suma total del traslape de todos los átomos hasta ahora colocados no debe exceder un valor predeterminado. Así, la severidad de la búsqueda conformacional es una función del intervalo usado en la rotación de la etapa prudente del enlace y el límite predeterminado para el traslape total. El valor último puede ser pequeño si las posiciones de las cadenas laterales de la cavidad se conocen por ser relativamente flexibles. Estas tolerancias pueden hacerse para imitar las variaciones en la flexibilidad dentro de las cavidades del canal de enlace. Esta búsqueda conformacional se repite entonces para cada posición del aminoácido de cada estructura cuando se apilan con cada una de las moléculas MHC clase II para crear una base de datos exhaustiva de las conformaciones de cadena lateral . Se usa una expresión matemática adecuada para estimar la energía de enlace entre los modelos de las moléculas MHC clase II junto con las conformaciones del ligando del péptido que se va a derivar empíricamente mediante el escaneo de la base de datos extensa de conformaciones de cadena estructura/cadena lateral descrita anteriormente. Por lo tanto, una proteína se escanea para los epítopos de las células T potenciales sometiendo cada péptido posible en longitud que varía entre 9 y 20 aminoácidos (a pesar de que la longitud se mantiene constante para cada escaneo) para los siguientes cálculos computacionales : se selecciona una clase de molécula tipo II MHC junto con una estructura del péptido permitida para que la molécula y las cadenas laterales que corresponden a la secuencia de péptido deseada se injerte. Los datos de la distancia interatómica e identidad atómica que relacionan a una cadena lateral particular en una posición particular en la estructura se recogen para cada conformación permitida del aminoácido (obtenida a partir de la base de datos descrita arriba) . Esto se repite para cada cadena lateral junto con la estructura y los registros del péptido derivados, que usan una función de registro. El mejor registro para la estructura se retiene y el proceso se repite para cada estructura permitida por el modelo seleccionado. Los registros de todas las estructuras permitidas se comparan y el registro más alto se estima por ser el registro del péptido deseado en el modelo clase II MHC. Este proceso se repite entonces para cada modelo con cada péptido posible derivado de la proteína que se escanea, y se muestran los registros de los péptidos contra los modelos. En el contexto de la presente invención, cada ligando presentado para el cálculo de afinidad de enlace es un segmento de aminoácidos seleccionado a partir de un péptido o proteína como se discutió anteriormente. Así, el ligando es un alargamiento seleccionado de aminoácidos de aproximadamente 9 a 20 aminoácidos en longitud derivados que se derivan a partir de un péptido, polipéptido o proteína de una secuencia conocida. Los términos "aminoácidos" y "residuos" son referidos a continuación como términos equivalentes . El ligando, en la forma de los aminoácidos consecutivos del péptido que van a ser examinado se injerta en una estructura a partir de la colección de la estructura, se coloca en la hendidura de enlace de una molécula clase II MHC a partir de la colección del modelo de molécula clase II MHC vía las coordenadas de los átomos Coc de la estructura del péptido y una conformación permitida para cada cadena lateral se selecciona a partir de la base de datos de las conformaciones permitidas. Las identidades del átomo relevantes y las distancias interatómicas se recupera también a partir de esta base de datos y se usa para calcular el registro de enlace del péptido. Los ligandos con una afinidad de enlace elevada para la cavidad de enlace clase II MHC son señalados como candidatos para la mutagénesis dirigida en el sitio. Las sustituciones de aminoácidos se hacen en el ligando señalado (y, por consiguiente, en la proteína de interés) la cual se vuelve a probar usando la función de registro para determinar los cambios que reducen la afinidad de enlace bajo un valor de umbral predeterminado. Estos cambios pueden incorporarse entonces en la proteína de interés para eliminar los epítopos de las células T. El enlace entre el ligando de péptido y el canal de enlace de las moléculas MHC clase II involucran interacciones no covalentes que incluyen pero no se limita a: enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas (lipofílicas) e interacciones de Van der alls. Estas se incluyen en la función de registro del péptido como se describe en detalle abajo. Se comprenderá que un enlace de hidrógeno es un enlace covalente que puede formarse entre grupos polares o cargados y consiste de un átomo de hidrógeno dividido por otros dos átomos. El hidrógeno del donador de hidrógeno tiene una carga positiva cuando el aceptor de hidrógeno tiene una carga negativa parcial . Para los propósitos de las interacciones del péptido/proteína, el enlace de hidrógeno de los donadores pueden ser ya sea nitrógenos con hidrógeno unidos o hidrógenos unidos a un oxígeno o nitrógeno. Los átomos aceptores de enlace de hidrógeno pueden ser oxígenos no unidos al hidrógeno, nitrógenos sin hidrógenos unidos y una o más conexiones, o azufres con una sola conexión. Ciertos átomos tales como oxígenos unidos a los hidrógenos o nitrógenos imina (por ejemplo, C=NH) pueden ser tanto aceptores de hidrógeno o donadores. Las energías de enlace de los hidrógenos se encuentran en el rango de 3 a 7 Kcal/mol y son mucho más grandes que los enlaces de Van der Walls pero más débiles que los enlaces covalentes. Los enlaces de hidrógeno son también altamente direccionales y son más fuertes cuando el átomo donador, átomo de hidrógeno y átomo aceptor son co-lineales. Los enlaces electrostáticos se forman entre pares de iones cargados opuestamente y la resistencia de la interacción es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia entre los átomos, de acuerdo a la Ley de Coulomb. La distancia entre los pares de iones es aproximadamente de 2.8 Á. En las interacciones de proteína/péptido, los enlaces electrostáticos pueden formarse entre la arginina, histidina o lisina y aspartato o glutamato. La resistencia del enlace depende del pKa del grupo de ionización y la constante dieléctrica del medio a pesar de que es aproximadamente similar en resistencia a los enlaces de hidrógeno. Las interacciones lipofílicas son contactos hidrofóbicos-hidrofóbicos favorables que se presentan entre la proteína y el ligando del péptido. Usualmente, estos se presentan entre las cadenas laterales de aminoácidos hidrofóbicos del péptido oculto dentro de las cavidades del canal de enlace tal que no se exponen al solvente. La exposición de los residuos hidrofóbicos al solvente es altamente desfavorable puesto que las moléculas que rodean al solvente son forzadas por un enlace de hidrógeno entre si formando estructuras de clatrato tipo jaula. La disminución resultante en la entropía es altamente desfavorable. Los átomos lipofílicos pueden ser azufres que no son aceptores de hidrógeno ni polares y átomos de carbono que no son polares .

Los enlaces de Van der Walls son fuerzas no específicas encontradas entre los átomos que están de 3 a 4 Á separados. Estos son más débiles y menos específicos que los enlaces de hidrógeno y electrostáticos. La distribución de la carga electrónica en los cambios del átomo con respecto al tiempo y, en cualquier instante, la distribución de la carga no es simétrica. Esta asimetría transitoria en la carga electrónica induce una asimetría similar en los átomos próximos. Las fuerzas de atracción resultantes entre los átomos alcanza un máximo en la distancia de contacto de Van der Waal pero disminuye muy rápido aproximadamente 1Á hasta aproximadamente 2Á. Recíprocamente, debido a que los átomos se vuelven a separar con una distancia de contacto menor, las fuerzas de repulsión fuertemente incrementadas tienen dominio sobre las nubes de electrones externos de los átomos traslapados. A pesar de que las fuerzas de atracción son relativamente débiles en comparación con los enlaces de hidrógeno y electrostáticos (aproximadamente 0.6 Kcal/mol) , las fuerzas repulsivas en particular pueden ser muy importantes para determinar si un ligando de péptido puede enlazarse exitosamente a una proteína. En una modalidad, la función de registro Bóhm (metodología SC0RE1) se usa para estimar la constante de enlace. (Bóhm, J.H., J. Comput Aided Mol. Des., 8 (3 ) : 243 -256 (1994) la cual se incorpora por la presente en su totalidad) . En otra modalidad, la función de registro (metodología SC0RE2) se usa para estimar las afinidades de enlace como un indicador de un ligando que contiene un epítopo de células T (Bóhm, J.H., J. Comput Aided Mol. Des., 12 (4) : 309-323 (1994) la cual se incorpora por la presente en su totalidad) . Sin embargo, las funciones de registro Bóhm descritas en las referencias de arriba se usan para estimar la afinidad de enlace de un ligando a una proteína cuando ya se sabe que el ligando se enlaza exitosamente a la proteína y el complejo de proteína/ligando tiene su estructura resuelta, la estructura resuelta está presente en el Banco de datos de la proteína ("PDB") . Por lo tanto, la función de registro ha sido desarrollada con el beneficio de conocer los datos de enlace positivos. Para permitir la discriminación entre los enlazadores negativos y positivos, un término de repulsión debe añadirse a la ecuación. Además, un estimado más satisfactoria de energía de enlace se logra mediante el computo de las interacciones lipofílicas en forma de pares en lugar de usar el término de energía basado en el área de las funciones Bóhm anteriores. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la energía de enlace se estima usando una función de registro Bóhm modificada. En la función de registro Bóhm modificada, la energía de enlace entre la proteína y el ligando (AGeniace) se estima considerando los siguientes parámetros: la reducción de energía de enlace debido a la pérdida total de la entropía de translación y rotacional del ligando (AG0) ; contribuciones de los enlaces de hidrógeno ideales (AGhb) cuando al menos un participante es neutral; contribuciones a partir de las interacciones iónicas no perturbadas (AGionicas) ; interacciones lipofílicas entre los átomos de ligandos lipofílicos y átomos de aceptores lipofílicos (AGüpo) ; la pérdida de energía de enlace debido al congelamiento de los grados internos de libertad en el ligando, es decir, la libertad de rotación alrededor de cada enlace C-C se reduce (AGrot) ; la energía de la interacción entre la proteína y el ligando (EVdw) · La consideración de estos términos proporcionan la ecuación 1 : (AGenlace) = (??0) + (AGhb X N b) + (AGiónico X Niónico) + (AGiipo x Niipo ) + (AGrot + Nrot)+ (E vd) · En donde N es el número de interacciones calificativas para un término específico y, en una modalidad, AG0, AGht>, AGiónico, AGiip0 y AGrot son constantes que están dados por los valores: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17 y 1.4, respectivamente. El término bb se calcula de acuerdo a la ecuación 2: -enlacesf(AR, ?a) X f (Npróximo) X fpcs f(AR, ? ) es una función de penalidad que calcula las desviaciones grandes de los enlaces de hidrógeno ideales y se calcula de acuerdo a la ecuación 3 : f (AR, A-D) = fl(AR) x f2 (? ) en donde: f (AR) = 1 si AR <= TOL o = 1-(AR - TOL) /O.4 si ÁR <= 0.4 + TOL o = 0 si AR > 0.4 + TOL y: f2 (?a) = 1 si ? < 30° o = 1- (?a -30) /50 si ?a <= 80° o = 0 si Ace >80° TOL es la desviación tolerada en la longitud del enlace de hidrógeno = 0.25Á AR es la desviación de la longitud de enlace del hidrógeno H-O/N a partir del valor ideal = 1.9Á Aoc es la desviación del ángulo de enlace del hidrógeno < N/o-H..o/N a partir de su valor idealizado de 180°. f ( próximo) se distingue entre las partes cóncava y convexa de una superficie de la proteína y por lo tanto asigna un peso mayor a las interacciones polares encontradas en las cavidades en lugar de aquellas encontradas en al superficie de al proteína. Esta función se calcula de acuerdo a la ecuación 4 de abajo: f (Npróxino) = (Npróximo/Npróximo.o) " donde CX = 0.5 - . Npróximo es el número de átomos de proteína que no son hidrógeno y que son cercanos a 5Á para cualquier átomo de proteína dado. Npróximo, o es una constante = 25 fpcs es una función que permite para el área de superficie de contacto polar por enlace de hidrógeno que se distingue por lo tanto entre los enlaces de hidrógeno fuertes y débiles y su valor se determina de acuerdo a los siguientes criterios : fpcs = ß CUandO Apolar/NHB < 10 Á2 o fpcs = 1 cuando APoiar/ HB > 10 Á2 Apoiar es el tamaño de la superficie de contacto proteína-ligando polar HB es el número de enlaces hidrógeno ß es una constante cuyo valor es = 1.2 para la implementación de la función de registro Bóhm modificada, las contribuciones de las interacciones iónicas, AGiónicas/ se computan de forma similar a aquellos enlaces de hidrógeno descritos anteriormente puesto que se asume la misma dependencia de la geometría. El término Nupo se calcula de acuerdo de la ecuación 5 de abaj o : f (rIL) se calcula para todos los átomos del ligando lipofílico, 1, y átomos de la proteína lipofílica, L, de acuerdo al siguiente criterio: f (¾)= 1 cuando riL <= Rlf (rIL)= (rIL -R1)/(R2-R1) cuando £ (rI ) = 0 cuando rIL >= R2 En donde: Rl = rxvdw + rLvdw + 0.5 Y R2 = Rl + 3.0 y rivdw es el radio de Van der Waall del átomo 1 y rLvdw es el radio de Van der Waall del átomo L El término Nrot es el número de enlaces que rotan de la cadena lateral del aminoácido y se toman por ser el número de enlaces acíclicos sp3 - sp3 y sp3 - sp2. Las rotaciones del - CH3 terminal o NH3 no se toman en cuenta. El término final, Evdw se calcula de acuerdo a la ecuación 6 de abajo: Evaw = e?e2((^?" + r2vdw)12/r12 - (rivdw + r2vdw)6/r6), en donde : 8i y e2 son constantes que dependen de la identidad rivdw + r2vdw son el radio atómico de Van der Waal r es la distancia entre un par de átomos. Con respecto a la ecuación 6, en una modalidad, las constantes Si y e2 están dadas por los valores del átomo: C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316, respectivamente (es decir, para los átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, respectivamente) . Con respecto a las ecuaciones 5 y 6, el radio de Van der Waal son los valores del átomo dado C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Á. Se entenderá que los valores predeterminados y constantes dadas en las ecuaciones de arriba se determinan dentro de las limitaciones de las interacciones del ligando de proteína con respecto al tipo de computación que se llevan a cabo aquí. Por lo tanto, es posible que la función de registro se mejore adicionalmente , estos valores y constantes pueden cambiar aquí cualquier valor numérico que proporciona los resultados deseados en términos de estimación de la energía de enlace de una proteína para un ligando que puede usarse y caer dentro del alcance de la presente invención. Como se describe arriba, la función de registro se aplica a los datos extraídos a partir de la base de datos de las conformaciones de cadena lateral, identidades del átomo y distancias interatómicas. Para el propósito de la presente descripción, el número de moléculas MHC clase II incluidas en esta base de datos es 42 modelos mejorados para cuatro estructuras resueltas. Deberá ser evidente a partir de las descripciones anteriores, que la naturaleza modular de la construcción del método computacional de la presente invención significa que nuevos modelos pueden añadirse simplemente y escanearse con la colección de estructuras del péptído y la función de búsqueda conformacional para crear conjuntos de datos que se procesen mediante la función de registro de péptido descrita anteriormente. Esto permite para el. repertorio de moléculas MHC clase II escaneadas ser incrementadas fácilmente, o las estructuras y datos asociados que van a ser reemplazados si los datos se encuentran disponibles para crear modelos más seguros a partir de los alelos existentes.

El método actual de predicción se puede calibrar contra el conjunto de datos que comprende un gran número de péptidos cuya afinidad para diversas moléculas MHC de clase II se ha determinado experimentalmente de forma previa. Al comparar los datos experimentales contra los calculados, se puede determinar arriba un corte de valor, que se sabe que se predicen correctamente todos los epítopos de células T determinados experimentalmente. Se debe entender que, aunque la función de registro anterior es relativamente sencilla en comparación con algunas metodologías sofisticadas que están disponibles, los cálculos se efectúan extremadamente rápido. Se deberá entender que el objetivo no es calcular la energía real de enlace per se, para cada péptido apilado en el canal de enlace de una proteína MHC de clase II seleccionada. El objetivo subyacente es obtener datos comparativos de energía de enlace como una ayuda para predecir la ubicación de los epítopos de células T, con base en la estructura primaria (esto es, la secuencia de aminoácidos) de una proteína seleccionada. Una energía de enlace relativamente alta o una energía de enlace arriba de un valor de umbral seleccionado, sugeriría la presencia de un epítopo de células T en el ligando. El ligando luego se puede someter a al menos una ronda de substitución de aminoácidos y recalcularse la energía de enlace. Debido a la naturaleza rápida de los cálculos, estas manipulaciones de la secuencia de péptidos se pueden efectuar interactivamente dentro de la interfaz del usuario del programa en un hardware de computadora disponible de forma efectiva en costo. No se requiere así una inversión importante en hardware de computadoras. Sería evidente para alguien experto en la técnica que se puede usar otro software disponible para los mismos propósitos. En particular, software más sofisticado que pueda apilar ligandos en los sitios de enlace de la proteína se pueden usar en conjunto con la minimización de energía. Ejemplos del software de apilamiento son: DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol . , 161: 269-288 (1982)), LUDI (Bóhm, H.J., Comput Aided Mol. Des., 8:623-632 (1994)) y FLEXX (Raley M.( et al., ISMB, 3:300-308 (1995)). Ejemplos del software para el modelaje y manipulación molecular incluyen: AMBER (Tripos) y CHARMm (Molecular Simulations Inc.). El uso de estos métodos computacionales limitaría severamente la producción del método de esta invención debido a las longitudes del tiempo de procesamiento requerido para hacer los cálculos necesarios. Sin embargo, es factible que tales métodos se puedan usar como un "tamiz secundario" para obtener cálculos más precisos de la energía de enlace para los péptidos que se encuentran que son enlazadores positivos, por medio del método de la presente invención. La limitación del tiempo de procesamiento para cálculos dinámicos moleculares o de mecánica molecular sofisticados, es uno que se define por el diseño del software que hace estos cálculos y las limitaciones actuales de tecnología de hardware de computadoras. Se puede anticipar que en el futuro, con la redacción de códigos más eficientes e incrementos continuos en la velocidad de los procesadores de computadora, puede ser factible hacer tales cálculos dentro de un marco de tiempo más manejable. La información adicional en las funciones de energía en funciones de energía aplicadas a macromoléculas y la consideración de diversas interacciones que tienen lugar dentro de una estructura de proteína plegada se pueden encontrar en Brooks, B.R., et al., J. Compu . Chem. , 4:187-217 (1983) y la información adicional que se refiere a las interacciones generales de ligando y proteína se pueden encontrar en Dauber-Osguthorpe et al., Proteins 4(1) :31-47(1988) , que se incorporan aquí como referencia en su totalidad. También se puede encontrar una información útil de respaldo por ejemplo en Fasman, G.D:, ed. , Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9. EJEMPLO 2 . Método de mapeo de epí topos en la birodina 1 usando ensayos de proliferación de células T humanas nuevas: La interacción entre el HC, péptidos y receptor de células T (TCR) suministra la base estructural para la especificidad de antígeno de reconocimiento de células T. Los ensayos de proliferación de células T prueban el enlace de los péptidos al MHC y el reconocimiento de los complejos MHC péptido por TCR. Los ensayos de proliferación de células T in vitro del ejemplo actual, involucran la estimulación de células mono-nucleares de sangre periférica (PBMCs) que contienen células que presentan antígenos (APCs) y células T. La estimulación se efectúa in vitro utilizando antígenos de péptidos sintéticos y en algunos experimentos antígenos de proteínas completas. La proliferación estimulada de células T se mide usando 3H-timidina (3H-Thy) y la presencia de 3H-Thy incorporado evaluado usando un conteo de escintilación de células fijas lavadas. Se obtuvieron cubiertas esponjosas de sangre humana almacenadas por menos de 12 horas del Servicio Nacional de Sangre (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK) . Se obtuvo un Ficoll-paque de Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, UK) . Un medio libre de suero AIM V para el cultivo de linfocitos humanos primarios y que contienen L-glutamina, 5(^g/ml estreptomicina, lC^g/ml gentomicina y 0.1% de albúmina de suero de humano fue de Gibco-BRL (Paisley, UK) . Se obtuvieron los péptidos sintéticos de Eurosequence (Groningen, Países Bajos) y Babraham Technix (Cambridge, UK) . Se separaron los eritrocitos y leucocitos del plasma y las plaquetas por centrifugación suave de las cubiertas esponjosas. La fase superior (que contiene plasma y plaquetas) se retiró y se descargó. Se diluyeron los eritrocitos y leucocitos 1:1 en solución salina amortiguada de fosfato (PBS) antes de formar capas sobre 15 mi de ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham UK) . Se hizo la centrifugación de acuerdo con las condiciones recomendadas de los fabricantes y se cosecharon los PDMC a partir de una interfaz ficoll paque/PBS+suero . Se mezclaron los PBMC con PBS (1:1) y se recolectaron por centrifugación. Se retiró el sobrenadante y se descargó en el peletizado PBMC vuelto a suspender en 50ml PBS. Nuevamente se peletizaron las células por centrifugación y se descargó el sobrenadante PBS. Se volvieron a suspender las células usando 50 mi de medios AIM V y en este punto se contaron y se evaluó la viabilidad usando una exclusión con colorante de azul de tripano. Nuevamente se recolectaron las células por centrifugación y se descarto el sobrenadante. Se volvieron a suspender las células para almacenamiento criogénico a una densidad de 3xl07 por mi. El medio de almacenamiento fue suero humano AB inactivado por calor al 90% (v/v) (Sigma, Poole, UK) y 10% (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) . Se transfirieron las células a un recipiente de congelamiento regulado (Sigma) y se colocaron a -70°C durante la noche. Cuando se requirieron para uso se deshielaron rápidamente las células en un baño de agua a 37°C antes de transferirse a un medio de 10 mi pre-calentado AIM V. Se estimularon los PBMC con antigenos de proteínas y péptidos en una placa de fondo plano de 96 pozos a una densidad de 2xl05 PBMC por pozos. Se incubaron PBMC durante 7 días a 37 °C antes de pulsar con 3H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK) . Para el estudio actual, los péptidos sintéticos (15 meros) que se traslaparon por 12 aminoácidos se generaron y abarcaron la secuencia completa de birodina 1. Los números de identificación de péptidos (ID#) y las secuencias se dan en la FIGURA 2. Cada péptido se separó por exclusión individualmente contra PBMC aislado de 21 donadores nuevos. Se utilizaron dos péptidos de control que se había demostrado previamente que eran inmunogénicos y un KLH de antígeno sin recordación potente en cada ensayo de donador. Los antígenos de control usados en este estudio fueron como se muestra a continuación: Péptido Secuencia C-32 Biotina PKYVKQNTLKLAT hemaglutinina de la gripe 307-319 C-49 KVVDQIKKISKPVQH péptido de clamidia HSP 60 KLH Proteína completa de una hemocianina de una variedad de lapa.

Se disolvieron péptidos en D SO hasta una concentración final de lOmM, esta solución de reserva luego se diluyó 1/500 en un medio AIM V (concentración final 20µ?) . Se agregaron los péptidos a una placa de 96 pozos de fondo plano para dar una concentración final de 2 y 20 µ? en 100 µ? . Se evaluó la viabilidad de los PBMC deshielados por una exclusión de colorante de azul de tripano, luego se volvieron a suspender las células a una densidad de 2xlOe células/ml, y 100 µ? (2xl05 PBMC/pozo) se transfirieron a cada pozo que contiene péptido. Se ensayaron los cultivos de pozo por triplicado en cada concentración de péptidos. Se incubaron las placas durante 7 días en una atmósfera humidificada de 5% C02 a 37°C. Se pulsaron las células por 18-21 horas con 1µ(G? 3H-Thy/pozo antes de cosecharse en cubiertas de filtro. Se determinaron los valores CPM usando un contador de placas superior beta de microplacas allac (Perkin Elmer) . Se expresaron los resultados como índices de estimulación derivados por una división del registro de proliferación (por ejemplo conteos por minuto de radioactividad) medidos para probar el péptido por el registro medido en células que no hacen contacto con un péptido de prueba. Los estudios actuales han descubierto algunas 32 secuencias de péptidos que pueden provocar una respuesta proliferativa importante (esto es SI>2.0) en células T derivadas de al menos un donador. Dentro de este conjunto de péptídos, un sub-conjunto adicional de péptidos se ha identificado que provoca una respuesta proliferativa importante en dos o más muestras de donadores individuales y para algunas de estas respuestas la magnitud de respuesta ha sido de hecho significativamente superior que SI=2.0. El mapeo de epítopos de células T en la secuencia de birodina 1 usando el ensayo de proliferación de células T resultó en la identificación de cinco principales regiones inmunogénicas abarcadas por los números de péptidos ID#16-18, 30, 38-41, 46-50 y 60-64. Para cada uno de estos péptidos, los PBMC preparados de 2 o más muestras del donador mostraron un índice de estimulación >2.0. La FIGURA 5 recuadros A-E muestra histogramas representativos de respuestas SI para péptidos individuales en muestras de donador PDMC seleccionada. Se han seleccionado colectivamente los paneles para demostrar ejemplos de respuestas positivas para los péptidos de cada una de las regiones de epítopos R1-R5. Los tipos de tejido para todas las muestras PBMC se ensayaron usando un sistema reactivo comercialmente disponible (Dynal, irral, UK) . Se efectuaron los ensayos de acuerdo con los protocolos recomendados por los proveedores y reactivos auxiliares estándar y sistemas de electroforesis con agarosa . La cobertura alotípica para los alelos DRB1 fue del 70% en los 20 donadores probados. De las 21 diferentes preparaciones del donador PBMC, 10 fueron reactivas a los péptidos abarcados dentro de las regiones de epítopos R1-R5. Las especificidades alotípicas de cada una de las muestras de donador responsivas se da en la TABLA 1. Tabla 1 Alotipos MHC de muestras de donador responsivas EJEMPLO 3 Diseño de secuencias modificadas con perfiles de inmunogenicidad mejorados: Se usó el método del EJEMPLO 1 en un análisis de las regiones de epítopos Rl, R2 , R3 , R4 y R5. El sistema permite la predicción de los ligandos particulares MHC abarcados dentro de las regiones de epítopos biológicamente detectadas y proporciona un registro con respecto a la capacidad de un ligando dado MHC de clase II para interactuar con un alotipo particular MHC. El patrón de restricción alotípico para los ligandos MHC se puede detallar usando los despliegues del diagrama de restricción alotípico como se suministra para cada una de las regiones de epítopos R1-R5 en las FIGURAS anexas 6-10. El análisis se extiende a la consideración de modificaciones de secuencias dentro de cada uno de los epítopos R1-R5. Se probaron las variantes de secuencias por su capacidad continua de enlazarse a los MHC de clase II y sus registros de enlace en donde permanecieron. Se definieron substituciones múltiples de aminoácidos que lograron la eliminación del enlace MHC de clase II con la mayoría de los alotipos MHC probados. Las substituciones particulares identificadas se probaron además por su capacidad de acomodarse dentro del modelo estructural de la molécula de birodina. Las mutaciones diseñadas en los residuos seleccionados de la secuencia de tipo silvestre se verificaron por golpes estéricos, formación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y su ajuste general en la estructura. Las substituciones que dieron lugar a los choques estéricos se eliminaron. Las substituciones que se ajustaron cuando la cadena lateral adoptó una configuración similar (rotámero) al residuo original se consideraron aceptables. Si más de una las substituciones cumplió con estos criterios, se prefirieron los residuos que forman potencialmente enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales vecinas o átomos de estructura, y/o forman contactos hidrofóbicos favorables u otras asociaciones. El procedimiento anterior se efectuó interactivamente utilizando S iss Prot Deep View v3.7 [Guex, N. y Peitsch, M.C. (1997) Electrophoresis 18: 2714-2723]. Este proceso resultó en un conjunto de substituciones preferidas para cada una de las regiones de epí opos R1-R5. Los conjuntos de substitución se compilaron para producir la estructura detallada en la FÓRMULA 1. Se confirmaron todas las substituciones para resultar en la eliminación de los ligandos MHC de clase II dentro de cada una de las regiones de epítopos R1-R5. Las substituciones que caracterizan residuos alternativos de aminoácidos además de las substituciones más preferidas se dan con la FÓRMULA 1. Para los conjuntos de substitución alternativa R3 de la región de epítopos se diseñaron permitiendo la opción de dejar la leucina 115 en la configuración de tipo silvestre. Este residuo se cree que es una parte de formación estructuralmente importante de la hendidura de enlace del substrato para la enzima de birodina 1. Un conjunto preferido de substituciones involucra L115 que comprende los cambios L115A, I122A, I126 L130A, L133F y I137A. Un conjunto alternativo de substituciones que mantiene LnS comprende An8T, Gi2oH, K121S y Ri23T- Estos cambios se harían en alternativa a los cambios duales Ln5A y I122A. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones 1. Una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la birodina 1, y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula no modificada que tiene la misma actividad biológica en un individuo cuando se usa in vivo, caracterizada porque la pérdida de inmunogenicidad se alcanza al retirar uno o más epítopos de células T derivados de la molécula originalmente no modificada y los epítopos de células T son ligandos de clase II MHC o secuencias de péptidos que muestran la capacidad de estimular o unir células T por medio de la presentación en la clase II. 2. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la eliminación de los epítopos de células T se logra al reemplazar 1-9 residuos de aminoácidos.
3. 3. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los epítopos de células T son secuencias de péptidos seleccionadas del grupo como se detalla en la figura 1.
4. 4. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los epítopos de células T se localizan dentro de las cadenas de residuos de aminoácidos contiguos denominados como R1-R5 que abarcan residuos 46-66; 88-102; 112-135; 136-162 y 178-204 de la secuencia de birodina 1 de tipo silvestre.
5. 5. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque las cadenas tienen las siguientes secuencias: (a) = ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA (Rl) , (b) = ATEAAKFVFKDAKKK (R2) , (c) = ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA (R3) , (d) = ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA R4) , (e) = ATISLENNWSALSKQIQIAST (R5) .
6. 6. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el reemplazo de los residuos de aminoácidos se logra dentro de una sub-cadena de al menos 9 residuos consecutivos de cualesquiera de las cadenas R1-R5.
7. 7. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 4-6, caracterizada porque comparte la identidad de aminoácidos con cualesquiera de las cadenas de secuencia de péptidos R1-R5 mayores al 80%.
8. 8. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comparte la identidad de aminoácidos con cualesquiera de las cadenas de secuencias de péptidos R1-R5 mayores al 90%.
9. 9. La molécula de birodina 1 de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque comprende la siguiente secuencia: DVSFRLSGATTTSYGVFIK LREALPYER VYNIPLLRSSISGSGRYX:LX2LX3LTX4X5AD ETX6SVAX7DX8TNVYIMGYLAGDVSYFFNEASATEAAKX9X10FKDAKKKX11TLPYSGNYE RX12QTX13AX14X15X16X17ENX18PLGX19PAX20DSAX21TTX22YX23X24TASSAASAX5X26X2 7X28IQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLATX29SX30ENNWSAX31SX32QX33QX34AST NNGQFESPWLIDG NQRVSITNASARWTSNIALLLNRN IAAIGEDISMTLIGFEHG LYGI en donde X1 es A, G o P; X2 es M, A, G, P o I; X3 es A, G o P; X4 es P o Y; Xs es T o S; Xs es P; X7 es A, P o G; X8 es A, G o P; X9 es A, P, G, H, D, E, N, Q, K, R, S o T; X10 es A, P O G; X11 es A, P o G; X12 es A, P, S, T, H o K; X13 es T; X14 es H; X15 es S; X16 es A, S, T, P, N, D, E, G, H, K o Q; X17 es T o P; X19 es A, I, F, G, M, P, V, W o Y; X20 es F, P o W; X21 es A, P o G; . X22. es G, A o P; X23 es G, A o P; X24 es A, P o G; X25 es A, P, G, S o T; X26 es A, I, M, S, T, P O G; X27 es A, G o P; X28 es S, A, G, P, T, H, D, N, Q, K o R; X29 es T, A, G, S, P, H, K, R, D, E, N o Q; X30 es A, G, S, T, P, K, R, H, D, E, N o Q; X31 es Q; X32 es H, D, E, F, L, N, P, S, o Y; X33 es T, A, G, P, D, E, H, K, R, N, Q, S o T; y X34 es D, y por lo cual simultáneamente, Xx= T, X2 = L, X3 = H, X4 = N, Xs = Y, Xs = I, X7 = V, Xs = V, X9 = F, X10 = V, X11 = V, X12 = L, X13 = A, X14 = G, X15 = K, X1S = I, X17 = R, X18 = I, X19 = L, X20 = L, X21 = I, X22 = L, X23 = Y, X24 = Y, X25 = L, X26 = L, X27 = V, X28 = L, X2S = I, X30 = L, X31 = L, X32 = K, X33 = I Y X34 = I se excluyen.
10. 10. La molécula de birodina 1 de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque X1 es A; X2 es M; X3 es A; X4 es P; Xs es T; Xs es P; X7 es A; X8 es A; X9 es A; X10 es A; X11 es A; X12 es A; X13 es T; X14 es H; X15 es S ; X16 es A; X17 es T; X18 es A; X19 es A; X20 es F; X21 es A; X22 es G; X23 es G; X24 es A; X25 es A; X26 es A; X27 es A; X28 es S; X29 es T; X30 es A; X31 es Q; X32 es H; X33 es T; y X34 es D.
11. 11. La molécula de birodina 1 de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la molécula, cuando se prueba como una proteína completa en un ensayo biológico de proliferación celular inducida de células T humanas, muestra un índice de estimulación (SI) menor que la molécula precursora no modificada y más pequeño que 2, probado en paralelo usando células del mismo donador, en donde el índice se toma como el valor de la proliferación celular registrada siguiendo a la estimulación por la proteína y dividida por el valor de la proliferación celular registrada en células de control que no reciben la proteína y en donde la proliferación celular se mide por cualquier medio adecuado.
12. 12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una molécula de bírodina 1 modificada de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, opcionalmente juntos con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. 13. Una molécula de ADN caracterizada porque codifica cualesquiera de las moléculas modificadas de birodina 1 como se especifica en cualesquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. 14. Un péptido caracterizado porque es parte de la birodina 1 de tipo silvestre y que comprende uno o más epítopos de células T que son ligandos MHC de clase II o secuencias de péptidos que muestran la capacidad de estimular o enlazar células T por medio de la presentación en la clase II; el péptido se selecciona del grupo: (a) = RYTLLHLTNYADETISVAVDV (Rl) , (b) = ATEAAKFVFKDAKKK (R2) , (c) = ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA (R3), (d) = ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA R4) , (e) = ATISLE NWSALSKQIQIAST (R5) .
15. 15. El péptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque tiene un índice de estimulación (SI) de >1.8 en un ensayo biológico de proliferación celular de células T humanas, en donde el índice se toma como el valor de la proliferación celular registrada siguiendo a la estimulación por un péptido y dividido por el valor de la proliferación celular registrada en células de control que no reciben el péptido y en donde la proliferación celular se mide por cualquier medio adecuado.
16. 16. El uso de una secuencia de péptidos especificada en la figura 1, o una secuencia de péptidos de al menos 9 residuos de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, para la manufactura de una molécula de birodina 1 o variantes de la misma que son substancialmente no inmunogénicas o menos inmunogénicas que cualquier molécula no modificada que tiene la misma actividad biológica cuando se usa in vivo.