KR20050010898A - 감소된 면역원성을 갖는 개질 브리오딘 1 - Google Patents

감소된 면역원성을 갖는 개질 브리오딘 1 Download PDF

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KR20050010898A KR10-2004-7020198A KR20047020198A KR20050010898A KR 20050010898 A KR20050010898 A KR 20050010898A KR 20047020198 A KR20047020198 A KR 20047020198A KR 20050010898 A KR20050010898 A KR 20050010898A
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Abstract

본 발명은 생체 내에서 사용될때 임의의 비개질 대응물보다 덜 면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 브리오딘 1 단백질을 초래하는 브리오딘 1의 변경에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감소된 면역원성을 갖는 개질 브리오딘 1 변이체를 생성 가능하게 하는 수단을 이용하여 상기 비개질 단백질로 부터 유래된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질 브리오딘 1{MODIFIED BRYODIN 1 WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}
치료적 단백질의 효능이 치료적 단백질에 대한 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 설정에 있어서 치료법으로써 유망함을 보여주었지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 응답성의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985)J. Immunol.135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 응답성을 감소시키기위한 시도로 여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 인해 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되었지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가되었다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999)Transplantation 68: 1417-1420].
항체가, 면역 반응을 일으킬 수 있는 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 응답성을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 그 중에서도 과립구-대식세포 집락 자극인자 [Wadhwa, M. 등, (1999)Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등, (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등, (1988)New Engl. J. Med.318: 1409-1413] 의 치료적 용도가 포함된다.
면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상으로의 제시를 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드, 소위 "T 세포 에피토프" 의 단백질 내 존재이다. 상기 잠재적인 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자들에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 상기 T 세포 에피토프는 MHC 결합의 성립으로 측정될 수 있다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로 TCR 의 관여에 의해 상기 T 세포의 활성화를 유도하여 T 세포응답을 자극할 수 있는 에피토프를 의미한다. 그러나, 보통은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 발견된 특정 펩티드들은, 상기 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자가" 로 인식되기 때문에 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.
특정한 상기 T 세포 에피토프 펩티드는 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주 조직적합 복합체 (major histocompatability complex, MHC) 의 분자에 의해 제시되어 T 세포의 활성화를 시발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제시되는 펩티드에 있어서, T 세포의 상기 활성화는 이어서, 예를 들어 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 응답을 일으켜 상기 항체를 생산하도록 할 수 있다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선별 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR) 가 상기 단백질군의 주요 이종형 (isotype) 이며, 본 발명의 주요 초점이다. 그러나, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 상기물에도 대등하게 적용가능하다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 통해 이들의 C 말단에서 삽입되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이합체 (hetero-dimer) 는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 개 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 개 아미노산으로 구성된다. 최근에 DQ 분자는 상동 구조를 갖는 것으로 나타났고, DP 군의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이종형에 대해서는 대략 70 개의 상이한 동종이형 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 동종이형이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 동종이형이 공지되어 있다. 각 개인은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등,Nature(1993)364: 33; Stern 등, (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대 유연성을 보장한다. 상이한 지리학적 인구집단 및 인종군 내 별개의 "패밀리"에 따라 리간드 결합 도메인 내에 상당한 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "패밀리" 는 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 중복이 있을 수 있다. 상기 특이성이 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B 세포 에피토프에 대한 항체 응답성을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T 세포 응답성) 을 결정한다. 따라서, 개인에서의 단백질에 대한 면역 응답성은, 개인의 HLA-DR 동종이형의 펩티드 결합 특이성의 기능인 T 세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로,세계 인구집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T 세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 동종이형 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 백분율의 세계 인구를 포함하는 것이 바람직하다.
치료적 단백질에 대한 면역 응답성은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와의 연합된 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께, T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 추가 활성화시키는 싸이토카인을 방출시켜, 항체를 생산시키거나 완전 세포성 면역 응답성으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다.
APC 표면 상의 제시를 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 여러 요인, 가장 중요하게는 그 일차 서열에 의존한다. 이는, 그 단백질 분해 절단에 대한 경향 및 MHC 클래스 II 분자 상의 펩티드 결합 틈 (cleft) 내에서의 결합에 대한 그 친화도 두가지 모두에 영향을 미칠 것이다. APC 표면 상의 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 노출된 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공되는 결정기를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR) 에 결합면을 제시한다.
당 분야에는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는절차가 있다 (예, W098/52976 및 WO00/34317). 상기 펩티드는 모든 상황에서, 특히 생체 내에서, 진행 경로 또는 기타 현상으로 인해 T 세포 에피토프로 작용하지 못할 수 있다. T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이다. 단백질로부터의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 및 제거에 대해서는 이미 개시되어 있다. 당 분야에서, 통상 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프에서 인식된 서열 모티브를 스캐닝 (scanning) 하는 컴퓨터 수단에 의해 T 세포 에피토프의 검출이 가능하도록 하는 방법, 또는 이와는 달리 컴퓨터 기술을 사용하여 MHC 클래스 II-결합 펩티드 및 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 방법이 제공되었다.
W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 세트에 결합할 수 있는 잠재성을 가진 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 컴퓨터 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측된 T 세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래 두가지의 치료적 항체 또는 비항체 단백질의 일차 서열 내에서의 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.
인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T 세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 분야에서 사용되어 왔다 [Kern, F. 등, (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588]. T 세포와 결합하거나 또는 자극할 수 있는 개질된 능력을 가진 분자에 대해 스크리닝된 전체 단백질 또는 합성 펩티드 또는 그의 변이체 분자의 이용과 같은 예를 포함하는 상기 및 다른 개념이 에피토프 동정 전략에서 개발될 수 있다.
상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 원칙적으로 치료적으로 유용하지만 원래는 면역원성인 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T 세포 에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
상기 치료적으로 유용한 분자들 중 하나는 브리오딘 1 이다. 본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 개질된 형태의 브리오딘 1 을 제공한다. Gawlak 등[Gawlak, S. 등(1997) Biochemistry 36: 3095-3103]에 의해 주어진 바와 같이 브리오딘 1 단백질의 서열은 하기와 같이 단일 문자 코드로 제시된다:
브리오딘 1 단백질은 대략 29,000 Da의 분자량을 갖는 267 개 아미노산의 단일 폴리펩티드이다. 브리오딘 1 은 본래 식물 브리오니아 디오니카(Bryonia dionica)의 뿌리로부터 분리된 타입 1 리보솜 불활성화 단백질 (RIP)이다[US,5541110]. 이들의 생체 세포에 대한 독성때문에 이에 대해 그리고 다른 RIP들에 대해 상당한 관심을 보이고 있다. 특히 세포-특이적 타겟 도메인들(예를 들어 항체)과의 융합된 재조합 형태는 특정 세포 개체수의 선택적 도살이 바람직한 결과를 가져오는 많은 치료적 분야들에서 잠재적 가치를 지닌다.
특히 본 발명은 목적은 면역 특성이 잠재적 T 세포 에피토프의 감소된 수에 의해 개질되는 개질 브리오딘 1 을 제공하는 것이다.
다른 이들은 브리오딘 분자 및 특히 재조합 브리오딘 1 을 제공하지만[US,5541110; US,5932447], 상기 교시들은 단백질의 면역원적 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못했을 뿐만 아니라, 본 발명의 개요에 따른 특이적이며 제어되는 방식으로 상기 특성에 직접 영향을 미치는 것에 대해서는 인식하지 못했다. 반대로, 2000년 6월 15일 출원된 PCT 특허 출원 WO00/34317 은 5, 6, 18, 27, 111, 164, 216, 222, 237 및 249 의 위치에서의 치환을 포함하는 개질된 브리오딘 1 분자를 개시한다. 상기 치환은 컴퓨터 이용(in-silico) 모티프 매칭 도구의 기재상에서 선택되지만 생물학적 분석에서 검출된 가장 생물학적으로 관련된 MHC 클래스 II 에피토프를 의미하지는 않으며 이들은 여기에 최초로 개시된다. 또한 본 발명이 대상 분자 내에서 생물학적으로 관련되는 에피토프로서 여겨지는 서열들을 개시하는 경우, 관련 단백질들 즉 구조적 동질성에 따라서 상기 단백질들에서도 상응하는 에피토프인 α-트리코산틴, α-모모르카린 및 β-모모르카린의 다수의 동일한 서열들을 발명자들은 인식하였다.
증강된 특성을 갖는 브리오딘 1 유사체에 대한 지속적인 요구가 있다. 요구되는 증강에는 상기 치료물의 발현 및 정제에 대한 대안적인 방법 및 양식 뿐만 아니라, 특히 단백질의 생물학적 특성의 개선이 포함된다. 특히 인간 대상체에 투여될 경우 생체 내 특성의 증강에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 응답성을 유도할 잠재성이 감소되거나 부재하는 브리오딘 1 을 제공하는 것이 크게 바람직하다.
본 발명은 특히 치료용으로, 특히 인간에게 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 개질된 폴리펩티드로써, 개질은 인간 대상체에 대한 투여 상의 면역 응답성을 나타내는 폴리펩티드에 대한 감소된 성향을 초래한다. 본 발명은 특히 생체내 사용되는 경우 임의의 비개질 대응체에 비해 덜 면역원성이거나 또는 본질적으로 비면역원성인 브리오딘(bryodin) 1 단백질을 초래하는 브리오딘 1 의 개질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감소된 면역원성을 가진 개질 브리오딘 1 변이체를 생성할 수 있는 수단으로써 상기 비개질 단백질로부터 유도된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.
도 1 은 잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 브리오딘 1 내 펩티드 서열의 목록을 제공한다. 펩티드는 13-머이고, 아미노산은 단일 문자 코드를 이용하여 나타낸다.
도 2 는 실시예 2 의 나이브 인간 시험관 내 T-세포 분석을 이용하여 분석된 브리오딘 1 15-머 펩티드의 표를 제공한다. 펩티드 ID# 및 브리오딘 1 서열 내 N-말단 펩티드 잔기의 위치를 나타낸다.
도 3 은 실시예 2 의 나이브 인간 시험관 내 T-세포 분석을 이용하여 2 명 이상의 공여자 PBMC 로부터의 PBMC 제제에서 2.0 이상의 자극 지수를 나타낸 브리오딘 1 (1BRY) 서열로부터의 서열 성분 R1, R2, R3, R4 및 R5 를 나타낸다. 관련 단백질 α-트리코산틴 (1TCS), α-모모르카린 (1MOM) 및 B-모모르카린 (1CF5) 로부터의 해당 서열을 각각의 브리오딘 1 서열 밑에 나타낸다. 서열들은 나타낸 부분을 제외하고는 브리오딘 1 과 동일하다. 아미노산은 단일 문자 코드를 이용하여 나타낸다.
도 4 는 개별 브리오딘 1 펩티드에 대한 공여자 반응 백분율을 나타낸다.총 85 개 펩티드가 21 명의 공여자 표본으로부터의 PBMC 제제를 이용하여 평가되었다. 양성 반응은 SI > 2 로 취하였고, 2 명 이상의 공여자에서 양성 반응이 나타난 에피토프 영역을 동정하였다.
도 5 는 나이브 인간 T-세포 증식 분석으로부터의 대표적 자극 지수 (SI) 도식을 나타낸다. 반응은 1 μM 및 5 μM 농도의 펩티드로 나타낸다. 각각의 피크는 3 회 분석의 평균이다.
패널 A 는 에피노프 영역 R1 내에 포함된 브리오딘 1 펩티드에 대한 3 명의 공여자 표본으로부터의 PBMC 반응을 나타낸다.
패널 B 는 에피노프 영역 R2 내에 포함된 브리오딘 1 펩티드에 대한 2 명의 공여자 표본으로부터의 PBMC 반응을 나타낸다.
패널 C 는 에피노프 영역 R3 내에 포함된 브리오딘 1 펩티드에 대한 2 명의 공여자 표본으로부터의 PBMC 반응을 나타낸다.
패널 D 는 에피노프 영역 R5 내에 포함된 브리오딘 1 펩티드에 대한 3 명의 공여자 표본으로부터의 PBMC 반응을 나타낸다.
도 6 은 에피토프 영역 R1 내에서 동정된 MHC 클래스 II 리간드의 도식이다. 리간드는 실시예 1 의 컴퓨터 이용 시스템을 이용하여 동정되었다. 상기 경우, 18 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각각의 13-머의 잔기 번호 1 은 검은색으로 나타낸다. 각각의 18 개 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합 상호작용 강도 (높음, 중간 또는 낮음) 는 나타내는 키에 따라 보여진다.
도 7 은 에피노프 영역 R2 내에서 동정된 MHC 클래스 II 리간드의 도식이다. 리간드는 실시예 1 의 컴퓨터 이용 시스템을 이용하여 동정되었다. 상기 경우, 18 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각각의 13-머의 잔기 번호 1 은 검은색으로 나타낸다. 각각의 18 개 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합 상호작용 강도 (높음, 중간 또는 낮음) 는 나타내는 키에 따라 보여진다.
도 8 은 에피노프 영역 R3 내에서 동정된 MHC 클래스 II 리간드의 도식이다. 리간드는 실시예 1 의 컴퓨터 이용 시스템을 이용하여 동정되었다. 상기 경우, 18 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각각의 13-머의 잔기 번호 1 은 검은색으로 나타낸다. 각각의 18 개 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합 상호작용 강도 (높음, 중간 또는 낮음) 는 나타내는 키에 따라 보여진다.
도 9 는 에피노프 영역 R4 내에서 동정된 MHC 클래스 II 리간드의 도식이다. 리간드는 실시예 1 의 컴퓨터 이용 시스템을 이용하여 동정되었다. 상기 경우, 18 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각각의 13-머의 잔기 번호 1 은 검은색으로 나타낸다. 각각의 18 개 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합 상호작용 강도 (높음, 중간 또는 낮음) 는 나타내는 키에 따라 보여진다.
도 10 은 에피토프 영역 R5 내에서 동정된 MHC 클래스 II 리간드의 도식이다. 리간드는 실시예 1 의 컴퓨터 이용 시스템을 이용하여 동정되었다. 상기 경우, 18 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각각의 13-머의 잔기 번호 1 은 검은색으로 나타낸다. 각각의 18 개 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합 상호작용 강도 (높음, 중간 또는 낮음) 는 나타내는 키에 따라 보여진다.
식 1 은 감소된 면역원성 잠재력을 갖는 브리오딘 1 분자의 도입을 위해 고려될 수 있는 대안적 치환을 특징으로 하는 가장 바람직한 브리오딘 1 구조를 나타낸다.
발명의 개요 및 설명
본 발명은 브리오딘 1 의 개질 형태를 제공하며, 여기에서 면역 특성은 잠재적인 T 세포 에피토프들 갯수의 감소에 의해 개질된다.
본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재능에 의해 잠재적인 T 세포 에피토프인 브리오딘 1 일차 서열 내에서 동정되는 서열을 개시한다. 본 개시는 특히 267 개의 아미노산 잔기들을 함유하는 N-말단 프로-펩티드를 포함한 브리오딘 1에 관한 것이다.
본 발명은 인간에서 면역원성인 브리오딘 1 일차 서열의 주요 부분을 개시하며, 따라서 상기 부위의 면역원성 효과를 제거하거나 또는 감소시키는 상기 서열의 개질을 행하기 위해 요구되는 주요한 정보를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 면역원성 영역을 포함하는 합성 펩티드는 모든 분자에 대한 관용원성 응답성을 개선시키기 위한 약제학적 조성물에 제공될 수 있다.
추가의 구현예에서, 여기에 개시된 에피토프 영역 내에서 개질된 브리오딘 1 분자는 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
나이브(naive) T 세포 분석에서 브리오딘 1 의 면역원성 영역을 맵핑하기 위한 합성 펩티드 패널의 사용;
나이브 T 세포 분석에서 대략 2 보다 큰 자극지수를 발생시키는데 사용되는 브리오딘 1 유도 펩티드 서열;
개질된 버전의 브리오딘 1 아미노산 서열을 포함하고 브리오딘 1 에 반응성인 공여자의 세포를 이용한 T 세포 증식 분석에서 야생형 브리오딘 1 아미노산서열에 의해 발생된 수치 이하의 자극지수를 발생시킬 수 있는 분자;
브리오딘 1 의 생물학적 활성을 갖고 생체 내에서 사용될 때 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성이거나 또는 실질적으로 비면역원성인 개질 분자;
면역원성의 상기 소실이 본래의 비개질 분자로부터 유도되는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거에 의해 달성되는 해당 특정 분자;
면역원성의 상기 소실이, 상기 분자로부터 유도되는 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형 수의 저감에 의해 달성되는 해당 특정 분자;
상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상에 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인 해당 특정 분자;
상기 펩티드 서열이 도 1 에 도시된 군으로부터 선택되는 해당 특정 분자;
본래 존재하는 임의의 T 세포 에피토프 중 1 - 9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 한 아미노산 잔기가 변경된 해당 특정 분자;
아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실인 해당 특정 분자;
필요한 경우, 일반적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의한 부가적인 추가의 변경이 상기 분자의 생물학적 활성을 보존하도록 수행되는해당 특정 분자;
도 1 의 임의의 펩티드와 90% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;
도 1 의 임의의 펩티드와 80% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;
MHC 클래스 II 에 결합할 수 있는 상기의 펩티드 서열;
하나 이상의 아미노산 치환이 도 1 에 특정된 임의의 아미노산에 대응되는 위치에서 수행되는 해당 특정 브리오딘 1 분자;
상기 서열이 하기의 단일 문자 코드를 사용한 브리오딘 1 야생형 서열로부터 유도된 하기와 같은 임의의 또는 모든 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 서열의 인접 잔기 스트링으로부터 하나 이상의 잔기에서 변경이 수행되는 해당 특정 분자;
상기 임의의 서열 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 로부터의 13 - 15 개의 연속 잔기를 함유하는 펩티드 분자;
상기 임의의 서열 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 로부터의 9 개 이상의 연속 잔기를 함유하는 펩티드 분자.
상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 로부터 유도된 임의의 펩티드 서열과 90% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;
상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 로부터 유도된 임의의 펩티드 서열과 80% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;
MHC 클래스 II 에 결합할 수 있는 상기 펩티드 서열;
하나 이상의 아미노산 치환이 상기 임의의 서열 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 내 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되는 해당 특정 브리오딘 1 분자;
하나 이상의 아미노산 치환이 상기 서열 (a) 및/또는 (e) 내 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되는 해당 특정 브리오딘 1 분자;
하나 이상의 아미노산 치환이 상기 서열 (a) 및/또는 (e) 내에서 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되며 부가적인 치환이 상기 서열 (c) 및/또는 (d) 내에서 수행되는 해당 특정 브리오딘 1 분자;
상기 특정된 바와 같은 임의의 서열 (a), (b), (c), (d) 또는 (e) 의 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 서열 및 생체 내에서 사용될 때 타입 1 RIP 의 생물학적 활성을 가지며 임의의 비개질 분자와는 달리 본래 면역원성이 아니거나 면역원성을 덜 갖는 브리오딘 1, α-트리코산틴, α-모모르카린 및 β-모모르카린의 제조에의 사용;
MHC 클래스 II 에의 결합 활성을 갖는 상기 임의의 펩티드 또는 개질된 펩티드를 포함하는 약학적 조성물;
상기 및 하기 정의된 바와 같은 임의의 상기 특정 개질 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;
브리오딘 1 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자를 포함하는 약학적 조성물;
상기 및/또는 청구항에서 정의된 바와 같은 약학적 조성물과, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학적 조성물;
하기 단계를 포함하는 상기 언급된 청구항 중 임의 청구항에서 정의된 바와 같은 브리오딘 1 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법: (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열 결정; (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정; (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안; (iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가; 및 (v) 임의로 단계 (ii) - (iv) 의 반복;
단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프에서 1-9 개 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 해당 특정 방법;
상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 변형이 수행되는 해당 특정 방법;
상기 단계 (ii) 가 하기 단계들에 의해 수행되는 특정 방법: (a) 공지된아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 소정의 균일 크기를 갖는, 겹치는 아미노산 잔기 절편의 순차적 샘플링; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값의 합산에 의한, 각각의 상기 샘플링된 절편의 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어 계산; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료적 효용성을 실질적으로 감소시키기 않으면서 펩티드의 전체적 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한 개질에 적합한 1 개 이상의 상기 절편의 동정 (단계 (c) 는 바람직하게는 하기에 의해, 12-6 반 데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 입체구조 에너지 항목을 포함하도록 개질된 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 수행된다: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스의 제공; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스의 제공; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델 선택; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격의 선택; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정; (6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도값 결정; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5) 를 반복);
도 1 에 나타낸 바와 같은 군으로부터 선택되고, 비개질된 브리오딘 1 로부터 생성되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는, 13머 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드, 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 브리오딘 1 의 제조를 위한 그의 용도;
도 1 의 임의의 서열로부터 유래된 바와 같이 13머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상 연속 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 브리오딘 1 의 제조를 위한 그의 용도;
화학식 I 에따른 분자 구조의 브리오딘 1;
(서열 중, X0는 수소 또는 항체 도메인과 같은 타겟 부위이며;
X1은 가장 바람직하게는 A 이지만 G 및 P 또한 고려되며;
X2는 가장 바람직하게는 M 이지만 A, G, P 및 I 또한 고려되며;
X3는 가장 바람직하게는 A 이지만 G 및 P 또한 고려되며;
X4는 가장 바람직하게는 P 이지만 Y 또한 고려되며;
X5는 가장 바람직하게는 T 이지만 S 또한 고려되며;
X6는 P 이며;
X7는 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X8는 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X9는 가장 바람직하게는 A 이지만 P, G, H, D, E, N, Q, K, R, S 및 T 또한 고려되며;
X10은 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X11은 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X12은 가장 바람직하게는 A 이지만 P, S, T, H 및 K 또한 고려되며;
X13은 T 이며; X14는 H 이며; X15은 S 이며;
X16은 가장 바람직하게는 A 이지만 S, T, P, N, D, E, G, H, K 및 Q 또한 고려되며;
X17은 T 이며;
X18은 가장 바람직하게는 A 이지만 P 또한 고려되며;
X19은 가장 바람직하게는 A 이지만 I, F, G, M, P, V, W 및 Y 또한 고려되며;
X20은 가장 바람직하게는 F 이지만 P 및 W 또한 고려되며;
X21은 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X22은 가장 바람직하게는 G 이지만 A 및 P 또한 고려되며;
X23은 가장 바람직하게는 G 이지만 A 및 P 또한 고려되며;
X24은 가장 바람직하게는 A 이지만 P 및 G 또한 고려되며;
X25은 가장 바람직하게는 A 이지만 P, G, S 및 T 또한 고려되며;
X26은 가장 바람직하게는 A 이지만 I, M, S, T, P 및 G 또한 고려되며;
X27은 가장 바람직하게는 A 이지만 G 및 P 또한 고려되며;
X28은 가장 바람직하게는 S 이지만 A, G, P, T, H, D, N, Q, K 및 R 또한 고려되며;
X29은 가장 바람직하게는 T 이지만 A, G, S, P, H, K, R, D, E, N 및 Q 또한 고려되며;
X30은 가장 바람직하게는 A 이지만 G, S, T, P, K, R, H, D, E, N 및 Q 또한 고려되며;
X31은 Q 이며;
X32은 가장 바람직하게는 H 이지만 D, E, F, L, N, P, S, W 및 Y 또한 고려되며;
X33은 가장 바람직하게는 T 이지만 A, G, P, D, E, H, K, R, N, Q, S 및 T 또한 고려되며; X34은 가장 바람직하게는 D 이며,
여기서, 동시에 X1= T, X2= L, X3= H, X4= N, X5= Y, X6= I, X7= V, X8= V, X9= F, X10= V, X11= V, X12= L, X13= A, X14= G, X15= K, X16= I, X17= R, X18= I, X19= L, X20= L, X21= I, X22= L, X23= Y, X24= Y, X25= L, X26= L, X27= V, X28= L, X29= I, X30= L, X31= L, X32= K, X33= I 및 X34= I 인 것은 제외된다.
"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따르면 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 복합체로 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 이를 활성화시키는지 측정할 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다.
본원 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 생성 아미노산이 있으며, 이들의 임의 수를 임의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 생성 아미노산은 모두 L-배좌를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 배좌의 아미노산의 다양한 조합을 이용하여, 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때때로 "올리고펩티드" 로 불린다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 포함하며, "폴리펩티드" 로 불린다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있고, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 임의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 및 이에 따른 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.
"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬인 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 구조와 비교하여 매우 상당히 다양할 수 있는 물리적 구조를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 포함할 수 있는 Cα에 대한 돌출기이다.
본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 임의의 브리오딘 1 분자종에 적용될 수 있고, 따라서 유전 공학적 수단 또는 기타 방법에 의해 유도된 브리오딘 1 분자를 포함할 것이며, 267 개 전후의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명은 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체를 생성시키는 면역 반응을유도할 수 있는, 치료적 목적으로 인간에게 도입되는 가용성 단백질의 실제 현실을 극복하기 위한 것으로 간주된다. 본 발명은 인간 숙주에게 투여 시 면역 반응을 일으키는 성향이 변형된 브리오딘 1 단백질을 제공함으로써 이를 해결하고자 한다. 본원에 기재된 방법에 따라, 본 발명자들은 상기 단백질에 대한 면역 반응을 일으키는데 결정적인 T 세포 에피토프를 포함하는 브리오딘 1 분자 영역을 발견하였다.
개질 브리오딘 1 을 만드는 본 발명의 일반적 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열 결정;
(b) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;
(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안. 상기 서열 변이체는, 서열 변이체에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 다시 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성된다; 및
(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가.
단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 당분야에서 이전에 설명된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 에 개시되어 있으며, MHC 클래스 II 분자에 대한 브리오딘 1 유래 펩티드의 결합 성향을 확인하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명에서 구현된 조성물은 생체 외 인간 T 세포 증식의 생물학적 분석 및 WO 02/069232 에 개관된 방식을 연구하는 소프트웨어 도구와의 혼합 적용으로부터 유래되며 이는 본 발명의 구현예이다.
소프트웨어는 펩티드 MHC 클래스 II 결합 상호작용의 수준에서 항원 제시의 과정을 자극하여 임의의 주어진 펩티드 서열에 대한 결합 스코어를 제공한다. 이러한 스코어는 개체군에 현존하는 다수의 주된 MHC 클래스 II 동종이형에 대해 결정된다. 이러한 개념은 임의의 펩티드 서열을 시험할 수 있기 때문에, MHC 클래스 II 결합 그루브와 상호작용하는 펩티드의 능력과 관련하여 아미노산의 치환, 부가 또는 결실의 중요성이 예측될 수 있다. 결과적으로 MHC 클래스 II 와 상호작용할 수 있는 펩티드의 감소된 수를 포함하는 새 서열 조성물이 고안될 수 있어 이는 면역원성 T 세포 에피토프로 작용한다. 임의의 주어진 공여자 샘플을 이용한 생물학적 분석이 최대 4 DR 동종이형에 대한 결합을 평가할 수 있는 경우에, 컴퓨터 이용 방법은 동시에 40 이상의 동종이형을 이용한 동일한 펩티트 서열을 시험할 수 있다. 실제로 이러한 접근은 다중 MHC 동종이형과 상호작용하는 이들의 능력에 합치된 새 서열 변이체의 고안으로 직접 이어질 수 있다.
이러한 컴퓨터 이용 접근법의 예로서, 전체 브리오딘 1 서열 상에서 수행된 분석 결과들이 도 1 에 제공된다. 여기에는 주요 결합 스코어를 갖는 하나 이상의 MHC 클래스 II 동종이형에 결합하는 능력을 갖는 것으로 검출된 브리오딘 1 으로부터 유래된 13머 펩티드 서열이 리스트되어 있다. 이의 전부를 취한, 13머 펩티드의 데이타 세트는 높은 수준의 확실성을 갖는, 브리오딘 1 단백질에 대한 다수의 허용되는 MHC 클래스 리간드를 제공하는 것으로 여겨진다. 완전한 브리오딘 1 폴리펩티드의 단백질 가수분해 과정 및 생체 내 브리오딘 1 펩티드의 제시로 이어지는 생리학적 단계를 위한 필요조건 때문에, 상대적으로 전 펩티드 목록의 소수 서브-세트가 궁극적인 생물학적 관련성을 갖게 될 것이 명백하다. 이러한 생물학적으로 관련된 펩티드를 추가로 동정하기 위해서, 발명자들은 생체 외 인간 T 세포 증식 분석을 연구하는 접근법을 개발하였다.
이 접근은 특히 효율적인 방법으로 판명되며 본원에 발명의 구현예로서 개시된다. 상기 방법은 서열의 일부, 예를 들어 도 1 에 리스트된 것들의 전부 또는 일부와 같은 브리오딘 1 펩티드의 서브-세트를 시험하는 데에 적용될 수 있다; 또는 이 방법은 전체 서열을 시험하는 데에 적용될 수 있다. 본 연구에서, 상기 방법은 전체 브리오딘 1 서열(N-말단 프로-펩티드를 나타내는 펩티드를 포함)을 스캔하고 시험하기 위하여 개념 내에서 브리오딘 1 유래 펩티드 서열의 오버랩 시험에 관계된다. 합성 펩티드들은 시험관 내에서 배양된 인간 T 세포의 증식 반응을 발생시키는 능력에 대해 시험된다. 이러한 타입의 접근이 건강한 공여자들로부터 채취된 나이브 인간 T 세포를 이용하여 수행되는 경우에, 발명자들은 이러한 분석 작업에서, 2.0 이상의 자극 지수가 유도 증식의 측정에 유용하다는 것을 성립시켰다. 자극 지수는 통상 시험 펩티드와 접촉되지 않은 세포 내에서 측정된 스코어로 시험 펩티드에 대해 측정된 증식 스코어(예를 들어, 3H-티미딘 혼입을 이용하는 경우 분당 방사능의 계수)를 나누어 계산한다.
본 연구는 하나 이상의 공여자로부터 유래된 T 세포 내에서 주된 증식 반응(즉, SI>2.0)을 발생시킬 수 있는 일부 32 개의 펩티드 서열은 망라하지 못했다. 이러한 세트의 펩티드 내에서, 2 이상의 개별 공여자 샘플 내에서 주요 증식 반응을 일으키는 추가의 펩티드 서브-세트가 확인되었고 일부 이러한 반응들에 있어서 반응 등급이 실제로 SI=2.0 보다 크게 높았다.
아미노산 변경(예를 들어, 치환)이 모 분자에서 가장 면역원성인 영역 내에서 수행되는 브리오딘 1 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 본원의 발명자들은 인간의 브리오딘 1 분자의 가장 면역원성인 영역이 각각의 하기 아미노산 서열을 포함하는 잔기 46-66; 88-102; 112-135; 136-162; 및 178-204 를 포함하는 5 개 이상의 영역 R1-R5로 제한됨을 발견하였다;
이러한 영역들은 하나 이상의 공여자 PBMC 샘플에서 SI가 2 초과로 주어졌을 경우에 확인된 것이다. 예를 들어 에피토프 영역 R1은 스크린된 공여자 샘플들중 28% 이상을 나타내는 6 개의 서로 다른 공여자 샘플에서 반응성인 것으로 판명되었다. 비슷하게 R2 및 R3 에피토프는 시험된 3 명(14%)의 공여자 샘플과 반응하였고, R4 는 5 명(24%)의 공여자 샘플과, R5 는 시험된 4 명(19%)의 공여자와 반응하였다. 영역 R1-R5 를 모두 취합하면 광범위한 범위의 동종이형 특이성을 커버하는 21 명(48의%) 시험된 PBMC 공여자 샘플 중 10 명의 공여자와 반응하는 것으로 나타났다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에는, 동정된 MHC 클래스 II 리간드에 대한 임의의 에피토프 R1-R5 내에 브리오딘 1 분자를, 결합이 제거되도록 변경시키거나 또는 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형체의 수를 감소시키도록 변형하는 것이 포함된다.
다중의 잠재적 에피토프프들이 동정되고 특히 다수의 펩티드 서열들이 생물학적 분석에서 T 세포를 자극할 수 있는 것으로 확인되는 경우에, MHC 클래스 II 제시 경로를 통해 면역 반응을 일으키는 성향에 관계한 단백질의 구조적 특징에 관하여 생각해 볼 수 있다. 예를 들어 흥미있는 단백질의 결정 구조가 공지된 경우 결정학상 B-인자 스코어가 생물학적으로 유의적인 면역 우성 펩티드 에피토프에 대한 근접성과 상호관련 있는 것으로 여겨지는 단백질 내의 구조적 장애의 증거를 위해 분석될 수 있다[Dai G. et al (2001) J. Biological Chem. 276: 41913-41920]. 브리오딘 1 결정 구조 모델[PDB ID:1BRY, Gawlak, S. L. , et al (1997) Biochemistry 36 :3095]상에서 수행될 경우 이러한 분석은 상기 평균 B-인자 스코어를 갖는 영역 중간 위치에 맵핑되며 4 이상의 구체적인 구역들을 갖는 다중 면역 우세 에피토프에 대한 높은 가능성을 시사한다. 이러한 4 가지 영역들 중에서 펩티드의 N-말단 경계에 맵핑된 3 이 실시예 2 의 나이브 T 세포 분석에서 증식 반응을 일으키는 것으로 나타났다.
특정 펩티드에 상응하는 다수의 나이브 공여자에 대한 데이터와 함께 취해지는 상기 데이터는 분자의 대다수의 면역우성 영역의 예측적인 순위매김을 가능하게 한다. 그러나, 이는 실제로 각각의 이들 영역이 인간에서 고려된 면역원성이며, 따라서 본 발명의 개요 하에 개질을 필요로 한다. 따라서, 상기 정의된 서열 스트링 R1-R5 를 참조하여, 서열은 {R1, R5}, {R3, R4}, R2 의 순서로 순위를 매길 수 있으며; 여기서 {R1, R5} 는 가장 면역원성인 서열로 간주되며, R2 는 상대적으로 덜 면역원성인 것으로 간주된다. 괄호 안의 상기 서열에 대해서는 동등한 순위매김이 적용될 수 있다. 이를 근거로, 본 발명의 개념 하 가장 바람직한 브리오딘 1 조성은 에피토프 영역 R1 및 R5 내에서의 개질을 수반한다. 에피토프 영역 R3 및 R4 내에서의 추가 개질 및 임의로는 또한 에피토프 영역 R2 내에 추가적인 치환을 포함하는 조성이 또한 바람직하다.
본원에 개시된 에피토프 서열은, 상기 에피토프 중 하나 이상이 타협된 개질된 브리오딘 1 분자의 구축에 필요한 중요한 정보를 나타낸다. 본 발명의 개요 하에, 에피토프는 T-세포 에피토프로서 더 이상 기능할 수 없는 서열을 초래하기 위한 돌연변이에 의해 타협된다. 표적 서열의 지시적인 돌연변이화를 달성하기 위해 재조합 DNA 법을 이용하는 것이 가능하며, 다수의 상기 기술이 당업계에서 이용가능하며 공지되어 있다. 실제로, 다수의 변이체 브리오딘 단백질이 생성될것이며, 바람직한 면역 및 기능적 특성에 대해 시험될 것이다.
도 1 에 나열된 상기 펩티드 하나 이상의 아미노산 서열을 개질하기 위한 본 발명의 목적에 있어서, 상기 정의된 에피토프 영역 R1-R5 의 하나 이상의 서열을 개질하는 것이 가장 바람직하다. 본원에는 T-세포 에피토프로서 기능하는 대상 펩티드 서열의 성능 감소 또는 제거의 목적을 달성하는 적합한 개질을 개시되어 있으며, 이는 인간 숙주에 치료제로서 투여되는 경우 감소된 면역원적 잠재성을 가진 브리오딘 1 분자를 초래할 수 있다.
T-세포 에피토프의 제거를 위해, 아미노산 치환은 바람직하게는 T-세포 에피토프의 활성을 실질적 감소 또는 제거를 달성하는 것으로 예측되는 펩티드 서열 내에서의 적당한 지점에서 수행된다. 실제로, 적당한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 그루브 내에 제공된 포켓 중 하나 내에 결합하는 아미노산 잔기에 상당할 것이다. 펩티드의 소위 P1 또는 P1 앵커 지점에서의 클레프트(cleft)의 제 1 포켓 내에서의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 앵커와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓 사이의 결합 상호작용의 품질은 전체 펩티드에 대한 전반적인 결합 친화도의 주요 결정자로서 인지된다. 펩티드의 상기 위치에서의 적당한 치환은 포켓 내에 바로 상주되지 않는 잔기에 대한 것일 것이며, 예를 들어 더욱 친수성인 잔기에 대한 치환일 것이다. 단일 에피토프 내에서의 치환의 조합이 수행될 수 있으며, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중복되는 곳이 특히 적당할 수 있다. 더욱이, 주어진 에피토프 내에서 단독적이거나 또는 단독 에피토프 내에서 조합되어 있는 아미노산 치환은 MHC 클래스II 결합 그루브 에 대해 "포켓 잔기" 에 상당하지 않는 위치에서 수행될 수 있으나, 펩티드 서열 내 임의의 지점에서 수행될 수 있다. 치환은 동종 구조를 참조하여 수행될 수 있거나 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 이용 기술을 이용해 양산되는 구조적 방법을 참조하여 수행될 수 있다. 모든 상기 치환들은 본 발명의 범위에 속한다.
상기 정의된 에피토프 내에 있는 것 이외의 아미노산 치환은 특히 나열된 펩티드 내에서 수행되는 치환(들)과 조합되는 경우 수행될 수 있다. 예를 들어, 변경은 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 보존하기 위해 수행될 수 있다. 상기 보상적인 변경 및 변경들에는, 원하는 활성을 가지며 임의의 개시된 펩티드 내에서의 변경과 조합된 변이체를 제공하기 위한 브리오딘 1 폴리펩티드로부터 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가가 포함된다.
바람직한 개질의 상기 세트의 한 예는 R1 에피토프 영역의 붕괴에 의해 제공된다. 상기 영역 내에서의 모든 가능한 MHC 리간드의 완전한 제거는 하기 변경들을 포함하는 치환 세트에 의해 달성된다: T49A, L50M, H52A, N55P, Y56T, I56P, V65A 및 V67A. 상기 바람직한 변경은 단독적이든 또는 조합된 것이든 본 발명의 구현예이다.
유사하게, R2 에피토프의 붕괴를 달성하는 변경의 바람직한 세트는 치환 세트인 F99A, V100A 및 V108A 로써 제공된다. 단독적이거나 또는 조합된 것인 상기 바람직한 변경들은 본 발명의 구현예이다.
에피토프 영역 R3 에 대해서는, 대안적인 치환 세트가 분자의 중요한 구조적 특징의 지식을 근거로 정의된다. 류신 잔기 115 (L115) 에서의 치환을 포함하는 개질된 브리오딘 1 분자를 구축하는 것이 매우 바람직한데, 이는 상기 잔기가 R3 에피토프 내에서 정의된 하나의 MHC 클래스 II 리간드에 대한 P1 앵커로서 기능할 수 있기 때문이다. 따라서, 치환의 바람직한 세트는 L115A, I122A, I125A, L130A, L133F 및 I137A 를 포함한다. 그러나, L115는 ROP 활성에 대한 결합 클레프트의 플로어(floor)에 위치하기 때문에, 상기 치환은 분자의 기능적 활성과 타협할 수 있다. R3 에피토프 내에서의 현저한 MHC 리간드를 붕괴시키면서도 L115를 유지하는 대안적인 세트의 치환이 정의될 수 있다. 따라서, 상기 치환은 A118T, G120H, K121S 및 R123T 를 포함하며, 이중적 변경 L115A 및 I122A 이 대안으로 성립될 수 있다. 모든 변경들이 본 발명의 구현예이다.
영역 R4 에 대해서는, 바람직한 치환 세트가 L152A, L153A, V154A 및 L155S 와 조합된 L140G, Y142G, Y143A 를 포함한다. 모든 변경들은 단독적이든 조합된 것이든 본 발명의 구현예이다.
바람직한 개질 세트의 추가적인 예시는, I187T, L189A, L196Q, K197H, I200T 및 I202D 를 포함하는 변경을 이용한 R5 에피토프 영역의 붕괴로써 제공된다. 모든 변경들은 단독적이든 또는 조합된 것이든 본 발명의 구현예이다.
상기 바람직한 치환의 거의 모든 것에 있어서, 대안적인 아미노산이 임의의 주어진 위치에서 고려될 수 있다. 그러나, 대안적인 잔기의 선택은 비제한적인 것은 아니며, 잠재적인 MHC 펩티드 상호작용을 감소 또는 제거하는 광범위한 목적을 만족시키며 또한 분자의 구조 내에 상주하는 잔기에 한하는데, 즉 대부분의 회전체에 대해 현저한 측쇄 충돌이 회피되거나, 또는 다른 접촉들이 보존되거나 또는 마련된다. 고려될 수 있는 대안적인 잔기 선택의 예는 식 1 에 제시된 브리오딘 1 구조에서 제공된다.
앞으로는, 본 발명에 따라 다수의 변이체 브리오딘 1 단백질이 원하는 면역 및 기능적 특성에 대해 생산 및 시험될 수 있음을 보여줄 수 있으며, 모든 상기 기능성 단백질이 본 발명의 구현예이다. 더욱이, 수행된 개질은, 모 펩티드 또는 "야생형" (wt) 펩티드 서열과 동일한 친화성으로 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 없는 펩티드 서열을 제공할 수 있다는 것을 WO02/069232 의 예측적인 컴퓨터 이용 MHC 클래스 II 결합 도구를 이용하여 보여준다.
본 발명의 바람직한 분자는 임의의 여러 방식으로 제조될 수 있지만, 가장 바람직하게는 일상적인 재조합 방법을 수행한다. 임의의 바람직한 단백질 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA)를 유추하기 위해서는, 본원에 제공되는 정보 및 단백질 서열을 이용하는 것이 비교적 손쉽다. 이는, 예를 들어 컴퓨터 소프트웨어 도구, 예컨대 DNSstar 소프트웨어 스위트 [DNAstar Inc, Madison, WI, USA] 또는 유사물을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 또는 이들의 유의미한 동족체를 코딩할 수 있는 임의의 상기 DNA 서열은 본 발명의 구현예로서 간주되어야 한다.
일반적 방식으로, 임의의 바람직한 브리오딘 1 단백질 서열을 코딩하는 유전자는 유전자 합성을 이용하여 제조되고, 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 다시, 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 세포가 선택 및 배양된다. 바람직한 분자는 배양 배지로부터 정제되어, 치료적 투여를 위한 제제로 제형화된다. 이와는 달리, 야생형 브리오딘 1 유전자 서열은, 예를 들어 브리오니아 식물의 뿌리 조직으로부터 제조된 RNA 를 사용하는 cDNA 클로닝 전략에 따라 수득될 수 있다. 야생형 유전자는 돌연변이화에 대한 주형 및 바람직한 변이체 서열에 대한 구축물로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 다른 방법론 및 시스템도 용이하게 적용될 수 있지만, Higuchi 등 [Higuchi 등, (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7351] 에 의해 기술된 "오버랩 연장 PCR" 전략을 이용하는 것이 특히 편리하다.
바람직한 브리오딘 1 분자의 구축은 재조합 DNA 기법에 의해 달성될 수 있고, 여기에는 목적하는 항체 가변부 도메인 또는 기타 타겟팅 부분과 융합된 브리오딘 1 분자가 포함된다. 융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 정제 및 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 필요한 기법은, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 판 (Sambrook 등, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocolsin Molecular Biology" (F.M. Ausubel 등, eds., 1987); "PCR:The Polymerase Chain Reaction" (Mullis 등, eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan 등, eds., 1991) 와 같은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
당업자에게 명확할 바와 같이, 여러 대안적 치환 세트가 바람직하지 못한 에피토프의 제거 목적을 달성하기 위해 얻어질 수 있다. 그러나, 생성 서열은 본원에 개시된 특정 조성과 근접하게 상동성인 것으로 인지될 것이며, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명이 개질 브리오딘 1 에 관한 것인 한, 상기 개질 브리오딘 단백질 또는 개질 브리오딘 단백질의 절편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위 내로 간주되어야 한다. 또다른 측면에 있어서, 본 발명은 개질 브리오딘 부분을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 추가 측면에 있어서, 본 발명은 개질 브리오딘 1 단백질을 이용하는 인간의 치료적 처리 방법에 관한 것이다. 상기 측면에 있어서, 개질 브리오딘 1 단백질은 항체 분자 또는 항체 분자 절편과 연결될 수 있다. 연결은 화학적 가교결합제의 의할 수 있고, 또는 브리오딘 1-항체가 재조합 융합 단백질로 제조될 수 있다. 융합 분자는 융합 분자의 N-말단을 향해 배열된 항체 도메인을 갖는 개질 브리오딘 1 도메인을 포함할 수 있지만, 반대 배열도 포함될 수 있다.
본 발명의 개질 브리오딘 1 분자를 연결하기 위해 바람직한 항체의 특이성은 내화 항원 결정기에 대해 생성된 것들을 포함한다. 상기 항원 클래스의 예는 희귀하지만, A33 항원 [Heath, J.K. 등 (1997) Proc. Natl, Acad. Sci U.S.A. 94:469-474] 및 GA733-1 항원 [US, 5,840,854] 이 포함될 것이다. 태아성암 항원도 또한 용도에 포함될 수 있으며, 하기를 포함하는 임의의 여러 항체에 의해 타겟팅될 수 있다 [Chester, K.A. 등 (1994) Lancet 343:455], A5B7 [W092/010159], T84.66 [US, 5,081,235], MN-14 [Hansen, H.J. 등 (1993) Cancer 71:3478-3485], COL-1 [US, 5,472,693] 및 기타. 다른 바람직한 특이성에는 비내화 (non-internalising) 항원에 대해 생성된 항체가 포함되며, 여기에는 항원, 예컨대 항체 KS 1/4 [Spearman 등 (1987) J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 241:695-703] 및 기타 항체에 의해 인지되는 40kDa 당단백질 항원이 포함될 수 있다. 다른 항원, 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (HER1) 또는 관련 수용체, 예컨대 HER2 가 항-GD2 항체, 예컨대 항체 14.18 [US, 4,675,287; EP 0 192 657] 를 포함하여 선택될 수 있고, 전립선암 특이적 막 항원 [US, 6,107,090], IL-2 수용체 [US, 6,013,256], 루이스 Y 결정기, 뮤신 당단백질 또는 기타에 대한 항체가 포함될 수 있다.
개질 브리오딘 1 단백질이 항체 서열과의 융합물로 제조되는 모든 경우에 있어서, T 세포 에피토프 또는 서열이 MHC 클래스 II 분자에 결합하거나 T 세포를 자극하거나 MHC 클래스 II 분자와 연합한 T 세포에 결합할 수 있는 항체 서열이 제거된 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 추가 구현예에서, 개질 브리오딘 1 단백질은 비항체 단백질에 연결될 수 있지만, 단백질이 여전히 특정 표적 세포에 특이적 결합 상호작용을 할 수 있다. 상기 단백질 부분에는 특이적 세포 표면 수용체가 존재하는 여러 폴리펩티드 리간드가 포함되며, 따라서 여러 사이토카인, 펩티드 및 폴리펩티드 호르몬및 기타 생물학적 반응 개질제가 포함된다. 구체적 예에는 혈관 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 헤레굴린, 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자 및 기타 단백질 및 당단백질 분자와 같은 단백질이 포함된다. 본 발명의 브리오딘 1 과 상기 및 기타 분자의 융합 단백질에는 단백질 리간드 도메인에 대해 N-말단 또는 C-말단 도메인에 개질 브리오딘 1 부분이 포함될 수 있고 포함할 수 있다. 마찬가지로, 개질 브리오딘 1 단백질에 대한 정제 리간드의 화학적 가교결합은 본 발명의 범위 내에 속하며, 포함될 수 있다.
추가 구현예에 있어서, 본 발명의 개질 브리오딘 1 단백질은 개질 브리오딘 1 단백질이 중합체에 공유 부착하거나 중합체와 비공유 결합 상호작용을 하는, 수용성 중합체, 예컨대 히드록시프로필메타크릴아미드 또는 다른 중합체를 포함하는 복합체로 사용될 수 있다. 상기 구현예에는 부가적으로 항원 결합 도메인, 예컨대 중합체 브리오딘 1 복합체와 연합된 항체 또는 항체 절편이 포함될 수 있다.
추가 측면에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 서열과 서열 상동성 또는 부분 상동성을 갖는 펩티드 또는 유도체 분자를 포함하는 약학 제제를 이용한 치료적 처치 방법에 관한 것이다.
추가 측면에 있어서, 본원에 개시되고 브리오딘 1 분자에 관련된 주요 면역원성 에피토프는 또한 본원에서 브리오딘 1 이 예인 여러 다른 제 1 유형의 RIP 단백질의 일차 서열 내에 존재하는 것으로 나타난다. 따라서, α-트리코산틴 (1TCS), α-모모르카린 (1MOM) 및 β-모모르카린 (1CF5) 및 기타 단백질이 브리오딘 1 분자의 면역원성 영역에 상동성 또는 유사 상동성을 갖는 서열 성분을 포함하는 것으로 단백질 서열 분석에서 나타날 수 있다. 도 3 은 브리오딘 1 주요 에피토프 및 1TCS, 1MOM 및 1CF5 단백질로부터의 서열 성분 간의 서열 비교를 나타낸다. 현재까지, 본 발명은 다른 단백질 내에서 동일하거나 실질적으로 유사한 서열이 동정되는 브리오딘 1 단백질 유래 펩티드 및 개질 서열에 관한 것이며, 이들도 본 발명의 범위 내에 동일하게 포함된다. 이는 특히 본원에 동정된 바람직한 돌연변이 세트의 일부에 있어 사실이다. 예를 들어, 브리오딘 1 서열 내에 포함된 R2 및 R3 내의 변화는 1TCS 서열 내의 동등 영역으로부터 MHC 클래스 II 리간드 제거를 위해 적용될 수 있다. 동등하게, 하나 이상의 치환 T49A, L50M, H52A, N55P, Y56T, I61P, V65A 및 V67A 를 포함하는 브리오딘 1 에서의 R1 변화는 단백질 1TCS 및 1CFS 의 동등 영역에 적용될 수 있다. 상기에서, 번호지정은 브리오딘 1 서열에 따른다. 일부 바람직한 R4 및 R5 변화도 또한 RIP 단백질 1TCS, 1CF5 및 1MOM 내에서 수행될 수 있으며, 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명이 개질 브리오딘 1 에 관한 것인 한, 상기 개질 브리오딘 1 단백질 또는 개질 브리오딘 1 단백질의 절편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위 내로 간주되어야 한다. 상기 측면의 구체적 예는 하나 이상의 개시된 펩티드가 면역치료 의도를 가지고 환자에게 투여되는 펩티드 매개 관용 유도 전략의 개발일 수 있다. 따라서, 합성 펩티드 분자, 예를 들어 도 1 에 기재된 하나 이상의 것들 또는 보다 바람직하게는 상기 정의된 임의의 에피토프 영역 R1-R5 의 전부 또는 일부를 포함하는 서열. 상기 펩티드는 본 발명의 구현예로 간주된다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 개질 브리오딘 1 부분을 코딩하는 헥산에 관한 것이다.
이제 본 발명을 하기 실험예로 예시할 것이다. 본 발명은 후술되는 도면으로 부가적으로 예시된다:
실시예 1
펩티드 MHC 결합 분석을 수행하기 위한 컴퓨터 이용 시스템을 이용한 브리오딘 1 의 에피토프 동정 방법:
단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 중의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조로, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 기를 포함하는 임의의 유기 화합물군이다.
인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:
O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 코너에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.
폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배좌를 정의하는데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배좌에 대해 상기 원자의 평면성이 약간 일탈될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배좌, 즉 주위 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 2 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φ1, ψ1(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인식에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437(1968), 페이지 285-94] 를 참고.
본 발명의 방법은 임의 단백질에 적용될 수 있으며, 부분적으로 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 순응될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 순응될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 순응될 수 있도록, 순응될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).
본 발명을 구현하는 컴퓨터적인 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:
(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 약 2 배의 값, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값 2 및 방향족 측쇄에 대한 값 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이인 각각의 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 절편의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 절편 (윈도우) 에 존재하는 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에서 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.
본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 가능성을 갖는다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 예측에는 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물 각각에 대해 각 모델로의 각각의 골격 잔교 (dock) 에 대한 아미노산 측쇄 배좌의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 배좌, 및 상기 상호작용의 결합 스코어 일탈을 선택하기 위한 스코어링 기능을 갖는 상기 골격 및 측쇄 배좌 라이브러리의 용도가 포함된다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 력 필드 (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815) 를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 각각의 아미노산 대안물의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적인 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. 단백질 Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995) 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후, 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해 상기 포켓 라이브러리의 포켓 유형을 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 컴퓨터적인 방법 (Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 과 매우 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법은 또한 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경우 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대립유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수가 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수 있다.
골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자와 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치 변화를 허용한다. 이는 다시, 특정 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 이전의 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배좌의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.
최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 수반되는 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 수반되는 아미드 평면은 각각의 상기 Cα상에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 수반되는 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 수반되는 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다.
이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 수반되는 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지 각각의 수반되는 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.
생성되는 골격의 수는 여러 요인에 근거한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 수반되는 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 순응될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성시킨다.
MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배좌로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 근거한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나거부된다: 배치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배좌 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 배좌 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배좌의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.
상술된 골격/측쇄 배좌의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배좌와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체성 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배좌에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 스코어링 함수를 이용하여 펩티드 스코어를 유도한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 결합 친화도 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 선택된 아미노산 연장물이다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. 골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배좌를 허용되는 배좌의 데이타베이스로부터 선택한다. 적절한 원자 정체성 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재평가하여, 결합 친화도를 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.
펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다.
수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자가 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될 때 가장 강하다.
정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 및 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.
친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.
반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.
하나의 구현예에서, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수(SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화도를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는 단백질에 대한 리간드의 결합 친화도를 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항목이 공식에 부가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항목에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지가 추정된다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 개질 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 개질 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔGbind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 손실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG0); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 기여 (ΔGhb); 비교란 (unperturbed) 이온 상호작용의 기여 (ΔGionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔGlipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 손실 (ΔGrot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (EVdW). 상기 항목을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:
[수학식 1]
(ΔGbind) = (ΔG0) + (ΔGhb×Nhb) + (ΔGionic×Nionic) + (ΔGlipo×Nlipo) + (ΔGrot+ Nrot) + (EVdW).
여기서, N 은 특정 항목에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서, ΔG0, ΔGhb, ΔGionic, ΔGlipo및 ΔGrot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 각각 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.
항목 Nhb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:
[수학식 2]
Nhb= Σh-bondsf (ΔR, Δα) × f (Nneighb) × fpcs
f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황에 대한 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:
[수학식 3]
f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)
여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나
ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나
ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,
또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나
Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나
Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.
TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이다.
ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.
Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠N/O-H..O/N의 편차이다.
f(Nneighb) 는 단백질 표면의 오목 및 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:
[수학식 4]
f(Nneighb) = (Nneighb/Nneighb,0)α(여기서 α = 0.5 임).
Nneighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb.0는 상수 = 25 이다.
fpcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:
Apolar/NHB< 10Å2인 경우 fpcs= β이거나
Apolar/NHB> 10Å2인 경우 fpcs= 1 이다.
Apolar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.
NHB는 수소 결합의 수이다.
β는 그 값이 1.2 인 상수이다.
개질 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용의 기여로부터, 동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, ΔGionic이 상술된 수소 결합에서와 유사한 방식으로 계산된다.
항목 Nlipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:
[수학식 5]
Nlipo= Σ1Lf(r1L[t1])
f(r1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준으로 계산된다:
r1L≤ Rl 인 경우 f(r1L) =1,
R2 < rlL> R1 인 경우 f(r1L) = (r1L-R1)/(R2-R1),
r1L≥ R2 인 경우 f(r1L) = 0
여기서, R1 = rl vdw+ rL vdw+ 0.5 이고
R2 = R1 + 3.0 이고
rl vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고
rL vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.
항목 Nrot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp3-sp3및 sp3-sp2결합의 수로 고려된다. 말단 -CH3또는 -NH3의 회전은 고려되지 않는다.
최종 항목 EVdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:
[수학식 6]
EVdW= ε1ε2((r1 vdw+ r2 vdw)12/r12- (r1 vdw+ r2 vdw)6/r6).
여기서, ε1및 ε2는 원자 정체성에 근거하는 상수이며,
r1 vdw+ r2 vdw는 반 데르 발스 원자 반경이고,
r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.
수학식 6 에 대해, 하나의 구현예에서, 상수 ε1및 ε2는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.
상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정에 대해서 목적하는 결과를 주는 임의의 적합한 수치값으로 변화될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다.
상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배좌, 원자 정체성 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 계수적 성질이, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배좌 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 데이타가 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다.
본 발명의 예측 방법은 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 실험적으로 미리 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포에피토프가 정확히 예측될 수 있는 것으로 공지된 상기 한계값이 결정될 수 있다.
상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하기 위한 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 상대적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 선택된 역치값을 초과하는 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 회 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 성질로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다. 당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다.
복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 처리 시간의 한계는 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 수 있음을 예견할 수 있다.
폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].
실시예 2
나이브 인간 T 세포 증식 분석을 이용한 브리오딘 1 내에 에피토프의 맵핑 방법
MHC, 펩티드 및 T 세포 수용체 (TCR) 간의 상호작용은 T 세포 인식의 항원 특이성에 대한 구조적인 기초를 제공한다. T 세포 증식 검정은 MHC 에 대한 펩티드의 결합 및 TCR 에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인식을 시험한다. 본 실시예의 시험관내 T 세포 증식 검정은 항원 제공 세포 (APCs) 및 T 세포를 함유하는 말초혈단핵세포 (PBMCs)의 자극을 포함한다. 자극은 합성 펩티드 항원을 사용하여 시험관 내에서 수행하고, 일부 실험에서는 전체 단백질 항원을 사용하였다. 자극된 T 세포 증식은3H-티미딘 (3H-Thy) 을 사용하여 측정하고, 혼입된3H-Thy의 존재는 세척된 고정 세포들의 신틸레이션 계수를 사용하여 평가하였다.
12 시간 이하 동안 보관된 인간 혈액으로부터의 백혈구 연층 (buffy coat)을 국립혈액원 (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK) 으로부터 입수하였다. 피콜-패이크 (Ficoll-paque) 를 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham,UK) 로부터 입수하였다. 일차 인간 림프구 배양용의, L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖ 젠토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 함유하는, 무혈청 AIM V 배지를 Gibco-BRL (Paisley, UK) 로부터 입수하였다. 합성 펩티드를 Eurosequence (Groningen, 네덜란드) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK) 로부터 입수하였다. 백혈구 연층을 온화하게 원심분리하여 적혈구 및 백혈구를 혈장 및 혈소판으로부터 분리하였다. 최상부 층을 (혈장 및 혈소판 함유) 제거하여 폐기하였다. 15 ㎖ 피콜-패이크 (Amersham Parmacia, Amersham UK) 상에 도말하기 전에 적혈구 및 백혈구를 인산 완충 식염수 (PBS) 중에서 1:1 로 희석하였다. 제조자의 권장 조건에 따라 원심분리를 수행하고, 혈청 + PBS/피콜 패이크 계면으로부터 PBMCs 를 수확하였다. PBMCs 를 PBS 와 혼합하고 (1:1), 원심분리에 의해 수합하였다. 상청액을 제거하여 폐기하고, PBMC 펠렛을 50 ㎖ PBS 에 재현탁하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 펠렛화하고, PBS 상청액을 폐기하였다. 50 ㎖ AIM V 배지를 사용하여 세포들을 재현탁하고, 이 시점에서 계수하고 트립판 블루 염료 배제 (exclusion) 를 이용하여 생존성 (viability) 을 평가하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 수합하고, 상청액은 폐기하였다. 세포들을 저온 저장을 위해 3 ×107/㎖ 의 밀도로 재현탁하였다. 저장 배지는 90 % (v/v) 의 가열 비활성화된 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, UK) 및 10 % (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) 이었다. 세포들을 조절된 동결 용기 (Sigma) 로 옮겨, -70 ℃ 에서 하룻밤동안 두었다. 사용시, 세포들을 10 ㎖ 의 예비가온된 AIM V 배지로 옮기기 전에 37 ℃ 수조에서 신속하게 해동시켰다.
PBMC 를 96 웰의 편평 바닥 플레이트 중에서 2 ×105PBMC/웰 의 밀도로 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다.3H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK) 로 펄스하기 (pulsing) 전에, PBMC 를 37 ℃ 에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 본 발명의 연구에서, 브리오딘 1 의 전체 서열에 뻗어있는, 발생된 12 개의 아미노산에 의해 오버랩된 합성 펩티드 (15 량체) 가 생성되었다. 펩티드 확인 번호 (ID#) 및 서열을 도 2 에 제공하였다. 각 펩티드를 21 명의 순수 공여자로부터 분리한 PBMC 에 대해 개별적으로 스크리닝하였다. 면역원성인 것으로 이미나타난 두 개의 대조군 펩티드 및 강한 비-회상 (non-recall) 항원 KLH 를 각 공여자 검정에 사용하였다.
이 연구에 사용된 대조군 항원들은 하기와 같았다:
펩티드 시퀀스
C-32 비오틴-PKYVKQNTLKLAT Flu 헤마글루티닌 307-319
C-49 KVVDQIKKISKPVQH 클라미디아 HSP 60 펩티드
KLH Keyhole Limpet Hemocyanin의 전체 단백질
펩티드를 DMSO 에 10 mM 의 최종 농도로 용해시키고, 이들 스톡 (stock) 용액들을 AIM V 배지 중에서 1/500 으로 희석하였다 (최종 농도 20 μM). 펩티드를 편평 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하여 100 ㎕ 중 2 및 20 μM 의 최종 농도로 만들었다. 트립판 블루 염료 배제로, 해동된 PBMC 의 생존성을 평가하고, 그 후 세포들을 2 ×106세포/㎖ 의 밀도로 재현탁하고, 100 ㎕ (2 ×105PBMC/웰) 을 펩티드가 담긴 각 웰로 옮겼다. 3 벌의 웰 배양물을 각 펩티드 농도에서 검정하였다. 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2의 습한 분위기에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 필터 매트 상에서 수확하기 전에 18~21 시간 동안 1 μCi3H-Thy/웰 로 펄스시켰다. 발락 (Wallac) 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Perkin Elmer) 를 사용하여 CPM 값을 결정하였다. 그 결과를, 시험용 펩티드로 측정된 증식 스코어(예컨대, 방사능 1 분당 계수)를 시험용 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 스코어로 나누어서 유도한 자극 지수로 표현하였다.
본 연구로, 하나 이상의 공여자로부터 유래한 T-세포에서 상당한 증식 반응(즉, SI > 2.0)을 일으킬 수 있는 몇가지 32 펩티드 시퀀스를 발견하였다. 상기펩티드 세트 중에서, 2 이상의 개별 공여자 샘플에서 상당한 증식 반응을 일으키는 추가적인 하위 세트의 펩티드를 확인하였는 바, 그 반응 중 일부의 경우, 반응의 강도가 실제로 SI=2.0 보다 상당히 높았다. T-세포 증식 분석법을 이용한 브리오딘 1 시퀀스에서의 T-세포 에피토프 매핑 결과, 펩티드 ID # 16-18, 30, 38-41, 46-50 및 60-64 를 포함하는 5 개의 주요한 면역원성 부분을 확인하였다. 이들 각각의 펩티드의 경우, 2 이상의 공여자 샘플로 제조한 PBMC가 2.0 을 초과하는 자극 지수를 나타냈다. 도 5의 패널 A-E 는, 선택된 PBMC 공여자 샘플에서의 개별적 펩티드에 대한 SI 반응의 대표 히스토그램을 나타낸다. 패널들은, 각각의 에피토프 부분 R1 - R5 에서의 펩티드에 대한 포지티브 반응의 예를 보여주기 위하여 종합적으로 선택되었다. 모든 PBMC 샘플을 위한 조직 유형을, 시판되는 시약 시스템(Dynal, Wirral, UK)을 이용하여 분석하였다. 공급업자가 추천하는 프로토콜 및 표준 보조 시약 및 아가로스 전기 영동 시스템에 따라서 분석을 수행하였다. 시험한 20 공여자에서 DRB1 대립유전자에 대한 알로타입 범위(allotypic coverage)는 70 %이었다. 21 개의 서로 다른 PBMC 공여자 제조물 중에서 10 개가 에피토프 부분 R1-R5 내에 포함된 펩티드에 대하여 반응성을 보였다. 각각의 반응성 공여자 샘플의 알로타입 특이성을 하기의 표 1에 나타내었다.
반응성 공여자 샘플의 MHC 동종이형
공여자 # MHC 동종이형
4 DRB1*03, DRB1*04, DRB3, DRB4*01
5 DRB1*07, DRB1*09, DRB4*01
6 DRB1*13, DRB1*15, DRB3, DRB5
9 DRB1*04, DRB1*12, DRB3, DRB4*01
12 DRB1*07, DRB1*13, DRB3, DRB4*01
14 DRB1*04, DRB4*01
15 DRB1*03, DRB1*14, DRB3
17 DRB1*12, DRB1*15, DRB3, DRB5
19 DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4*01
21 DRB1*08, DRB1*14, DRB3
실시예 3
향상된 면역성 프로파일을 갖는 개질 서열의 고안:
실시예 1 의 방법을 에피토프 영역 R1, R2, R3, R4 및 R5 의 분석에 사용하였다. 이 시스템은 생물학적으로 검출된 에피토프 영역 내에 포함된 특정 MHC 리간드의 예측이 가능하며 특정 MHC 동종이형과 상호작용하는 주어진 MHC 클래스 II 리간드의 능력에 대한 "스코어"를 제공한다. MHC 리간드에 대한 동종이형 제한 패턴은 도 6-10에 수반된 각 에피토프 영역 R1-R5 을 위해 제공된 것과 같은 동종이형 제한 차트 디스플레이를 이용하여 설명될 수 있다.
분석은 각 에피토프 R1-R5 내에 서열 변경의 고려로 확장되었다. 서열 변이체들을 MHC 클래스 II 결합 유지 능력 및 이들이 잔존하는 결합 스코어에 대해 시험하였다. 다중 아미노산 치환은 시험된 다수의 MHC 동종이형과 결합하는 MHC 클래스 II의 제거를 달성함으로써 정의된다. 확인된 특정 치환을 브리오딘 분자의 구조 모델 내에서 수용될 수 있는 능력에 대해 추가로 시험하였다. 야생형 서열의 선택된 잔기들 상에서 고안된 돌연변이들을 입체적 불일치(steric clash), 수소 결합 형성, 소수성 결합 및 이의 구조 내에서의 일반적인 수용성에대해 체크하였다. 입체적 불일치를 야기하는 치환들은 제외되었다. 측쇄가 본래 잔기에 대해 유사 구성(로타머)을 채택하는 경우에 수용되는 치환이 적합한 것으로 고려된다. 하나 이상의 치환이 이러한 기준에 합치되면, 이웃 측쇄 또는 골격 원자와 잠재적으로 수소 결합을 형성하거나, 및/또는 선호되는 소수성 접촉 또는 다른 결합을 형성하는 잔기들이 바람직하다. 상기 절차는 Swiss Prot Deep View v3.7 [Guex, N. and Peitsch, M. C. (1997) Electrophoresis 18: 2714-2723]를 이용하여 상호적으로 수행하였다. 이 방법은 각 에피토프 영역 R1-R5 에 대한 바람직한 치환 세트를 초래하였다. 상기 치환 세트는 편집되어 식 1 에 설명된 구조를 형성하였다. 모든 치환은 각 에피토프 영역 R1-R5 내에 MHC 클래스 II 리간드의 제거를 초래하는 것으로 확인되었다. 가장 바람직한 치환 이외에 대안적 아미노산 잔기로 특징되는 치환이 식 1 에 주어진다.
에피토프 영역 R3 에 대하여 대안적 치환 세트가 야생형 구조 내에서 루이신 115를 잔존케 하는 선택을 가능하게끔 고안되었다. 이 잔기는 브리오딘 1 효소에 대해 구조적으로 중요하다고 여겨지는 기질 결합 클레프트의 일부를 형성한다. L 115 에 관계된 바람직한 치환 세트는 변경 L115A, I122A, I125A, L130A, L133F 및 I137A 를 포함한다. L115A 를 유지하는 대안적인 치환 세트는 A118T, G120H, K121S 및 R123T 를 포함한다. 이중적 변경 L115A 및 I122A 이 대안으로 성립될 수 있다.

Claims (16)

  1. 브리오딘 1 의 생물학적 활성을 갖고 생체 내에서 사용될 때 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성인 또는 실질적으로 비면역원성인 개질 분자.
    (여기서, 면역원성의 상기 소실이 본래의 비개질 분자로부터 유도되는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거에 의해 달성되고, 상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상에 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드이다)
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프의 제거가 1 내지 9 개의 아미노산 잔기를 변경하여 달성되는 브리오딘 1 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 도 1 에 도시된 바와 같은 군으로부터 선택되는 펩티드 서열인 브리오딘 1 분자.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 야생형 브리오딘 1 서열의 잔기 46-66; 88-102; 112-135; 136-162; 및 178-204 를 포함하는 R1-R5 로 지칭되는 인접 아미노산 잔기의 스트링 내에 위치하는 브리오딘 1 분자.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 스트링이 하기 서열을 갖는 브리오딘 1 분자:
  6. 제 5 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 임의의 스트링 R1-R5로부터 9 개이상의 연속 잔기의 서브-스트링 내에서 달성되는 브리오딘 1 분자.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 펩티드 서열 스트링 R1-R5 과 80% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 브리오딘 1 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, 임의의 펩티드 서열 스트링 R1-R5 과 90% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 브리오딘 1 분자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 브리오딘 1 분자:
    (서열 중, X1은 A, G 또는 P; X2는 M, A, G, P 또는 I; X3는 A, G 또는 P; X4는 P 또는 Y; X5는 T 또는 S; X6는 P; X7는 A, P 또는 G; X8는 A, P 또는 G; X9는 A, P, G, H, D, E, N, Q, K, R, S 또는 T; X10은 A, P 또는 G; X11은 A, P 또는 G; X12은 A, P, S, T, H 또는 K; X13은 T; X14는 H; X15은 S; X16은 A, S, T, P, N, D, E, G, H, K 또는 Q; X17은 T; X18은 A 또는 P; X19은 A, I, F, G, M, P, V, W 또는 Y; X20은 F, P 또는 W; X21은 A, P 또는 G; X22은 G, A 또는 P; X23은 G, A 또는 P; X24은 A, P 또는 G; X25은 A, P, G, S 또는 T; X26은 A, I, M, S, T, P 또는 G; X27은 A, G 또는 P; X28은 S, A, G, P, T, H, D, N, Q, K 또는 R; X29은 T, A, G, S, P, H, K, R, D, E, N 또는 Q; X30은 A, G, S, T, P, K, R, H, D, E, N 또는 Q; X31은 Q; X32은 H, D, E, F, L, N, P, S, W 또는 Y; X33은 T, A, G, P, D, E, H, K, R, N, Q, S 또는 T; X34은 D 이며,
    여기서, 동시에 X1= T, X2= L, X3= H, X4= N, X5= Y, X6= I, X7= V, X8= V, X9= F, X10= V, X11= V, X12= L, X13= A, X14= G, X15= K, X16= I, X17= R, X18= I, X19= L, X20= L, X21= I, X22= L, X23= Y, X24= Y, X25= L, X26= L, X27= V, X28= L, X29= I, X30= L, X31= L, X32= K, X33= I 및 X34= I 인 것은 제외된다)
  10. 제 9 항에 있어서, X1= A, X2= M, X3= A, X4= P, X5= T, X6= P, X7= A, X8= A, X9= A, X10= A, X11= A, X12= A, X13= T, X14= H, X15= S, X16= A, X17= T, X18= A, X19= A, X20= F, X21= A, X22= G, X23= G, X24= A, X25= A, X26= A, X27= A, X28= S, X29= T, X30= A, X31= Q, X32= H, X33= T 및 X34= D 인 브리오딘 1 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는, 인간 T 세포의 유도된 세포 증식의 생물학적 분석에서 전체 단백질로서 시험될 때 모 비개질 분자보다 작은 자극지수(SI)를 나타내며 이는 2보다 작고, 상기 지수는 단백질에 뒤따르는 자극으로 스코어화된 세포 증식의 수치로서 취해 이를 단백질을 첨가하지 않은 대조군 세포에서 스코어화된 세포 증식 수치로 나누어서 계산되는, 동일한 공여자로부터의 세포를 이용하여 시험하며, 세포 증식이 임의의 적절한 수단으로 측정되는 개질 브리오딘 1 분자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 따른 개질 브리오딘 1 분자가 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학적 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 특정된 것과 같은 임의의 개질 브리오딘 1 분자의 코딩을 위한 DNA 분자.
  14. 야생형 브리오딘 1 의 일부이며 MHC 클래스 II 리간드 또는 클래스 II 상의 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 보여주는 펩티드 서열인 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드.
    (펩티드는 하기 군으로부터 선택된다);
  15. 제 14 항에 있어서, 인간 T 세포 증식의 생물학적 분석에서 1.8 초과의 자극지수(SI)를 갖는 펩티드.
    (여기서, 상기 지수는 펩티드에 뒤따르는 자극으로 스코어화된 세포 증식의 수치로서 취해 이를 펩티드를 첨가하지 않은 대조군 세포에서 스코어화된 세포 증식 수치로 나누어서 계산되며, 여기서의 세포 증식은 임의의 적절한 수단으로 측정된다)
  16. 도 1 에 나타난 펩티드 서열 또는 브리오딘 1 분자 또는 생체 내에서 사용될 때 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 이의 변이체의 제조를 위한 제 14 항 또는 제 15 항의 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기의 펩티드 서열의 용도.
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