KR20030081479A - 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 알파 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 치료 용도로, 특히 인간에게 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 개질 폴리펩티드이며, 상기 개질에 의해 인간 대상에 투여시 상기 폴리펩티드가 면역 반응을 발현하는 성향이 감소된다. 본 발명은 구체적으로 인간 인터페론 알파 및 특이적으로 인터페론 알파 2 (INFα2)의 개질에 관한 것으로, 이로써 생체내에 사용된 경우 임의의 비개질된 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 단백질을 생성한다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 알파{MODIFIED INTERFERON ALPHA WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}

치료적 단백질의 효능은 치료적 단백질에 대한 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 상태에 있어서 치료법으로 유망하게 나타났지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 반응의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985)J. Immunol.135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 반응을 감소시키기 위한 시도로여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 인해 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되었지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가되었다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999)Transplantation 68: 1417-1420].

항체가, 면역 반응을 일으킬 수 있는 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 그 중에서도 과립구-대식세포 집락 자극인자 [Wadhwa, M. 등, (1999)Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 INFα2 [Russo, D. 등, (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등, (1988)New Engl. J. Med.318: 1409-1413] 의 치료적 사용이 포함된다.

면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상에서의 제공을 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드, 소위 "T 세포 에피토프" 의 단백질 내 존재이다. 상기 잠재적인 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 상기 T 세포 에피토프는 MHC 결합의 구축으로 측정될 수 있다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로 TCR 의 관여에 의해 상기 T 세포의 활성화를 유도하여 T 세포반응을 자극할 수 있는 에피토프를 의미한다. 그러나, 보통은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 발견된 특정 펩티드들은, 상기 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자가" 로 인식되기 때문에 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.

특정한 상기 T 세포 에피토프 펩티드는 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주 조직적합 복합체 (major histocompatability complex, MHC) 의 분자에 의해 제공되어 T 세포의 활성화를 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제시되는 펩티드에 있어서, T 세포의 상기 활성화는 이어서, 예를 들어 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 반응을 일으켜서 상기 항체를 생산시킬 수 있다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선택 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원기 DR (HLA-DR) 가 상기 단백질군의 주요 이종형(isotype) 이며, 본 발명에서 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 상기물에도 대등하게 적용가능하다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 통해 이들의 C 말단에서 삽입되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이합체 (hetero-dimer) 는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 개 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 개 아미노산으로 구성된다. 최근에 DQ 분자는 상동 구조를 갖는것으로 나타났고, DP 군의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이종형에 대해서는 대략 70 개의 상이한 동종이형 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 동종이형이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 동종이형이 공지되어 있다. 각 개인은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등,Nature(1993)364: 33; Stern 등, (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대 유연성을 보장한다. 상이한 지리학적 집단 및 인종군 내 별개의 "군"에 따라 리간드 결합 도메인 내에 상당량의 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "군"은 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 중복이 있을 수 있다. 상기 특이성이 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B-세포 에피토프에 대한 항체 반응을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T 세포 반응)을 결정한다. 따라서, 개인에서의 단백질에 대한 면역 반응은, 개인의 HLA-DR 동종이형의 펩티드 결합 특이성의 작용인 T 세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로, 전체 집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T 세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 동종이형 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 퍼센트의 전체 집단을 커버하는 것이 바람직하다.

본 발명의 목적 단백질과 같은 치료적 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제공 경로를 통해 진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와의 연합된 제공을 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제공 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께, T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 추가 활성화시키는 시토카인을 방출시켜, 항체를 생산시키거나 완전 세포성 면역 반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다. APC 표면 상의 제공을 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 여러 요인, 가장 중요하게는 그 일차 서열에 의존한다. 이는, 그 단백분해 절단에 대한 경향 및 MHC 클래스 II 분자 상의 펩티드 결합 틈 (cleft) 내에서의 결합에 대한 그 친화도 둘 다에 영향을 미칠 것이다. APC 표면 상의 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 노출된 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공되는 결정기를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR) 에 결합면을 제시한다.

당 분야에는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는절차가 있다 (예, W098/52976 및 WO00/34317). 상기 펩티드는 모든 상황에서, 특히 생체 내에서, 처리 경로 또는 기타 현상으로 인해 T 세포 에피토프로 작용하지 못할 수 있다. T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이다. 단백질로부터의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 및 제거에 대해서는 이미 개시되어 있다. 당 분야에서, 컴퓨터 수단에 의해 T 세포 에피토프의 검출을 가능하게 하기 위해 통상 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프에서 인식된 서열 모티브를 스캐닝 (scanning)하거나, 이와는 달리 MHC 클래스 II-결합 펩티드 및 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 컴퓨터 기술을 사용하는 방법들이 제공되었다.

W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 세트에 결합할 수 있는 가능성을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 컴퓨터 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측된 T 세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래 둘 다의 치료적 항체 또는 비항체 단백질의 일차 서열 내에서의 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.

인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T 세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 분야에서 사용되어 왔으며 [Kern, F. 등, (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588], 또한 에피토프 동정 전략에도 사용될 수 있다.

상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 원칙적으로 치료적으로 유용하지만 원래는 면역원성인 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T 세포에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다.

상기 치료적으로 유용한 분자의 하나는 INFα2 이다. 이 분자는 활성화된 대식세포에 의해 발현되는 중요한 당단백질 시토카인이다. 상기 단백질은 항바이러스 활성을 가지며, 발현 세포 중의 인터페론 알파 수용체에 결합시 2 개 이상의 효소, 즉 단백질 키나아제 및 올리고아데닐레이트 합성효소의 생산을 자극한다. 성숙한 INFα2 단백질은 아미노 말단으로부터 23 아미노산 단일 서열의 분할에 의해, 188 아미노산 전구체 단백질의 번역후 가공에 의해 생성되는 165 개 아미노산의 단일 폴리펩티드이다. 일차 아미노산 서열과 적은 차이를 나타내는 인간 INFα2 의 몇가지 상이한 서브타입이 알려져 있다. 즉, INFα2a 및 INFα2b 는 성숙 단백질 사슬의 23 위치에서의 하나의 잔기만이 상이하며, INFα2a 에서는 리신이고, INFα2b 에서는 아르기닌이다. 본 발명의 개시는 INFα2b 의 서열에 관한 것이지만, 모든 실질적인 목적에서, INFα2a 의 서열도 본 발명의 대상인 INFα2b 서브타입과 상호 교체될 수 있는 것으로 고려될 수 있음을 알 수 있다. INFα2(a, b) (일문자 표기로 나타냄)의 아미노산 서열은 하기와 같다:

상기 단백질은 광범위의 항바이러스성, 항증식성 및 면역조절제로로서 임상적으로 상당히 중요하다. INFα2의 재조합 및 기타 제조형태는 인간에서 각종 암 및 바이러스성 적응증에서 치료적으로 사용되어 왔다 [Sen, G.G. 및 Lengyel P,(1992),J. Biol. Chem. 267: 5017-5020]. 그러나, 다수의 환자에게서 매우 현저한 치료적 이익에도 불구하고, 일부 환자들에서의 치료에 대한 내성이 기록되어왔으며, 내성의 한 중요한 기작은 처리된 환자의 혈청에서 탐지가능한 중성화 항체의 발생인 것으로 나타났다 [Quesada, J.R. 등 (1985),J.Clin. Oncology 3: 1522~1528; Stein R.G. 등 (1988) ibid; Russo, D. 등 (1996) ibid; Brooks M.G. 등(1989)Gut 30: 1116~1122]. 적어도 동일한 일차 구조의 분자가 인간에서 내생적으로 생산됨에도 불구하고, 이러한 환자들에서 치료 인터페론에 대해 면역 반응이 일어난다.

개질 INFα2a 및 사용 방법 [US, 4,496,537; US, 5,972,331; US, 5,480,640; US, 5,190,751; US, 4,959,210]이 제공되었으나, 이러한 시도들은 INFα2a 의 상업적 생산에서의 개선에 관한 것이었다. 이들중 어느 것도 단백질의 면역원성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하였고, 본 발명의 방법에 따른 특이적이고 조절되는 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 미칠 것을 생각하지 못하였다.

그러나, 증강된 특성을 갖는 INFα2a 유사체에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 목적하는 증강에는 상기 치료물의 발현 및 정제에 대한 대안적인 방법 및 양식 뿐만 아니라, 특히 단백질의 생물학적 특성의 개선이 포함된다. 특히 인간 대상체에 투여될 경우 생체 내 특성의 증강에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 반응을 유도할 잠재성이 감소되거나 없는 INFα2a 를 제공하는 것이 크게 요구된다.

본 발명은 특히 인간에게, 특히 치료적 용도를 위해 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 개질 폴리펩티드인데, 여기서 개질은 인간 대상체에 투여시 면역 반응을 일으키는 폴리펩티드의 성향을 감소시킨다. 본 발명은 특히, 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 INFα2 단백질 변이체를 만드는 인간 인터페론, 구체적으로 인간 인터페론 α2 (INFα2)의 개질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감소된 면역원성을 갖는 개질 INFα2 변이체를 생성시킬 수 있는 방법에 의해 상기 비개질 단백질에서 유도된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

본 발명을 이제 하기 실시예들에 의해 설명할 것이나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 실시예들은 하기 도면을 참조한다. 아미노산 잔기들은 일문자 표기로서 나타내었다.

도 1은 잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 INFα2a 중의 펩티드 서열을 제공한다.

도 2 는 인간 INFα2a 의 T 세포 에피토프의 제거를 일으키는 치환을 제공한다 (WT = 야생형 잔기).

도 3 은 하나 이상의 MHC 동종이형에 대한 잠재적인 T 세포 에피토프의 제거를 일으키는 추가의 치환을 제공한다.

도 4 는 인간 INFα2a 에서 바람직한 치환을 제공한다 (WT= 야생형 잔기, MUT = 바람직한 잔기).

도 5 는 실시예 2 의 시험관내 MHC 클래스 II 결합 분석을 사용하여 분석된 INFα2 13량체 합성 펩티드 서열의 표를 제공한다.

도 6 은 MHC 동종이형에 대한 시험관내 MHC 펩티드 결합 분석의 결과를 나타낸다. a)는 시험된 각 MHC 동종이형에 대한 고친화성 결합 (경쟁자 참조 펩티드에 의해 0 % 저해)을 갖는 펩티드들을 나타내고; b)는 시험된 각 MHC 동종이형에 대한 중간 친화성 결합(경쟁자에 의해 0~50 % 저해)을 갖는 펩티드들을 나타내고; c)는 시험된 각 MHC 동종이형에 대한 저 친화성 결합 (경쟁자에 의해 50~100 % 저해)을 갖는 펩티드들을 나타내고; 및 d) 는 시험된 각 MHC 동종이형에 대한 결합이탐지되지 않는 펩티드들을 나타낸다.

도 7 은 실시예 3 의 시험관내 순수한 (naive) 인간 T 세포 분석을 사용하여 분석된 INFα2 15량체 펩티드 서열의 표를 제공한다. 펩티드 ID# 및 INFα2 서열 내의 N-말단 펩티드 잔기의 위치를 나타내었다.

도 8 은 INFα 펩티드를 이용한 자극에 반응하는 6 명의 개인으로부터의 누적 자극 지수를 나타낸다. 스크리닝된 20 명으로부터의 6 명의 공여자가 INFα 서열로부터의 51 개 중 하나 이상의 15량체 펩티드를 사용한 자극에 대해 반응하였다. 개별적인 펩티드들에 대한 반응을 가장 면역원성 펩티드인 #38 및 #39 (화살표)를 함유하는 3 개의 영역을 사용하여 3 개의 구분되는 영역으로 그룹화하였다. 대조군 펩티드 C32 (DRB1-제한됨) 및 C49 (DP-제한됨)는 비교를 위해 포함시켰다. 각 막대 내의 가로선은 개별적인 공여자들로부터의 기여를 나타낸다.

도 9 는 INFα 내의 면역원성 영역을 나타내고, 순수한 인간 T 세포를 자극할 수 있는 이들 영역들로부터의 펩티드 서열을 상세히 설명한다.

도 10 은 순수한 인간 T 세포의 시험관내 증식을 촉진할 수 있는 INFα 펩티드를 나타내는 표를 제공한다. 공여자 중 5 명이, 주요 에피토프 영역인 R1, R2 및 R3 으로부터의 다중 중복 펩티드들에 대한 반응을 나타내었다. 공여자 중 3 명이, R1, R2 또는 R3 으로부터의 개별적인 합성 펩티드들에 대한 반응을 나타내었다.

도 11 은 INFα 펩티드에 대해 반응 또는 반응하지 않는 공여자들에서 MHC 클래스 II 대립유전자의 빈도를 나타내는 표를 제공한다. a = 분자는 DR 대립유전자를 갖는 공여자의 수이며, 분모는 상기 펩티드에 대해 시험관내 T 세포 증식을 나타낸 공여자의 수이다 (반응하는 공여자의 총 수는 6 이다). b = 공여자 집단에서 대립유전자의 빈도. 2 이하의 반응에 대한 펩티드를 기록하고, 평가하지 않았다. DRB1*14 에 대해서는 모든 반응 공여자들이 음성으로 시험되었다. DRB1*14 동종이형은 시험된 20 명의 공여자들 중 1.5 % 의 빈도를 가졌다. 소정의 펩티드의 알로제한 (allorestriction)은 공여자 집단에서의 대립 유전자의 빈도 및 동일한 대립유전자를 발현하는 반응 공여자의 수에 의해 결정된다. 펩티드가 임의의 특정 대립유전자 (알로제한됨)와 결합하면, 나타낸 백분율은 집단 중에서 대립유전자에 대한 빈도보다 더 클 것으로 예측될 것이다.

도 12 는 15 량체 합성 펩티드에 대한 특정 MHC 클래스 II 동종이형에 대한 경쟁 결합 분석에서 IC₅₀값의 표를 제공한다.

(a) DRB1^*0101 에 대한 시험관내 순수 인간 T 세포의 증식을 촉진할 수 있는 INFα 펩티드의 상대적 결합 친화도를 결정하기 위한 경쟁 MHC 클래스 II 펩티드 결합 분석. INFα 펩티드들을 10 μM 비오티닐화 인플루엔자 헤마글루티닌 307~319의 존재 하에서 고정된 HOM-2 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 최대 비오티닐화 펩티드 결합의 50 % 저해를 일으키는 경쟁자 펩티드의 농도를 IC₅₀으로서 취하였다. 인플루엔자 103~115 는 고친화성 대조구로서 포함시켰다. IC₅₀≤20 μM = 고친화성, IC₅₀= 20~100 μM = 중간 친화성, IC₅₀≥100 μM = 저친화성.

(b) DRB1^*0701 에 대한 시험관내 순수 인간 T 세포의 증식을 촉진할 수 있는 INFα 펩티드의 상대적 결합 친화도를 결정하기 위한 경쟁 MHC 클래스 II 펩티드 결합 분석. INFα 펩티드들을 10 μM 비오티닐화 파상풍 독소 828~840 의 존재 하에서 고정된 MOU (MANN) 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 최대 비오티닐화 펩티드 결합의 50 % 저해를 일으키는 경쟁자 펩티드의 농도를 IC₅₀으로서 취하였다. 파상풍 독소 828~840 은 고친화성 대조구로서 포함시켰다. IC₅₀≤20 μM = 고친화성, IC₅₀= 20~100 μM = 중간 친화성, IC₅₀≥100 μM = 저친화성.

(c) DRB1^*0401 에 대한 시험관내 순수 인간 T 세포의 증식을 촉진할 수 있는 INFα 펩티드의 상대적 결합 친화도를 결정하기 위한 경쟁 MHC 클래스 II 펩티드 결합 분석. INFα 펩티드들을 50 μM 비오티닐화 인플루엔자 헤마글루티닌 307~319 의 존재 하에서 고정된 WT-51 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 최대 비오티닐화 펩티드 결합의 50 % 저해를 일으키는 경쟁자 펩티드의 농도를 IC₅₀으로서 취하였다. 인플루엔자 103~115 는 고친화성 대조구로서 포함시켰다. IC₅₀≤20 μM = 고친화성, IC₅₀= 20~100 μM = 중간 친화성, IC₅₀≥100 μM = 저친화성.

도 13 은 실시예 7 의 항증식 분석에서 보유된 활성을 갖는 분자들을 제공하는 INFα 내의 치환들을 상세히 나타내는 표를 제공한다.

WT = 야생형 잔기; # = 잔기 번호; Mut = 수행된 돌연변이. 에피토프 영역은 면역원성 에피토프 영역 R1, R2 또는 R3 에 대한 치환의 위치를 나타낸다.

도 14 는 선택된 돌연변이 INFα2 분자의 항증식 효과의 대표적인 데이타를 제공한다. 분석은 실시예 7 의 방법에 따라 수행하였다.

패널 a) 는 면역원성 에피토프 R1 내에서 치환을 가진 분자의 활성을 나타낸다.

패널 b) 는 면역원성 에피토프 R2 내에서 치환을 가진 분자의 활성을 나타낸다.

패널 c) 는 면역원성 에피토프 R3 내에서 치환을 가진 분자의 활성을 나타낸다.

도 15 는 INFα합성 펩티드에 대한 개별적인 공여자 반응들을 나타내는 패널을 제공한다. 대조구 펩티드 C32 (DRB1-제한됨) 및 C49 (DP-제한됨)로부터의 데이타는 비교를 위해 포함시켰다. 면역원성 영역 R1, R2, R3 를 관련 패널상에 나타내었다. 양성 자극에 대한 역치 = 2.

하기 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이나, 이를 한정 또는 제한으로서 해석하여서는 안될 것이다.

발명의 개요 및 설명

본 발명은 인간 인터페론 α, 특히 인터페론 α2 형의 개질 형태를 제공하며, 여기에서 "INFα2" 으로 명명하고, 여기에서 면역 특성은 잠재적인 T 세포 에피토프들의 수의 감소 또는 제거에 의해 개질된다.

본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재능에 의해 잠재적인 T 세포 에피토프인 INFα2 일차 서열 내에서 동정된다. 본 개시는 특히 165 아미노산 잔기들인 인간 INFα2 단백질을 포함한다. 본 발명은 원칙적으로 생물학적 활성에는 영향을 미치지 않으면서, 본 발명에 따른 분자의 일차 서열 내에서 특정 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 변경되는 특정 위치들을 개시한다. 면역원성의 손실이 생물학적 활성의 동시 손실에 의해서만 달성될 수 있는 경우, 단백질의 아미노산 서열 내의 추가 변경에 의해 상기 활성을 회복하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 상기 개질 분자의 제조방법을 개시하며, 무엇보다도 면역원적 부위를 감소시키거나 또는 제거하기 위한 변경에 요구되는 상기 T 세포 에피토프를 동정하는 방법을 개시한다.

본 발명에 따른 단백질은 인간 대상 내에서 증가된 순환 시간을 나타낼 것으로 예측되며, INFα2 에 대한 다수의 적응증에 대한 경우에서와 같이 만성 또는 재발성 질병 사태에서 특히 유리할 것이다. 본 발명은 생체 내에서 향상된 성질을 나타내는 것으로 예측되는 INFα2 단백질의 개질된 형태를 제공한다. 이들 개질 INFα 분자들은 약학 조성물에 사용될 수 있다.

요약하면, 본 발명은 하기 문제에 관한 것이다:

ㆍ생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자;

ㆍ상기 면역원성의 손실이 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프, 바람직하게는 하나의 T 세포 에피토프의 제거 및/또는 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의해 달성되는 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가, MHC 클래스 II 상의 제공을 통하여 T 세포를 자극하거나 또는 이에 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ상기 리간드 또는 펩티드 서열이 13량체 또는 15량체 펩티드인 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ상기 펩티드 서열이 도 1 에 나타낸 것과 같은 군으로부터 선택된 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1~9 개 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변경된 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)을 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)로의 치환, 부가 또는 결실, 바람직하게는 치환인 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 도 2 에 나타낸 것과 같이 실시되며, 추가로 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이, 개질 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키기 위하여 도 3 에 나타낸 것과 같이 실시되는 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위하여 치환, 부가 또는 결실과 같은 변경이 추가로 더 수행된 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ아미노산 변경이 상동성 단백질 서열 및 컴퓨터 이용 (in silico) 모델링 기술을 참조하여 이루어진 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ(i) MHC 클래스 II 상에서의 제공을 통해 T 세포를 자극 또는 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도된 펩티드를 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의한, 일차 서열 중의 하나 이상의 아미노산들의 변경에 의해 수득가능한, 생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자로, 여기에서 상기 개질 분자가 INFα2 야생형으로부터 유도된 상기 일차 서열의 연속된 아미노산 잔기들의 하기 스트링 (strings) 내의 하나 이상의 위치에서 이루어진 변경을 포함하는 개질 분자:

(a) ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH (R1),

(b) FNLFSTKDSSAAWDE (R2),

(c) KEDSILAVRKYFQRITLY (R3);

ㆍ상기 변경이 1~9 개 아미노산 잔기의 치환인 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ상기 치환이 스트링 R1, R2 및 R3, 바람직하게는 R2 및 R3, 보다 바람직하게는 R3 으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 수행된 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ서열 스트링 R1, R2 또는 R3 외의 아미노산 잔기들의 하나 이상의 치환이 추가로 수행된 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ야생형 분자 중 하기의 하나 이상의 위치:

24, 26, 27, 38, 55, 63, 64, 66, 67, 76, 84, 85, 89, 103, 110, 111, 116, 117, 119, 122, 123, 126, 128, 129, 130, 153, 바람직하게는 하기의 하나 이상의 위치: 26, 27, 38, 63, 85, 89, 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153, 보다 바람직하게는 하기의 하나 이상의 위치: 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153 에서 이루어진 아미노산 잔기 치환을 함유하는 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ바람직한 구현예에서, 상기 치환이 26, 27, 38 로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어지고, 추가적으로 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153 으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어지거나, 또 다르게는, 63, 85, 89 및 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153 으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어진 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ치환이 도 4 에 특정된 것과 같은 하나 이상의 위치에서 이루어진 상기에따른 개질 분자;

ㆍ치환이 L26P, F27S, F38E 및/또는 I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N 및/또는 V103E, L110G, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A, Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A, L153S 위치 에서 이루어진 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ치환이 L26P, F27S, F38E 및/또는 I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N 및/또는 V103E, L110G, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A 에서 이루어진 바람직한 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ(i) MHC 클래스 II 상에서의 제공을 통해 T 세포를 자극 또는 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도된 펩티드를 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의한, 일차 서열 중의 하나 이상의 아미노산들의 치환에 의해 수득가능한, 생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자로, 여기에서 상기 치환이 하기로부터 선택된 하나 이상의 그룹에 대응하는 야생형 INFα2a 또는 INFα2b 분자 중 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자:

(i) I24P, L26P, F27S, F38E, V55A,

(ii) I63T, L66A, F67D, F67E, W76H, F84D, F84E, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N,

(iii) R3 서열 내의 임의의 위치;

ㆍ하기 치환: V103E, L110G, L110S, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q,L117G, L117A, V119A, Y122Q, Y122E, Y122H, F123H, I126A, L128A, Y129N, L130G, L130, L153S, 바람직하게는 하기 치환: Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A 중 하나 이상이 R3 서열 내에서 이루어지고, 임의로 바람직하게는 치환인, 면역원성을 더 감소시키는 추가의 아미노산 잔기의 변경을 함유하는 상기에 따른 개질 분자;

ㆍ하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

[상기에서, X⁰은 R, K 이고;

X¹은 Y, E, Q 이고;

X²는 F, H 이고;

X³은 I, A 이고; 및

X⁴는 L, A 이고;

동시에 X¹= Y, X²= F, X³= I 및, X⁴= L 은 제외된다 (이 서열은 야생형 INFα2 에 대응한다];

ㆍ하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파2 (INFα2):

[상기에서, X⁰은 R, K 이고;

X¹은 L, S, G 이고;

X²는 M, T, S, E 이고;

X³은 I, S, Q 이고;

X⁴는 L, G 이고;

X⁵는 Y, E, Q 이고;

X⁶는 F, H 이고;

X⁷는 I, A 이고;

X⁸는 L, A 이고; 및

X⁹는 L, S 이고;

동시에 X¹= L, X²= M, X³= I, X⁴= L, X⁵= Y, X⁶= F, X⁷= I, X⁸= L 및 X⁹= L 은 제외된다];

ㆍ하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

[상기에서, X⁰은 R, K 이고;

X¹은 I, T 이고;

X²는 F, D, A 이고;

X³은 L, A 이고;

X⁴는 F, D, E 이고;

X⁵는 W, H 이고;

X⁶는 F, D, E 이고;

X⁷는 Y, S 이고; 및

X⁸는 Y, D, E, N 이고;

동시에 X¹= I, X²= F, X³= L, X⁴= F, X⁵= W, X⁶= F, X⁷= Y 및 X⁸= Y 는 제외된다];

ㆍ하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파2 (INFα2):

[상기에서, X⁰은 R, K 이고;

X¹은 I, T 이고;

X²는 Y, S 이고; 및

X³은 Y, D, E, N 이고;

동시에 X¹= I, X²= Y, 및 X³= Y 은 제외된다];

ㆍ하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

[상기에서, X⁰은 R, K 이고;

X¹은 L, P 이고;

X²는 F, S 이고;

X³은 F, E 이고; 및

X⁴는 V, A 이고;

동시에 X¹= L, X²= F, X³= F 및 X⁴= V 는 제외된다]; 상기 식에 특정된 모든 제외는 선행 기술에서 알려진 INFα2의 비-탈면역화된 모든 형태를 의미하고, 그들을 포함할 것임을 나타낸다;

ㆍ특히 청구항에 나타낸 것과 같은 조합에 의해 추가의 치환이 이루어진 상기에 따른 개질 INFα2 서열;

ㆍ추가의 치환이 바람직하게는, R1 및/또는 R2 및/또는 R3 부분 서열 내에서 하나 이상의 위치에서 이루어지는, 상기에 따른 개질 INFα2 서열 (여기에서 R1, R2 및 R3 는 상기 나타낸 것과 같이 정의된다);

ㆍ상기 및 하기 기재된 것과 같은 개질 INFα2를 코딩하는 DAN 서열;

ㆍ상기 정의된 것과 같은 INFα2 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물;

ㆍ하기 단계를 포함하는, 상기 및 하기에 정의된 것과 같은 INFα2 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조방법:

(i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

(ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여, 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계;

(iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합 또는 펩티드-MHC 복합체의 T 세포에 대한 결합에 의해 결정되는 것과 같은 T 세포 에피토프의 활성을 제거 또는 실질적으로 감소시키는 방식으로 상기 동정된 잠재적인 T 세포 에피토프들 내의 하나 이상의 아미노산을 사용하여 신규 서열 변이체를 고안하는 단계;

(iv) 재조합 DNA 기술로 상기 서열 변이체를 구축하고, 바람직한 성질을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위하여 상기 변이체들을 시험하는 단계; 및

(v) 임의로 하기 단계 (ii)~(iv)를 반복하는 단계;

ㆍ단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1~9 개의 아미노산 잔기들의 치환, 부가 또는 결실에 의해, 또는 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 실시되는 상기에 따른 방법;

ㆍ단계 (ii) 가 하기 단계에 의해 실시되는 상기에 따른 방법: (a) 기지의 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역을 선택하는 단계; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 예비결정된 균일한 크기의 중복 (overlapping) 아미노산 잔기 절편을 순차적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 지정된 값들을 합산함으로써 상기 각 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산하는 단계; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 근거하여, 펩티드의 치료적 이용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변화시키는 개질에 적합한 상기 절편들 중 1 개 이상을 동정하는 단계;

ㆍ단계 (c)가 하기에 의해, 12~6 의 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 구조 에너지 항목을 포함하도록 변경된 봄 (Boehm) 점수계산 함수를 사용함으로써 실시되는 상기에 따른 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공하고; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공하고; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델을 선택하고; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하고; (5) 샘플링된 각 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄들을 동정하고; (6) 샘플링된 각 절편에 존재하는 모든 측쇄들에 대한 결합 친화도 값을 결정하고; 상기 각 모델 및 상기 각 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복;

ㆍ도 1, 도 6a, 도 6b, 도 6c 에 기술된 것과 같은 군으로부터 선택된, 비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13 개의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 T 세포 에피토프인 펩티드 분자;

ㆍR1, R2, R3 부분 서열들 중 임의의 그룹으로부터 선택된, 또는 도 7 로부터 선택된 비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 15 개, 바람직하게는 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 분자;

ㆍ비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 9 내지 15 개의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 분자로, 상기 분자는 세포 증식의 생물학적 분석에서 1.8 이상, 바람직하게는 1.8~2, 보다 바람직하게는 >2 의 자극 지수를 가지며, 상기 지수는 펩티드에 의한 자극 후점수화된 세포 증식의 값으로서 채택되고, 수용 펩티드 중에 존재하지 않는 대조 세포에서 점수화된 세포 증식의 값에 의해 나누어지고, 여기에서 세포 증식은 실시예에서 보다 상세히 기재된 것과 같은 표준 방법에 의해 임의의 적합한 수단에 의해 측정되는 것인 펩티드 분자;

ㆍ도 6 또는 도 7 에 나타낸 것과 같은 임의의 서열로 이루어지는 상기와 같은 자극 지수를 갖는 상기에 따른 펩티드 분자;

ㆍ상기에서 정의된 것과 같은 임의의 INFα2 부분 서열들 R1, R2, R3 로부터 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기들을 함유하는, 상기와 같은 자극 지수를 갖는 상기에 따른 펩티드 분자;

ㆍ생체 내에서 사용된 경우 임의의 비개질 분자보다 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, 생물학적 활성은 동일하거나 또는 허용가능한 정도로 감소된 INFα2 분자의 제조에의 상기에 따른 펩티드의 용도.

ㆍ상기 및 하기, 및 도에서 특정된 것과 같은 INFα2의 생물학적 활성을 갖는 합성 펩티드, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제로 이루어지는 약학 조성물.

"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따라 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 조합되어 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 측정가능한 정도로 활성화시킬 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다.

본원 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은, (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 발생 아미노산이 존재하며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 발생 아미노산은 모두 L-입체구조를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 입체구조의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 함유한다. 짧은 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 함유하며, "폴리펩티드" 로 불린다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "짧은" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 모든 언급은 올리고펩티드도 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 모든 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 따라서 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.

"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 크기에 비해 상당히 다양할 수 있는 물리적 크기를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 구성할 수 있는 Cα에 대한 펜던트기이다.

본 발명은 여기 개시된 것과 같은 일차 아미노산 서열들과 실질적으로 동일한 임의의 INFα2 종의 분자에 적용될 수 있으며, 따라서 유전공학적 수단 또는 기타 방법에 의해 유도된 INFα2 분자를 포함하고, 165 개 이상 또는 이하의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.

기타 포유류 기원으로부터 동정되는 것과 같은 INFα2 단백질들은 본 개시의 다수의 펩티드 서열을 공통적으로 갖고, 개시된 서열목록의 것들과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 다수의 펩티드를 공통적으로 갖는다. 따라서, 이러한 펩티드 서열들은 균등하게 본 발명의 범주에 속하는 것이다.

본 발명은 자가 유기체 내로 도입된 가용성 단백질이 면역반응을 촉발시켜 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체들의 발현을 일으킬 수 있다는 실질적인 문제를 극복하는 것에 관한 것이다. 다른 것들 중 이 현상의 두드러진 예는, INFα2의 임상적 사용이다. INFα2 가 내생적으로 생산됨에도 불구하고, 상당한 비율의 INFα2 처리된 인간 환자들이 항체를 생성한다 [Russo, D. 등 (1996)ibid; Stein, R. 등 (1988)ibid]. 본 발명은 인간 숙주에게 투여시 면역반응을 나타내는 성향이 변경된 INFα2 단백질을 제공하고자 하는 것이다. 여기 기재된 방법에 따라, 본 발명자들은 상기 자가 단백질에 대해 면역반응을 일으키는 중요한 T 세포 에피토프를 함유하는 INFα2 분자의 영역을 발견하여, 여기에 개시하였다.

개질 INFα2 를 수득하는 본 발명의 일반 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열의 결정;

(b) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;

(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안. 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성되는데, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 다시 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 그렇게 된다; 및

(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축, 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가.

단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 선행 기술에 미리 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 대한 INFα2a-유래 펩티드의 결합 성향을 확인하는 데 사용될 수 있다.

계산에 의한 T 세포 에피토프 동정에 매우 효과적인 또다른 방법이 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예 1에 기재되어 있다.

실제로, 여러 변이체 INFα2 단백질이 제조되고, 목적하는 면역 및 기능적 특징에 대해 평가될 것이다. 변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 것이지만, INFα2 단편의 화학적 합성을 포함하는 기타 방법도 포함될 수 있다.

165 개의 아미노산 잔기들의 인간 INFα2a 단백질 서열에 관한, 상기 방법의 단계 (b) 에 따른 분석 결과를 도 1 에 나타내었다. 본 발명의 개질 분자에 관한, 상기 방법의 단계 (c) 및 (d) 에 다른 고안 및 구조의 결과를 도 2 및 도 3 에 나타내었다.

본 발명은, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 단백질로부터 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 일으키는 위치에서 이루어진 INFα2 유사체에 관한 것이다. 표 1 에 나타낸 임의의 잠재적인 MHC 클래스 II 리간드 내의 특정 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환은 인간 숙주에 대해 치료제로서 투여된 경우 감소된 면역원성능을 갖는 INFα2 분자를 생성한다.

가장 바람직하게는 아미노산 개질 (예로서, 치환)이 부모 분자의 가장 면역원성인 영역 내에서 수행된 INFα2 분자가 제공된다. 본 발명자들은 여기에서 인간에서 INFα2 분자의 가장 면역원성인 영역이 하기 아미노산 서열을 각각 함유하는 R1, R2 및 R3 의 세 영역에 한정된다는 것을 발견하였다; ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH; FNLFSTKDSSAAWDE 및 KEDSILAVRKYFQRITLY. 본 발명의 주로 바람직한 구현예는, 이는 도 1 의 MHC 클래스 II 리간드이며, 그들의 전체 또는 상기 서열 성분들 R1, R2 또는 R3 중 임의의 최소 9 개 아미노산 잔기에서의 배열이 결합을 제거하도록, 그렇지 않으면 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수가 감소되도록 변경된 INFα2 분자를 함유한다.

본 발명의 바람직한 구현예는 도 4 의 특정 치환들을 포함한다. 특히 바람직하게는 도 4 로부터의 치환의 조합을 함유하는 개질 INFα2 분자들을 제공한다. 각 면역원성 영역 R1, R2 및 R3 에 대한 개질을 함유하는 조합이 바람직하며, R2 및 R3 에 대한 개질을 함유하는 조합이 특히 바람직하지만, 이러한 선호는 바람직한 것으로 고려되는 치환의 조합을 한정하고자 하는 것은 아니다.

T 세포 에피토프의 제거를 위해, 아미노산 치환은 바람직하게는 T 세포 에피토프의 활성의 제거 또는 실질적인 감소를 달성할 것으로 예측되는 펩티드 서열 내에 적절한 위치에서 이루어진다. 실질적으로 적절한 위치는 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공되는 포켓들 중 하나 내로의 아미노산 잔기의 결합에 해당할 것이다.

펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정 위치에서의 틈(cleft)의 제 1 포켓 내로의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓간의 결합 상호작용의 성질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화도의 주요 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이 위치에서의 적절한 치환은 포켓 내에 보다 덜 용이하게 수용되는 잔기일 것이며, 예로서 보다 친수성 잔기로의 치환이다. MHC 결합 틈 내의 기타 포켓 영역 내에서의 결합에 균등한 위치에서의 펩티드 중의 아미노산 잔기들도 고려되며, 본 발명의 범주에 속한다.

잠재적인 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수있는 가장 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 단일 에피토프 내의 치환의 조합이 고려될 수 있으며, 예로서 개별적으로 정의된 에피토프들이 서로 중복되는 곳이 특히 적절할 수 있다. 또한, 아미노산 치환은 소정의 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일한 에피토프 내에서 조합되어, MHC 클래스 II 결합 그루브에 대한 "포켓 잔기들"에 대등한 위치가 아닌, 펩티드 내의 임의의 지점에서 이루어질 수 있다. 치환은 상동성 구조 또는 당 기술분야에서 알려진 컴퓨터 이용 기술을 사용하여 생성되는 구조적 방법을 참조하여 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 본자의 기지의 구조적 특징들에 근거할 수 있다. 이러한 모든 치환은 본 발명의 범주에 속하는 것이다.

열거된 펩티드 내에서 이루어진 치환(들)과 조합하여 이루어지는 경우, 상기 나타낸 펩티드 내에서의 치환 외의 아미노산 치환이 특히 고려될 수 있다. 예로서, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 회복하기 위한 변화가 고려될 수 있다. 이러한 보상적 변화 및 개시된 펩티드들 중의 임의의 변화와 조합된, 바람직한 활성을 갖는 변이체를 생성하는 INFα2 폴리펩티드로부터의 특정 아미노산 잔기들의 결실 또는 부가를 포함하는 변화들은 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명이 개질 INFα2에 관한 한, 이러한 개질 INFα2 단백질 또는 개질 INFα2 단백질의 단편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 생각되어야 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 개질 INFα2 실체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면에서, 개질 INFα2 단백질을 사용하는 인간 치료방법에 관한 것이다.

실시예 1

단백질 또는 폴리펩티드 또는 면역글로불린의 전체 구조를 결정하는 데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫 번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 내의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조이며,본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 그룹을 함유하는 유기 화합물의 임의의 기이다.

인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:

O=C 및 C-N 원자들이 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 구석에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.

폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 입체구조를 정의하는 데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀림 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 입체구조에 대해 상기 원자의 평면성이 약간 변경될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 입체구조, 즉 인접한 잔기 사이에 존재하는 그대로의 구조를 정의한다. 상기 두 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서, 한 세트의 각 φ_i, ψ_i(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄)은 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. 주어진 폴리펩티드에 대해 φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 기준점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인가에 대한 정의는 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등.Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참조.

본 발명의 방법은 어느 단백질에나 적용될 수 있으며, 부분적으로, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 기저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W.,J. Immunol.,152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족은: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌이고, 방향족은: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이다) 은 포켓 내에 수용될 수 있는데, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족측쇄를 갖는 아미노산이 발견되는 어느 곳에나, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄에 비해 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 2 배 가량 더 높다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).

본 발명을 구현하는 전산적인 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:

(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 값의 약 2 배, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값으로 2, 및 방향족 측쇄에 대한 값으로 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것으로 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이를 갖는 각각의 중복되는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편 (윈도우)의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기에, 바람직하게는 샘플링된 절편 (윈도우)의 대략 정중앙 위치의 잔기에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복되는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 T 세포 에피토프가 상기 특정 절편 (윈도우)에 존재할 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바와 같이 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 점수를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.

본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 가능성을 갖는다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 전산적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 전산적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축, 및 T 세포 에피토프의 전산적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 대해 결정적인 위치의 20 개 아미노산 대안물 각각에 대한 각 모델을 사용한 각각의 골격 잔교 (dock)에 대한 아미노산 측쇄 입체구조의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자로 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 입체구조를 선택하기 위한 점수계산 기능 및 상기 상호작용으로부터 결합 점수의 유도와 연관된, 상기 골격 및 측쇄 입체구조의 라이브러리의 사용이 포함된다.

MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 역장 (force-field) (Molecular SimulationsInc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993.J. Mol Biol 234: 779-815). 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.

본 발명의 방법은, MHC 클래스 II 분자의 작은 세트를 위한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 전산적 방법 (Marshall, K. W., 등,Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids,1(3): 157-162) (1995), 또는 그루브 내의 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리로부터의 포켓 유형을 '혼합 및 대조'하여 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 전산적 방법 (Sturniolo T., 등,Nat. Biotech,17(6): 555-561 (1999))과는 상당히 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자에 대해서만 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법도 또한, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자의 맥락에서 동일한 결합 특징을 갖는다는 가정을 하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게 (virtually)' 생성될 수 있다는 추가적 단점을 갖는다.본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 구체적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시켜야 하는 것보다 훨씬 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수 있다.

골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 전산적 선행 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 입체구조의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 제곱근 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 주위로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.

최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브 내 11 개 잔기의 위치 2에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구를 3 차원적 격자로 분할하고, 격자 내의 각각의 정점을 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용한다. 후속 아미노산으로의 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 상기 Cα들의 각각에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속의 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 배향이 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다.

이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해, 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서, 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 한 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.

생성되는 골격의 수는 여러 요인에 의존한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 방법을 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자에 의해 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의서브세트를 생성한다.

MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은, 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 입체구조로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는, MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 수득된 원자 위치는 언급된 결합에 의존한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자간의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 그 때까지 배치된 모든 원자의 겹침의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 입체구조 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 경직된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모사할 수 있다. 이어서, 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 입체구조 탐색을 각 골격의 매 위치마다 모든 아미노산에 대해 반복하여, 측쇄 입체구조의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.

상술된 골격/측쇄 입체구조의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 입체구조와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델간의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 입체구조에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 점수계산 함수를 이용하여 펩티드 점수를 유도한다. 상기 골격에 대한 최고 점수를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 점수를 비교하고, 최고 점수를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 점수로 간주한다. 이어서 스캐닝되는 단백질로부터 유도되는 가능한 모든 펩티드로써 각각의 모델에 대해 상기 절차를 반복하고, 모델 대비 펩티드 점수를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. 조사될 펩티드의 연속적 아미노산이 골격 라이브러리로부터의 골격 상에 그래프트된 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 입체구조를 허용되는 입체구조의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 점수를 계산하는 데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 내 (즉, 관심 단백질 내임)에 아미노산 치환을 수행한 후, 점수계산 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화도를 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.

펩티드 리간드와 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 점수계산 함수에 포함된다.

수소 결합은 극성 또는 하전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용의 목적 하에, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개의 연결을 갖는 질소, 또는 1 개의 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다.

정전기적 결합은, 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신과 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.

친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 호의적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로 이들은, 용매에 노출되지 않도록 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 수소 결합을 형성하도록 강요되어, 우리 모양의 포접화합물 (clathrate) 구조를 형성하므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성도 수소 수용자도 아닌 황이거나, 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.

반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭적이다.상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 생성된 원자 사이의 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대치에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서, 점점 더 강해지는 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.

한 구현예에서는, Boehm 점수계산 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서는, 점수계산 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 점수계산 함수는, 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는 경우의 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는 데 사용된다. 따라서, 점수계산 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 가능하게 하기 위해, 반발 항목이 등식에 첨가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 면적 기준 에너지 항목을 이용하기보다는 쌍쌍의 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다.

따라서, 바람직한 구현예에서는 결합 에너지가 변경된 Boehm 점수계산 함수를 이용하여 추정된다. 변경된 Boehm 점수계산 함수에서는, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔG_bind)가 하기 파라미터를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 병진 및 회전 엔트로피의 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG₀); 1 개 이상의 파트너가 중성인 경우의 이상적인 수소 결합의 기여 (ΔG_hb); 비교란 (unperturbed) 이온 상호작용의 기여 (ΔG_ionic); 친유성 리간드 원자와 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔG_lipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔG_rot); 단백질과 리간드 사이의 상호작용 에너지 (E_VdW). 상기 항목을 고려하여 수학식 1 을 수득한다:

[수학식 1]

(ΔG_bind) = (ΔG₀) + (ΔG_hb×N_hb) + (ΔG_ionic×N_ionic) + (ΔG_lipo×N_lipo) + (ΔG_rot+ N_rot) + (E_VdW).

식 중, N 은 특정 항목에 대해 한정하는 상호작용의 수이고, 한 구현예에서, ΔG₀, ΔG_hb, ΔG_ionic, ΔG_lipo및 ΔG_rot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.

항목 N_hb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:

[수학식 2]

N_hb= Σ_h-bondsf (ΔR, Δα) × f (N_neighb) × f_pcs

f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황으로부터의 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:

[수학식 3]

f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)

[식 중, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나

ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나

ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,

또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나

Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나

Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이며,

TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이고,

ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이며,

Δα는 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠_N/O-H..O/N의 편차이다].

f(N_neighb) 는 단백질 표면의 오목한 부분과 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다는 포켓 내에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 비중을 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:

[수학식 4]

f(N_neighb) = (N_neighb/N_neighb,0)^α[식 중, α = 0.5 이다].

N_neighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비(非)수소 단백질 원자의 수이다.

N_neighb.0는 상수 = 25 이다.

f_pcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 수소 결합과 약한 수소 결합 사이를 구별하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:

A_polar/N_HB< 10Ų인 경우 f_pcs= β이거나

A_polar/N_HB> 10Ų인 경우 f_pcs= 1 이다.

[식 중, A_polar는 극성 단백질-리간드 접촉면의 크기이고,

N_HB는 수소 결합의 수이며,

β는 그 값이 1.2 인 상수이다].

변경된 Boehm 점수계산 함수의 실행에 있어서, 동일한 기하학적 의존성이 가정되므로, 이온성 상호작용의 기여인 ΔG_ionic은 상술된 수소 결합의 기여에 대해서와 유사한 방식으로 계산된다.

항목 N_lipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:

[수학식 5]

N_lipo= Σ_1Lf(r_1L)

f(r_1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:

r_1L≤ Rl 인 경우 f(r_1L) =1,

R2 < r_lL> R1 인 경우 f(r_1L) = (r_1L-R1)/ (R2-R1),

r_1L≥ R2 인 경우 f(r_1L) = 0

[식 중, R1 = r_l ^vdw+ r_L ^vdw+ 0. 5 이고,

R2 = R1 + 3.0 이며,

r_l ^vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고,

r_L ^vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다].

항목 N_rot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp³-sp³및 sp³-sp²결합의 수로 여겨진다. 말단 -CH₃또는 -NH₃의 회전은 고려되지 않는다.

최종 항목 E_VdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:

[수학식 6]

E_VdW= ε₁ε₂((r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)¹²/r¹²- (r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)⁶/r⁶)

[식 중, ε₁및 ε₂는 원자 정체에 근거하는 상수이고,

r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw는 반 데르 발스 원자 반경이며,

r 은 원자 쌍 사이의 거리이다].

수학식 6 에 대해, 한 구현예에서, 상수 ε₁및 ε₂에 각각 하기의 원자 값이 주어진다: C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경에 하기의 원자 값이 주어진다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.

상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는, 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용에 대한 현재의 이해 내용의 한계 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다.

따라서, 상기 점수계산 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수가 변할 수 있으므로, 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지의 추정 차원에서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값이 사용될 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 속한다.

상술한 바와 같이, 점수계산 함수는 측쇄 입체구조, 원자 정체 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본원의 목적 하에, 상기데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 기재로부터, 본 발명의 전산적 방법의 구축의 모듈적 성질은, 펩티드 골격 라이브러리, 및 상술한 바와 같이 펩티드 점수계산 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적 데이터 세트를 생성시키는 측쇄 입체구조 탐색 함수를 사용하여, 신규 모델이 간단하게 첨가되고 스캐닝될 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성시키도록 데이타가 존재한다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되게 하거나, 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다.

본 발명의 예측 방법은, 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화성이 미리 실험적으로 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프가 정확히 예측된 것으로 공지되는 하한치가 결정될 수 있다.

상기 점수계산 함수는 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 단순하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이, 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 실제 결합 에너지 그 자체를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은, 선택된 단백질의 일차 구조 (즉, 아미노산 서열)를 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는, 비교적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 역치값 초과의 결합 에너지는 리간드 내 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 회 이상의 아미노산 치환 처리하여, 결합 에너지를 재계산할 수 있다. 신속한 계산의 속성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은, 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지 않는다.

당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 사용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 연관시켜 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등,J. Mol. Biol.,161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등,ISMB,3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 전산적 방법의 사용은, 필요한 계산을 수행하는 데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법들이, 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 밝혀지는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 수득하기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수도 있다.

복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 처리 시간의 제한은, 상기 계산을 수행하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재의 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다.

폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등,J. Comput. Chem.,4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등,Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저,Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

하기 실시예들은 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 2

INFα2 의 165 아미노산 서열을 실시예 1 의 방법에 의해 컴퓨터를 이용하여 대략적으로 분석하였다. 57 패널의 13량체 합성 펩티드를 생산하고, 이들의 인간 MHC 클래스 II 분자와의 시험관내 결합 능력에 대해 분석하였다. 펩티드 서열을 도 5 에 나타내었다.

MHC 클래스 II 합성 펩티드 결합 분석을 기지의 HLA-DR 동종이형의 인간 림포아구 (lymphoblastoid) B 세포를 사용하여 수행하였다. 세포를 파라포름알데히드로 고정하고, 비오티닐화 펩티드 단독 또는 IC₅₀값을 결정하기 위하여 비(非)-비오티닐화 경쟁자 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 펩티드와의 인큐베이션후, 세포들을 용해시키고, MHC 클래스 II 분자들은 항-HLA-DR α-사슬 단일클론성 항체 LB3.1 에 의해 포획되었다. 결합된 비오티닐화 펩티드를 스트렙트아비딘 과산화효소에 의해 검출하였으며, 결합된 펩티드의 양을 발광 판독기에 의해 정량화하였다.

경쟁 결합 분석을 수행하였으며, 여기에서 비-비오티닐화 시험 펩티드를 비오티닐화 경쟁자 펩티드 존재 하에서 고정 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 경쟁자 펩티드들을 미리 결정하여 단순 (비(非)-경쟁적) 결합 분석을 사용하여 관심대상의 특정 동종이형에 대한 IC₅₀값을 갖도록 하였다. 상기 IC₅₀값은 표지된 펩티드의 50 % 가 결합되지 않도록 방지하는 비표지된 펩티드의 농도이다. 비오티닐화 펩티드의 농도를 실험적으로 결정하여 각 대립 유전자에 대해 측정된 ED₅₀(최대 반응의 1/2를 나타내는 펩티드 농도)의 1/6 이상이 되도록 하여, 저해가 경쟁자 펩티드의 결합 특성을 우선적으로 측정할 것을 보장하였다.

EBV 형질전환 인간 B 림프아구 세포계들은 ECACC (Salisbury, UK) 로부터 수득가능하다. HOM-2 세포들을 DRB1^*0101 결합에 대한 분석에 사용하였다; WT51 세포들을 DRB1^*0401 결합의 분석에 사용하였으며, MOU (MANN) 세포들을 DRB1^*0701 결합의 분석에 대해 사용하였다. 마우스 하이브리도마 LB3.1 을 미국 세포표본 보관소 ATCC (Virgina, USA)로부터 수득하였다. 향상된 화학발광성 (ECL) 시약을 Amersham Pharmacia (Amersham, UK) 로부터 구입하였다. RPMI 1640 배지,L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 Life Technologies (Paisley, UK) 로부터 수득하였다. 옵티플레이츠™(Optiplates™)를 Packard (Pangbourne, 잉글랜드) 로부터 수득하였다. 비오티닐화 펩티드를 Babraham Tech^nix(Cambridge, 잉글랜드) 로부터 수득하고, 비-비오티닐화 펩티드를 Pepscan Systems (Lelystad, 네덜란드)로부터 수득하였다. Prosep A 를 Millipore (Warford, UK)로부터 수득하였다. DAB, PMSF, 인도아세트아미드, 벤즈아미딘, 류펩틴, 펩스타틴, PBS 정제, DMSO, BSA, 스트렙트아비딘 과산화효소 접합물 및 기타 모든 화학물질들을 The Sigma Chemical Company (Poole, UK)로부터 수득하였다.

림포아구 세포들을 10% 태아 소 혈청 (FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 가한 RPMI-1640 배지 중에서 습한 분위기, 37 ℃/5 % CO₂에서 배양하였다.

LB3.1 하이브리도마 세포들을 10% 태아 소 혈청 (FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 가한 RPMI-1640 배지 중에서 습한 분위기, 37 ℃/5 % CO₂에서 배양하고, LB3.1 항체를 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 0.22 μM 필터를 사용하여 여과한 후, 450 ㎖ 당 1 M의 Tris pH 8.0 50 ㎖ 를 첨가하여 0.1M 버퍼화된 용액을 만들었다. 버퍼화된 상청액을 3 ㎖ PROSEP A 컬럼을 통해 하룻밤 동안 4 ℃ 에서 통과시키고 25 ㎖ 의 PBS 로 세척하였다. LB3.1 항체를 8 ㎖ 의 0.1 M 시트레이트 pH 3.0 을 사용하여 용리하고, 각 0.5 ㎖ 분획을 500 ㎕의 1M Tris-HCl pH 8.0 내로 수합하였다. 각 분획의 단백질 함량을 분광광도계 (A280 nm)를 사용하여 결정하였다. 분획들을 풀 (pool)로 만들고, Slide-A-Lyser 3.5 K 컷-오프 (cut-off) (Pierce)를 사용하여 800 ㎖ PBS 내로 투석하였다. LB3.1 의 순도를 쿠마씨 염색 후 감소된 SDS-PAGE에 의해 점검하였다.

각 펩티드/동종이형 조합에 대한 결합 분석을, 웰 당 2×10⁶세포를 사용하여 96 웰의 편평 바닥 Optiplates™에서 3 회 수행하였다. 세포들을 RPMI-1640 으로 2 회 세척한 후, 30 분 동안 얼음상에서 0.5 % 파라포름알데히드/PBS 로 고정하였다. RPMI-1640 으로 2 회 세척 후 세포들을 비오티닐화 펩티드; 비오티닐화 펩티드 + 비-비오티닐화 경쟁 펩티드와 인큐베이션하거나, 또는 펩티드 없이 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 펩티드 결합 버퍼 (100 mM 시트레이트/포스페이트 pH 4.5, 5 mM EDTA, 1mM PMSF, 100 μM 류펩틴, 1 mM 요오도아세트아미드, 100 μM 펩스타틴 A, 1 mM 벤즈아미딘)를 사용하여 37 ℃ 에서 24 시간 동안 수행하였다. 세포들을 원심분리하여 수합한 후, 80 ㎕의 상청액을 제거하고, 80 ㎕/웰 의 NP40 용해 버퍼 (0.5% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 100 μM 류펩틴, 1 mM 요오도아세트아미드, 100 μM 펩스타틴 A, 1 mM 벤즈아미드 50 mM Tris-HCl pH 8.0 까지)로 치환하였다. 세포들을 4 ℃ 에서 45 분 동안 인큐베이션하고 원심분리에 의해 깨끗한 용균물을 수득하였다. 용균물 (3 벌/샘플) 50 ㎕ 를 50 ㎕ PBS/5% BSA 를 함유하는 예비코팅된 96 웰 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 모든 실험에서 예비코팅을 전날 밤에 수행하였으며, 여기에서 분석 플레이트를 PBS중에서 20 ㎍/㎖ 로 희석된 항-클래스 II 항체 LB3.1 100 ㎕/웰 로 4 ℃ 에서 예비처리하였다. 과량의 항체를 제거하고, 250 ㎕/PBS 웰/5 % BSA 로 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 블록킹하였다(blocked). 각 플레이트를 PBS/1% Tween 로 7 회 세척하고, 세포 용균물의 첨가 전에 50 ㎕ 의 PBS/5% BSA/0.5 % NP40 를 각 웰에 첨가하였다.

용균물 첨가 후, 플레이트를 4 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시키고, PBS/0.1 % Tween 으로 7 회 세척하였다. PBS/5% BSA/0.1 % Tween 중에서 1:1000 으로 희석된 100 ㎕ 의 스트렙트아비딘 과산화효소를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.1 % Tween 으로 7 회 세척하고, 100 ㎕ 의 화학발광 기질 (Amersham Pharmacia)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Perkin Elmer MicroBetaTrilux 플레이트 판독기를 사용하여 판독하고, 결과를 CPS 로 제공하였다.

경쟁 분석에서: 비오티닐화 펩티드의 최대 결합은 경쟁자 펩티드의 부재시 일어나는 결합 (CPS) 로서 정의되며, 저해는 하기 식에 의해 정의된다:

최대 비오티닐화 펩티드 결합의 50 % 저해를 일으키는 경쟁자 펩티드의 농도를 IC₅₀으로서 취하였다.

도 5 에 열거한 것과 같은 13량체 펩티드의 패널 상에서 수행된 결합 분석을 도 6a~도6d 에 나타내었다. 도 6d 에 나타낸 펩티드를 제외하고, 모든 펩티드들이 시험된 하나 이상의 인간 MHC 클래스 II 동종이형과 결합 상호작용을 나타내었다.

실시예 3

MHC, 펩티드 및 T 세포 수용체 (TCR) 간의 상호작용은 T 세포 인식의 항원 특이성에 대한 구조적인 기초를 제공한다. T 세포 증식 분석은 MHC 에 대한 펩티드의 결합 및 TCR 에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인식을 시험한다. 본 실시예의 시험관내 T 세포 증식 분석은 항원 제공 세포 (APCs) 및 T 세포를 함유하는 말초혈단핵세포 (PBMCs)의 자극을 포함한다. 자극은 합성 펩티드 항원을 사용하여 시험관 내에서 수행하고, 일부 실험에서는 전체 단백질 항원을 사용하였다. 자극된 T 세포 증식은³H-티미딘 (³H-Thy) 을 사용하여 측정하고, 혼입된³H-Thy의 존재은 세척된 고정 세포들의 신틸레이션 계수를 사용하여 평가하였다.

12 시간 이하 동안 보관된 인간 혈액으로부터의 백혈구 연층 (buffy coat)을 국립혈액원 (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK)으로부터 수득하였다. 피콜-패이크 (Ficoll-paque)를 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham,UK)로부터 수득하였다. 일차 인간 림프구 배양용의, L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖ 젠토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 함유하는, 무혈청 AIM V 배지를 Gibco-BRL (Paisley, UK)로부터 수득하였다. 합성 펩티드를 Eurosequence (Groningen, 네덜란드) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK)로부터 수득하였다.

백혈구 연층을 온화하게 원심분리하여 적혈구 및 백혈구를 혈장 및 혈소판으로부터 분리하였다. 최상부 층을 (혈장 및 혈소판 함유) 제거하여 폐기하였다. 15 ㎖ 피콜-패이크 (Amersham Parmacia, Amersham UK) 상에 도말하기 전에 적혈구 및 백혈구를 인산 완충 식염수 (PBS) 중에서 1:1 로 희석하였다. 제조자의 권장 조건에 따라 원심분리를 수행하고, 혈청 + PBS/피콜 패이크 계면으로부터 PBMCs 를 수확하였다. PBMCs 를 PBS 와 혼합하고 (1:1), 원심분리에 의해 수합하였다. 상청액을 제거하여 폐기하고, PBMC 펠렛을 50 ㎖ PBS 에 재현탁하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 펠렛화하고, PBS 상청액을 폐기하였다. 50 ㎖ AIM V 배지를 사용하여 세포들을 재현탁하고, 이 시점에서 계수하고 트립판 블루 염료 절제 (exclusion)를 사용하여 생존성 (viability)을 평가하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 수합하고, 상청액은 폐기하였다. 세포들을 저온 저장을 위해 3 ×10⁷/㎖ 의 밀도로 재현탁하였다. 저장 배지는 90 % (v/v) 의 가열 비활성화된 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, UK) 및 10 % (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) 이었다. 세포들을 조절된 동결 용기 (Sigma)로 옮겨, -70 ℃ 에서 하룻밤동안 두었다. 사용시, 세포들을 10 ㎖ 예비가온된 AIM V 배지로 옮기기 전에 37 ℃ 수조에서 신속하게 해동시켰다.

PBMC 를 96 웰의 편평 바닥 플레이트 중에서 2 ×10⁵PBMC/웰 의 밀도로 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다.³H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK)로 맥동시키기 (pulsing) 전에, PBMC 를 37 ℃ 에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 본 발명의 연구에서, INFα의 전체 서열에 뻗어있는, 3aa 증가분에 의해중복된 합성 펩티드 (15 량체)가 생성되었다. 펩티드 확인 번호 (ID#) 및 서열을 도 7 에 제공하였다. 각 펩티드를 20 명의 순수 공여자로부터 단리된 PBMC 에 대해 개별적으로 스크리닝하였다. 면역원성인 것으로 이미 나타난 두 개의 대조구 펩티드 및 강한 비-회상 (non-recall) 항원 KLH 를 각 공여자 분석에 사용하였다.

이 연구에 사용된 대조구 항원들은 하기와 같았다:

펩티드	서열
C-32	비오틴-PKYVKQNTLKLAT독감 헤마글루티닌 307-319
C-49	KVVDQIKKISKPVQH클라미디아 HSP 60 펩티드
KLH	키홀 삿갓조개 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin)으로부터의 전체 단백질

펩티드를 DMSO 에 10 mM 의 최종 농도로 용해시키고, 이들 스톡 (stock) 용액들을 AIM V 배지 중에서 1/500 으로 희석하였다 (최종 농도 20 μM). 펩티드를 편평 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하여 100 ㎕ 중의 2 및 20 μM 의 최종 농도로 만들었다. 트립판 블루 염료 절제에 의해 해동된 PBMC의 생존성을 평가하고, 그 후 세포들을 2 ×10⁶세포/㎖ 의 밀도로 재현탁하고, 100 ㎕ (2 ×10⁵PBMC/웰)을 펩티드가 담긴 각 웰로 옮겼다. 3 벌의 웰 배양물을 각 펩티드 농도에서 분석하였다. 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂의 습한 분위기에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 필터 매트 상에서 수확하기 전에 18~21 시간 동안 1 μCi³H-Thy/웰 로 맥동시켰다. 발락 (Wallac) 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Perkin Elmer)를 사용하여 CPM 값을 결정하였다. 결과를, 하기 화학식을 사용하여 결정되는 자극 지수로서 결정하였다:

2 이상의 자극 지수를 이 분석에서 양성 자극으로서 채택하였다. T 세포 증식 분석을 사용하여 INFα 서열 중의 T 세포 에피토프를 맵핑 (mapping)하여 3 개의 면역원성 영역 R1, R2, R3 를 동정하였다. 하나 이상의 이들 영역 중에서 펩티드에 대해 반응한 6 명의 공여자 중에서의 T 세포 증식에 의해 이를 결정하였다. 증식이 INFα 펩티드에 대해 반응한 6 명 중 4 명의 공여자들에서 기록됨에 따라, 영역 3 이 잠재적인 면역우세 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 생각된다. 영역 1 및 2 는 특정 개인들에서 T 세포 증식을 유도하였다. 반응하는 개인들에 대한 누적 반응 데이타를 도 8 에 나타내었으며, 개별적인 반응자들로부터의 데이타를 도 9 에 요약하였다. 개별적인 공여자들에 대한 자극 지수를 도 15에 나타내었다. 개별적인 펩티드/공여자 반응과 함께 R1, R2 및 R3 를 표시한, INFα에 대한 에피토프 데이타를 도 10 에 나타내었다.

실시예 4

실시예 3 에서 사용된 모든 PBMC 시료들에 대한 조직 유형을, 상업적으로 구입가능한 시약계 (Dynal, Wirral, UK)를 사용하여 분석하였다. 공급자의 권장 프로토콜 및 표준 보조시약 및 아가로오스 전기영동 시스템에 따라 분석을 수행하였다. DRB1 대립 유전자에 대한 동종이형성 커버리지 (coverage)는 시험된 20 명의 공여자 중에서 70 % 였다. 조직 유형화의 결과를 특정 MHC 클래스 II 대립유전자를 갖는 INFα2 펩티드 반응자의 빈도를 평가하는데 사용하였다. 소정의 펩티드의 동종이형성 제한은 공여자 집단에서 대립 유전자의 빈도 및 동일한 대립유전자를 발현하는 반응 공여자의 수에 의해 결정하였다. 펩티드가 임의의 특정 대립유전자와 결합된다면, 그 빈도 (백분율로서 나타냄)는 집단 중에서 대립유전자의 빈도 이상으로 예측된다. 이러한 분석 결과를 도 11 에 나타내었다. 일반적으로 적은 수는 엄밀한 통계적 시험이 불가능하게 하지만, 상기 데이타는 R3 으로서 정의된 에피토프 영역으로부터 펩티드의 DRB4*01 동종이형과의 가능한 연합을 나타낸다.

실시예 5

MHC 펩티드 결합 분석을, 실시예 3 의 생물학적 분석을 사용하여 동정된 주 면역원성 영역으로부터 유도된 서열을 함유하는 합성 펩티드를 사용하여 수행하였다. 상기 분석에서, 합성 15 량체 펩티드를, 비오티닐화 경쟁자 펩티드와 경쟁하여 3 개의 MHC 동종이형에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 분석을 개략적으로 실시예 2 에 상세히 나타낸 바와 같이 수행하고, IC₅₀값을 시험 펩티드에 대한 경쟁자의 6 개 농도 비율로부터 유도된 결합 곡선으로부터 계산하였다. 시험된 각 펩티드/동종이형 조합에 대한 IC₅₀값을 도 12a~12c 에 나타내었다. 이들 데이타는 시험관내 생물학적 분석에서 T 세포 증식을 자극할 수 있는 펩티드가 저친화성 또는 고친화성 MHC 클래스 II 리간드일 수 있음을 나타내었다.

실시예 6

통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 다수의 개질 INFα2 분자를 만들었다. 야생형 INFα2b 유전자를 인간 태반 DNA 로부터 클로닝하고, 상기 유전자를 대조구 시약 및 이로부터 부위-유도 돌연변이 유발에 의해 개질된 INFα2b 유전자들을 유도하는 주형으로서 모두 사용하였다. 야생형 및 개질 유전자를 진핵성 발현 벡터 내로 삽입하여, 재조합 INFα2 단백질이 인간 면역글로불린 불변 영역 도메인을 갖는 융합 단백질로서 발현되었다. 재조합 단백질을 일시적으로 형질감염된 인간 배 (embryonic) 신장 세포로부터 제조하고, 실시예 7 에 상세히 설명한 것과 같이 분석하였다.

간략하게는, 상기 야생형 INFα2b 유전자를, 중합연쇄반응 (PCR)을 사용하여 인간 태반 DNA (Sigma, Poole, UK)로부터 증폭시켰다. 상기 유전자는 인트론을 함유하지 않았으며, 하기 나타낸 것과 같이 클로닝을 촉진하는 제한 부위를 함유하는 전방 및 후방 프라이머 OL177 및 OL178 을 사용하여 용이하게 증폭되었다:

550 bp 의 PCR 생성물을 EcoRI 및 BamHI 으로 소화시키고, pLITMUS28 벡터 (NEB, UK Ltd.) 내로 클로닝하였다. 상기 서열은 다수의 양성 클론의 분석에 의해 인터페론 알파 2b 의 서열임을 확인하였다. 인간 배 신장 세포로부터의 발현을 수득하기 위하여, 야생형 유전자를 pd-Cs[Lo, 등 (1998), ProteinEngineering 11:495] 내로 재클로닝하였다. pd-CS 벡터는 인간 면역글로불린 불변 영역 도메인을 함유하는 융합 단백질의 발현에 대한 것이다. 상기 벡터로의 클로닝은 PCR 및 프라이머 OL232 및 OL178 을 사용하여 달성하였다. 이들 프라이머들은 하기와 같은 XmaI 및 BamHI 효소와 함께 사용되어 클로닝 부위를 제공한다.

530 bp 의 PCR 생성물을 XmaI 및 BamHI 로 소화시키고, Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, XmaI 및 BamHI 를 사용하여 INF(L) 서열이 제거된, 제조된 pd-Cs 내로 전이시켰다. 양성 클론을 선발하고, 서열 분석에 의해 INFα2b 서열을 확인하였다. 야생형 INFα2b 유전자를 함유하는 pd-Cs 벡터를 pCIFN5 로써 명명하였다.

개질 INFα2 유전자를 발생시키는 단일 또는 다중 코돈 돌연변이는 pCIFN5 를 주형으로서 사용하여 돌연변이 유발 PCR 에 의해 수행하였다. 중복 PCR 을 사용하여 상기 인터페론 서열의 2 개의 돌연변이된 반쪽들을 조합시켰다. 상기 기재된 것과 같이 XmaI 및 BamHI 를 사용하여 pd-Cs 유도된 발현 벡터 내로 전이시키기 전에, 서열 분석을 위해 상기 단편을 중간체 벡터 (pGEM-T EASY 벡터; Promega, UK) 내로 클로닝하였다.

특정 돌연변이 유발 (미스-매치된(mis-matched)) 프라이머 및 pCIFN5 주형DNA 와 조합하여, 개별 반응들에서 측면근접 (flanking) 프라이머들 OL235 및 OL234 를 사용하여 돌연변이 유발을 수행하였다.

반응들은 Expand HI Fidelity PCR 시약 (Roche, GmbH)을 사용하여 수행하고, 반응 조건은 하기 사이클에 의해 특정하였다:

94 ℃/2' + 25 사이클 @ 94 ℃/30", 60 ℃/30", 72 ℃/30" + 72 ℃/10'

프라이머 OL235 및 OL234 에 의해 유발된 반응에서 15 사이클의 PCR 을 사용하여 상기와 같은 PCR 에 의해 개별 반응에서의 생성물을 결합하였다.

PCR 생성물들을 상업적으로 구입가능한 키트 시스템 (Qiagen 겔 추출 키트) 을 사용하여 겔 정제하였다. 생성물을 T/A 클로닝 시스템을 사용하여 벡터 pGEMT EASY (Promega, UK) 내로 클로닝하고, 다수의 클론들을 각 경우에서 서열화하여 목적하는 돌연변이의 성공적인 도입을 확인하였다.

목적하는 클론들을 BamH1 및 Xma1 으로 소화시키고, 정제된 생성물을 제조된 pd-Cs 벡터 내로 결찰시켰다. E.coli XL1-Blue 세포 (Strategene Europe)를 사용하고, 공급자에 의해 권장된 배양 조건에서 클로닝을 수행하였다. 서열 확인은 OL261 및 OL234 를 서열화 프라이머로서 사용하여 전체 최종 벡터 제제 상에서수행하였다.

개질 INFα2 인간 IgFC 융합 단백질의 발현은 HEK293 인간 배 신장 세포계를 발현 숙주로서 사용하여 달성하였다. 형질감염을 위한 전체 DNA 를 고순도 CONCERT 반제조 (midiprep) 시스템을 사용하고, 공급자 (Invitrogen, Paisley, UK)에 의해 제공된 지시사항에 따라 제조하였다. DNA 를 사용 전에 필터 멸균하고, A₂₆₀의 측정에 의해 정량하였다. 농도를 0.5~1.0 ㎍/㎕ 으로 조정하였다.

일시적 발현을 위해, HEK293 을 10% FCS 및 250 ㎍/㎖ 제네티신으로 보강된 D-MEM 글루타맥스 배지를 사용하여 배양하였다 (Invitrogen, Paisley, UK). 형질감염 전에, 세포들을 트립신 처리에 의해 수합하고, PBS 를 사용하여 세척하였다. 2 사이클의 세척 후, 세포들을 4×10⁵세포/㎖ 의 밀도로 신선한 배지 내에 취하고, 양호한 세포 접착을 보장하도록 폴리-l-리신으로 예비처리된 다중 웰 디쉬(dish) 내에 도말하였다. 전형적으로, 2 ×10⁵세포들을 48 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 37 ℃/5 % CO₂에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

형질감염 전에, 상기 배지를 각 웰에 넣고 형질감염 믹스를 첨가하였다. 형질감염을 리포펙타민(lipofectamine) 시약을 사용하고 공급자 (Invitrogen,Paisley, UK)에 의해 제공된 지시사항을 따라 수행하였다. 간략하게는, 리포펙타민, OPTI-MEM (Invitrogen, Paisley, UK) 및 각 발현 벡터 구축을 위하여 웰 당 0.8 ㎍ DNA을 함유하는 형질감염 믹스를 제조하였다. 형질감염 믹스를 세포에 첨가하고, 세포들을 4~6 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 0.5 ㎖ 의 신선한 배지로 대체하고, 세포들을 37 ℃/5 % CO₂에서 인큐베이션하였다. 항-FC ELISA 및 다우디 (Daudi) 세포 증식 분석 모두에 의한 분석을 위해 48 시간 후에 시료를 취하였다. 상기 배지를 7 일 후에 수확하여, 상기와 같은 추가의 분석을 위해 4 ℃ 에 저장하였다.

상업적으로 구입가능한 ELISA 시스템을 사용하고, 공급자 (R&D systems, UK)에 의해 제공된 지시사항에 따라 상기 배지를 INFα2 의 존재에 대하여 분석하였다. 일부 경우에서는, INFα-융합단백질의 인간 면역글로불린 고정 영역 도메인을 탐지하는 ELISA 를 적용하였다. 이 분석을 위해, 마우스 항-인간 IgG Fc 제제 (Sigma, Poole, UK)를 포획 시약으로서 사용하였다. INFα-HuFc 융합을, 참조 인간 IgG 제제 (Sigma) 의 일련의 희석물들을 사용하여 만든 표준 곡선을 참조하여 정량하였다. 결합 INFα-FC 융합 또는 참조 단백질을, 항-인간 IgG 과산화효소 접합물 (Sigma) 및 Sigma OPD 색측정 기질을 사용하여 탐지하였다.

HEK293 컨디셔닝된 배지 중의 INFα의 양의 측정 후, 상기 컨디셔닝된 배지를, 실시예 7 에 상세히 기재된 것과 같은 항-증식 분석을 사용하여 개질 INFα의 기능적 활성을 시험하는데 바로 사용하였다.

실시예 7

본 발명의 개질 인터페론 분자들을 그들의 인간 B 세포 림프종계 Daudi 의 성장 저해 능력에 대해 시험하였다. 상기 방법은 대략적으로 이미 [Mark, D.F. 등 (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662~5666]에 기재된 것과 같다. 상기 시험 분자의 항-증식 효과는 증식 세포들의 존재시 색상이 변화하게 되는 가용성 염료 물질을 사용하여 측정하였다. 유도된 색상 변화는 분광광도계에서 측정하고, 임의의 항증식 효과는 비처리된 대조구 세포 및 표준 인터페론 제제로 처리된 세포에서 기록된 색상 변화를 참조하여 계산하였다.

간략하게는, Daudi 세포들 (ATCC #CCL-213)을 100 유닛/㎖ 페니실린/100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민 및 20 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보강된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 모든 배지 및 보강물은 Gibco (Paisley, UK)로부터 수득하였다. 분석 전날, 세포들을 신선한 배지내에 0.9 ×10⁶/㎖ 의 밀도로 넣고, 다음날 10 % (v/v) FBS 를 함유하는 것을 제외하고는 상기와 같은 신선한 배지 내에 넣었다. 세포 밀도는 2×10⁵세포/㎖ 로 조정하였다.

시험구 및 대조구 인터페론 제제들을 10 % FBS 를 함유하는 RPMI 내로 희석하였다. 희석은 96 웰 편평 바닥 플레이트들 내에서, 100 ㎕/웰 을 함유하도록 이루어졌으며, 모든 샘플들은 3 벌씩으로 하였다. 전형적으로 각 플레이트에 걸쳐 2 배 희석물 (doubling dilution series)들을 배치하였다. 양성 대조구 웰들도 10000 pg/㎖ 의 인터페론 표준품 (NIBSC, South Mimms, UK)의 출발 농도를사용하여 3 벌 포함되었다. 100 ㎕ 배지만을 (인터페론 없음) 함유하는 대조구 웰들도 포함되었다. 100 ㎕ 의 세포들을 각 웰에 첨가하고, Aqueous One 시약 시스템을 사용하여, 공급자 (Promega, Southampton, UK) 권장 프로토콜에 따라 평가하였다. 간략하게는, 40 ㎕ 의 Aqueous One 시약을 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂에서 72 시간 동안 인큐베이션 하였다. 증식은 기질을 혼합하였다. 플레이트를 37 ℃ 에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후, 광흡수 측정을 위해 플레이트 판독 기기로 옮겼다. 판독은 490 nm 에서 실시하였다. X 축을 따라, 첨가된 인터페론 표준품의 농도들에 대해, 490 nm 에서의 평균 흡수를 Y 축으로 하여 플롯팅하였다. 실시예 6 에 기재된 것과 같은 ELISA 기술을 사용하여 인터페론 농도를 결정하였다. 결과의 보정 곡선을 사용하여 각 시험 샘플에 대한 ED₅₀값을 측정하였다.

다수의 개질 INFα2 분자에 대한 상기 방법에 따른 분석 결과를 도 14에 나타내었다. 결과는 INFα2 서열 내에서의 아미노산 치환의 존재시 보유된 항-증식 성질을 나타낸다.

Claims (70)

1. 생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자.
2. 제 1 항에 있어서, 면역원성의 손실이 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거 및/또는 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의해 달성되는 개질 분자.
3. 제 2 항에 있어서, 하나의 T 세포 에피토프가 제거된 개질 분자.
4. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래 존재하는 T 세포 에피토프가, MHC 클래스 II 상의 제공을 통하여 T 세포를 자극하거나 또는 이에 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 개질 분자.
5. 제 4 항에 있어서, 리간드 또는 펩티드 서열이 13량체 또는 15량체 펩티드인 개질 분자.
6. 제 5 항에 있어서, 펩티드 서열이 도 1 에 나타낸 군으로부터 선택된 개질분자.
7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1~9 개 아미노산 잔기가 변경된 개질 분자.
8. 제 7 항에 있어서, 하나의 아미노산 잔기가 변경된 개질 분자.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)을 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)로의 치환인 개질 분자.
10. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 도 2 에 나타낸 것과 같이 실시되는 개질 분자.
11. 제 10 항에 있어서, 추가의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이, 개질 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키기 위하여, 도 3 에 나타낸 것과 같이 실시되는 개질 분자.
12. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 도 3 에 나타낸 것과 같이 실시되는 개질 분자.
13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실인 개질 분자.
14. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 아미노산들에 대해 특정 위치(들)에서의 아미노산(들)의 부가인 개질 분자.
15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위하여 추가의 변경을 더 수행하는 개질 분자.
16. 제 15 항에 있어서, 추가의 변경이 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실인 개질 분자.
17. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 상동성 단백질 서열을 참조하여 이루어지는 개질 분자.
18. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 컴퓨터 이용 (in silico) 모델링 기술을 참조하여 이루어지는 개질 분자.
19. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 INFα2 유도된 펩티드 또는 INFα2 단백질에 의한 T 세포의 자극 또는 결합을 참조하여 이루어지는 개질 분자.
20. (i) MHC 클래스 II 상에서의 제공을 통해 T 세포를 자극 또는 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도된 펩티드를 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의한, 일차 서열 중의 하나 이상의 아미노산들의 변경에 의해 수득가능한, 생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자로, 여기에서 상기 개질 분자가 INFα2 야생형으로부터 유도된 상기 일차 서열의 연속된 아미노산 잔기들의 하기 스트링 (strings) 내의 하나 이상의 위치에서 이루어진 변경을 포함하는 개질 분자:

    (a) ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH (R1),

    (b) FNLFSTKDSSAAWDE (R2),

    (c) KEDSILAVRKYFQRITLY (R3).
21. 제 20 항에 있어서, 변경이 1~9 개 아미노산 잔기의 치환인 개질 분자.
22. 제 21 항에 있어서, 치환이 스트링 R1, R2 및 R3 으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 수행되는 개질 분자.
23. 제 21 항에 있어서, 치환이 스트링 R2 및 R3 으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 수행되는 개질 분자.
24. 제 21 항에 있어서, 치환이 스트링 R3 으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 수행되는 개질 분자.
25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 스트링 R1, R2 또는 R3 외의 아미노산 잔기들의 하나 이상의 치환이 추가로 수행되는 개질 분자.
26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 분자 중 하기의 하나 이상의 위치에서 이루어진 아미노산 잔기 치환을 포함하는 개질 분자: 24, 26, 27, 38, 55, 63, 64, 66, 67, 76, 84, 85, 89, 103, 110, 111, 116, 117, 119, 122, 123, 126, 128, 129, 130, 153.
27. 제 25 항에 있어서,야생형 분자 중 하기의 하나 이상의 위치에서 이루어진 아미노산 잔기 치환을 포함하는 개질 분자: 26, 27, 38, 63, 85, 89, 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153.
28. 제 27 항에 있어서, 치환이 26, 27, 38 로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자.
29. 제 27 항에 있어서, 치환이 63, 85 또는 89 에서 이루어진 개질 분자.
30. 제 27 항에 있어서, 치환이 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153 으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자.
31. 제 27 항에 있어서, 치환이 26, 27, 38 로부터 선택된 하나 이상의 위치 및 추가적으로 63, 85 또는 89 에서 이루어진 개질 분자.
32. 제 27 항에 있어서, 치환이 26, 27, 28 로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어지거나, 다르게는 63, 85, 89 로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어지고, 추가적으로 103, 110, 111, 116, 117, 122, 123, 126, 128, 153 으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자.
33. 제 26 항에 있어서, 치환이 도 4 에 특정된 것과 같은 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자.
34. 제 28 항에 있어서, 치환이 L26P, F27S, F38E 로부터 선택된 개질 분자.
35. 제 29 항에 있어서, 치환이 I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N 으로부터 선택된 개질 분자.
36. 제 30 항에 있어서, 치환이 V103E, L110G, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A, Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A, L153S 로부터 선택된 개질 분자.
37. (i) MHC 클래스 II 상에서의 제공을 통해 T 세포를 자극 또는 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 본래의 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도된 펩티드를 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의한, 일차 서열 중의 하나 이상의 아미노산들의 치환에 의해 수득가능한, 생체 내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는, 인간 인터페론 알파 2 (INFα2)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자로, 여기에서 상기 치환이 하기로부터 선택된 하나 이상의 그룹에 대응하는 야생형 INFα2a 또는 INFα2b 분자 중 하나 이상의 위치에서 이루어진 개질 분자:

    (i) I24P, L26P, F27S, F38E, V55A,

    (ii) I63T, L66A, F67D, F67E, W76H, F84D, F84E, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N,

    (iii) L153S 를 포함하는 R3 서열 내의 임의의 위치.
38. 제 37 항에 있어서, 하기 치환 중 하나 이상이 R3 서열 내에 이루어진 개질 분자: V103E, L110G, L110S, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A, V119A, Y122Q, Y122E, Y122H, F123H, I126A, L128A, Y129N, L130G, L130, L153S.
39. 제 38 항에 있어서, 하기 치환 중 하나 이상이 이루어진 개질 분자: Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A.
40. 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 치환이 추가적으로 이루어진 개질 분자.
41. 하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

    [상기에서, X⁰은 R, K 이고;

    X¹은 Y, E, Q 이고;

    X²는 F, H 이고;

    X³은 I, A 이고; 및

    X⁴는 L, A 이고;

    동시에 X¹= Y, X²= F, X³= I 및, X⁴= L 은 제외된다].
42. 하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

    [상기에서, X⁰은 R, K 이고;

    X¹은 L, S, G 이고;

    X²는 M, T, S, E 이고;

    X³은 I, S, Q 이고;

    X⁴는 L, G 이고;

    X⁵는 Y, E, Q 이고;

    X⁶는 F, H 이고;

    X⁷는 I, A 이고;

    X⁸는 L, A 이고; 및

    X⁹는 L, S 이고;

    동시에 X¹= L, X²= M, X³= I, X⁴= L, X⁵= Y, X⁶= F, X⁷= I, X⁸= L 및 X⁹= L 은 제외된다].
43. 하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

    [상기에서, X⁰은 R, K 이고;

    X¹은 I, T 이고;

    X²는 F, D, A 이고;

    X³은 L, A 이고;

    X⁴는 F, D, E 이고;

    X⁵는 W, H 이고;

    X⁶는 F, D, E 이고;

    X⁷는 Y, S 이고; 및

    X⁸는 Y, D, E, N 이고;

    동시에 X¹= I, X²= F, X³= L, X⁴= F, X⁵= W, X⁶= F, X⁷= Y 및 X⁸= Y 는 제외된다].
44. 하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

    [상기에서, X⁰은 R, K 이고;

    X¹은 I, T 이고;

    X²는 Y, S 이고; 및

    X³은 Y, D, E, N 이고;

    동시에 X¹= I, X²= Y, 및 X³= Y 은 제외된다].
45. 하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 알파 2 (INFα2):

    [상기에서, X⁰은 R, K 이고;

    X¹은 L, P 이고;

    X²는 F, S 이고;

    X³은 F, E 이고; 및

    X⁴는 V, A 이고;

    동시에 X¹= L, X²= F, X³= F 및 X⁴= V 는 제외된다].
46. 제 41 항에 있어서, 추가의 치환이 이루어진 개질 INFα2 서열.
47. 제 46 항에 있어서, 제 43 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
48. 제 46 항에 있어서, 제 44 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
49. 제 47 또는 제 48 항에 있어서, 제 45 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
50. 제 42 항에 있어서, 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
51. 제 50 항에 있어서, 제 43 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
52. 제 50 항에 있어서, 제 44 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
53. 제 51 항 또는 제 52 항에 있어서, 제 45 항에 따른 추가의 치환을 함유하는 개질 INFα2 서열.
54. 추가의 치환이 제 19 항에서 특정된 것과 같이 정의된 R1 및/또는 R2 및/또는 R3 부분 서열 내에서 하나 이상의 위치에서 이루어지는, 제 1 항에 따른 개질 INFα2 서열.
55. 제 1 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항의 개질 INFα2를 코딩하는 DAN 서열.
56. 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 INFα2 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물.
57. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 INFα2 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조방법:

    (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

    (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여, 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계;

    (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합 또는 펩티드-MHC 복합체의 T 세포에 대한 결합에 의해 결정되는 것과 같은 T 세포 에피토프의 활성을 제거 또는 실질적으로 감소시키는 방식으로 상기 동정된 잠재적인 T 세포 에피토프들 내의 하나 이상의 아미노산을 사용하여 신규 서열 변이체를 고안하는 단계;

    (iv) 재조합 DNA 기술로 상기 서열 변이체를 구축하고, 바람직한 성질을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위하여 상기 변이체들을 시험하는 단계; 및

    (v) 임의로 하기 단계 (ii)~(iv)를 반복하는 단계.
58. 제 57 항에 있어서, 단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1~9 개의 아미노산 잔기들의 치환, 부가 또는 결실에 의해 실시되는 방법.
59. 제 57 항에 있어서, 변경이 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 이루어지는 방법.
60. 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 가 하기 단계에 의해 실시되는 방법: (a) 기지의 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역을 선택하는 단계; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 예비결정된 균일한 크기의 중복 (overlapping) 아미노산 잔기 절편을 순차적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 지정된 값들을 합산함으로써 상기 각 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산하는 단계; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 근거하여, 펩티드의 치료적 이용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변화시키는 개질에 적합한 상기 절편들 중 1 개 이상을 동정하는 단계.
61. 제 60 항에 있어서, 단계 (c)가 하기에 의해, 12~6 의 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 구조 에너지 항목을 포함하도록 변경된 봄 (Boehm) 점수계산 함수를 사용함으로써 실시되는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공하고; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공하고; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델을 선택하고; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하고; (5) 샘플링된 각 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄들을 동정하고; (6) 샘플링된 각 절편에 존재하는 모든 측쇄들에 대한 결합 친화도 값을 결정하고; 상기 각 모델 및 상기 각 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복.
62. 도 1, 도 6a, 도 6b, 도 6c 에 기술된 것과 같은 군으로부터 선택된, 비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13 개의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 분자.
63. 제 19 항에 특정된 것과 같은 R1, R2, R3 부분 서열들 중 임의의 그룹으로부터 선택된, 비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 15 개의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 분자.
64. 제 63 항에 있어서, 도 7 로부터 선택된 펩티드 분자.
65. 제 62 내지 제 64 항 중 어느 한 항에서 특정된 것과 같은 T 세포 에피토프로부터 선택된 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 서열.
66. 비개질 INFα2 의 일차 서열로부터 제조되고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 9 내지 15 개의 연속된 아미노산 잔기들로 이루어지는 펩티드 분자로, 상기 분자는 세포 증식의 생물학적 분석에서 1.8 이상의 자극 지수를 가지며, 상기 지수는 펩티드에 의한 자극 후 점수화된 세포 증식의 값으로서 채택되고, 수용 펩티드 중에 존재하지 않는 대조 세포에서 점수화된 세포 증식의 값에 의해 나누어지고, 여기에서 세포 증식은 표준 방법에 의해 임의의 적합한 수단에 의해 측정되는 것인 펩티드 분자.
67. 제 66 항에 있어서, 도 6 또는 도 7 에 나타낸 것과 같은 서열로 이루어지는 펩티드 분자.
68. 제 66 항에 있어서, 제 19 항에 정의된 것과 같은 임의의 INFα2 부분 서열들 R1, R2, R3 로부터 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기들을 함유하는 펩티드 분자.
69. 제 62 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의, 생체 내에서 사용된 경우 임의의 비개질 분자보다 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, 생물학적 활성은 동일하거나 또는 허용가능한 정도로 감소된 개질 INFα2 분자의 제조에의 용도.
70. 제 62 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 특정된 것과 같은 합성 펩티드 서열, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제로 이루어지는 약학 조성물.