JP2024517476A - 自己免疫を治療するためのｈｌａ対立遺伝子のポケット操作 - Google Patents

Abstract

自己免疫疾患を予防又は治療する方法が開示される。いくつかの場合、自己免疫疾患を有する又はそれを発症するリスクのある対象は、１以上のＨＬＡ遺伝子座に１以上の自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子を有すると同定される。多くの場合、ＨＬＡ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子座、例えば、クラスＩ Ａ、Ｂ、及びＣ、及びクラスＩＩ ＤＱ、ＤＲ、及びＤＰから選択される。多くの場合、自己免疫疾に罹患している又はそれを発症するリスクのある対象に、抗原結合クレフトにその変異型ＨＬＡ分子の抗原結合及び／又は特異性を変化させる少なくとも１つの突然変異を有する変異型感受性対立遺伝子を保有し発現するように改変された複数の操作された自己ＨＳＣを投与することができる。多くの実施形態では、操作されたＨＳＣは、１以上の改変ＨＬＡタンパク質を発現するＣＤ３４＋免疫細胞である。【選択図】なし

Description

開示される組成物、方法、及びシステムは、自己免疫性病態の治療及び予防を対象とする。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１０日に出願された「ＨＬＡ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」と題する米国仮特許出願第６３／１８６，７７０号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益及び優先権を主張するものであり、又その全体が本明細書に援用される。本出願は、「ＨＬＡ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」と題された関連する米国非仮出願、並びに「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＨＬＡ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」、及び「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＬＡ Ａｌｌｅｌｅｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」と題されたＰＣＴ出願と同時に出願されており、これらは本明細書の一部として援用される。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書の一部として援用される。２０２２年 に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、 .txtの名称で、サイズは バイトである。

自己免疫とは、身体の免疫系が健康な組織及び細胞を誤って異物と認識し、それらを攻撃する病的状態を指す。この誤った免疫反応に起因する疾患は、自己免疫疾患、障害又は病態と呼ばれる。関節リウマチ（ＲＡ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、及び多発性硬化症（ＭＳ）等の幾つかの自己免疫疾患は、他の疾患よりも多くみられるが、総体的には、世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼす、重大な公衆衛生問題である。一般的に、自己免疫疾患の患者は、限定されるものではないが、倦怠感、発熱、筋肉痛、関節痛や腫脹、皮膚障害、腹痛、及び消化不良を含む軽度のものから、運動能力の低下、視力低下、及び臓器不全を含み得る重度のものまで、様々な症状に悩まされる。

自己免疫疾患は、様々な分子的、細胞的、及び生理学的基盤を有し得る。一般に、自己免疫は、遺伝的又は環境的要因に起因し得る調節不全の免疫系の結果であり、その結果、対象の免疫系が自己に向く。理想的には、正常な状況下では、健康な免疫系は異物（例えば、微生物、ウイルス、タンパク質、及び核酸）を認識し、撃退する。しかし、これを効果的に行うためには、対象自身の組織、細胞、タンパク質、及び核酸を攻撃しないように訓練する必要がある。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とは、免疫機能に関与するタンパク質をコードする関連遺伝子の一群を指す。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩタンパク質は、Ｔ細胞受容体にペプチドを提示するためのペプチドクレフトを備えた細胞表面タンパク質である。ＨＬＡ遺伝子複合体は、ヒト第６染色体の短腕に存在する。ＨＬＡタンパク質の対立遺伝子は、よく知られた命名法で呼称される。例えば、ＤＲＢ１^*０１：０１：０１：０１は、当業者のＨＬＡ研究者にはよく知られているように、ＨＬＡ複合体のＤＲＢ１遺伝子の対立遺伝子を指し、ＨＬＡ遺伝子の指定の後に「^*」で区切られた最初の２つの値（この例では「０１：０１」）は、対立遺伝子群又はレベル、及びタンパク質配列レベルでの変異を指し、例えば、ＤＲＢ１^*０１：０１とＤＲＢ１^*０１：０２は、ペプチド結合領域において２つのアミノ酸が異なる。３番目のフィールド（ここでは、３番目の「０１」）は、遺伝子コードの縮重により、アミノ酸が変化せず、従って免疫学的に同一である、遺伝子配列の違いを示し、つまり、ＤＲＢ１^*０１：０２：０１はＤＲＢ１^*０１：０２：０２と免疫学的に同一である。最後のフィールド（即ち、最後の「０１」）は、タンパク質のコード領域外（イントロン、プロモーター等）で生じる遺伝子配列の違いを示し、従って、ＤＲＢ１^*０１：０１：０１：０１と仮想的なＤＲＢ１^*０１：０１：０１：０２は、コード配列内では免疫学的レベル及び遺伝子レベルで同一であるが、非コード配列は異なる。この種の変化は、通常、発現レベルに影響を及ぼす可能性がある。従って、本明細書で言及されるように、慣例により、操作されたＨＬＡ対立遺伝子は、一般に最初の２つのフィールドを使用して記述される。

ＨＬＡは自己免疫疾患に関連する主要な遺伝因子であり、既知の遺伝的素因のおよそ半分を占めている。ＨＬＡと疾患との関連は２００以上が記載されているが、その根底にある発症機序まだ十分定義されておらず。ＨＬＡの特定の遺伝的特徴、並びに他の遺伝子及び環境との複雑な相互作用が、この分野における臨床的に意味のあるさらなる発展を妨げてきた。疾患感受性におけるＨＬＡの役割を解明し、理解する必要性が高まっている。

自己免疫疾患の１つである関節リウマチ（ＲＡ）は関節包滑膜の炎症を特徴とし、その結果、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、及びＢ細胞の浸潤が起こる。これにより広範な関節破壊、身体障害、及び生活の質の低下が生じる。ＲＡに関連する持続的な炎症は、虚血性心疾患及び呼吸器疾患の発症リスクも高め、早期の死亡につながる。ＲＡは世界人口のおよそ１％に生じ、米国（ＵＳ）だけでも１３０万人が罹患していると推計される。ＲＡは４０歳を超える女性及び長期喫煙者に多く発症する。年間数十億ドルの直接的な医療費がＲＡの治療に関連しており、ＲＡの年間の社会的総コスト（直接的、間接的及び無形的）は、米国だけでも数百億ドルに達すると推計される。
ＲＡの治療には、患者に適した最適な治療レジメンを決定するために、疾患活動性及び薬剤の副作用を頻繁にモニタリングする体系的なアプローチが必要である。現在、症状を制御し、疼痛を管理し、関節損傷を制限するために、多様な治療薬が承認されている。現在のＲＡ治療薬には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、コルチコステロイド、合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、及び生物学的薬剤がある。ＤＭＡＲＤ治療は、世界的には、ＲＡの進行を阻止するために免疫系の主要な成分を標的とし、寛解を維持するためには持続的な投与が必要である。このため、患者は望ましくない副作用、重篤な感染症、悪性腫瘍、及び臓器毒性を発症するリスクがあり、又、患者は、効果を無効にする生物学的製剤に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生じる可能性がある。更に、およそ６％～２１％の患者は、現在の治療法では、疾病を十分に管理するだけの十分な応答を得ることができない。このような患者は一般に難治性ＲＡ患者と呼ばれる。

自己免疫疾患に対する既存の治療法は、疾患の根本原因ではなく、症状を対象としている。ＲＡのような多くの自己免疫疾患は、ＨＬＡ対立遺伝子のサブセットによって改変された自己ペプチドが提示されることによって発症する。
ＲＡを治癒させるための造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植は、安全に長期寛解をもたらすという点では成功していない。第一に、自家移植は免疫系をリセットするために短期間の化学療法を用い、比較的安全であるが、根本的な問題に対処するのではなく、ＲＡを最初に発症させたのと同じ、問題のある細胞を骨髄に再定着させるだけである。第二に、ＨＬＡが一致したドナーからの同種骨髄移植も、患者の骨髄を置き換えるために同じＨＬＡ対立遺伝子が使用されるため、高い再発率を示す。更に、この技術は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を伴うため、治療戦略としては受け入れがたい。自己ＨＳＣ移植を受けた１５５人のＲＡ患者を含む１７の研究の最近のメタ分析では、寛解は２年以上維持されないことが示された。

米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）は２００５年、米国で２３５０万人もの人々が自己免疫疾患に罹患している可能性があると報告し、多くの場合で治療法がない。治療法がないため、多くの患者が衰弱症状、臓器機能の低下、仕事の生産性の低下、及び高額な医療費に苦しんでいる。必要とされているのは、自己免疫疾患を治療するための効果的な治療法である。
本明細書で、出願者らは、自己免疫疾患に関連するＨＬＡ対立遺伝子を標的とし、この情報を使用して、標的ＨＬＡ対立遺伝子が抗原結合親和性及び／又は特異性を変化させるように操作された１以上の自己ＨＳＣを含むテーラーメード治療法を作出する技術を記載する。

本明細書で、自己免疫疾患の既存の治療及び管理における前述の欠点及び他の欠点に対処するために、出願者らは、疾患に関連するＨＬＡ対立遺伝子を同定及び標的化し、この情報を使用して、標的ＨＬＡ対立遺伝子が自己抗原結合親和性及び／又は特異性を変化させるように操作された１以上の自己ＨＳＣを含むテーラーメード治療を作出する方法を開発した。

本明細書では、自己免疫疾、障害、又は病態に罹患している又はそれを発症するリスクのある対象において自己免疫を低減するのに有用な方法及び組成物が開示される。このような疾患、障害、及び病態としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害（ＭＯＧＡＤ）、筋無力症候群及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、バードショットブドウ膜炎、ナルコレプシー、ナルコレプシー１型（ＮＴ１；以前はカタプレキシーを伴うナルコレプシーと呼称）、川崎病、クローン病、乾癬、皮膚筋炎（ＤＭ）、アジソン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、グレーブス病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎（ＰＭ）、傍腫瘍性神経症候群（ＰＮＳ）、自己免疫性脳炎、狼瘡腎炎（ＬＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、乾癬性関節炎、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、望ましくない遅延型過敏症反応、Ｔ細胞介在性肺疾患、神経炎、白斑、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、喘息、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、肺線維症又は特発性肺線維症、原発性胆汁性肝硬変、及び悪性貧血が挙げられる。様々な自己免疫疾患が、免疫機能に関与するタンパク質をコードする関連遺伝子の一群であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の１以上の対立遺伝子の存在に関連する。ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、Ｔ細胞受容体にペプチドを提示するペプチドクレフトを備えた細胞表面タンパク質である。ＨＬＡ遺伝子複合体は、ヒト第６染色体の短腕に存在する。

一態様において、自己免疫疾患に関連するＨＬＡ対立遺伝子を改変する方法が提供される。このような方法の１つには、自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程；感受性ＨＬＡ対立遺伝子がコードするタンパク質の結合クレフト内の標的アミノ酸位置を同定する工程、上記標的アミノ酸位置は、自己免疫耐性ＨＬＡ対立遺伝子において異なる識別性を有する；標的アミノ酸位置のアミノ酸識別性を自己免疫耐性ＨＬＡ対立遺伝子における同じアミノ酸位置の識別性に改変して改変された自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子を作出する工程、上記改変された自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質は、少なくとも１つの自己ペプチドに対する結合親和性が改変されている、を含む。
本開示の関連の態様では、自己免疫疾に罹患している又はそれを発症するリスクのある対象を治療する方法が提供される。１つのこのような方法には、上記対象のＨＬＡ複合体内の自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程；上記対象から複数のＣＤ３４＋免疫細胞を単離する工程；及びＣＤ３４＋免疫細胞を改変して、改変された自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子を発現する改変されたＣＤ３４＋免疫細胞を作出する工程を含む。改変された自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子は、自己免疫感受性ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して少なくとも１つの自己ペプチドに対する結合親和性が改変されているタンパク質をコードする。

本開示による特定の実施形態では、操作された自己ＨＬＡを発現する造血系細胞で治療可能な、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質による抗原提示に関連する自己免疫性病態を同定するための方法が提供される。多くの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子座は、クラスＩ Ａ、Ｂ、及びＣ、及びクラスＩＩ ＤＰ、ＤＲ、及びＤＱから選択される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子、対立遺伝子、及びタンパク質としては、ＨＬＡ－Ａ^*０２、ＨＬＡ－Ａ^*０３、ＨＬＡ－Ａ^*２９、ＨＬＡ－Ｂ^*０７、ＨＬＡ－Ｂ^*０８、ＨＬＡ－Ｂ^*２７、Ｂ^*２７：０３ Ｂ^*２７：０５、Ｂ^*２７：０９、ＨＬＡ－Ｂ^*５１、ＨＬＡ－Ｂ^*５４、ＨＬＡ－Ｂ^*５７、ＨＬＡ－Ｃ^*０６、ＨＬＡ－Ｃ^*１８、ＨＬＡ－ＤＰＡ１^*０２、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^*１３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１^*０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１^*０３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１^*０５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^*０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^*０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^*０６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０８、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*１１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*１５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*１６、及びこれらＨＬＡの変異体のうち１以上を含み得る。開示される方法は、特定の実施形態において、特定の自己免疫疾患に対する感受性に関連する１以上のＨＬＡ対立遺伝子（感受性対立遺伝子）及び同じＨＬＡ遺伝子の、特定の自己免疫疾患に対する耐性に関連する１以上の対立遺伝子（耐性対立遺伝子）を同定する工程、ＨＬＡ遺伝子の抗原結合グルーブ内の１以上の可変アミノ酸位置を同定する工程を含み、上記感受性対立遺伝子の可変アミノ酸位置は第１の識別性（first identity）を有し、上記耐性対立遺伝子の可変アミノ酸位置は第２の識別性（second identity）を有する。

本開示の特定の実施形態は、一つには、特定の自己免疫疾患と特定のＨＬＡ対立遺伝子の間の因果関係の発見を前提としている。例えば、特定の実施形態は、１型糖尿病とＤＱＢ１^*０２及び／又はＤＱＢ１^*０３、特に、ＤＱＢ１^*０２：０１及び／又はＤＱＢ１^*０３：０２との関連に基づいている。いくつかの実施形態では、関節リウマチは、ＤＲＢ１^*０４及びＤＲＢ１^*０１、特に、ＤＲＢ１^*０４：０１、ＤＲＢ１^*０４：０５、及びＤＲＢ１^*０１：０１に関連している。いくつかのこのような実施形態では、多発性硬化症は、ＤＲＢ１^*１５、特に、ＤＲＢ１^*１５：０１に関連している。いくつかのこのような実施形態では、セリアック病は、ＤＱＢ１^*０２、特に、ＤＱＢ１^*０２：０１に関連している。いくつかのこのような実施形態では、ＮＭＯは、ＤＲＢ１^*０３、特に、ＤＲＢ１^*０３：０１に関連している。いくつかのこのような実施形態では、ベーチェット症候群は、Ｂ^*５１又はＢ５１に関連している。いくつかの場合、乾癬は、Ｃ^*０６、Ｂ^*５７、ＤＲＢ１^*０７、及び／又はＤＱＢ１^*０３に関連している可能性がある。いくつかの場合、バードショットブドウ膜炎は、Ａ^*２９に関連している可能性がある。いくつかの場合、ナルコレプシーは、ＤＱＢ１^*０６、特に、ＤＱＢ１^*０６：０２に関連している可能性がある。いくつかの場合、重症筋無力症は、Ａ^*０３、Ｂ^*０７、ＤＲ２（ＤＲＢ１^*１５及び／又はＤＲＢ１^*１６）及び／又はＤＲ４（ＤＲＢ１^*０４）に関連している可能性がある。いくつかの場合、川崎病は、Ｂ^*５４、特に、アミノ酸位置９１、１０４、及び３２９に関連している可能性がある。いくつかの場合、炎症性腸疾患は、ＤＲＢ１^*０１、特に、ＤＲＢ１^*０１：０３に関連している可能性がある。いくつかの場合、全身性硬化症は、ＤＲＢ１^*１１、ＤＰＢ１^*１３、Ｂ^*０８、ＤＱＡ１^*０２：０１、ＤＱＡ１^*０５、ＤＲＢ１^*０８、ＤＲＢ１^*０７、ＤＰＡ１^*０２、ＤＱＢ１^*０３、特に、ＤＲＢ１^*１１：０４、ＤＰＢ１^*１３：０１、Ｂ^*０８：０１、ＤＱＡ１^*０２：０１、ＤＱＡ１^*０５：０１、ＤＲＢ１^*０８：０１、ＤＲＢ１^*０７：０１、ＤＰＡ１^*０２：０１、ＤＱＢ１^*０３：０１に関連している可能性がある。

又、本明細書では、自己免疫性病態を治療又は予防するのに有用な化合物及び組成物も開示される。多くの実施形態では、開示される化合物及び組成物は、改変されたＨＬＡ対立遺伝子を含む１以上の操作された免疫細胞を含む。ほとんどの実施形態では、改変されたＨＬＡ対立遺伝子は、編集されたタンパク質分子であり、改変されたＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨＬＡタンパク質のペプチド結合クレフト内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。他の実施形態では、改変されたＨＬＡ対立遺伝子は、編集されたＨＬＡタンパク質をコードする編集された核酸分子であり、編集された核酸は、編集されたＨＬＡタンパク質のペプチド結合クレフト内にアミノ酸突然変異をコードする少なくとも１つのコドンを含む。ほとんどの実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｔ細胞受容体界面にない。多くの実施形態では、改変されたＨＬＡ対立遺伝子は、操作された免疫細胞に保有されるか、含まれるか、又は操作された免疫細胞により発現される。多くの実施形態では、操作された免疫細胞は自己細胞であり、即ち、それらは自己免疫疾患が治療される対象から取得される。多くの実施形態では、操作された免疫細胞は、組成物、例えば、自己免疫疾患に罹患している又はそのリスクがある対象に投与される治療用組成物内に含まれ得る。多くの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＨＳＣであり得る。

更に、開示される化合物及び組成物を作製する方法が開示される。多くの実施形態では、これらの方法は、特定の自己免疫疾患の高い罹患率に関連する１以上のＨＬＡ遺伝子を同定すること、特定の自己免疫疾患に対する感受性に関連するＨＬＡ遺伝子の１以上の対立遺伝子（感受性対立遺伝子）及び／又は耐性に関連する１以上の対立遺伝子（耐性対立遺伝子）を同定すること、ＨＬＡ分子の抗原結合グルーブ内の１以上の可変アミノ酸位置を同定することを含み、上記感受性対立遺伝子の可変アミノ酸位置は第１の識別性を有し、上記耐性対立遺伝子の可変アミノ酸位置は第２の識別性を有する。特定の実施形態では、開示される化合物を作製する方法は、上記感受性対立遺伝子の操作されたＨＬＡ分子を作出することを更に含み、上記可変位置のアミノ酸の識別性は第２の識別性である。いくつかの実施形態では、操作されたＨＬＡ分子は、発現ベクター又は操作されたゲノム配列によりコードされる。

又、開示される療法を必要とする対象を治療する様々な方法も開示され、治療は、ＭＨＣ抗原結合領域（例えば、ＨＬＡタンパク質の抗原結合グルーブ）内に少なくとも１つの変異型アミノ酸を有する１以上の操作された抗原提示細胞の投与を含む。多くの実施形態では、治療方法は、ドナーから１以上の細胞を単離することを含む。多くの実施形態では、単離された細胞はＨＳＣである。多くの実施形態では、この方法は、ＨＳＣを改変して操作されたＨＳＣを作出する工程を更に含む。操作されたＨＳＣは、自己抗原又は変異体自己抗原に対する結合特異性又は親和性が変化している操作されたＨＬＡ対立遺伝子（編集されたＨＬＡ対立遺伝子、変異型ＨＬＡ対立遺伝子、改変されたＨＬＡ対立遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＨＳＣは、ゲノム配列に操作されたＨＬＡ対立遺伝子をコードする１以上の核酸配列又は操作されたＨＬＡ対立遺伝子をコードする核酸配列を含む１以上の発現ベクターを含む。多くの実施形態では、改変されたＨＳＣは、対象の骨髄に生着し、１以上の改変された抗原提示細胞を産生する可能性がある。

本明細書では、自己免疫疾患を発症するリスクがある又はそれに罹患している対象を治療するための様々な組成物が開示される。代表的な特定の実施形態では、組成物は、配列番号５９～９６からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。
本開示によるいくつかの特定の実施形態では、自己免疫疾患に対する感受性は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、例えば、ＤＲＢ１^*０１、ＤＲＢ１^*０３、ＤＲＢ１^*０４、ＤＲＢ１^*０７、ＤＲＢ１^*０９、ＤＲＢ１^*１０、ＤＲＢ１^*１１、ＤＲＢ１^*１２、ＤＲＢ１^*１３、ＤＲＢ１^*１４、ＤＲＢ１^*１５、及びＤＲＢ１^*１６に関連する。多くの実施形態では、自己免疫疾患は、ＤＲＢ１^*０１：０１、ＤＲＢ１^*０１：０２、ＤＲＢ１^*０１：０３、ＤＲＢ１^*０３：０１、ＤＲＢ１^*０４：０１、ＤＲＢ１^*０４：０２、ＤＲＢ１^*０４：０３、ＤＲＢ１^*０４：０４、ＤＲＢ１^*０４：０５、ＤＲＢ１^*０４：０８、ＤＲＢ１^*０７：０１、ＤＲＢ１^*０９：０１、ＤＲＢ１^*１０：０１、ＤＲＢ１^*１１：０１、ＤＲＢ１^*１１：０２、ＤＲＢ１^*１１：０３、ＤＲＢ１^*１２：０１、ＤＲＢ１^*１３：０１、ＤＲＢ１^*１４：０１、ＤＲＢ１^*１５：０１、ＤＲＢ１^*１５：０２、及びＤＲＢ１^*１６：０１から選択されるＨＬＡ－ＤＲＢ１の対立遺伝子に関連する。関連の実施形態では、組成物は、Ｌ６７、Ｑ７０、Ｖ８５、Ｇ８６、Ｒ７１（アミノ酸の位置はebi.ac.uk/ipd/imgt/hlaに示されるような成熟タンパク質配列に関するものである）、及びこれらの組合せから選択される位置に突然変異、例えば、限定されるものではないが、Ｌ６７Ｉ、Ｑ７０Ｄ、Ｖ８５Ａ、Ｇ８６Ｖ、Ｒ７１Ｅ、及びこれらの組合せを含むＤＲＢ１^*０１：０１タンパク質又はそのＤＮＡコード領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、位置Ｖ８６に突然変異、例えば、Ｖ８６Ｌ又はＶ８６Ｍを含む変異型ＤＲＢ１^*０３：０１タンパク質又はコード領域を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、位置Ｒ７１に突然変異、例えば、Ｒ７１Ｅを含む変異型ＤＲＢ１^*０４：０３、ＤＲＢ１^*０４：０４ ＤＲＢ１^*０４：０５、及びＤＲＢ１^*０４：０８タンパク質又はコード領域を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、位置Ｖ８６に突然変異、例えば、Ｖ８６Ｌ又はＶ８６Ｍを含む変異型ＤＲＢ１^*１３：０１タンパク質又はコード領域を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、位置Ｆ４７、Ａ７１、又はＶ８６に、突然変異例えば、Ｆ４７Ｙ、Ａ７１Ｒ、Ｖ８６Ｌ、Ｖ８６Ｍ、及びこれらの組合せを含む変異型ＤＲＢ１^*１５：０１タンパク質又はコード領域を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、自己免疫疾患に対する感受性は、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、又はＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ３^*０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３^*０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ３^*０３、ＤＲＢ４^*０１、及びＤＲＢ５^*０１に関連する。例えば、特定の実施形態では、自己免疫疾患は、ＤＲＢ３^*０１：０１、ＤＲＢ３^*０２：０２、ＤＲＢ３^*０３：０１、ＤＲＢ４^*０１：０１、ＤＲＢ４^*０１：０３、及びＤＲＢ５^*０１：０１から選択されるＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５の対立遺伝子に関連する。
本開示による更なる実施形態では、自己免疫疾患に対する感受性は、ＨＬＡ－ＤＱＡ及び／又はＨＬＡ ＤＱＢ遺伝子に関連する。例えば、特定の実施形態では、自己免疫疾患は、ＨＬＡ－ＤＱＡ１の、及び／又はＤＱＡ１^*０１、ＤＱＡ１^*０３、ＤＱＡ１^*０５、ＤＱＢ１^*０２、ＤＱＡ１^*０３、ＤＱＢ１^*０５、ＤＱＢ１^*０６、及びこれらの組合せ、例えば、ＤＱ５、ＤＱＡ１^*０１：０１及びＤＱＢ１^*０５：０１；ＤＱ６、ＤＱＡ１^*０１：０２及びＤＱＢ１^*０６：０２；ＤＱ２、ＤＱＡ１^*０５：０１及びＤＱＢ１^*０２：０１；ＤＱ２トランス、ＤＱＡ１^*０３：０１及びＤＱＢ１^*０２：０１；ＤＱ８、ＤＱＡ１^*０３：０１及びＤＱＢ１^*０３：０２；ＤＱ８トランス、ＤＱＡ１^*０５：０１及びＤＱＢ１^*０３：０２；ＤＱＡ１^*０５：０５及びＤＱＢ１^*０３：０１；及びＤＱＡ１^*０３：０１及びＤＱＢ１^*０３：０１から選択される対立遺伝子に関連する。いくつかのこのような実施形態では、少なくとも１つの改変型又は変異型ＨＬＡは、抗原結合グルーブ内に、例えば、位置５７又は７１に少なくとも１つの置換を有するように操作され、突然変異はＡ５７Ｄ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ７１Ｔ、又はこれらの組合せである。

本開示による更なる実施形態では、自己免疫疾患に対する感受性は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子に関連する。例えば、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、Ｂ２７の、及び／又はＢ^*２７：０３ Ｂ^*２７：０５、及びＢ^*２７：０９から選択される対立遺伝子に関連する。多くの実施形態では、突然変異は、抗原結合グルーブ内の任意の多形性の位置から選択される位置、例えば、位置５９又は１１６であってよく、突然変異はＹ５９Ｈ、Ｄ１１６Ｈ、又はこれらの組合せである。
本明細書では更に、変異した場合に、自己免疫に対する感受性又は自己免疫の症状を低減又は排除するのに有用であり得るＨＬＡ対立遺伝子の位置を同定するための方法が開示される。これらの方法は、多くの実施形態において、自己免疫疾患に罹患しているの個人のコホートを比較すること、疾患感受性に関連する特定のＨＬＡ遺伝子対立遺伝子（感受性対立遺伝子）を同定すること、疾患耐性に関連する特定のＨＬＡ遺伝子対立遺伝子（耐性対立遺伝子）を同定すること、ＨＬＡ分子の抗原結合グルーブ内の耐性対立遺伝子と感受性対立遺伝子の間に位置する多形性のアミノ酸位置、即ち、耐性対立遺伝子でのアミノ酸識別性が感受性対立遺伝子での識別性と異なる位置を同定することを含む。一例として、抗原結合グルーブ内に位置するＤＲＢ１遺伝子の残基には、８～１４、１６、２５～２６、２８、３０～３３、３７～３８、４０、４７、５７～６０、６７、７０～７１、７３～７４、７７～７８、８５～８６、及び９３が含まれる。関連の実施形態では、これらの方法は、多形性の位置に耐性対立遺伝子のアミノ酸識別性を含むように感受性対立遺伝子を操作することを更に含む。本開示による特定の実施形態では、１以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でこのような１又は複数の操作されたＨＬＡ分子を発現させると、対象の自己免疫疾患が抑制、治療、又は改善される。

又、本明細書では、非操作ＨＬＡ分子と比較して抗原結合及び／又は特異性が変化している操作されたＨＬＡ分子も開示される。多くの実施形態では、抗原は、改変されたペプチド、シトルリン化ペプチド、ハイブリッドペプチド、核酸等を含む様々なペプチドから選択され得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッドペプチドは、ハイブリッドインスリンペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰＰ、ＬＶＲＹＷＩＳＡＦＰ、ＦＦＲＤＨＳＹＱＥＥＡ、ＡＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ、ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ、ＧＱＶＥＬＧＧＧＮＡＶＥＶＬＫ、ＧＱＶＥＬＧＧＧＳＳＰＥＴＬＩ、ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ、ＨＬＶＥＥＬＹＬＶＡＧＥＥＧ、ＡＭＭＩＡＲＦＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ、ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ、ＲＳＱＶＥＴＤＤＬＩＬＫＰＧＶ、ＳＱＶＥＴＤＤＬＩＬＫＰＧＶＶ、ＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥ、ＩＦＤＳＲＧＮＰＴＶＥＶＤＬＦ、ＩＦＤＳ｛ＣＩＴ｝ＧＮＰＴＶＥＶＤＬＦ、ＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲ、ＳＡＶＲＬ｛ＣＩＴ｝ＳＳＶＰＧＶＲ、ＱＤＦＴＮＲＩＮＫＬＫＮＳ、ＱＤＦＴＮ｛ＣＩＴ｝ＩＮＫＬＫＮＳ、ＡＴＥＧＲＶＲＶＮＳＡＹＱＤＫ、ＡＴＥＧ｛ＣＩＴ｝ＶＲＶＮＳＡＹＱＤＫ、ＡＴＩＫＡＥＦＶＲＡＥＴＰＹＭ、ＡＴＩＫＡＥＦＶ｛ＣＩＴ｝ＡＥＴＰＹＭ、ＡＶＲＬＱＧＳＶＡＧＶＲ、ＰＹＨＦＫＹＨＥＫＨＦＡＮＡＩ、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ、ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ、及びこれらの組合せから選択され、ここで、｛ＣＩＴ｝は脱イミノ化アルギニン残基を示し、これはシトルリン化残基と呼称することもできる。

又、ＨＬＡ対立遺伝子の結合クレフト内のポケットを閉塞する方法も開示され、これらの方法は、感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程、及び抗原結合クレフトのポケット又はその付近の標的アミノ酸位置を同定する工程を含み、ポケットは抗原結合クレフトの底部の凹部を画定する。これらの方法は、標的アミノ酸よりも大きな側鎖を有するアミノ酸を置換して閉塞ＨＬＡ対立遺伝子を作出すること、第２のアミノ酸の側鎖は抗原結合クレフトの底部の凹部に伸びる、それにより、ＨＬＡ対立遺伝子のポケットを閉塞することを更に含み得る。様々な実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５から選択することができ、ポケットはポケット１であり得る。これらの実施形態では、標的アミノ酸は例えば位置８６であり得、置換アミノ酸の識別性は、バリン、メチオニン、及びロイシンから選択され得る。多くの実施形態では、ポケットが閉塞しているＨＬＡタンパク質は、任意選択で、自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの自己ペプチドに対してより低い結合親和性を有してよく、少なくとも１つの自己ペプチドは脱イミノ化され、更に任意選択で、標的アミノ酸はＴ細胞受容体結合界面にない。

本開示を通じて、様々な刊行物が参照され得る。これらの刊行物の開示は、これらの全体が法律で認められる限り、本出願の一部として援用される。
本開示は、当業者が本開示を実施するのに十分である。記載の実施形態は本開示の特定の態様の例示として意図され、機能的に等価であるいずれの構築物も本開示の範囲内にあるため、本開示は記載の構築物によって範囲が限定されない。
特許又は出願ファイルには，カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開公報の写しは、請求して必要な手数料を支払えば特許庁から提供される。
実施形態は、添付図面と共に以下の詳細な説明を読めば容易に理解されるであろう。実施形態は、添付図面において例示として示され、これらに限定されない。

図１は、自己免疫における様々な経路、相互作用、及び薬学的介入の模式図である。 図２は、マウスＴＣＲ／ＣＤ４と操作されたヒト化ＨＬＡ－ＤＲ４／Ｉ－Ｅ^dの相互作用を示す模式図であり、下は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖により検出した場合のコラーゲン感作に関する試験から得られた結果のグラフであり、記号は、個々のヒト化ＤＲＢ１^*０４：０１、ＤＲＢ１^*０１：０１及びＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eマウス由来サンプルを示し、バーは平均を示す。データは一元配置ＡＮＯＶＡにより分析されたものである。 図３Ａは、クレフト内のＤＲＢ１^*０４：０１同定位置Ｋ７１及びコラーゲンペプチドにより占められた抗原結合クレフトの三次元表示であり（左）、右の図はＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eの構造及びコラーゲンペプチド結合が存在しない場合を示し、酸性残基を青で示し、塩基性残基を赤で示す。 図３Ｂは、０日目と９日目の代表的マウスのＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントの皮膚移植片を示し、１５～１８日目の全てのマウスを示す。右下のパネルに、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E移植片（７０日目）の長期移植を示す。赤いかさぶたは移植片の拒絶を示す。 図４は、本開示の実施形態によるＤＲＢ１^*０１：０１、ＤＲＢ１^*１１：０１及びＤＲＢ１^*１５：０１成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図５は、ＤＲＢ１^*０１：０１、^*１５：０１及び^*１１：０１対立遺伝子の抗原結合試験を示し、ボックスの左上の数字は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現しない、従ってペプチド結合のない細胞（陰性対照）と比較したペプチドの結合比である。 図６は、自己免疫性脱髄関連ペプチドのＤＲＢ１^*１５：０１及び１５：０２単一及び二重変異実施形態への結合を示し、ボックスの左上の数字は、陰性対照（薄いグレー）と比較した結合比である。 図７は、自己免疫性脱髄関連ペプチドのＤＲＢ１^*１５：０１対立遺伝子への結合及び位置７１と８６における編集効果を示し、ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図８は、本開示の実施形態によるＤＲＢ１^*０３：０１、ＤＲＢ１^*０７：０１、及びＤＲＢ１^*０９：０１成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図９は、アクアポリン４ペプチド５及び６のＤＲＢ１^*０３：０１及びＤＲＢ１^*０７：０１への結合を示す。 図１０は、本開示の実施形態による^*０４：０１及び^*０４：０５成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図１１は、本開示の実施形態による、関節リウマチに関連する３つのペプチドのＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５対立遺伝子への結合及びＲ７１Ｅ編集の効果を示す。ボックスの右上の比は、陰性対照（コラーゲン）との比較又は天然型のビメンチン及びα－エノラーゼとの比較を示す。 図１２は、複数の濃度にわたるＨＩＰ８－ＮＰＹペプチドの天然とＡ５７Ｄへの結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１３は、複数の濃度にわたるＨＩＰ１１－Ｃペプチドの天然とＡ５７Ｄへの結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１４は、複数の濃度にわたるインスリンミモトープの天然とＡ５７Ｄ結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１５（上）は、ＤＱ２ Ｔ２細胞株が親ＥＢＶ株よりも遙かに良好にＥ２ Ｔ細胞クローンを刺激することを示す。Ａ５７Ｄ変異を導入するとＥ２ Ｔ細胞の刺激が低下する、ＤＱ２及びＤＱ２ Ａ５７Ｄを有するＥ２ Ｔ細胞の、１０ｕＭ及び２０ｕＭの前負荷濃度のＨＩＰ１１ペプチドでの刺激、黒丸はＤＱ２であり、白丸はＤＱ２ Ａ５７Ｄであり、菱形は患者ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株であり、（下）は、ＤＱ２トランス及びＤＱ２トランス Ａ５７Ｄを有するＥ２ Ｔ細胞の、１０ｕＭ及び２０ｕＭ前負荷濃度のＨＩＰ１１ペプチドでの刺激を示し、黒丸はＤＱ２トランスであり、白丸はＤＱ２トランス Ａ５７Ｄであり、菱形は患者ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株である。 図１６は、様々なＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合ハイブリッドインスリンペプチドを示し、ボックスの左上の数字は結合比である。 図１７は、本開示の実施形態による様々なＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合糖尿病誘発ペプチドを示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図１８は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０３：０１、^*０４：０１及び^*１５：０１へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上角の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図１９は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０３：０１、^*０４：０１及び^*１５：０１への糖尿病誘発ペプチド及びインフルエンザ血球凝集素ペプチドの結合を示す。ボックスの左上角の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２０は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５対立遺伝子へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。これらの対立遺伝子の「一般的な」血清学的名称（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ５２）は対立遺伝子名の上に示されている。 図２１は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５対立遺伝子への糖尿病誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２２は、本開示の実施形態による、遺伝子編集されたＨＬＡ分子による結合を検討するために本試験で使用した様々な抗原の一覧である。 図２３Ａは、本開示の実施形態による、ポケット１の位置を示すＤＲＢ１構造の三次元表示とアミノ酸化学の二次元表示である。 図２３Ｂは、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の対立遺伝子の抗原結合試験を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２４は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の２つの対立遺伝子へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２５は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の対立遺伝子への神経自己免疫性ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２６は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１及びポケット１変異で操作された本開示の対立遺伝子への関節炎誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、天然ペプチドと比較したシトルリン化ペプチドの結合比である。 図２７は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１及びポケット１変異で操作された本開示の対立遺伝子への天然及びシトルリン化関節炎誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２８は、本開示の実施形態による、代表的ＨＬＡ対立遺伝子、アミノ酸位置、及び変異の一覧である。

本明細書では、自己免疫疾患に罹患している又はそれを発症するリスクのある対象において自己免疫疾患を治療、軽減、又は排除するのに有用な様々な方法及び組成物が開示される。このような自己免疫疾患としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害（ＭＯＧＡＤ）、筋無力症候群及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、バードショットブドウ膜炎、ナルコレプシー、ナルコレプシー１型（ＮＴ１；以前はカタプレキシーを伴うナルコレプシーと呼称）、川崎病、クローン病、乾癬、皮膚筋炎（ＤＭ）、アジソン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、グレーブス病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎（ＰＭ）、傍腫瘍性神経症候群（ＰＮＳ）、自己免疫性脳炎、狼瘡腎炎（ＬＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、乾癬性関節炎、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、望ましくない遅延型過敏症反応、Ｔ細胞介在性肺疾患、神経炎、白斑、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、喘息、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、肺線維症又は特発性肺線維症、原発性胆汁性肝硬変、及び悪性貧血が挙げられる。

本開示による特定の実施形態では、開示される自己免疫疾患は、１以上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子の存在と相関している。出願者らは、本明細書に自己免疫疾患に罹患している対象において自己免疫疾患の１以上の症状を改善するのに有用な方法及び化合物を記載する。多くの実施形態では、これらの方法は、対象の抗原提示細胞により発現される自己免疫性感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定すること、感受性ＨＬＡ対立遺伝子のアミノ酸配列と同じ自己免疫疾患に対する耐性に関連する１以上のＨＬＡ対立遺伝子を比較することを含み得る。ほとんどの実施形態では、造血幹細胞が動員され、対象から単離され、感受性ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質の抗原結合クレフト内に１以上のアミノ酸置換を含む操作されたＨＬＡ対立遺伝子で改変又は置換され、置換アミノ酸の特定の識別性は、耐性に関連するＨＬＡ対立遺伝子の同じアミノ酸位置の識別性と一致する。

特定の実施形態では、ＨＬＡ遺伝子のクレフトを提示する抗原の標的化操作は、１以上の自己抗原に対する結合特異性及び／又は親和性を改変する。ほとんどの実施形態では、ＴＣＲ尋問から隠されているクレフト内の単一のアミノ酸が、ＴＣＲ結合に直接影響を及ぼさずにペプチド結合を変化させるように変異される。ほとんどの実施形態では、開示されるＨＬＡ突然変異は、患者において拒絶反応又はＧＶＨＤを惹起できないＨＬＡタンパク質変化をもたらす。ほとんどの実施形態では、自己免疫疾患に罹患している対象の１以上の抗原提示細胞での操作されたＨＬＡタンパク質の発現は、自己免疫疾患に関連する１以上の症状の改善をもたらし得る。

又、ＨＬＡ対立遺伝子の結合クレフト内のポケットを閉塞する方法も開示され、これらの方法は、感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程、及び抗原結合クレフトのポケット又はその付近の標的アミノ酸位置を同定する工程を含み、ポケットは抗原結合クレフトの底部の凹部を画定する。これらの方法は、標的アミノ酸よりも大きな側鎖を有するアミノ酸を置換して閉塞ＨＬＡ対立遺伝子を作出すること、第２のアミノ酸の側鎖は抗原結合クレフトの底部の凹部に伸びる、それにより、ＨＬＡ対立遺伝子のポケットを閉塞することを更に含み得る。様々な実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５から選択することができ、ポケットはポケット１であり得る。これらの実施形態では、標的アミノ酸は例えば位置８６であり得、置換アミノ酸の識別性は、バリン、メチオニン、及びロイシンから選択され得る。多くの実施形態では、ポケットが閉塞しているＨＬＡタンパク質は、自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの自己ペプチドに対してより低い結合親和性を有してよく、任意選択で少なくとも１つの自己ペプチドは脱イミノ化され、更に任意選択で、標的アミノ酸はＴ細胞受容体結合界面にない。
出願者の現在の概念は、図１の図に示されている。ＨＬＡ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相互作用は、多くの自己免疫疾患、例えば上記のものの病因における中心的な側面である。自己免疫疾患を標的とする現在の生物学的薬剤は、このシグナルから下流の自然経路および適応経路を標的として遮断する傾向がある。これらの経路は無数の病原体に対する防御免疫応答に関与しており、それらを遮断する又は変化させると、患者は様々な日和見感染のリスクに曝されるので、このことは問題である。

ＡＰＣは、骨髄内のＨＳＣ前駆細胞に由来する。今回記載される操作されたＨＳＣは、自己免疫につながる抗原を提示する対象ＡＰＣに取って代わる。操作されたＨＳＣは変化したＨＬＡ分子を発現し、自己反応性ＣＤ４⁺Ｔ細胞の事前の活性化並びに慢性炎症性サイトカイン産生、マクロファージ活性化、及びＢ細胞自己抗体産生に対するその後の影響を軽減、抑制、及び／又は解消する。
よって、本開示の一態様において、出願者らは本明細書で、今回記載するような編集されたＨＬＡタンパク質を含む操作された自己ＨＳＣを用いて自己免疫疾患を治療する能力を提供する。開示される方法は有利には、患者の免疫系の他の側面への広範な影響を避けつつ患者の自己免疫疾患の基礎にある病因を特異的に標的とする。

単球、マクロファージ、及び樹状細胞（ＤＣ）は、多くの自己免疫疾患において病態の発症と維持を助ける主要なＡＰＣである。例えば、ＲＡでは、これらの細胞は関節の炎症亢進状態を持続させ、疼痛及び疾患の衰弱性の関節損傷の進行を伴う。しかし、これらの細胞は短命であり、定期的に骨髄中のＣＤ３４⁺ＨＳＣから補充されなければならない。例えば、単球は通常、血液中で数日間しか生存しない。しかし、単球が炎症を起こしている関節に移動すれば、単球は単球由来のＤＣ及びマクロファージに移行し、数週間～数か月生存する可能性がある。従って、出願者らの本開示は、患者の骨髄のサブセットを、もはや自己免疫原性抗原を提示しない新たな操作された単球、マクロファージ及びＤＣを産生する操作されたＨＳＣに置き換えることで、Ｔ細胞の活性化を抑制し、及び／又は自己反応性Ｔ細胞を休止記憶状態に戻すことを記載している。
本開示の方法、組成物、及びシステムは、一般に、操作されたＨＳＣを注入する前に患者のＴ細胞及びＢ細胞を枯渇させることを含まない。従って、本開示の治療方法は、微生物病原体による感染及び認識腫瘍抗原に対する患者の正常な自然免疫及び適応免疫を保持する。

操作されたＨＳＣによる発現のためのＨＬＡ対立遺伝子、位置、及び変異の選択
本明細書には、操作されたＨＳＣによる発現のために、ＨＬＡ対立遺伝子、それらの対立遺伝子内の標的アミノ酸の位置、及びそれらの位置における変異を選択するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、開示される方法、組成物、及びシステムは、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子、位置、及び／又は変異を選択及び同定すること、上記対立遺伝子を改変して、非改変ＨＬＡ対立遺伝子と比較して少なくとも１つの自己抗原に対する結合親和性が変化した操作されたＨＬＡ対立遺伝子を作出することを含み得る。多くの実施形態では、操作されたＨＬＡ対立遺伝子は、開示された療法により治療される患者の操作された造血系細胞により発現される。

開示される方法は、自己免疫の高いリスクに密接に関連するＨＬＡ対立遺伝子（感受性対立遺伝子又は感受性ＨＬＡ対立遺伝子と呼ぶことができる）を同定及び／又は選択することを含み得る。特定の実施形態では、感受性ＨＬＡ対立遺伝子は、特定の自己免疫疾患を有する患者の約５％超、例えば、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％超、又は約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％に見られる。多くの実施形態では、感受性ＨＬＡ対立遺伝子は、より低パーセンテージの、例えば、約３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満の、同定された自己免疫疾患に罹患していない個人（即ち、対照集団又は対照）に見られ得る。

ＲＡの場合、ＤＲＢ１^*０４：０４、ＤＲＢ１^*０１：０１又はＤＲＢ１^*０４：０１が、操作のためのＨＬＡ対立遺伝子として選択され得る。例えば、いくつかのＤＲＢ１対立遺伝子が位置７１にアルギニンを含み、ＲＡを発症する高いリスクがあるが、それらは比較的まれである。ＤＲＢ１^*０１：０１は、ＲＡ患者に１３％の対立遺伝子頻度で見られ、対照の９．７％と比較して、これらの他の「共有エピトープ」の中でも最も多い。対立遺伝子ＤＲＢ１^*０４：０３（０．６％）、^*０４：０４（９．１％）、^*０４：０５（１．２％）、^*０４：０８（１．７％）及び^*１０：０１（２％）は全て、ＲＡ患者間ではまれである。対照的に、ＤＲＢ１^*０４：０１は、ＲＡ患者の３１％に見られる（対照の１０％と比較、ρ＝１０^-3）。ＤＲＢ１^*０４：０１の頻度は、疾患の重症度とともに増加し、難治性ＲＡ患者では５０％超、最も重症型のＲＡ（フェルティ症候群）では８８％である。又、ＤＲＢ１^*０４：０１はＲＡに対する最も高い感受性を示す。

開示される方法は、操作されたＨＬＡ対立遺伝子を作出するために変異させる感受性ＨＬＡ対立遺伝子内の標的アミノ酸位置を同定及び／又は選択することを含み得る。特定の実施形態では、選択された標的アミノ酸位置（１）は、ＨＬＡタンパク質の構造コアに埋もれておらず、（２）ＨＬＡタンパク質の抗原結合クレフト又はその付近に位置し、（３）グルーブ／クレフト内にあって、Ｔ細胞受容体に直接接近できず、即ち、ＴＣＲ：ＨＬＡ結合界面になく、及び／又は（４）操作されたＨＬＡ対立遺伝子に対する少なくとも１つの抗原の結合親和性が変化している。多くの実施形態では、選択された感受性ＨＬＡ対立遺伝子分子によりコードされるタンパク質の、開示される標的アミノ酸位置は、同じＨＬＡ遺伝子の感受性に関連しない別の対立遺伝子とは異なる識別性を有し得る。その代わりに、この他のＨＬＡ対立遺伝子は、同じ自己免疫疾患に対する耐性に関連している可能性があり；このＨＬＡ対立遺伝子は、耐性ＨＬＡ対立遺伝子と呼ぶことができる。例えば、ＲＡ関連感受性ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１^*０４：０１の成熟タンパク質の位置７１の標的アミノ酸はリシンであるが、ＲＡ関連耐性ＨＬＡタンパク質では、ＤＲＢ１^*０４：０２の位置７１はグルタミン酸である。

特定の実施形態によれば、ＨＬＡの操作は、ＨＬＡ不一致の結果を最小化する又は完全になくすために最適化される。同種骨髄移植のレシピエントでは、いかなるＨＬＡ不一致も移植不全（拒絶反応）及びＧＶＨＤのリスクを増加させるので、本明細書に記載される特定の実施形態は、ＨＬＡ分子の抗原結合グルーブ／クレフト内の変異を含む。例えば、ＤＲＢ１^*０４：０１のＫ７１の位置は、ＨＬＡ分子の上面（ＴＣＲ相互作用面）の下にあり、ＴＣＲに直接接触しない。従って、ＤＲＢ１^*０４：０１におけるＫ７１の変異は、直接的な同種反応性を誘導する可能性は低い。特定の実施形態において、適切な操作部位は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング、ペプチド結合の解析、及び／又は操作されたＨＳＣにより惹起されるＴ細胞応答のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価等によって、Ｔ細胞応答を惹起できないことに基づいて評価される。

本明細書には、抗原結合を変化させるには十分であるが、拒絶反応を惹起しない編集されたＨＬＡ対立遺伝子を作製するための方法が記載される。具体的には、編集されたＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eは、自然界には見られない変異体であり、そのペプチドレパートリーおよび同種反応性の可能性は未知であった。
対象の免疫系による拒絶反応を回避しながら変更され得るＨＬＡ標的アミノ酸位置を同定するための本開示の方法論に基づいて、出願者らは本明細書において、そのようなアミノ酸の変更が拒絶反応を回避しながら自己免疫を治療することを示す。具体的には、出願者らは、ＤＲＢ１^*０４：０１又はＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eのいずれかを発現するトランスジェニックマウスを作製し、これらの系統間で皮膚移植を行った。あるＤＲＢ１^*０４：０１マウスから採取し、別のＤＲＢ１^*０４：０１マウスに適用した皮膚移植は、ＤＲＢ１^*０４：０１免疫細胞により自己として受け入れられる。しかしながら、ＤＲＢ１^*０４：０１マウスの免疫細胞がＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eを外来組織とみなすと、拒絶される（逆も同様）。
ここで、出願者らの実験結果は、本開示の、対象自身の感受性ＨＬＡ対立遺伝子及びＨＳＣに基づき操作されたＨＬＡ対立遺伝子を作出する方法は拒絶されない。開示される操作されたＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E対立遺伝子は、抗原結合クレフト内に１つの非天然アミノ酸置換を含み、その置換は少なくとも１つの抗原への結合を変化させる（天然感受性対立遺伝子と比較）が、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E編集のようなＴ細胞受容体相互作用に直接影響を及ぼさず、天然ＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントに同種反応性を誘導しない。

１００を超える遺伝子座がＲＡに関連している。しかしながら、ＲＡ病因との最も強い遺伝的関連は、主要組織適合性複合体内のＤＲＢ１遺伝子とのものであり、遺伝的リスクのおよそ５０％に寄与している。より具体的には、ＨＬＡ－ＤＲＢ１における３つのアミノ酸位置（１１、７１及び７４；ウェブサイトebi.ac.uk/ipd/imgt/hlaで公開されているウェブサイトImmuno Polymorphism Database-ImMunoGeneTics project/Human Leukocyte Antigen又はIPD-IMGT/HLAに示されているように、ＨＬＡ内のａａ位置は成熟タンパク質に対する相対的なものであることに留意されたい）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座と血清陽性ＲＡとの関連の大部分を説明する。
関連のあるＲＡ感受性対立遺伝子及びＲＡ耐性対立遺伝子を全てクローニングした後、個々のアミノ酸に部位特異的突然変異誘発を行うことにより、出願者らは、位置７１をＫからＥへ変異させることによってペプチド結合プロファイルが耐性ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１^*０４：０２と類似のものに変換されたことを実証した（下記）。

ペプチド競合アッセイを用い、出願者らは、ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１^*０４：０１が、ＲＡ関連抗原のセット、具体的には、翻訳後修飾された「変化した自己」ペプチドに対して最大の選好性を有すると同定した。これらの変化した自己ペプチドは、前臨床ＲＡにおける寛容の初期破壊のシグナルとなり得る。変化した自己ペプチドのコレクションには、感染及び炎症時にアップレギュレートされる一連のシトルリン化ペプチド新抗原が含まれる。ヒトＩＩ型コラーゲンは動物モデルで関節炎を誘発し、マウスでは関節炎を起こすＣＤ４⁺Ｔ細胞はコラーゲンのアミノ酸２５８～２７２の間に位置する免疫優位ペプチドを認識する。コラーゲン^258~272ペプチドを認識するＣＤ４⁺Ｔ細胞はＲＡの関節に見られ、疾患発症時の末梢血におけるその存在は、関節疾患の急速な進行と、従来の合成および生物学的疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対する反応性の低さと関連している。出願者らは、位置７１の酸性Ｋ残基とコラーゲン^258~272ペプチド中の塩基性Ｅ残基との間のイオン引力が、ＤＲＢ１^*０４：０１へのペプチド結合を増強することを発見した。
難治性ＲＡは、様々な関節の滑膜が不断の炎症状態に維持される、疾患のより重篤な形態である。この炎症状態は、Ｔ細胞マクロファージ、好中球、及びＢ細胞の浸潤を特徴とする。本開示の組成物、方法、及び治療法は、骨髄にＤＲＢ１^*０４：０１^K71E対立遺伝子を発現する骨髄性ＡＰＣを補充する操作されたＨＳＣの生着をもたらす。

理論によって限定されることを望むものではないが、天然ＤＲＢ１^*０４：０１とは異なり、操作されたＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eは、コラーゲン^258-272に強固に結合せず、コラーゲンに反発する可能性があり、その結果、この自己抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答が減弱する。コラーゲン特異的メモリーＣＤ４⁺Ｔ細胞の集団は患者に持続し得るが、それらの細胞は慢性関節炎症を維持するのに必要なＴＣＲシグナルをもはや受け取らない可能性がある。
開示される操作されたＨＳＣは数日以内に骨髄に生着し、１０日以内にＤＲＢ１^*０４０１^K71E発現骨髄細胞を生成し始める。開示される操作されたＨＳＣを投与する前に患者が免疫抑制コンディショニングを受けない実施形態では、患者は処置前に存在した獲得Ｔ細胞及びＢ細胞免疫を保持する。患者が低用量ブスルファンを用いた非骨髄破壊的コンディショニング処置を受ける実施形態では、患者は短期間の好中球減少症（７～１０日；感染症、特に細菌に対する免疫応答を惹起するのに必要な好中球の濃度が低い）及び血小板数の減少（２０～３０日；血液凝固に影響を及ぼす可能性がある）を被る可能性がある。これらの現象は生命を脅かすものではないはずであり、重篤な有害事象（ＳＡＥ）は予想されない。

本開示の療法で治療可能な自己免疫疾患
関節リウマチ（ＲＡ）は、関節包滑膜の炎症を特徴とする自己免疫疾患であり、その結果、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞及びＢ細胞の浸潤が生じ、広範な関節破壊、障害及び生活の質の低下をもたらす。ＲＡに伴う持続的な炎症は、虚血性心疾患及び呼吸器疾患の発症リスクも高め、早期の死亡につながる。ＲＡは世界人口のおよそ１％に生じ、米国だけで１３０万人が罹患していると推計される。ＲＡは４０歳以上の女性と長期喫煙者に多く発症する。ＲＡの治療に伴う直接的な医療費は年間数十億ドルにのぼり、ＲＡの年間の総社会的コスト（直接的、間接的及び無形的）は、米国だけで数百億ドルに達すると推計される。

ベーチェット症候群は、再発性口腔潰瘍、性器潰瘍、皮膚病変、ブドウ膜炎、並びに関節炎、及び消化器系または中枢神経系病変等の広範な全身症状を特徴とする慢性の多系統炎症性疾患である。この疾患は、あらゆる大きさの動脈及び静脈血管に多発性病変を伴う可変性血管炎に分類される。
バードショットブドウ膜炎（バードショット脈絡網膜症又はバードショット網脈絡膜症としても知られる）は、自己免疫性ブドウ膜炎（眼のブドウ膜層の炎症）のよく特徴付けられた形態であり、そのほとんどが、眼の後方の脈絡膜（即ち、これらの病変が写真で見える眼底）に沿って分布する「散弾銃パターン」様に見える卵形の光病変で知られている。炎症と脈絡膜の広範な色素脱失、黄斑浮腫、末梢の虚血、網膜の変性、及び網膜上の薄い瘢痕組織層の進行性の形成（「網膜上膜」）により、かなりの割合の患者で視力が徐々に低下する。バードショットブドウ膜炎は、一般に５０歳を超える西欧系祖先の患者が罹患し、男性よりも女性が多く罹患する。

セリアック病は、遺伝的素因のある人が食事性グルテンに曝されることによって引き起こされる、慢性的な免疫介在性腸疾患である（１）。セリアック病患者では、グルテンの摂取によって免疫系の自然応答と適応応答の両方が活性化され、これに絨毛萎縮、陰窩過形成及びリンパ球浸潤を含む粘膜構造の変化を決定付ける慢性炎症が続く。このような構造の変化の後に腸粘膜の機能が失われ、栄養吸収不良による症状が現れる。
乾癬は、樹状細胞の関与を伴うＴリンパ球によって媒介される慢性炎症性疾患である。遺伝的および環境的因子は、明白な疾患の発症に寄与するか、又は必要とされる。病変は紅斑と落屑を特徴とし、境界の鮮明な斑からびまん性の紅皮症まで、様々な臨床像を構成する。患者の３０％までに関節病変がみられ、処置しなければ、糜爛性疾患及び機能障害をきたすことがある。西洋諸国では人口の２％が罹患しており、有病率の高い疾患と考えられている。

ナルコレプシーは、１８７７年にＷｅｓｔｐｈａｌによって初めて報告され、１８８０年にＧｅｌｉｎｅａｕによって命名された。１９５３年に急速眼球運動（ＲＥＭ）睡眠が発見された後、数人の研究者がナルコレプシー患者の入眠を研究した。健常者は通常、入眠後およそ９０分で最初のレム睡眠に入るが、ナルコレプシー患者では入眠時に直接レム睡眠に入ることが多い。レム睡眠を調節するメカニズムの不全は、ナルコレプシーの症状の一部を説明することができる。ナルコレプシーには現在知られている治療法はない。その症状は適切な治療によって管理することができるが、ほとんどの患者には生涯にわたる治療が必要である。
川崎病（ＫＤ）は、急性全身性血管炎であり、小児における後天性心疾患の主要な原因である。ＫＤの病因は未だ不明である。ＫＤは、遺伝的に感受性のある小児において、未知の誘因に対する異常な免疫応答によって引き起こされると思われる。１ ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）遺伝子は、脊椎動物の中で最も多型性の遺伝子として知られており、免疫系の調節に関与する細胞表面の抗原提示タンパク質上のタンパク質をコードしている。ＨＬＡ遺伝子の役割は、ベーチェット病、ＫＤ、及びウェゲナー肉芽腫症を含む、いくつかの免疫介在性血管疾患で研究されてきた。最近のゲノムワイド関連研究では、日本人集団においてＨＬＡクラスＩＩ領域（ＨＬＡ－ＤＱＢ２－ＤＯＢ）とＫＤとの有意な関連が実証された。

重症筋無力症（ＭＧ）は、神経筋伝達のまれな障害であり、単一の疾患というよりはむしろ症候群として認められつつある。近年、重症筋無力症における新しい抗原の探索が活発に行われており、一方、臨床的及び実験的研究により、免疫調節における、将来の治療薬の標的となり得る重要な経路に関する新たな知見が得られている。
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、複数の臓器系を侵す重篤な自己免疫疾患である。ループス腎炎（ＬＮ）はＳＬＥの合併症であり、低い生存率及び高い罹患率が伴う。多くのゲノム研究が世界中で行われ、いくつかの組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座がループス感受性と関連している。

クローン病（ＣＤ）は、１９３２年にＣｒｏｈｎらが１４例の終末回腸炎を報告して以来知られている。クローン病は、主に口から肛門までの消化管を侵す再発性の炎症性疾患である。クローン病は、主に口から肛門までの消化管を侵す再発性の炎症性疾患である。クローン病は、消化管のどの部分も侵し、最も一般的には回腸末端部又は肛門周囲の領域を非連続的に侵す。
自己免疫神経学は、近年大きな発展を遂げている拡大分野である。この進歩の大部分は、末梢神経系及び／又は中枢神経系の抗原に対する自己抗体（Ａｂ）の発見と特徴決定によるものであり、これらの疾患のバイオマーカーとして使用されている。これらのＡｂの中には、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）におけるアクオポリン－４に対するＡｂ（抗ＡＱＰ４ Ａｂ）のように、既に知られている実体をより明確にすることを可能にしたものもある。

１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵臓のインスリン分泌β細胞の破壊を起こす多因子性の自己免疫疾患である。ゲノムワイド関連研究により、Ｔ１Ｄ発症リスクに関連する５０を超える遺伝子座が同定されている。しかしながら、ＤＱ２及びＤＱ８等の特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の遺伝が、疾患感受性と最も強く関連している。
強直性脊椎炎（ＡＳ）は、脊椎及び末梢関節の免疫介在性関節炎を起こす慢性炎症性疾患である。この疾患は男性に多く、症状は一般に人生の早期に始まる。ＨＬＡ－Ｂ^*２７：０５はＡＳと強く関連しているが、Ｂ^*２７：０６及びＢ^*２７：０９は抵抗性と関連している。
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳と中枢神経系の自己免疫疾患である。ＭＳでは、免疫系が神経線維を覆っているミエリン鞘を攻撃し、神経の永続的な損傷又は劣化を引き起こす可能性がある。ＭＳに対する感受性はＤＲＢ１^*１５：０１対立遺伝子と関連している。

以下の表１に、上記の自己免疫疾患に対する感受性に関連する様々なＨＬＡ対立遺伝子を示す。又、表１には、耐性ＨＬＡ対立遺伝子における同じ位置のアミノ酸に対応するように変異させた場合に、自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減又は排除するのに役立ち得る標的アミノ酸位置も示す。表１は又、自己免疫疾患を治療するための標的アミノ酸位置における特定の変異も開示している。

操作されたＨＬＡ分子
本明細書では、様々な操作されたＨＬＡ分子が開示される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５のうち１以上から選択され得る。
多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－Ａは、９、１２、１７、３１、３５、４３、４４、５６、６２、６３、６５、６６、６７、７０、７３、７４、７６、７７、７９、８０、８１、８２、８３、９０、９５、９７、９９、１０２、１０５、１０７、１０９、１１４、１１６、１２７、１４２、１４４、１４５、１４９、１５０、１５１、１５２、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６７、１７１、１８４、及び１８６；特に、９、３１、５６、６２、６３、６６、７３、７７、８０、８１、９５、９７、９９、１１４、１１６、１５０、１５２、１５６、及び１７１から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。
多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－Ｂは、４、９、１１、１２、２４、３０、３２、３３、４１、４５、４６、５２、５９、６２、６３、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８０、８１、８２、８３、９０、９４、９５、９７、９９、１０３、１０９、１１３、１１４、１１６、１３１、１４３、１４５、１４７、１５２、１５６、１５８、１６２、１６３、１６６、１６７、１７１、１７７、１７８、及び１８０；特に、９、２４、３３、４５、４６、５２、５９、６２、６６、７０、７３、７７、８１、９５、９７、９９、１１４、１１６、１４３、１４７、１５２、１５６、１６３、１６７、１７１、及び１７８から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。

多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－Ｃは、４、９、１１、１２、２４、３０、３２、３３、４１、４５、４６、５２、５９、６２、６３、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８０、８１、８２、８３、９０、９４、９５、９７、９９、１０３、１０９、１１３、１１４、１１６、１３１、１４３、１４５、１４７、１５２、１５６、１５８、１６２、１６３、１６６、１６７、１７１、１７７、１７８、及び１８０；特に、４、２４、３０、３３、４５、５２、５９、６２、６３、６６、６７、７０、７３、７４、７７、８０、８１、９５、９７、９９、１１４、１１６、１４３、１４７、１５２、１６７、及び１７１から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。
多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－ＤＱＡ１は、２０、２６、３４、４０、４１、４４、４６、４７、４８、５０、５２、５３、５４、５５、６１、６４、６６、６９、７５、７６、及び８０；特に、３４、４４、６１、６４、６９、７６、及び８０から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。
多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－ＤＱＢ１は、９、１３、１４、２６、２８、３０、３７、３８、４５、４６、４７、５２、５３、５５、５６、５７、６６、６７、７０、７１、７４、７５、７７、８４、８５、８６、８７、８９、及び９０；特に、９、２６、２８、３０、３７、３８、４７、５３、５７、６７、７０、７１、７４、８６、８７、及び９０から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。

多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－ＤＰＡ１は、１１、１８、２８、３０、３１、５０、７２、７３、８３、及び９６；特に、１１、２８、３１、７２、７３、及び９６から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。
多くの実施形態では、開示ざれる操作されたＨＬＡ－ＤＰＢ１は、８、９、１１、３３、３５、３６、５５、５６、５７、６５、６９、７２、７６、８４、８５、８６、８７、及び９１；特に、９、１１、３３、３５、３６、５５、５６、６５、６９、７２、７６、８４、８７、及び９１から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。
多くの実施形態では、開示される操作されたＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３７、３８、４０、４７、５７、５８、６０、６７、７０、７１、７３、７４、７７、７８、８５、及び８６；特に、９、１１、１３、２６、２８、３０、３２、３３、３７、３８、４０、４７、５７、５８、６７、７１、７４、７８、８５、及び８６から選択される多形性の位置のうち１以上に変異を含み得る。

多くの実施形態では、開示される方法は、
Ａ^*０２、Ａ^*０３、Ａ^*２９；
Ｂ^*０７、Ｂ^*０８、Ｂ^*０８：０１、Ｂ^*２７、Ｂ^*２７：０３ Ｂ^*２７：０５、Ｂ^*２７：０９、Ｂ^*５１、Ｂ^*５４：０１、Ｂ^*５７；
Ｃ^*０６、Ｃ^*１８；
ＤＰＡ１^*０２：０１；
ＤＰＢ１^*１３：０１；
ＤＱ；
ＤＱＡ１^*０２：０１、ＤＱＡ１^*０３：０１、ＤＱＡ１^*０５、ＤＱＡ１^*０５：０１；
ＤＱＢ１^*０２、ＤＱＢ１^*０２：０１、ＤＱＢ１^*０３、ＤＱＢ１^*０３：０１、ＤＱＢ１^*０３：０２、ＤＱＢ１^*０６：０２；
ＤＲ；
ＤＲＢ１^*０１：０３、ＤＲＢ１^*０４、ＤＲＢ１^*０７、ＤＲＢ１^*０７：０１；ＤＲＢ１^*１５、ＤＲＢ１^*１５：０１；ＤＲＢ１^*１６；ＤＲＢ１^*０８、ＤＲＢ１^*０８：０１、ＤＲＢ１^*１１：０４
から選択される１以上の感受性ＨＬＡ対立遺伝子から１以上の操作されたＨＬＡ対立遺伝子を作出し得る。

本明細書では、成熟ＨＬＡタンパク質配列内の標的アミノ酸位置における様々な変異が開示される。多くの実施形態では、突然変異は、上記に開示される基準に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、治療される自己免疫疾患又は障害に基づいて、特定の対立遺伝子変異が選択され得る。例えば、１型糖尿病の治療はＤＱＢ１^*０２：０１にＡ５７Ｄの変異（ここでは、位置５７の天然のＡ、アラニンがＤ、アスパラギン酸に変異される）及び／又はＤＱＢ１^*０３：０２にＡ５７Ｄの変異を含むことができ；関節リウマチの治療はＤＲＢ１^*０４：０１にＬ６７Ｉ、Ｑ７０Ｄ、Ｌ６７Ｉ＋Ｑ７０Ｄ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ７１Ｒ、Ｌ６７Ｆ、Ａ７４Ｌ、Ｌ６７Ｆ－Ａ７４Ｆ、Ｇ８６Ｖ、Ｇ８６Ｍ、Ｇ８６Ｌ、Ｇ８６Ｆ、及びＡ７４Ｅ；ＤＲＢ１^*０４：０５にＲ７１Ｅ、ＤＲＢ１^*０１：０１にＬ６７１、Ｑ７０Ｄ、Ｒ７１Ｅ、Ｖ８５Ａ、及びＧ８６Ｖ、ＤＲＢ１^*０４：０３にＲ７１Ｅ、ＤＲＢ１^*０４：０４にＲ７１Ｅ、ＤＲＢ１^*０４：０８にＲ７１Ｅの１以上の変異を含むことができ；多発性硬化症の治療はＤＲＢ１^*１５：０１にＦ４７Ｙ、Ａ７１Ｒ、Ａ７１Ｒ－Ｖ８６Ｇ、Ｖ８６Ｌ、及びＶ８６Ｆの１以上の変異を含むことができ；セリアック病の治療はＤＱＢ１^*０２：０１にＫ７１Ｅ、及びＫ７１Ｔの１以上の変異を含むことができ；視神経脊髄炎の治療はＤＲＢ１^*０３：０１にＶ８６Ｌ及びＶ８６Ｍの１以上の変異を含むことができ；ベーチェット症候群の治療はＢ^*５１に１以上の変異を含むことができ；乾癬の治療はＣ^*０６；Ｂ^*５７、及びＣ^*０６；Ｃ^*１８、Ａ^*０２に１以上の変異を含むことができる。

治療方法
本開示は、操作されたＡＰＣ及び／又はＡＰＣ前駆体、即ち、操作されたＨＳＣを投与することによって自己免疫疾患を治療又は予防する方法を含む。例えば、Ｔ細胞療法とは対照的に、本明細書で開示される操作された組成物は、Ｔ細胞介在性拒絶応答を惹起するのではなく低減又は抑制するために提供される。従って、操作された組成物は、対象の特定の病態を標的としつつ比較的に広い治療域を提供する。特定の実施形態では、これらの方法は、治療上有効な量の操作されたＨＳＣの投与を含む。
特定の実施形態では、対象に、１日以上にわたって１用量以上での静脈内投与などにより、体重１ｋｇ当たり１×１０⁶、２×１０⁶、３×１０⁶、４×１０⁶、５×１０⁶、例えば、１００万～５００万、又はそれより多い操作された自己ＨＳＣを投与する。

本開示の方法には、記載のような操作されたＨＳＣの生産及び投与が含まれる。現在の特定の実施形態を含む特定の実施形態では、操作されたＨＳＣは、治療される対象に対して自己である。従って、いくつかの実施形態は、対象からＨＳＣ又はＨＳＣ前駆体を単離すること、単離されたＨＳＣをｅｘ ｖｉｖｏで操作すること、操作されたＨＳＣの任意選択の選択及び／又は拡大増殖、並びに操作された自己ＨＳＣの対象への投与を含む。
ＨＳＣ又は前駆体は当技術分野で公知の方法により対象から単離することができる。例えば、ＰＢＭＣ及び／又は骨髄細胞は、ＣＤ３４の発現に基づいて動員、単離、及びＨＳＣ精製することができる。所望により、ＨＳＣ亜集団は更なる抗原の発現に基づいて選択することができる。それに加えて、又はその代わりに、ＨＳＣは、当技術分野で公知のように、対象の採取前の幹細胞又は脱分化細胞等の前駆細胞から生産することもできる。自己ＨＳＣは現在特定のものであるが、本開示は自己ＨＳＣに限定されない。例えば、特定の実施形態では、非自己応答を惹起し得るタンパク質を発現せずに所望のＨＬＡを発現するように操作された非自己（ドナー）ＨＳＣが提供される。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態は、非骨髄破壊的コンディショニング等のプレコンディショニング、及び／又は操作されたＨＳＣの生着を促進するため等の治療後介入も含む。それに加えて、又はその代わりに、本開示によるＨＳＣ操作は、本明細書に記載されるように、とりわけ、発現自己免疫耐性対立遺伝子及び／又は遺伝子編集構築物をコードするウイルスベクターの投与によるなどでｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。更に、本明細書では主に単一の操作されたＨＳＣ集団について言及するが、複数対立遺伝子自己免疫疾患の場合等では、個別のＨＬＡ対立遺伝子修飾を有する複数のＨＳＣ組成物を個別に又は順次に提供することもできる。

ＨＬＡ対立遺伝子の操作
本開示は、遺伝子編集のためのシステム、構築物、及び技術、並びに自己免疫に対する耐性を提供するためのその適用を含む。特に、本開示の特定の実施形態は、本明細書で開示されるようなＨＬＡ対立遺伝子操作のための構築物、システム、及びベクターを含む。
多くの遺伝子編集システムが利用可能であり、好適であり、当技術分野で十分に特徴付けられている。例えば、特定の実施形態では、修飾されるＨＬＡ対立遺伝子に相補的なＤＮＡ標的化ポリヌクレオチド及びＣａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが提供される。ＲＮＡの治療のための関連するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＷＯ２０１９２００６３５として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２９３０２に開示されており、その全体が本明細書の一部として援用される。

他の実施形態では、例えば、ＷＯ／２０２０／０２３５２９として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４３０６６、ＷＯ／２０１８／１９５５４５として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８９１９等、例えば、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、又はＭＡＤ７を含むＨＳＣ ＨＬＡ対立遺伝子操作のためのＣＲＩＳＰＲシステムが提供される。特定のＣＲＩＳＰＲシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性に基づいて選択することができ、ほぼ全てのゲノム配列の標的化、オンターゲット選択性、ヒトＨＳＣにおける効率、及び他の考慮事項が可能である。別の実施形態では、Nucleic Acid Res. 2011 Sep. 1; 39 (17):7879に開示されているように、ＨＬＡ対立遺伝子操作のためにＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が採用される。
更なる実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子操作は、酵素的に不活性なｄＣａｓ９に基づく融合タンパク質等の融合タンパク質を用いて行うことができる。これらのシステムは、ＣＲＩＳＰＲに関連するプログラム可能なＤＮＡ標的化能力を、他の遺伝子操作プラットフォームの付加的なオンターゲット選択性及び／又は機能的能力と組み合わせたものである。例えば、特定の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子の操作は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３６２２６に記載されているように、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ融合を含むシステムを用いて行われる。

特定の実施形態を含む更なる実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子の操作は、核酸塩基編集システムを用いて行われる。例えば、特定の実施形態は、ＨＬＡ対立遺伝子標的化ポリヌクレオチドとｄＣａｓ９及びデアミナーゼ等の核酸塩基編集酵素を含む融合タンパク質とを提供する。このような実施形態は、有利には、ＤＮＡ二本鎖の切断及び修復を生じずに又は必要とせずに、標的ＨＬＡ対立遺伝子コドンにおいてコードされるアミノ酸を変化させるに十分な特定の点突然変異を創出する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及びそのためのベクターの設計原理は当技術分野で周知であり、現在の文脈では、本質的に、操作されるＨＬＡ対立遺伝子の部分に相補的な配列を選択することのみを必要とする。記載の例を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合に基づくシステムに関しても同様である。ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガー等のタンパク質に基づくＤＮＡの標的化を含む遺伝子操作プラットフォームの作出も又、十分に特徴付けられており、本開示で使用するための適切なそのようなシステムは、常法と実験だけで作出することができる。

更なる及び別の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子操作システムは相同修復鋳型を含む。例えば、特定の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子座内の感受性ＨＬＡ対立遺伝子の全遺伝子を切除し、操作されたＨＬＡ対立遺伝子に置き換えることができる。多くの実施形態において、感受性ＨＬＡ対立遺伝子をコードする遺伝子は、操作されたＨＬＡ対立遺伝子の挿入によって破壊され得、これは、操作されたＨＬＡ対立遺伝子のｃＤＮＡ配列を有する中断されない核酸として存在し得る。
本開示によるＨＬＡ対立遺伝子操作、及びそのためのシステムは又、例えば、開示されたＨＬＡ対立遺伝子操作構築物の発現のためのレトロウイルスベクター等のベクターを含み得る。従って、一過性トランスフェクション技術及びシステムも又適用され得る。従って、本開示は、特定のＨＬＡ対立遺伝子操作構築物若しくはシステムによって限定されるものではなく、又は特定のＨＬＡ対立遺伝子操作構築物若しくはシステムに限定されるものではない。いくつかの特定の実施形態を含む特定の実施形態では、下表によるＨＬＡ対立遺伝子操作が提供される。

操作された造血系細胞
自己免疫細胞は、本明細書で開示されるような様々なシステムを用いて操作され得る。例えば、細胞は、ゲノム編集可能な様々なウイルスベクター及び／又はヌクレアーゼを用いた操作されたＨＬＡ遺伝子及び分子を保有し発現するように操作することができる。当業者に周知の様々なプロトコールが、ウイルス挿入、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）又は他の潜在的変異原性事象の頻度及び／又は位置を評価するための操作された細胞のゲノムのスクリーニングを可能にし得る(Li H, Haurigot V, Doyon Y, et al. In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature. 475(7355):217-21, 2011)。多くの実施形態において、本システムは、感受性ＨＬＡ対立遺伝子の発現を除去又は抑制するのに有用であり得るとともに、操作されたＨＬＡ対立遺伝子を同じ遺伝子座に挿入するのに有用であり得る。多くの実施形態において、操作されたＨＬＡ対立遺伝子はｃＤＮＡ配列から発現される。感受性ＨＬＡ対立遺伝子及び操作されたＨＬＡ対立遺伝子の特定のｃＤＮＡ配列は、図３０、及び配列番号５９～９６に示される。
臨床転帰をもたらすために必要な、治療上適切なレベルの遺伝子改変造血幹細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞の大集団の拡大及び患者への再導入によってより容易に達成できる可能性がある。

定義
以下の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。示される定義は、特定の実施形態の記載を補助することを意図しており、特許請求される組成物、方法、化合物、システム、及び療法を限定することを意図しない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と本明細書に示されるその定義との間に明らかな不一致がある場合には本明細書内で示される定義が優先する。

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差を意味し、一部は値がどのように測定又は決定されるかに依存する。特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３、又は４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．０５％以内を意味する。「約」又は「およそ」という用語が、一連の２つ以上の数値の最初の数値の前にある場合は、「約」又は「およそ」という用語は、その一連の各数値に適用されると理解される。
「アミノ酸識別性」、「残基識別性」、「識別性（identity）」等は、本明細書で使用する場合、所与の位置におけるポリペプチド主鎖上の官能基（Ｒ基）の構造を指す。天然アミノ酸の識別性は（名称／３文字コード／１文字コード）：アラニン／ａｌａ／Ａ；アルギニン／ａｒｇ／Ｒ；アスパラギン／ａｓｎ／Ｎ；アスパラギン酸／ａｓｐ／Ｄ；システイン／ｃｙｓ／Ｃ；グルタミン／ｇｌｎ／Ｑ；グルタミン酸／ｇｌｕ／Ｅ；グリシン／ｇｌｙ／Ｇ；ヒスチジン／ｈｉｓ／Ｈ；イソロイシン／ｉｌｅ／Ｉ；ロイシン／ｌｅｕ／Ｌ；リシン／ｌｙｓ／Ｋ；メチオニン／ｍｅｔ／Ｍ；フェニルアラニン／ｐｈｅ／Ｆ；プロリン／ｐｒｏ／Ｐ；セリン／ｓｅｒ／Ｓ；トレオニン／ｔｈｒ／Ｔ；トリプトファン／ｔｒｐ／Ｗ；チロシン／ｔｙｒ／Ｙ；及びバリン／ｖａｌ／Ｖである。ＨＬＡ分子内の位置を示すために本明細書で使用するアミノ酸位置は、ウェブサイトebi.ac.uk/ipd/imgt/hlaに示されるような成熟タンパク質配列を参照する。よって、例えば、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eは、ＤＲＢ１の対立遺伝子^*０４：０１の成熟タンパク質の位置７１を指し、天然識別性はリシン、Ｋであり、非天然の編集された識別性はグルタミン酸、Ｅである。

「自己免疫疾患、障害、又は病態」とは、免疫系が内因性の抗原に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を生じて１以上の組織を傷害する疾患、障害、又は病態を指す。このような疾患としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害（ＭＯＧＡＤ）、筋無力症候群及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、バードショットブドウ膜炎、ナルコレプシー、ナルコレプシー１型（ＮＴ１；以前はカタプレキシーを伴うナルコレプシーと呼称）、川崎病、クローン病、乾癬、皮膚筋炎（ＤＭ）、アジソン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、グレーブス病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎（ＰＭ）、傍腫瘍性神経症候群（ＰＮＳ）、自己免疫性脳炎、狼瘡腎炎（ＬＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、乾癬性関節炎、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、望ましくない遅延型過敏症反応、Ｔ細胞介在性肺疾患、神経炎、白斑、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、喘息、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、肺線維症又は特発性肺線維症、原発性胆汁性肝硬変、及び悪性貧血が挙げられる。本明細書で使用する場合、「疾患」、「障害」、及び「病態」という用語は互換的である。
「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」とは、免疫系の調節を担う細胞の表面にある主要組織的合成複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードするヒト遺伝子を指す。「ＨＬＡ－Ｉ」又は「ＨＬＡクラスＩ」とは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、及びβ２－ミクログロブリン遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子を指す。「ＨＬＡ－ＩＩ」又は「ＨＬＡクラスＩＩ」とは、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、及びＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を指す。

「静脈内」投与とは、治療目的で、例えば注入（静脈中への緩徐な治療的導入）により、患者の静脈中に薬物又は療法、例えば開示される１以上の操作されたＨＳＣを投与することを指す。「注入」または「注入する」とは、治療目的で静脈を通して患者の体内に薬物、療法、及び／又は溶液を導入することを指す。一般に、これは静脈内（ＩＶ）バッグを介して達成され得る。
「静脈内バッグ」又は「ＩＶバッグ」は、患者の静脈を介して投与可能な溶液を保持し得るバッグである。一実施形態では、溶液は、生理食塩水（例えば、約０．９％又は約０．４５％ＮａＣｌ）、又は開示される操作されたＨＳＣの投与のために治療上有用な任意の溶液であり得る。

「共投与」とは、２種類以上の薬物を順次（即ち、他方の後に一方を）注入するのではなく、同じ投与中に２種類の（またはそれを超える）薬物を静脈内投与することを意味する。一般に、共投与には、２種類の（またはそれを超える）薬物を同じＩＶバッグに組み合わせること、又はその共投与の前に第１の薬物を含むＩＶバッグに第２の薬物を加えることを含み得る。
「改善」という用語は、本明細書で使用する場合、本開示による、１以上の治療、薬物、及び／又は組成物の、そのような患者又はそれを必要とする対象への投与による、それに罹患している患者の疾患状態の任意の改善（例えば、自己免疫疾患の症状、例えば、関節リウマチの症状の改善）を指す。そのような改善は、患者の疾患の進行の減速、若しくは進行の停止、任意の症状の頻度、持続時間、及び／若しくは重症度の減少、並びに／或いは疾患の症状のない期間の頻度若しくは持続時間の増加、又は疾患による損傷若しくは障害の予防として見られ得る。

「抗原」とは、天然、改変、又は合成のいずれであっても、動物における抗体産生又はＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、物質、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオペプチド等を指し、動物に注射若しくは吸収される、又は動物によって改変される組成物を含む。本明細書で使用する場合、抗原は、天然型又は操作されたＨＬＡ分子の抗原結合クレフト内に結合する能力によって定義され得る。いくつかの態様において、抗原は、特定の体液性免疫系又は細胞性免疫系の１以上の産物と反応し得る。「抗原」という用語は、関連する全ての抗原エピトープ及び抗原決定基を含む。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、クラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合した、ペプチドを含む抗原性化合物を処理し、Ｔ細胞に提示することができる細胞を指す。多くの場合、ＡＰＣはＴ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを送達することができる。典型的なＡＰＣとしては、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、胸腺上皮細胞、及び血管内皮細胞が挙げられる。

「抗原結合領域」、「抗原結合クレフト」、「抗原結合グルーブ」、及び「抗原クレフト」等は、ＨＬＡにより提示される抗原と相互作用して結合するＨＬＡ分子の領域を指す。本明細書の一部として援用されるNguyen, A. et al., “The pockets guide to HLA class I molecules,” Biochemical Society Transactions (2021) 49 2319-2331に述べられているように、ＨＬＡ－Ｉペプチド結合クレフトは、Ｎ末端及びＣ末端で閉塞し（ペプチド抗原の長さを約８～１０アミノ酸に制限する）、一方、ＨＬＡ－ＩＩクレフトの末端は開放していて、より長いペプチド抗原（例えば、＞１３アミノ酸長）を許容する。本明細書の一部として援用されるK.J. Smith et al., “Crystal Structure of HLA-DR2 (DRA^*0101, DRB1^*1501) Complexed with a Peptide from Human Myelin Basic Protein,” Vol. 188, No. 8, October 19, 1998, 1511-1520には、ＨＬＡクラスＩＩ分子の結合クレフト及びポケット構造が考察されている。一般に、特定の結合ポケットが、抗原結合クレフト内に結合した抗原の特定の成分と結合する。本明細書で使用する場合、クレフトの「底部」は、分子のコアに最も近く、ＴＣＲ界面から最も遠いクレフトの表面であり得、クレフトは底部からＴＣＲ界面に向かって概ね上方に伸びる側面を有し得る。ほとんどの実施形態において、抗原はペプチドであり、構成成分はアミノ酸である。ＨＬＡ分子の三次元構造は当業者に参照可能であり（例えば、ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla）、任意のＨＬＡ分子の抗原結合領域の同定を可能とする。
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）は、内部の非コードセグメント（イントロン）と転写を決定する調節配列を欠いたポリ核酸である。ＤＮＡは、実験室では、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡから逆転写により合成される。

「投与量」又は「用量」という用語は、本明細書で使用する場合、単回投与で治療効果を生じるのに十分な量を含む有効成分製剤のいずれの形態も示す。
「治療上有効な量」という語句は、単独で、又は他の療法と組み合わせて、（ｉ）特定の疾患、病態、若しくは障害を治療するか、（ｉｉ）特定の疾患、病態、若しくは障害の１以上の症状を減弱、改善若しくは排除するか、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載される特定の疾患、病態、若しくは障害の１以上の症状の発症を予防若しくは遅延させる、本開示の薬物、組成物、化合物、治療、又は療法の量を意味する。この用語は、療法全体を改善するか、疾患の症状若しくは原因を軽減若しくは回避するか、又は治療効果を増強する、若しくは別の治療薬と相乗作用する量を包含し得る。標的自己免疫の場合、治療上有効な量の薬物、組成物、化合物、治療、又は療法は、Ｔ細胞等の反応性又は活性免疫細胞の数を減少させ；炎症を軽減し；細胞、組織、若しくは器官の免疫に基づく攻撃若しくは劣化を阻害し（即ち、ある程度緩徐化する、好ましくは停止させる）；及び／又は自己免疫応答に関連する症状の１以上を部分的に若しくは完全に寛解させ得る。

「免疫応答」は、刺激に対する、Ｂ細胞、又はＴ細胞等の免疫系の細胞の応答を指す。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。
「自己免疫応答」とは、自己抗原(auto- or self-antigen)に対する免疫応答を指す。多くの場合、自己免疫応答は、１以上の自己抗原(auto- or self-antigen)を認識する自己反応性Ｔ細胞の結果である。免疫系は通常、微生物及びその他の有害な異物に対する防御免疫反応を指示するように機能する。自己免疫応答では、患者自身の組織に存在する抗原が自己反応性免疫応答の標的となり、細胞、組織、又は器官の劣化、破壊、又は機能不全を引き起こす。

「哺乳動物」という用語は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ及びヒツジを含む。
「患者」又は「対象」には、哺乳動物又はヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラム、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、若しくはモルモット等の動物が含まれる。動物は非霊長類又は霊長類（例えばサル及びヒト）等の哺乳動物であり得る。一実施形態では、患者はいずれかの性別又は性別を問わず幼児、小児、青年、又は成人等のヒトである。
「薬学上許容される組成物」は、哺乳動物細胞の生存力を維持又は支持するための有機又は無機溶液である。
「予防」は、本明細書で使用する場合、本開示による組成物、化合物、治療、又は療法を、それを必要とする対象に投与することによる、本明細書に明示されるような疾患、障害、又は病態の発生又は再発の回避を意味する。

「組換え体」とは、患者において通常見出されないか若しくは発現されない配列を有するか、又は１以上の核酸若しくはアミノ酸の変異等の人為的操作の結果である配列を有する核酸又はポリペプチドを指す。人為的操作は、化学合成、又はより一般的には、例えば遺伝子工学技術による、核酸の単離されたセグメントの編集（挿入、欠失、突然変異等）により達成され得る。
アミノ酸配列又はペプチド配列間の類似性は、２つの配列間の類似性（他には配列同一性と呼ばれる）で表される。配列同一性は、しばしば同一性のパーセンテージ（ペプチドでは同一残基又は核酸では同一塩基のパーセンテージ、又は類似性又は相同性）で測定され、パーセンテージが高いほど２つの配列は類似性が高い。完全な同一性とは、例えば５０、１００、１５０、又は２００の塩基又は残基等の与えられた配列において１００％同一である。
「特異的に結合する」、「抗原特異的」である、抗原「に特異的」である、「選択的結合剤」、「特異的結合剤」、「抗原標的」、又は抗原と「免疫反応性」があるという用語は、類似の配列の他の抗原よりも高い親和性で標的抗原と結合する分子またはポリペプチドを指す。本明細書では、抗原がＡＰＣの表面でＨＬＡ分子と特異的に結合することが企図される。

「必要とする対象」、「患者」又は「治療を必要とする」者には、既に既存の疾患（即ち、自己免疫疾患、例えば、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害（ＭＯＧＡＤ）、筋無力症候群及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、バードショットブドウ膜炎、ナルコレプシー、ナルコレプシー１型（ＮＴ１；以前はカタプレキシーを伴うナルコレプシーと呼称）、川崎病、クローン病、乾癬、皮膚筋炎（ＤＭ）、アジソン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、グレーブス病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎（ＰＭ）、傍腫瘍性神経症候群（ＰＮＳ）、自己免疫性脳炎、狼瘡腎炎（ＬＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、乾癬性関節炎、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、望ましくない遅延型過敏症反応、Ｔ細胞介在性肺疾患、神経炎、白斑、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、喘息、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、肺線維症又は特発性肺線維症、原発性胆汁性肝硬変、及び悪性貧血）を有する者並びにその疾患のリスクがある又はその疾患に対して感受性のある者が含まれる。これらの用語は又、本明細書で開示されるような予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象も含む。

「免疫寛容」とは、抗原に対して特異的な免疫応答を起こす能力が低下しているか、又はない状態を指す。免疫寛容は、本明細書に記載されているように、２ドメインＭＨＣ分子の存在下で抗原と接触した結果として生じることが多い。一実施形態では、Ｂ細胞応答が低下するか、又は生じない。別の実施形態では、Ｔ細胞応答が低下するか、又は生じない。或いは、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方が低下するか、又は生じないこともある。
「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、本明細書に記載される免疫障害及び疾患に関連する事象、疾患、又は病態の臨床症状、発現、又は進行を、一時的又は永続的に、部分的又は完全に、排除、軽減、抑制、又は改善することを指す。関連分野で認識されているように、療法として採用される方法および組成物は、所与の疾患状態の重症度を軽減し得るが、有用とみなされるために疾患の全ての発現を消失させる必要はない。同様に、予防的に投与される処置は、実行可能な予防方法又は薬剤を構成するために、病態の発症を予防する上で完全に有効である必要はない。単に、疾患の影響を軽減する（例えば、本明細書に開示されるように、炎症、Ｔ細胞の活性化等を軽減する、及び／又は関連する症状の数若しくは重症度を軽減する、又は別の治療の有効性を増大させることによる、又は別の有益な効果を生じることによる）、又は対象において疾患が発症若しくは悪化する可能性を軽減することで十分である。本開示の一実施形態は、既存の病態、又は特定の障害の重症度を反映するベースライン指標よりも持続的な改善を誘導するのに十分な量、期間、及び反復で患者に治療的処置を投与することを含む、治療の有効性を決定するための方法を対象とする。

本明細書で使用する場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のα－アミノとカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続した一連のアミノ酸残基を表して互換的に使用される。「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、大きさ又は機能にかかわらず改変されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化されたもの等）及びアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドを指して用いられる場合が多く、「ペプチド」という用語は小さいポリペプチドを指して用いられる場合が多いが、これらの用語の用法は当技術分野では重複している。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書で遺伝子産物及びその断片を指す場合に互換的に使用される。従って、例示的ポリペプチド又はタンパク質としては、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オーソログ、パラログ、断片及び他の等価物、上記の変異体、断片、及び類似体が含まれる。
ＨＬＡ分子内のアミノ酸は操作されたＨＬＡ分子を作出するために置換することができる。アミノ酸（ａａ又はａ．ａ．）残基は、類似の物理化学的特徴を有する残基、即ち「保存的置換」で置換する－例えば、ある脂肪族残基を別の残基に（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａを互いに）置換すること、又はある極性残基を別の残基に（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌｎとＡｓｎの間で）置換することができる。例えば、大きさ、電荷、極性、疎水性、鎖の剛性／配向等に基づく他のこのような保存的置換は、タンパク質工学の技術分野において周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、所望の活性、例えば、天然又は参照ポリペプチドの結合、特異性、及び／又は機能が達成されることを確認するために、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つで試験することができる。

アミノ酸はそれらの側鎖の特性の類似性に従って分類することができる (A. L. Lehninger, in Biochemistry, 第2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。或いは、天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて分類することができる：（１）疎水性：ロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。特定の保存的置換としては、例えば、ＡｌａのＧｌｙ又はＳｅｒへの置換；ＡｒｇのＬｙｓへの置換；ＡｓｎのＧｌｎ若しくはＨｉｓへの置換；ＡｓｐのＧｌｕへの置換；ＣｙｓのＳｅｒヘの置換；ＧｌｎのＡｓｎへの置換；ＧｌｕのＡｓｐへの置換；ＧｌｙのＡｌａ若しくはＰｒｏへの置換；ＨｉｓのＡｓｎ若しくはＧｌｎへの置換；ＩｌｅのＬｅｕ若しくはＶａｌへの置換；ＬｅｕのＩｌｅ若しくはＶａｌへの置換；ＬｙｓのＡｒｇ、Ｇｌｎ若しくはＧｌｕへの置換；ＭｅｔのＬｅｕ、Ｔｙｒ若しくはＩｌｅへの置換；ＰｈｅのＭｅｔ、Ｌｅｕ若しくはＴｙｒへの置換；ＳｅｒのＴｈｒへの置換；ＴｈｒのＳｅｒへの置換；ＴｒｐのＴｙｒへの置換；ＴｙｒのＴｒｐへの置換；及び／又はＰｈｅのＶａｌ、Ｉｌｅ若しくはＬｅｕへの置換が挙げられる。

「Ｔ細胞」は、胸腺で成熟した免疫細胞を指す。活性化Ｔ細胞は、Ｇ₀を抜け、ＤＮＡを合成し、ＣＤ２５をアップレギュレートし、及び／又はＣＤをアップレギュレートしているＴ細胞である。
「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、本明細書で使用する場合、ＡＰＣ上のＨＬＡ分子を認識し／それと相互作用する、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質を指す。
「Ｔ細胞受容体：ＨＬＡ結合界面」、「Ｔ細胞受容体結合界面」、「ＴＣＲ：ＨＬＡ結合界面」、「ＴＣＲ：ＨＬＡ界面」は、本明細書で使用する場合、ＴＣＲ：ＨＬＡ結合の間に近接しているＴＣＲの表面及びＨＬＡ分子の表面を指し、ほとんどの場合、ＴＣＲ：ＨＬＡ結合界面は、ＴＣＲと直接接触していないＨＬＡの抗原結合クレフト内のアミノ酸を含まない。

「変異体」は、本明細書で使用する場合、天然又は参照メンバーと実質的に相同であるが、１又は複数の欠失、挿入、置換、分子、発現レベル等のために天然又は参照メンバーとは異なるポリペプチド、核酸、遺伝子、配列、又は分子を指す。変異型ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比較した場合に１以上のヌクレオチド付加、欠失、又は置換を含む、変異型タンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。多様なクローニング、ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発、及びゲノム編集アプローチが当技術分野で公知であり、当業者により適用可能である。
変異型ＨＬＡ遺伝子及び分子には、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ウェブサイトebi.ac.uk/ipd/imgt/hla；「ＩＰＤデータベース」）に列挙されているような天然変異体が含まれる。例えば、ＨＬＡ－Ａ変異体には、ＩＰＤデータベースに列挙されている^*０１～^*８０の全てのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子が含まれる。
変異型アミノ酸又は核酸配列は、天然又は参照配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれを超える同一性を有し得る。天然配列と変異配列の間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、これら２つの配列をワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に採用される自由に利用できるコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎ）を使用して比較することによって決定することができる。

天然アミノ酸配列の改変は、当業者に公知の多くの技術のいずれかによって達成することができる。変異は、例えば、天然配列の断片とのライゲーションを可能にする制限部位に挟まれた変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。或いは、オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的突然変異誘発法を用いて、必要な置換、欠失、又は挿入に応じて特定のコドンを変化させた改変ヌクレオチド配列を提供することもできる。このような改変を行うための技術は、当業者には非常によく確立されており、理解されている。
「核酸」又は「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸又はそれらの類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくは高分子を指す。核酸は一本鎖でも二本鎖であり得る。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの一方の核酸鎖であり得る。或いは、二本鎖ＤＮＡに由来しない一本鎖核酸であってもよい。一態様において、核酸はＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸はＲＮＡであり得る。適切なＤＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はベクターＤＮＡが挙げられる。適切なＲＮＡとしては、例えばｍＲＮＡが挙げられる。

「発現」は、本明細書で使用する場合、該当する場合、限定されるものではないが、例えば、転写、転写産物のプロセシング、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及びプロセシングを含む、ＲＮＡ及びタンパク質の産生、提示（例えば、細胞の表面／外膜における）、又は分泌に関与する細胞プロセスを指す。発現は、１若しくは複数の核酸断片に由来するセンス（例えばｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積、並びに／又はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。
「ベクター」とは、遺伝子工学的方法を用いて、通常は共有結合的に連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡを指す。別のタイプのベクターとしてファージベクターがある。さらに別のタイプのベクターとしてウイルスベクターがあり、ウイルスゲノムに付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内で自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を持つ細菌ベクター及びエピソーム型哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム型哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、従って宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、プラスミドがベクターの中で最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用する場合がある。

「操作された」とは、本明細書で使用する場合、人間の介入によって操作されたという側面を指す場合がある。本明細書では、操作された細胞、ＨＳＣ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、分子、ＨＬＡタンパク質、核酸、遺伝子等が開示される。一例として、ＨＬＡタンパク質は、ポリペプチドの少なくとも１つの側面、例えばその配列が、患者／対象に存在する、又は自然界に存在するような側面と異なるように、人間の介入（直接的又は間接的）によって意図的に操作された場合、「操作された」とみなされる。一般的な慣行であり、当業者には理解されているように、操作された細胞の後代は、実際の操作が以前の実体に行われたとしても、一般にはやはり「操作された」と呼ばれる。対照的に、「天然」又は「野生型」とは、本明細書で用いる場合、非操作及び／又は非改変の細胞、遺伝子、タンパク質、核酸、核酸配列、対立遺伝子、及びアミノ酸配列、並びにそれらの部分を指す。

略号：ＡＣＲ、米国リウマチ学会；ＡＤＡ、抗薬物抗体；ＡＥ、有害事象；ＡＮＣ、絶対好中球数；ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＡＵＣ、濃度－時間曲線下面積；ＤＭＡＲＤ、疾患修飾抗リウマチ薬；ＣＢＣ、全血算；ｃＧＣＰ、現行の医薬品の臨床試験の実施の基準；ＣＤ、分化抗原群；ＣＭＰ、全代謝パネル；ｃＧＭＰ、現行の適正製造規範；ｃＧＴＰ、現行の適正組織規範；ＤＣ、樹状細胞；ＤＭ、皮膚筋炎；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＲＢ１^*０４：０１、ＨＬＡのＨＬＡ ＤＲ β１鎖 ０４：０１対立遺伝子；Ｅ、グルタミン酸；ＥＢＭＴ、欧州骨髄移植登録；Ｇ－ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子；ＧＶＨＤ、移植片対宿主病；ＧＷＡＳ、ゲノムワイド関連解析；ＨＬＡ、ヒト白血球抗原；ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ヒト白血球抗原－ＤＲ β１；ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ＨＳＣ、造血幹細胞；ＨＳＰ、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病；ＩＢＳ、過敏性腸症候群；ＩＬ、インターロイキン；ＩＶ、静脈内；Ｋ、リシン；ＬＮ、狼瘡腎炎；ＭＧ、重症筋無力症；ＭＨＣ ＩＩ、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ヒトのＨＬＡ）；ＭＯＧＡＤ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害；ＭＳ、多発性硬化症；ＭＴＸ、メトトレキサート；ＮＩＳ、全米入院情報抽出データセット；ＮＭＯ、視神経脊髄炎；ＮＳＡＩＤＥｓ、非ステロイド系抗炎症薬；ＮＴ１、ナルコレプシー１型；ＰＮＳ、傍腫瘍性神経症候群；ＰＭ、多発性筋炎；ＲＡ、関節リウマチ；ＳＣ、皮下；ＳＡＥ、重篤有害事象；ＳＬＥ、全身性紅斑性狼瘡；ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子。

「感受性ＨＬＡ対立遺伝子」、及び「感受性対立遺伝子」等は、本明細書で使用する場合、所与の集団における１以上の自己免疫疾患に対する感受性に関連する所与のＨＬＡ対立遺伝子を指す。
「耐性ＨＬＡ対立遺伝子」、及び「耐性対立遺伝子」等は、本明細書で使用する場合、所与の集団における１以上の自己免疫疾患に対する耐性に関連する所与のＨＬＡ対立遺伝子を指す。
「ゲノム」は、本明細書で使用する場合、コードデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（即ち、遺伝子）及び非コードデオキシリボ核酸の両方を含む生物の全ての遺伝情報を指す。「ゲノム配列」は、ゲノムのＤＮＡのヌクレオチド配列である。「天然ゲノム」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるような修飾又は操作前の、対象又は患者等の個体の元のゲノム配列を指す。
同様の主題を指す特定の用語は、本明細書において互換的に使用され得る。例えば、特定の遺伝子の特定の対立遺伝子によりコードされるＨＬＡタンパク質については、ＨＬＡ対立遺伝子を参照して同定することができる。同様に、ＨＬＡ対立遺伝子における特定のコドンは、それによってコードされるアミノ酸を参照して同定することができる。例えば、ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質のアミノ酸配列中の特定の位置は、ＨＬＡ対立遺伝子中の対応する位置を参照して同定することができ、逆もまた同様である。

実施例１－材料及び方法
細胞株
簡単に述べれば、ｃＤＮＡ発現構築物は、対象とする対立遺伝子をその対立遺伝子を発現する細胞から直接クローニングするか、又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、ＩＡ）から「ｇＢｌｏｃｋ」配列（ウェブサイトebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/で利用可能なＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース配列に基づく）を得ることによって取得した。ＲＥ部位を有する様々なｇＢｌｏｃｋ配列を図３０に示す。試験のために、ｃＤＮＡをレトロウイルス形質導入及び発現用のマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プラスミドにクローニングした。従前に記載されたように(Bowerman et 2011)、Ｐｈｏｅｎｉｘ ２９３Ｔ細胞をＧＦＰ＋ＭＳＣＶプラスミドで一過性にトランスフェクトすることにより、様々な対立遺伝子をレトロウイルスとして個々にパッケージングした。ＨＬＡクラスＩＩタンパク質をヒトクラスＩＩ陰性Ｔ２細胞株（Ｔ２親）で発現させた。以下にクラスＩＩの発現を示す。

ＤＲＢ１^*０３：０１、ＤＲＢ３^*０２：０２、ＤＱＡ１^*０５：０１、ＤＱＢ１^*０２：０１、ＤＱＡ１^*０３：０１、ＤＱＢ１^*０３：０２、ＤＲＢ１^*１５：０１、ＤＱＡ１^*０１：０２、又はＤＱＢ１^*０６：０２を発現する個体からＲＮＡを単離し、各個のＨＬＡ－ＤＲ、ＤＱＡ１又はＤＱＢ１対立遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０４：０１、ＤＲＢ３^*０３：０１、ＤＲＢ４^*０１：０３、及びＤＲＢ５^*０１：０１ Ｔ２細胞株は予め作製された(Anderson et al. 2016)。ＤＲＢ１^*１１：０３、ＤＲＢ３^*０１：０１、ＤＱＡ１^*０５：０５、及びＤＱＢ１^*０３：０１のｃＤＮＡ配列をＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ウェブサイトebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から取得し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、ＩＡ）からｇＢｌｏｃｋとして入手した。ｃＤＮＡをヒトクラスＩＩ陰性Ｔ２細胞株（Ｔ２親）のレトロウイルス形質導入用のマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プラスミドにクローニングした。従前に記載されたように(Bowerman et 2011）、Ｐｈｏｅｎｉｘ ２９３Ｔ細胞をＧＦＰ＋ＭＳＣＶプラスミドで一過性にトランスフェクトすることにより、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、－ＤＲＢ３、－ＤＱＡ１、及び－ＤＱＢ１対立遺伝子をレトロウイルスとして個々にパッケージングした。ＨＬＡ－ＤＲＢ１及び－ＤＲＢ３対立遺伝子については、上清中のレトロウイルスを用いて、ＤＲＡ１^*０１：０１を発現する１×１０⁵のＴ２細胞に導入し、形質導入７日後にＨＬＡ－ＤＲ＋／ＧＦＰ＋の高発現で選別した（抗ＤＲ－ＡＰＣ（ＬＮ３） Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１７－９９５６－４２）。－ＤＱ対立遺伝子については、ＨＬＡ－ＤＱＢ１対立遺伝子のレトロウイルスを用いて１×１０⁵のＨＬＡクラスＩＩ陰性Ｔ２細胞に導入し、形質導入７日後にＧＦＰ＋の高発現で選別した。次に、シス及びトランス二量体の対応するＨＬＡ－ＤＱＡ１対立遺伝子のレトロウイルスを用いて１×１０⁵のＤＱＢ１＋Ｔ２細胞に導入し、形質導入７日後にＨＬＡ－ＤＱ＋／ＧＦＰ＋の高発現で選別した（抗ヒトＨＬＡ－ＤＰ／ＤＱ／ＤＲ Ｓｔａｒｂｒｉｇｈｔ Ｂｌｕｅ（ＷＲ１８）７００ ＢｉｏＲａｄカタログ番号 ＭＣＡ４７７ＳＢＢ７００）。選別後、各細胞株からＲＮＡを単離して、シス及びトランスの両方のＨＬＡ対立遺伝子のＨＬＡ配列をサンガーシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により確認した。細胞株は全て、ピルビン酸ナトリウム、チオ－ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＩＭＤＭ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。

ペプチド結合アッセイのためのペプチド設計及び合成
ハイブリッドインスリンペプチドＨＩＰ１－ＷＥ１４（ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ）、ＨＩＰ６－ＩＡＰＰ２（ＧＱＶＥＬＧＧＧＮＡＶＥＶＬＫ）、ＨＩＰ８－ＮＰＹ（ＧＱＶＥＬＧＧＧＳＳＰＥＴＬＩ）、及びＨＩＰ１１－Ｃペプチド（ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）(Delong 2016, Baker2019)によりトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を除去して＞９８％純度となるように、ビオチン化ＰＥＧ３リンカーを用いてＮ末端に合成した。本研究に使用したＨＩＰは、利用可能なＴ細胞クローンを刺激するそれらの能力のために選択した（表１）。ビオチン化ＧＡＤ６５^265-281（ＡＭＭＩＡＲＦＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ）、インスリンミモトープ（ＨＬＶＥＥＬＹＬＶＡＧＥＥＧ）、及びインフルエンザＡ（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）ペプチドも、ＨＬＡ－ＤＲ及びＤＱ結合の対照として合成した[S. Dai, at doi.org/10.1073/pnas.1716527115]。ＨＩＰ６を除き、全てのペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、次いで等量の水、及び最後にダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再構成して４００μＭ濃度とし、ペプチド結合及びＴ細胞研究で使用するまで－２０℃で凍結保存した。ＨＩＰ６を３％アンモニア水、次いで当量の水、中性ｐＨに戻すための７５μＬの１Ｍ ＨＣＬ、及び最後にＤＰＢＳで再構成して４００μＭとした。

患者特異的ＨＬＡ－クラスＩＩ発現Ｔ２細胞のペプチド結合
Ｐｔ３９７７のＨＬＡ－クラス－ＤＲ及び－ＤＱ遺伝子型を発現するＴ２細胞株を採取し、１００μＭ ＨＩＰ１を用いて再懸濁させ、播種し、前述のように一晩培養した。プレートをＤＰＢＳで２回洗浄して結合していないペプチドを除去し、次いで１００μＬの１：１０００希釈ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０に４℃で３０分間再懸濁させた。次に、これらの細胞を従前のように処理し、染色した。データはＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｘ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で解析した。３回の独立した実験の平均結合比（ＨＬＡクラスＩＩ＋Ｔ２細胞のＭＦＩ／ＭＦＩ Ｔ２親ＨＬＡクラスＩＩ－）±ＳＥＭを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン９．１を用いて決定した。

Ｔ細胞刺激アッセイのペプチド合成
ハイブリッドインスリンペプチドＨＩＰ１（ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ）、及びＨＩＰ１１（ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）[Baker et al. 2019]によりトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を除去して＞９８％純度で合成した。ペプチドをＤＭＳＯで再構成して終濃度を１０，０００μＭとした。刺激アッセイでは、ペプチドを１：１００希釈して検量線作成濃度１００μＭとした。

耐性及び感受性ＨＬＡ－クラスＩＩ発現Ｔ２細胞のペプチド結合
ペプチド結合アッセイは従前に記載されているように行った(Anderson et al. 2016, Roark et al. 2016)。簡単に述べれば、Ｔ１Ｄ耐性及び感受性ＨＬＡ－ＤＲ及び－ＤＱ対立遺伝子を発現するＴ２細胞株を採取し、培地（ＩＭＤＭ－ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ＦＢＳ、チオ－ペニシリン／ストレプトマイシン及びピルビン酸ナトリウム）に４×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁させた。９６ウェル丸底プレートで、再懸濁細胞、１００μＭビオチン化原液ペプチド、及びＤＰＢＳを合わせた。陰性対照ウェルは再懸濁細胞をＤＰＢＳ単独とともに含んだ。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プレートをＤＰＢＳで２回洗浄して結合していないペプチドを除去し、次いで１×Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔカタログ番号４２３１０２）に再懸濁させ、室温で１５分間置いた。細胞をＤＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド中で５分間軽く固定して細胞表面からのペプチドの喪失を防いだ。ペプチド結合を検出するために、１×ＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ ＬＴ－ＳＡ－ＰＥ）を４℃で３０分間加えた。Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得する前に、細胞を再び固定した。データをＦｌｏｗＪｏバージョンＸ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で解析し、３回の独立した実験の平均結合比（ＨＬＡクラスＩＩ＋Ｔ２細胞のＭＦＩ／ＭＦＩ Ｔ２親ＨＬＡクラスＩＩ－）±ＳＥＭを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン９．１（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ）を用いて決定した。
ＨＩＰ１１の力価決定のため、Ｔ２親、ＨＬＡ－ＤＱ２、及びＨＬＡ－ＤＱ２トランスを採取し、前述のように再懸濁させた。次に、９６ウェルの丸底プレートで、ペプチドの終濃度を５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、及び５０μＭとした以外は前述のように反応を設定した。細胞を一晩培養し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１００μＬの１：１０００希釈ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（カタログ番号６５－０８６５－１８）に再懸濁させ、４℃で３０分間置いた。次に、細胞を前述のように処理し、染色し、分析した。

Ｔ細胞刺激アッセイ
Ｔ細胞を従前に記載されているように(Baker 2019)クローニングし、拡大培養した。ＨＩＰ１１については、ＨＬＡ－ＤＱ２及びＨＬＡ－ＤＱ２トランス発現Ｔ２株又は自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（ＥＢＶ３５３７）に種々の濃度のＨＩＰ１１（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、及び５０μＭ）を負荷しないか、前負荷した。抗原提示細胞には、選択された濃度の抗原を細胞と共に３７℃で１時間インキュベートすることにより、前負荷を行った。次に、ＤＰＢＳで洗浄することにより過剰な抗原を除去し、結合しＨＬＡ対立遺伝子により提示された抗原のみがＴ細胞クローンを刺激できるようにした。次に、１×１０⁵のＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（Ｅ２）を５×１０⁴の抗原提示細胞株と共に一晩インキュベートした後、生存能色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０）で４℃にて３０分間染色した。細胞を洗浄した後、抗ＣＤ４－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＰＥ抗ヒトＣＤ４抗体カタログ番号３１７４１０）、及び抗ＣＤ２５－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ２５カタログ番号５６２４４３）で４℃にて３０分間染色した。細胞を洗浄した後、Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得する前に固定した。データはＦｌｏｗＪｏバージョンＸ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で解析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン９．１を用いて３回の独立した実験の平均ＣＤ２５ ＭＦＩ±ＳＥＭを計算した。
ＨＩＰ１については、１×１０⁵のＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（Ｄ１１）を、抗原の不在又は存在下で５×１０⁴の患者特異的ＨＬＡ－クラスＩＩ Ｔ２株又は自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（ＥＢＶ ３９７７）と共にインキュベートした。ＨＬＡ－クラスＩＩ Ｔ２細胞株及びＥＢＶ株に前述のように２０μＭ濃度を前負荷した。細胞を一晩共培養し、それらを前述のように処理し、分析した。

実施例２－ヒト化ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eトランスジェニックマウスはコラーゲン感作に耐性がある
コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は、ＭＨＣ ＩＩ分子の重要な役割及びコラーゲン特異的Ｔ細胞応答を含むＲＡの重要な特徴を再現する、十分に確立された自己免疫性関節炎のマウスモデルである。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した異種ＩＩ型コラーゲンタンパク質を注射したＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスは、ＣＩＡ発症に必要な必須の第一段階である強力なコラーゲン特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を生じる（コラーゲン感作）。
ＤＲＢ１^*０４：０１－Ｋ７１Ｅ遺伝子編集がｉｎ ｖｉｖｏコラーゲン感作を予防するのに十分であるかどうかを判定するために、Ｈ－２クラスＩＩノックアウトバックグラウンドに対するキメラＨＬＡ－ＤＲ４／Ｉ－Ｅ^dトランスジェニックマウスを用いた。図２の上は、キメラＭＨＣ ＩＩ分子における遠位／ヒトＤＲα１及びＤＲβ１ドメインはマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）とのペプチド結合及び相互作用を媒介し、近位マウスＩ－Ｅ^dα２ドメイン及びＩ－Ｅ^dα２ドメインはマウスＣＤ４共刺激分子との相互作用を媒介することを示す図である。これらの実験では、３つのトランスジェニック系統を用いた：ＤＲＢ１^*０４：０１遺伝子を有するもの、ＤＲＢ１^*０１：０１遺伝子を有するもの（例えば、J. Exp. Med., Vol. 180, 1994, pp. 173-18、及びJ. of Exp. Med., Vol. 185, No. 6, 1997, p. 1113-1122参照、双方ともそれらの全体が本明細書の一部として援用される）、及びＤＲＢ１^*０４：０１^K71E遺伝子を有するもの（本明細書の一部として援用されるPLOS ONE, Vol. 8, 12, 2013, e84908の方法に基づく）。３系統は全て、ＣＦＡで乳化した可溶性ＩＩ型コラーゲンタンパク質で０日目と２１日目に免疫した。５６日目にマウスを犠死させ、リンパ節を採取し、増殖細胞のＤＮＡに組み込まれるチミジンヌクレオシドアナログ５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）の存在下、コラーゲン^258-272ペプチド（Ｐｅｐ）とともに又は培地のみで（Ｐｅｐなし）培養した。
蛍光アジドとＣｕ（Ｉ）触媒による［３＋２］環化付加「クリック」化学を用いて、増殖細胞におけるＥｄＵの取り込みを検出した。細胞は又、ＣＤ３とＣＤ４の蛍光抗体で共染色した。コラーゲン^258-272に応答してｅｘ ｖｉｖｏで増殖したＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度を用いて感作を定量した。図２の下に示すように、ＤＲＢ１^*０４：０１マウスはコラーゲン^258-272特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を生じたが、ＤＲＢ１^*０１：０１トランスジェニックマウス由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＤＲＢ１^*０４：０１と比較してコラーゲン^258-272との結合能が低く、ＲＡとの関連が弱いことに相応して、弱い増殖応答を示した。対照的に、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eトランスジェニックマウス由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞では増殖応答は見られなかった。このことは、感受性マウスにＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eを発現させると、マウスがコラーゲンに感作されなくなることを示した。

実施例３－ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E皮膚移植はＤＲＢ１^*０４：０１マウスにおいて安定した生着を達成する
Ｋ７１Ｅ編集はＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントにおいて同種反応性を誘発しないことを確認するために、ＤＲＢ１^*０１：０１及びＤＲＢ１^*０４：０１^K71EマウスからＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントへ皮膚移植を行った。皮膚移植片は豊富なＡＰＣを含んでいるので、生着しにくい組織である。皮膚生着の評価は、潜在的な同種反応性を試験するための強固なモデルである。この前臨床モデルを用いて、ＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントにおけるＤＲＢ１^*０４：０１^K71E皮膚移植片の拒絶反応の頻度を決定した。
図３の下に示されるように、ＤＲＢ１^*０１：０１皮膚移植片は１４日までに完全に拒絶されたが（ｎ＝３）、ＤＲＢ１^*０４：０１（ｎ＝３）及びＤＲＢ１^*０４：０１^K71E（ｎ＝３）移植片は双方とも安定した生着状態に留まった。ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E同種移植片が無期限に生存したことは、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Ｅ発現が急性拒絶反応も慢性拒絶反応も誘発しないことを示している。従って、一度骨髄に生着すれば、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eを発現する長期前駆ＨＳＣは、ＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントにおいて拒絶されたり、免疫応答を誘導したりすることはないはずである。

実施例４－ＭＳに関与するＨＬＡ対立遺伝子
ＭＳ耐性及び感受性に関連する対立遺伝子を検討した。２つのＤＲＢ１対立遺伝子、^*０１：０１及び^*１１：０１を、耐性を付与する対立遺伝子として同定し、^*１５：０１は感受性に関連する。これら３つの対立遺伝子の成熟タンパク質配列をアラインし、ＤＲＢ１^*１５：０１対立遺伝子：Ｆ４７、Ａ７１、及びＶ８６に関して、上記の基準に適合する多形性の位置を同定した。４つのペプチド：ＭＯＧＡＤに関連するＭＯＧ^97-109（ＦＦＲＤＨＳＹＱＥＥＡ）；脳で発現し、ＭＳにおいてメモリーＴ細胞を活性化させて特徴的な脳炎症をもたらし得るＲＡＳＧＲＰ^278-87（ＬＶＲＹＷＩＳＡＦＰ）(Jelcic et al., 2018, Cell 175)；ＤＲＢ１^*１５：０１と結合する免疫原性ペプチドであるＭＢＰ^83-101（ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰＰ）；及びＭＳに対する耐性に役割を果たしている可能性があり、ＤＲＢ１^*０１：０１と結合し、ＭＳ Ｔ細胞を活性化しないＭＢＰ^146-170（ＡＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ）(Mamedov et al., Front. Immunol. 2020)に対してこれらの位置（Ｆ４７Ｙ、Ａ７１Ｒ、及びＶ８６Ｇ）の１以上に変異を作出した。
収集したデータ（図５～７）は、ＭＳに感受性を付与するＤＲＢ１^*１５：０１は、２つの耐性対立遺伝子よりもＲＡＳＧＲＰ２とよく結合すること、又、ＭＢＰ^83-101ペプチドと強く結合するが、ＭＢＰ^1146-170ペプチドとは結合しないことを示している。又、これらのデータから、Ｖ８６Ｇ及びＦ４７Ｙ変異は、ＭＢＰ^146-170ペプチド（結合が良好であり、このペプチドが耐性に役割を果たす可能性があることを示唆する）を除き、結合パターンに与える影響は軽度であることが示唆された。最後に、ＤＲＢ１^*１５：０１のＡ７１Ｒ変異単独では、ＭＢＰ１４６－１７０の結合を増加させる以外は、ペプチド結合に変化はない（図６）。二重変異であるＡ７１Ｒ－Ｖ８６Ｇは、ＲＡＳＤＲＰ２結合の減少も示しており（図７）、二重変異がＭＳの自己免疫に対処する上で更なる利点をもたらし得ること示唆している。

実施例５－ＨＬＡ対立遺伝子はＮＭＯ（視神経脊髄炎）に関連する
ＮＭＯの臨床症候群は、アクアポリン４（ＡＱＰ４）に対する病原性血清ＩｇＧ自己抗体により引き起こされる急性視神経炎及び横断性脊髄炎を特徴とする。ＡＱＰ４は、中枢神経系（症例の＞８０％）で最も豊富な水チャネルタンパク質である。ＮＭＯに対する感受性はＨＬＡ－ＤＲＢ１^*０３：０１に関連し、耐性は対立遺伝子ＤＲＢ１^*０７：０１に関連する。２つのＡＱＰ４ペプチドを、両対立遺伝子に対するそれらの結合に関して試験した。
収集したデータは、ＡＱＰ４－５ペプチドは感受性対立遺伝子に結合し、耐性対立遺伝子に結合しないことを示す（図９）。同じことがＡＱＰ４－６ペプチドでも見られ、これも又感受性対立遺伝子に結合するが、耐性対立遺伝子には結合しない。これらの結果は、ペプチド結合グルーブの位置を変異させることにより、ＤＲＢ１^*０３：０１のペプチド結合プロファイルに、ＡＱＰ４ペプチドの結合を抑制又は減弱し、従って自己免疫を抑制するような影響を与え得ることを示唆する。ＤＲＢ１^*０３：０１及びＤＲＢ１^*０７：０１の配列アラインメントから、このような変異のための候補位置（例えば、他所で開示されるように、標的アミノ酸位置９、１１、１３、２６、２８、３０、３２、３３、３７、３８、４０、４７、５７、５８、６７、７１、７４、７８、８５、及び８６）を同定することができる（図８；位置３８、４０、及び８５は多形的に０３：０１及び０７：０１を示さないことに留意；又、アラインされた配列位置は成熟タンパク質配列に基づいて符番されることにも留意されたい）。

実施例６－ＲＡに関連するＨＬＡ対立遺伝子
ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５はＲＡに対する感受性も示す。特に、この対立遺伝子は、日本人集団のＲＡと強い関連を示す。これらの試験のために、ＤＲＢ１^*０４：０５の位置７１をＲからＥに変異させた（図１０参照）。
これらの試験は、ＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５が免疫優性コラーゲンペプチドへの結合に対して強い優先性を示さないことを示す（図１１）。しかしながら、位置７１をグルタミン酸に変異させると（Ｒ７１Ｅ）、低レベルの結合が更に低下する。ビメンチン及びα－エノラーゼの場合、^*０４：０５対立遺伝子は、天然型よりもシトルリン化型と優先的に結合する。Ｋ７１Ｅ突然変異の場合、この優先性はＤＲＢ１^*０４：０５の位置７１のアルギニンをグルタミン酸に変更する（Ｒ７１Ｅ）ことによって低減される。ＭＦＩ結合比は、２回の実験の平均である。
本明細書で開示されるように、ＲＡに感受性の他のＤＲ４対立遺伝子、例えば、ＤＲＢ１^*０４：０３、^*０４：０４、及び^*０４：０８は、位置７１がアルギニン（Ｒ）からグルタミン酸（Ｅ）に変更されると耐性（即ち、耐性対立遺伝子）を付与し得る。

実施例６－Ｉ型糖尿病に関連するＨＬＡ対立遺伝子－Ｔ１Ｄ
Ｉ型糖尿病に対する感受性に関連するＤＱＢ１対立遺伝子が、抗原結合グルーブにおける１以上の変異で耐性を付与することができるどうか試験した。具体的には、いくつかのＤＱＢ対立遺伝子及び対応するＡ５７Ｄ変異体をＴ２細胞株にクローニングした。いくつかの耐性対立遺伝子の位置５７にはアスパラギン酸が見られる。

ペプチド選択－ビオチン化ＰＥＧ３リンカーを用い、ハイブリッドインスリンペプチドＨＩＰ１－ＷＥ１４（ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ）、ＨＩＰ６－ＩＡＰＰ２（ＧＱＶＥＬＧＧＧＮＡＶＥＶＬＫ）、ＨＩＰ８－ＮＰＹ（ＧＱＶＥＬＧＧＧＳＳＰＥＴＬＩ）、及びＨＩＰ１１－Ｃペプチド（ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ）をＮ末端に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）(Delong 2016, Baker2019)によりトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を除去して＞９８％純度で合成した。この試験に使用したＨＩＰをＴ細胞クローンの刺激能及びアベイラビリティのため選択した（表１）。ビオチン化ＧＡＤ６５^265-281（ＡＭＭＩＡＲＦＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ）、インスリンミモトープ（ＨＬＶＥＥＬＹＬＶＡＧＥＥＧ）、及びインフルエンザＡ（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）ペプチドも又、ＨＬＡ－ＤＲ及びＤＱ結合の対照として合成した[S. Dai、doi.org/10.1073/pnas.1716527115で利用可能]。
ハイブリッドインスリンペプチドを、様々な濃度でこれらの細胞株に対する結合に関して試験した。具体的には、天然ＨＬＡ ＤＱＢ１対立遺伝子のペプチド結合をそのＡ５７Ｄ変異型と比較した。感受性対立遺伝子はハイブリッドインスリンペプチドと結合すると仮定された。

これらの試験は、感受性ＤＱ２及びＤＱ８対立遺伝子はＨＩＰ８－ＮＰＹペプチドと結合しないが、ＤＱ２トランスＨＬＡ分子とは結合することが示された（図１２）。位置５７がＡからＤに変わると、このハイブリッドインスリンペプチドの結合は、ＤＱ２及びＤＱ８では増加するが、ＤＱ２トランスでは低下する。同様に、ＤＱ２及びＤＱ８はＨＩＰ１１－Ｃペプチドと結合しないが（図１３）、ＤＱ２トランス分子とは結合する。Ａ５７Ｄが導入されると、ＤＱ２はペプチド結合を示す。ＤＱ２トランスとこのペプチドとの結合は低下するものの、結合は無くなるわけではない。インスリンミモトープペプチドの結合は上記のペプチドと同様のパターンに従う（図１４）。具体的には、ＤＱ２はミモトープペプチドと結合しないが、ＤＱ２トランス及びＤＱ８はこのペプチドと結合する。Ａ５７Ｄ変異が導入されると、その場合にはＤＱ２及びＤＱ２トランスはそのペプチドに結合する。一方、この変異はＤＱ８分子との結合を低下させる。
Ａ５７Ｄ変異によるＴ細胞刺激に対する効果も試験した。具体的には、ＤＱ２に限定され、ＨＩＰ１１－Ｃペプチドに特異的なＥ２ Ｔ細胞が得られた。これらのＴ細胞を、種々の濃度のＨＩＰ１１－Ｃペプチドの存在下で、ＤＱ２又はＤＱ２トランス分子を発現するＴ２細胞との培養で一晩刺激した。Ａ５７Ｄ変異を有する両分子も試験した。次に、Ｔ細胞刺激を、細胞表面のＩＬ－２Ｒ（ＣＤ２５）に関して細胞を染色することにより測定した。

これらの試験は、ＤＱ２ Ｔ２細胞株が親ＥＢＶ株よりも遙かに良くＥ２ Ｔ細胞クローンを刺激することを示した（図１５、一番上のパネル）。これらの対立遺伝子にＡ５７Ｄ変異を導入すると、Ｅ２ Ｔ細胞の刺激が少なくなる。図１５の下のパネルに示されるように、Ｅ２ Ｔ細胞クローンはＤＱ２トランス分子により刺激されるが、ＤＱ２トランス分子にＡ５７Ｄを導入するとＴ細胞クローンの刺激が少なくなる。
図１６は、ＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合ハイブリッドインスリンペプチドを示す。ビオチン化ＨＩＰ１－ＷＥ１４、ＨＩＰ６－ＩＡＰＰ２、ＨＩＰ９－ＮＰＹ、及びＨＩＰ１１－Ｃペプチドの結合は、ＤＱ２のリスク対立遺伝子（Ａ１^*０５：０１／Ｂ１^*０２：０１）、ＤＱ８のリスク対立遺伝子（Ａ１^*０３：０１／Ｂ１^*０３：０２）、ＤＱ２トランスのリスク対立遺伝子（Ａ１^*０３：０１／Ｂ１^*０２：０１）、及びＤＱ８トランスのリスク対立遺伝子（Ａ１^*０５：０１／Ｂ１^*０３：０２）を発現するＴ２細胞で測定した。ＤＱ６の耐性対立遺伝子（Ａ１^*０１：０２／Ｂ１^*０６：０２）も又試験した。薄いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（－）Ｔ２親株に対するペプチドのバックグラウンド結合であり、濃いグレーは特定のＨＬＡ－クラスＩＩ（＋）Ｔ２株のペプチド結合である。列は種々の対立遺伝子を表し、行は種々のペプチドを表す。右上角の数字は平均結合比（ＳＡ－ＰＥ ＭＦＩ Ｔ２ ＨＬＡクラス（＋）／ＳＡ－ＰＥ ＭＦＩ Ｔ２親）である。数字は３回の独立した実験からの平均結合比を表す。

図１７は、ＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合対照天然ペプチドを示す。ビオチン化インスリンミモトープ及びＧＡＤ６５^265-281の結合を、ＤＱ２のリスク対立遺伝子（Ａ１^*０５：０１／Ｂ１^*０２：０１）、ＤＱ８のリスク対立遺伝子（Ａ１^*０３：０１／Ｂ１^*０３：０２）、ＤＱ２トランスのリスク対立遺伝子（Ａ１^*０３：０１／Ｂ１^*０２：０１）、及びＤＱ８トランスのリスク対立遺伝子（Ａ１^*０５：０１／Ｂ１^*０３：０２）を発現するＴ２細胞で測定した。ＤＱ６の耐性対立遺伝子（Ａ１^*０１：０２／Ｂ１^*０６：０２）も又試験した。薄いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（－）Ｔ２親に対するペプチドのバックグラウンド結合であり、濃いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（＋）Ｔ２株のシグナルである。右上角の数字は平均結合比（ＳＡ－ＰＥ ＭＦＩ Ｔ２ ＨＬＡクラス（＋）／ＳＡ－ＰＥ ＭＦＩ Ｔ２親）である。数字は３回の独立した実験からの平均結合比を表す。
図１８は、感受性及び耐性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子結合ＨＩＰを示す。ビオチン化ＨＩＰ１、ＨＩＰ６、ＨＩＰ８、及びＨＩＰ１１の結合を、感受性対立遺伝子ＤＲＢ１^*０３：０１及びＤＲＢ１^*０４：０１及び耐性対立遺伝子ＤＲＢ１^*１５：０１を発現するＴ２細胞で測定した。薄いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（－）Ｔ２親株に対するペプチドのバックグラウンド結合であり、濃いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（＋）Ｔ２株のシグナルである。角の数字は３回の独立した実験からの平均結合比である。

図１９は、感受性及び耐性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子結合天然対照ペプチドを示す。ビオチン化インスリンミモトープ、ＧＡＤ６５^265-281、及びインフルエンザＨＡの結合を、感受性又は耐性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子のいずれか、具体的には、ＤＲＢ１^*０３：０１、ＤＲＢ１^*０４：０１、及びＨＬＡ^*ＤＲＢ１^*１５：０１を発現するＴ２細胞で測定した。角の数字は平均結合比である。
図２０は、様々なＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５対立遺伝子結合ＨＩＰを示す。ビオチン化ＨＩＰ１、ＨＩＰ６、ＨＩＰ８、及びＨＩＰ１１に対するＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５対立遺伝子の結合能を、ＤＲＢ３の対立遺伝子（^*０１：０１、^*０２：０２、^*０３：０１）、ＤＲＢ４^*０１：０３、及びＤＲＢ５^*０１：０１を発現するＴ２細胞で測定した。薄いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（－）Ｔ２親株に対するペプチドのバックグラウンド結合であり、濃いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（＋）Ｔ２株のシグナルである。角の数字は３回の独立した実験からの平均結合比である。
図２１は、様々なＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５対立遺伝子結合天然対照ペプチドを示す。ビオチン化インスリンミモトープ、ＧＡＤ６５^265-281、及びインフルエンザＨＡの結合を、ＤＲＢ３（^*０１：０１、^*０２：０２、^*０３：０１）、ＤＲＢ４^*０１：０３、及びＤＲＢ５^*０１：０１を発現するＴ２細胞で測定した。薄いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（－）Ｔ２親株に対するペプチドのバックグラウンド結合であり、濃いグレーはＨＬＡ－クラスＩＩ（＋）Ｔ２株のシグナルである。角の数字は３回の独立した実験からの平均結合比である。

実施例７－ＤＲＢ１のポケット１における変異の効果
本明細書では、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質の抗原結合位置、ポケット１を閉塞するための方法及び組成物が開示される。多くの実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質は、ＤＲＢ、例えば、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、又はＤＲＢ５である。多くの実施形態では、ポケット１内の１以上のアミノ酸位置が編集された変異型ＤＲＢ分子が記載される。多くの実施形態では、この編集は、グリシンをより大きなアミノ酸識別性、例えば、バリン、メチオニン、又はロイシンに変更することを含み得る。多くの実施形態では、アミノ酸位置は、成熟ＤＲＢタンパク質の８５又は８６である。
位置８６は、ＤＲＢ１のペプチド結合領域のポケット１内に位置し、結合グルーブ内の深い部分でペプチド係留位置として働き得る。ＤＲＢ分子のポケット１（又はＰ１）は、１以上の大きなアミノ酸側鎖を受容してペプチド抗原の係留を補助するための深い凹部、くぼみ、又は穴を形成し得る。研究は、ＤＲＢ１の位置８６のグリシンを他のアミノ酸に置き換えた場合の効果を検討するために計画された。具体的には、より大きな非極性アミノ酸、バリン、メチオニン、及びロイシンを置換して、このペプチド係留位置のサイズを小さくした。

これらの研究では、ＤＲＢ１^*０４：０１の結合クレフト内の特定のアミノ酸位置である位置８６を、グリシンからメチオニン（Ｇ８６Ｍ）又はロイシン（Ｇ８６Ｌ）のいずれかに変更した。Ｔ２細胞株を、変異体をコードする操作された遺伝子でトランスフェクトし、新規なＨＬＡ分子を発現させた。細胞株を、１００ｕＭビオチン化ペプチドと共に一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、軽く固定した後に、ストレプトアビジン－ＰＥを添加して、結合したビオチン化ペプチドを検出した。細胞は、ＢＤ Ｃａｎｔｏ装置を用いたフローサイトメトリーにより分析した。ポケット１の変更がペプチド結合にどのような影響を与えるか（それを増加するか、減少するか、又は維持するか）を見るために様々なペプチドを調べた。
位置８６がグリシンからメチオニン（Ｇ８６Ｍ）に又はグリシンからロイシン（Ｇ８６Ｌ）に変更されたＤＲＢ１^*０４：０１又はＤＲＢ１^*０４：０１を発現するＴ２細胞株を、様々なペプチドとの結合能に関して調べた。位置８６は、ＤＲＢ１のペプチド結合領域のポケット１内に位置しており、本発明者らは、グリシンをより大きな非極性アミノ酸に置き換えれば、この係留位置を埋めてペプチド結合を本質的に遮断できるのではないかと考えた。

ＤＲＢ１^*０４：０１は、ここに列挙された全てのペプチドと結合する（図２３）。位置８６がメチオニン又はロイシンに変更されると、コラーゲン、ＭＯＧ、及びＧＡＤ６５に関してペプチド結合の阻害が見られる。インスリンミモトープ及びインフルエンザウイルスＨＡペプチドに関しては、ペプチド結合の低下が見られる。薄いグレーのピークは、Ｔ２親細胞株Ａによる結合である。濃いピークは、特定のＨＬＡ対立遺伝子によるペプチド結合である。右角の数字は、クラスＩＩ ＨＬＡを発現しないＴ２親株に対するバックグラウンド結合に対するＭＦＩ比である。太字の数字は、ＨＡ、コラーゲン、ＭＯＧ、及びＧＡＤ６５に関する２回の実験の結合比であり、インスリンミモトープだけが１回の実験であった。
同じ細胞株を、ハイブリッドインスリンペプチドを用いて調べた（図２４）。位置８６をＧからＭへ又はＧをＬへ変更しても、これらのハイブリッドインスリンペプチドの機能獲得型を生じなかった。それらはＤＲＢ１^*０４：０１又は２つの変異体に結合しなかった。
図２５に示されるように、これら２つの変異体では、ＭＳに役割を果たすと思われるＲＡＳＧＲＰ２ペプチドの結合が低下していた。しかしながら、これらの変異細胞株はなおＭＢＰペプチドと結合した。ＡＱＰ４ペプチド（ＮＭＯ）は、ＤＲＢ１^*０４：０１及びこれら２つの変異体と同様に結合した。

位置８６をＭ又はＬに変更すると、シトルリン化ビメンチンペプチドの結合が優先され、シトルリン化ａ－エノラーゼペプチドの結合は低下する。図２６は、ａ－エノラーゼペプチドとのこれらの結合を示す。これらの変異は全てのペプチド結合を遮断するわけではない。薄いグレーはシトルリン化ペプチドであり、濃いグレーは天然ペプチドである。ごく薄いグレーのピークは、ＨＬＡ分子を発現しないＴ２細胞へのペプチドのバックグラウンド結合である。シトルリン化ペプチド結合と天然ペプチド結合の比率を右角に示す。
関節炎誘発ペプチドを、ＤＲＢ１^*０４：０１及び２つの変異体に対して試験した。図２７は、これらの細胞株での天然ペプチドとシトルリン化型ペプチドの比較を示す。これらの研究は、天然ビメンチンとシトルリン化型ビメンチンは位置８６が変異された場合により良く結合することを示す。Ｇ８６Ｌ細胞株では、天然ａ－エノラーゼ結合が増加するが、両変異株ともシトルリン化型の結合は少ない。ここでは、Ｔ２親株のバックグラウンドに対する比率を計算する。

実施例８－骨髄治療
実験の少なくとも４８時間前に、マウスにバイトリル水（バイトリル２２．７ｍｇ／ｍｌ：５０ｍｌ試験管に、１１３５ｍｇエンロフロキサシン、４５ｍｌ水、１．２５ｍｌ １－ブタノール（ｎ－ブタノール）及びエンロフロキサシンが溶解するまで（５０％ＮａＯＨ、１９Ｍ）４５％ＫＯＨ（１１．７Ｍ）を滴下（約１５０～２００μｌ）；ｐＨ確認、ＨＣｌでｐＨ８．９～１０．９に調整、及び５０ｍｌとなるように適量の水）を水ボトル１本（約３７５ｍｌ）当たり２ｍｌのバイトリル水を与えた。骨髄細胞をドナーＫ７１Ｅマウスから単離し、照射済みのＤＲ４レシピエントに移入した。レシピエントマウスには、総線量に達するまで６時間あけて２回の照射を行った。

骨髄再構成
エタノールで洗浄し、筋肉組織と腱を全て取り除いた後、骨から骨髄細胞を単離した。骨髄細胞を除去するために、骨の端を切り、２５ゲージの針をつけた１０ｍｌのシリンジを用いて流出させ、骨髄細胞を除去した。細胞を新鮮なＰＢＳを入れた１０ｍｌの組織培養プレートに流出させた。骨髄細胞は、プレート内のＰＢＳと共に１８ゲージの針／１０ｍＬシリンジに細胞を通すことで破砕した。単細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブに移し、遠心分離して細胞をペレットとした。２ｍｌのＲＢＣ溶解バッファーで１分間インキュベートして赤血球を溶解し、次いで、組成物を７０μＭのフィルターで新しい５０ｍｌチューブへ濾過した。１０ｕｌのアリコートをトリパンブルーで１：２に希釈して染色した。非ＲＢＣ細胞を数え、各種ドナーについて細胞総数を集計した。細胞を再び４００ｘｇで遠心分離し、２～５×１０⁷細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁させた。１００ｕｌを後眼窩注射により各照射レシピエントマウスに移入した。

再構成及びキメラ性に関するモニタリング及び確認
最初の２週間は毎日、その後は毎週マウスをモニタリングした。バイトリル水は４週間、週１回交換した。マウスの血液サンプルは、６週間後にＢ細胞及びＴ細胞を染色することにより再構成を確認した。ドナー細胞マーカーを持つマウスはフローサイトメトリーを用いてキメラ性を確認した。細胞表面マーカーが得られない場合、サンプルに対して遺伝子型分析を行い、改変遺伝子又は遺伝子破壊の有無を検査した。

移植のためにレシピエントの細胞を除去するために抗ＣＤ１１７又は他の試薬を使用する骨髄移植
抗ＣＤ１１７抗体は、ＨＳＣを標的とするため、開示された、操作されたＨＳＣの生着を助ける可能性がある(2019 May 9;133(19):2069-2078 doi: 10.1182/blood-2018-06-858159)。抗ヒトＣＤ１１７ ｍＡｂであるＳＲ－１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで正常な臍帯血及び骨髄ＨＳＣを阻害する。ＳＲ－１及び臨床グレードのヒト化抗ヒトＣＤ１１７ ｍＡｂであるＡＭＧ １９１は、異種移植マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで正常及びＭＤＳ ＨＳＣを枯渇させる。これらの抗ＣＤ１１７ ｍＡｂは又、ＭＤＳ異種移植マウスモデルにおいて正常ドナーのヒトＨＳＣの生着を促進し、正常なヒト造血を回復させ、侵攻性の病理学的ＭＤＳ細胞を根絶するのに有用であり、場合によっては、抗ＣＤ１１７抗体は造血幹細胞の骨髄間質への結合を遮断し、ひいては造血幹細胞は骨髄から末梢循環に放出させるのに役立つ。このため、自己免疫疾患を発症している、又は発症するリスクのある対象を治療する１つの方法は、開示された変異型ＨＬＡ分子を含む操作されたＨＳＣの生着を補助するために、抗ＣＤ１１１７抗体による前処置を含み得る。或いは、上記でＨＳＣの採取について開示したように、操作細胞の投与に先立ち、対象をＧＣＦ治療による免疫細胞の動員に曝してもよい。

マウスを２群に分ける。これらの実験では、群ＩはＤＲ４＋マウスであり、抗ＣＤ１１７の２回の後眼窩ｉｖ注射（０日目と２日目）を行った。次に、これらのマウスに８日目にＤＲＢ１^*０４：０１Ｋ７１Ｅドナー由来の骨髄細胞を投与した。その後、レシピエントの血液を２つの時点（ＢＭＴ後１４日目と２８日目）で採取し、解析した。群ＩＩのマウスもＤＲ４＋であったが、抗ＣＤ１１７は投与しなかった（０日目と２日目）。しかしながら、これらには８日目にＫ７１Ｅ骨髄細胞が投与された。その後、群Ｉと同様に２つの時点（ＢＭＴ後１４日目と２８日目）で血液を採取した。最後のサンプルは５６日目に採取した。
血液サンプルは、ＤＲ４マウスとＫ７１Ｅマウスの間の単一アミノ酸の違いを調べるために、デジタルＰＣＲを用いて分析する。
アルキル化化学療法薬であるブスルファンも又、同種操作ＨＳＣを受容するために対象を準備するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ブスルファンは、操作されたＤＲＢ１^*０４：０１Ｋ７１Ｅ対立遺伝子を有するドナーマウス由来の骨髄細胞を移入する前にレシピエントマウスを処置する目的でも使用される。

考察
本明細書に開示された実験及びデータは、ＲＡ並びに１型糖尿病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、及び免疫エフェクター細胞への自己ペプチドの望ましくないＨＬＡタンパク質媒介性結合及び提示から生じる他の障害を含む自己免疫疾患の治療のための概念の独自の証明を提供する。本開示は又、本出願者らの知る限り、ＲＡ以外の自己免疫疾患の治療に関する最初の記載である。従って、本開示は、本出願者らの知る限り、開示されたようなＨＬＡ操作による自己免疫の治療を幅広く可能にし、その保有を初めて実証するものである。
本開示は更に、自己免疫疾患において抗原として認識される自己ペプチドを含むペプチドの結合及び提示を改変するために、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質の抗原結合ポケット（ポケット１）を立体的に閉塞するという新規なＨＬＡ操作戦略を提供する。特に、本開示は、自己免疫に関連するＨＬＡタンパク質によるペプチド結合の量及び親和性を一般的に減少させるために、比較的小さいアミノ酸（例えば、グリシン）を比較的大きいアミノ酸（例えば、メチオニン）に置換する戦略を記載し、例示する（実施例７参照）。

従って、広範に具体化されるように、本開示は、特に、ＨＬＡ操作による自己免疫の治療又は予防方法、及び自己免疫疾患のためのＨＬＡ操作治療を設計する方法を提供する。ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで実施され得るＨＬＡ操作は、自己免疫応答に関連する１以上の自己ペプチドの結合を減少させ、ＨＬＡタンパク質によるその自己ペプチドの結合に寄与する１以上のアミノ酸を置換するように設計及び実施され、ここで、１以上のアミノ酸は、ＨＬＡタンパク質の抗原結合クレフト内のその位置により相対的に「免疫特権化」されている。
置き換えられた又は置換アミノ酸は、対象が罹患しているか、又は対象が罹患しやすいと考えられる特定の自己免疫疾患等の、自己免疫に対する耐性に関連するＨＬＡ対立遺伝子を参照して同定することができる。特定の実施形態において、例えば、操作のための候補ＨＬＡタンパク質アミノ酸残基は、自己免疫疾患に関連するＨＬＡタンパク質及び同じ自己免疫疾患に対する耐性に関連するＨＬＡタンパク質の配列及び／又は三次元モデルの比較によって同定される。このような三次元モデルには、自己免疫疾患に関連する１又は複数のペプチドと複合したＨＬＡタンパク質の結晶構造が含まれる。それに加えて、又はその代わりに、置換アミノ酸は、自己免疫関連ペプチド（例えば、糖尿病、ＲＡ、及びＭＳにおいて、それぞれインスリン、コラーゲン、ＲＡＳＤＲＰ２に由来するペプチド）へのＨＬＡタンパク質の結合を減少させる置換を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング及び／又はハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ等によって、ｄｅ ｎｏｖｏで同定することができる。

いくつかの実施形態では、これらの方法は、自己免疫疾患に関連するＨＬＡタンパク質のポケット１等の適切な位置にあるグリシン等の小さなアミノ酸を同定すること、及び対応するＨＬＡ対立遺伝子を操作して、より大きなサイズの置換アミノ酸を発現させることを含む。これらの方法は、上述の機能アッセイと同様に、操作されたＨＬＡタンパク質への自己及び／又は非自己ペプチドの結合をアッセイすることを更に含み得る。
本明細書で企図され、例えば実施例４で明示的に記載されるように、ＨＬＡ操作は、ＨＬＡタンパク質中の２つ以上のアミノ酸の置換（又は変異）を含むことができ、治療法を設計する方法は、それに応じて適用され、最適化され得る。

特定の実施形態は、自己免疫疾患を治療又は予防する方法、及びＨＬＡ操作による自己免疫疾患の治療法を設計する方法を提供する。特定の実施形態は、ＲＡ、Ｔ１Ｄ、ＭＳ、視神経脊髄炎、ベーチェット症候群、セリアック病、及び乾癬を治療又は予防する方法、並びにそれらの治療法を設計する方法を提供する。特定の実施形態は、Ｔ１Ｄ、ＭＳ、視神経脊髄炎、ベーチェット症候群、セリアック病、及び乾癬を治療又は予防する方法、並びにそれらの治療法を設計する方法を提供する。特定の実施形態では、ＨＬＡ操作は、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E変異を含まない。特定の実施形態では、ＨＬＡ操作は、ＤＲＢ１^*０４：０１対立遺伝子の位置７１の変異を含まない。特定の実施形態では、ＨＬＡ操作は、ＤＲＢ１^*０４：０１対立遺伝子の変異を含まない。
重要なことに、特定の実施形態を含む本開示の多くの実施形態は、治療後の免疫抑制を必要とせず、排除することができる。従って、本開示によるＨＬＡ操作による自己免疫疾患の治療法を設計する特定の方法は、例えば、候補変異の有効性及び非拒絶性を確認するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞刺激アッセイ及び／又は皮膚移植実験を含み、このような有効性及び／又は非拒絶性は、本明細書に開示されるようなＨＬＡ操作に適した変異を同定する。

複数の実施形態が開示されているが、本開示の概念、化合物、組成物、方法、工程、システム、及び療法の更なる他の実施形態は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。明らかなように、本開示は、様々な明白な局面において、全て本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく改変可能である。従って、詳細な説明は、本質的に例示的なものとみなされ、限定されるものではない。
本明細書で開示される全ての参考文献は、特許であれ非特許であれ、その全体がそれぞれ引用に含まれているかのように、本明細書の一部として援用される。参考文献と本明細書との間に矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。
本開示は、ある程度の特殊性をもって記載されているが、本開示は例示としてなされたものであり、詳細又は構造の変更は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本開示の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

図１は、自己免疫における様々な経路、相互作用、及び薬学的介入の模式図である。 図２は、マウスＴＣＲ／ＣＤ４と操作されたヒト化ＨＬＡ－ＤＲ４／Ｉ－Ｅ^dの相互作用を示す模式図であり、下は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖により検出した場合のコラーゲン感作に関する試験から得られた結果のグラフであり、記号は、個々のヒト化ＤＲＢ１^*０４：０１、ＤＲＢ１^*０１：０１及びＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eマウス由来サンプルを示し、バーは平均を示す。データは一元配置ＡＮＯＶＡにより分析されたものである。 図３Ａは、クレフト内のＤＲＢ１^*０４：０１同定位置Ｋ７１及びコラーゲンペプチドにより占められた抗原結合クレフトの三次元表示であり（左）、右の図はＤＲＢ１^*０４：０１^K71Eの構造及びコラーゲンペプチド結合が存在しない場合を示し、酸性残基を青で示し、塩基性残基を赤で示す。 図３Ｂは、０日目と９日目の代表的マウスのＤＲＢ１^*０４：０１レシピエントの皮膚移植片を示し、１５～１８日目の全てのマウスを示す。右下のパネルに、ＤＲＢ１^*０４：０１^K71E移植片（７０日目）の長期移植を示す。赤いかさぶたは移植片の拒絶を示す。 図４は、本開示の実施形態によるＤＲＢ１^*０１：０１、ＤＲＢ１^*１１：０１及びＤＲＢ１^*１５：０１成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図５は、ＤＲＢ１^*０１：０１、^*１５：０１及び^*１１：０１対立遺伝子の抗原結合試験を示し、ボックスの左上の数字は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現しない、従ってペプチド結合のない細胞（陰性対照）と比較したペプチドの結合比である。 図６は、自己免疫性脱髄関連ペプチドのＤＲＢ１^*１５：０１及び１５：０２単一及び二重変異実施形態への結合を示し、ボックスの左上の数字は、陰性対照（薄いグレー）と比較した結合比である。 図７は、自己免疫性脱髄関連ペプチドのＤＲＢ１^*１５：０１対立遺伝子への結合及び位置７１と８６における編集効果を示し、ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図８は、本開示の実施形態によるＤＲＢ１^*０３：０１、ＤＲＢ１^*０７：０１、及びＤＲＢ１^*０９：０１成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図９は、アクアポリン４ペプチド５及び６のＤＲＢ１^*０３：０１及びＤＲＢ１^*０７：０１への結合を示す。 図１０は、本開示の実施形態による^*０４：０１及び^*０４：０５成熟長タンパク質の配列アラインメントである。 図１１は、本開示の実施形態による、関節リウマチに関連する３つのペプチドのＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５対立遺伝子への結合及びＲ７１Ｅ編集の効果を示す。ボックスの右上の比は、陰性対照（コラーゲン）との比較又は天然型のビメンチン及びα－エノラーゼとの比較を示す。 図１２は、複数の濃度にわたるＨＩＰ８－ＮＰＹペプチドの天然とＡ５７Ｄへの結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１３は、複数の濃度にわたるＨＩＰ１１－Ｃペプチドの天然とＡ５７Ｄへの結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１４は、複数の濃度にわたるインスリンミモトープの天然とＡ５７Ｄ結合の比較を示し、黒丸は天然対立遺伝子であり、白丸はＡ５７Ｄ変異である：パネルＡ、ＤＱ２；パネルＢ、ＤＱ８；パネルＣ、ＤＱ２トランス；及びパネルＤ、ＤＱ８トランス。 図１５（上）は、ＤＱ２ Ｔ２細胞株が親ＥＢＶ株よりも遙かに良好にＥ２ Ｔ細胞クローンを刺激することを示す。Ａ５７Ｄ変異を導入するとＥ２ Ｔ細胞の刺激が低下する、ＤＱ２及びＤＱ２ Ａ５７Ｄを有するＥ２ Ｔ細胞の、１０ｕＭ及び２０ｕＭの前負荷濃度のＨＩＰ１１ペプチドでの刺激、黒丸はＤＱ２であり、白丸はＤＱ２ Ａ５７Ｄであり、菱形は患者ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株であり、（下）は、ＤＱ２トランス及びＤＱ２トランス Ａ５７Ｄを有するＥ２ Ｔ細胞の、１０ｕＭ及び２０ｕＭ前負荷濃度のＨＩＰ１１ペプチドでの刺激を示し、黒丸はＤＱ２トランスであり、白丸はＤＱ２トランス Ａ５７Ｄであり、菱形は患者ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株である。 図１６は、様々なＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合ハイブリッドインスリンペプチドを示し、ボックスの左上の数字は結合比である。 図１７は、本開示の実施形態による様々なＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子結合糖尿病誘発ペプチドを示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図１８は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０３：０１、^*０４：０１及び^*１５：０１へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上角の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図１９は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０３：０１、^*０４：０１及び^*１５：０１への糖尿病誘発ペプチド及びインフルエンザ血球凝集素ペプチドの結合を示す。ボックスの左上角の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２０は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５対立遺伝子へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。これらの対立遺伝子の「一般的な」血清学的名称（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ５２）は対立遺伝子名の上に示されている。 図２１は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５対立遺伝子への糖尿病誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２２は、本開示の実施形態による、遺伝子編集されたＨＬＡ分子による結合を検討するために本試験で使用した様々な抗原の一覧である。 図２３Ａは、本開示の実施形態による、ポケット１の位置を示すＤＲＢ１構造の三次元表示とアミノ酸化学の二次元表示である。 図２３Ｂは、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の対立遺伝子の抗原結合試験を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２４は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の２つの対立遺伝子へのハイブリッドインスリンペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２５は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１並びにポケット１変異Ｇ８６Ｌ及びＧ８６Ｍで編集された本開示の対立遺伝子への神経自己免疫性ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２６は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１及びポケット１変異で操作された本開示の対立遺伝子への関節炎誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、天然ペプチドと比較したシトルリン化ペプチドの結合比である。 図２７は、本開示の実施形態による、ＤＲＢ１^*０４：０１及びポケット１変異で操作された本開示の対立遺伝子への天然及びシトルリン化関節炎誘発ペプチドの結合を示す。ボックスの左上の数字は、陰性対照と比較した結合比である。 図２８は、本開示の実施形態による、代表的ＨＬＡ対立遺伝子、アミノ酸位置、及び変異の一覧である。 図２９では、様々なＨＬＡ対立遺伝子の成熟タンパク質配列を表に示す。 図３０では、感受性ＨＬＡ対立遺伝子及び操作されたＨＬＡ対立遺伝子の様々な実施形態のｃＤＮＡ配列を表に示す。

ペプチド結合アッセイのためのペプチド設計及び合成
ハイブリッドインスリンペプチドＨＩＰ１－ＷＥ１４（ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ）、ＨＩＰ６－ＩＡＰＰ２（ＧＱＶＥＬＧＧＧＮＡＶＥＶＬＫ）、ＨＩＰ８－ＮＰＹ（ＧＱＶＥＬＧＧＧＳＳＰＥＴＬＩ）、及びＨＩＰ１１－Ｃペプチド（ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）(Delong 2016, Baker2019)によりトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を除去して＞９８％純度となるように、ビオチン化ＰＥＧ３リンカーを用いてＮ末端に合成した。本研究に使用したＨＩＰは、利用可能なＴ細胞クローンを刺激するそれらの能力のために選択した（表２）。ビオチン化ＧＡＤ６５^265-281（ＡＭＭＩＡＲＦＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ）、インスリンミモトープ（ＨＬＶＥＥＬＹＬＶＡＧＥＥＧ）、及びインフルエンザＡ（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）ペプチドも、ＨＬＡ－ＤＲ及びＤＱ結合の対照として合成した[S. Dai, at doi.org/10.1073/pnas.1716527115]。ＨＩＰ６を除き、全てのペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、次いで等量の水、及び最後にダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再構成して４００μＭ濃度とし、ペプチド結合及びＴ細胞研究で使用するまで－２０℃で凍結保存した。ＨＩＰ６を３％アンモニア水、次いで当量の水、中性ｐＨに戻すための７５μＬの１Ｍ ＨＣＬ、及び最後にＤＰＢＳで再構成して４００μＭとした。

実施例６Ａ－ＲＡに関連するＨＬＡ対立遺伝子
ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５はＲＡに対する感受性も示す。特に、この対立遺伝子は、日本人集団のＲＡと強い関連を示す。これらの試験のために、ＤＲＢ１^*０４：０５の位置７１をＲからＥに変異させた（図１０参照）。
これらの試験は、ＤＲＢ１対立遺伝子^*０４：０５が免疫優性コラーゲンペプチドへの結合に対して強い優先性を示さないことを示す（図１１）。しかしながら、位置７１をグルタミン酸に変異させると（Ｒ７１Ｅ）、低レベルの結合が更に低下する。ビメンチン及びα－エノラーゼの場合、^*０４：０５対立遺伝子は、天然型よりもシトルリン化型と優先的に結合する。Ｋ７１Ｅ突然変異の場合、この優先性はＤＲＢ１^*０４：０５の位置７１のアルギニンをグルタミン酸に変更する（Ｒ７１Ｅ）ことによって低減される。ＭＦＩ結合比は、２回の実験の平均である。
本明細書で開示されるように、ＲＡに感受性の他のＤＲ４対立遺伝子、例えば、ＤＲＢ１^*０４：０３、^*０４：０４、及び^*０４：０８は、位置７１がアルギニン（Ｒ）からグルタミン酸（Ｅ）に変更されると耐性（即ち、耐性対立遺伝子）を付与し得る。

実施例６Ｂ－Ｉ型糖尿病に関連するＨＬＡ対立遺伝子－Ｔ１Ｄ
Ｉ型糖尿病に対する感受性に関連するＤＱＢ１対立遺伝子が、抗原結合グルーブにおける１以上の変異で耐性を付与することができるどうか試験した。具体的には、いくつかのＤＱＢ対立遺伝子及び対応するＡ５７Ｄ変異体をＴ２細胞株にクローニングした。いくつかの耐性対立遺伝子の位置５７にはアスパラギン酸が見られる。

ペプチド選択－ビオチン化ＰＥＧ３リンカーを用い、ハイブリッドインスリンペプチドＨＩＰ１－ＷＥ１４（ＧＱＶＥＬＧＧＷＳＫＭＤＱＬＡ）、ＨＩＰ６－ＩＡＰＰ２（ＧＱＶＥＬＧＧＧＮＡＶＥＶＬＫ）、ＨＩＰ８－ＮＰＹ（ＧＱＶＥＬＧＧＧＳＳＰＥＴＬＩ）、及びＨＩＰ１１－Ｃペプチド（ＳＬＱＰＬＡＬＥＡＥＤＬＱＶ）をＮ末端に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）(Delong 2016, Baker2019)によりトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を除去して＞９８％純度で合成した。この試験に使用したＨＩＰをＴ細胞クローンの刺激能及びアベイラビリティのため選択した（表２）。ビオチン化ＧＡＤ６５^265-281（ＡＭＭＩＡＲＦＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ）、インスリンミモトープ（ＨＬＶＥＥＬＹＬＶＡＧＥＥＧ）、及びインフルエンザＡ（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）ペプチドも又、ＨＬＡ－ＤＲ及びＤＱ結合の対照として合成した[S. Dai、doi.org/10.1073/pnas.1716527115で利用可能]。
ハイブリッドインスリンペプチドを、様々な濃度でこれらの細胞株に対する結合に関して試験した。具体的には、天然ＨＬＡ ＤＱＢ１対立遺伝子のペプチド結合をそのＡ５７Ｄ変異型と比較した。感受性対立遺伝子はハイブリッドインスリンペプチドと結合すると仮定された。

Claims (28)

1. ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、又はＨＬＡ－ＤＲＢ５の天然対立遺伝子によりコードされる配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質であって、
   アミノ酸配列のあるアミノ酸位置における少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記天然ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされる配列の前記アミノ酸位置におけるアミノ酸残基とは異なり、前記アミノ酸位置は抗原結合クレフトのポケット１又はその付近にあり、前記変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質は、少なくとも１つのペプチド抗原に対する結合親和性が前記天然ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して変化している、
   変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
2. 前記対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１である、請求項１に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
3. 前記対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ３である、請求項１に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
4. 前記対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ４である、請求項１に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
5. 前記対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ５である、請求項１に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
6. 前記アミノ酸位置が前記アミノ酸配列の位置８５又は位置８６である、請求項１～５のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
7. 前記アミノ酸配列のアミノ酸位置における前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、バリン、メチオニン、又はロイシンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
8. 前記少なくとも１つのアミノ酸残基がメチオニンである、請求項７に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
9. 前記少なくとも１つのアミノ酸残基がロイシンである、請求項７に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
10. 前記少なくとも１つのアミノ酸残基がグリシンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
11. 関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害（ＭＯＧＡＤ）、筋無力症候群及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、バードショットブドウ膜炎、ナルコレプシー、ナルコレプシー１型（ＮＴ１；以前はカタプレキシーを伴うナルコレプシーと呼称）、川崎病、クローン病、乾癬、皮膚筋炎（ＤＭ）、アジソン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、グレーブス病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎（ＰＭ）、傍腫瘍性神経症候群（ＰＮＳ）、自己免疫性脳炎、狼瘡腎炎（ＬＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、乾癬性関節炎、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、望ましくない遅延型過敏症反応、Ｔ細胞介在性肺疾患、神経炎、白斑、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、喘息、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、肺線維症又は特発性肺線維症、原発性胆汁性肝硬変、及び悪性貧血から選択される自己免疫性障害に罹患している患者の治療において使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質を含む、操作された造血系細胞。
13. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質をコードする核酸。
14. 請求項１３に記載の核酸を含む、操作された造血系細胞。
15. 自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＨＬＡ－ＤＲＢタンパク質、請求項１２若しくは請求項１４に記載の操作された造血系細胞、又は請求項１３に記載の核酸の使用。
16. ＨＬＡ対立遺伝子の改変方法であって、
    １以上の自己免疫疾患に関連するＨＬＡ対立遺伝子を同定すること；
    前記１以上の自己免疫疾患に対する感受性に関連する１以上の感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定すること；
    抗原結合クレフトのポケット又はその付近のアミノ酸位置に相当する標的配列を同定することであって、前記ポケットは、前記抗原結合クレフト内の抗原結合のための一次アンカーアミノ酸残基のセットである、同定すること；
    前記ポケット内に閉塞を作り出すために、前記アミノ酸位置の標的アミノ酸の、前記標的アミノ酸より大きい側鎖を有する第２のアミノ酸での置換を引き起こすように前記標的配列を改変することであって、前記第２のアミノ酸の前記側鎖は、前記抗原結合クレフトの前記ポケット内での抗原結合に影響を与える、改変すること；及び、それにより
    前記ＨＬＡ対立遺伝子の前記ポケットを閉塞すること
    を含む、方法。
17. 前記ＨＬＡ対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ポケットがポケット１である、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
19. 前記アミノ酸位置が、前記ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の８６である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第２のアミノ酸がバリン、メチオニン、及びロイシンから選択される、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ポケット内に閉塞を有するＨＬＡタンパク質が自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの自己ペプチドに対してより低い結合親和性を有し、前記少なくとも１つの自己ペプチドが脱イミノ化されていてもよく、更に任意選択で、前記標的アミノ酸がＴ細胞受容体結合界面にない、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 自己免疫疾患に罹患している又は自己免疫疾患を発症するリスクのある対象を治療する方法であって、
    前記対象のＨＬＡ複合体内のＨＬＡ遺伝子の、前記自己免疫疾患に対する感受性に関連する感受性ＨＬＡ対立遺伝子を同定すること；
    前記対象から複数のＣＤ３４＋免疫細胞を単離すること；
    前記ＣＤ３４＋免疫細胞のＨＬＡ複合体を改変して操作されたＣＤ３４＋免疫細胞を作出することであって、前記操作されたＣＤ３４＋免疫細胞は、前記感受性ＨＬＡ対立遺伝子を発現せず、操作されたＨＬＡ対立遺伝子を発現し、前記操作されたＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質は、前記感受性ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質とは、前記操作されたＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質の抗原結合クレフトのポケット内の閉塞が存在することで異なり、前記感受性ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して少なくとも１つの自己ペプチドに対する結合親和性が変化している、作出すること；
    複数の前記操作されたＣＤ３４＋免疫細胞を単離すること；
    前記単離された、操作されたＣＤ３４＋免疫細胞を前記対象に投与すること；及び、それにより、
    前記自己免疫疾患に罹患している又は前記自己免疫疾患を発症するリスクのある前記対象を治療すること
    を含む、方法。
23. 前記ＨＬＡ対立遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ポケットがポケット１である、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
25. 前記抗原結合クレフトの前記ポケット内の閉塞が、前記感受性ＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質と比較した、前記操作されたＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質の位置８６におけるアミノ酸置換に起因する、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記アミノ酸置換が、位置８６のアミノ酸をバリン、メチオニン、及びロイシンから選択されるアミノ酸に置き換えることである、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記操作されたＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質が、前記自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの自己ペプチドに対してより低い結合親和性を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記自己ペプチドが少なくとも１つの脱イミノ残基を含むペプチドから選択される、請求項２７に記載の方法。

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