CN117751136A

CN117751136A - 用于治疗自身免疫的工程化hla等位基因

Info

Publication number: CN117751136A
Application number: CN202280049028.7A
Authority: CN
Inventors: B·弗里德; C·罗阿克; E·孙德豪斯
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2024-03-22
Also published as: WO2022240915A1; US20230126183A1; US20230123094A1; CA3218757A1; JP2024517474A; US20230159617A1; JP2024517475A; CN117916257A; JP2024517476A; EP4337687A1; US20230295265A1; EP4337686A2; WO2022240917A2; KR20240023035A; US20230192808A1; WO2022240916A1; CN117813322A; AU2022272922A2; AU2022272922A1; US20230091257A1

Abstract

本发明公开了预防或治疗自身免疫性疾病的方法。在一些情形中，患有自身免疫性疾病或处于自身免疫性疾病发展风险的受试者被识别为在一个或多个HLA基因座处具有一种或多种自身免疫易感性HLA等位基因。在许多情形中，HLA基因座选自I类和II类基因座，例如I类的A、B和C，以及II类的DQ、DR和DP。在许多情形中，可以向患有自身免疫性疾病或处于自身免疫性疾病发展风险的受试者施用多个工程化自体HSC，所述多个工程自体HSC经修饰以携带和表达变体易感性等位基因，所述变体易感性等位基因在所述抗原结合裂隙中具有至少一个改变该变体HLA分子的抗原结合性和/或特异性的突变。在许多实施方案中，所述工程HSC是表达一种或多种经修饰的HLA蛋白的CD34+免疫细胞。

Description

用于治疗自身免疫的工程化HLA等位基因

发明领域

本申请所公开的组合物、方法和系统涉及自身免疫病症的治疗和预防。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.第119(e)条主张2021年5月10日提交的美国临时专利申请号63/186,770，标题为“用于治疗自身免疫的HLA工程化方法、化合物和组合物”的利益和优先权，该申请也通过引用全文并入本文。本申请与标题为“用于治疗自身免疫的HLA工程化方法和组合物”的相关美国非临时申请以及标题为“HLA工程化方法和自身免疫治疗”和“用于治疗自身免疫的HLA等位基因的口袋工程化”的PCT申请同时提交，所述申请通过引用并入。

序列表

本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过引用将其整体并入本文。所述ASCII副本于2022年_______创建，名为______.txt，并且是______字节大小。

背景技术

自身免疫是指身体免疫系统错误地将健康组织和细胞识别为外来物质并攻击它们的病理状况。由这种错误的免疫反应引起的任何疾病都被称为自身免疫性疾病、障碍或病症。虽然一些自身免疫性疾病比如类风湿性关节炎(RA)、1型糖尿病(T1D)和多发性硬化症(MS)比其他疾病更为普遍，但它们共同构成了严重的公共卫生挑战，影响着全世界数百万人。通常，患有自身免疫性疾病的患者会出现各种症状，这些症状包括但不限于从轻微的症状，包括疲劳、发烧、肌肉疼痛、关节疼痛和肿胀、皮肤问题、腹痛和消化问题，到更严重的症状，包括活动能力下降、视力丧失和器官衰竭。

自身免疫性疾病可能有多种分子、细胞和生理基础。一般来说，自身免疫是免疫系统失调的结果，这可能源于遗传或环境因素，导致受试者的免疫系统自行启动。理想情况下，在正常情况下，健康的免疫系统识别并抵抗外来物(例如微生物、病毒、蛋白质和核酸)。然而，为了有效地做到这一点，必须训练它避免攻击受试者自身的组织、细胞、蛋白质和核酸。

人类白细胞抗原(HLA)是指编码参与免疫功能的蛋白质的一组相关基因。HLA I类和II类蛋白是具有肽结合裂隙的细胞表面蛋白，所述肽结合裂隙用于将肽呈递给T细胞受体。HLA基因复合体位于人类6号染色体的短臂上。关于HLA蛋白的等位基因有一个众所周知的命名法。例如，如HLA研究人员熟知的DRB1*01:01:01:01是指HLA复合体的DRB1基因的等位基因，HLA基因名称后的前两个值并由‘*’与名称分隔开(在此示例中为‘01:01’)指等位基因组或水平，以及蛋白质序列水平的差异-例如，DRB1*01:01和DRB1*01:02在肽结合区中的两个氨基酸不同。第三个字段(此处为第三个‘01’)表示遗传序列中的差异，由于遗传密码的简并性，该差异不会改变氨基酸，因此在免疫学上是相同的-即，DRB1*01:02:01与DRB1*01:02:02在免疫学上相同。最后一个字段(即最后的‘01’)表示蛋白质编码区外部(内含子、启动子等)发生的遗传序列差异-因此，DRB1*01:01:01:01和假设的DRB1*01:01:01:02在编码序列内的免疫学和遗传水平上是相同的，但具有不同的非编码序列。这种类型的变化通常可能会影响表达水平。因此，按照惯例，如本文所引用的，工程化HLA等位基因通常使用前两个字段来描述。

HLA是与自身免疫性疾病相关的主要遗传因素，约占已知遗传倾向的一半。尽管已经描述了多于200种HLA与疾病之间的关联，但潜在的致病机制仍不清楚。最初，HLA的特殊遗传特征以及与其他基因和环境的复杂相互作用阻碍了该领域进一步具有临床意义的发展。更需要剖析和了解HLA在疾病易感性中的作用。

类风湿性关节炎，或RA，是一种自身免疫性疾病，其特征是关节囊滑膜炎症，导致巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞浸润。这最终导致广泛的关节破坏、残疾和生活质量下降。与RA相关的持续炎症也会增加患缺血性心脏病和呼吸系统疾病的风险，从而导致早期死亡。大约有1％的世界人口患有RA，估计仅在美国(US)就有130万人受到影响。RA更常见于40岁以上的女性和长期吸烟者。仅在美国，每年数十亿美元的直接医疗费用与RA的治疗相关，每年RA的社会总成本(直接、间接和无形)估计就达到数百亿美元。

RA的治疗需要采用系统方法，频繁监测疾病活动性和药物副作用，以确定适合患者的最佳治疗方案。目前有多种已批准的治疗制剂可以控制症状、控制疼痛和限制关节损伤。目前治疗RA的药物包括非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、皮质类固醇、合成缓解病情抗风湿药(DMARD)和生物制剂。DMARD治疗在全球范围内针对免疫系统的主要组成部分，以阻止RA的进展，并需要持续给药以维持缓解。这使患者面临产生不良副作用、严重感染、恶性肿瘤和器官毒性的风险；患者还可以针对生物制剂产生抗药物抗体(ADA)，从而中和其作用。此外，大约6％至21％的患者无法通过当前的治疗获得足够的反应来充分控制疾病。此类患者通常被称为难治性RA患者。

现有的自身免疫性疾病治疗方法针对症状，而不是疾病的根本原因。许多自身免疫性疾病，如RA，是由HLA等位基因的亚型呈现修饰的自肽引发的。

移植造血干细胞(HSC)来治愈RA未能成功安全地实现长期缓解。首先，自体移植采用短期化疗来重置免疫系统，是相对安全的，但这并没有解决根本问题，而是简单地将与最初允许RA发展的相同的、有问题的细胞重新填充到骨髓中。其次，由于使用相同的HLA等位基因来替代患者的骨髓，来自HLA匹配供体的同种异体骨髓移植也表现出很高的复发率。此外，该技术与移植物抗宿主病(GVHD)相关，使其成为不可接受的治疗策略。最近一项对17项研究进行的荟萃分析(meta-analysis)，涉及155名接受自体HSC移植的独特RA患者，结果表明缓解不能维持超过2年。

美国国立卫生研究院(NIH)2005年报告称，美国有多达2350万人可能患有自身免疫性疾病，而且大多数情况下无法治愈。由于缺乏治疗，使得许多患者出现衰弱症状、器官功能丧失、工作效率下降和高昂的医疗费用。需要有效的疗法来治疗自身免疫性疾病。

本文中，申请人描述了靶向与自身免疫性疾病相关的HLA等位基因的技术，并使用该信息来创建包含一种或多种自体HSC的定制治疗，其中靶HLA等位基因已被工程化以具有改变的抗原结合亲和力和/或特异性。

发明内容

在此，为了解决自身免疫性疾病的现有治疗和管理中的上述和其他缺点，申请人开发了识别和靶向与疾病相关的HLA等位基因的方法，并使用该信息来创建涉及一种或多种自体HSC的定制治疗，其中靶HLA等位基因经过工程化改造，改变了自身抗原结合亲和力和/或特异性。

本文公开了可用于减少患有自身免疫疾病、病症或病症或处于发展自身免疫疾病、病症或病症风险的受试者中的自身免疫的方法和组合物。此类疾病、病症和病症包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体病症(MOGAD)、肌无力综合征与视神经脊髓炎(NMO)、强直性脊柱炎、白盖特氏综合征(syndrome)、鸟弹葡萄膜炎(Birdshot uveitis)、发作性睡病(narcolepsy)、1型发作性睡病(NT1；以前称作发作性睡病伴猝倒(narcolepsywith cataplexy))、川崎病、克罗恩病(Crohn’s disease)、牛皮癣、皮肌炎(DM)、阿迪森氏病(Addison's disease)、肠易激综合征(irritable-bowl syndrome(IBS))、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、过敏性紫癜(Henoch-/>purpura(HSP))、结节病、干燥综合征(syndrome)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、桥本氏病(Hashimoto's disease)、特发性血小板减少性紫癜、多发性肌炎(PM)、副肿瘤性神经综合征(PNS)、自身免疫性脑炎、狼疮性肾炎(LN)、重症肌无力(MG)、银屑病关节炎、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、不良迟发型超敏反应、T细胞介导的肺部疾病、神经炎、白癜风、自身免疫性胰腺炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、寻常型天疱疮、肺纤维化或特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血。各种自身免疫性疾病是与人类白细胞抗原(HLA)基因的一个或多个等位基因的存在相关，其中HLA基因是一组编码参与免疫功能的蛋白质的相关基因。HLA I类和II类蛋白是具有肽裂隙的细胞表面蛋白，用于将肽呈递给T细胞受体。HLA基因复合体位于人类6号染色体的短臂上。

一方面，提供了修饰与自身免疫性疾病相关的HLA等位基因的方法。其中一种方法包括识别自身免疫易感性HLA等位基因的步骤；识别易感性HLA等位基因编码的蛋白质的结合裂隙内的靶氨基酸位置，其中靶氨基酸位置具有与自身免疫抗性HLA等位基因不同的特征；将靶氨基酸位置的氨基酸特征修饰为自身免疫抗性HLA等位基因中相同氨基酸位置的特征，以产生修饰的自身免疫易感性HLA等位基因，其中由修饰的自身免疫易感性HLA编码的蛋白质对至少一种自身肽具有改变的结合亲和力。

在本公开的相关方面，提供了治疗患有自身免疫性疾病或处于发展自身免疫性疾病风险的受试者的方法。一种这样的方法包括识别受试者的HLA复合物内的自身免疫易感性HLA等位基因的步骤；从受试者分离多个CD34+免疫细胞；修饰CD34+免疫细胞以产生表达修饰的自身免疫易感性HLA等位基因的修饰的CD34+免疫细胞。与自身免疫易感性HLA等位基因编码的蛋白质相比，修饰的自身免疫易感性HLA等位基因编码的蛋白质对至少一种自身肽具有改变的结合亲和力。

在根据本公开的某些实施方案中，提供了用于识别与HLA I类和II类蛋白呈递的抗原相关的自身免疫病症的方法，所述自身免疫病症可用工程化的自体表达HLA的造血细胞治疗。在许多实施方案中，HLA基因座选自I类A、B和C，以及II类DP、DR和DQ。在一些实施方案中，HLA基因、等位基因和蛋白质可包括HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*29、HLA-B*07、HLA-B*08、HLA-B。*27、B*27:03B*27:05、B*27:09、HLA-B*51、HLA-B*54、HLA-B*57、HLA-C*06、HLA-C*18、HLA-DPA1*02、HLA-DPB1*13、HLA-DQA1*02、HLA-DQA1*03、HLA-DQA1*05、HLA-DQB1*02、HLA-DQB1*03、HLA-DQB1*06、HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04、HLA-DRB1*07、HLA-DRB1*08、HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*15、HLA-DRB1*16以及这些HLA的变体中的一种或多种。所公开的方法包括，在某些实施方案中，识别与特定自身免疫性疾病的易感性(易感性等位基因)相关的一种或多种HLA等位基因以及与对特定自身免疫性疾病的抗性(抗性等位基因)相关的同一HLA基因的一种或多种等位基因的步骤，识别HLA基因的抗原结合沟槽内的一个或多个可变氨基酸位置，其中易感等位基因的可变氨基酸位置具有第一特征，并且抗性等位基因的可变氨基酸位置具有第二特征。

本公开的某些实施方案部分地以特定自身免疫性疾病和特定HLA等位基因之间因果关系的发现为前提。例如，某些实施例基于1型糖尿病与DQB1*02和/或DQB1*03、并且特别是与DQB1*02:01和/或DQB1*03:02的关联。在一些实施方案中，类风湿性关节炎(RA)与DRB1*04和DRB1*01相关，特别是DRB1*04:01、DRB1*04:05和DRB1*01:01。在一些这样的实施方案中，多发性硬化症(MS)与DRB1*15、特别是DRB1*15:01相关。在一些这样的实施方案中，乳糜泻与DQB1*02、特别是DQB1*02:01相关。在一些这样的实施例中，NMO与DRB1*03、特别是DRB1*03:01相关。在一些这样的实施方案中，白盖特氏综合征(syndrome)与B*51或B51相关。在某些情况下，牛皮癣可能与C*06、B*57、DRB1*07和/或DQB1*03相关。在某些情况下，鸟弹葡萄膜炎(Birdshot uveitis)可能与A*29有关。在某些情况下，发作性睡病(narcolepsy)可能与DQB1*06，特别是DQB1*06:02相关。在一些情况下，重症肌无力(MG)可能与A*03、B*07、DR2(DRB1*15和/或DRB1*16)和/或DR4(DRB1*04)相关。在某些情况下，川崎病可能与B*54有关，特别是氨基酸位置91、104和329。在某些情况下，炎症性肠病可能与DRB1*01，特别是DRB1*01:03相关。在一些情况下，系统性硬化症可能与DRB1*11、DPB1*13、B*08、DQA1*02:01、DQA1*05、DRB1*08、DRB1*07、DPA1*02、DQB1*03有关，特别是DRB1*11:04、DPB1*13:01、B*08:01、DQA1*02:01、DQA1*05:01、DRB1*08:01、DRB1*07:01、DPA1*02:01、DQB1*03:01。

本文还公开了可用于治疗或预防自身免疫病症的化合物和组合物。在许多实施方案中，所公开的化合物和组合物包括一种或多种包含修饰的HLA等位基因的工程化免疫细胞。在大多数实施方案中，修饰的HLA等位基因是经编辑的蛋白质分子并且在由修饰的HLA等位基因编码的HLA蛋白质的肽结合裂隙内含有至少一个氨基酸突变。在其他实施方案中，修饰的HLA等位基因是编码经编辑的HLA蛋白的经编辑的核酸分子，其中经编辑的核酸含有至少一个编码经编辑的HLA蛋白的肽结合裂隙中的氨基酸突变的密码子。在大多数实施方案中，氨基酸突变不在T细胞受体界面处。在许多实施方案中，修饰的HLA等位基因可以被工程化免疫细胞携带、包含或表达。在许多实施方案中，工程化免疫细胞是自体细胞——即，它们从正在接受自身免疫性疾病治疗的受试者获得。在许多实施方案中，工程化免疫细胞可以包含在组合物内，例如可以施用于患有自身免疫疾病或处于自身免疫疾病风险中的受试者的治疗组合物。在许多实施例中，工程化免疫细胞可以是HSC。

进一步公开了制备所公开的化合物和组合物的方法。在许多实施方案中，该方法包括识别与特定自身免疫性疾病发病率升高相关的一种或多种HLA基因、识别与易感性相关的HLA基因的一种或多种等位基因(易感性等位基因)和/或与特定自身免疫性疾病相关的一种或多种等位基因。和/或对特定自身免疫性疾病具有抗性(抗性等位基因)，识别HLA分子的抗原结合沟槽内的一个或多个可变氨基酸位置，其中易感等位基因的可变氨基酸位置具有第一特征并且可变抗性等位基因的氨基酸位置具有第二个特征。在某些实施方案中，制备所公开的化合物的方法还包括产生易感等位基因的工程化HLA分子，其中可变位置处的氨基酸的特征是第二特征。在一些实施方案中，工程化HLA分子由表达载体或工程化基因组序列编码。

还公开了用所公开的疗法治疗需要的受试者的多种方法，其中治疗包括施用一种或多种工程化抗原呈递细胞，所述细胞在MHC抗原结合区(例如，HLA蛋白质的抗原结合沟槽)内具有至少一个突变的氨基酸。在许多实施方案中，治疗方法包括从供体分离一种或多种细胞。在许多实施例中，分离的细胞是HSC。在许多实施例中，该方法进一步包括修饰HSC以产生工程化HSC的步骤。工程化HSC包含工程化HLA等位基因(经编辑的HLA等位基因、变体HLA等位基因、经修饰的HLA等位基因)，其对自身抗原或变体自身抗原具有改变的结合特异性或亲和力。在一些实施方案中，经修饰的HSC在其基因组序列中包含编码工程化HLA等位基因的一种或多种核酸序列，或者包含编码工程化HLA等位基因的核酸序列的一种或多种表达载体。在许多实施例中，经修饰的HSC可以植入受试者的骨髓中并产生一种或多种经修饰的抗原呈递细胞。

本文公开了用于治疗处于发展或患有自身免疫性疾病风险的受试者的多种组合物。在代表性的具体实施方案中，组合物包含选自由SEQ ID NO：59-96组成的组的DNA序列。

在根据本公开的一些某些实施方案中，对自身免疫性疾病的易感性与HLA-DRB1基因相关，例如DRB1*01、DRB1*03、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*10，DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14、DRB1*15和DRB1*16。在许多实施方案中，自身免疫性疾病与选自以下的HLA-DRB1的等位基因相关：DRB1*01:01、DRB1*01:02、DRB1*01:03、DRB1*03:01、DRB1*04:01、DRB1*04:02、DRB1*04:03、DRB1*04:04、DRB1*04:05、DRB1*04:08、DRB1*07:01、DRB1*09:01、DRB1*10:01、DRB1*11:01、DRB1*11:02、DRB1*11:03、DRB1*12:01、DRB1*13:01、DRB1*14:01、DRB1*15:01、DRB1*15:02和DRB1*16:01。

在相关实施方案中，组合物包含DRB1*01:01蛋白质或其DNA编码区，其包含在选自L67、Q70、V85、G86、R71的位置处的突变(氨基酸位置参考如所呈现的成熟蛋白质序列)(ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla)及其组合，例如但不限于L67I、Q70D、V85A、G86V，R71 E及其组合。例如，在一些实施方案中，组合物包含变体DRB1*03:01蛋白或编码区，其包含位置V86处的突变，例如V86L或V86M。在一些实施方案中，组合物包含变体DRB1*04:03、DRB1*04:04、DRB1*04:05和DRB1*04:08蛋白质或编码区，其包含在位置R71处的突变，例如R71E。在一些实施方案中，组合物包含变体DRB1*13:01蛋白或编码区，其包含位置V86处的突变，例如V86L或V86M。在一些实施方案中，组合物包含变体DRB1*15:01蛋白或编码区，其包含位置F47、A71或V86处的突变，例如F47Y、A71R、V86L、V86M及其组合。

在本公开的一些实施方案中，对自身免疫性疾病的易感性与HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5基因相关，例如HLA-DRB3*01、HLA-DRB3*02、HLA-DRB3*03、DRB4*01和DRB5*01。例如，在某些实施方案中，自身免疫性疾病与选自DRB3*01:01、DRB3*02:02、DRB3*03:01、DRB4*01:01、DRB4*01:03和DRB5*01:01的HLA-DRB3/4/5等位基因相关。

在根据本公开的另外的实施方案中，对自身免疫性疾病的易感性与HLA-DQA和/或HLA DQB基因相关。例如，在某些实施方案中，自身免疫性疾病与HLA-DQA 1的等位基因相关和/或选自DQA1*01、DQA1*03、DQA1*05、DQB1*02、DQA1*03、DQB1*05、DQB1*06及其组合，例如DQ5，DQA1*01:01和DQB1*05:01；DQ6、DQA1*01:02和DQB1*06:02；DQ2、DQA1*05:01和DQB1*02:01；DQ2反式(Trans)、DQA1*03:01和DQB1*02:01；DQ8、DQA1*03:01和DQB1*03:02；DQ8反式、DQA1*05:01和DQB1*03:02；DQA1*05:05和DQB1*03:01；和DQA1*03:01和DQB1*03:01。在一些这样的实施方案中，至少一种修饰的或变体HLA被工程化，在抗原结合沟槽内具有至少一个取代，例如位置57或71，其中突变是A57D、K71E、K71T或其组合。

在根据本公开的进一步的实施方案中，对自身免疫性疾病的易感性与HLA-B基因相关。例如，在一些实施方案中，自身免疫性疾病与B27的等位基因相关和/或选自B*27:03、B*27:05和B*27:09。在许多实施方案中，突变可以位于选自抗原结合沟槽内的任何多态性位置的位置，例如位置59或116，其中突变是Y59H、D116H或其组合。

本文进一步公开了用于识别HLA等位基因的位置的方法，所述HLA等位基因在突变时可用于降低或消除对自身免疫的易感性或自身免疫的症状。在许多实施方案中，该方法包括比较患有自身免疫性疾病的一组个体、识别与疾病易感性相关的特定HLA基因等位基因(易感性等位基因)、识别与疾病抗性(抗性)相关的特定HLA基因等位基因。等位基因)，识别位于HLA分子的抗原结合沟槽内、抗性等位基因(或抗性等位基因)和易感性等位基因(或易感等位基因)之间的多态性氨基酸位置，即，抗性等位基因与易感性等位基因的特征不同。比如，位于抗原结合沟内的DRBl基因的残基包括8-14、16、25-26、28、30-33、37-38、40、47、57-60、67、70-71、73-74、77-78、85-86和93。在相关实施方案中，该方法还包括工程化易感性等位基因以在多态性位置处包括抗性等位基因的氨基酸特征。在根据本公开的某些实施方案中，在一种或多种抗原呈递细胞(APC)上表达此类工程化HLA分子可预防、治疗或改善受试者的自身免疫病。

本文还公开了与非工程化HLA分子相比具有改变的抗原结合和/或特异性的工程化HLA分子。在许多实施方案中，抗原可以选自各种肽，包括修饰的肽、瓜氨酸肽、杂合肽、核酸等。在一些实施方案中，杂合肽是杂合胰岛素肽。在一些实施方案中，肽选自ENPVVHFFKNIVTPRTPPP、LVRYWISAFP、FFRDHSYQEEA、AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR、GQVELGGWSKMDQLA、GQVELGGGNAVEVLK、GQVELGGGSSPETLI、SLQPLALEAEDLQV、HLVEELYLVAGEEG、AMMIARFKMFPEVKEKG、SHLVEALYLVCGERG、RSQVETDDLILKPGV、SQVETDDLILKPGVV、PGIAGFKGEQGPKGE、IFDSRGNPTVEVDLF、IFDS{CIT}GNPTVEVDLF、SAVRLRSSVPGVR、SAVRL{CIT}SSVPGVR、QDFTNRINKLKNS、QDFTN{CIT}INKLKNS、ATEGRVRVNSAYQDK、ATEG{CIT}VRVNSAYQDK、ATIKAEFVRAETPYM、ATIKAEFV{CIT}AETPYM、AVRLQGSVAGVR、PYHFKYHEKHFANAI、PVSKMRMATPLLMQA、PKYVKQNTLKLAT及其组合，其中{CIT}表示脱亚胺基精氨酸残基，可称为瓜氨酸残基。

还公开了闭塞HLA等位基因的结合裂隙中的口袋的方法，该方法包括以下步骤：识别易感HLA等位基因，以及识别在抗原结合裂隙的口袋(pocket)处或附近的靶氨基酸位置，其中所述口袋限定了位于抗原结合裂隙底部的凹陷处。该方法还可以包括取代具有比靶氨基酸更大侧链的氨基酸以产生被闭塞的HLA等位基因，其中第二氨基酸的侧链延伸到抗原结合裂隙底部的凹陷中，从而闭塞HLA等位基因的口袋。在各种实施方案中，HLA等位基因可以选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5，并且口袋可以是口袋1(Pocket 1)。在这些实施方案中，靶氨基酸可以是例如位置86，并且取代的氨基酸的特征可以选自缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸。在许多实施方案中，口袋中存在闭塞的HLA蛋白可以对与自身免疫性疾病相关的至少一种自肽具有较低的结合亲和力，任选地其中所述至少一种自肽是脱亚胺化的，并且进一步任选地其中靶氨基酸不在T细胞受体结合界面处。

贯穿本公开，可以参考各种出版物。在法律允许的范围内，这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中。

本公开足以使本领域技术人员能够实践本公开。本公开的范围不限于所描述的构造，因为所描述的实施例旨在作为本公开的某些方面的说明，并且功能上等同的任何构造都在本公开的范围内。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。根据请求并支付必要的费用，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开副本。

通过结合以下附图的详细描述，将容易理解实施方案。附图中通过示例而非限制的方式示出了实施方案。

图1是自身免疫中的各种途径、相互作用和药物干预的示意图。

图2描述了小鼠TCR/CD4与工程化人源化HLA-DR4/I-E^d相互作用的示意图，底部是通过CD4⁺T细胞的离体增殖检测到的胶原致敏研究的结果图，其中符号表示来自人源化DRB1*04:01、DRB1*01:01和DRB1*04:01^K71E小鼠个体的样本，条形表示平均值。数据通过单向方差分析进行分析。

图3A显示了DRB1*04:01的三维描绘，识别了裂隙内的位置K71和被胶原肽占据的抗原结合裂隙(左)；右图显示了DRB1*04:01^K71E的结构以及胶原蛋白肽结合的缺失-酸性残基以蓝色阴影表示，碱性残基以红色阴影表示。

图3B显示了第0天和第9天的代表性小鼠的DRB1*04:01受体中的皮肤移植物，以及显示了第15-18天的所有小鼠。右下图中显示了DRB1*04:01^K71E移植(第70天)的长期植入。红色结痂表明移植物被排斥。

图4是根据本公开的实施方案的DRB1*01:01、DRB1*11:01和DRB1*15:01成熟长度蛋白质的序列比对。

图5描述了DRB1*01:01、*15:01和*11:01等位基因的抗原结合研究，方框左上角的数字是肽比细胞(不表达任何HLA II类分子因此不结合肽，阴性对照)的结合比率。

图6描述了自身免疫脱髓鞘相关肽与DRB1*15:01和15:02单、双突变体实施方案的结合，方框左上角的数字是与阴性对照(浅灰色)相比的结合比率。

图7描述了自身免疫脱髓鞘相关肽与DRB1*15:01等位基因的结合，以及编辑位置71和86处的效果；方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图8是根据本公开的实施方案的DRB1*03:01、DRB1*07:01和DRB1*09:01成熟长度蛋白质的序列比对。

图9描述了与DRB1*03:01和DRB1*07:01结合的水通道蛋白4肽5和6。

图10是根据本公开的实施方案的*04:01和*04:05成熟长度蛋白质的序列比对。

图11描述了根据本公开的实施方案，与类风湿性关节炎相关的三种肽与DRB1等位基因*04:05等位基因的结合以及R71E编辑的效果。方框右上角的比率是与阴性对照(胶原)的比较或与波形蛋白和α-烯醇酶的天然形式的比较。

图12描述了天然vs.A57D在多个浓度下的HIP8-NPY肽结合，其中实心圆是天然等位基因，空心圆是A57D突变：图A，DQ2；图B，DQ8；图C，DQ2反式；和图D，DQ8反式。

图13描述了天然vsA57D在多个浓度下的HIP11-C肽结合，其中实心圆是天然等位基因，空心圆是A57D突变：图A，DQ2；图B，DQ8；图C，DQ2反式；和图D，DQ8反式。

图14描述了天然vsA57D在多个浓度下的胰岛素模拟表位结合，其中实心圆是天然等位基因，空心圆是A57D突变：图A，DQ2；图B，DQ8；图C，DQ2反式；和图D，DQ8反式。

图15(顶部))显示DQ2 T2细胞系比亲本EBV系更好地刺激E2 T细胞克隆。引入A57D突变导致E2 T细胞刺激减少：用DQ2和DQ2 A57D在10μM和20μM预加载浓度的HIP11肽下刺激E2 T细胞，实心圆是DQ2，空心圆是DQ2 A57D，菱形是亲本EBV转化的B细胞系(底部)显示在10μM和20μM预加载浓度的HIP11肽下，DQ2反式和DQ2反式A57D对E2 T细胞的刺激，其中实心圆是DQ2反式，空心圆是DQ2反式A57D、钻石是亲本EBV转化的B细胞系。

图16描述了各种HLA-DQ等位基因结合杂合胰岛素肽，方框左上角的数字是结合比率。

图17描述了根据本公开的实施方案，多种HLA-DQ等位基因结合致糖尿病肽。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图18描述了根据本公开的实施方案，杂合胰岛素肽与DRB1*03:01、*04:01和*15:01的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图19描述了根据本公开的实施方案，致糖尿病肽和流感血凝素肽与DRB1*03:01、*04:01和*15:01的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图20描述了根据本公开的实施方案，杂合胰岛素肽与DRB3、DRB4和DRB5等位基因的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。这些等位基因的“常见”血清学名称(例如HLA-DR52)显示在等位基因名称上方。

图21描述了根据本公开的实施方案，致糖尿病肽与DRB3、DRB4和DRB5等位基因的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图22是根据本公开的实施方案，在本研究中用于研究基因编辑的HLA分子的结合的多种抗原的列表。

图23A是根据本公开的实施方案，三维展示DRB1结构的的口袋1(Pocket 1)的位置，以及二维展示氨基酸化学。

图23B描述了根据本公开的实施方案，DRB1*04:01和本公开的具有口袋1突变G86L和G86M的经编辑等位基因的抗原结合研究。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图24描述了根据本公开的实施方案，杂合胰岛素肽与DRB1*04:01和本公开的具有口袋1突变G86L和G86M的两个经编辑等位基因的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图25描述了根据本公开的实施方案，神经自身免疫肽与DRB1*04:01和本公开的具有口袋1突变G86L和G86M的经编辑等位基因的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图26描述了根据本公开内容的实施方案，致关节炎肽与DRB1*04:01和本公开的具有口袋1突变的工程化等位基因的结合。方框左上角的数字是瓜氨酸肽与天然肽相比的结合比率。

图27描述了根据本公开内容的实施方案，天然的和瓜氨酸化的致关节炎肽与DRB1*04:01和本公开的具有口袋1突变的工程化等位基因的结合。方框左上角的数字是与阴性对照相比的结合比率。

图28是根据本公开的实施方案的代表性HLA等位基因、氨基酸位置和突变的列表。

具体描述

本文公开了用于治疗、减少或消除受试者中的自身免疫性疾病的多种方法和组合物，所述受试者患有自身免疫性疾病或处于发生自身免疫性疾病的风险。此类自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体病症(MOGAD)、肌无力综合征和视神经脊髓炎(NMO)、强直性脊柱炎、白盖特氏综合征(syndrome)、鸟弹葡萄膜炎(Birdshotuveitis)、发作性睡病(narcolepsy)、1型发作性睡病(NT1；以前称为发作性睡病伴猝倒(narcolepsy with cataplexy))、川崎病、克罗恩病(Crohn's disease,)、牛皮癣、皮肌炎(DM)、阿迪森氏病(Addison's disease)、肠易激综合症(IBS)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、过敏性紫癜(Henoch-/>purpura(HSP))、结节病、干燥综合征(/>syndrome)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、桥本氏病(Hashimoto's disease)、特发性血小板减少性紫癜、多发性肌炎(PM)、副肿瘤性神经综合征(PNS)、自身免疫性脑炎、狼疮性肾炎(LN)、重症肌无力(MG)、银屑病关节炎、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、不良迟发型超敏反应、T细胞介导的肺部疾病、神经炎、白癜风、自身免疫性胰腺炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、寻常型天疱疮、肺纤维化或特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血。

在根据本公开的具体实施方案中，所公开的自身免疫性疾病与一种或多种人类白细胞抗原(HLA)等位基因的存在相关。申请人在本文中描述了可用于改善患有自身免疫性疾病的受试者中的其一种或多种症状的方法和化合物。在许多实施方案中，该方法可以包括识别由受试者的抗原呈递细胞表达的自身免疫易感HLA等位基因，将该易感HLA等位基因的氨基酸序列与对该相同自身免疫性疾病的抗性相关的一个或多个HLA等位基因进行比较。在大多数实施方案中，造血干细胞被移动并从受试者中分离，并且易感HLA等位基因被修饰或替换为工程化HLA等位基因，所述工程化HLA等位基因包含在由HLA等位基因编码的蛋白质的抗原结合裂隙内的一个或多个氨基酸取代，经取代的氨基酸的具体身份对应于与抗性相关的HLA等位基因中相同氨基酸位置的身份。

在某些实施方案中，HLA基因的抗原呈递裂隙的靶向工程化修饰对一种或多种自身抗原的结合特异性和/或亲和力。在大多数实施方案中，对TCR检测(TCR interrogation)隐藏的裂隙内的单个氨基酸被突变以改变肽结合而不直接影响TCR结合。在大多数实施方案中，所公开的HLA突变导致HLA蛋白变化，其不能触发患者的排斥或GVHD。在大多数实施方案中，工程化HLA蛋白在患有自身免疫性疾病的受试者中的一种或多种抗原呈递细胞上的表达可以导致与自身免疫性疾病相关的一种或多种症状的改善。

还公开了闭塞HLA等位基因的结合裂隙中的口袋的方法，该方法包括以下步骤：识别易感HLA等位基因，以及识别在抗原结合裂隙的口袋处或附近的靶氨基酸位置，其中所述口袋限定了位于抗原结合裂隙底部的凹陷处。所述方法可以进一步包括取代具有比靶氨基酸更大侧链的氨基酸以产生闭塞HLA等位基因，其中第二氨基酸的侧链延伸到抗原结合裂隙底部的凹陷中，从而闭塞HLA等位基因的口袋。在不同的实施方案中，所述HLA等位基因可以选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5，并且口袋可以是口袋1。在这些实施方案中，靶氨基酸可以是，例如位置86，并且经取代的氨基酸的身份可以选自缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸。在许多实施方案中，口袋中存在闭塞的HLA蛋白可以对与自身免疫性疾病相关的至少一种自肽具有较低的结合亲和力，任选地其中所述至少一种自肽是脱亚胺化的，并且进一步任选地其中靶氨基酸不在T细胞受体结合界面处。

申请人目前的概念如图1所示。HLA T细胞受体(TCR)相互作用是许多自身免疫性疾病(例如上述疾病)发病机制的核心方面。目前针对自身免疫性疾病的生物制剂倾向于靶向并阻断该信号下游的先天和适应性通路。这是有问题的，因为这些通路参与针对多种病原体的保护性免疫反应，并且阻断或改变它们会使患者面临各种机会性感染的风险。

APC源自骨髓中的HSC祖细胞。本公开描述的工程化HSC取代了呈递导致自身免疫的抗原的受试者APC。工程化HSC表达改变的HLA分子，这将减少、预防和/或解决自身反应性CD4⁺T细胞的先前激活及其对慢性炎症细胞因子产生、巨噬细胞激活和B细胞自身抗体产生的后续影响。

因此，在本公开的一方面，申请人在本文中提供了使用包含如本文所描述的经编辑的HLA蛋白的工程化自体HSC来治疗自身免疫性疾病的能力。所公开的方法有利地特异性针对患者的自身免疫性疾病的潜在病因，同时避免对患者的免疫系统的其他方面产生广泛影响。

单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)是主要的APC，其有助于引发和维持许多自身免疫性疾病的疾病状态。例如，在RA中，细胞维持与疼痛和疾病的关节损伤的衰弱进展相关的关节中的高炎症状态。然而，这些细胞的寿命短，必须定期从骨髓中的CD34⁺HSC补充。例如，单核细胞通常在血液中只能存活几天。然而，如果单核细胞迁移到发炎关节，它们可能会发展为单核细胞衍生的DC和巨噬细胞，并存活数周至数月。因此，申请人的本公开描述了用工程化HSC替换患者骨髓的亚型，所述工程化HSC将产生新的工程化单核细胞、巨噬细胞和DC，所述新的细胞不再呈现自身免疫原性抗原，从而防止T细胞激活和/或导致自身反应性T细胞以恢复到静止记忆状态。

本公开的方法、组合物和系统通常不包括在输注工程化HSC之前耗尽患者的T细胞和B细胞。因此，本公开的治疗方法保留了患者对微生物病原体感染和识别肿瘤抗原的正常、先天和适应性免疫。

选择用于工程化HSC表达的HLA等位基因、位置和突变

本文公开了方法，所述方法用于选择HLA等位基因、所述等位基因内的靶氨基酸位置以及用于工程化HSC表达的所述位置处的突变。在一些实施方案中，所公开的方法、组合物和系统可以包括选择和识别多于一种HLA等位基因、位置和/或突变，修饰所述等位基因以产生工程化HLA等位基因，与未修饰的HLA等位基因相比，其对至少一种自身抗原具有改变的结合亲和力。在许多实施方案中，工程化HLA等位基因由待通过本公开的疗法治疗的患者的工程化造血细胞表达。

所公开的方法可包括识别和/或选择与自身免疫风险增加密切相关的HLA等位基因，其可称为易感性等位基因或易感HLA等位基因。在某些实施方案中，易感HLA等位基因存在于大于约5％的患有特定自身免疫性疾病的患者中，例如大于约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％，或更多，且小于约90％、80％、70％、60％、50％、45％、40％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％，或5％。在许多实施方案中，易感HLA等位基因可以存在于较小百分比的未患有所识别的自身免疫性疾病的个体(即，对照群体或对照)中，例如，小于约35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％，或5％。

在RA的情况下，可以选择DRB1*04:04、DRB1*01:01或DRB1*04:01作为用于工程化HLA等位基因。例如，虽然几个DRB1等位基因包含71位上的精氨酸，并且患RA的风险增加，但是这相对不常见。DRB1*01:01在RA患者中的等位基因频率为13％，相比于对照组为9.7％，并且是这些其他“共享表位”中最常见的。等位基因DRB1*04:03(0.6％)、*04:04(9.1％)、*04:05(1.2％)、*04:08(1.7％)和*10:01(2％)均相对在RA患者中罕见。相反，DRB1*04:01见于31％的RA患者中(与对照组的10％相比，ρ＝10^-3)。DRB1*04:01的频率随着疾病的严重程度而增加，在难治性RA患者中超过50％，在最严重的RA(费尔蒂综合征(Felty'sSyndrome))中超过88％。此外，DRB1*04:01对RA的易感性程度最高。

所公开的方法可以包括识别和/或选择待突变的易感HLA等位基因内的靶氨基酸位置以产生工程化HLA等位基因。在某些实施方案中，选择的靶氨基酸位置(1)不埋藏在HLA蛋白的结构核心中，(2)位于HLA蛋白的抗原结合裂隙处或附近，(3)在沟/裂隙内而不是可直接接触T细胞受体，即不在TCR:HLA结合界面处，和/或(4)改变至少一种抗原与工程化HLA等位基因的结合亲和力。在许多实施方案中，由选择的易感HLA等位基因分子编码的蛋白质中的公开的靶氨基酸位置可以具有与易感性不相关的相同HLA基因的另一个等位基因不同的身份。相反，所述另一个HLA等位基因可能与对相同自身免疫性疾病的抗性有关；所述HLA等位基因可以称为抗性HLA等位基因。例如，RA相关易感HLA等位基因DRB1*04:01的成熟蛋白中靶氨基酸位置71位是赖氨酸，而RA相关抗性HLA蛋白DRB1*04:02中71位是谷氨酸。

根据某些实施方案，HLA工程化被优化以最小化或完全避免HLA不匹配的后果。在同种异体骨髓移植的受者中，任何HLA差异都会增加移植失败(排斥)和GVHD的风险，因此本文描述的某些实施方案包括HLA分子的抗原结合沟/裂隙内的突变。例如，DRB1*04:01中K71的位置位于HLA分子的上表面(TCR相互作用表面)下方，并且不会直接接触TCR。因此，DRB1*04:01中K71的突变不太可能诱导直接同种异体反应性。在某些实施方案中，基于合适的工程化位点不能引发T细胞反应来评估，例如通过计算机建模、肽结合分析和/或由工程化HSC引发的T细胞反应的体外表征。

本文描述的是用于生成足以改变抗原结合但不引起排斥的编辑的HLA等位基因的方法。具体来说，经编辑的HLA等位基因DRB1*04:01^K71E是一种在自然界中未发现的变体，其肽库和同种异体反应性潜力未知。

基于目前公开的用于识别可被改变同时避免被受试者的免疫系统排斥的HLA靶氨基酸位置的方法，申请人在此表明此类氨基酸改变确实治疗自身免疫性同时避免排斥。具体地，申请人产生表达DRB1*04:01或DRB1*04:01K71E的转基因小鼠并在这些品系之间进行皮肤移植。从一只DRB1*04:01小鼠取出的皮肤移植物应用于另一只DRB1*04:01小鼠时，DRB1*04:01免疫细胞会像自身一样接受所述皮肤移植物。然而，如果DRB1*04:01小鼠的免疫细胞将DRB1*04:01^K71E视为外来组织，则其会被排斥(反之亦然)。

在此，申请人的实验结果表明，本公开的基于受试者的自身易感HLA等位基因和HSC创建工程化HLA等位基因的方法没有被拒绝。本公开的工程化

HLA-DRB1*04:01^K71E等位基因包括抗原结合裂隙中的一个非天然氨基酸取代，其中所述取代改变与至少一种抗原(相对于天然易感等位基因)的结合，但不直接影响T细胞受体相互作用，例如DRB1*04:01^K71E编辑，不会诱导天然DRB1*04:01受体的同种异体反应性。

超过100个基因位点与RA相关。然而，与RA发病机制最强的遗传关联是主要组织相容性复合体中的DRB1基因，约占50％的遗传风险。更具体地，HLA-DRB1中的三个氨基酸位置(11、71和74；注意HLA内的aa位置是相对于成熟蛋白质的，如免疫多态性数据库(theImmuno Polymorphism Database)-lmMunoGeneTics项目/人类白细胞抗原或IPD-IMGT/HLA网站中所呈现的，可在website ebi.ac.uk/ipd/imgthl获得)解释HLA DRB1基因座与血清阳性RA的大部分的关联。

通过克隆所有相关的RA易感和RA抗性等位基因，然后对各个氨基酸进行定点诱变，申请人表明将位置71从K突变为E将肽结合谱转变为与抗性HLA等位基因DRB1*04:02(下文)相似的肽结合谱。

使用肽竞争测定，申请人识别了HLA等位基因DRB1*04:01对于一组RA相关抗原具有最大偏好-具体来说，翻译后修饰的“自改变(altered-self)”肽。这些自改变肽可能标志临床前RA中最初突破耐受性。自改变肽的集合包括一组在感染和炎症期间上调的瓜氨酸肽新抗原。人II型胶原蛋白在动物模型和小鼠CD4⁺T细胞中具有致关节炎性，引发关节炎的小鼠CD4⁺T细胞识别位于胶原蛋白氨基酸258-272之间的免疫显性肽。识别胶原蛋白^258-272肽的CD4⁺T细胞存在于RA关节中，它们在疾病发作时外周血中的存在与关节疾病的快速进展以及对传统合成和生物疾病调节抗风湿药物(disease modifying anti-rheumatic drugs)(DMARD)的不良反应有关。申请人发现胶原^258-272肽中71位的酸性K残基和碱性E残基之间的离子吸引力增强了肽与DRB1*04:01的结合。

难治性类风湿性关节炎是该疾病的一种更严重的形式，其中不同关节的滑膜维持在持续炎症状态。这种炎症状态的特点是T细胞巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞的浸润。目前公开的组合物、方法和疗法导致工程化HSC植入骨髓中，这将补充表达DRB1*04:01^K71E等位基因的髓系APC。

不希望受理论限制，与天然DRB1*04:01不同，工程化DRB1*04:01^K71E不与胶原蛋白^258-272紧密结合并且可能排斥它，导致CD4⁺T细胞对该自身抗原的反应减弱。虽然胶原蛋白特异性记忆CD4⁺T细胞群可能持续存在于患者中，但这些细胞可能不再接收维持慢性关节炎症所需的TCR信号。

本公开的工程化HSC将在几天内植入骨髓并在10天内开始产生表达DRB1*0401^K71E的髓系细胞。在患者在施用本公开的工程化HSC之前不经历免疫抑制调节的实施方案中，他们将保留在手术之前存在的获得性T和B细胞免疫。在使用低剂量白消安对患者进行非清髓性调理治疗的实施方案中，患者可能会经历短暂的中性粒细胞减少症(7-10天；中性粒细胞浓度低，这是增强对感染(尤其是细菌)的免疫应答所需的)和血小板计数低(20-30天；可能影响血液凝固)。这些现象不应危及生命，并且预计不会出现严重不良事件(SAE)。

可用本公开的疗法治疗的自身免疫性疾病

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，其特征是关节囊滑膜炎症，导致巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞浸润，这最终导致广泛的关节破坏、残疾和生活质量下降。与RA相关的持续炎症还会增加患缺血性心脏病和呼吸系统疾病的风险，从而导致早期死亡。大约有1％的世界人口患有RA，估计仅在美国就有130万人受到影响。RA更常见于40岁以上的女性和长期吸烟者。仅在美国，每年数十亿美元的直接医疗费用与RA的治疗相关，每年RA的社会总成本(直接、间接和无形)估计就达到数百亿美元。

白盖特氏综合征是一种慢性多系统炎症性疾病，其特征是复发性和复发性口腔溃疡、生殖器溃疡、皮肤病变、葡萄膜炎和更广泛的全身表现，如关节炎，和胃肠道或中枢神经系统受累。该疾病被归类为可变性血管炎，各种大小的动脉和静脉血管都有多个病变。

鸟弹葡萄膜炎(也称为鸟弹状脉络膜视网膜病变(Birdshot chorioretinopathy)或鸟弹状视网膜脉络膜病变(Birdshot retinochoroidopathy))是一种典型的自身免疫性葡萄膜炎(眼睛葡萄膜层炎症)，主要以其卵圆形光病变而闻名，其呈“霰弹枪样”状在眼睛后部(即眼睛的“眼底”，通过摄影可以看到这些病变)沿血管弓分布。脉络膜炎症和广泛色素脱失、黄斑水肿、周围缺血、视网膜变性以及视网膜上(“视网膜前膜”)疤痕组织薄层的逐渐形成，使相当一部分患者的视力逐渐受损。鸟弹葡萄膜炎通常影响50岁以上的西欧血统患者，受影响的女性多于男性。

乳糜泻是一种慢性免疫介导性肠病，由遗传易感人群(1)接触膳食麸质引发。在乳糜泻患者中，摄入麸质会激活免疫系统的先天性和适应性反应，随后发生慢性炎症，导致粘膜结构发生变化，包括绒毛萎缩、隐窝增生和淋巴细胞浸润。这些结构的变化导致肠粘膜功能丧失，并出现营养吸收不良引起的症状。

银屑病是一种由T淋巴细胞介导、树突状细胞参与的慢性炎症性疾病。遗传和环境因素促成或需要明显疾病的发展。皮损的特点是红斑和脱屑，具有不同的临床形式，从边界清晰的斑块到弥漫性红皮病。高达30％的患者可能还会出现关节受累，如果不及时治疗，可能会导致糜烂性疾病和丧失能力。它被认为是一种流行疾病，影响西方国家2％的人口。

发作性睡病由Westphal于1877年首次描述，并由Gélineáu于1880年命名。1953年发现快速眼动(REM)睡眠后，几位研究人员研究了发作性睡病患者的入睡情况。虽然健康个体通常在入睡后约90分钟进入第一次REM睡眠，但发作性睡病患者经常在入睡时直接进入REM睡眠。调节REM睡眠的机制出现故障可以解释发作性睡病的一些症状。发作性睡病目前尚无已知的治疗方法。尽管可以通过适当的治疗来控制其症状，但大多数患者需要终身治疗。

川崎病(KD)是一种急性系统性血管炎，是儿童获得性心脏病的主要原因。KD的发病机制仍不清楚。KD很可能是由遗传易感儿童对未知触发因素的异常免疫反应引起的。1HLA(人类白细胞抗原)基因被称为脊椎动物中最多态性的基因，编码细胞参与免疫系统调节的细胞表面抗原呈递蛋白上的蛋白质。HLA基因在多种免疫介导的血管疾病中的作用已得到研究，包括白盖特病、KD和韦格纳肉芽肿病(Wegener granulomatosis)。最近的一项全基因组关联的研究表明，HLA II类区域(HLA-DQB2-DOB)与日本人群中的KD存在显着关联。

重症肌无力(MG)是一种罕见的神经肌肉传递疾病，越来越多地被认为是一种综合征而不是单一疾病。近年来，一直在积极寻找重症肌无力的新抗原，而临床和实验研究为免疫调节的关键途径提供了新的见解，这可能成为未来治疗的目标。

系统性红斑狼疮(SLE)是一种严重的自身免疫性疾病，涉及多个器官系统。狼疮性肾炎(LN)是SLE的并发症，与生存率低和发病率高有关。许多基因组研究已在世界范围内进行，一些组织相容性白细胞抗原(HLA)基因座与狼疮易感性有关。

克罗恩病(CD)自1932年以来就为人所知，当时克罗恩等人报告了十四例末端回肠炎。克罗恩病是一种复发性炎症性疾病，主要影响从口腔到肛门的胃肠道。它以不连续的方式涉及胃肠道的任何部分，最常见的是回肠末端或肛周区域。

自身免疫神经病学是一个不断扩展的领域，近年来取得了巨大的发展。这一进展大部分归功于针对外周和/或中枢神经系统抗原的自身抗体(Ab)的发现和表征，这些Ab被用作这些疾病的生物标志物。其中一些Ab允许更好地定义已知的实体，例如视神经脊髓炎(NMO)中针对水通道蛋白-4的Ab(抗AQP4 Ab)。

1型糖尿病(T1D)是一种多因素自身免疫性疾病，其导致胰腺中胰岛素分泌β细胞遭到破坏。全基因组关联研究已识别了与发展T1D风险相关的50多个基因座。然而，特定人类白细胞抗原(HLA)基因(例如DQ2和DQ8)的遗传与疾病易感性关系最为密切。

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎症性疾病，其导致脊柱和周围关节的免疫介导性关节炎。这种疾病在男性中更为常见，症状通常在生命早期就开始出现。

HLA-B*27:05与AS密切相关，但B*27:06和B*27:09与抗性相关。

多发性硬化症(MS)是一种大脑和中枢神经系统的自身免疫性疾病。在MS中，免疫系统攻击覆盖神经纤维的髓鞘，这会导致神经永久性损伤或恶化。MS易感性与DRB1*15:01等位基因相关。

下表1所示的是与上述自身免疫性疾病易感性相关的各种HLA等位基因。表1中还显示了靶氨基酸位置，当这些靶氨基酸位置突变为对应于抗性HLA等位基因中相同位置处的氨基酸时，可以帮助减少或消除与自身免疫性疾病相关的至少一种症状。表1还公开了用于治疗自身免疫性疾病的靶氨基酸位置处的特定突变。

工程化HLA分子

本文公开了各种工程化HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子可以选自以下的一种或多种：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-A可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：9、12、17、31、35、43、44、56、62、63、65、66、67、70、73、74、76、77、79、80、81、82、83、90、95、97、99、102、105、107、109、114、116、127、142、144、145、149、150、151、152、156、158、161、163、166、167、171、184和186；具体地：9、31、56、62、63、66、73、77、80、81、95、97、99、114、116、150、152、156、和171。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-B可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：4、9、11、12、24、30、32、33、41、45、46、52、59、62、63、65、66、67、69、70、71、73、74、76、77、80、81、82、83、90、94、95、97、99、103、109、113、114、116、131、143、145、147、152、156、158、162、163、166、167、171、177、178和180；具体地：9、24、33、45、46、52、59、62、66、70、73、77、81、95、97、99、114、116、143、147、152、156、163、167、171和178。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-C可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：4、9、11、12、24、30、32、33、41、45、46、52、59、62、63、65、66、67、69、70、71、73、74、76、77、80、81、82、83、90、94、95、97、99、103、109、113、114、116、131、143、145、147、152、156、158、162、163、166、167、171、177、178和180；具体地：4、24、30、33、45、52、59、62、63、66、67、70、73、74、77、80、81、95、97、99、114、116、143、147、152、167和171。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-DQA1可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：20、26、34、40、41、44、46、47、48、50、52、53、54、55、61、64、66、69、75、76和80；具体地：34、44、61、64、69、76和80。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-DQB1可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：9、13、14、26、28、30、37、38、45、46、47、52、53、55、56、57、66、67、70、71、74、75、77、84、85、86、87、89和90；具体地：9、26、28、30、37、38、47、53、57、67、70、71、74、86、87和90。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-DPA1可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：11、18、28、30、31、50、72、73、83和96；具体地：11、28、31、72、73和96。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-DPB1可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：8、9、11、33、35、36、55、56、57、65、69、72、76、84、85、86、87和91；具体地：9、11、33、35、36、55、56、65、69、72、76、84、87和91。

在许多实施方案中，本公开的工程化HLA-DRB1、工程化HLA-DRB3、工程化HLA-DRB4和工程化HLA-DRB5可以包括选自以下一个或多个在多态性位置处的突变：9、10、11、12、13、14、16、25、26、28、30、31、32、33、37、38、40、47、57、58、60、67、70、71、73、74、77、78、85和86；具体地：9、11、13、26、28、30、32、33、37、38、40、47、57、58、67、71、74、78、85和86。

在许多实施方案中，本公开的方法可以从易感HLA等位基因产生一种或多种工程化HLA等位基因，所述易感HLA等位基因选自以下一个或多个：

A*02、A*03、A*29；

B*07、B*08、B*08:01、B*27、B*27:03B*27:05、B*27:09、B*51、B*54:01、B*57；

C*06、C*18；

DPA1*02:01；

DPB1*13:01；

DQ；

DQA1*02:01、DQA1*03:01、DQA1*05、DQA1*05:01；

DQB1*02、DQB1*02:01、DQB1*03、DQB1*03:01、DQB1*03:02、DQB1*06:02；

DR；

DRB1*01:03、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*07:01；DRB1*15、DRB1*15:01；DRB1*16；

DRB1*08、DRB1*08:01、DRB1*11:04。

本文公开了成熟HLA蛋白序列内靶氨基酸位置处的各种突变。在许多实施方案中，基于上文公开的标准选择突变。在一些实施方案中，可以基于待治疗的自身免疫性疾病或病症来选择特定的等位基因突变。例如，治疗：1型糖尿病可以包括在A57D处的DQB1*02:01突变(其中第57位的天然A，丙氨酸突变为D，天冬氨酸)和/或A57D的DQB1*03:02；类风湿性关节炎可包括在L67I、Q70D、L67I+Q70D、K71E、K71R、L67F、A74L、L67F-A74F、G86V、G86M、G86L、G86F和A74E的DRB1*04:01；在R71E的DRB1*04:05，在L671、Q70D、R71E、V85A和G86V的DRB1*01:01，在R71E的DRB1*04:03，在R71E的DRB1*04:04，在R71E的DRB1*04:08中的一种或多种突变；多发性硬化症可能包括在F47Y、A71R、A71R-V86G、V86L和V86F的DRB1*15:01中的一种或多种突变；乳糜泻可能包括在K71E和K71T的DQB1*02:01中的一种或多种突变；视神经脊髓炎可能包括在V86L和V86M的DRB1*03:01中的一个或多个突变；白盖特氏综合征可能包括在B*51中的一种或多种突变；牛皮癣可能包括在C*06；B*57和C*06；C*18，A*02中的一种或多种突变。

治疗方法

本公开内容包括通过施用工程化APC和/或APC前体，即工程化HSC来治疗或预防自身免疫性疾病的方法。例如，与T细胞疗法相反，本文公开的工程化细胞组合物被提供来减少或预防T细胞介导的排斥反应，而不是引发它们。因此，工程化组合物提供了相对广泛的治疗窗口，同时针对受试者的具体病症。在某些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的工程化HSC。

在某些实施方案中，受试者接受每公斤体重1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶，例如1-5百万个或更多工程化、自体HSC，例如通过静脉注射在一天或多天内以一剂或多剂施用。

本公开的方法包括如上所述的工程化HSC的生产和施用。在某些实施方案中，包括当前某些实施方案，工程化HSC对于待治疗的受试者来说是自体的。因此，一些实施方案包括从受试者分离HSC或HSC前体、分离的HSC的离体工程化、工程化HSC的任选地选择和/或扩增、以及向受试者施用工程化自体HSC。

可以通过本领域已知的方法从受试者分离HSC或前体。例如，可以基于CD34的表达，移动、分离PBMC和/或骨髓细胞并纯化HSC。可以根据需要的额外抗原的表达来选择HSC亚群。另外或替代地，HSC可以由前体细胞产生，例如预收获的干细胞或受试者的去分化细胞，如本领域已知的。尽管自体HSC目前是确定的，但本公开不限于自体HSC。例如，在某些实施方案中，提供了非自体(供体)HSC被工程化以表达所需的HLA而不表达能够引发非自身反应的蛋白质。

本文提供的方法的某些实施方案还包括预调节，例如非清髓性调节，和/或治疗后干预，例如促进工程化HSC的植入。另外或替代地，根据本公开内容的HSC工程化可以在体内进行，例如通过施用编码尤其是本文所述的表达的自身免疫抗性等位基因和/或基因编辑构建体的病毒载体。此外，虽然本文主要参考单一工程化HSC群体，但也可以单独或连续地提供具有离散HLA等位基因修饰的多种HSC组合物，例如在多等位基因自身免疫性疾病病的实例中。

HLA等位基因工程

本公开内容包括用于基因编辑的系统、构建体和技术，及其用于提供对自身免疫的抗性的应用。具体地，本公开的某些实施方案包括用于本文公开的HLA等位基因工程的构建体、系统和载体。

许多基因编辑系统是可用的、合适的并且在本领域中得到充分表征。例如，在某些实施方案中，提供了包含与待修饰的HLA等位基因互补的DNA靶向多核苷酸和CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的CRISPR-Cas系统。用于处理RNA的相关CRISPR-Cas9系统公开于公开号为WO2019200635的PCT/US2018/029302中，其全部内容通过引用并入本文。

在其他实施方案中，提供含有例如CasX、Cas12a、Cas13或MAD7的CRISPR系统用于HSC HLA等位基因工程，例如，如公开号为WO/2020/023529的PCT/US2019/043066、公开号WO/2018/195545的PCT/US2018/028919等中公开的。可以根据原型间隔子相邻基序(protospacer-adjacent motif)(PAM)特异性来选择某些CRISPR系统，从而允许靶向几乎所有基因组序列、中靶选择性、人类HSC的效率以及其他考虑因素。在可选的实施方案中，应用TAL效应核酸酶(TAL effector nucleases)(TALEN)或锌指核酸酶(zinc fingernucleases)(ZFN)用于HLA等位基因工程，如Nucleic Acid Res.2011年9月1日；39(17):7879)中公开的。

在进一步的实施方案中，HLA等位基因工程是用融合蛋白进行的，例如基于酶促失活的dCas9的融合蛋白。这些系统将与CRISPR相关的可编程DNA靶向能力与其他基因工程平台的附加靶向选择性和/或功能能力相结合。例如，在某些实施方案中，用包括Cas-CLOVER融合的系统进行HLA等位基因工程，如PCT/US2015/036226中所述。

在另外的实施方案中，包括某些实施方案，HLA等位基因工程是用核碱基编辑系统进行的。例如，某些实施方案提供了HLA等位基因靶向多核苷酸和包含dCas9和核碱基编辑酶，例如脱氨酶的融合蛋白。此类实施方案有利地导致足以改变在靶向HLA等位基因密码子处编码的氨基酸的特定点突变的产生，而不导致或需要DNA双链断裂和修复。

CRISPR-Cas系统及其载体的设计原理是本领域众所周知的，并且在本发明中基本上仅需要选择与待工程化HLA等位基因部分互补的序列。对于基于CRISPR-Cas融合的系统(包括所描述的实施例)也是如此。涉及基于蛋白质的DNA靶向(例如TALEN和锌指)的基因工程平台的产生也是表征明确的，并且仅通过常规程序和实验就可以产生适合与本公开一起使用的此类系统。

在附加和替代的实施方案中，HLA等位基因工程系统包括同源修复模板。例如，在某些实施方案中，可以切除MHC基因座内的易感HLA等位基因的整个基因并用工程化HLA等位基因替换。在许多实施方案中，编码易感HLA等位基因的基因可以通过插入工程化HLA等位基因来破坏，其可以作为具有工程化HLA等位基因的cDNA序列的不间断核酸。

根据本公开的HLA等位基因工程及其系统还可以包括，例如载体，例如用于表达所公开的HLA等位基因工程构建体的逆转录病毒载体。因此也可以应用瞬时转染技术和系统。相应地，本公开不限于特定的HLA等位基因工程构建体或系统。在某些实施方案中，包括某些实施方案，提供了根据下表的HLA等位基因工程。

表1

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工程化造血细胞

可以使用本文公开的各种系统对自体免疫细胞进行工程化，例如可以对细胞进行工程化以携带并表达具有能够进行基因组编辑的各种病毒载体和/或核酸酶的工程化HLA基因和分子。本领域技术人员熟知的各种方案可以允许筛选被操作细胞的基因组以评估病毒插入、DNA双链断裂(DSB)或其他潜在诱变事件的频率和/或位置(Li H，Haurigot V，Doyon Y，等，在血友病小鼠模型中的体内基因组编辑恢复止血(In vivo genome editingrestores haemostasis in a mouse model of haemophilia.)自然(Nature)475(7355):217-21,2011)。在许多实施方案中，所述系统可用于去除和/或预防易感HLA等位基因的表达，以及将工程化HLA等位基因插入相同基因座。在许多实施方案中，工程化HLA等位基因由cDNA序列表达。图30和SEQ ID NO：59-96提供了易感HLA等位基因和工程化HLA等位基因的具体cDNA序列。

通过体外扩增大量细胞并将其重新引入患者体内，可以更容易地实现影响临床结果所需的治疗相关水平的基因修饰的工程化造血干细胞。

定义

以下术语和短语具有以下含义。所提供的定义旨在帮助描述特定实施例，而不旨在限制所要求保护的组合物、方法、化合物、系统和疗法。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如果本领域术语的使用与本文提供的其定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的定义为准。

术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差，其部分取决于如何测量或确定该值。在某些实施例中，术语“大约”或“大约”是指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施方案中，术语“大约”或“大约”是指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％之内。每当术语“约”或“大约”出现在一系列两个或更多个数值中的第一个数值时，应理解术语“大约”或“大约”适用于该系列中的每个数值。

如本文所用，“氨基酸特征”、“残基特征”、“特征”等是指多肽主链上给定位置处的官能团(R基团)的结构。天然存在的氨基酸特征是(名称/三字母代码/单字母代码)：丙氨酸/Ala/A；精氨酸/Arg/R；天冬酰胺/Asn/N；天冬氨酸/Asp/D；半胱氨酸/Cys/C；谷氨酰胺/Gln/Q；谷氨酸/Glu/E；甘氨酸/Gly/G；组氨酸/His/H；异亮氨酸/Ile/l；亮氨酸/Leu/L；赖氨酸/Lys/K；蛋氨酸/Met/M；苯丙氨酸/Phe/F；脯氨酸/Pro/P；丝氨酸/Ser/S；苏氨酸/Thr/T；色氨酸/Trp/W；酪氨酸/Tyr/Y；和缬氨酸/Val/V。氨基酸位置，如本文所用，指HLA分子上的位置，参考网站ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla提供的成熟蛋白质序列。因此，例如，DRB1*04:01_K71E是指DRB1的等位基因*04:01的成熟蛋白质中的位置71，其中天然特征是赖氨酸K，非天然编辑特征是谷氨酸E。

“自身免疫疾病、病症或病症”是指其中免疫系统产生针对内源性抗原的免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)，导致损伤一种或多种组织的疾病、病症或病症。此类疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体病症(MOGAD)、肌无力综合征与视神经脊髓炎(NMO)、强直性脊柱炎、白盖特氏综合征(syndrome)、鸟弹葡萄膜炎(Birdshot uveitis)、发作性睡病(narcolepsy)、1型发作性睡病(NT1；以前称作发作性睡病伴猝倒(narcolepsywith cataplexy))、川崎病、克罗恩病(Crohn’s disease)、牛皮癣、皮肌炎(DM)、阿迪森氏病(Addison's disease)、肠易激综合征(irritable-bowl syndrome(IBS))、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、过敏性紫癜(Henoch-/>purpura(HSP))、结节病、干燥综合征(syndrome)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、桥本氏病(Hashimoto's disease)、特发性血小板减少性紫癜、多发性肌炎(PM)、副肿瘤性神经综合征(PNS)、自身免疫性脑炎、狼疮性肾炎(LN)、重症肌无力(MG)、银屑病关节炎、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、不良迟发型超敏反应、T细胞介导的肺部疾病、神经炎、白癜风、自身免疫性胰腺炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、寻常型天疱疮、肺纤维化或特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血。当本文使用时，术语“疾病”、“病症”和“病症”可互换。

“HLA”或“人类白细胞抗原”是指编码细胞表面上负责调节免疫系统的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的人类基因。“HLA-I”或“HLA I类”是指人类MHC I类基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和β2-微球蛋白基因座。“HLA-II”或“HLA II类”是指人类MHC II类基因，包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA1、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DM、HLA-DOA和HLA-DOB基因座。

“静脉内”施用是指将药物或疗法，例如一种或多种所公开的工程化HSC，施用到患者的静脉中，例如，通过输注(缓慢的治疗性引入静脉)达到治疗目的。“输注”或“输注”是指将药物、疗法和/或溶液通过静脉引入患者体内进行治疗。一般来说，这可以通过静脉注射(IV)袋来完成。

“静脉袋”或“IV袋”是能够容纳可通过患者静脉施用的溶液的袋。在一个实施方案中，溶液可以是盐水溶液(例如约0.9％或约0.45％NaCl)，或用于施用所公开的工程化HSC的任何治疗上有用的溶液。

“共同施用”是指在同一施用期间静脉内施用两种(或更多种)药物，而不是两种或更多种药物的顺序(即，一个接一个)输注。一般来说，共同施用可能涉及将两种(或多种)药物合并到同一个静脉注射袋中，或将第二种药物在其共同施用之前添加到包含第一种药物的袋子。

本文使用的术语“改善”是指通过向有此需要的患者或受试者提供一种或多种根据本公开的治疗、药物和/或组合物而患有该疾病的患者的疾病状态的任何改善(例如自身免疫性疾病的症状的改善，例如类风湿性关节炎的症状)。这种改善可以被视为患者疾病进展的减慢或进展的停止，任何症状的频率、持续时间和/或严重性的减少，和/或疾病无症状期的频率或持续时间或预防因疾病引起的损伤或残疾症状的增加。

“抗原”是指可以刺激动物体内抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物、物质、蛋白质、肽、核酸、核肽等，无论是天然的、修饰的还是合成的，包括注射或吸收到动物体内或经动物修饰的组合物。如本文所用，抗原可以通过其在天然或工程化HLA分子的抗原结合裂隙内结合的能力来定义。在一些方面，抗原可以与特定体液或细胞免疫系统的一种或多种产物反应。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位和抗原决定簇。

“抗原呈递细胞”(APC)是指能够加工并向T细胞呈递与I类或II类MHC分子相关的抗原化合物(包括肽)的细胞。在许多情况下，APC可以传递T细胞激活所需的共刺激信号。典型的APC包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、胸腺上皮细胞和血管内皮细胞。

“抗原结合区”、“抗原结合裂隙”、“抗原结合沟”、“抗原裂隙”等是指与HLA呈递的抗原相互作用并结合的HLA分子区域。Nguyen,A.等人，“HLA I类分子的口袋指引(Thepockets guide to HLA class I molecules)”，Biochemical Society Transactions(2021)49 2319-2331，其并入本文，讨论了HLA-I肽结合裂隙在N和C末端闭合(将肽抗原的长度限制为约8-10个氨基酸)，而HLA-II裂隙的末端是开放的，允许更长的肽抗原(例如长度>13个氨基酸)。K.J.Smith等人，“与人髓磷脂碱性蛋白肽复合的HLA-DR2(DRA*0101、DRB1*1501)的晶体结构(Crystal Structure of HLA-DR2(DRA*0101,DRB1*1501)Complexed with a Peptide from Human Myelin Basic Protein)”，第1卷。188,第8号，1998年10月19日，1511-1520，其并入本文，讨论了HLA II类分子中的结合裂隙和口袋结构。一般而言，特异性结合口袋结合在抗原结合裂隙内结合的抗原的特定组分。如本文所用，裂隙的“底部”可以是离分子核心最近且距TCR界面最远的裂隙表面，裂隙可以具有从底部向TCR界面大体向上延伸的侧面。在大多数实施方案中，抗原是肽并且组分是氨基酸。HLA分子的三维结构可供本领域技术人员参考(例如在ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla)，允许识别任何HLA分子的抗原结合区域。

cDNA(互补DNA)是缺乏内部非编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的多聚核酸。cDNA是在实验室中通过从细胞中提取的信使RNA进行逆转录合成的。

本文所用的术语“剂量”或“剂量”表示含有足以通过单次施用产生治疗效果的量的任何形式的活性成分制剂。

短语“治疗有效量”意指本公开的药物、组合物、化合物、治疗或疗法单独或与其他疗法组合，(i)治疗特定疾病、病症或病症，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或病症的一种或多种症状的发作。该术语可涵盖改善总体治疗、减少或避免疾病的症状或原因、或增强治疗功效或与另一种治疗剂协同作用的量。在靶向自身免疫的情况下，治疗有效药物、组合物、化合物、治疗或疗法的量可以减少反应性或活性免疫细胞(例如T细胞)的数量；减少炎症；抑制(即在一定程度上减缓并最好停止)基于免疫的细胞、组织或器官的攻击或降解；和/或部分或完全缓解与自身免疫反应相关的一种或多种症状。

“免疫反应”是指免疫系统的细胞(例如B细胞或T细胞)对刺激的反应。在一个实施方案中，该反应对于特定抗原是特异性的(“抗原特异性反应”)。在另一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答。

“自身免疫反应”是指针对自身或自身抗原的免疫反应。在许多情况下，自身免疫反应是自身反应性T细胞的结果，其识别一种或多种自身或自身抗原。免疫系统通常负责引导针对微生物和其他有害异物的保护性免疫反应。在自身免疫反应中，患者自身组织中存在的抗原成为自身反应性免疫反应的目标，导致细胞、组织或器官恶化、破坏或功能障碍。

术语“哺乳动物”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、狗、猫、马、牛、猪和羊。

“患者”或“受试者”包括哺乳动物或动物，例如人、牛、马、羊、羔羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。动物可以是哺乳动物，例如非灵长类动物或灵长类动物(例如，猴子和人)。在一个实施方案中，患者是人类，例如任何性别或不确定性别的人类婴儿、儿童、青少年或成人。

“药学上可接受的组合物”是用于维持或支持哺乳动物细胞活力的有机或无机溶液。

本文所用的“预防”是指通过向有需要的受试者施用根据本公开的组合物、化合物、治疗或疗法来避免本文指定的疾病、病症或病症的发生或再次发生。

“重组体”是指具有通常不在患者中发现或表达的序列的核酸或多肽，或者具有人工操作(例如一种或多种核酸或氨基酸的突变)结果的序列。人工操作可以通过化学合成或更常见地通过分离的核酸片段的编辑(插入、删除、突变等)来实现，例如通过基因工程技术。

氨基酸或肽序列之间的相似性以两个序列之间的相似性来表达，也称为序列同一性。序列同一性通常以百分比同一性(肽的相同残基或核酸的碱基的百分比；或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。完全同一性是指给定序列100％相同，例如50、100、150或200个碱基或残基。

术语“特异性结合”是“抗原特异性的”、“特异性的”、“选择性结合剂”、“特异性结合剂”、“抗原靶标”或与抗原具有“免疫反应性”是指结合的分子或多肽。比类似序列的其他抗原具有更大亲和力的靶抗原。本文预期抗原特异性结合APC表面的HLA分子。

“有需要的受试者”、“患者”或那些“需要治疗”的人包括那些已经患有现有疾病的人(即自身免疫性疾病，例如但不限于类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体病症(MOGAD)、肌无力综合征与视神经脊髓炎(NMO)、强直性脊柱炎、白盖特氏综合征(syndrome)、鸟弹葡萄膜炎(Birdshot uveitis)、发作性睡病(narcolepsy)、1型发作性睡病(NT1；以前称作发作性睡病伴猝倒(narcolepsy with cataplexy))、川崎病、克罗恩病(Crohn’s disease)、牛皮癣、皮肌炎(DM)、阿迪森氏病(Addison's disease)、肠易激综合征(irritable-bowlsyndrome(IBS))、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、过敏性紫癜(Henoch-/>purpura(HSP))、结节病、干燥综合征(/>syndrome)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、桥本氏病(Hashimoto's disease)、特发性血小板减少性紫癜、多发性肌炎(PM)、副肿瘤性神经综合征(PNS)、自身免疫性脑炎、狼疮性肾炎(LN)、重症肌无力(MG)、银屑病关节炎、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、不良迟发型超敏反应、T细胞介导的肺部疾病、神经炎、白癜风、自身免疫性胰腺炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、寻常型天疱疮、肺纤维化或特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血)，以及有患该病风险或易患该病的人。该术语还包括接受本文公开的预防性或治疗性治疗的人类和其他哺乳动物受试者。

“耐受性”是指对抗原产生特异性免疫反应的能力减弱或缺失。如本文所述，通常由于在双结构域MHC分子存在下与抗原接触而产生耐受性。在一个实施方案中，B细胞反应减少或不发生。在另一个实施方案中，T细胞反应减少或不发生。或者，T细胞和B细胞反应都可以减少或不发生。

术语“治疗”是指暂时或永久、部分或完全地消除、减少、抑制或改善与本文描述的免疫病症和疾病相关的事件、疾病或病症相关的临床症状、表现或进展。如相关领域所认识到的，用作疗法的方法和组合物可以降低给定疾病状态的严重性，但不需要消除被认为有用的疾病的每种表现。类似地，预防性施用的治疗不需要完全有效地预防病症的发作以构成可行的预防方法或药剂。简单地减少疾病的影响(例如，如本文所公开的，减少炎症、T细胞活化等和/或减少相关症状的数量或严重程度，或通过增加另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或降低受试者中疾病发生或恶化的可能性就足够了。本公开的一个实施例涉及一种用于确定治疗功效的方法，包括以足以引起相对于先前存在的状况的持续改善的量、持续时间和重复性向患者施用治疗性治疗，或者反映特定疾病严重程度的基线指标。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，指一系列氨基酸残基，通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如磷酸化的、糖化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于指代相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指代较小的多肽，但这些术语在本领域中的使用是重叠的。当指基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等同物、变体、片段和类似物。

HLA分子内的氨基酸可以被取代以产生工程化HLA分子。氨基酸(aa或a.a.)残基可以被具有相似生理化学特征的残基取代，即“保守取代”-例如，用一个脂肪族残基取代另一个(例如，Ile、Val、Leu或Ala)，或用一个极性残基取代另一个极性残基(例如在Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其他此类保守取代，例如基于大小、电荷、极性、疏水性、链刚性/方向等的取代，是蛋白质工程化领域众所周知的。包含保守氨基酸取代的多肽可以在本文所述的任何一种测定法中进行测试，以确认所需的活性，例如天然或参考多肽的结合、特异性和/或功能，已实现。

氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(见A.L.Lehninger，《生物化学》，第二版，第173页)。73-75,沃斯出版社，纽约(1975))：(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

或者，天然存在的残基可以根据共同的侧链特性分为几组：(1)疏水性：亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守替换将需要将其中一个类的成员替换为另一个类的成员。具体的保守取代包括，例如；Ala转化为Gly或Ser；Arg转化为Lys；Asn进入Gln或His；Asp转化为Glu；Cys变为Ser；Gln转化为Asn；Glu转化为Asp；Gly转化为Ala或Pro；His转化为Asn或Gln；Ile转化为Leu或Val；Leu转化为Ile或Val；Lys转化为Arg、Gln或Glu；Met转化为Leu、Tyr或Ile；Phe转化为Met、Leu或Tyr；Ser转化为Thr；Thr转化为Ser；Trp转化为Tyr；Tyr转化为Trp；和/或Phe转化为Val、Ile或Leu。

“T细胞”是指在胸腺中成熟的免疫细胞。激活的T细胞是已经离开G₀并正在合成DNA、上调CD25和/或上调CD的T细胞。

如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞上识别APC上的HLA分子/与APC上的HLA分子相互作用的细胞表面蛋白。

本文所用的“T细胞受体HLA结合界面”、“T细胞受体结合界面”、“TCR:HLA结合界面”、“TCR:HLA界面”是指TCR的表面和HLA分子的表面在TCR:HLA结合期间的近距离，在大多数情况下，TCR:HLA结合界面不包括HLA抗原结合间隙内不与TCR直接接触的氨基酸。

本文所用的“变体”是指与天然存在的或参考成员基本上同源的多肽、核酸、基因、序列或分子，但由于一种或多种原因而不同于天然或参考成员。多个缺失、插入、取代、分子、表达水平等。编码变体多肽的DNA序列涵盖与天然或参考DNA序列相比包含一处或多处核苷酸添加、缺失或取代但编码变体蛋白质或其片段的序列。多种克隆、基于PCR的位点特异性诱变和基因组编辑方法是本领域已知的，并且可以由普通技术人员应用。

变体HLA基因和分子包括那些天然存在的变体，如IPD-IMGT/HLA数据库(网站ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla；“IPD数据库”)中列出的。例如，HLA-A变体包括IPD数据库中列出的从*01到*80的所有HLA-A等位基因。

变体氨基酸或核酸序列可以是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％与天然序列或参考序列至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。天然序列和变体序列之间的同源性程度(百分比特征)可以通过例如使用万维网上通常用于此目的的免费计算机程序(例如，具有默认设置的BLASTp或BLASTn)比较两个序列来确定。

天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来完成。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定基因座处引入突变，所述寡核苷酸侧接能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。或者，可以采用寡核苷酸定向的位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，其具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。用于进行此类改变的技术已被本领域技术人员充分确立和理解。

“核酸”或“核酸序列”是指掺入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一条核酸链。或者，它可以是并非衍生自任何双链DNA的单链核酸。一方面，核酸可以是DNA。在另一个方面，核酸可以是RNA。合适的DNA可包括例如基因组DNA、cDNA或载体DNA。合适的RNA可以包括例如mRNA。

本文使用的“表达”是指参与产生、展示(例如，在细胞表面/外膜上或处)或分泌RNA和蛋白质的细胞过程，包括但不限于，例如，转录、转录加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。表达可以指源自一个或多个核酸片段的有义(例如，mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累和/或指mRNA翻译成多肽。

“载体”是指能够转运通常使用基因工程方法共价连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以连接额外DNA片段的环状双链DNA。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体中最常用的形式。

如本文所使用的“工程化”可以指已被人为干预操纵的方面。本文公开了工程细胞、HSC、肽、多肽、蛋白质、分子、HLA蛋白质、核酸、基因等。在一个例子中，当至少一个方面时，HLA蛋白被认为是“工程化的”多肽的序列，例如其序列，已被人为干预(直接或间接)有意操纵，以不同于其存在于患者/受试者中或自然界中的方面。正如通常的实践和本领域技术人员所理解的，工程细胞的后代通常仍然被称为“工程化的”，即使实际操作是在先前的实体上进行的。相反，本文所用的“天然”或“野生型”是指未工程化和/或未修饰的细胞、基因、蛋白质、核酸、核酸序列、等位基因和氨基酸序列及其部分。

缩写：ACR，美国风湿病学会；ADA，抗药物抗体；AE，不良事件；ANC，中性粒细胞绝对计数；APC，抗原呈递细胞；AUC，浓度-时间曲线下的面积；

DMARD，改变疾病的抗风湿药物；CBC，全血细胞计数；cGCP，现行良好临床实践；CD，分化簇；CMP，完整代谢组；cGMP，现行良好生产规范；cGTP，现行良好组织实践；DC，树突状细胞；DM，皮肌炎；DMSO，二甲亚砜；DRB1*04:01，HLA DR Beta 1链，04:01等位基因；E，谷氨酸；EBMT，欧洲骨髓移植登记处；G-CSF，粒细胞集落刺激因子；GVHD，移植物抗宿主病；GWAS，全基因组关联研究；HLA，人类白细胞抗原；HLA-DRB1，人类白细胞抗原-DR Beta 1；HSA，人血清白蛋白；HSC，造血干细胞；HSP，过敏性紫癜；IBS，肠易激综合症；IL，白细胞介素；IV，静脉注射；K，赖氨酸；LN，狼疮性肾炎；MG，重症肌无力；MHC II，主要组织相容性复合物II类(人类HLA)；MOGAD，髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体疾病；MS，多发性硬化症；MTX，甲氨蝶呤；NIS，国家住院样本数据集；NMO，视神经脊髓炎；NSAIDs，非甾体类抗炎药；NT1，发作性睡病1型；PNS，副肿瘤性神经系统综合征；PM，多发性肌炎；RA，类风湿性关节炎；SC，皮下注射；SAE，严重不良事件；SLE，系统性红斑狼疮；TCR，T细胞受体；TNF，肿瘤坏死因子。

本文使用的“易感HLA等位基因”、“易感性等位基因”等是指与给定群体中对一种或多种自身免疫病的易感性相关的给定HLA等位基因。

本文使用的“抗性HLA等位基因”、“抗性等位基因”等是指与给定群体中对一种或多种自身免疫性疾病的抗性相关的给定HLA等位基因。

本文使用的“基因组”是指生物体的所有遗传信息，包括编码(即基因)和非编码脱氧核糖核酸(DNA)。“基因组序列”是基因组DNA的核苷酸序列。本文所用的“天然基因组”是指个体(例如受试者或患者)在本文所述的任何修饰或工程改造之前的原始基因组序列。

涉及相似主题的某些术语在本文中可以互换使用。例如，对由特定基因的特定等位基因编码的HLA蛋白的提及可以参照HLA等位基因来识别。类似地，HLA等位基因中的特定密码子可以参考其编码的氨基酸来识别。例如，由HLA等位基因编码的HLA蛋白的氨基酸序列中的特定位置可以通过参考HLA等位基因中的相应位置来识别，反之亦然。

实施例

实施例1-材料和方法

细胞系

简而言之，通过直接从表达该等位基因的细胞克隆感兴趣的等位基因，或通过获得“gBIock”序列(基于IPD-IMGT/HLA数据库序列，来自Integrated DNA Technologies(爱荷华州科拉尔维尔)，可在网站ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/获得)来获得cDNA表达构建体。具有RE位点的各种gBlock序列如图30所示。为了进行测试，将cDNA克隆到鼠干细胞病毒(MSCV)质粒中，用于逆转录病毒转导和表达。如前所述(Bowerman等，2011)，通过用GFP+MSCV质粒瞬时转染Phoenix 293T细胞，将各种等位基因各自包装为逆转录病毒。HLA II类蛋白在人II类阴性T2细胞系(T2亲本)中表达。II类表达描述如下。

从表达DRB1*03:01、DRB3*02:02、DQA1*05:01、DQB1*02:01、DQA1*03:01、DQB1*03:02、DRB1*15:01、DQA1*01:02或DQB1*06:02的个体中分离RNA，并制备每个HLA-DR、DQA1或DQB1等位基因个体的互补DNA(cDNA)。

HLA-DRB1*04:01、DRB3*03:01、DRB4*01:03和DRB5*01:01T2细胞系已提前制备(Anderson等人，2016)。DRB1*11:03、DRB3*01:01、DQA1*05:05和DQB1*03:01的cDNA序列获自IPD-IMGT/HLA数据库(网站ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)并以gBlocks形式从IntegratedDNA Technologies(爱荷华州科拉尔维尔)获得。将cDNA克隆到鼠干细胞病毒(MSCV)质粒中，用于人II类阴性T2细胞系(T2亲本)的逆转录病毒转导。如前所述(Bowerman等人，2011)，通过用GFP+MSCV质粒瞬时转染Phoenix293T细胞，将HLA-DRB1、-DRB3、-DQA1和-DQB1等位基因各自包装为逆转录病毒。对于HLA-DRB1和-DRB3等位基因，使用上清液中的逆转录病毒转导表达DRA1*01:01的1x10⁵T2细胞，并在转导后7天分选HLA-DR+/GFP+的高表达(抗DR-APC(LN3)Invitrogen Cat#17-9956-42)。对于-DQ等位基因，使用HLA-DQB1等位基因的逆转录病毒转导1x10⁵HLA II类阴性T2细胞，并在转导后7天分选高GFP+表达。然后，使用顺式和反式二聚体的相应HLA-DQA1等位基因的逆转录病毒转导1x10⁵DQB1+T2细胞，并在转导后7天分选高HLA-DQ+/GFP+表达(抗人类HLA-DP/DQ/DR星光蓝(WR18)700BioRad Cat#MCA477SBB700)。分选后，从每个细胞系中分离RNA，通过桑格测序(Quintara Biosciences)验证顺式和反式HLA等位基因的HLA序列。所有细胞系均在补充有丙酮酸钠、硫青霉素/链霉素和10％胎牛血清(FBS)的IMDM-GlutaMAX(Life Technologies)中生长。

肽结合测定的肽设计和合成

杂合胰岛素肽HIP1-WE14(GQVELGGWSKMDQLA)、HIP6-IAPP2(GQVELGGGNAVEVLK)、HIP8-NPY(GQVELGGGSSPETLI)和HIP11-C肽(SLQPLALEAEDLQV)在N末端使用生物素化PEG3连接子合成，用Genscript(新泽西州皮斯卡塔韦)去除三氟乙酸(TFA)(Delong 2016，Baker2019)，纯度>98％。选择本研究中使用的HIP是因为它们能够刺激可用的T细胞克隆(表1)。还合成了生物素化的GAD65^265-281(AMMIARFKMFPEVKEKG)、胰岛素拟表位(HLVEELYLVAGEEG)和甲型流感(PKYVKQNTLKLAT)肽作为HLA-DR和DQ结合的对照[S.Dai，在doi.org/10.1073/pnas.1716527115]。除HIP6外，所有肽均先用二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后用等份水溶解，最后用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Life Technologies)溶解至400mM浓度，并在-20℃下冷冻直至用于肽结合和T细胞研究。HIP6在3％氨水中重构，然后用等份水、75μL 1M HCL恢复中性pH，最后用DPBS调整至400μM。

表达患者特异性HLA-II类的T2细胞肽结合

如上所述，收获表达Pt3977的HLA-类-DR和-DQ基因型的T2细胞系，重悬，用100μMHIP1铺板，并培养过夜。用DPBS洗涤板两次以除去未结合的肽，然后在4℃下重悬于100μL1:1000稀释的eBioscience^TM Fixable Viability Dye eFIuor^TM 780中30分钟。然后，如前所述对细胞进行处理和染色。数据在Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)上采集，并通过FlowJo Version X(Tree Star)进行分析，使用GraphPad Prism软件版本9.1确定3次独立实验的的平均结合比(HLA II类+T2细胞的MFI/MFI T2亲本HLA II类-)±SEM。

用于T细胞刺激测定的肽合成

合成了杂合胰岛素肽HIP1(GQVELGGWSKMDQLA)和HIP11(SLQPLALEAEDLQV)，用(新泽西州皮斯卡塔韦)去除了三氟乙酸(TFA)[Baker等人.2019]，纯度>98％。将肽在DMSO中重构至终浓度10,000μM。对于刺激测定，将肽以1:100稀释以获得100mM的工作浓度。

表达抗性和易感HLA II类的T2细胞肽结合

如前所述(Anderson等人2016，Roark等人2016)，进行肽结合测定。简言之，收获表达T1D抗性和易感HLA-DR和-DQ等位基因的T2细胞系，并以4*10⁶个细胞/mL重悬于培养基(IMDM-GlutaMAX、10％ FBS、噻吩/链球菌和丙酮酸钠)中。在96孔圆底板中，将重悬细胞、100μM生物素化储备肽和DPBS混合。阴性对照孔含有仅用DPBS重悬的细胞。将板在37℃下孵育过夜。用DPBS洗涤板两次以去除未结合的肽，然后在室温下重悬于1X Zombie Aqua(Biolegend Zombie Aqua^TMFixable Viability Kit cat#423102)中15分钟。将细胞在含1％甲醛的DPBS中轻微固定五分钟，以防止细胞表面的肽损失。为了检测肽结合，添加1X PE标记的链霉亲和素(One Lambda LT-SA-PE)，在4℃下孵育30分钟。在Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)采集之前，再次固定细胞。通过FlowJo Version X(Tree Star)分析数据，并使用GraphPad Prism软件版本9.1确定3次独立实验的平均结合比率(HLA II类+T2细胞的MFI/MFI T2亲本HLA II类-)±SEM(GraphPad)。

为了滴定HIP11，如上所述收获并重悬T2亲本、HLA-DQ2和-DQ2反式。然后，在96孔圆底板中，如前所述设置反应，不同之处在于肽的最终浓度为5μM、10μM、20μM和50μM。将细胞培养过夜，并用DPBS洗涤两次。将细胞重悬于100μL 1:1000稀释的eBioscience^TMFixableViability Dye eFIuor^TM780(Cat#65-0865-18)中，在4℃下悬浮30分钟。然后，如上所述对细胞进行处理、染色和分析。

T细胞刺激试验

如前所述(Baker 2019)克隆和扩增T细胞。对于HIP11、HLA-DQ2和-DQ2反式表达T2系或自体EBV转化的B细胞系(EBV3537)卸载或预加载不同浓度的HIP11(5μM、10μM、20μM和50μM)。通过将选定浓度的抗原与细胞在37℃下孵育1小时来预加载抗原呈递细胞。然后，通过用DPBS洗涤去除过量的抗原，以确保只有HLA等位基因结合和呈递的抗原能够刺激T细胞克隆。然后，将1x10⁵个CD4+T细胞克隆(E2)与5x10⁴个抗原呈递细胞系一起孵育过夜，然后用活力染料(eBioscience^TMFixable Viability Dye eFIuor^TM780)在4℃下染色30分钟。洗涤细胞，然后用抗氧化剂染色。CD4-PE(Biolegend PE抗人CD4抗体Cat#317410)和抗CD25-BV421(BD Biosciences BV421小鼠抗人CD25 Cat#562443)在4℃下反应30分钟。洗涤细胞，然后固定，然后在Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)上采集。数据通过FlowJoVersion X(Tree Star)进行分析。GraphPad Prism软件版本9.1用于计算3次独立实验的平均CD25 MFI±SEM。

对于HIP1，在不存在或存在抗原的情况下，将1x10⁵个CD4+T细胞克隆(D11)与5x10⁴个患者特异性HLA-II类T2系或自体EBV转化的B细胞系(EBV 3977)一起温育。如上所述，以20mM的浓度预加载HLA-II类T2细胞系和EBV系。将细胞共培养过夜，并如上所述对它们进行处理和分析。

实施例2-人源化DRB1*04:01K71E转基因小鼠对胶原致敏具有抵抗力

胶原诱导关节炎(CIA)是一种成熟的自身免疫性关节炎小鼠模型，它重现了RA的关键特征，包括MHC II分子的重要作用和胶原蛋白特异性T细胞反应。注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的异源II型胶原蛋白的HLA-DR4转基因小鼠会产生有效的胶原特异性CD4+T细胞反应(胶原致敏)，这是CIA发展所需的重要第一步。

为了确定DRB1*04:01-K71E基因编辑是否足以防止体内胶原致敏，使用了H-2II类敲除背景的嵌合HLA-DR4/I-E^d转基因小鼠。图2(顶部)显示了嵌合MHC II分子中的远端/人DRα1和DRβ1结构域介导肽与小鼠T细胞受体(mTCR)的结合和相互作用，而近端鼠I-Eda2和I-Eda2结构域介导与小鼠CD4共刺激分子的相互作用。这些实验中使用了三种转基因系：一种携带DRB1*04:01基因，一种携带DRE31*01:01基因(参见，例如(J.Exp.医学，卷180，1994年，第173-18页，以及J.of Exp。医学，卷185,第6期，1997年，第6页。1113-1122，两者均通过引用整体并入)，以及携带DRB1*04:01K71E基因的一个(基于PLOS ONE，第8卷，12，2013，e84908中的方法，其通过引用并入)。所有三个系在第0天和第21天用乳化在CFA中的可溶性II型胶原蛋白进行免疫。第56天，处死小鼠，收获淋巴结，并在胸苷核苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)存在下与胶原蛋白258 272肽(Pep)一起培养或仅在培养基中培养(NoPep)，其中胸苷核苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)掺入了进入增殖细胞的DNA中。

使用荧光叠氮化物和Cu(1)催化的[3+2]环加成“点击”化学来检测增殖细胞中的EdU掺入。细胞还与CD3和CD4的荧光抗体共染色。CD4+T细胞响应胶原蛋白258 272体外增殖的频率用于量化致敏作用。如图2所示，底部，DRB1*04:01小鼠产生了胶原蛋白258 272特异性CD4+T细胞反应，而来自DRB1*01:01转基因小鼠的CD4+T细胞表现出较弱的增殖反应，与其结合胶原蛋白258 272的能力降低以及与胶原蛋白258 272的关联性减弱相称。RA与DRB1*04:01相比。相反，DRB1*04:01K71E转基因小鼠的CD4+T细胞没有增殖反应。这表明在其他敏感小鼠中DRB1*04:01K71E的表达可防止小鼠对胶原蛋白敏感。

实施例3-DRB1*04:01K71E皮肤移植在DRB1*04:01小鼠中实现稳定植入

为了验证K71 E编辑不会在DRB1*04:01受体中诱发同种异体反应性，从DRB1*01:01和DRB1*04:01^K71E小鼠之中任一向DRB1*04:01受体进行皮肤移植。皮肤移植物含有大量的APC，使其成为难以移植的组织。皮肤移植评估是测试潜在同种异体反应性的稳健模型。该临床前模型用于确定在DRB1*04:01受体中DRB1*04:01^K71E皮肤移植排斥的频率。

如图3下图所示，DRB1*01:01皮肤移植物在第14天时完全排斥(n＝3)，但DRB1*04:01(n＝3)和DRB1*04:01^K71E(n＝3)皮肤移植物均保持稳定嫁接。

DRB1*04:01^K71E同种异体移植物无限期存活的事实表明DRB1*04:01^K71E表达不会诱发急性或慢性排斥反应。因此，一旦植入骨髓，表达DRB1*04:01^K71E的长期祖细胞HSC在DRB1*04:01受体中不应被排斥或诱发免疫反应。

实施例4-涉及MS的HLA等位基因

研究了与MS抗性和易感性相关的等位基因。两个DRB1等位基因*01:01和*11:01被鉴定为赋予抗性的等位基因，而*15:01与易感性相关。对三个等位基因的成熟蛋白质序列进行比对，并针对DRB1*15:01等位基因：F47、A71和V86鉴定符合上述标准的多态性位置。

针对4种肽在这些位置(F47Y、A71 R和V86G)中的一个或多个位置进行突变：MOG⁹⁷ ^-109(FFRDHSYQEEA)，其与MOGAD相关；RASGRP^278-87(LVRYWISAFP)，在大脑中表达，可能激活MS中的记忆T细胞，导致特征性脑部炎症(Jelcic et al.,2018,Cell 175)；MBP^83-101(ENPVVHFFKNIVTPRTPPP)，一种结合DRB1*15:01的免疫原性肽；和MBP^146-170(AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR)，其可能在抵抗MS中发挥作用，它结合DRB1*01:01并且不激活MS T细胞(Mamedov等人，Front.Immunol2020.)。

收集的数据(图5-7)表明赋予MS易感性的DRB1*15:01比两个抗性等位基因更好地结合RASGRP2——它还强烈结合MBP^83-101肽，但不结合MBP^1146-170肽。这些数据还表明，V86G和F47Y突变对结合模式有轻微影响，但MBP^146-170肽除外，其结合更好，表明该肽可能在抗性中发挥作用。最后，DRB1*15:01中单独的A71R突变不改变肽结合，除了增加MBP^146-170的结合(图6)。双突变A71 R-V86G也显示出RASDRP2结合的减少(图7)，这表明双突变可能在解决MS自身免疫方面提供额外的益处。

实施例5-与NMO(视神经脊髓炎)相关的HLA等位基因

NMO的临床综合征以急性视神经炎和横贯性脊髓炎为特征，由致病性血清IgG自身抗体水通道蛋白4(AQP4)引起。

AQP4是中枢神经系统中最丰富的水通道蛋白(>80％的病例)。对NMO的易感性与HLA-DRB1*03:01相关，而抗性与等位基因DRB1*07:01相关。测试了两种AQP4肽与两个等位基因的结合。

收集的数据表明AQP4-5肽结合易感等位基因而不结合抗性等位基因(图9)。AQP4-6肽也有同样的情况，它也结合易感等位基因，但不结合抗性等位基因。这些结果表明，DRB1*03:01的肽结合谱可能会受到肽结合槽中突变位置的影响，从而阻止或减少AQP4肽的结合，从而预防自身免疫。候选位置(例如，如别处所公开的，靶氨基酸位置9、11、13、26、28、30、32、33、37、38、40、47、57、58、67、71、74、78、85和86)可以从DRB1*03:01和DRB1*07:01的序列比对来鉴定这样的突变(图8；注意位置38、40和85不是多态性的，指示03:01和07:01；另请注意，比对的序列位置是根据成熟蛋白质序列编号的)。

实施例6-与RA相关的HLA等位基因

HLA-DRB1等位基因*04:05也显示出对RA的易感性。特别是，该等位基因显示出与日本人群中的RA密切相关。对于这些研究，DRB1*04:05中的位置71从R突变为E(参见图10)。

这些研究表明DRB1等位基因*04:05并未表现出对结合免疫显性胶原肽的强烈偏好(图11)。然而，当71位突变为谷氨酸(R71E)时，低水平的结合进一步降低。对于波形蛋白和α-烯醇化酶，*04:05等位基因优先结合瓜氨酸化的版本而不是天然版本。与K71E突变一样，通过将DRB1*04:05中第71位的精氨酸更改为谷氨酸(R71E)，可以减少这种偏好。2次实验的MFI结合比率平均值。

如本文所公开的，当位置71从精氨酸(R)改变为谷氨酸(E)时，对RA敏感的其他DR4等位基因，例如DRB1*04:03、*04:04和*04:08，可以赋予抗性(即抗性等位基因)。

实施例6-与I型糖尿病-T1D相关的HLA等位基因

测试了与I型糖尿病易感性相关的DQB1等位基因通过抗原结合槽中的一个或多个突变赋予抗性的能力。具体来说，几个DQB等位基因和相应的A57D变体被克隆到T2细胞系中。在几个抗性等位基因的位置57上发现了天冬氨酸。

表格1.所选择的杂合胰岛素肽的信息(另参见图22)

肽选择-合成杂合胰岛素肽HIP1-WE14(GQVELGGWSKMDQLA)、HIP6-IAPP2(GQVELGGGNAVEVLK)、HIP8-NPY(GQVELGGGSSPETLI)和HIP11-C肽(SLQPLALEAEDLQV)，其N端带有生物素化PEG3连接子，用Genscript(新泽西州皮斯卡塔韦)去除三氟乙酸(TFA)(Delong 2016，Baker2019)，纯度>98。选择本研究中使用的HIP是因为它们具有刺激T细胞克隆的能力和T细胞的可用性(表1)。还合成了生物素化的GAD65^265-281(AMMIARFKMFPEVKEKG)、胰岛素拟表位(HLVEELYLVAGEEG)和甲型流感(PKYVKQNTLKLAT)肽作为HLA-DR和DQ结合的对照[S.Dai，可访问doi.org/10.1073/pnas.1716527115]。

测试了杂合胰岛素肽在不同浓度下与这些细胞系的结合。具体来说，将天然HLADQB1等位基因的肽结合与其A57D突变形式进行比较。假设易感等位基因与杂合胰岛素肽结合。

这些研究表明易感的DQ2和DQ8等位基因不结合HIP8-NPY肽，但DQ2反式HLA分子却结合(图12)。当位置57从A变为D时，该杂合胰岛素肽在DQ2和DQ8上的结合增加，但在DQ2反式上的结合减少。类似地，DQ2和DQ8不结合HIP11-C肽(图13)，但DQ2反式分子结合。当引入A57D时，DQ2显示肽结合。虽然DQ2反式与该肽的结合较少，但结合并未消除。胰岛素模拟表位肽的结合遵循与上述肽类似的模式(图14)。具体而言，DQ2不结合模拟表位肽，但DQ2反式和DQ8结合该肽。当引入A57D突变时，DQ2和DQ2反式现在与肽结合。而突变减少了与DQ8分子的结合。

还测试了A57D突变对T细胞刺激的影响。具体而言，获得了仅限于DQ2且对HIP11-C肽具有特异性的E2 T细胞。在不同浓度的HIP11-C肽存在下，用表达DQ2或DQ2反式分子的T2细胞在培养物中刺激这些T细胞过夜。两种带有A57D突变的分子也进行了测试。然后通过对细胞表面的IL-2R(CD25)进行染色来测量T细胞刺激。

这些研究表明，DQ2 T2细胞系比亲本EBV系更好地刺激E2 T细胞克隆(图15，上图)。将A57D突变引入这些等位基因会导致E2 T细胞的刺激减少。如图15的下图所示，E2 T细胞克隆受到DQ2反式分子的刺激，但是将A57D引入DQ2反式分子会减少对T细胞克隆的刺激。

图16显示结合杂合胰岛素肽的HLA-DQ等位基因。在表达DQ2(A1*05:01/B1*02:01)、DQ8(A1*03:01/B1*03:02)、DQ2反式(A1*03:01/B1*02:01)和DQ8反式(A1*05:01/B1*03:02)的风险等位基因的T2细胞上测量生物素化HIP1-WE14、HIP6-IAPP2、HIP9-NPY和HIP11-C肽的结合。还测试了DQ6(A1*01:02/B1*06:02)的抗性等位基因。浅灰色是肽与HLA-II类(-)T2亲本系结合的背景，而深灰色是与特定HLA-II类(+)T2系结合的肽。行代表不同的等位基因，列代表不同的肽。右上角的数字为平均结合率(SA-PE MFI T2 HLA类(+)/SA-PE MFI T2亲本)。该数字代表3次独立实验的平均结合比率。

图17显示HLA-DQ等位基因结合对照天然肽。在表达DQ2(A1*05:01/B1*02:01)、DQ8(A1*03:01/B1*03:02)、DQ2反式(A1*03:01/B1*02:01)和DQ8反式(A1*05:01/B1*03:02)。还测试了DQ6(A1*01:02/B1*06:02)的抗性等位基因。浅灰色是肽与HLA-II类(-)T2亲本的背景结合，而深灰色是HLA-II类(+)T2系的信号。右上角的数字是平均结合比率(SA-PE MFIT2 HLA类(+)/SA-PE MFI T2亲本)。该数字代表3次独立实验的平均结合比率。

图18显示易感和抗性HLA-DRB1等位基因结合HIP。在表达DRB1*03:01和DRB1*04:01的易感等位基因以及抗性DRB1*15:01的T2细胞上测量生物素化的HIP1、HIP6、HIP8和HIP11的结合。浅灰色是肽与HLA-II类(-)T2亲本系的背景结合，而深灰色是HLA-II类(+)T2系的信号。角上的数字是3次独立实验的平均结合率。

图19显示结合天然对照肽的易感和抗性HLA-DRB1等位基因。在表达易感或抗性HLA-DRB1等位基因(特别是DRB1*03:01、DRB1*04:01和HLA*DRB1*15:01)的T2细胞上测量生物素化胰岛素模拟表位、GAD65^265-281和流感HA的结合。角上的数字是平均结合比率。

图20显示结合HIP的多种HLA-DRB3/4/5等位基因。在表达DRB3(*01:01、*02:02、*03:01)、DRB4*01:03和DRB5*01:01等位基因的T2细胞上测量HLA-DRB3/4/5等位基因结合生物素化HIP1、HIP6、HIP8和HIP11的能力。浅灰色是肽与HLA-II类(-)T2亲本系的背景结合，而深灰色是HLA-II类(+)T2系的信号。角上的数字是3次独立实验的平均结合比率。

图21显示结合天然对照肽的多种HLA-DRB3/4/5等位基因。在表达DRB3(*01:01、*02:02、*03:01)、DRB4*01:03和DRB5*01:01的T2细胞上测量生物素化胰岛素模拟表位、GAD65^265-281和流感HA的结合。浅灰色是肽与HLA-II类(-)T2亲本系的背景结合，而深灰色是HLA-II类(+)T2系的信号。角上的数字是3次独立实验的平均结合比率。

实施例7-DRB1口袋1(Pocket 1)中突变的影响

本文公开了用于封闭HLA II类蛋白的抗原结合位置、口袋1的方法和组合物。在许多实施方式中，HLA II类蛋白是DRB，例如DRB1、DRB3、DRB4或DRB5。在许多实施方式中，描述了变体DRB分子，其中口袋1中的一个或多个氨基酸位置被编辑。在许多实施方式中，所述编辑可包括将甘氨酸改变为同特性的更大氨基酸，例如缬氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸。在许多实施方式中，成熟DRB蛋白中的氨基酸位置是85或86。

位置86位于DRB1的肽结合区的口袋1内，并且可以充当结合槽深处的肽锚定位置。DRB分子的口袋1(或P1)可以形成深凹处、凹陷或孔，用于容纳一个或多个大的氨基酸侧链，以帮助锚定肽抗原。研究旨在调查用其他氨基酸替换DRB1位置86的甘氨酸的效果。具体来说，用较大的非极性氨基酸(缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸)进行取代，以减小该肽锚定位置的大小。

在这些研究中，DRB1*04:01的结合裂隙内的特定氨基酸位置(位置86)从甘氨酸改变为甲硫氨酸(G86M)或亮氨酸(G86L)。T2细胞系由编码变体的工程化基因转染，新型HLA分子得以表达。细胞系与100μM生物素化肽一起孵育过夜。第二天，洗涤细胞并轻微固定，然后添加链霉亲和素-PE以检测结合的生物素化肽。使用BD Canto仪器通过流式细胞术分析细胞。对多种肽进行了测试，以了解改变口袋1可能如何影响肽结合：增加、减少或保持不变。

测试表达DRB1*04:01或DRB1*04:01(其中第86位从甘氨酸更改为甲硫氨酸(G86M)或甘氨酸更改为亮氨酸(G86L))的T2细胞系结合多种肽的能力。位置86位于DRB1肽结合区的口袋1，我们假设用更大的非极性氨基酸替换甘氨酸，可以通过填充该锚定位置来基本上阻断肽结合。

DRB1*04:01结合此处列出的所有肽(图23)。当位置86变为甲硫氨酸或亮氨酸时，观察到胶原蛋白、MOG和GAD65的肽结合受到抑制。观察到胰岛素模拟表位和病毒流感HA肽的肽结合减少。浅灰色峰是T2亲本细胞系A的结合。深色峰是特定HLA等位基因的肽结合。右上角的数字是相对于与不表达II类HLA的T2亲本系背景结合的MFI比率。粗体数字是两次实验中HA、胶原蛋白、MOG和GAD65的结合比率；胰岛素模拟表位仅有一次实验。

用杂合胰岛素肽测试相同的细胞系(图24)。将位置86从G更改为M或G更改为L不会导致这些杂合胰岛素肽的功能获得。它们不结合DRB1*04:01或两个突变体。

如图25所示，RASGRP2肽(被认为在MS中发挥作用)的结合在两种突变体上减少。然而，突变细胞系仍然结合MBP肽。AQP4肽(NMO)与DRB1*04:01和两个突变体的结合类似。

当位置86改变为M或L时，偏好结合瓜氨酸化波形蛋白并且瓜氨酸化α-烯醇酶肽被还原。图26描绘了这些与α-烯醇酶肽的结合。这些突变不会阻断所有肽结合。浅灰色是瓜氨酸化肽，深灰色是天然肽。非常浅的灰色峰是肽与不表达HLA分子的T2细胞的背景结合。瓜氨酸化与天然肽结合的比率显示在右上角。

针对DRB1*04:01和两个突变体测试了致关节炎肽。图27显示了肽的天然版本与瓜氨酸化版本在这些细胞系上的比较。这些研究表明，当位置86发生突变时，波形蛋白的天然版本和瓜氨酸化版本结合得更好。G86L细胞系上的天然α-烯醇酶结合增加，但两种突变体与瓜氨酸化形式的结合较少。此处比率是根据T2亲本背景计算的。

实施例8-骨髓治疗

实验前至少48小时，给小鼠喂食Baytril水(Baytril浓度为22.7mg/ml：50ml试管中装有1135mg恩诺沙星(enrofloxacin)、45ml水、1 25ml 1-丁醇(n-丁醇)并滴加(50％NaOH,19M)45％ KOH(11.7M)直至恩诺沙星溶解(～150-200μl)；检查pH值，用HCl调节至pH8.9-10.9，用水定量至50ml)，每个水瓶含2ml Baytril水(～375毫升)。从供体K71 E小鼠中分离骨髓细胞，并将其转移到受辐射的DR4受体中。受体小鼠间隔6小时接受2次剂量照射，以达到总剂量。

骨髓重建

用乙醇清洗并解剖掉所有肌肉组织和肌腱后，从骨头中分离出骨髓细胞。使用带有25号针头的10ml注射器切割并冲洗骨端以去除骨髓细胞。将细胞用新鲜的PBS冲洗至10ml组织培养板中。通过将细胞通过18号针/10mL注射器与板中的PBS传代来破坏骨髓细胞。将单细胞悬液转移至50ml锥形管中，离心沉淀细胞。通过与2ml RBC裂解缓冲液一起温育1分钟来裂解红细胞，然后将组合物通过70μM过滤器过滤到新鲜的50ml管中。将10μl等分试样在台盼蓝(trypan blue)中以1:2稀释用于染色。对非红细胞进行计数，并统计每种类型供体的细胞总数。将细胞再次以400×g离心并重悬于PBS中至2-5×10⁷个细胞/mL。通过眼眶后注射将100μl转移至每只受辐射的受体小鼠。

监测和检查重构和嵌合状态

前两周每天监测小鼠，此后每周监测一次。Baytril水每周更换一次，持续4周。6周后，通过B细胞和T细胞染色来检查小鼠的血样是否重建。使用流式细胞术检查具有供体细胞标记的小鼠的嵌合状态。如果没有可用的细胞表面标记，则提交样本进行基因分型，以测试是否存在改变的基因或基因破坏。

使用抗CD117或其他试剂去除受体体内的细胞以进行骨髓移植。

抗CD117抗体可有助于所公开的工程化HSC的植入，因为它们靶向HSC(2019年5月9日；133(19)：2069-2078doi：10.1182/blood-2018-06-858159)。抗人CD117 mAb SR-1在体外抑制正常脐带血和骨髓HSC。SR-1和临床级人源化抗人CD117 mAb AMG 191在异种移植小鼠模型中消除体内正常和MDS HSC。这些抗CD117 mAb还可用于促进正常供体人类HSC在MDS异种移植小鼠模型中的植入，恢复正常人类造血功能并根除侵袭性病理性MDS细胞，在某些情况下，抗CD117抗体有助于阻断造血干细胞与骨髓基质细胞的结合，从而将它们从骨髓释放到外周循环中。为此，治疗患有自身免疫性疾病或处于发展自身免疫性疾病风险的受试者的一种方法可以包括用抗CD1117抗体预先治疗以帮助包含所公开的变体HLA分子的工程化HSC的植入。或者，在施用工程化细胞之前，可以用GCF治疗对受试者进行免疫细胞动员，如上文对于收获HSC所公开的。

将小鼠分为两组。对于这些实验，第一组是DR4+小鼠，接受两次抗CD117眼眶后静脉注射(第0天和第2天)。然后这些小鼠在第8天接受了来自DRB1*04:01K71E供体的骨髓细胞。此后，在两个时间点(BMT后第14天和第28天)收集接受者的血液并进行分析。第II组小鼠也是DR4+，但未接受抗CD117(第0天和第2天)。然而，他们确实在第8天接受了K71E骨髓细胞。此后，与第一组一样，在两个时间点(BMT后第14天和第28天)采集血液。在第56天采集最终样本

使用数字PCR分析血液样本，以寻找DR4小鼠和K71 E小鼠之间的单一氨基酸差异。

白消安(Busulfan)(一种烷基化化疗剂)也可用于为受试者接受同种异体工程造血干细胞做好准备。在一些实施方案中，白消安还用于在从携带工程化DRB1*04:01K71E等位基因的供体小鼠转移骨髓细胞之前治疗受体小鼠。

讨论

本公开的实验和数据提供了治疗自身免疫性疾病概念的原始证明，所述自身免疫性疾病包括RA以及1型糖尿病、多发性硬化症、视神经脊髓炎和由不期望的HLA蛋白介导的自身肽结合和呈递至免疫效应细胞引起的其他疾病。据申请人所知，本公开也是对除RA之外的自身免疫性疾病的治疗的首次描述。因此，据申请人所知，本公开是第一个广泛实现并证明拥有通过所公开的HLA工程化治疗自身免疫的技术。

本公开进一步提供了HLA II类蛋白的抗原结合袋(口袋1)的空间封闭的新HLA工程策略，以修饰肽的结合和呈递，包括在自身免疫性疾病中被识别为抗原的自身肽。具体地，本公开描述并举例说明了(参见实施例7)用相对较大的氨基酸(例如，甲硫氨酸)替换相对较小的氨基酸(例如，甘氨酸)的策略，以通过一种与自身免疫相关的HLA蛋白整体降低肽结合的量和亲和力：。

因此，如广泛体现的，本公开尤其提供了通过HLA工程化治疗或预防自身免疫的方法以及设计用于自身免疫性疾病的HLA工程治疗的方法。HLA工程化可在体内或离体进行，减少与自身免疫反应相关的一种或多种自身肽的结合，并被设计和进行通过HLA蛋白以替换有助于该自身肽结合的一种或多种氨基酸，其中一个或多个氨基酸由于其在HLA蛋白的抗原结合裂隙内的位置而具有相对“免疫特权”。

取代的或置换的氨基酸可以通过参考与自身免疫抗性相关的HLA等位基因来鉴定，所述自身免疫例如困扰受试者或受试者被认为易感的特定自身免疫疾病。在某些实施方式中，例如，通过比较自身免疫疾病相关HLA蛋白和与相同自身免疫病抗性相关的HLA蛋白的序列和/或三维模型来识别用于工程化的候选HLA蛋白氨基酸残基。这种三维模型包括与自身免疫性疾病相关的一个或多个肽复合的HLA蛋白的晶体结构。另外或替代地，可以从头识别替代氨基酸，例如通过计算机建模和/或高通量体外测定来鉴定减少HLA蛋白与自身免疫相关肽(例如衍生自分别来自糖尿病、RA和MS的胰岛素、胶原蛋白、RASDRP2)结合的取代。

在一些实施方式中，该方法包括鉴定与自身免疫性疾病相关的HLA蛋白的合适位置(例如口袋1)的小氨基酸(例如甘氨酸)，并改造相应的HLA等位基因以表达尺寸较大的取代氨基酸。该方法还可包括测定自身肽和/或非自身肽与工程化HLA蛋白的结合，以及上述功能测定。

如本文所考虑的，并且如实施例4中明确描述的，HLA化工程可以包括HLA蛋白中的两个或更多个氨基酸的替换(或突变)，并且可以相应地应用和优化设计治疗的方法。

某些实施方式提供了治疗或预防自身免疫性疾病的方法以及通过HLA工程化设计治疗自身免疫性疾病的方法。某些实施方式提供治疗或预防RA、T1D、MS、视神经脊髓炎、白盖特氏综合征、乳糜泻和牛皮癣的方法，以及设计其治疗的方法。某些实施方式提供治疗或预防T1D、MS、视神经脊髓炎、白盖特氏综合征、乳糜泻和牛皮癣的方法，以及设计其治疗的方法。在某些实施方案中，HLA工程化不包含DRB1*04:01^K71E突变。在某些实施方式中，HLA工程化不包含DRB1*04:01等位基因的位置71的突变。在某些实施方式中，HLA工程化不包括DRB1*04:01等位基因的突变。

明显地，本公开的许多实施方式，包括某些实施方式，不需要并且可以排除治疗后免疫抑制。因此，根据本发明的通过HLA工程设计治疗自身免疫性疾病的某些方法包括例如体外T细胞刺激测定和/或皮肤移植实验以确认候选突变的功效和不排斥性，其中这样的功效和/或不排斥鉴定了用于本文公开的HLA工程的合适突变。

虽然公开了多个实施方式，但是根据以下详细描述，本领域技术人员将清楚当前公开的概念、化合物、组合物、方法、过程、系统和疗法的其他实施方式。显然，本公开能够在各种明显方面进行修改，所有这些都不脱离本公开的精神和范围。因此，详细描述本质上应被认为是说明性的而不是限制性的。

本文公开的所有参考文献，无论是专利的还是非专利的，都通过引用并入本文，就好像每个参考文献都完整地包含在其引用中一样。如果参考文献和说明书之间存在冲突，则以本说明书(包括定义)为准。

尽管已经以一定程度的特殊性描述了本公开，但是应当理解，本公开是通过示例的方式进行的，并且可以在不背离所附权利要求中限定的本公开的精神的情况下做出细节或结构的改变。

Claims

1.一种变体HLA蛋白，所述变体HLA蛋白包括：

与选自下组的野生型HLA蛋白具有至少95％同一性的氨基酸序列：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DPA和HLA-DPB；并且

在抗原结合裂隙内的至少一个氨基酸取代，其中所述变体HLA蛋白的抗原结合亲和力与所述野生型HLA蛋白的抗原结合亲和力不同；并且

其中所述变体HLA蛋白是经过工程化的。

2.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-A具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置9、31、56、62、63、66、73、77、80、81、95、97、99、114、116、150、152、156、171，或它们的组合。

3.如权利要求2所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-A选自A*02、A*03和A*29。

4.如权利要求2或权利要求3中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-A选自A*02:01、A*03:01和A*29:01。

5.如权利要求2-4中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-A的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、2或3。

6.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-B具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置9、24、33、45、46、52、59、62、66、70、73、77、81、95、97、99、114、116、143、147、152、156、163、167、171、178，或它们的组合。

7.如权利要求6所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-B选自B*07、B*08、B*27、B*51、B*54和B*57。

8.如权利要求6或权利要求7中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-B选自B*07:02、B*08:01、B*27:03、B*27:05、B*27:09、B*51:01、B*54:01和B*57:01。

9.如权利要求6-8中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-B的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-13。

10.如权利要求6-9中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述位置是59或116，并且所述至少一个氨基酸取代是组氨酸。

11.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-C具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置4、24、30、33、45、52、59、62、63、66、67、70、73、74、77、80、81、95、97、99、114、116、143、147、152、167、171，或它们的组合。

12.如权利要求11所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-C选自C*06和C*18。

13.如权利要求11或权利要求12中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-C选自C*06:02和C*18:01。

14.如权利要求11-13中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-C的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:14或15。

15.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-DQA1具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置34、44、61、64、69、76、80，或它们的组合。

16.如权利要求15所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQA1选自DQA1*01、

DQA1*02、DQA1*03和DQA1*05。

17.如权利要求15或权利要求16中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQA1选自DQA1*01:01、DQA1*01:02、DQA1*02:01、DQA1*03:01、DQA1*05:01和DQA1*05:05。

18.如权利要求15-17中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQA1的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:19-23。

19.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-DQB1具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置9、26、28、30、37、38、47、53、57、67、70、71、74、86、87、90，或它们的组合。

20.如权利要求19所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQB1选自DQB1*02、

DQB1*03、DQB1*05和DQB1*06。

21.如权利要求19或权利要求20中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQB1选自DQB1*02:01、DQB1*03:01、DQB1*03:02、DQB1*05:01、DQB1*06:01和DQB1*06:02。

22.如权利要求19-21中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DQB1的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:24-29。

23.如权利要求19-22中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述位置57或71，并且所述至少一个氨基酸取代是天冬氨酸、谷氨酸或酪氨酸。

24.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-DPA1具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置11、28、31、72、73、96，或它们的组合。

25.如权利要求24所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPA1是DPA1*02。

26.如权利要求24或权利要求25中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPA1是DPA1*02:01。

27.如权利要求24-26中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPA1的所述氨基酸序列为SEQ ID NO:16。

28.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-DPB1具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置9、11、33、35、36、55、56、65、69、72、76、84、87、91，或它们的组合。

29.如权利要求28所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPB1是DPB*13。

30.如权利要求28或权利要求29中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPB1是DPB*13:01。

31.如权利要求28-30中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DPB1的所述氨基酸序列为SEQ ID NO:17。

32.如权利要求1所述的变体HLA蛋白，其中所述氨基酸序列与HLA-DRB1、

HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5具有至少95％同一性，并且所述至少一个氨基酸取代在所述氨基酸序列中所处的位置选自位置9、11、13、26、28、30、32、33、37、38、40、47、57、58、67、71、74、78、85、86，或它们的组合。

33.如权利要求32所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DRB选自DRB1*01、DRB1*03、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*10、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14、DRB1*15、DRB1*16、DRB3*01、DRB3*02、DRB3*03、DRB4*01和DRB5*01。

34.如权利要求32或权利要求33中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DRB选自DRB1*01:01、DRB1*01:03、DRB1*03:01、DRB1*04:01、DRB1*04:02、DRB1*04:03、DRB1*04:04、DRB1*04:05、DRB1*04:08、DRB1*07:01、DRB1*08:01、DRB1*09:01、DRB1*10:01、DRB1*11:02、DRB1*11:03、DRB1*12:01、DRB1*13:01、DRB1*14:01、DRB1*15:01、DRB1*15:02、DRB1*16:01、DRB3*01:01、DRB3*02:02、DRB3*03:01、DRB4*01:03和DRB5*01:01。

35.如权利要求32-34中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述HLA-DRB的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:30-58。

36.如权利要求32-35中任一项所述的变体HLA蛋白，其中所述位置是47、67、70、71、74、85、86或71，并且所述至少一个氨基酸取代是异亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、精氨酸或苯丙氨酸。

37.如权利要求1-36中任一项所述的变体HLA蛋白，用于治疗患有选自以下自身免疫性病症的患者：类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体病症(MOGAD)、肌无力综合征与视神经脊髓炎(NMO)、强直性脊柱炎、白盖特氏综合征( syndrome)、鸟弹葡萄膜炎(Birdshotuveitis)、发作性睡病(narcolepsy)、1型发作性睡病(NT1；以前称作发作性睡病伴猝倒(narcolepsy with cataplexy))、川崎病、克罗恩病(Crohn's disease)、牛皮癣、皮肌炎(DM)、阿迪森氏病(Addison's disease)、肠易激综合征(irritable-bowl syndrome(IBS))、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、过敏性紫癜(Henoch-/> purpura(HSP))、结节病、干燥综合征(/> syndrome)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、桥本氏病(Hashimoto's disease)、特发性血小板减少性紫癜、多发性肌炎(PM)、副肿瘤性神经综合征(PNS)、自身免疫性脑炎、狼疮性肾炎(LN)、重症肌无力(MG)、银屑病关节炎、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、不良迟发型超敏反应、T细胞介导的肺部疾病、神经炎、白癜风、自身免疫性胰腺炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、寻常型天疱疮、肺纤维化或特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血。

38.一种工程化造血细胞，所述工程造血细胞包括如权利要求1-36中任一项所述的变体HLA蛋白。

39.一种非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸编码如权利要求1-36所述的变体HLA蛋白。

40.一种工程化造血细胞，所述工程化造血细胞包括如权利要求39所述的核酸。

41.如权利要求1-36中任一项所述的变体HLA蛋白在制备用于治疗自身免疫性病症的药物中的用途。