KR20240023035A - 자가면역 치료를 위한 hla 조작 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20240023035A
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브라이언 프리드
크리스티나 로아크
엘리자베스 선더하우스
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코퍼레이트
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Abstract

본 발명은 자가면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상은 하나 이상의 HLA 유전자좌에서 하나 이상의 자가면역-감수성 HLA 대립유전자를 보유한 것을 확인하였다. 여러 실시예에서, HLA 유전자좌는 클래스 I 및 클래스 II 유전자좌(예: 클래스 I A, B 및 C, 클래스 II DQ, DR 및 DP)에서 선택된다. 여러 실시예에서, 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상에는 변이체 HLA 분자의 항원 결합 및/또는 특이성을 변경하는 항원 결합 틈에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 변이체 감수성 대립유전자를 보유하고 발현하도록 변형된 다수의 조작된 자가(autologous) HSC가 투여될 수 있다. 많은 구현예에서, 조작된 HSC는 하나 이상의 변형된 HLA 단백질을 발현하는 CD34+ 면역 세포이다.

Description

자가면역 치료를 위한 HLA 대립유전자의 포켓 엔지니어링
본 발명의 조성물, 방법 및 시스템은 자가면역 질환의 치료 및 예방에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 10일에 출원된 "HLA 엔지니어링 방법, 화합물 및 자가면역 치료용 조성물"이라는 제목의 미국 임시 특허 출원 번호 63/186,770의 35 U.S.C. § 119(e) 에 따른 이익 및 우선권을 주장하며, 이 출원은 또한 그 전체 내용이 참조로 여기에 포함된다. 본 출원은 "자가면역 치료를 위한 HLA 조작 방법 및 조성물"이라는 제목의 관련 미국 임시 출원 및 "자가면역을 치료하기 위한 HLA 조작 및 치료 방법" 및 "자가면역 치료를 위한 조작된 HLA 대립유전자"라는 제목의 PCT 출원과 동시에 제출되었으며, 이들은 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 그 전체가 참조로 포함된 서열 목록이 포함되어 있다. 2022년 ____________에 생성된 해당 ASCII 사본의 이름은 ____________.txt이고 크기는 ______바이트이다.
자가면역은 신체의 면역체계가 건강한 조직과 세포를 이물질로 잘못 식별하여 공격하는 병리학적 상태를 말한다. 이러한 잘못된 면역 반응으로 인해 발생하는 모든 질병을 자가면역 질환, 장애 또는 상태라고 한다. 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS)과 같은 일부 자가면역 질환은 다른 질환보다 더 널리 퍼져 있지만 전체적으로 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 심각한 공중 보건 문제를 제기한다. 일반적으로 자가면역 질환 환자는 피로, 발열, 근육통, 관절통 및 부기, 피부 문제, 복통 및 소화 문제를 포함한 경미한 증상부터 이동성 감소, 시력 상실, 장기 부전을 포함할 수 있는 보다 심각한 증상까지 다양한 증상을 겪는다.
자가면역질환은 다양한 분자, 세포, 생리학적 기반을 가질 수 있다. 일반적으로 자가면역은 유전적 요인이나 환경적 요인으로 인해 조절되지 않은 면역 체계의 결과로, 대상의 면역 체계가 스스로 활성화되는 결과를 낳는다. 이상적으로는 정상적인 상황에서 건강한 면역 체계는 이물질(예: 미생물, 바이러스, 단백질 및 핵산)을 인식하고 퇴치한다. 그러나 이를 효과적으로 수행하려면 대상 자신의 조직, 세포, 단백질 및 핵산을 공격하지 않도록 훈련되어야 한다.
인간 백혈구 항원(HLA)은 면역 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 관련 유전자 그룹을 의미한다. HLA 클래스 I 및 II 단백질은 T 세포 수용체에 펩티드를 제시하기 위한 펩티드 틈이 있는 세포 표면 단백질이다. HLA 유전자 복합체는 인간 염색체 6번의 짧은 팔에 존재한다. HLA 단백질의 대립 유전자에 대한 언급은 잘 알려진 명명법을 가지고 있다. 예를 들어, 숙련된 HLA 연구자에게 잘 알려진 DRB1*01:01:01:01은 HLA 복합체의 DRB1 유전자 대립유전자를 의미하며, HLA 유전자 지정 다음의 처음 두 값은 대립유전자 그룹 또는 수준, 그리고 단백질 서열 수준의 변이를 나타내는 '*' (이 예에서는 '01:01')로 구분된다.- 예를 들어 DRB1*01:01과 DRB1*01:02는 펩티드 결합 영역의 두 아미노산이 다르다. 세 번째 필드 (여기서 세 번째 '01')는 유전자 코드의 퇴화로 인해 아미노산이 변경되지 않아 면역학적으로 동일한 유전자 서열의 차이를 나타낸다.- 즉, DRB1*01:02:01은 DRB1*01:02:02와 면역학적으로 동일하다. 마지막 필드 (즉, 마지막 '01')는 단백질의 암호화 영역(인트론, 프로모터 등) 외부에서 발생하는 유전자 서열의 차이를 나타낸다.- 따라서 DRB1*01:01:01:01과 가상의(hypothetical) DRB1*01:01:01:02는 암호화 서열 내에서 면역학적 및 유전적 수준에서 동일하지만 비암호화 서열은 다르다. 이러한 유형의 변경은 일반적으로 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 관용적으로, 본원에 언급된 바와 같이, 조작된 HLA 대립유전자는 일반적으로 처음 두 필드를 사용하여 기술된다.
HLA는 자가면역질환과 관련된 주요 유전적 요인으로 알려진 유전적 소인의 약 절반을 차지한다. HLA와 질병 사이의 연관성은 200가지 이상 설명되었지만 근본적인 병원성 메커니즘은 제대로 정의되지 않은 채 남아 있다. 처음에는 HLA의 특정한 유전적 특징과 다른 유전자 및 환경과의 복잡한 상호작용으로 인해 이 분야에서 임상적으로 의미 있는 발전이 더 이상 이루어지지 않았다. 질병 감수성에서 HLA의 역할을 분석하고 이해해야 할 필요성이 더 커졌다.
자가면역 질환 중 하나인 류마티스 관절염(RA)은 관절낭 윤활막의 염증으로 인해 대식세포, 호중구, T 세포 및 B 세포가 침윤되는 것이 특징이다. 이는 광범위한 관절 파괴, 장애 및 삶의 질 저하로 이어진다. RA와 관련된 지속적인 염증은 또한 허혈성 심장 및 호흡기 질환 발병 위험을 증가시켜 조기 사망을 초래한다. RA는 세계 인구의 약 1%에서 발생하며, 미국에서만 약 130만 명이 영향을 받는다. RA는 40세 이상의 여성과 장기간 흡연자에게서 더 자주 발생한다. 매년 수십억 달러의 직접 의료 비용이 RA 치료와 관련되어 있으며, RA(직접, 간접, 무형)의 연간 총 사회적 비용은 미국에서만 수백억 달러에 달하는 것으로 추산된다.
RA 치료에는 환자에게 적합한 최적의 치료 요법을 결정하기 위해 질병 활동 및 약물 부작용을 자주 모니터링하는 체계적인 접근 방식이 필요하다. 현재 증상 조절, 통증 관리, 관절 손상 제한을 위해 승인된 다양한 치료제가 있다. RA에 대한 현재 약물에는 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드, 합성 질환 수정 항류마티스 약물(DMARD) 및 생물학적 제제가 포함된다. DMARD 치료법은 전 세계적으로 면역 체계의 주요 구성 요소를 표적으로 삼아 RA의 진행을 중단하고 완화를 유지하려면 지속적인 투여가 필요하다. 이로 인해 환자는 원치 않는 부작용, 심각한 감염, 악성 종양 및 장기 독성이 발생할 위험이 있다; 환자는 또한 그 효과를 중화시키는 생물학적 제제에 대한 항약물항체(ADA)를 개발할 수도 있다. 더욱이, 약 6% 내지 21%의 환자는 현재 치료법으로 질병을 적절히 관리하기 위한 충분한 반응을 얻지 못한다. 이러한 환자를 일반적으로 불응성 RA 환자라고 한다.
자가면역질환에 대한 기존 치료법은 질병의 근본 원인이 아닌 증상을 목표로 한다. RA와 같은 많은 자가면역 질환은 HLA 대립유전자의 하위 집합에 의해 변형된 자가 펩티드가 제시되면서 시작된다.
RA를 치료하기 위한 조혈 줄기 세포(HSC) 이식은 안전하게 장기간 완화를 부여하는 데 성공하지 못했다. 첫째, 자가 이식은 짧은 과정의 화학 요법을 사용하여 면역 체계를 재설정하고 상대적으로 안전하지만 근본적인 문제를 해결하기보다는 처음에 RA가 발생하도록 허용한 동일한 문제가 있는 세포로 골수를 다시 채울 뿐이다. 둘째, HLA 일치 공여자의 동종 골수 이식 역시 환자의 골수를 대체하는 데 동일한 HLA 대립유전자가 사용되었기 때문에 높은 재발률을 나타낸다. 더욱이, 이 기술은 이식편대숙주병(GVHD)과 연관되어 있어 허용되지 않는 치료 전략이다. 자가 HSC 이식을 받은 RA 환자 155명을 대상으로 한 17개 연구에 대한 최근 메타 분석에서는 경감(remission)이 2년 이상 유지되지 않는 것으로 나타났다.
2005년 국립보건원(NIH)은 미국에서 최대 2,350만 명이 자가면역 질환을 앓고 있으며 대부분의 경우 치료법이 부족하다고 보고했다.
치료법이 없어 많은 환자들이 허약한 증상과 장기 기능 상실, 직장 생산성 저하, 높은 의료비 등으로 고통받고 있다. 자가면역 질환을 치료하기 위한 효과적인 치료법이 필요하다.
본 명세서에서, 기존 자가면역질환 치료 및 관리에 있어 위와 같은 문제점 및 기타 문제점을 해결하기 위해, 출원인은 질병과 관련된 HLA 대립유전자를 식별 및 표적화하고 이 정보를 사용하여 하나 이상의 자가 HSC와 관련된 맞춤형 치료법을 생성하는 방법을 개발했으며, 상기 표적 HLA 대립유전자는 변경된 자가 항원 결합 친화도 및/또는 특이성을 갖도록 조작되었다.
본 발명은 자가면역 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상에서 자가면역을 감소시키는 데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
이러한 질환, 장애 및 병태에는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 셀리악병(celiac disease), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 수초희소돌기아교세포 당단백질 항체 장애(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody disorders, MOGAD), 근무력증 증후군(myasthenic syndromes), 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 증후군(Behet's syndrome), 버드샷 포도막염(Birdshot uveitis), 기면증(narcolepsy), 기면증 1형(narcolepsy type 1, NT1; 이전에는 탈력발작을 동반한 기면증(narcolepsy with cataplexy)으로 불림), 가와사키병(Kawasaki disease), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 피부근염(dermatomyositis, DM), 애디슨병(Addison's disease), 과민성대장증후군(irritable-bowl syndrome, IBS), 그레이브스병(Graves' disease), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schnlein purpura, HSP), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발근염(polymyositis, PM), 신생물부신경증후군(paraneoplastic neurological syndromes, PNS), 자가면역뇌염(autoimmune encephalitis), 루푸스신염(lupus nephritis, LN), 중증근육무력증(myasthenia gravis, MG), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 이식 거부반응(graft rejection), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 원치 않는 지연형 과민반응(unwanted delayed-type hypersensitivity reaction), T세포 매개성 폐질환(T-cell mediated pulmonary disease), 신경염(neuritis), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 자가면역 갑상선 질환(autoimmune thyroid diseases), 천식(asthma), 자가면역 포도막염(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 다양한 자가면역 질환은 면역 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 관련 유전자 그룹인 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자의 하나 이상의 대립유전자의 존재와 연관되어 있다. HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 T 세포 수용체에 펩티드를 제시하기 위한 펩티드 틈이 있는 세포 표면 단백질이다. HLA 유전자 복합체는 인간 염색체 6번의 짧은 팔에 존재한다.
본 발명의 일 측면에서, 자가면역 질환과 관련된 HLA 대립유전자를 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 하나는 자가면역-감수성(autoimmunity-susceptibility) HLA 대립유전자를 확인하는 단계; 감수성 HLA 대립유전자 암호화 단백질의 결합 틈(cleft) 내의 표적 아미노산 위치를 확인하는 단계, 여기서 상기 표적 아미노산 위치는 자가면역 저항성 HLA 대립유전자와는 다른 동일성을 갖고; 변형된 자가면역-감수성 HLA 대립유전자를 생성하기 위해 표적 아미노산 위치의 아미노산 동일성을 자가면역-저항성 HLA 대립유전자의 동일한 아미노산 위치의 동일성으로 변형시키는 단계, 여기서 상기 변형된 자가면역-감수성 HLA대립유전자에 의해 암호화된 단백질은 적어도 하나의 자가 펩티드에 대해 변경된 결합 친화력을 가진다.
본 발명의 관련된 측면에서, 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 하나는 대상의 HLA 복합체 내 자가면역-감수성 HLA 대립유전자를 확인하는 단계; 대상으로부터 다수의 CD34+ 면역 세포를 분리하는 단계; 및 변형된 자가면역-감수성 HLA 대립유전자를 발현하는 변형된 CD34+ 면역 세포를 생성하기 위해 CD34+ 면역 세포를 변형시키는 단계를 포함한다. 변형된 자가면역-감수성 HLA 대립유전자는 자가면역-감수성 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 적어도 하나의 자가 펩티드에 대한 결합 친화성이 변경된 단백질을 암호화한다.
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 조작된 자가-HLA 발현 조혈 세포로 치료가능한 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질에 의한 항원 제시와 관련된 자가면역 상태를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 여러 구현예에서, HLA 유전자좌는 클래스 I A, B 및 C와 클래스 II DP, DR 및 DQ로부터 선택된다. 일부 실시예에서, HLA 유전자, 대립유전자 및 단백질은 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*29, HLA-B*07, HLA-B*08, HLA-B*27, B*27:03 B*27:05, B*27:09, HLA-B*51, HLA-B*54, HLA-B*57, HLA-C*06, HLA-C*18, HLA-DPA1*02, HLA-DPB1*13, HLA-DQA1*02, HLA-DQA1*03, HLA-DQA1*05, HLA-DQB1*02, HLA-DQB1*03, HLA-DQB1*06, HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*16 및 이들 HLA의 변이체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 특정 자가면역 질환에 대한 감수성(susceptibility)과 연관된 하나 이상의 HLA 대립유전자 (감수성 대립유전자) 및 특정 자가면역 질환에 대한 저항성(resistance)과 연관된 동일한 HLA 유전자의 하나 이상의 대립유전자 (저항성 대립유전자)를 확인하고, HLA 유전자의 항원 결합 홈(groove) 내의 하나 이상의 가변 아미노산 위치를 확인하는 단계를 포함한다. 여기서 상기 감수성 대립유전자의 가변 아미노산 위치는 제1 동일성을 갖고, 저항성 대립유전자의 가변 아미노산 위치는 제2 동일성을 갖는다.
본 발명의 특정 실시양태는 특정 자가면역 질환과 특정 HLA 대립유전자 사이의 인과적 연관성의 발견을 부분적으로 전제로 한다. 예를 들어, 특정 실시예는 제1형 당뇨병과 DQB1*02 및/또는 DQB1*03, 특히 DQB1*02:01 및/또는 DQB1*03:02와의 연관성에 기초한다. 일부 실시양태에서, 류마티스 관절염은 DRB1*04 및 DRB1*01, 특히 DRB1*04:01, DRB1*04:05 및 DRB1*01:01과 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 다발성 경화증은 DRB1*15, 특히 DRB1*15:01과 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 소아지방변증은 DQB1*02, 특히 DQB1*02:01과 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, NMO는 DRB1*03, 특히 DRB1*03:01과 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 베체트 증후군은 B*51 또는 B51과 연관되어 있다. 어떤 경우에, 건선은 C*06, B*57, DRB1*07 및/또는 DQB1*03과 연관될 수 있다. 어떤 경우에, Birdshot 포도막염은 A*29와 연관될 수 있다. 어떤 경우에, 기면증은 DQB1*06, 특히 DQB1*06:02와 연관될 수 있다. 어떤 경우에, 중증근육무력증은 A*03, B*07, DR2(DRB1*15 및/또는 DRB1*16) 및/또는 DR4(DRB1*04)와 연관될 수 있다. 어떤 경우에, 가와사키병은 B*54, 특히 아미노산 위치 91, 104, 329와 연관될 수 있다. 어떤 경우에, 염증성 장질환은 DRB1*01, 특히 DRB1*01:03과 연관될 수 있다. 어떤 경우에, 전신 경화증은 DRB1*11, DPB1*13, B*08, DQA1*02:01, DQA1*05, DRB1*08, DRB1*07, DPA1*02, DQB1*03, 특히 DRB1*11:04, DPB1*13:01, B*08:01, DQA1*02:01, DQA1*05:01, DRB1*08:01, DRB1*07:01, DPA1*02:01, DQB1*03:01과 연관될 수 있다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물 및 조성물을 제공한다. 여러 구현예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 변형된 HLA 대립유전자를 포함하는 하나 이상의 조작된 면역 세포를 포함한다. 대부분의 구현예에서, 변형된 HLA 대립유전자는 편집된 단백질 분자이고, 변형된 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질의 펩티드 결합 틈 내에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 HLA 대립유전자는 편집된 HLA 단백질을 암호화하는 편집된 핵산 분자이고, 여기서 상기 편집된 핵산은 편집된 HLA 단백질의 펩티드 결합 틈 내에 아미노산 돌연변이를 암호화하는 적어도 하나의 코돈을 함유한다. 대부분의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 T 세포 수용체 경계면에서 발생하지 않는다. 여러 구현예에서, 변형된 HLA 대립유전자는 조작된 면역 세포에 의해 운반되거나, 포함되거나, 발현될 수 있다. 여러 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 자가 세포이다. 즉, 이는 자가 면역 질환 치료를 받는 대상으로부터 획득된다. 여러 구현예에서, 조작된 면역 세포는 조성물, 예를 들어 자가면역 질환을 앓고 있거나 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여될 수 있는 치료 조성물 내에 포함될 수 있다. 여러 구현예에서, 조작된 면역 세포는 HSC일 수 있다.
본 발명은 개시된 화합물 및 조성물의 제조 방법을 추가로 제공한다. 여러 구현예에서, 본 발명의 방법은 특정 자가면역 질환의 증가된 발병률과 연관된 하나 이상의 HLA 유전자를 확인하고, 감수성과 연관된 HLA 유전자의 하나 이상의 대립유전자 (감수성 대립유전자) 및/또는 특정 자가면역 질환에 대한 저항성과 연관된 하나 이상의 대립유전자 (저항성 대립유전자)를 확인하고, HLA 분자의 항원 결합 홈 내의 하나 이상의 가변 아미노산 위치를 확인하는 것을 포함하고, 여기서 상기 감수성 대립유전자의 가변 아미노산 위치는 제1 동일성을 갖고, 저항성 대립유전자의 가변 아미노산 위치는 제2 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 개시된 화합물을 제조하는 방법은 가변 위치에서의 아미노산의 동일성이 두 번째 동일성인 감수성 대립유전자의 조작된 HLA 분자를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 HLA 분자는 발현 벡터 또는 조작된 게놈 서열에 의해 암호화된다.
또한, 본 발명의 요법으로 필요한 대상을 치료하는 다양한 방법이 개시되며, 여기서 상기 치료는 MHC 항원 결합 영역 (예: HLA 단백질의 항원 결합 홈) 내에 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 갖는 하나 이상의 조작된 항원 제시 세포의 투여를 포함한다. 여러 구현예에서, 치료 방법은 기증자로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 것을 포함한다. 여러 실시양태에서, 분리된 세포는 HSC이다. 여러 실시양태에서, 방법은 HSC를 변형하여 조작된 HSC를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 조작된 HSC는 자기항원 또는 변이체 자기항원에 대한 결합 특이성 또는 친화성이 변경된 조작된 HLA 대립유전자(편집된 HLA 대립유전자, 변이체 HLA 대립유전자, 변형된 HLA 대립유전자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 HSC는 그의 게놈 서열에 조작된 HLA 대립유전자를 암호화하는 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하거나 조작된 HLA 대립유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함한다. 여러 구현예에서, 변형된 HSC는 대상의 골수에 이식되어 하나 이상의 변형된 항원 제시 세포를 생성할 수 있다.
본 발명은 자가면역 질환이 발병하거나 앓을 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 다양한 조성물을 제공한다. 대표적인 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 서열번호 59-96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 일부 특정 실시양태에서, 자가면역 질환에 대한 감수성은 HLA-DRB1 유전자, 예를 들어 DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*07, DRB1*09, DRB1*10, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*15 및 DRB1*16과 연관되어 있다. 여러 실시양태에서, 자가면역 질환은 DRB1*01:01, DRB1*01:02, DRB1*01:03, DRB1*03:01, DRB1*04:01, DRB1*04:02, DRB1*04:03, DRB1*04:04, DRB1*04:05, DRB1*04:08, DRB1*07:01, DRB1*09:01, DRB1*10:01, DRB1*11:01, DRB1*11:02, DRB1*11:03, DRB1*12:01, DRB1*13:01, DRB1*14:01, DRB1*15:01, DRB1*15:02 및 DRB1*16:01로부터 선택된 HLA-DRB1의 대립유전자와 연관되어 있다. 관련 실시양태에서, 조성물은 L67, Q70, V85, G86, R71 및 이들의 조합, 예를 들어 제한 없이 L67I, Q70D, V85A, G86V, R71E 및 이들의 조합으로부터 선택된 위치 (아미노산의 위치는 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla에 제시된 성숙 단백질 서열 참조)에 돌연변이를 포함하는 DRB1*01:01 단백질 또는 이에 대한 DNA 암호화 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 변이체 DRB1*03:01 단백질 또는 V86 위치에 돌연변이, 예를 들어 V86L 또는 V86M을 포함하는 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 변이체 DRB1*04:03, DRB1*04:04 DRB1*04:05 및 DRB1*04:08 단백질 또는 위치 R71에 돌연변이, 예를 들어 R71E를 포함하는 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 변이체 DRB1*13:01 단백질 또는 V86 위치에 돌연변이, 예를 들어 V86L 또는 V86M을 포함하는 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 위치 F47, A71 또는 V86에 돌연변이, 예를 들어 F47Y, A71R, V86L, V86M 및 이들의 조합을 포함하는 변이체 DRB1*15:01 단백질 또는 암호화 영역을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 자가면역 질환에 대한 감수성은 HLA-DRB3, HLA-DRB4 또는 HLA-DRB5 유전자, 예를 들어 HLA-DRB3*01, HLA-DRB3*02, HLA-DRB3*03, DRB4*01 및 DRB5*01와 연관되어 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 DRB3*01:01, DRB3*02:02, DRB3*03:01, DRB4*01:01, DRB4*01:03 및 DRB5*01:01로부터 선택된 HLA-DRB3/4/5의 대립유전자와 연관되어 있다.
본 발명에 따른 추가 실시양태에서, 자가면역 질환에 대한 감수성은 HLA-DQA 및/또는 HLA DQB 유전자와 연관되어 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 HLA-DQA1의 대립유전자와 연관되고/거나 DQA1*01, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQA1*03, DQB1*05, DQB1*06 및 이들의 조합, 예를 들어 DQ5, DQA1*01:01 및 DQB1*05:01; DQ6, DQA1*01:02 및 DQB1*06:02; DQ2, DQA1*05:01 및 DQB1*02:01; DQ2 트랜스, DQA1*03:01 및 DQB1*02:01; DQ8, DQA1*03:01 및 DQB1*03:02; DQ8 트랜스, DQA1*05:01 및 DQB1*03:02; DQA1*05:05 및 DQB1*03:01; 및 DQA1*03:01 및 DQB1*03:01로부터 선택된다. 이러한 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형 또는 변이체 HLA는 항원 결합 홈, 예를 들어 위치 57 또는 71 내에 적어도 하나의 치환을 갖도록 조작되며, 여기서 돌연변이는 A57D, K71E, K71T 또는 이들의 조합이다.
본 발명에 따른 추가 실시양태에서, 자가면역 질환에 대한 감수성은 HLA-B 유전자와 연관되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 B27의 대립유전자와 연관되고/거나 B*27:03 B*27:05 및 B*27:09로부터 선택된다. 여러 구현예에서, 돌연변이는 항원 결합 홈 내의 임의의 다형성 위치, 예를 들어 위치 59 또는 116 중에서 선택된 위치에 있을 수 있으며, 여기서 돌연변이는 Y59H, D116H 또는 이들의 조합이다.
또한, 본 발명은 돌연변이된 경우 자가면역에 대한 감수성 또는 증상을 감소시키거나 제거하는 데 유용할 수 있는 HLA 대립유전자의 위치를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 여러 구체예에서 자가면역 질환을 앓고 있는 개인의 코호트를 비교하고, 질병 감수성과 연관된 특정 HLA 유전자 대립유전자(들) (감수성 대립유전자)를 확인하고, 질병 저항성과 관련된 특정 HLA 유전자 대립유전자 (저항성 대립유전자)를 확인하고, 저항성 대립유전자와 감수성 대립유전자 사이 - 즉, 저항성 대립유전자의 아미노산 동일성이 감수성 대립유전자의 동일성과 다른 위치, HLA 분자의 항원 결합 홈 내에 위치한 다형성 아미노산 위치를 확인하는 것을 포함한다. 한 가지 예로서, 항원 결합 홈 내에 위치한 DRB1 유전자의 잔기에는 8-14, 16, 25-26, 28, 30-33, 37-38, 40, 47, 57-60, 67, 70-71, 73-74, 77-78, 85-86 및 93이 포함된다. 관련 실시양태에서, 방법은 다형성 위치에서 저항성 대립유전자의 아미노산 동일성을 포함하도록 감수성 대립유전자를 조작하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 상기 조작된 HLA 분자 또는 분자들을 하나 이상의 항원 제시 세포(APC) 상에 발현시키는 것은 대상의 자가면역 질환을 예방, 치료 또는 개선시킨다.
또한, 본 발명은 조작되지 않은 HLA 분자와 비교하여 변경된 항원 결합 및/또는 특이성을 갖는 조작된 HLA 분자를 제공한다. 여러 실시 양태에서, 항원은 변형된 펩티드, 시트룰린화 펩티드, 하이브리드 펩티드, 핵산 등을 포함하는 다양한 펩티드로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 하이브리드 펩티드는 하이브리드 인슐린 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 ENPVVHFFKNIVTPRTPPP, LVRYWISAFP, FFRDHSYQEEA, AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, GQVELGGWSKMDQLA, GQVELGGGNAVEVLK, GQVELGGGSSPETLI, SLQPLALEAEDLQV, HLVEELYLVAGEEG, AMMIARFKMFPEVKEKG, SHLVEALYLVCGERG, RSQVETDDLILKPGV, SQVETDDLILKPGVV, PGIAGFKGEQGPKGE, IFDSRGNPTVEVDLF, IFDS{CIT}GNPTVEVDLF, SAVRLRSSVPGVR, SAVRL{CIT}SSVPGVR, QDFTNRINKLKNS, QDFTN{CIT}INKLKNS, ATEGRVRVNSAYQDK, ATEG{CIT}VRVNSAYQDK, ATIKAEFVRAETPYM, ATIKAEFV{CIT}AETPYM, AVRLQGSVAGVR, PYHFKYHEKHFANAI, PVSKMRMATPLLMQA, PKYVKQNTLKLAT 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 여기서 {CIT}는 시트룰린화 잔기로서 지칭될 수 있는 탈이미화된 아르기닌 잔기를 나타낸다.
또한, 본 발명은 HLA 대립유전자의 결합 틈에서 포켓을 폐쇄하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 감수성 HLA 대립유전자를 확인하는 단계, 및 항원 결합 틈의 포켓에서 또는 근처의 표적 아미노산 위치를 확인하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 포켓은 항원 결합 틈의 바닥에 있는 오목부(recess)을 정의한다. 상기 방법은 폐쇄 HLA 대립유전자를 생성하기 위해 표적 아미노산보다 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 치환하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 두 번째 아미노산의 측쇄는 항원 결합 틈의 바닥에 있는 오목부 내로 연장되어 HLA 대립유전자의 포켓을 폐쇄한다. 다양한 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5로부터 선택될 수 있고, 포켓은 포켓 1일 수 있다. 이들 실시양태에서, 표적 아미노산은 예를 들어 위치 86일 수 있고, 치환된 아미노산의 동일성은 발린, 메티오닌 및 류신으로부터 선택될 수 있다. 여러 실시예에서, 포켓이 폐쇄된 HLA 단백질은 자가면역 질환과 관련된 적어도 하나의 자가펩티드에 대해 더 낮은 결합 친화도를 가질 수 있고, 선택적으로 적어도 하나의 자가펩티드는 제거되고, 추가로 선택적으로 표적 아미노산은 T 세포 수용체 결합 계면에 존재하지 않는다.
본원 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 간행물이 참조될 수 있다. 이들 간행물 전체의 공개는 법이 허용하는 한도 내에서 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분하다. 본 명세서에 설명된 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시하기 위한 것이며 기능적으로 동등한 임의의 구성이 본 발명의 범위 내에 있으므로 본 발명은 설명된 구성에 의해 범위가 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 출원인은 자가면역 질환과 관련된 HLA 대립유전자를 표적화하고 이 정보를 사용하여 하나 이상의 자가 HSC를 포함하는 맞춤형 치료법을 생성하는 기술을 제공하며, 여기서 표적 HLA 대립유전자는 변경된 항원 결합 친화도 및/또는 특이성을 갖도록 조작되었다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 된 도면이 하나 이상 포함되어 있다. 컬러 도면이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청하고 필요한 수수료를 지불하면 관청에서 제공된다.
실시예는 첨부된 도면과 함께 다음의 상세한 설명에 의해 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 첨부된 도면에 의해 제한되지 않으며 예로서 도시된다.
도 1은 자가면역에서 다양한 경로, 상호작용 및 약학적 개입의 개략도이다.
도 2는 조작된 인간화 HLA-DR4/I-Ed와 마우스 TCR/CD4 상호작용의 개략도를 도시하고, 하단은 CD4+ T 세포의 생체외 증식에 의해 검출된 콜라겐 감작에 대한 연구 결과 그래프이다. 여기서 기호는 개별 인간화 DRB1*04:01, DRB1*01:01 및 DRB1*04:01K71E 마우스의 샘플을 나타내고 막대는 평균을 나타낸다. 데이터는 일원 분산 분석(One-way ANOVA)으로 분석되었다.
도 3A는 갈라진 틈 내의 위치 K71 및 콜라겐 펩티드가 차지하는 항원 결합 틈을 식별하는 DRB1*04:01의 3차원 묘사를 보여준다(좌측); 우측 도면은 DRB1*04:01K71E의 구조와 콜라겐 펩티드 결합이 없음을 보여준다. - 산성 잔류물은 파란색으로, 염기성 잔류물은 빨간색으로 표시된다.
도 3B는 0일 및 9일의 대표적인 마우스 및 15-18일의 모든 마우스에 대한 DRB1*04:01 수용자의 피부 이식편을 보여준다. DRB1*04:01K71E 이식(70일)에 대한 장기 생착(long-term engraftment)이 오른쪽 하단 패널에 표시된다. 빨간색 딱지(scabbing)는 이식을 거부했음을 나타낸다.
도 4는 본원의 실시형태에 따른 DRB1*01:01, DRB1*11:01 및 DRB1*15:01 성숙 길이 단백질(mature length proteins)의 서열 정렬(sequence alignment)이다.
도 5는 DRB1*01:01, *15:01 및 *11:01 대립유전자의 항원 결합 연구를 도시한 것으로, 박스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 HLA 클래스 II 분자를 발현하지 않아 펩티드에 결합하지 않는 세포(음성 대조군)와 비교한 펩티드의 결합 비율이다.
도 6은 DRB1*15:01 및 15:02 단일 및 이중 돌연변이 구현예에 대한 자가면역 탈수초화 관련 펩티드의 결합을 도시한 것으로, 박스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 음성 대조군(밝은 회색)과 비교한 결합 비율이다.
도 7은 DRB1*15:01 대립유전자에 대한 자가면역 탈수초화 관련 펩티드의 결합, 및 위치 71 및 86에서의 편집(edit) 효과를 도시한다; 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 8은 본원의 실시형태에 따른 DRB1*03:01, DRB1*07:01, 및 DRB1*09:01 성숙 길이 단백질(mature length proteins)의 서열 정렬이다.
도 9는 DRB1*03:01 및 DRB1*07:01에 결합하는 아쿠아포린 4 펩티드 5 및 6을 도시한다.
도 10은 본원의 실시형태에 따른 *04:01 및 *04:05 성숙 길이 단백질(mature length proteins)의 서열 정렬이다.
도 11은 본원의 실시형태에 따른, 류마티스 관절염과 연관된 3개의 펩티드의 DRB1 대립유전자 *04:05 대립유전자에 대한 결합 및 R71E 편집의 효과를 도시한다. 박스의 오른쪽 상단 모서리에 있는 비율은 음성 대조군(콜라겐)과의 비교 또는 비멘틴 및 α-에놀라제의 기본(native) 형태와 비교를 나타낸다.
도 12는 여러 농도에 걸친 HIP8-NPY 펩티드의 천연(native) 대(vs.) A57D 결합을 도시하며, 여기서 채워진 원은 천연 대립유전자이고, 열린 원은 A57D 돌연변이이다: 패널 A, DQ2; 패널 B, DQ8; 패널 C, DQ2 트랜스; 및 패널 D, DQ8 트랜스.
도 13은 여러 농도에 걸친 HIP11-C 펩티드의 천연(native) 대(vs.) A57D 결합을 도시하며, 여기서 채워진 원은 천연 대립유전자이고, 열린 원은 A57D 돌연변이이다: 패널 A, DQ2; 패널 B, DQ8; 패널 C, DQ2 트랜스; 및 패널 D, DQ8 트랜스.
도 14는 여러 농도에 걸친 인슐린 유사체(mimotope)의 천연(native) 대(vs.) A57D 결합을 도시하며, 여기서 채워진 원은 천연 대립유전자이고, 열린 원은 A57D 돌연변이이다: 패널 A, DQ2; 패널 B, DQ8; 패널 C, DQ2 트랜스; 및 패널 D, DQ8 트랜스.
도 15 (상단)은 DQ2 T2 세포주가 모 EBV 세포주 보다 E2 T 세포 클론을 훨씬 더 잘 자극한다는 것을 보여준다. A57D 돌연변이를 도입하면 E2 T 세포의 자극이 감소한다: HIP11 펩티드의 10uM 및 20uM 프리로드(preload) 농도에서 DQ2 및 DQ2 A57D로 E2 T 세포를 자극했으며, 채워진 원은 DQ2이고, 열린 원은 DQ2 A57D이고, 다이아몬드는 환자의 EBV 형질전환 B 세포주이다. (하단)은 HIP11 펩티드의 10uM 및 20uM 프리로드(preload) 농도에서 DQ2 트랜스 및 DQ2 트랜스 A57D를 사용한 E2 T 세포의 자극을 보여주는 것으로, 여기서 채워진 원은 DQ2 트랜스이고, 열린 원은 DQ2 트랜스 A57D이고, 다이아몬드는 환자의 EBV 형질전환 B 세포주이다.
도 16은 다양한 HLA-DQ 대립유전자 결합 하이브리드 인슐린 펩티드를 도시하며, 박스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 결합 비율이다.
도 17은 본원의 실시형태에 따른 당뇨병 유발 펩티드에 결합하는 다양한 HLA-DQ 대립유전자를 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 18은 본원의 실시양태에 따른 DRB1*03:01, *04:01 및 *15:01에 대한 하이브리드 인슐린 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 19는 본원의 실시양태에 따른 DRB1*03:01, *04:01 및 *15:01에 대한 당뇨병 유발 펩티드 및 인플루엔자 헤마글루티닌(influenza hemagglutinin) 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 20은 본원의 실시양태에 따른 DRB3, DRB4 및 DRB5 대립유전자에 대한 하이브리드 인슐린 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다. 이러한 대립유전자의 '공통' 혈청학적 이름(예: HLA-DR52)은 대립유전자 이름 위에 표시된다.
도 21은 본원의 실시양태에 따른 DRB3, DRB4 및 DRB5 대립유전자에 대한 당뇨병 유발 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 22는 본원의 실시양태에 따라 유전자 편집된(gene-edited) HLA 분자에 의한 결합을 조사하기 위해 본 발명에 사용된 다양한 항원의 목록이다.
도 23A는 본원의 실시양태에 따른 포켓 1(Pocket 1)의 위치를 보여주는 DRB1 구조의 3차원 표현 및 아미노산의 화학적 성질의 2차원 표현이다.
도 23b는 본원의 실시양태에 따른 DRB1*04:01 및 포켓 1 돌연변이 G86L 및 G86M을 갖는 본 발명의 편집된 대립유전자의 항원 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 24는 본원의 실시양태에 따른 DRB1*04:01 및 포켓 1 돌연변이 G86L 및 G86M을 갖는 본 발명의 2개의 편집된 대립유전자에 대한 하이브리드 인슐린 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 25는 본원의 실시양태에 따른 DRB1*04:01 및 포켓 1 돌연변이 G86L 및 G86M을 갖는 본 발명의 편집된 대립유전자에 결합하는 신경자가면역(neuroautoimmune) 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 26은 본원의 실시양태에 따른 DRB1*04:01 및 포켓 1 돌연변이를 갖는 본 발명의 조작된 대립유전자에 대한 관절염 유발성(arthritogenic) 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 천연 펩티드와 비교한 시트룰린화 펩티드의 결합 비율이다.
도 27은 본원의 실시양태에 따른, DRB1*04:01 및 포켓 1 돌연변이를 갖는 본 발명의 조작된 대립유전자에 대한 천연(native) 및 시트룰린화(citrullinated) 관절염 유발(arthritogenic) 펩티드의 결합을 도시한다. 박스의 왼쪽 상단에 있는 숫자는 음성 대조군과 비교한 결합 비율이다.
도 28은 본원의 실시양태에 따른 대표적인 HLA 대립유전자, 아미노산 위치 및 돌연변이의 목록이다.
본 발명은 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상에서 자가면역 질환을 치료, 감소 또는 제거하는데 유용한 다양한 방법 및 조성물을 제공한다.
이러한 자가면역 질환에는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 셀리악병(celiac disease), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 수초희소돌기아교세포 당단백질 항체 장애(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody disorders, MOGAD), 근무력증 증후군(myasthenic syndromes), 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 증후군(Behet's syndrome), 버드샷 포도막염(Birdshot uveitis), 기면증(narcolepsy), 기면증 1형(narcolepsy type 1, NT1; 이전에는 탈력발작을 동반한 기면증(narcolepsy with cataplexy)으로 불림), 가와사키병(Kawasaki disease), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 피부근염(dermatomyositis, DM), 애디슨병(Addison's disease), 과민성대장증후군(irritable-bowl syndrome, IBS), 그레이브스병(Graves' disease), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schnlein purpura, HSP), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발근염(polymyositis, PM), 신생물부신경증후군(paraneoplastic neurological syndromes, PNS), 자가면역뇌염(autoimmune encephalitis), 루푸스신염(lupus nephritis, LN), 중증근육무력증(myasthenia gravis, MG), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 이식 거부반응(graft rejection), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 원치 않는 지연형 과민반응(unwanted delayed-type hypersensitivity reaction), T세포 매개성 폐질환(T-cell mediated pulmonary disease), 신경염(neuritis), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 자가면역 갑상선 질환(autoimmune thyroid diseases), 천식(asthma), 자가면역 포도막염(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 본 발명의 자가면역 질환은 하나 이상의 인간 백혈구 항원(HLA) 대립유전자의 존재와 상관관계가 있다. 출원인은 자가면역 질환을 앓고 있는 대상에서 자가면역 질환의 하나 이상의 증상을 개선하는데 유용한 방법 및 화합물을 본원에 개시한다. 여러 구현예에서, 방법은 감수성 HLA 대립유전자의 아미노산 서열을 동일한 자가면역 질환에 대한 저항성과 연관된 하나 이상의 HLA 대립유전자와 비교하여 대상의 항원 제시 세포에 의해 발현된 자가면역 감수성 HLA 대립유전자를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 대부분의 구현예에서, 조혈 줄기 세포는 대상으로부터 동원되고 분리되며, 감수성 HLA 대립 유전자는 변형되거나 HLA 대립 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 항원 결합 틈 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 HLA 대립 유전자로 대체되고, 치환된 아미노산의 구체적인 동일성은 저항성과 관련된 HLA 대립유전자의 동일한 아미노산 위치의 동일성과 일치한다.
특정 구현예에서, HLA 유전자의 갈라진 틈을 제시하는 항원의 표적화된 조작은 하나 이상의 자기-항원에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성을 변형시킨다. 대부분의 실시양태에서, TCR 조사로부터 숨겨진 갈라진 틈 내의 단일 아미노산은 돌연변이되어 TCR 결합에 직접적인 영향을 주지 않고 펩티드 결합을 변경시킨다. 대부분의 구현예에서, 개시된 HLA 돌연변이는 환자에서 거부반응 또는 GVHD를 유발하지 못하는 HLA 단백질 변화를 초래한다. 대부분의 구현예에서, 자가면역 질환을 앓고 있는 대상의 하나 이상의 항원 제시 세포에서 조작된 HLA 단백질의 발현은 자가면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 완화시키는 결과를 가져올 수 있다.
또한, 본 발명은 HLA 대립유전자의 결합 틈에서 포켓을 폐쇄하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 감수성 HLA 대립유전자를 확인하는 단계, 및 항원 결합 틈의 포켓에서 또는 근처의 표적 아미노산 위치를 확인하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 포켓은 항원 결합 틈의 바닥에 있는 오목부(recess)을 정의한다. 상기 방법은 폐쇄 HLA 대립유전자를 생성하기 위해 표적 아미노산보다 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 치환하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 두 번째 아미노산의 측쇄는 항원 결합 틈의 바닥에 있는 오목부 내로 연장되어 HLA 대립유전자의 포켓을 폐쇄한다. 다양한 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5로부터 선택될 수 있고, 포켓은 포켓 1일 수 있다. 이들 실시양태에서, 표적 아미노산은 예를 들어 위치 86일 수 있고, 치환된 아미노산의 동일성은 발린, 메티오닌 및 류신으로부터 선택될 수 있다. 여러 실시예에서, 포켓이 폐쇄된 HLA 단백질은 자가면역 질환과 관련된 적어도 하나의 자가펩티드에 대해 더 낮은 결합 친화도를 가질 수 있고, 선택적으로 적어도 하나의 자가펩티드는 제거되고, 추가로 선택적으로 표적 아미노산은 T 세포 수용체 결합 계면에 존재하지 않는다.
본 출원의 개념은 도 1의 다이어그램에 제시되어 있다. HLA T 세포 수용체(TCR) 상호작용은 많은 자가면역 질환, 예를 들어 위에서 설명한 질환의 발병에 있어서 중심적인 측면이다. 자가면역 질환을 표적으로 하는 현재 생물학적 제제는 이 신호의 하류에 있는 선천적 및 적응성 경로를 표적으로 삼아 차단하는 경향이 있다. 이는 이러한 경로가 수많은 병원체에 대한 보호 면역 반응에 관여하고 이를 차단하거나 변경하여 환자를 다양한 기회 감염의 위험에 빠뜨리기 때문에 문제가 된다.
APC는 골수에 있는 HSC 전구세포로부터 유래된다. 본원에 개시된 조작된 HSC는 자가면역을 유발하는 항원을 제시하는 대상 APC를 대체한다. 조작된 HSC는 변경된 HLA 분자를 발현하여 자가반응성 CD4+ T 세포의 사전 활성화와 만성 염증성 사이토카인 생성, 대식세포 활성화 및 B 세포 자가항체 생성에 대한 후속 영향을 감소, 예방 및/또는 해결한다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 편집된 HLA 단백질을 포함하는 조작된 자가 HSC를 사용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 개시된 방법은 유리하게는 환자의 면역계의 다른 측면에 대한 광범위한 영향을 피하면서 환자의 자가면역 질환의 근본적인 병인을 구체적으로 표적으로 삼는다.
단핵구, 대식세포 및 수지상 세포(DC)는 많은 자가면역 질환에서 질병 상태를 시작하고 유지하는 데 도움이 되는 주요 APC이다. 예를 들어, RA에서 세포는 통증 및 질병의 관절 손상 진행과 관련된 관절의 과다염증 상태를 유지한다. 그러나 이러한 세포는 수명이 짧으며 정기적으로 골수의 CD34+ HSC에서 보충되어야 한다. 예를 들어, 단핵구는 일반적으로 혈액 속에서 단 며칠 동안만 생존한다. 그러나 단핵구가 염증이 있는 관절로 이동하면 단핵구 유래 DC 및 대식세포로 진행되어 몇 주에서 몇 달 동안 생존할 수 있다. 따라서, 본원은 환자의 골수의 하위세트를 더 이상 자가면역원성 항원을 제시하지 않는 새로운 조작된 단핵구, 대식세포 및 DC를 생성할 조작된 HSC로 대체하여 T 세포의 활성화를 방지하고/하거나 자가반응성 T 세포가 정지 메모리 상태로 되돌아가게 하는 것을 개시하고 있다.
본원에 개시된 방법, 조성물 및 시스템은 일반적으로 조작된 HSC를 주입하기 전에 환자의 T 세포 및 B 세포를 고갈시키는 것을 포함하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 치료 방법은 미생물 병원체 및 인식 종양 항원에 의한 감염에 대한 환자의 정상, 선천 및 적응 면역을 유지한다.
조작된 HSC에 의한 발현을 위한 HLA 대립유전자, 위치 및 돌연변이 선택
본원에는 HLA 대립유전자, 이러한 대립유전자 내의 표적 아미노산 위치, 및 조작된 HSC에 의한 발현을 위한 해당 위치에서의 돌연변이를 선택하는 방법이 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 개시된 방법, 조성물 및 시스템은 하나 이상의 HLA 대립유전자, 위치 및/또는 돌연변이를 선택하고 식별하고, 상기 대립유전자를 변형시켜 비변형 HLA 대립유전자와 비교하여 적어도 하나의 자기항원에 대해 변경된 결합 친화도를 갖는 조작된 HLA 대립유전자를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 여러 구현예에서, 조작된 HLA 대립유전자는 개시된 치료법에 의해 치료될 환자의 조작된 조혈 세포에 의해 발현된다.
본원에 개시된 방법은 감수성 대립유전자 또는 감수성 HLA 대립유전자로 지칭될 수 있는 자가면역의 위험 증가와 밀접하게 연관된 HLA 대립유전자를 확인 및/또는 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 감수성 HLA 대립유전자는 특정 자가면역 질환을 갖는 환자의 약 5% 이상, 예를 들어 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 이상 및 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5% 미만에서 발견된다. 여러 실시예에서, 감수성 HLA 대립유전자는 확인된 자가면역 질환을 앓지 않는 개체(즉, 대조 집단 또는 대조군)의 더 작은 비율, 예를 들어 약 35% 또는 5% 미만에서 발견될 수 있다.
많은 실시예에서, 감수성 HLA 대립유전자는 확인된 자가면역 질환을 앓지 않는 개체(즉, 대조 집단 또는 대조군)의 더 작은 비율, 예를 들어 약 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만에서 발견될 수 있다.
RA의 경우 DRB1*04:04, DRB1*01:01 또는 DRB1*04:01을 HLA 대립유전자로 선택하여 공학적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 DRB1 대립유전자는 71번 위치에 아르기닌을 함유하고 있으며 RA 발병 위험이 높지만 상대적으로 흔하지 않다. DRB1*01:01은 대조군의 9.7%에 비해 RA 환자의 대립유전자 빈도는 13%로 발견되며 이러한 다른 '공유 에피토프' 중에서 가장 일반적이다. 대립유전자 DRB1*04:03 (0.6%), *04:04 (9.1%), *04:05 (1.2%), *04:08 (1.7%) 및 *10:01 (2%)은 모두 RA 환자에서 상대적으로 드물다. 대조적으로, DRB1*04:01은 RA 환자의 31%에서 나타난다. (대조군의 10%에 비해, ??= 10-3). DRB1*04:01의 빈도는 질병의 중증도에 따라 증가하여 불응성 RA 환자의 50% 이상, 가장 심각한 형태의 RA(펠티 증후군)의 88%로 증가한다. 또한 DRB1*04:01은 RA에 대한 민감도가 가장 높다.
본 발명에 개시된 방법은 조작된 HLA 대립유전자를 생성하기 위해 돌연변이되기 쉬운 HLA 대립유전자 내의 표적 아미노산 위치를 식별 및/또는 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선택된 표적 아미노산 위치는 (1) HLA 단백질의 구조적 코어에 묻혀 있지 않으며, (2) HLA 단백질의 항원 결합 틈에 또는 그 근처에 위치하고, (3) 홈/틈 내에 있고 T 세포 수용체에 직접 접근할 수 없다. 즉, TCR:HLA 결합 경계면에 있지 않으며/ 또는 (4) 조작된 HLA 대립유전자에 대한 적어도 하나의 항원의 결합 친화도를 변경한다. 여러 실시양태에서, 선택된 감수성 HLA 대립유전자 분자에 의해 암호화된 단백질 내 개시된 표적 아미노산 위치는 감수성과 연관되지 않은 동일한 HLA 유전자의 또 다른 대립유전자에서 상이한 동일성을 가질 수 있다. 대신, 이 다른 HLA 대립유전자는 동일한 자가면역 질환에 대한 저항성과 연관될 수 있다; 이 HLA 대립유전자는 저항성 HLA 대립유전자로 지칭될 수 있다. 예를 들어, RA 관련 감수성 HLA 대립유전자 DRB1*04:01의 성숙 단백질에서 표적 아미노산 위치 71은 라이신인 반면, RA 관련 저항성 HLA 단백질 DRB1*04:02에서 위치 71은 글루탐산이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, HLA 엔지니어링은 HLA 불일치의 결과를 최소화하거나 완전히 방지하도록 최적화된다. 동종이계 골수 이식의 수용자 중에서, 임의의 HLA 차이는 이식 실패(거부) 및 GVHD의 위험을 증가시키므로, 본원에 기술된 특정 구현예는 HLA 분자의 항원 결합 홈/틈 내의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, DRB1*04:01에서 K71의 위치는 HLA 분자의 상부 표면(TCR 상호작용 표면) 아래에 있으며 TCR과 직접 접촉하지 않는다. 따라서 DRB1*04:01의 K71 돌연변이는 직접적인 동종반응성을 유도할 가능성이 없다. 특정 실시양태에서, 적합한 조작 부위는 인실리코(in silico) 모델링, 펩티드 결합 분석 및/또는 조작된 HSC에 의해 유발된 T 세포 반응의 시험관내 특성화와 같은 T 세포 반응을 유발하는 무능력을 기준으로 평가된다.
본원에는 항원 결합을 변경하기에 충분하지만 거부반응을 유발하지 않는 편집된 HLA 대립유전자를 생성하는 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 편집된 HLA 대립유전자 DRB1*04:01K71E는 자연에서 발견되지 않는 변이체이며, 그 펩티드 레퍼토리와 동종반응 가능성은 알려지지 않았다.
대상의 면역 체계에 의한 거부를 피하면서 변경될 수 있는 HLA 표적 아미노산 위치를 확인하기 위해 본원에 개시된 방법론에 기초하여, 본원 발명은 그러한 아미노산 변화가 거부를 피하면서 자가면역을 치료한다는 것을 보여준다. 구체적으로, 본원은 DRB1*04:01 또는 DRB1*04:01K71E를 발현하는 형질전환 마우스를 생성하고 이들 계통 사이의 피부 이식을 수행하였다. 한 DRB1*04:01 마우스에서 채취하여 다른 DRB1*04:01 마우스에 적용한 피부 이식편은 DRB1*04:01 면역 세포에 의해 자기 자신으로 받아들여진다. 그러나 DRB1*04:01 마우스의 면역 세포가 DRB1*04:01K71E를 외부 조직으로 인식하면 거부된다(그 반대의 경우도 마찬가지).
본 발명의 실험 결과는 피험자 자신의 감수성 HLA 대립유전자 및 HSC에 기초하여 조작된 HLA 대립유전자를 생성하는 본원에 개시된 방법이 거부되지 않음을 입증한다. 본원에 개시된 조작된 HLA-DRB1*04:01K71E 대립유전자는 항원 결합 틈에 하나의 비천연 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 치환은 적어도 하나의 항원(천연 감수성 대립유전자에 비해)에 대한 결합을 변경하지만 DRB1*04:01K71E 편집과 같은 T 세포 수용체 상호작용에 직접적인 영향을 미치지 않으며 천연 DRB1*04:01 수용자에서 동종반응성을 유도하지 않는다.
100개 이상의 유전자좌가 RA와 연관되어 있다. 그러나 RA 발병과 가장 강력한 유전적 연관성은 주요 조직적합성 복합체 내의 DRB1 유전자에 있으며, 이는 유전적 위험의 약 50%에 기여한다. 보다 구체적으로, HLA-DRB1의 3개 아미노산 위치(11, 71 및 74; HLA 내의 aa 위치는 면역 다형성 데이터베이스-ImMunoGeneTics 프로젝트/인간 백혈구 항원 또는 IPD-IMGT/HLA 웹사이트(ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla 웹사이트에서 이용 가능)에 제시된 바와 같이 성숙한 단백질에 상대적임)는 HLA DRB1 유전자좌와 혈청 양성 RA의 연관성을 대부분 설명한다.
모든 관련 RA 감수성 대립유전자와 RA 저항성 대립유전자를 클로닝한 후 개별 아미노산에 대해 부위 지정 돌연변이 유발을 수행함으로써, 본 발명은 위치 71을 K에서 E로 돌연변이시키면 펩티드 결합 프로파일이 저항성 HLA 대립유전자 DRB1*04:02 와 유사한 프로파일로 전환된다는 것을 입증했다 (아래).
본 발명은 펩티드 경쟁 분석을 사용하여 HLA 대립유전자 DRB1*04:01이 RA 관련 항원 세트, 특히 번역 후 변형된 "변경된 자가" 펩티드에 대해 가장 큰 선호도를 갖는 것으로 확인했다. 이러한 변형된 자가 펩티드는 전임상 RA의 초기 내성 위반을 알 수 있다. 변경된 자가 펩티드 모음에는 감염 및 염증 중에 상향 조절되는 시트룰린화 펩티드 신생항원 세트가 포함되어 있다. 인간 유형 II 콜라겐은 동물 모델과 관절염을 유발하는 마우스 CD4+ T 세포에서 관절염을 유발하며 콜라겐의 아미노산 258-272 사이에 위치한 면역우세 펩티드를 인식한다. 콜라겐258-272 펩티드를 인식하는 CD4+ T 세포는 RA 관절에서 발견되며, 질병 발병 시 말초혈액에 존재하는 이들의 존재는 관절 질환의 급속한 진행 및 기존의 합성 및 생물학적 질병 수정 항류마티스 약물(DMARD)에 대한 낮은 반응성과 관련이 있다. 본 발명은 위치 71의 산성 K 잔기와 콜라겐258-272 펩티드의 염기성 E 잔기 사이의 이온 인력이 DRB1*04:01에 대한 펩티드 결합을 향상시킨다는 것을 발견했다.
난치성 RA는 다양한 관절의 윤활막이 지속적인 염증 상태로 유지되는 질병의 더 심각한 형태이다. 이러한 염증 상태는 T 세포 대식세포, 호중구 및 B 세포의 침윤을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물, 방법 및 치료법은 DRB1*04:01K71E 대립유전자를 발현하는 골수성 APC를 보충할 골수에서의 조작된 HSC 생착을 초래한다.
이론에 의해 제한되기를 바라지 않고, 천연 DRB1*04:01과 달리 조작된 DRB1*04:01K71E는 콜라겐258-272에 단단히 결합하지 않고 이를 밀어낼 수 있어 이 자가항원에 대한 CD4+ T 세포 반응이 약화될 수 있다. 콜라겐 특이적 기억 CD4+ T 세포 집단이 환자에게 지속될 수 있지만, 이러한 세포는 만성 관절 염증을 유지하는 데 필요한 필수 TCR 신호를 더 이상 수신하지 못할 수 있다.
본 발명의 조작된 HSC는 며칠 내에 골수에 이식되고 10일 이내에 DRB1*0401K71E-발현 골수 세포를 생성하기 시작할 것이다. 환자가 본 발명의 조작된 HSC의 투여 전에 면역억제 조건화를 겪지 않는 실시양태에서, 환자는 시술 전에 존재하는 획득된 T 및 B 세포 면역을 유지할 것이다. 환자가 저용량 부설판을 사용하여 비골수절제 조건화로 치료되는 실시 형태에서, 환자는 짧은 기간 동안 호중구 감소증 (7-10일; 낮은 농도의 호중구, 감염, 특히 박테리아에 대한 면역 반응을 높이는 데 필요함) 및 낮은 혈소판 수 (20-30일; 혈액 응고에 영향을 줄 수 있음)를 경험할 수 있다. 이러한 현상은 생명을 위협해서는 안 되며 심각한 부작용(SAE)도 예상되지 않는다.
본 발명의 치료법으로 치료 가능한 자가면역 질환
류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis, RA)은 관절낭 활액의 염증을 특징으로 하는 자가면역 질환으로, 대식세포, 호중구, T 세포 및 B 세포의 침윤을 초래하여 광범위한 관절 파괴, 장애 및 삶의 질 저하를 초래한다. RA와 관련된 지속적인 염증은 또한 허혈성 심장 및 호흡기 질환 발병 위험을 증가시켜 조기 사망을 초래한다. RA는 세계 인구의 약 1%에서 발생하며, 미국에서만 약 130만 명이 영향을 받는다. RA는 40세 이상의 여성과 장기간 흡연자에게서 더 자주 발생한다. 매년 수십억 달러의 직접 의료 비용이 RA 치료와 관련되어 있으며, RA(직접, 간접, 무형)의 연간 총 사회적 비용은 미국에서만 수백억 달러에 달하는 것으로 추산된다.
베체트 증후군(Behet's syndrome)은 재발성 구강 궤양, 생식기 궤양, 피부 병변, 포도막염, 관절염, 위장관 또는 중추신경계 침범과 같은 보다 광범위한 전신 증상을 특징으로 하는 만성 다기관성 염증 질환이다. 이 질병은 모든 크기의 동맥 및 정맥 혈관에 다발성 병변이 있는 가변 혈관 혈관염으로 분류된다.
버드샷 포도막염 (Birdshot uveitis) (버드샷 맥락망막병증 또는 버드샷 망막병증이라고도 함)은 눈 뒤쪽의 혈관 아케이드 (즉, 이러한 병변이 사진으로 보이는 눈의 '안저')를 따라 분포된 '산탄총 패턴'과 유사한 난형 가벼운 병변으로 주로 알려진 자가면역 포도막염 (눈의 포도막층의 염증)의 잘 특징화된 형태이다. 맥락막의 염증 및 광범위한 탈색, 황반 부종, 말초 허혈, 망막 변성 및 망막에 얇은 반흔 조직 층("망막앞막")의 진행성 형성으로 인해 상당 부분의 환자에서 시력이 점진적으로 손상된다. 버드샷 포도막염은 일반적으로 서유럽 혈통의 50세 이상의 환자에게 영향을 미치며, 남성보다 여성이 더 많이 영향을 받는다.
셀리악병(Celiac disease)은 유전적 소인이 있는 개인의 식이 글루텐 노출로 인해 유발되는 만성 면역 매개성 장질환이다(1). 소아 지방변증 환자의 경우 글루텐 섭취는 면역 체계의 선천적 반응과 적응적 반응을 모두 활성화시키며, 융모 위축, 선와 증식 및 림프구 침윤을 포함한 점막 구조의 변화를 결정하는 만성 염증을 유발한다. 이러한 구조 변화로 인해 장 점막의 기능이 상실되고 영양분 흡수 장애로 인한 증상이 시작된다.
건선(Psoriasis)은 수지상 세포의 참여로 T 림프구에 의해 매개되는 만성 염증성 질환이다. 유전적 및 환경적 요인은 명백한 질병의 발병에 기여하거나 필요하다. 병변은 홍반과 표피 박리를 특징으로 하며 경계가 뚜렷한 플라크부터 미만성 홍피증까지 다양한 임상 형태를 나타낸다. 최대 30%의 환자에서는 관절 침범이 있을 수 있으며, 치료하지 않으면 미란성 질환과 무능력을 초래할 수 있다. 이는 서방 국가 인구의 2%에 영향을 미치는 널리 퍼진 질병으로 간주된다.
기면증(Narcolepsy)은 1877년 Westphal에 의해 처음 기술되었고 1880년 G
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lineu에 의해 명명되었다. 1953년 급속 안구 운동(REM) 수면이 발견된 후 여러 연구자들이 기면증 환자의 수면 시작을 연구했다. 건강한 사람은 일반적으로 잠들고 약 90분 후에 첫 번째 REM 수면에 들어가지만, 기면증 환자는 수면 시작 시 곧바로 REM 수면에 들어가는 경우가 많다. REM 수면을 조절하는 메커니즘의 오작동은 기면증의 일부 증상을 설명할 수 있다. 기면증은 현재 알려진 치료법이 없다. 적절한 치료를 통해 증상을 관리할 수 있지만 대부분의 환자에서는 평생 치료가 필요하다.
가와사키병(Kawasaki disease, KD)은 어린이 후천성 심장병의 주요 원인인 급성 전신 혈관염이다. KD의 발병기전은 아직 알려지지 않았다. KD는 유전적으로 취약한 어린이의 알려지지 않은 유발인자에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생할 가능성이 높다. 척추동물에서 가장 다형성이 높은 유전자로 알려진 HLA(인간 백혈구 항원) 유전자는 면역체계 조절에 관여하는 세포 표면 항원 제시 단백질의 단백질을 암호화한다. HLA 유전자의 역할은 베체트병, KD 및 베게너 육아종증을 포함한 여러 면역 매개 혈관 질환에서 조사되었다. 최근 게놈 차원의 연관성 연구에서는 일본 인구에서 HLA 클래스 II 영역(HLA-DQB2-DOB)과 KD의 중요한 연관성이 입증되었다.
신경근 전달의 드문 장애인 중증근육무력증(Myasthenia gravis, MG)은 단일 질병이 아닌 증후군으로 점점 더 인식되고 있다. 최근에는 중증근육무력증에 대한 새로운 항원에 대한 활발한 연구가 진행되어 왔으며, 임상 및 실험 연구는 미래 치료법의 표적이 될 수 있는 면역 조절의 중요한 경로에 대한 새로운 통찰력을 제공했다.
전신홍반루푸스(Systemic lupus erythematosus, SLE)는 여러 장기 시스템을 침범하는 심각한 자가면역 질환이다. 루푸스 신염(Lupus nephritis, LN)은 SLE의 합병증이며 낮은 생존율 및 높은 이환율과 관련이 있다. 전 세계적으로 많은 게놈 연구가 수행되었으며, 여러 조직적합성 백혈구 항원(HLA) 유전자좌가 루푸스 감수성과 연관되어 있다.
크론병(Crohn's disease, CD)은 크론 등이 말단 회장염 14건을 보고한 1932년부터 알려져 왔다. 크론병은 주로 입에서 항문까지 위장관에 영향을 미치는 재발성 염증성 질환이다. 이는 위장관의 모든 부분(가장 일반적으로 말단 회장 또는 항문주위 부위)을 비연속적으로 침범한다.
자가면역 신경학은 최근 몇 년 동안 엄청난 발전을 보인 확장 분야이다. 이러한 발전의 대부분은 말초 및/또는 중추 신경계의 항원에 대한 자가항체(Ab)의 발견 및 특성화에 기인하며 이러한 질병의 바이오마커로 사용된다. 이들 Ab 중 일부는 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO)의 아쿠포린-4(aquoporin-4)에 대한 Ab(항-AQP4 Ab)와 같이 이미 알려진 개체를 더 잘 정의할 수 있게 해주었다.
제1형 당뇨병(Type 1 diabetes, T1D)은 췌장에서 인슐린을 분비하는 세포가 파괴되는 다인성 자가면역 질환이다. 게놈 전반의 연관성 연구에서는 제1형 당뇨병 발병 위험과 관련된 50개 이상의 유전자좌를 확인했다. 그러나 DQ2 및 DQ8과 같은 특정 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자의 유전은 질병 감수성과 가장 밀접하게 연관되어 있다.
강직성 척추염(Ankylosing spondylitis, AS)은 척추와 말초 관절의 면역 매개 관절염을 일으키는 만성 염증성 질환이다. 이 질병은 남성에게 더 흔하며 증상은 일반적으로 어릴 때 시작된다. HLA-B*27:05는 AS와 강하게 연관되어 있지만 B*27:06 및 B*27:09는 저항성과 연관되어 있다.
다발성 경화증(Multiple sclerosis, MS)은 뇌와 중추신경계의 자가면역 질환이다. 다발성 경화증(MS)에서는 면역 체계가 신경 섬유를 덮고 있는 미엘린 껍질을 공격하여 신경의 영구적인 손상이나 악화를 일으킬 수 있다. MS에 대한 감수성은 DRB1*15:01 대립유전자와 연관되어 있다.
하기 표 1에는 위에서 설명한 자가면역 질환에 대한 감수성과 관련된 다양한 HLA 대립유전자를 보여준다. 표 1에는 저항성 HLA 대립유전자의 동일한 위치에 있는 아미노산에 상응하도록 돌연변이가 발생하는 경우 자가면역 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하는 데 도움이 될 수 있는 표적 아미노산 위치도 보여준다. 표 1은 또한 자가면역 질환을 치료하기 위한 표적 아미노산 위치에서의 특정 돌연변이를 개시한다.
가공된 HLA 분자
본 발명에는 다양한 조작된 HLA 분자가 개시되어 있다. 일부 구현예에서, HLA 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-A는 9, 12, 17, 31, 35, 43, 44, 56, 62, 63, 65, 66, 67, 70, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 90, 95, 97, 99, 102, 105, 107, 109, 114, 116, 127, 142, 144, 145, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 161, 163, 166, 167, 171, 184 및 186; 구체적으로 9, 31, 56, 62, 63, 66, 73, 77, 80, 81, 95, 97, 99, 114, 116, 150, 152, 156 및 171로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-B는 4, 9, 11, 12, 24, 30, 32, 33, 41, 45, 46, 52, 59, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 90, 94, 95, 97, 99, 103, 109, 113, 114, 116, 131, 143, 145, 147, 152, 156, 158, 162, 163, 166, 167, 171, 177, 178 및 180; 구체적으로 9, 24, 33, 45, 46, 52, 59, 62, 66, 70, 73, 77, 81, 95, 97, 99, 114, 116, 143, 147, 152, 156, 163, 167, 171 및 178로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-C는 4, 9, 11, 12, 24, 30, 32, 33, 41, 45, 46, 52, 59, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 90, 94, 95, 97, 99, 103, 109, 113, 114, 116, 131, 143, 145, 147, 152, 156, 158, 162, 163, 166, 167, 171, 177, 178 및 180; 구체적으로 4, 24, 30, 33, 45, 52, 59, 62, 63, 66, 67, 70, 73, 74, 77, 80, 81, 95, 97, 99, 114, 116, 143, 147, 152, 167 및 171로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-DQA1는 20, 26, 34, 40, 41, 44, 46, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 55, 61, 64, 66, 69, 75, 76 및 80; 구체적으로 34, 44, 61, 64, 69, 76 및 80로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-DQB1는 9, 13, 14, 26, 28, 30, 37, 38, 45, 46, 47, 52, 53, 55, 56, 57, 66, 67, 70, 71, 74, 75, 77, 84, 85, 86, 87, 89 및 90; 구체적으로 9, 26, 28, 30, 37, 38, 47, 53, 57, 67, 70, 71, 74, 86, 87 및 90로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-DPA1는 11, 18, 28, 30, 31, 50, 72, 73, 83 및 96; 구체적으로 11, 28, 31, 72, 73 및 96로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-DPB1는 8, 9, 11, 33, 35, 36, 55, 56, 57, 65, 69, 72, 76, 84, 85, 86, 87 및 91; 구체적으로 9, 11, 33, 35, 36, 55, 56, 65, 69, 72, 76, 84, 87 및 91로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 조작된 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 25, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 40, 47, 57, 58, 60, 67, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 85 및 86; 구체적으로 9, 11, 13, 26, 28, 30, 32, 33, 37, 38, 40, 47, 57, 58, 67, 71, 74, 78, 85 및 86로부터 선택된 다형성 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 감수성 HLA 대립유전자로부터 하나 이상의 조작된 HLA 대립유전자를 생성할 수 있다:
A*02, A*03, A*29;
B*07, B*08, B*08:01, B*27, B*27:03 B*27:05, B*27:09, B*51, B*54:01, B*57;
C*06, C*18;
DPA1*02:01;
DPB1*13:01;
DQ;
DQA1*02:01, DQA1*03:01, DQA1*05, DQA1*05:01;
DQB1*02, DQB1*02:01, DQB1*03, DQB1*03:01, DQB1*03:02, DQB1*06:02;
DR;
DRB1*01:03, DRB1*04, DRB1*07, DRB1*07:01; DRB1*15, DRB1*15:01; DRB1*16; DRB1*08, DRB1*08:01, DRB1*11:04.
본 발명에는 성숙한 HLA 단백질 서열 내의 표적 아미노산 위치에서의 다양한 돌연변이가 개시된다. 여러 실시양태에서, 돌연변이는 상기 개시된 기준에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 특정 대립유전자 돌연변이는 치료할 자가면역 질환 또는 장애에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어 다음과 같은 치료법이 있다: 1형 당뇨병은 A57D의 DQB1*02:01(위치 57의 천연 A인 알라닌이 D인 아스파르트산으로 돌연변이됨) 및/또는 A57D의 DQB1*03:02에 돌연변이를 포함할 수 있다; 류마티스 관절염은 L67I, Q70D, L67I+Q70D, K71E, K71R, L67F, A74L, L67F-A74F, G86V, G86M, G86L, G86F 및 A74E의 DRB1*04:01에; R71E의 DRB1*04:05에, L671, Q70D, R71E, V85A 및 G86V의 DRB1*01:01에, R71E의 DRB1*04:03에, R71E의 DRB1*04:04에, R71E의 DRB1*04:08에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다; 다발성 경화증은 F47Y, A71R, A71R-V86G, V86L 및 V86F의 DRB1*15:01에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다; 셀리악병은 K71E 및 K71T의 DQB1*02:01에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다; 시신경척수염은 V86L 및 V86M의 DRB1*03:01에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다; 베체트 증후군은 B*51에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다; 건선은 C*06; B*57 및 C*06; C*18, A*02에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
치료 방법
본 발명은 조작된 APC 및/또는 APC 전구체, 즉 조작된 HSC를 투여함으로써 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 예를 들어, T 세포 치료법과 대조적으로, 본원에 개시된 조작된 세포 조성물은 T 세포 매개 거부 반응을 유도하기보다는 감소시키거나 예방하기 위해 제공된다. 따라서, 조작된 조성물은 대상의 특정 상태를 표적으로 하면서 비교적 광범위한 치료 범위를 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 조작된 HSC의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 대상은 1일 이상에 걸쳐 1회 이상의 용량으로 정맥내 투여 등을 통해 체중 kg당 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 예를 들어 100만개 내지 500만 이상의 조작된 자가 유래 HSC를 투여받는다.
본 발명의 방법은 기술된 바와 같이 조작된 HSC의 생산 및 투여를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조작된 HSC는 치료할 대상에 대해 자가 유래이다. 따라서, 일부 구현예는 대상으로부터 HSC 또는 HSC 전구체를 분리하는 것, 분리된 HSC의 생체외 조작, 조작된 HSC의 선택적(optional) 선택 및/또는 확장, 및 조작된 자가 HSC를 대상에 투여하는 것을 포함한다.
HSC 또는 전구체는 당업계에 공지된 방법에 의해 대상으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, PBMC 및/또는 골수 세포는 CD34의 발현에 기초하여 동원 및 분리되고, HSC는 정제될 수 있다. HSC 하위집단은 원하는 대로 추가 항원의 발현을 기반으로 선택될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, HSC는 당해 분야에 공지된 바와 같이 대상의 사전 수확된 줄기 세포 또는 역분화 세포와 같은 전구 세포로부터 생산될 수 있다. 자가 HSC가 특정되지만, 본 발명은 자가 HSC에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 비자기 반응을 유도할 수 있는 단백질을 발현하지 않고 원하는 HLA를 발현하도록 조작된 비-자가(공여자) HSC가 제공된다.
본 발명에 제공된 방법의 특정 구현예는 또한 비-골수파괴 컨디셔닝과 같은 사전 컨디셔닝 및/또는 조작된 HSC의 생착을 촉진하기 위한 치료후 중재를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 HSC 조작은 특히 본원에 기술된 바와 같은 발현된 자가면역 저항 대립유전자 및/또는 유전자 편집 구축물을 암호화하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 생체내에서 수행될 수 있다. 더욱이, 본원에서는 단일 조작된 HSC 집단에 대해 주로 언급되지만, 다중 대립유전자 자가면역 질환의 경우와 같이 별도의 HLA 대립유전자 변형을 갖는 다중 HSC 조성물이 개별적으로 또는 순차적으로 제공될 수도 있다.
HLA 대립 유전자 엔지니어링
본 발명은 유전자 편집을 위한 시스템, 구축물, 기술 및 자가면역에 대한 저항성을 제공하기 위한 그의 적용을 포함한다. 특히, 본 발명의 특정 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 HLA 대립유전자 조작을 위한 구축물, 시스템 및 벡터를 포함한다.
많은 유전자 편집 시스템이 이용 가능하고 적합하며 해당 분야에서 잘 특성화되어 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 변형될 HLA 대립유전자를 보완하는 DNA 표적화 폴리뉴클레오티드 및 CRISPR 관련 뉴클레아제(예: Cas9)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템이 제공된다. RNA 치료를 위한 관련 CRISPR-Cas9 시스템은 WO2019200635로 공개된 PCT/US2018/029302에 개시되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
다른 구현예에서, 예를 들어 CasX, Cas12a, Cas13 또는 MAD7을 포함하는 CRISPR 시스템은 예를 들어 WO/2020/023529로 공개된 PCT/US2019/043066, WO/2018/195545로 공개된 PCT/US2018/028919 등에서와 같이 HSC HLA 대립유전자 조작을 위해 제공된다. 특정 CRISPR 시스템은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 특이성을 기반으로 선택될 수 있어 거의 모든 게놈 서열의 표적화, 표적 선택성, 인간 HSC의 효율성 및 기타 고려 사항을 허용한다. 대안적인 구현예에서, TAL 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 Nucleic Acid Res. 2011 Sep. 1; 39 (17):7879에 개시된 바와 같이 HLA 대립유전자 조작을 위해 사용된다.
추가 구현예에서, HLA 대립유전자 조작은 효소적으로 불활성인 dCas9 기반 융합 단백질과 같은 융합 단백질을 사용하여 수행된다. 이러한 시스템은 CRISPR과 관련된 프로그래밍 가능한 DNA 표적화 기능과 다른 유전자 공학 플랫폼의 추가 표적 선택성 및/또는 기능적 기능을 결합한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 HLA 대립유전자 조작은 PCT/US2015/036226에 설명된 대로 Cas-CLOVER 융합을 포함하는 시스템을 사용하여 수행된다.
특정 구현예를 포함한 추가 구현예에서, HLA 대립유전자 조작은 핵염기 편집 시스템을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 특정 구현예는 HLA-대립유전자 표적화 폴리뉴클레오티드, 그리고 dCas9 및 데아미나제(deaminase)와 같은 핵염기 편집 효소를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 구현예는 DNA 이중 가닥 파손 및 복구를 초래하거나 요구하지 않고 표적 HLA 대립유전자 코돈에서 암호화된 아미노산을 변경하기에 충분한 특정 점 돌연변이를 생성하는 것이 유리하다.
CRISPR-Cas 시스템 및 이에 대한 벡터의 설계 원리는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원의 맥락에서는 본질적으로 조작될 HLA 대립유전자 부분에 상보적인 서열의 선택만이 필요하다. 설명된 예시를 포함하여 CRISPR-Cas 융합 기반 시스템에 대해서도 마찬가지이다. TALEN 및 아연 핑거와 같은 단백질 기반 DNA 표적화를 포함하는 유전 공학 플랫폼의 생산 또한 잘 특성화되어 있으며, 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 이러한 시스템은 단지 통상적인 절차 및 실험만으로 생성될 수 있다.
추가적인 및 대안적 실시양태에서, HLA 대립유전자 공학 시스템은 상동성 복구 템플릿(homologous repair template)을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, MHC 유전자좌 내의 감수성 HLA 대립유전자에 대한 전체 유전자를 절제하고 조작된 HLA 대립유전자로 대체할 수 있다. 여러 실시예에서, 감수성 HLA 대립유전자를 암호화하는 유전자는 조작된 HLA 대립유전자의 삽입에 의해 파괴될 수 있으며, 이는 조작된 HLA 대립유전자의 cDNA 서열을 갖는 중단되지 않은 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 HLA 대립유전자 조작 및 그에 따른 시스템은 또한 예를 들어 개시된 HLA 대립유전자 조작 구축물의 발현을 위한 레트로바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함할 수 있다. 따라서 일시적인 형질감염 기술과 시스템도 적용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 특정 HLA 대립유전자 조작 구축물 또는 시스템에 의해 또는 이에 제한되지 않는다. 일부 특정 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 하기 표에 따른 HLA 대립유전자 조작이 제공된다.
표
조작된 조혈 세포
자가 면역 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 다양한 시스템을 사용하여 조작될 수 있으며, 예를 들어 세포는 조작된 HLA 유전자 및 게놈 편집이 가능한 다양한 바이러스 벡터 및/또는 뉴클레아제를 갖는 분자를 운반하고 발현하도록 조작될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 다양한 프로토콜은 조작된 세포의 게놈을 스크리닝하여 바이러스 삽입, DNA 이중 가닥 절단(DSB) 또는 기타 잠재적인 돌연변이 유발 사건의 빈도 및/또는 위치를 평가할 수 있도록 할 수 있다. (Li H, Haurigot V, Doyon Y, et al. 생체 내 게놈 편집은 혈우병 마우스 모델에서 지혈을 복원한다. Nature. 475(7355):217-21, 2011). 많은 구현예에서, 시스템은 조작된 HLA 대립유전자를 동일한 유전자좌에 삽입하는 것뿐만 아니라 감수성 HLA 대립유전자의 발현을 제거 및/또는 예방하는데 유용할 수 있다. 여러 구현예에서, 조작된 HLA 대립유전자는 cDNA 서열로부터 발현된다. 감수성 HLA 대립유전자 및 조작된 HLA 대립유전자의 특정 특정 cDNA 서열은 도 30 및 서열번호 59-96에 제공된다.
임상 결과에 영향을 미치는 데 필요한 치료 관련 수준의 유전자 변형 조혈 줄기 세포는 생체 외에서 대규모 세포 집단을 확장하고 환자에게 재도입함으로써 보다 쉽게 달성될 수 있다.
정의
다음 용어와 구절에는 아래에 개시된 의미가 포함된다. 개시된 정의는 특정 실시양태를 설명하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 청구된 조성물, 방법, 화합물, 시스템 및 치료법을 제한하려는 의도는 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 내용이 속하는 기술 분야의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 해당 분야의 용어 사용과 본원에 개시된 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우, 명세서에 개시된 정의가 우선한다.
"약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오류를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이내를 의미한다. 용어 "약" 또는 "대략"이 일련의 2개 이상의 수치 값에서 첫 번째 수치 앞에 올 때마다, 용어 "약" 또는 "대략"이 해당 일련의 수치 값 각각에 적용되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "아미노산 동일성", "잔기 동일성", "동일성" 등은 주어진 위치에서 폴리펩티드 백본 상의 작용기(R 기)의 구조를 지칭한다. 자연 발생 아미노산 ID는 다음과 같다(이름/3문자 코드/1문자 코드): 알라닌/ala/A; 아르기닌/arg/R; 아스파라긴/asn/N; 아스파르트산/asp/D; 시스테인/cys/C; 글루타민/gln/Q; 글루탐산/glu/E; 글리신/gly/G; 히스티딘/his/H; 이소류신/ile/I; 류신/leu/L; 리신/lys/K; 메티오닌/met/M; 페닐알라닌/phe/F; 프롤린/pro/P; 세린/ser/S; 트레오닌/thr/T; 트립토판/trp/W; 티로신/tyr/Y; 및 발린/val/V. HLA 분자 상의 위치를 지정하기 위해 본원에서 사용된 아미노산 위치는 웹사이트 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla에 제공된 성숙한 단백질 서열을 참조한다. 따라서 예를 들어 DRB1*04:01K71E는 DRB1 대립유전자 *04:01의 성숙 단백질의 71번 위치를 의미하고, 여기서 천연 동일성은 리신 K이고, 비천연 편집 동일성은 글루탐산 E이다.
"자가면역 질환, 장애 또는 상태"는 면역체계가 내인성 항원에 대한 면역 반응(예: B 세포 또는 T 세포 반응)을 생성하여 하나 이상의 조직을 손상시키는 질환, 장애 또는 상태를 의미한다. 이러한 질환에는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 셀리악병(celiac disease), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 수초희소돌기아교세포 당단백질 항체 장애(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody disorders, MOGAD), 근무력증 증후군(myasthenic syndromes), 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 증후군(Behet's syndrome), 버드샷 포도막염(Birdshot uveitis), 기면증(narcolepsy), 기면증 1형(narcolepsy type 1, NT1; 이전에는 탈력발작을 동반한 기면증(narcolepsy with cataplexy)으로 불림), 가와사키병(Kawasaki disease), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 피부근염(dermatomyositis, DM), 애디슨병(Addison's disease), 과민성대장증후군(irritable-bowl syndrome, IBS), 그레이브스병(Graves' disease), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schnlein purpura, HSP), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발근염(polymyositis, PM), 신생물부신경증후군(paraneoplastic neurological syndromes, PNS), 자가면역뇌염(autoimmune encephalitis), 루푸스신염(lupus nephritis, LN), 중증근육무력증(myasthenia gravis, MG), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 이식 거부반응(graft rejection), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 원치 않는 지연형 과민반응(unwanted delayed-type hypersensitivity reaction), T세포 매개성 폐질환(T-cell mediated pulmonary disease), 신경염(neuritis), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 자가면역 갑상선 질환(autoimmune thyroid diseases), 천식(asthma), 자가면역 포도막염(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "질환", "장애" 및 "상태"는 상호교환 가능하다.
"HLA" 또는 "인간 백혈구 항원"은 면역체계 조절을 담당하는 세포 표면의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질을 암호화하는 인간 유전자를 의미한다. "HLA-I" 또는 "HLA 클래스 I"은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 및 2-마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 인간 MHC 클래스 I 유전자를 의미한다. "HLA-II" 또는 "HLA 클래스 II"는 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA1, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DM, HLA-DOA 및 HLA-DOB 유전자좌를 포함하는 인간 MHC 클래스 II 유전자를 의미한다.
"정맥내" 투여는 약물 또는 치료법, 예를 들어 본 발명의 조작된 HSC 중 하나 이상을 환자의 정맥 내로 투여 (예를 들어 치료 목적 주입 (정맥으로의 느린 치료적 주입)을 통해) 하는 것을 의미한다. "주입"은 치료 목적으로 약물, 치료법 및/또는 용액을 정맥을 통해 환자의 신체에 도입하는 것을 의미한다. 일반적으로 이는 정맥주사(IV) 백(bag)을 통해 수행될 수 있다.
"정맥주사 백" 또는 "IV 백"은 환자의 정맥을 통해 투여할 수 있는 용액을 담을 수 있는 백이다. 한 실시양태에서, 용액은 식염수 용액(예를 들어 약 0.9% 또는 약 0.45% NaCl), 또는 본 발명의 조작된 HSC의 투여를 위한 임의의 치료적으로 유용한 용액일 수 있다.
"공동투여(co-administering)"는 2개 이상의 약물을 순차적으로(즉, 차례로) 주입하는 것이 아니라 동일한 투여 동안 2개(또는 그 이상)의 약물을 정맥내 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로, 공동 투여에는 두 가지(또는 그 이상의) 약물을 동일한 IV 백에 결합하거나, 공동 투여하기 전에 첫 번째 약물을 포함하는 IV 백에 두 번째 약물을 추가하는 것이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "완화"는 본 발명에 따른 하나 이상의 치료제, 약물 및/또는 조성물을 이러한 환자 또는 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 고통받는 환자의 질병 상태가 개선 (예: 자가면역질환 증상 개선, 예: 류마티스 관절염 증상 개선)되는 것을 의미한다. 이러한 개선은 환자의 질병 진행이 느려지거나 진행이 중단되고, 증상의 빈도, 기간 및/또는 중증도가 감소하고/또는 질병 증상이 없는 기간의 빈도나 기간의 증가 또는 질병으로 인한 손상이나 장애의 예방으로 볼 수 있다.
"항원"은 동물에 주입 또는 흡수되거나 동물에 의해 변형되는 조성물을 포함하여, 천연, 변형 또는 합성 여부에 관계없이 동물에서 항체 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 물질, 단백질, 펩티드, 핵산, 핵-펩티드 등을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원은 천연 또는 조작된 HLA 분자의 항원 결합 틈 내에서 결합하는 능력에 의해 정의될 수 있다. 일부 측면에서 항원은 특정 체액성 또는 세포성 면역체계의 하나 이상의 산물과 반응할 수 있다. "항원"이라는 용어는 관련된 모든 항원 에피토프와 항원 결정자를 포함한다.
"항원 제시 세포"(APC)는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 결합하여 펩티드를 포함한 항원 화합물을 처리하고 T 세포에 제시할 수 있는 세포를 의미한다. 많은 경우에 APC는 T 세포 활성화에 필요한 공동자극 신호를 전달할 수 있다. 전형적인 APC에는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 흉선 상피 세포 및 혈관 내피 세포가 포함된다.
"항원 결합 영역", "항원 결합 분열", "항원 결합 홈", "항원 분열" 등은 HLA에 의해 제시된 항원과 상호작용하고 이에 결합하는 HLA 분자의 영역을 의미한다. 본 명세서에 포함된, Nguyen, A. et al., "HLA 클래스 I 분자에 대한 포켓 가이드," Biochemical Society Transactions (2021) 49 2319-2331에 개시된 바와 같이, HLA-I 펩티드 결합 틈은 N 및 C 말단에서 닫혀 (펩티드 항원의 길이를 약 8~10개의 아미노산으로 제한) 있는 반면, HLA-II 틈의 끝은 열려 있어 더 긴 펩티드 항원 (예: 아미노산 길이 13개 초과)을 허용한다. 본 명세서에 포함된, K.J. Smith et al., "인간 미엘린 염기성 단백질의 펩티드와 복합체를 형성한 HLA-DR2(DRA*0101, DRB1*1501)의 결정 구조," Vol. 188, No. 8, October 19, 1998, 1511-1520 는 HLA 클래스 II 분자의 결합 틈새 및 포켓 구조를 개시한다. 일반적으로 특정 결합 포켓은 항원 결합 틈 내에 결합된 항원의 특정 구성 요소와 결합한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 갈라진 틈의 '바닥'은 분자의 코어에 가장 가깝고 TCR 경계면에서 가장 먼 틈의 표면일 수 있으며, 갈라진 틈은 일반적으로 바닥에서 TCR 경계면을 향해 위쪽으로 연장되는 측면을 가질 수 있다. 대부분의 실시형태에서, 항원은 펩티드이고 성분은 아미노산이다. HLA 분자의 3차원 구조는 당업자가 참조용으로 이용할 수 있으며(예를 들어 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla) 임의의 HLA 분자에 대한 항원 결합 영역을 식별할 수 있다.
cDNA(상보성 DNA)는 전사를 결정하는 내부 비암호화 세그먼트(인트론)와 조절 서열이 없는 다중 핵산이다. cDNA는 세포에서 추출한 메신저 RNA로부터 역전사를 통해 실험실에서 합성된다.
본원에서 사용된 용어 "투여량" 또는 "용량"은 단일 투여로 치료 효과를 생성하기에 충분한 양을 함유하는 활성 성분 제제의 모든 형태를 의미한다.
"치료적 유효량"이라는 어구는 본 발명의 약물, 조성물, 화합물, 치료법 또는 요법 단독으로 또는 본원에 개시된 (i) 특정 질병, 상태 또는 장애를 치료하거나, (ii) 특정 질병, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화, 개선 또는 제거하거나, 또는 (iii)특정 질병, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 지연시키는 다른 치료법과 조합한 양을 의미한다. 이 용어는 전반적인 치료를 개선하거나, 증상 또는 질병의 원인을 감소 또는 방지하거나, 치료 효능을 향상시키거나 다른 치료제와 상승작용을 일으키는 양을 포괄할 수 있다. 표적화된 자가면역의 경우, 약물, 조성물, 화합물, 치료법 또는 요법의 치료적 유효량은 T 세포와 같은 반응성 또는 활성 면역 세포의 수를 감소시킬 수 있으며; 염증을 감소시키고; 세포, 조직 또는 기관의 면역 기반 공격 또는 분해를 억제(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)하고; 및/또는 자가면역 반응과 관련된 하나 이상의 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화한다.
"면역 반응"은 자극에 대한 B 세포 또는 T 세포와 같은 면역 체계 세포의 반응을 의미한다. 한 실시양태에서, 반응은 특정 항원에 특이적("항원 특이적 반응")이다. 다른 실시예에서, 면역 반응은 T 세포 반응이다.
"자가면역 반응"은 자가항원 또는 자가항원에 대한 면역 반응을 의미한다. 많은 경우 자가면역 반응은 하나 이상의 자가 항원 또는 자가 항원을 인식하는 자가 반응성 T 세포의 결과이다. 면역 체계는 일반적으로 미생물 및 기타 유해한 외부 물질에 대한 보호 면역 반응을 지시하는 기능을 한다. 자가면역 반응에서 환자 자신의 조직에 존재하는 항원은 세포, 조직 또는 기관의 악화, 파괴 또는 기능 장애를 유발하는 자가반응성 면역 반응의 표적이 된다.
"포유동물"이라는 용어는 인간, 생쥐, 쥐, 기니피그, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"환자" 또는 "대상"에는 인간, 소, 말, 양, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 기니피그와 같은 포유동물 또는 동물이 포함된다. 동물은 비영장류 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)와 같은 포유동물일 수 있다. 한 실시양태에서, 환자는 임의의 성별 또는 불특정 성별의 인간 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인과 같은 인간이다.
"약학적으로 허용되는 조성물"은 포유동물 세포의 생존력을 유지하거나 지지하기 위한 유기 또는 무기 용액이다.
본 명세서에 사용된 "예방"은 본 발명에 따른 조성물, 화합물, 치료제 또는 치료법을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 본 명세서에 개시된 질병, 장애 또는 상태의 발생 또는 재발을 방지하는 것을 의미한다.
"재조합"은 환자에게서 일반적으로 발견되거나 발현되지 않는 서열을 갖거나 하나 이상의 핵산 또는 아미노산의 돌연변이와 같은 인공 조작의 결과인 서열을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 인공 조작은 화학적 합성에 의해 수행될 수 있으며, 보다 일반적으로는 유전공학 기술과 같은 분리된 핵산 세그먼트의 편집(삽입, 삭제, 돌연변이 등)에 의해 수행될 수 있다.
아미노산 또는 펩티드 서열 간의 유사성은 두 서열 간의 유사성, 달리 서열 동일성으로 표현된다. 서열 동일성은 흔히 동일성 백분율(펩티드 또는 핵산의 염기에 대한 동일한 잔기의 백분율, 유사성 또는 상동성)로 측정되고; 백분율이 높을수록 두 시퀀스가 더 유사하다. 완전한 동일성은 주어진 서열(예: 50, 100, 150 또는 200개 염기 또는 잔기)에 걸쳐 100% 동일하다.
"특이적으로 결합한다"는 용어는 "항원 특이적인", "~에 특이적", "선택적 결합제", "특이적 결합제", "항원 표적" 또는 항원과 "면역반응성"으로 유사한 서열의 다른 항원보다 더 큰 친화력으로 표적 항원에 결합하는 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 항원이 APC 표면에서 HLA 분자에 특이적으로 결합하는 것이 본원에서 고려된다.
"필요한 피험자", "환자" 또는 "치료가 필요한 사람"에는 이미 질병(즉, 자가면역 질환, 예를 들어 비제한적으로, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 셀리악병(celiac disease), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 수초희소돌기아교세포 당단백질 항체 장애(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody disorders, MOGAD), 근무력증 증후군(myasthenic syndromes), 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 증후군(Behet's syndrome), 버드샷 포도막염(Birdshot uveitis), 기면증(narcolepsy), 기면증 1형(narcolepsy type 1, NT1; 이전에는 탈력발작을 동반한 기면증(narcolepsy with cataplexy)으로 불림), 가와사키병(Kawasaki disease), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 피부근염(dermatomyositis, DM), 애디슨병(Addison's disease), 과민성대장증후군(irritable-bowl syndrome, IBS), 그레이브스병(Graves' disease), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schnlein purpura, HSP), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발근염(polymyositis, PM), 신생물부신경증후군(paraneoplastic neurological syndromes, PNS), 자가면역뇌염(autoimmune encephalitis), 루푸스신염(lupus nephritis, LN), 중증근육무력증(myasthenia gravis, MG), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 이식 거부반응(graft rejection), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 원치 않는 지연형 과민반응(unwanted delayed-type hypersensitivity reaction), T세포 매개성 폐질환(T-cell mediated pulmonary disease), 신경염(neuritis), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 자가면역 갑상선 질환(autoimmune thyroid diseases), 천식(asthma), 자가면역 포도막염(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 악성 빈혈(pernicious anemia))이 있는 사람뿐만 아니라 질병에 걸릴 위험이 있거나 걸리기 쉬운 사람도 포함된다. 이 용어는 또한 본원에 개시된 바와 같이 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 기타 포유동물 대상을 포함한다.
"내성"은 항원에 대한 특정 면역 반응을 일으키는 능력이 감소되거나 부재하는 것을 의미한다. 내성은 종종 본원에 기술된 바와 같이 2개의 도메인 MHC 분자의 존재 하에 항원과의 접촉의 결과로 생성된다. 한 실시양태에서, B 세포 반응은 감소되거나 발생하지 않는다. 다른 구현예에서, T 세포 반응은 감소되거나 발생하지 않는다. 대안적으로, T 세포와 B 세포 반응이 둘 다 감소되거나 발생하지 않을 수 있다.
용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 개시된 면역 장애 및 질병과 관련된 임상 증상, 사건, 질병 또는 병태의 발현 또는 진행을 일시적으로든 영구적으로든, 부분적으로든 완전히든 제거, 감소, 억제 또는 개선하는 것을 의미한다. 관련 분야에서 알려진 바와 같이, 치료법으로 사용되는 방법 및 조성물은 주어진 질병 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만 유용한 것으로 간주되기 위해 질병의 모든 징후를 없앨 필요는 없다. 마찬가지로, 예방적으로 투여된 치료법은 실행 가능한 예방 방법 또는 제제를 구성하기 위해 질병 상태의 발병을 예방하는 데 완전히 효과적일 필요는 없다. 단순히 질병의 영향을 줄이는 것 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 염증, T 세포 활성화 등을 감소시키고/시키거나 관련 증상의 수 또는 중증도를 감소시키거나, 또 다른 치료의 효과를 증가시키거나, 또 다른 유익한 효과를 생성함으로써), 또는 대상에서 질병이 발생하거나 악화될 가능성을 줄이는 것만으로도 충분하다. 본 발명의 한 실시양태는 기존 질환에 대한 지속적인 개선을 유도하거나 또는 특정 장애의 중증도를 반영하는 기준 지표로 환자에게 치료학적 치료제를 충분한 양, 지속 기간 및 반복으로 투여하는 것을 포함하는 치료 효능을 결정하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노와 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 크기나 기능에 관계없이 변형된 아미노산(예: 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는 아미노산의 중합체를 의미한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상대적으로 큰 폴리펩티드와 관련하여 종종 사용되는 반면, "펩티드"라는 용어는 작은 폴리펩티드와 관련하여 종종 사용되지만, 당해 분야에서 이들 용어의 사용은 중복된다. "단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 유전자 산물 및 이의 단편을 언급할 때 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질에는 유전자 산물, 자연 발생 단백질, 상동체(homologs), 오르토로그(orthologs), 파라로그(paralogs), 단편 및 전술한 것의 기타 등가물, 변이체, 단편 및 유사체가 포함된다.
HLA 분자 내의 아미노산을 치환하여 조작된 HLA 분자를 생성할 수 있다. 아미노산(aa 또는 a.a.) 잔기는 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체될 수 있다. 즉 '보존적 치환'이다. - 예를 들어, 하나의 지방족 잔기를 다른 것으로 치환(예: 서로 Ile, Val, Leu 또는 Ala)하거나, 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환(예: Lys와 Arg, Glu와 Asp, 또는 Gln과 Asn 사이). 예를 들어 크기, 전하, 극성, 소수성, 사슬 강성/배향 등에 기초한 다른 보존적 치환은 단백질 공학 분야에 잘 알려져 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 원하는 활성, 예를 들어, 천연 또는 참조 폴리펩티드의 결합, 특이성 및/또는 기능이 달성된다.
아미노산은 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) 비극성: Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M); (2) 비전하 극성: Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(N), Gln(Q); (3) 산성: Asp(D), Glu(E); (4) 염기성: Lys(K), Arg(R), His(H). 대안적으로, 자연적으로 발생하는 잔기는 공통 측쇄 특성에 따라 분류할 수 있다: (1) 소수성: 류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 대체(Non-conservative substitution)는 이러한 그룹 중 하나를 다른 그룹으로 교환하는 것을 수반한다. 특정한 보존적 대체에는 예를 들어 다음이 포함된다: Ala를 Gly 또는 Ser로; Arg를 Lys로; Asn를 Gln 또는 His로; Asp를 Glu로; Cys를 Ser로; Gln를 Asn로; Glu를 Asp로; Gly를 Ala 또는Pro로; His를 Asn 또는Gln로; Ile를 Leu 또는Val로; Leu를 Ile 또는Val로; Lys를 Arg, Gln 또는Glu로; Met를 Leu, Tyr 또는Ile로; Phe를 Met, Leu 또는Tyr로; Ser를 Thr로; Thr를 Ser로; Trp를 Tyr로; Tyr를 Trp로; 및/또는 Phe를 Val, Ile 또는Leu로.
"T세포"는 흉선에서 성숙된 면역세포를 말한다. 활성화된 T 세포는 G0을 떠나 DNA를 합성하고, CD25를 상향 조절하고/하거나 CD를 상향 조절하는 T 세포이다.
본원에 사용된 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 APC 상의 HLA 분자를 인식/상호작용하는 T 세포 상의 세포 표면 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "T 세포 수용체:HLA 결합 인터페이스", "T 세포 수용체 결합 인터페이스", "TCR:HLA 결합 인터페이스", "TCR:HLA 인터페이스"는 TCR:HLA 결합 중에 TCR의 표면과 HLA 분자의 표면이 근접해 있는 것을 의미하며, 대부분의 경우, TCR:HLA 결합 인터페이스에는 TCR과 직접 접촉하지 않는 HLA의 항원 결합 틈 내의 아미노산이 포함되지 않는다.
본원에 사용된 "변이체"는 천연 또는 참조 구성원과 실질적으로 상동성이지만, 하나 또는 복수의 결실, 삽입, 치환, 분자, 발현 수준 등으로 인해 천연 또는 참조 구성원의 구성원과 다른 폴리펩티드, 핵산, 유전자, 서열 또는 분자를 의미한다. 변이체 폴리펩티드 암호화 DNA 서열은 천연 또는 참조 DNA 서열과 비교할 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 삭제 또는 치환을 포함하지만 변이체 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 다양한 클로닝, PCR 기반 부위 특이적 돌연변이 유발 및 게놈 편집 접근법이 해당 분야에 알려져 있으며, 당업자가 적용할 수 있다.
변이체 HLA 유전자 및 분자에는 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스(웹사이트 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla, "IPD 데이터베이스")에 나열된 자연 발생 변이체가 포함된다. 예를 들어, HLA-A 변종에는 IPD 데이터베이스에 나열된 *01부터 *80까지의 모든 HLA-A 대립유전자가 포함된다.
변이체 아미노산 또는 핵산 서열은 천연 또는 참조 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상 동일할 수 있다. 천연 서열과 변이체 서열 사이의 상동성 정도(동일성 백분율)는 예를 들어 월드 와이드 웹에서 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 무료로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램 (예: 기본 설정의 BLASTp 또는 BLASTn)을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
천연 아미노산 서열의 변경은 당업자에게 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 천연 서열의 단편에 결찰을 가능하게 하는 제한 부위가 측면에 있는 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 돌연변이가 도입될 수 있다. 결찰 후, 생성된 재구성된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유사체를 암호화한다. 대안적으로, 필요한 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공하기 위해 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이 유발 절차가 사용될 수 있다. 이러한 변경을 수행하는 기술은 당업자에게 매우 잘 확립되고 이해되어 있다.
"핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이들의 유사체의 단위를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성 이중 가닥 DNA의 한 핵산 가닥일 수 있다. 대안적으로, 이는 임의의 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일 가닥 핵산일 수 있다. 한 측면에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 또 다른 측면에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA에는 예를 들어 게놈 DNA, cDNA 또는 벡터 DNA가 포함될 수 있다. 적합한 RNA는 예를 들어 mRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "발현"은 적용 가능한 경우 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 접힘, 변형 및 처리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 RNA 및 단백질의 생산, 표시(예: 세포 표면/외막에) 또는 분비에 관여하는 세포 과정을 의미한다. 발현은 핵산 단편 또는 단편들로부터 유래된 센스(예를 들어 mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적인 축적 및/또는 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 의미할 수 있다.
"벡터"는 일반적으로 유전자 조작 방법을 사용하여 공유적으로 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 간단히 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 벡터 중에서 가장 일반적으로 사용되는 형태인 플라스미드이므로 혼용하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 '엔지니어링'이란 인간의 개입에 의해 조작된 측면을 의미할 수 있다. 본 명세서에서는 조작된 세포, HSC, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 분자, HLA 단백질, 핵산, 유전자 등이 개시된다. 일 실시예에서, HLA 단백질은 폴리펩티드의 적어도 하나의 측면, 예를 들어, 그 서열이 환자/피험자 또는 자연에 존재하는 측면과 다르게 인간의 개입에 의해 (직접 또는 간접적으로) 의도적으로 조작된 경우 "조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관행이고 당업자가 이해하는 바와 같이, 조작된 세포의 자손은 실제 조작이 이전 개체에 대해 수행되었음에도 불구하고 일반적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다. 대조적으로, 본원에 사용된 "천연" 또는 "야생형"은 조작되지 않은 및/또는 변형되지 않은 세포, 유전자, 단백질, 핵산, 핵산 서열, 대립유전자 및 아미노산 서열, 및 이들의 부분을 의미한다.
약어: ACR, 미국 류마티스학회; ADA, 항약물 항체; AE, 이상반응; ANC, 절대 호중구 수; APC, 항원 제시 세포; AUC, 농도-시간 곡선 아래 면적; DMARD, 질병 완화 항류마티스 약물; CBC, 전체 혈구 수; cGCP, 현행 우수임상관리기준; CD, 분화 클러스터; CMP, 완전 대사 패널; cGMP, 현재 우수제조관리기준; cGTP, 현행 우수 조직 관리 기준; DC, 수지상 세포; DM, 피부근염; DMSO, 디메틸 설폭사이드; DRB1*04:01, HLA의 HLA DR 베타 1 체인, 04:01 대립유전자; E, 글루탐산; EBMT, 유럽 골수 이식 등록소; G-CSF, 과립구 집락 자극 인자; GVHD, 이식편대숙주병; GWAS, 게놈 전체 연관 연구; HLA, 인간 백혈구 항원; HLA-DRB1, 인간 백혈구 항원 - DR 베타 1; HSA, 인간 혈청 알부민; HSC, 조혈줄기세포; HSP, 헤노흐-쇤라인 자반병; IBS, 과민성대장증후군; IL, 인터루킨; IV, 정맥내; K, 라이신; LN, 루푸스 신염; MG, 중증근육무력증; MHC II, 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(인간의 HLA); MOGAD, 미엘린 희돌기아교세포 당단백질 항체 장애; MS, 다발성 경화증; MTX, 메토트렉세이트; NIS, 국립 입원환자 샘플 데이터세트; NMO, 시신경척수염; NSAID, 비스테로이드성 항염증제; NT1, 기면증 1형; PNS, 부신생물성 신경증후군; PM, 다발성 근염; RA, 류마티스 관절염; SC, 피하; SAE, 심각한 부작용; SLE, 전신홍반루푸스; TCR, T 세포 수용체; TNF, 종양 괴사 인자.
본 명세서에 사용된 "감수성 HLA 대립유전자", "감수성 대립유전자" 등은 주어진 집단에서 하나 이상의 자가면역 질환에 대한 감수성과 연관된 주어진 HLA 대립유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 "저항성 HLA 대립유전자", "저항성 대립유전자" 등은 주어진 집단에서 하나 이상의 자가면역 질환에 대한 저항성과 연관된 주어진 HLA 대립유전자를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "게놈"은 암호화(즉, 유전자) 및 비암호화 데옥시리보핵산(DNA)을 모두 포함하는 유기체의 모든 유전 정보를 의미한다. "게놈 서열"은 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열이다. 본 명세서에 사용된 "천연 게놈"은 본 명세서에 기술된 임의의 변형 또는 조작 전의 대상 또는 환자와 같은 개체의 원래 게놈 서열을 지칭한다.
유사한 주제를 지칭하는 특정 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자의 특정 대립유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질에 대한 언급은 HLA 대립유전자에 대한 언급으로 식별될 수 있다. 유사하게, HLA 대립유전자의 특정 코돈은 이에 의해 암호화된 아미노산을 참조하여 식별될 수 있다. 예를 들어, HLA 대립유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질의 아미노산 서열의 특정 위치는 HLA 대립유전자의 상응하는 위치를 참조하여 식별할 수 있으며 그 반대도 마찬가지이다.
실시예
실시예 1- 재료 및 방법
세포주
간략하게, cDNA 발현 구성체는 해당 대립유전자를 발현하는 세포로부터 직접 관심 대립유전자를 클로닝하거나 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)로부터 'gBlock' 서열 (IPD-IMGT/HLA 데이터베이스 시퀀스 기반, 웹사이트 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/에서 이용 가능)을 얻음으로써 얻어졌다. RE 부위를 갖는 다양한 gBlock 서열이 도 30에 개시되어 있다. 테스트를 위해, 레트로바이러스 형질도입 및 발현을 위해 cDNA를 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 플라스미드에 클로닝하였다. 앞서 설명한 대로(Bowerman et 2011) GFP+MSCV 플라스미드로 Phoenix 293T 세포를 일시적으로 형질감염시켜 다양한 대립유전자를 레트로바이러스로 개별적으로 포장하였다. HLA 클래스 II 단백질은 인간 클래스 II 음성 T2 세포주(T2 Parent)에서 발현되었다. 아래에는 클래스 II 발현이 설명되어 있다.
DRB1*03:01, DRB3*02:02, DQA1*05:01, DQB1*02:01, DQA1*03:01, DQB1*03:02, DRB1*15:01, DQA1*01:02 또는 DQB1*06:02을 발현하는 개체로부터 RNA를 분리하고 각 개체의 HLA-DR, DQA1 또는 DQB1 대립유전자에 대한 상보적인 DNA(cDNA)를 만들었다. HLA-DRB1*04:01, DRB3*03:01, DRB4*01:03 및 DRB5*01:01 T 2 세포주는 이전에 만들어졌다(Anderson et al. 2016). DRB1*11:03, DRB3*01:01, DQA1*05:05 및 DQB1*03:01에 대한 cDNA 서열은 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스(웹사이트 ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)에서 얻었고 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)에서 gBlocks로 얻었다. 인간 클래스 II 음성 T2 세포주(T2 Parent)의 레트로바이러스 형질도입을 위해 cDNA를 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 플라스미드에 클로닝했다. HLA-DRB1, -DRB3, -DQA1 및 -DQB1 대립유전자는 앞서 설명한 대로 Phoenix 293T 세포를 GFP+MSCV 플라스미드로 일시적 형질감염시켜 레트로바이러스로 개별적으로 포장하였다(Bowerman et 2011). HLA-DRB1 및 -DRB3 대립유전자의 경우, 상등액의 레트로바이러스를 사용하여 DRA1*01:01을 발현하는 1 x 105 T2 세포를 형질도입하고 형질도입 후 7일 동안 HLA-DR+/GFP+의 높은 발현을 위해 분류하였다 (항-DR-APC(LN3) Invitrogen Cat#17-9956-42). -DQ 대립유전자의 경우, HLA-DQB1 대립유전자의 레트로바이러스를 사용하여 1 x 105 HLA 클래스 II 음성 T2 세포를 형질도입하고 형질도입 후 7일 동안 높은 GFP+ 발현을 위해 분류하였다. 그런 다음, cis 및 trans 이량체에 해당하는 HLA-DQA1 대립유전자에 대한 레트로바이러스를 사용하여 1 x 105 DQB1+ T2 세포를 형질도입하고 형질도입 후 7일 동안 높은 HLA-DQ+/GFP+ 발현을 위해 분류하였다 (항-인간 HLA-DP/DQ/DR Starbright Blue(WR18) 700 BioRad Cat# MCA477SBB700). 분류 후, 각 세포주에서 RNA를 분리하여 Sanger 시퀀싱(Quintara Biosciences)을 통해 cis 및 trans HLA 대립유전자 모두에 대한 HLA 서열을 확인하였다. 모든 세포주는 피루브산 나트륨, 티오-페니실린/스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 IMDM-GlutaMAX(Life Technologies)에서 성장시켰다.
펩티드 결합 분석을 위한 펩티드 설계 및 합성
하이브리드 인슐린 펩티드 HIP1-WE14 (GQVELGGWSKMDQLA), HIP6-IAPP2 (GQVELGGGNAVEVLK), HIP8-NPY (GQVELGGGSSPETLI) 및HIP11-C 펩티드 (SLQPLALEAEDLQV)는 Genscript (Piscataway, NJ)에 의한 트리플루오로아세트산(TFA) 제거를 통해 >98% 순도로 N 말단에 비오티닐화 PEG3 링커로 합성되었다 (Delong 2016, Baker2019). 본 연구에 사용된 HIP는 이용 가능한 T 세포 클론을 자극하는 능력 때문에 선택되었다(표 1). 비오티닐화 GAD65265-281 (AMMIARFKMFPEVKEKG), 인슐린 유사체 (HLVEELYLVAGEEG) 및 인플루엔자 A (PKYVKQNTLKLAT) 펩티드도 HLA-DR 및 DQ 결합에 대한 대조군으로 합성되었다 [S. Dai, at doi.org/10.1073/pnas.1716527115]. HIP6를 제외한 모든 펩티드를 DMSO(디메틸 설폭사이드), 물과 같은 비율로 재구성(reconstitute)하고 마지막으로 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) (Life Technologies)를 400μM 농도로 재구성하고 펩티드 결합 및 T 세포 연구에 사용할 때까지 -20℃에서 냉동 보관하였다. HIP6을 3% 암모니아수에서 재구성한 다음 물과 같은 비율로, 75uL의 1M HCL로 재구성하여 중성 pH를 복원하고 마지막으로 DPBS를 400μM로 복원하였다.
T2 세포 펩티드 결합을 발현하는 환자 특이적 HLA-클래스 II
Pt3977의 HLA-클래스 -DR 및 -DQ 유전자형을 발현하는 T2 세포주를 수확하고, 재현탁하고, 100μM HIP1로 플레이팅하고, 앞서 언급한 대로 밤새 배양하였다. 플레이트를 DPBS로 두 번 세척하여 결합되지 않은 펩티드를 제거한 다음 1:1000 희석된 eBioscience?? Fixable Viability Dye eFluor?? 780 100μL에 4℃에서 30분 동안 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 이전과 같이 처리하고 염색하였다. Canto II 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 데이터를 수집하고 FlowJo 버전 X(Tree Star)로 분석하였다. 3개의 독립적인 실험에 대한 평균 결합 비율(HLA 클래스 II + T2 세포의 MFI/MFI T2 모 HLA 클래스 II -) ± SEM은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.1을 사용하여 결정되었다.
T 세포 자극 분석을 위한 펩티드 합성
하이브리드 인슐린 펩티드 HIP1(GQVELGGWSKMDQLA) 및 HIP11(SLQPLALEAEDLQV)은 Genscript (Piscataway, NJ)에 의한 트리플루오로아세트산(TFA) 제거를 통해 >98% 순도로 합성되었다 [Baker et al. 2019]. 펩티드를 DMSO에서 최종 농도 10,000μM으로 재구성하였다. 자극 분석을 위해 펩티드를 100μM의 작업 농도에 대해 1:100으로 희석하였다.
저항성 및 감수성 HLA 클래스 II 발현 T2 세포 펩티드 결합
펩티드 결합 분석은 앞서 설명된 대로 수행되었다(Anderson et al. 2016, Roark et al. 2016). 간략하게, T1D 내성 및 감수성 HLA-DR 및 -DQ 대립유전자를 발현하는 T2 세포주를 수확하고 배지(IMDM-GlutaMAX, 10% FBS, 티오펜/스트렙 및 피루브산나트륨)에 4x106 세포/mL로 재현탁시켰다. 96웰 둥근 바닥 플레이트에 재현탁된 세포, 100μM 비오티닐화 스톡 펩티드 및 DPBS를 결합하였다. 음성 대조군 웰에는 DPBS만 있는 재현탁된 세포가 포함되었다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 DPBS로 2회 세척하여 결합되지 않은 펩티드를 제거한 후 1X Zombie Aqua(Biolegend Zombie AquaTM Fixable Viability Kit cat# 423102)에 실온에서 15분 동안 재현탁시켰다. 세포 표면에서 펩티드가 손실되는 것을 방지하기 위해 DPBS 내 1% 포름알데히드에 세포를 5분 동안 가볍게 고정시켰다. 펩티드 결합을 검출하기 위해 1X PE 표지 스트렙타비딘(One Lambda LT-SA-PE)을 4℃에서 30분간 첨가하였다. Canto II 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 획득하기 전에 세포를 다시 고정하였다. 데이터는 FlowJo 버전 X(Tree Star)로 분석되었으며 3개의 독립적인 실험에 대한 평균 결합 비율 (HLA 클래스 II의 MFI + T2 세포/MFI T2 모 HLA 클래스 II -) ± SEM은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.1(Graph Pad)을 사용하여 결정되었다.
HIP11 적정을 위해 T2 모, HLA-DQ2 및 -DQ2 트랜스를 앞서 언급한 대로 수확하고 재현탁하였다. 그런 다음 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 펩티드의 최종 농도가 5μM, 10μM, 20μM 및 50μM인 것을 제외하고 이전과 동일하게 반응을 설정하였다. 세포를 밤새 배양하고 DPBS로 2회 세척하였다. 세포를 1:1000으로 희석된 100μL의 eBioscienceTM Fixable Viability Dye eFluorTM 780(cat# 65-0865-18)에 4℃에서 30분간 재현탁하였다. 그런 다음 앞서 언급한 대로 세포를 처리하고 염색하고 분석하였다.
T 세포 자극 분석
T 세포는 앞서 설명한 대로 복제되고 확장되었다(Baker 2019). HIP11의 경우, T2 세포주 또는 자가 EBV 형질전환 B 세포주(EBV3537)를 발현하는 HLA-DQ2 및 -DQ2 트랜스를 언로드하거나 다양한 농도의 HIP11(5μM, 10μM, 20μM 및 50μM)을 미리 로드하였다. 선택된 농도의 항원을 세포와 함께 37??에서 1시간 동안 배양하여 항원 제시 세포를 미리 로드하였다. 그런 다음, HLA 대립유전자에 의해 결합되고 제시된 항원만이 T 세포 클론을 자극할 수 있는지 확인하기 위해 DPBS로 세척하여 과잉 항원을 제거하였다. 그런 다음, 1x105의 CD4+ T 세포 클론(E2)을 5x104의 항원 제시 세포주와 밤새 배양한 후 생존성 염료(eBioscienceTM Fixable Viability Dye eFluorTM 780)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 세포를 세척한 후 항-CD4-PE(Biolegend PE 항-인간 CD4 항체 카탈로그 번호 317410) 및 항-CD25-BV421(BD Biosciences BV421 마우스 항-인간 CD25 카탈로그 번호 562443)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척한 다음 고정한 후 Canto II 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 획득하였다. 데이터는 FlowJo Version X(Tree Star)로 분석되었다. GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.1을 사용하여 3개의 독립적인 실험의 평균 CD25 MFI ± SEM을 계산하였다.
HIP1의 경우, 1x105의 CD4+ T 세포 클론(D11)을 항원의 부재 또는 존재 하에 5x104의 환자 특이적 HLA-클래스 II T2 세포주 또는 자가 EBV-형질전환 B-세포주(EBV 3977)와 함께 배양하였다. HLA-클래스 II T2 세포주와 EBV 세포주는 앞서 언급한 대로 20μM의 농도로 사전 로드되었다. 세포를 밤새 함께 배양하고 위에서 언급한 대로 처리하고 분석하였다.
실시예 2 - 인간화 DRB1*04:01 K71E 형질전환 쥐는 콜라겐 감작(sensitization)에 저항성을 갖는다.
콜라겐 유발 관절염(CIA)은 MHC II 분자 및 콜라겐 특이적 T 세포 반응의 중요한 역할을 포함하여 RA의 주요 특징을 요약하는 자가면역 관절염의 잘 확립된 마우스 모델이다. CFA(Complete Freund's Adjuvant)에 유화된 이종 II형 콜라겐 단백질을 주입한 HLA-DR4 형질전환 마우스는 CIA 발달에 필요한 필수 첫 번째 단계인 강력한 콜라겐 특이적 CD4+ T 세포 반응(콜라겐 감작)을 나타낸다.
DRB1*04:01-K71E 유전자 편집이 생체 내 콜라겐 감작을 예방하기에 충분한지 확인하기 위해 H-2 클래스 II 녹아웃 배경의 키메라 HLA-DR4/I-Ed 형질전환 마우스를 사용하였다. 도 2 상단은 키메라 MHC II 분자의 원위/인간 DRα1 및 DRβ도메인이 펩티드 결합 및 마우스 T 세포 수용체(mTCR)와의 상호작용을 중재하는 반면, 근위 쥐 I-Edα2 및 I-Edα2 도메인은 마우스 CD4 공동 자극 분자와의 상호작용을 중재하는 것을 보여주는 다이어그램을 나타낸다. 3개의 형질전환 계통이 이 실험에 사용되었습니다. 하나는 DRB1*04:01 유전자를 보유하고 하나는 DRB1*01:01 유전자를 보유하고(예를 들어, J. Exp. Med., Vol. 180, 1994, pp. 173-18 및 J. of Exp. Med., Vol. 185, No. 6, 1997, p. 1113-1122, 둘 다 그 전체가 참조로 포함된다), 다른 하나는 DRB1*04:01K71E 유전자를 보유한다(참고로 포함된 PLOS ONE, Vol. 8, 12, 2013, e84908의 방법을 기반으로 함). 세 가지 계통 모두 0일과 21일에 CFA에 유화된 가용성 II형 콜라겐 단백질로 면역화되었다. 56일째에, 마우스를 희생시키고, 림프절을 수확하고, 증식하는 세포의 DNA에 통합되는 티미딘 뉴클레오시드 유사체 5-에티닐-2'-데옥시유리딘(EdU)의 존재 하에 콜라겐258-272 펩티드와 함께(Pep) 배양하거나 배지 단독(No Pep)에서 배양하였다.
형광 아지드 및 Cu(I)-촉매된 [3 + 2] 고리화 첨가 "클릭" 화학을 사용하여 증식하는 세포에서 EdU 혼입을 검출하였다. 세포는 또한 CD3 및 CD4에 대한 형광 항체로 공동 염색되었다. 콜라겐258-272에 반응하여 생체 외에서 증식된 CD4+ T 세포의 빈도를 사용하여 감작을 정량화하였다. 도 2 하단에 표시된 것처럼, DRB1*04:01 마우스는 콜라겐258-272 특이적 CD4+ T 세포 반응을 나타낸 반면, DRB1*01:01 형질전환 쥐의 CD4+ T 세포는 DRB1*04:01에 비해 콜라겐258-272에 결합하는 능력이 감소하고 RA와의 연관성이 약한 것에 비례하여 약한 증식 반응을 나타냈다. 대조적으로, DRB1*04:01K71E 형질전환 마우스의 CD4+ T 세포에서는 증식 반응이 없었다. 이는 민감한 마우스에서 DRB1*04:01K71E의 발현이 마우스가 콜라겐에 민감해지는 것을 방지한다는 것을 입증하였다.
실시예 3 - DRB1*04:01 K71E 피부 이식은 DRB1*04:01 마우스에서 안정적인 생착을 달성한다.
K71E 편집이 DRB1*04:01 수용자에서 동종반응성을 유도하지 않는지 확인하기 위해 DRB1*01:01 및 DRB1*04:01K71E 마우스에서 DRB1*04:01 수용자에게 피부 이식을 수행하였다. 피부 이식편에는 APC가 풍부하게 포함되어 있어 이식하기 어려운 조직이다. 피부 생착의 평가는 잠재적인 동종반응성을 테스트하기 위한 강력한 모델이다. 이 전임상 모델은 DRB1*04:01 수용자의 DRB1*04:01K71E 피부 이식 거부 빈도를 결정하는 데 사용되었다.
도 3 하단에 도시된 바와 같이, DRB1*01:01 피부 이식편은 14일차(n=3)까지 완전히 거부되었지만 DRB1*04:01(n=3) 및 DRB1*04:01K71E(n=3) 이식편은 모두 안정적으로 이식된 상태를 유지하였다. DRB1*04:01K71E 동종이식편이 무기한 생존했다는 사실은 DRB1*04:01K71E 발현이 급성 또는 만성 거부를 유발하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서 일단 골수에 이식되면 DRB1*04:01K71E를 발현하는 장기 전구 HSC가 거부되거나 DRB1*04:01 수용자에서 면역 반응을 유도해서는 안 된다.
실시예 4 - MS와 관련된 HLA 대립유전자
MS 저항성 및 감수성과 관련된 대립유전자를 조사하였다. 두 개의 DRB1 대립유전자인 *01:01과 *11:01은 저항성을 부여하는 대립유전자로 확인되었으며, *15:01은 감수성과 연관되어 있다. 3개 대립유전자의 성숙한 단백질 서열을 정렬에 제출하고 위에서 설명한 기준과 일치하는 다형성 위치를 DRB1*15:01 대립유전자: F47, A71 및 V86에 대해 식별하였다. 4개 펩티드에 대해 다음 위치 (F47Y, A71R, V86G) 중 하나 이상에서 돌연변이가 발생하였다: MOGAD와 관련된 MOG97-109 (FFRDHSYQEEA); 뇌에서 발현되고 MS에서 기억 T 세포를 활성화하여 특징적인 뇌 염증을 유발할 수 있는 RASGRP278-87 (LVRYWISAFP) (Jelcic et al., 2018, Cell 175); DRB1*15:01에 결합하는 면역원성 펩티드인 MBP83-101 (ENPVVHFFKNIVTPRTPPP); 및 MS에 대한 저항성 역할을 할 수 있으며 DRB1*01:01에 결합하고 MS T 세포를 활성화하지 않는 MBP146-170 (AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR) (Mamedov et al., Front. Immunol. 2020.).
수집된 데이터(도 5-7)는 MS에 대한 감수성을 부여하는 DRB1*15:01이 두 개의 저항성 대립유전자보다 RASGRP2에 더 잘 결합하고, 또한 MBP83-101 펩티드에는 강력하게 결합하지만 MBP1146-170 펩티드에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 또한 결합이 더 나은 MBP146-170 펩티드를 제외하고는 V86G 및 F47Y 돌연변이가 결합 패턴에 약간 영향을 미쳤음을 나타내며, 이는 이 펩티드가 저항성에서 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 마지막으로, DRB1*15:01의 A71R 돌연변이 단독은 MBP146-170의 결합을 증가시키는 것을 제외하고는 펩티드 결합을 변화시키지 않는다(도 6). 이중 돌연변이인 A71R-V86G는 RASDRP2 결합의 감소도 보여주며(도 7), 이는 이중 돌연변이가 MS 자가면역 문제를 해결하는 데 추가적인 이점을 제공할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5 - NMO(시신경척수염)와 관련된 HLA 대립유전자
NMO의 임상 증후군은 아쿠아포린 4(AQP4)에 대한 병원성 혈청 IgG 자가항체에 의해 유발되는 급성 시신경염 및 횡단 척수염을 특징으로 한다. AQP4는 중추신경계에서 가장 풍부한 수로(water-channel) 단백질이다(사례의 >80%). NMO에 대한 감수성은 HLA-DRB1*03:01과 연관되어 있는 반면, 저항성은 대립유전자 DRB1*07:01과 연관되어 있다. 2개의 AQP4 펩티드를 두 대립유전자에 대한 결합에 대해 테스트하였다.
수집된 데이터는 AQP4-5 펩티드가 저항성 대립유전자가 아닌 감수성 대립유전자에 결합한다는 것을 나타낸다(도 9). AQP4-6 펩티드에서도 동일한 현상이 나타나며, 이는 감수성 대립유전자에도 결합하지만 저항성 대립유전자에는 결합하지 않는다. 이러한 결과는 DRB1*03:01의 펩티드 결합 프로파일이 펩티드 결합 홈의 위치 돌연변이에 영향을 받아 AQP4 펩티드의 결합을 방지하거나 감소시켜 자가면역을 예방할 수 있음을 의미한다. 그러한 돌연변이에 대한 후보 위치 (예를 들어 다른 곳에 개시된 바와 같이 아미노산 위치 9, 11, 13, 26, 28, 30, 32, 33, 37, 38, 40, 47, 57, 58, 67, 71, 74, 78, 85 및 86을 표적으로 삼음)는 DRB1*03:01 및 DRB1*07:01의 서열 정렬로부터 식별될 수 있다. (도 8; 위치 38, 40 및 85는 다형성이 아니며 03:01 및 07:01을 나타내고;정렬된 서열 위치는 성숙한 단백질 서열을 기준으로 번호가 매겨져 있음).
실시예 6 - RA와 관련된 HLA 대립유전자
HLA-DRB1 대립유전자 *04:05도 RA에 대한 감수성을 보여준다. 특히, 이 대립유전자는 일본인 인구에서 RA와 강한 연관성을 보여준다. 이러한 연구에서, DRB1*04:05의 위치 71이 R에서 E로 돌연변이되었다(도 10 참조).
이들 연구는 DRB1 대립유전자 *04:05가 면역우세 콜라겐 펩티드 결합에 대한 강한 선호도를 나타내지 않음을 나타낸다(도 11). 그러나 위치 71이 글루타민산(R71E)으로 돌연변이되면 낮은 수준의 결합이 더욱 감소된다. 비멘틴(vimentin) 및 알파-에놀라제(α-enolase)의 경우 *04:05 대립유전자는 기본 버전보다 시트룰린화 버전에 우선적으로 결합한다. K71E 돌연변이와 마찬가지로 DRB1*04:05의 위치 71에 있는 아르기닌을 글루탐산(R71E)으로 변경하면 이러한 선호도가 감소된다. MFI 바인딩 비율은 2번의 실험에 대한 평균이다.
본원에 개시된 바와 같이, RA에 민감한 다른 DR4 대립유전자, 예를 들어 DRB1*04:03, *04:04 및 *04:08은 위치 71이 아르기닌(R)에서 글루탐산(E)으로 변경될 때 저항성 (즉, 저항성 대립유전자)을 부여할 수 있다.
실시예 6 - 제1형 당뇨병 - T1D와 관련된 HLA 대립유전자
제1형 당뇨병에 대한 감수성과 관련된 DQB1 대립유전자를 항원 결합 홈에서 하나 이상의 돌연변이로 저항성을 부여하는 능력에 대해 테스트하였다. 구체적으로, 여러 DQB 대립유전자 및 상응하는 A57D 변이체가 T2 세포주에 클로닝되었다. 아스파르트산은 여러 저항성 대립유전자의 57번 위치에서 발견된다.
선택된 하이브리드 인슐린 펩티드 정보(도 22 참조)
하이브리드 인슐린 펩티드 약어 서열 참조자료 서열번호
HIP1- WE14 HIP1 GQVELGG-WSKMDQLA Delong et al. 2016
HIP6- IAPP2 HIP6 GQVELGGG-NAVEVLK Delong et al. 2016
HIP8- NPY HIP9 GQVELGGG-SSPETLI Delong et al. 2016
HIP11- C HIP11 SLQPLAL-EAEDLQV Baker et al. 2019
펩티드 선택 - 하이브리드 인슐린 펩티드 HIP1- WE14 (GQVELGGWSKMDQLA), HIP6- IAPP2 (GQVELGGGNAVEVLK), HIP8- NPY (GQVELGGGSSPETLI) 및 HIP11- C 펩티드 (SLQPLALEAEDLQV)는 Genscript (Piscataway, NJ)에 의한 트리플루오로아세트산(TFA) 제거를 통해 >98% 순도로 N-말단에 비오티닐화된 PEG3 링커로 합성되었다 (Delong 2016, Baker2019). 이 연구에 사용된 HIP는 자극 능력과 T 세포 클론의 가용성 때문에 선택되었다(표 1). 비오티닐화 GAD65265-281 (AMMIARFKMFPEVKEKG), 인슐린 유사체 (HLVEELYLVAGEEG) 및 인플루엔자 A (PKYVKQNTLKLAT) 펩티드도 HLA-DR 및 DQ 결합에 대한 대조군으로 합성되었다 [S. Dai, doi.org/10.1073/pnas.1716527115에서 확인 가능].
하이브리드 인슐린 펩티드를 다양한 농도에서 이들 세포주에 결합하는지 테스트하였다. 구체적으로, 천연 HLA DQB1 대립유전자의 펩티드 결합을 A57D 돌연변이 형태와 비교하였다. 감수성 대립유전자는 하이브리드 인슐린 펩티드에 결합하는 것으로 가정하였다.
이들 연구는 감수성 DQ2 및 DQ8 대립유전자는 HIP8-NPY 펩티드에 결합하지 않지만 DQ2 트랜스 HLA 분자는 결합한다는 것을 보여준다(도 12). 위치 57이 A에서 D로 변경되면, 이 하이브리드 인슐린 펩티드의 결합은 DQ2 및 DQ8에서는 증가하지만 DQ2 트랜스에서는 감소한다. 유사하게, DQ2 및 DQ8은 HIP11-C 펩티드에 결합하지 않지만(도 13), DQ2 트랜스 분자는 결합한다. A57D가 도입되면 DQ2는 펩티드 결합을 보여준다. DQ2 트랜스는 이 펩티드에 덜 결합하지만 결합은 없어지지 않는다. 인슐린 유사체 펩티드의 결합은 상기 펩티드와 유사한 패턴을 따른다(도 14). 구체적으로 DQ2는 유사체 펩티드에 결합하지 않지만, DQ2 트랜스와 DQ8은 펩티드에 결합한다. A57D 돌연변이가 도입되면 이제 DQ2와 DQ2 트랜스가 펩티드에 결합한다. 돌연변이는 DQ8 분자에 대한 결합을 감소시킨다.
A57D 돌연변이에 의한 T 세포 자극에 대한 효과도 테스트하였다. 구체적으로, DQ2로 제한되고 HIP11-C 펩티드에 특이적인 E2 T 세포를 수득하였다. 이들 T 세포를 다양한 농도의 HIP11-C 펩티드 존재 하에 DQ2 또는 DQ2 트랜스 분자를 발현하는 T2 세포와 함께 밤새 배양하여 자극하였다. A57D 돌연변이가 있는 두 분자도 테스트하였다. 그런 다음 세포 표면의 IL-2R(CD25)에 대해 세포를 염색하여 T 세포 자극을 측정하였다.
이러한 연구는 DQ2 T2 세포주가 모 EBV 세포주보다 E2 T 세포 클론을 훨씬 더 잘 자극한다는 것을 보여준다(도 15, 상단 패널). 이러한 대립유전자에 A57D 돌연변이를 도입하면 E2 T 세포의 자극이 감소한다. 도 15의 하단 패널에 도시된 바와 같이, E2 T 세포 클론은 DQ2 트랜스 분자에 의해 자극되지만, DQ2 트랜스 분자에 A57D를 도입하면 T 세포 클론의 자극이 감소한다.
도 16은 하이브리드 인슐린 펩티드에 결합하는 HLA-DQ 대립유전자를 보여준다. 비오틴화된 HIP1-WE14, HIP6-IAPP2, HIP9-NPY 및 HIP11-C 펩티드의 결합은 DQ2 (A1*05:01/B1*02:01), DQ8 (A1*03:01/B1*03:02), DQ2 트랜스 (A1*03:01/B1*02:01) 및 DQ8 트랜스 (A1*05:01/B1*03:02)의 위험 대립유전자(A1*05:01/B1*02:01)를 발현하는 T2 세포에서 측정되었다. DQ6의 저항성 대립유전자(A1*01:02/B1*06:02)도 테스트되었다. 밝은 회색은 HLA-클래스 II(-) T2 모 세포주에 대한 펩티드의 배경 결합이고, 더 어두운 회색은 특정 HLA-클래스 II(+) T2 세포주에 대한 펩티드 결합이다. 행은 서로 다른 대립유전자를 나타내고 열은 서로 다른 펩티드를 나타낸다. 오른쪽 상단의 숫자는 평균 결합 비율(SA-PE MFI T2 HLA 클래스(+)/SA-PE MFI T2 모)이다. 숫자는 3번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 결합 비율을 나타낸다.
도 17은 HLA-DQ 대립유전자 결합 대조군 천연 펩티드를 보여준다. 비오틴화된 인슐린 유사체(Mimotope) 및 GAD65265-281의 결합을 DQ2 (A1*05:01/B1*02:01), DQ8 (A1*03:01/B1*03:02), DQ2 트랜스 (A1*03:01/B1*02:01) 및 DQ8 트랜스 (A1*05:01/B1*03:02)의 위험 대립유전자를 발현하는 T2 세포에서 측정하였다. DQ6의 저항성 대립유전자 (A1*01:02/B1*06:02)도 테스트되었다. 밝은 회색은 HLA-클래스 II(-) T2 모 세포주에 대한 펩티드의 배경 결합이고, 더 어두운 회색은 HLA-클래스 II(+) T2 세포주의 신호이다. 오른쪽 상단의 숫자는 평균 결합 비율(SA-PE MFI T2 HLA 클래스(+)/SA-PE MFI T2 모)이다. 숫자는 3번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 결합 비율을 나타낸다.
도 18은 HIP에 결합하는 민감성 및 저항성 HLA-DRB1 대립유전자를 보여준다. 비오틴화된 HIP1, HIP6, HIP8 및 HIP11의 결합은 DRB1*03:01 및 DRB1*04:01의 감수성 대립유전자와 저항성 DRB1*15:01을 발현하는 T2 세포에서 측정되었다. 밝은 회색은 HLA-클래스 II(-) T2 모 세포주에 대한 펩티드의 배경 결합이고, 더 어두운 회색은 HLA-클래스 II(+) T2 세포주의 신호이다. 모서리에 있는 숫자는 3번의 독립적인 실험의 평균 결합 비율이다.
도 19는 감수성 및 저항성 HLA-DRB1 대립유전자 결합 천연 대조 펩티드를 보여준다. 비오틴화된 인슐린 유사체, GAD65265-281 및 인플루엔자 HA의 결합은 감수성 또는 저항성 HLA-DRB1 대립유전자, 특히 DRB1*03:01, DRB1*04:01 및 HLA*DRB1*15:01을 발현하는 T2 세포에서 측정되었다. 모서리에 있는 숫자는 평균 결합 비율이다.
도 20은 HIP에 결합하는 다양한 HLA-DRB3/4/5 대립유전자를 보여준다. 비오틴화된 HIP1, HIP6, HIP8 및 HIP11에 결합하는 HLA-DRB3/4/5 대립유전자의 능력은 DRB3 (*01:01, *02:02, *03:01), DRB4*01:03 및 DRB5*01:01의 대립유전자를 발현하는 T2 세포에서 측정되었다. 밝은 회색은 HLA-클래스 II(-) T2 모 세포주에 대한 펩티드의 배경 결합이고, 더 어두운 회색은 HLA-클래스 II(+) T2 세포주의 신호이다. 모서리에 있는 숫자는 3번의 독립적인 실험의 평균 결합 비율이다.
도 21은 다양한 HLA-DRB3/4/5 대립유전자 결합 천연 대조 펩티드를 보여준다. 비오틴화된 인슐린 유사체, GAD65265-281 및 인플루엔자 HA의 결합은 DRB3 (*01:01, *02:02, *03:01), DRB4*01:03 및 DRB5*01:01을 발현하는 T2 세포에서 측정되었다. 밝은 회색은 HLA-클래스 II(-) T2 모 세포주에 대한 펩티드의 배경 결합이고, 더 어두운 회색은 HLA-클래스 II(+) T2 세포주의 신호이다. 모서리에 있는 숫자는 3번의 독립적인 실험의 평균 결합 비율이다.
실시예 7 - DRB1의 포켓 1에서의 돌연변이의 효과
본 명세서에는 HLA 클래스 II 단백질의 항원 결합 위치인 포켓 1을 폐쇄하기 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 여러 구현예에서, HLA 클래스 II 단백질은 DRB, 예를 들어 DRB1, DRB3, DRB4 또는 DRB5이다. 여러 실시형태에서, 포켓 1의 하나 이상의 아미노산 위치가 편집되는 변이체 DRB 분자가 개시된다. 여러 실시예에서, 편집에는 글리신을 더 큰 아미노산 동일성(예: 발린, 메티오닌 또는 류신)으로 변경하는 것이 포함될 수 있다. 여러 실시예에서, 성숙한 DRB 단백질의 아미노산 위치는 85 또는 86이다.
위치 86은 DRB1의 펩티드 결합 영역의 포켓 1 내에 위치하며 결합 홈 깊은 곳에서 펩티드 앵커 위치로 작용할 수 있다. DRB 분자의 포켓 1(또는 P1)은 펩티드 항원을 고정하는 데 도움이 되는 하나 이상의 큰 아미노산 측쇄를 수용하기 위한 깊은 오목부, 함몰부 또는 구멍을 형성할 수 있다. DRB1의 86번 위치에 있는 글리신을 다른 아미노산으로 대체하는 효과를 조사하기 위한 연구를 설계하였다. 구체적으로, 더 큰 비극성 아미노산인 발린, 메티오닌 및 류신을 대체하여 이 펩티드 앵커 위치의 크기를 줄였다.
이 연구에서는 DRB1*04:01의 결합 틈 내 특정 아미노산 위치(위치 86)가 글리신에서 메티오닌(G86M) 또는 류신(G86L)으로 변경되었다. T2 세포주를 변이체를 암호화하는 조작된 유전자로 형질감염시키고 신규 HLA 분자를 발현시켰다. 세포주를 100uM 비오티닐화된 펩티드와 함께 밤새 배양하였다. 다음날, 결합된 비오티닐화된 펩티드를 검출하기 위해 스트렙타비딘-PE를 첨가하기 전에 세포를 세척하고 가볍게 고정시켰다. BD Canto 기기를 사용하여 유세포 분석으로 세포를 분석하였다. 다양한 펩티드를 테스트하여 포켓 1의 변화가 펩티드 결합에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지(증가, 감소 또는 동일하게 유지) 확인하였다.
위치 86이 글리신에서 메티오닌(G86M)으로 또는 글리신에서 류신(G86L)으로 변경된 DRB1*04:01 또는 DRB1*04:01을 발현하는 T2 세포주를 다양한 펩티드에 결합하는 능력에 대해 테스트하였다. 위치 86은 DRB1의 펩티드 결합 영역의 포켓 1에 위치하고 있으며 글리신을 더 큰 비극성 아미노산으로 대체하면 이 앵커 위치를 채워 펩티드 결합을 본질적으로 차단할 수 있다는 가설을 세웠다.
DRB1*04:01은 여기에 나열된 모든 펩티드에 결합한다(그림 23). 위치 86이 메티오닌 또는 류신으로 변경되면 콜라겐, MOG 및 GAD65에 대한 펩티드 결합의 억제가 관찰된다. 인슐린 유사체와 바이러스 인플루엔자 HA 펩티드에 대한 펩티드 결합의 감소가 나타난다. 밝은 회색 피크는 T2 모 세포주 A에 의해 결합된다. 어두운 피크는 특정 HLA 대립유전자에 의해 결합되는 펩티드다. 오른쪽 모서리에 있는 숫자는 클래스 II HLA를 표현하지 않는 T2 모 세포주에 대한 배경 결합에 대한 MFI 비율이다. 굵은 숫자는 HA, 콜라겐, MOG 및 GAD65에 대한 두 가지 실험의 결합 비율이고; 인슐린 유사체는 실험이 하나뿐이다.
동일한 세포주를 하이브리드 인슐린 펩티드로 테스트하였다(도 24). 위치 86을 G에서 M으로 또는 G에서 L로 변경해도 이들 하이브리드 인슐린 펩티드에 대한 기능이 얻어지지 않았다. 이들은 DRB1*04:01 또는 두 돌연변이에 결합하지 않는다.
도 25에 나타난 바와 같이, MS에서 역할을 하는 것으로 생각되는 RASGRP2 펩티드의 결합은 두 돌연변이체에서 감소되었다. 그러나 돌연변이 세포주는 여전히 MBP 펩티드에 결합되어 있다. AQP4 펩티드(NMO)는 DRB1*04:01 및 두 돌연변이와 유사하게 결합하였다.
시트룰린화 비멘틴 결합에 대한 선호(preference)가 있으며 시트룰린화 α-에놀라제 펩티드는 위치 86이 M 또는 L로 변경될 때 감소된다. 도 26은 α-에놀라제 펩티드와의 이들 결합을 도시한다. 이러한 돌연변이는 모든 펩티드 결합을 차단하지는 않는다. 밝은 회색은 시트룰린화, 어두운 회색은 천연 펩티드다. 매우 밝은 회색 피크는 HLA 분자를 발현하지 않는 T2 세포에 대한 펩티드의 배경 결합이다. 시트룰린화 대 천연 펩티드 결합의 비율은 오른쪽 모서리에 표시된다.
관절염 유발성 펩티드는 DRB1*04:01 및 두 돌연변이에 대해 테스트되었다. 도 27은 이들 세포주에 대한 펩티드의 천연 버전과 시트룰린화 버전의 비교를 보여준다. 이 연구는 위치 86이 돌연변이될 때 천연 버전과 시트룰린화 버전의 비멘틴이 더 잘 결합한다는 것을 보여준다. 천연 α-에놀라제 결합은 G86L 세포주에서 증가하지만 두 돌연변이 모두 시트룰린화 세포주에 덜 결합한다. 여기서 비율은 T2 모(parent) 배경(background)에 대해 계산된다.
실시예 8 - 골수 치료
실험 시작 최소 48시간 전에 쥐에게 물병(~375ml)당 베이트릴 물 (Baytril water) (베이트릴 22.7mg/ml: 1135mg 엔로플록사신, 45ml 물, 1.25ml 1-부탄올(n-부탄올)이 담긴 50ml 튜브에 엔로플록사신이 용해될 때까지(~150-200μl) 한 방울씩(50% NaOH, 19M) 45% KOH(11.7M)를 첨가하고; pH를 확인하고 HCl로 pH 8.9-10.9로 조정하고 물로 50ml로 조정함) 2ml를 먹였다. 기증자 K71E 마우스로부터 골수 세포를 분리하고 조사된 DR4 수용자에게 옮겼다. 수용자 마우스에 총 용량을 달성하기 위해 6시간 간격으로 2회 방사선을 조사하였다.
골수 재구성(reconstitution)
골수 세포는 에탄올로 세척하고 모든 근육 조직과 힘줄을 해부한 후 뼈에서 분리되었다. 골수 세포를 제거하기 위해 25게이지 바늘이 달린 10ml 주사기를 사용하여 뼈의 끝 부분을 자르고 씻어냈다. 세포를 신선한 PBS가 포함된 10ml 조직 배양 플레이트에 플러싱(flush)하였다. 플레이트에 있는 PBS와 함께 18게이지 바늘/10mL 주사기를 통해 세포를 통과시켜 골수 세포를 파괴하였다. 단일 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 2ml RBC 용해 완충액과 함께 1분 동안 배양하여 적혈구를 용해시킨 다음, 조성물을 70uM 필터를 통해 새로운 50ml 튜브로 여과하였다. 염색을 위해 10ul 분취량을 트리판 블루에 1:2로 희석하였다. 비적혈구 세포 수를 세고 각 유형의 기증자에 대한 총 세포 수를 계산하였다. 세포를 다시 400 xg에서 원심분리하고 PBS에 2-5 x 107세포/mL로 재현탁시켰다. 100ul를 후안와 주사(retro-orbital injection)를 통해 조사된 각 수용자 마우스에 투여하였다.
재구성 및 키메라 현상 모니터링 및 확인
마우스를 처음 2주 동안 매일 모니터링하고 그 이후에는 매주 모니터링하였다. 베이트릴 물은 4주 동안 일주일에 한 번씩 교체해주었다. 6주 후에 B 및 T 세포를 염색하여 생쥐의 혈액 샘플을 재구성하여 확인하였다. 기증자 세포 마커가 있는 마우스를 유동 세포 계측법을 사용하여 키메라 현상에 대해 검사하였다. 세포 표면 마커를 사용할 수 없는 경우, 변경된 유전자 또는 유전자 파괴의 존재 여부를 테스트하기 위해 유전자형 분석을 위해 샘플을 제출하였다.
이식을 위해 수용자의 세포를 제거하기 위해 항-CD117 또는 기타 시약을 사용하는 골수 이식
항-CD117 항체는 HSC를 표적으로 하기 때문에 본 발명의 조작된 HSC의 생착을 도울 수 있다(2019 May 9;133(19):2069-2078 doi: 10.1182/blood-2018-06-858159). 항인간 CD117 mAb, SR-1은 시험관 내에서 정상적인 제대혈 및 골수 HSC를 억제한다. SR-1 및 임상 등급 인간화 항인간 CD117 mAb, AMG 191은 이종이식 마우스 모델에서 생체 내 정상 및 MDS HSC를 고갈시킨다. 이러한 항-CD117 mAb는 또한 MDS 이종이식 마우스 모델에서 정상적인 기증 인간 HSC의 생착을 촉진하고 정상적인 인간 조혈을 복원하며 공격적인 병리학적 MDS 세포를 근절하는 데 유용하다. 어떤 경우에는 항-CD117 항체가 조혈 줄기 세포가 골수 간질에 결합하는 것을 차단하여 이를 골수에서 말초 순환계로 방출하는 데 도움이 된다. 이러한 이유로, 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상을 치료하는 한 가지 방법은 개시된 변이체 HLA 분자를 포함하는 조작된 HSC의 생착을 돕기 위해 항-CD1117 항체를 사용한 사전 치료를 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상은 상기 HSC 수득에 대해 개시된 바와 같이 조작된 세포를 투여하기 전에 GCF 처리로 면역 세포를 동원할 수 있다.
마우스를 두 그룹으로 나누었다. 이들 실험을 위해, 그룹 I은 항-CD117(0일 및 2일)을 2회 후안와 정맥 주사한 DR4+ 마우스였다. 그런 다음 이 마우스들은 8일차에 DRB1*04:01K71E 기증자로부터 골수 세포를 수득하였다. 그 후 두 시점(BMT 후 14일차와 28일차)에 수용자로부터 혈액을 수집하여 분석하였다. 그룹 II 마우스도 DR4+였지만 항-CD117을 투여받지 않았다(0일 및 2일). 그러나 8일차에 K71E 골수 세포를 투여받았다. 그 후 그룹 I과 마찬가지로 두 시점(BMT 후 14일차 및 28일차)에 혈액을 수집하였다. 최종 샘플은 56일차에 수집되었다.
DR4 마우스와 K71E 마우스 사이의 단일 아미노산 차이를 찾기 위해 디지털 PCR을 사용하여 혈액 샘플을 분석한다.
알킬화 화학요법제인 부설판(Busulfan)은 또한 동종이형 조작 HSC를 받을 피험자를 준비하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 부설판은 또한 조작된 DRB1*04:01K71E 대립유전자를 보유하는 기증자 마우스로부터 골수 세포를 전달하기 전에 수용자 마우스를 치료하는 데 사용된다.
논의
본 명세서에 개시된 실험 및 데이터는 RA는 물론 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 시신경척수염 및 바람직하지 않은 HLA 단백질 매개 결합 및 면역 효과 세포에 대한 자가-펩티드의 제시로 인해 발생하는 기타 장애를 포함하는 자가면역 질환의 치료에 대한 독창적인 개념을 입증한다. 본 발명은 또한 출원인의 지식에 따라 RA 이외의 자가면역 질환의 치료에 대한 최초의 설명이다. 따라서, 본 발명은 개시된 바와 같이 HLA 공학에 의한 자가면역 치료를 광범위하게 가능하게 하고 입증한 최초의 출원인의 지식이다.
본 발명은 자가면역 질환에서 항원성으로 인식되는 자가-펩티드를 포함하는 펩티드의 결합 및 제시를 변형시키기 위해 HLA 클래스 II 단백질의 항원 결합 포켓(포켓 1)의 입체적 폐쇄의 신규한 HLA 조작 전략을 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 자가면역과 관련된 HLA 단백질에 의한 펩티드 결합의 양 및 친화도를 일반적으로 감소시키기 위해 상대적으로 작은 아미노산 (예: 글리신)을 상대적으로 큰 아미노산 (예: 메티오닌)으로 대체하는 전략을 개시하고 예시한다 (실시예 7 참조).
따라서, 광범위하게 구현된 바와 같이, 본 발명은 특히 HLA 조작에 의해 자가면역을 치료 또는 예방하는 방법 및 자가면역 질환에 대한 HLA 조작 치료법을 설계하는 방법을 제공한다. 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있는 HLA 조작은 자가면역 반응과 관련된 하나 이상의 자가 펩티드의 결합을 감소시키고, HLA 단백질에 의한 자가 펩티드(들)의 결합에 기여하는 하나 이상의 아미노산을 대체하도록 설계되고 수행되며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 HLA 단백질의 항원 결합 틈 내의 위치(들)로 인해 상대적으로 '면역 특권(immunoprivileged)'을 갖는다.
치환 또는 대체 아미노산은 자가면역, 예를 들어 대상이 앓고 있거나 대상이 취약하다고 간주되는 특정 자가면역 질환에 대한 저항성과 연관된 HLA 대립유전자를 참조하여 식별할 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 조작을 위한 후보 HLA 단백질 아미노산 잔기는 자가면역 질환 관련 HLA 단백질과 동일한 자가면역 질환에 대한 저항성과 관련된 HLA 단백질의 서열 및/또는 3차원 모델을 비교함으로써 식별된다. 이러한 3차원 모델에는 자가면역 질환과 관련된 펩티드 또는 펩티드와 복합체를 이루는 HLA 단백질의 결정 구조가 포함된다. 추가로 또는 대안적으로, 대체 아미노산은 자가면역 관련 펩티드 (예를 들어, 당뇨병, RA 및 MS에서 각각 인슐린, 콜라겐, RASDRP2로부터 유래된 펩티드)에 대한 HLA 단백질의 결합을 감소시키는 치환을 확인하기 위해 인실리코(in silico) 모델링 및/또는 고처리량 시험관내 분석과 같은 방식으로 새롭게 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 자가면역 질환과 관련된 HLA 단백질의 Pocket 1과 같은 적절한 위치에 글리신과 같은 작은 아미노산을 확인하고 상응하는 HLA 대립유전자를 조작하여 크기가 더 큰 대체 아미노산을 발현시키는 것을 포함한다. 방법은 조작된 HLA 단백질에 대한 자가- 및/또는 비자기 펩티드의 결합을 검정하는 것뿐만 아니라 위에서 논의된 기능적 검정을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 고려되고, 예를 들어 실시예 4에 명시적으로 설명된 바와 같이, HLA 조작은 HLA 단백질에서 2개 이상의 아미노산의 대체(또는 돌연변이)를 포함할 수 있으며, 이에 따라 치료 설계 방법이 적용되고 최적화될 수 있다.
특정 구현예는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법과 HLA 공학에 의한 자가면역 질환 치료를 설계하는 방법을 제공한다. 특정 실시예는 RA, T1D, MS, 시신경척수염, 베체트 증후군, 셀리악병 및 건선을 치료 또는 예방하는 방법과 이에 대한 치료법을 설계하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태는 제1형 당뇨병, MS, 시신경척수염, 베체트 증후군, 셀리악병 및 건선을 치료 또는 예방하는 방법과 이에 대한 치료법을 설계하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, HLA 조작은 DRB1*04:01K71E 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, HLA 조작은 DRB1*04:01 대립유전자의 위치 71의 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, HLA 조작은 DRB1*04:01 대립유전자의 돌연변이를 포함하지 않는다.
중요하게도, 특정 실시양태를 포함하는 본 발명의 여러 실시양태는 치료후 면역억제를 요구하지 않으며 이를 배제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 HLA 조작에 의해 자가면역 질환에 대한 치료법을 설계하는 특정 방법은 예를 들어 후보 돌연변이의 효능 및 비거부성을 확인하기 위한 시험관내 T 세포 자극 분석 및/또는 피부 이식 실험을 포함하며, 여기서 이러한 효능 및/또는 비거부 여부는 본 명세서에 개시된 HLA 조작에 적합한 돌연변이를 확인하는 것이다.
다수의 구현예가 개시되어 있지만, 본원에 개시된 개념, 화합물, 조성물, 방법, 프로세스, 시스템 및 치료법의 또 다른 구현예는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 명백해지는 바와 같이, 본 개시는 본 발명의 사상 및 범위를 모두 벗어나지 않고 명백한 측면에서 다양한 변형이 가능하다. 따라서, 상세한 설명은 본질적으로 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌은 특허 여부에 관계없이 각각의 인용문 전체가 포함된 것처럼 참고로 본 명세서에 포함된다. 참고문헌과 명세서가 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 내용이 어느 정도 구체적으로 설명되었지만, 본 개시는 예시로서 이루어졌으며, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 세부사항 또는 구조의 변경이 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.

Claims (28)

  1. 변이체 HLA-DRB 단백질로서,
    HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 또는 HLA-DRB5의 천연 대립유전자(native allele)에 의해 암호화된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 및
    천연 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 서열의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기와 다른 아미노산 서열의 아미노산 위치에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하고,
    여기서 상기 아미노산 위치는 항원 결합 틈(cleft)의 포켓 1에 또는 그 근처에 있고, 변이체 HLA-DRB 단백질은 천연 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 적어도 하나의 펩티드 항원에 대해 변경된 결합 친화도를 갖는 것인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대립유전자가 HLA-DRB1인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대립유전자가 HLA-DRB3인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 대립유전자가 HLA-DRB4인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대립유전자가 HLA-DRB5인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 위치가 아미노산 서열의 85번 위치 또는 86번 위치인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 아미노산 위치에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 발린, 메티오닌 또는 류신인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가 메티오닌인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가 류신인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가 글리신인 변이체 HLA-DRB 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 셀리악병(celiac disease), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 수초희소돌기아교세포 당단백질 항체 장애(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody disorders, MOGAD), 근무력증 증후군(myasthenic syndromes), 시신경척수염(neuromyelitis optica, NMO), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 증후군(Behet's syndrome), 버드샷 포도막염(Birdshot uveitis), 기면증(narcolepsy), 기면증 1형(narcolepsy type 1, NT1; 이전에는 탈력발작을 동반한 기면증(narcolepsy with cataplexy)으로 불림), 가와사키병(Kawasaki disease), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 피부근염(dermatomyositis, DM), 애디슨병(Addison's disease), 과민성대장증후군(irritable-bowl syndrome, IBS), 그레이브스병(Graves' disease), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schnlein purpura, HSP), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발근염(polymyositis, PM), 신생물부신경증후군(paraneoplastic neurological syndromes, PNS), 자가면역뇌염(autoimmune encephalitis), 루푸스신염(lupus nephritis, LN), 중증근육무력증(myasthenia gravis, MG), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 이식 거부반응(graft rejection), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 원치 않는 지연형 과민반응(unwanted delayed-type hypersensitivity reaction), T세포 매개성 폐질환(T-cell mediated pulmonary disease), 신경염(neuritis), 백반증(vitiligo), 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 자가면역 갑상선 질환(autoimmune thyroid diseases), 천식(asthma), 자가면역 포도막염(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)로 이루어진 군에서 선택되는 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 변이체 HLA-DRB 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 변이체 HLA-DRB 단백질을 포함하는 조작된 조혈 세포.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 변이체 HLA-DRB 단백질을 암호화하는 핵산.
  14. 제13항의 핵산을 포함하는 조작된 조혈 세포.
  15. 자가면역 질환 치료용 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변이체 HLA-DRB 단백질, 제12항 또는 제14항의 조작된 조혈 세포, 또는 제13항의 핵산의 용도.
  16. HLA 대립유전자의 변형 방법으로서,
    하나 이상의 자가면역 질환과 관련된 HLA 대립유전자를 확인하는 단계;
    하나 이상의 감수성(susceptible) HLA 대립유전자를 확인하는 단계, 여기서, 상기 감수성 HLA 대립유전자는 하나 이상의 자가면역 질환에 대한 감수성과 연관되고;
    항원 결합 틈(cleft)의 포켓 또는 그 근처의 아미노산 위치에 대응하는 표적 서열을 확인하는 단계, 상기 포켓은 항원 결합 틈 내의 항원 결합을 위한 1차 앵커 아미노산 잔기의 세트이고;
    아미노산 위치의 표적 아미노산을 표적 아미노산보다 큰 측쇄를 갖는 제2 아미노산으로 치환시켜 포켓에 폐쇄를 생성하도록 표적 서열을 변형시키는 단계, 여기서 상기 제 2 아미노산의 측쇄는 항원 결합 틈의 포켓에 결합하는 항원에 영향을 미치고; 및
    이로써 HLA 대립유전자의 포켓을 폐쇄시키는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 변형 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 HLA 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 포켓은 포켓 1인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 위치가 HLA 대립유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 86번인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 아미노산이 발린, 메티오닌 및 류신으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포켓에 폐쇄된 HLA 단백질이 자가면역 질환과 관련된 적어도 하나의 자가펩티드(self-peptide)에 대해 더 낮은 결합 친화성을 갖고, 선택적으로 상기 적어도 하나의 자가펩티드가 제거되고, 추가로 선택적으로 상기 표적 아미노산은 T 세포 수용체 결합 계면에 존재하지 않는 것인 방법.
  22. 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상을 치료하는 방법으로서,
    대상의 HLA 복합체 내 HLA 유전자의 감수성 HLA 대립유전자를 확인하는 단계, 여기서, 상기 감수성 HLA 대립유전자는 자가면역 질환에 대한 감수성과 연관되고;
    대상으로부터 다수의 CD34+ 면역 세포를 분리하는 단계;
    CD34+ 면역 세포의 HLA 복합체를 변형하여 조작된 CD34+ 면역 세포를 생성하는 단계, 여기서 상기 조작된 CD34+ 면역 세포는 감수성 HLA 대립유전자를 발현하지 않고, 조작된 HLA 대립유전자를 발현하며, 여기서 조작된 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질은 조작된 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질의 항원 결합 틈의 포켓 내에 폐쇄가 존재한다는 점에서 감수성 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질과 다르며, 감수성 HLA 대립유전자에 의해 암호화되는 단백질과 비교하여 적어도 하나의 자가펩티드에 대한 결합 친화도를 변경하고;
    다수의 조작된 CD34+ 면역 세포를 분리하는 단계; 및
    분리되고 조작된 CD34+ 면역 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로써 자가면역 질환을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 HLA 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 포켓은 포켓 1인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 틈의 포켓 내 폐쇄가 감수성 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 조작된 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질의 위치 86에서의 아미노산 치환으로부터 발생하는 것인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 위치 86의 아미노산을 발린, 메티오닌 및 류신으로부터 선택된 아미노산으로 대체하는 것인 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 단백질이 자가면역 질환과 연관된 적어도 하나의 자가펩티드에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 자가펩티드가 적어도 하나의 최종 잔기를 포함하는 펩티드로부터 선택되는 것인 방법.
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