KR20040039323A

KR20040039323A - 개질된 인간 성장 호르몬

Info

Publication number: KR20040039323A
Application number: KR10-2004-7003170A
Authority: KR
Inventors: 카프랜시스제이; 카터그레이엄
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2004-05-10
Also published as: EP1427756A1; PL369066A1; WO2003020761A1; CN1551888A; BR0211991A; JP2005501546A; MXPA04001976A; RU2004110238A; CA2459138A1; HUP0402334A3; ZA200402602B; HUP0402334A2; US20050020494A1

Abstract

본 발명은 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 인간 성장 호르몬을 만드는 인간 성장 호르몬 (hGH) 의 개질에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 hGH 에서 유래된 면역원성 T 세포 에피토프 서열에 관한 것이다.

Description

개질된 인간 성장 호르몬 {MODIFIED HUMAN GROWTH HORMONE}

치료적 단백질의 효능이 치료적 단백질에 대해 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 설정에 있어서 치료법으로 유망하게 나타났지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 반응의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 반응을 감소시키기 위한 시도로 여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 일반적으로 최종 항체 구축물에서 마우스 유전 정보는 감소되지만, 최종 구축물에서 인간 유전 정보는 증가된다. 그럼에도 불구하고,생성된 "인간화" 항체는 여러 경우, 여전히 환자에서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

항체가 면역 반응이 일으킬 수 있는 것에 대한 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 다른 것들 중에서, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 [Wadhwa, M. 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등, (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등, (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] 의 치료적 사용이 포함된다. 상기 인간 단백질이 면역원성인 상황에서는 상기 대상체 내에서 단백질을 만나면 달리 작동하는 면역원성 관용이 손상된 것으로 추정된다.

상기 상황은 인간 단백질이 대체 요법으로 투여되는 경우, 예를 들어 혈우병 A, 혈우병 B, 고쉐병 (Gauchers disease) 및 여러 기타 예와 같은 질환의 경우에서 있을 수 있는 단백질 결핍이 지속되는 유전 질환의 경우 상이하다. 이런 경우, 치료적 대체 단백질은 처음부터 외부 분자로 면역학적으로 기능할 수 있으며, 개인이 치료물에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있는 경우, 요법의 효능은 상당히 손상될 수 있다.

단백질 치료물이 숙주 면역계에 의해 외부 분자로 인지되는지 또는 분자에 대한 기존 관용성이 극복되는지 여부와 무관하게, 단백질에 대한 면역 반응성의 기전은 동일하다. 면역 반응 유도의 열쇠는 단백질 내에 소위 "T 세포 에피토프" 로 불리는, MHC 클래스 II 분자 상의 제시를 통해 T 세포 활성을 자극할 수 있는 펩티드의 존재에 있다. 상기 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인지될 수 있고, 적어도 원칙적으로 TCR 이 관여하여 상기 T 세포의 활성화를 야기하여 T 세포 반응을 촉진할 수 있는 에피토프를 의미한다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선택 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원기 DR (HLA-DR) 이 상기 단백질군의 주요 이종형 (isotype) 이지만, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행한다. 인간 개체군 내에서, 개인들은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등, Nature (1993) 364: 33; Stern 등, (1994) Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형 (allotype) 을 나타내는 다형성 (polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 개체군 수준에서는 외부 단백질을 인식하고, 병원성 유기체에 대한 면역 반응을 유발하는 능력에 대한 최대 유연성을 보장한다.

치료적 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와 연합된 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 다른 것들 중에서 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께 T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 더욱 활성화시키는 시토카인을 방출시켜, 항체를 생산시키거나 완전 세포성 면역 반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다.

T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이지만, 당 분야에서 에피토프 동정 및 에피토프 제거가 단일한 체계로 통합되는 경우는 소수의 뚜렷한 경우뿐이다. 따라서, W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위세트에 결합할 가능성을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 컴퓨터 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측되는 T 세포 에피토프는 관심 단백질 내 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다. 그러나, 상기 체계 및 에피토프 동정을 위한 다른 컴퓨터 기반 절차 [Godkin, A.J. 등 (1998) J. Immunol. 161:850-858; Sturniolo, T. 등 (1999) Nat. Biotechnol. 17:555-561] 는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있을 것으로 예측되는 펩티드가 모든 상황 하에, 특히 생체 내에서 처리 경로 또는 다른 현상으로 인해 T 세포 에피토프로 기능하지 않을 수 있다.

마찬가지로, 예를 들어 MHC 클래스 II 결합 표면원으로서 정의된 MHC 동종이형의 B 세포주를 사용하는, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 합성 펩티드의 능력 측정을 위한 시험관 내 방법을 MHC 클래스 II 리간드 동정에 적용할 수 있다 [Marshall K.W. 등 (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan 등 (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. 등 (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. 그러나, 상기 기법은 매우 다양한 MHC 동종이형에 대한 다중 잠재적 (multi potential) 에피토프의 스크리닝을 위해 적응되지 않았고, 이들은 T 세포 에피토프로서 기능하는 펩티드의 결합능을 확인할 수 없다.

최근 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기술들이 사용되어 왔다 [Kern, F. 등, (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001) TRENDS in Immunology 22: 583-588]. 상기 시약 및 절차는 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있고, 매우 다양한 MHC 동종이형에 대한 다중 잠재적 에피토프의 스크리닝을 위해 적응되지 않은 인간 또는 실험적 동물 대상체의 말초 혈액 표본으로부터 T 세포 클론의 존재를 동정하는데 사용된다.

T 세포 활성화의 생물학적 분석은 면역 반응을 일으키는 시험 펩티드/단백질 서열의 능력을 읽어내기 위한 실제적 선택권을 제공한다. 상기 종류의 접근법의 예에는 T 세포주를 자극하기 위해 합성 펩티드를 이용한 에피토프 맵핑이 수반되는, 박테리아 단백질 스타필로키나아제 (staphylokinase) 에 대한 T 세포 증식 분석을 이용한 Petra 등의 작업이 포함된다 [Petra, A.M. 등 (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. 유사하게, 파상풍균 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T 세포 증식 분석으로 독소의 면역지배적 (immunodominant) 에피토프 영역이 정의되었다 [Reece J.C. 등 (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. WO99/53038 에는 단리된 인간 면역 세포의 하위세트를 이용하여, 이들의 시험관 내 분화를 촉진하고, 관심 합성 펩티드의 존재 하에 세포를 배양하고, 배양된 T 세포에서 임의의 유도된 증식을 측정함으로써 시험 단백질 중 T 세포 에피토프가 결정될 수 있는 접근법이 개시되어 있다. 또한 동일한 기법이 Stickler 등에 의해 개시되어 있으며 [Stickler, M.M. 등 (2000) J. Immunotherapy 23:654-660], 두 경우 모두에서 상기 방법은 박테리아 서브틸리신 (subtilisin) 내 T 세포 에피토프의 검출에 적용된다. 상기 기법은 목적하는 면역 세포 하위 세트 (수지상 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 를 수득하기 위한 여러 시토카인 보충물로의 세포 배양 및 세포 단리 기법의 주의깊은 적용을 필요로하며, 여러 공여자 표본을 이용한 신속 작업처리량 (rapid through-put) 스크리닝에는 도움이 되지 않는다.

상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 주로 치료적으로 유용하지만, 원래는 면역원성인 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T 세포 에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 치료적으로 유용한 잠재적 분자의 하나는 인간 성장 호르몬 (본원에서 hGH 로 약칭) 이다.

천연 hGH 는 22kDa 분자량, 191 개 아미노산 잔기의 뇌하수체 호르몬이다. 대안적 스플라이싱 (alternative splicing) 에 의해 유도되는 대안적 20kDa 산물이 또한 확인되며, 22kDa 형태와 비교하여 일부 변형된 특성을 갖는다 [Wada, M. 등 (1997) Mol. Cell Endocrinol. 133: 99-107]. 22kDa 단백질은 대장균[Goeddel, D. 등 (1979) Nature 281: 544-548], 고초균 [Honjo, J. 등 (1987) J. Biotech 6: 191-204], 효모 [Hiramatsu, R. 등 (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57: 2052-2056] 및 동물 세포 [Lupker, J. 등 (1983) Gene 24: 281-287] 를 포함하는 여러 숙주 유기체에서 재조합 기법을 이용하여 제조되었다. hGH 의 약학 제조물은 뇌하수체성 소인증 (pituitary dwarfism), 소아 만성 신부전 (paediatric chronic renal failure) 및 유사 적응증의 치료를 위해 사용된다. 성장을 촉진하는 그 능력에 부가하여, 본 단백질은 대식세포 활성화 및 인슐린 유사 효과를 포함하는 여러 생물학적 활성을 갖는다 [Chawler, R. (1993) Ann. Rev. Med. 34: 519; Edwards, C. 등 (1988) Science 239: 769].

본 발명은 인간 성장 호르몬 (hGH) 에 관한 것으로, 1 글자 코드로 나타낸 분비형 hGH 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다:

FPTIPLSRLFQNAMLRAHRLHQLAFDTYEEFEEAYIPKEQKYSFLQAPQASLCFSESIPTPSNRE

QAQQKSNLQLLRISLLLIQSWLEPVGFLRSVFANSLVYGASDSDVYDLLKDLEEGIQTLMGRLED

GSPRTGQAFKQTYAKFDANSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

특히 본 발명의 목적은, 잠재적 T 세포 에피토프의 수를 감소시켜 면역 특징이 개질된 개질 hGH 단백질을 제공하는 것이다.

다른 연구자들이 개질 hGH 를 포함하는 hGH 분자 및 그 재조합 생산, 정제 및 치료적 용도를 위한 계획을 제공하였지만 [EP 0107890, US 4,517,181, EP 0105759; US 4,703,035; US 4,658,021; EP 0022242; EP 0001929; EP 0001939; US 4,342,832; US 4,601,980; US 4,604,359; US 4,634,677; US 4,898,830; US5,424,119; US 4,366,246; US 4,425,437; US 4,431,739; US 4,563,424; US 4,571,421; EP 0131843; EP 0319049; US 4,831,120; US 4,871,835; US 4,997,916; US 5,612,315; US 5,633,352; US 5,618,697; US 5,635,604; EP 0127658; EP 0217814; US 5,898,030; EP 0804223], 그러나 이들 교시는 단백질의 면역원성 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하였고, 본 발명의 계획에 따른 특이적이고 조절되는 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 미칠 것을 계획하지 못하였다. 이와 관련된 예는, hGH 수용체에 대해 대략 400 배 증가된 결합 친화도를 나타내는 hGH 변이체의 생성에 있어 파지 디스플레이 (phage display) 를 사용한 Lowman 및 Wells [Lowman H.B. & Wells J.A. (1993) J. Mol. Biol. 243: 564-578] 에 의해 제공된다. 이러한 고친화도 변이체는 15 개 아미노산 치환을 포함하지만, 신규 변이체 분자의 면역학적 특성에 대한 고려는 수행되지 않았다.

그러나, 본원에서 하기에 최초로 개시되는 바와 같이, 본 발명자들은 고친화도 변이체에서 상기 15 개 치환 중에, 7 개 (위치 10, 14, 42, 45, 54, 176 및 179 에서의 것들) 가 본 발명의 계획에 따라 면역학적 이점을 제공할 것으로 추정될 수 있음을 발견하였다.

인간 대상체에서 면역 반응을 유도할 잠재성이 감소되거나 없는 hGH 를 제공하는 것이 크게 요구된다.

본 발명은 특히 인간에게 투여될, 특히 치료적 용도를 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 개질 폴리펩티드이며, 여기서 개질은 인간 대상체에 투여시 면역 반응을 일으키는 폴리펩티드의 특성을 감소시킨다. 본 발명은 특히 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 인간 성장 호르몬 단백질을 만드는 인간 성장 호르몬의 개질에 관한 것이다.

본 발명의 개요 및 설명

본 발명은 hGH 의 개질형을 제공하며, 여기서 면역 특징은 잠재적인 T 세포에피토프의 수를 감소시키거나 제거시켜 개질된다.

본 발명은 MHC 클래스 II 결합 가능성에 의해 잠재적인 T 세포 에피토프인 hGH 일차 서열에서 동정된 서열을 개시하고 있다. 이 개시에는 구체적으로 191 개 아미노산 잔기를 포함하는 본원에서 상기에 나타낸 인간 hGH 단백질 서열이 포함된다.

본 발명은 인간에서 면역원성인 hGH 일차 서열의 주요 영역이 개시되며, 이로 인해 상기 부위의 면역원성 효과를 제거하거나 감소시키기 위한 서열의 개질을 수행하는데 필요한 결정적 정보가 제공된다.

하나의 구현예에 있어서, 면역원성 영역을 포함하는 합성 펩티드는 전체 분자에 대한 관용 반응을 촉진시키기 위한 목적으로 약학 조성물 중에 제공될 수 있다.

추가적 구현예에 있어서, 본원에 개시되는 에피토프 영역 내에서 개질된 hGH 분자는 약학 조성물 중에 사용될 수 있다.

요약하면, 본 발명은 하기 문제들에 관한 것이다:

ㆍ생체 내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, hGH 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자;

ㆍ상기 면역원성의 손실이 본래 비개질 분자에서 유래되는 1 개 이상의 T 세포 에피토프를 제거하여 얻어지는 특정 분자;

ㆍ상기 면역원성의 손실이 상기 분자에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있는MHC 동종이형의 수를 감소시켜 얻어지는 특정 분자;

ㆍ1 개의 T 세포 에피토프가 제거된 특정 분자;

ㆍ상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상의 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 이에 결합할 수 있는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 특정 분자;

ㆍ상기 펩티드 서열이 표 1 에 나타낸 군으로부터 선택되는 특정 분자;

ㆍ임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1-9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 개의 아미노산 잔기가 변형된 특정 분자;

ㆍ아미노산 잔기의 변형이 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 특정 위치(들)에서의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 치환, 부가 또는 결실인 특정 분자;

ㆍ1 개 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행되는 특정 분자;

ㆍ(부가적으로) 1 개 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 3 에 나타낸 바와 같이, 상기 분자 유래의 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키기 위해 수행되는 특정 분자;

ㆍ필요하다면, 통상적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의한 부가적 추가 변형이 상기 분자의 생물학적 활성의 복구를 위해 수행되는 특정 분자;

ㆍ1 개 이상의 아미노산 치환이 표 2 또는 표 3 에 나타낸 임의의 아미노산에 해당하는 위치에서 수행되는 특정 hGH 분자;

ㆍ1 개 이상의 아미노산 치환이 표 2 또는 표 3 에 나타낸 임의의 아미노산에 해당하는 위치에서 수행되지만 기능적 단백질과 양립될 수 없는 것으로 hGH 유전적 돌연변이 기록에 알려진 임의 치환은 배제되는 특정 hGH 분자;

ㆍ임의의 상기 펩티드 또는 MHC 클래스 II 로의 결합 활성을 갖는 상기 개질 펩티드를 포함하는 약학 조성물;

ㆍ상기 및 하기 정의된 바와 같은 임의의 상기 특정 개질 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;

ㆍ상기 및/또는 청구항에서 정의된 바와 같은 hGH 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자와, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학 조성물;

ㆍ하기 단계를 포함하는 상기 언급된 청구항 중 임의 청구항에서 정의된 바와 같은 hGH 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법: (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열 결정; (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정; (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안; (iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가; 및 (v) 임의로 단계 (ii) - (iv) 의 반복;

ㆍ단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프에서 1-9 개 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 특정 방법;

ㆍ상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 변형이 수행되는 특정 방법;

ㆍ상기 단계 (ii) 가 하기 단계들에 의해 수행되는 특정 방법: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 소정의 균일 크기를 갖는, 겹치는 아미노산 잔기 절편의 순차적 샘플링; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값의 합산에 의한, 각각의 상기 샘플링된 절편의 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어 계산; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료적 효용성을 실질적으로 감소시키기 않으면서 펩티드의 전체적 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한 개질에 적합한 1 개 이상의 상기 절편의 동정 (단계 (c) 는 바람직하게는 하기에 의해, 12-6 반 데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 입체구조 에너지 항목을 포함하도록 개질된 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 수행된다: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스의 제공; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스의 제공; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델 선택; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격의 선택; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정;(6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도값 결정; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5) 를 반복);

ㆍ표 1 에 나타낸 바와 같은 군으로부터 선택되고, 비개질된 hGH 로부터 생성되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는, 13머 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드, 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 hGH 의 제조를 위한 그의 용도;

ㆍ상기 명시된 바와 같은 13머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상 연속 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 hGH 의 제조를 위한 그의 용도;

ㆍ인간 hGH 의 면역원성 영역(들)을 맵핑하기 위한 생물학적 T 세포 분석에서의 합성 펩티드 패널의 이용;

ㆍ시험관 내에서 최소 면역원성을 나타내는 변이체를 선택하기 위한 생물학적 T 세포 분석에서의 hGH 단백질 변이체 패널의 이용;

ㆍ시험관 내에서 최소 면역원성을 나타내는 펩티드 서열을 선택하기 위한 생물학적 T 세포 분석에서의 합성 펩티드 변이체 패널의 이용;

ㆍ나이브 (naive) T 세포 분석에서 2.0 미만, 바람직하게는 1.8 미만의 자극 지수 (stimulation index) 를 나타내는 단백질 변이체를 선택하기 위한 T 세포 자극의 생물학적 분석의 이용;

ㆍ건강한 공여자로부터 단리된 PBMC 를 이용한 hGH 단백질의 T 세포 에피토프 맵의 구축 및 하기를 포함하는 단계가 관여하는 스크리닝 방법:

i) 7 일까지의 배양 기간 동안 합성 펩티드 또는 전체 단백질 면역원을 이용한 시험관 내 항원 초회감작 (priming); ii) IL-2 의 첨가 및 3 일까지의 배양; iii) 자가유래의 조사된 (irradiated) PBMC 로의 초회감작 T 세포의 첨가 및 4 일의 추가 배양 기간 동안 항원으로의 재감작 및 iv) 임의의 적합한 방법에 의한 증식 지수의 측정;

ㆍ나이브 T 세포 분석에서 1.8 초과, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 일으킬 수 있는 hGH 유래 펩티드 서열;

ㆍ펩티드가 최소 정도로 개질되고 나이브 T 세포 분석에서 평가되어 2.0 미만의 자극 지수를 갖는 것으로 발견되는, 나이브 T 세포 분석에서 1.8 초과, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 갖는 hGH 유래 펩티드 서열;

ㆍ야생형 단백질 서열과 100% 아미노산 동일성을 공유하고, T 세포 분석에서 1.8 이상, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 일으킬 수 있는 hGH 유래 펩티드 서열;

ㆍ야생형 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 포함하도록 개질되고, T 세포 분석에서 평가되는 경우 2.0 미만의 자극 지수를 일으키는 특정 hGH 펩티드 서열;

ㆍ개별적으로 평가되는 경우, T 세포 분석에서 2.0 미만의 자극 지수를 일으키는 개질 펩티드 서열을 포함하는 hGH 분자;

ㆍT 세포 분석에서 평가되는 경우, 비개질 단백질 분자와 비교하여 감소된 자극 지수를 일으키는 개질을 포함하는 hGH 분자;

ㆍ면역원성 영역이 T 세포 분석을 이용하여 맵핑된 후, T 세포 분석에서의 재평가 시에 개질 단백질이 부모 (비개질) 분자보다 더 작은, 가장 바람직하게는 2.0 미만의 자극 지수를 일으키도록 개질된 hGH 분자.

"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따르면 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 복합체로 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 이를 활성화시키는지 측정할 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다.

본원 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 생성 아미노산이 있으며, 이들의 임의 수를 임의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 생성 아미노산은 모두 L-배좌를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 배좌의 아미노산의 다양한 조합을 이용하여, 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때때로 "올리고펩티드" 로 불린다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 포함하며, "폴리펩티드" 로 불린다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있고, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 임의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 및 이에 따른 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.

"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬인 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 구조와 비교하여 매우 상당히 다양할 수 있는 물리적 구조를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 포함할 수 있는 Cα에 대한 돌출기이다.

본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 임의의 hGH 분자종에 적용될 수 있고, 따라서 유전 공학적 수단 또는 기타 방법에 의해 유도된 hGH 분자를 포함할 것이며, 191 개 전후의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 여러 펩티드 서열은 비인간 유래의 hGH 단백질에서 유래된 펩티드 서열과 공통점을 갖거나, 비인간 hGH 단백질에서와 적어도 실질적으로 동일하다. 따라서, 상기 단백질 서열이 동등하게 본 발명의 범위 내에 속한다.

본 발명은 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체를 생성시키는 면역 반응을 유도할 수 있는, 치료적 목적으로 인간에게 도입되는 가용성 단백질의 실제 현실을 극복하기 위한 것으로 간주된다. 본 발명은 인간 숙주에게 투여 시 면역 반응을 일으키는 성향이 변형된 hGH 단백질을 제공함으로써 이를 해결하고자 한다.본원에 기재된 방법에 따라, 본 발명자들은 상기 단백질에 대한 면역 반응을 일으키는데 결정적인 T 세포 에피토프를 포함하는 hGH 분자 영역을 발견하였다.

개질 hGH 를 만드는 본 발명의 일반적 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열 결정;

(b) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;

(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안. 상기 서열 변이체는, 서열 변이체에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 다시 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성된다; 및

(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가.

단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 당분야에서 이전에 설명된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 대한 hGH-유래 펩티드의 결합 성향을 확인하는데 사용될 수 있다.

계산에 의한 T 세포 에피토프 동정을 위해 또다른 매우 효과적인 방법은 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예 1 에 기재되어 있다.

인간 hGH 단백질 서열을 포함하는 상기 계획의 단계 (b) 에 따른 분석 결과를 표 1 에 나타낸다.

펩티드는 13머이고, 아미노산은 1 글자 코드를 이용하여 확인된다.

상기 계획의 단계 (c) 및 (d) 에 따른, 본 발명의 개질 분자에 관련된 구축물 및 고안의 결과를 표 2 및 3 에 나타낸다.

T 세포 에피토프를 검출하기 위한 추가의 기술적 접근법은 생물학적 T 세포 분석을 통한 것이다. hGH 분자 내 T 세포 에피토프의 검출을 위해 특히 효과적은 방법은 시험관 내에서 배양된 인간 T 세포에서의 증식 반응을 일으키는 이들의 능력에 대해 표 1 에서의 모든 또는 임의의 펩티드 서열을 평가하는 것일 것이다. 바람직한 방법은 결과적으로, 개인들에서 유전적 결손의 성질로 인한 hGH 단백질 항원이 외부 단백질을 구성할 수 있는 개인들로부터의 말초 혈액 단구 세포 (PBMC) 를 개발하기 위한 것일 것이다. 이러한 관점에서, 상기 단백질은 생체 내에서 잠재적으로 항원을 나타낼 수 있을 것이다. 이는 IL-2 의 존재 하에서의 즉각적 증식이 수반되는 시험관 내 항원 (hGH) 을 수회 자극시킨 T 세포를 이용하여 달성될 수 있다. 폴리클론 T 세포주를 확립하기 위해, 일반적으로 2-3 회 항원 자극이 다수의 항원 특정 세포를 생성하는데 충분하다. 이들은 큰 수의 합성 펩티드 (예를 들어 펩티드 풀의 형태인 것들) 를 스크리닝하는데 사용되며, 이들은 차후 사용되기 위해 동결 보관될 수 있다. 7 일 동안 hGH 항원 및 PBMC 의 공동 인큐베이션을 포함하는 초회 항원 자극 후, 항원 제시 세포로서 가장 바람직하게는 자가유래의 조사된 PBMC 의 존재 하에 항원으로의 후속 재감작이 수행된다. 이러한 항원 선택은 3-4 일 동안 수행되며, 9 일 경의 전체 기간 동안 매 3 일 마다 첨가될 수 있는 IL-2 로의 자극을 포함하는 증식상에 의해 변화된다. 최종적인 재감작은 4 일 경에 IL-2 자극되지 않은 T 세포인 "휴면 (rested)" T 세포를 이용하여 수행된다. 상기 세포를 4 일 경에 앞에서와 같이 가장 바람직하게는 자가유래의 항원 제시 세포를 이용하여 항원 (예컨대 합성 펩티드 또는 전체 단백질) 으로 자극하고, 이후에 후속 증식 반응 (만약 있다면) 을 측정한다. 증식 반응은 임의의 편리한 수단 및 널리 공지된 반응, 예를 들어³H-티미딘 혼입 분석을 이용할 수 있는 방법으로 측정할 수 있다.

본원에 구현된 방법에 따라, 상기에는 hGH 로의 치료적 대체 요법이 이전에 개시되어, 대체 요법으로 치료적 단백질에 대한 면역 반응이 유도된 개인으로부터 채취된 PBMC 표본에서 유래된 올리고클론 배양물 또는 T 세포주의 생산이 포함된다. 상기 개인으로부터의 세포주 또는 배양물은 합성 펩티드 또는 전체 단백질 제조물과 접촉되어, 임의의 시험관 내 증식 효과가 측정된다. 임의의 개별 합성 펩티드 또는 단백질에 있어서, 변이체가 생성되어 T 세포주 또는 배양물에서 유의미한 증식 반응을 촉진시키는 지속적 능력에 대해 재평가될 수 있다. 따라서, 예를 들어 표 2 또는 표 3 에 동정된 임의의 치환 또는 치환의 조합을 포함하는 합성 펩티드가 상기 분석에서 평가될 수 있다.

상기 계획 하에, 상당수의 상기 개인들의 T 세포 목록에 의해 정의된 hGH 단백질의 에피토프 맵이 생체 내 상황 하에 제시될 수 있는 가장 유력한 펩티드 에피토프의 대표물일 수 있음을 추정할 수 있다. 이와 관련하여, 이전에 면역 반응을 나타낸 환자로부터의 PBMC 는 생체 내 초회감작 단계의 산물을 포함하며, 상기 개인들로부터의 PBMC 세포주의 사용은 원칙적으로 면역학적인 시험관 내 연상 분석을 제공하고, 또한 임의의 주어진 자극 펩티드 또는 단백질에 대해 훨씬 더 큰 강도의 증식 반응의 가능성이 있다는 실질적 이점을 제공한다. 이는 증식 측정을수행하기 위한 기술적 어려움을 감소시키며, 이러한 상황 하에 다중 MHC 클래스 II 펩티드 리간드, 따라서 다중 또는 복합 (즉 겹치는) T 세포 에피토프를 보유하는 것으로 본원에서 컴퓨터를 이용하여 설명된 hGH 의 경우에서와 같이, 가능한 면역지배적 에피토프의 가능한 체계가 정의될 수 있다.

이전의 치료적 hGH 대체 요법으로 hGH 에 대한 면역 반응이 유도된 개인들로부터 올리고클론 배양물의 T 세포주를 구축하는 것이 특히 유용하지만, 이들이 생체 내에서 관련된 면역원성 에피토프를 맵핑하는데 사용될 수 있는 유일한 세포원은 아니다. 건강한 공여자로부터 채취한 나이브 T 세포 분석도 동일하게 사용할 수 있지만, 이러한 경우 임의의 개별 펩티드에 대해 스코어링된 자극 지수의 크기가 배경으로부터 펩티드 또는 단백질 유도 자극을 식별하기 위해 민감한 측정을 필요로 할 정도로 낮을 수 있다. 본 발명자들은 널리 공지된 기법을 이용하는 상기 분석 공정에서, 2.0 이상인 자극 지수가 유도 증식의 측정에 유용함을 확립하였으며, 자극 지수는 시험 (폴리)펩티드에 대해 측정된 증식 스코어 (예컨대³H-티미딘 혼입을 이용하는 경우 분당 카운트) 를 시험 (폴리)펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정되는 증식 스코어로 나누어 얻어진다. 이러한 유형의 적합한 방법을 실시예 2 에 상세히 설명한다.

다중 잠재적 에피토프가 동정되고 특히 여러 펩티드 서열이 생물학적 분석에서 T 세포를 자극할 수 있는 것으로 나타나는 경우, MHC 클래스 II 제시 기전을 통해 면역 반응을 일으키는 그 성향에 대한 단백질의 구조적 특징도 인식될 수 있다.예를 들어 관심 단백질의 결정 구조가 공지된 경우, 단백질 내 구조적 장애의 증거에 대해 생물학적으로 관련된 면역지배적 펩티드 에피토프에 대한 근접성과의 연관성을 제시하는 파라미터인 결정학적 B 인자 스코어가 분석될 수 있다 [Dai G. 등 (2001) J. Biological Chem. 276: 41913-41920]. 상기 분석은 hGH 결정 구조 [PDB ID:1 HGU Chantalat, L. 등 (1995), Protein And Peptide Letters 2:333 & PDB ID 1A22 Clackson, T. 등 (1998), J. Mol. Biol. 277: 1111] 상에서 수행되는 경우, 수용체 비결합 구조 [PDB ID 1HGU] 내에 상기 평균 B 인자 스코어를 초과하는 7 개 이상의 피크를 가지며 다중 면역지배적 에피토프에 대한 높은 가능성을 시사한다. 상기 분석은 생물학적으로 관련된 T 세포 에피토프가 글루타민 잔기 41 하류의 hGH 서열 영역까지 맵핑됨을 제시한다. 따라서, 본 발명의 계획 하에, 표 2 및 표 3 에 기재된 아미노산 치환 중에서, 가장 바람직한 치환에는 잔기 번호 42-180 내에 포함되는 잔기에 대한 것들이 포함된다.

실제로 여러 변이체 hGH 단백질이 제조되어 목적하는 면역 및 기능적 특징에 대해 평가될 것이다. 분자의 기능성 특징을 변형시키는 것으로 공지된 공개 문헌에서의 돌연변이 [Lowman H.B. & Wells J.A. (1993) J. Mol. Biol. 243: 564-578; Wells J.A. 등 (1993) Recent Prog. Horm. Res. 48: 253-275] 를 참조할 수 있고, 단백질 기능에 해로운 것으로 또한 알려진 표 2 및 표 3 에 기재된 치환들이 분석에서 배제되거나 이와는 달리 단백질의 기능적 활성을 복구시키기 위해 보상 돌연변이가 수행될 수 있다. 모든 경우, 변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술의 널리 공지된 방법에 의해 제조될 것이지만, hGH 단편의 화학적합성을 포함하는 기타 절차도 포함될 수 있다. 본 발명은 1 개 이상의 아미노산 잔기의 치환이 단백질로부터 1 개 이상의 잠재적 T 세포 에피토프의 제거 또는 활성의 실질적 감소를 일으키는 위치에서 수행되는 hGH 유사체에 관한 것이다. 부모 분자의 가장 면역원성인 영역 내에서 아미노산 개질 (예컨대 치환) 이 수행된 hGH 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 주로 바람직한 구현예에는 임의의 MHC 클래스 II 리간드가 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키거나 결합을 제거시키도록 변형된 hGH 분자가 포함된다.

T 세포 에피토프를 제거하기 위해, T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거시킬 것으로 추정되는 펩티드 서열 내의 적절한 지점에서의 아미노산 치환이 바람직하다. 실제로, 적절한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공되는 1 개의 포켓 내에 결합하는 아미노산 잔기와 동일할 것이다.

펩티드의 소위 P1 에서의 틀 또는 P1 고정 위치의 제 1 포켓 내의 결합을 변형시키는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기 및 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은 전체 펩티드의 전체적 결합 친화도의 주요 결정기로 인식된다. 펩티드의 상기 위치에서의 적절한 치환은 포켓 내에서 덜 순응되는 잔기에 대한 것으로, 예를 들어 보다 친수성 잔기로의 치환일 것이다. MHC 결합 틈 내의 다른 포켓 영역 내에서의 결합에 상응하는 위치에서의 펩티드의 아미노산 잔기도 또한 고려되며, 본 발명의 범위 내에 속한다.

주어진 잠재적 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로로 이해된다. 단일 에피토프 내 치환의 조합이 포함될 수 있고, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 겹치는 경우 특히 적절할 수 있다. 또한, 주어진 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일 에피토프 내에서 조합된 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브에 대해 "포켓 잔기" 에 해당하지 않는 위치가 아니라 펩티드 서열 내의 임의 위치에서도 수행될 수 있다. 치환은 상동성 구조 또는 당 분야에 공지된 컴퓨터 이용 기술을 사용하여 생성되는 구조적 방법을 참조하여 수행될 수 있고, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징에 근거할 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위 내에 속한다.

본원에서 동정된 펩티드 밖에서의 아미노산 치환은 특히, 기재된 펩티드 내에서 수행되는 치환(들)과 조합으로 수행되는 경우 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 복구시키기 위한 변화가 포함될 수 있다. 상기 보상적 변화들에는, 본 발명의 범위 내에 속하는 임의의 개시된 펩티드의 변화와 조합되어, 목적하는 활성을 갖는 변이체가 수득되는 hGH 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가가 포함된다.

본 발명이 개질 hGH 에 관한 것인 한, 상기 개질 hGH 단백질 또는 개질 hGH 단백질의 단편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 hGH 물질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 hGH 단백질을 이용한 인간의 치료적 처치 방법에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열과 서열 동일성 또는 부분동일성을 갖는 펩티드 또는 유도체 분자를 포함하는 약학 제제를 이용한 치료적 처치 방법에 관한 것이다.

실시예 1

단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 중의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조로, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 기를 포함하는 임의의 유기 화합물군이다.

인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:

O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 코너에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.

폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배좌를 정의하는데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배좌에 대해 상기 원자의 평면성이 약간 일탈될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배좌, 즉 주위 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 2 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φ₁, ψ₁(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인식에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참고.

본 발명의 방법은 임의 단백질에 적용될 수 있으며, 부분적으로 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 순응될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956(1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 순응될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 순응될 수 있도록, 순응될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).

본 발명을 구현하는 컴퓨터적인 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:

(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 약 2 배의 값, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값 2 및 방향족 측쇄에 대한 값 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이인 각각의 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 절편의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를각각의 샘플링된 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 절편 (윈도우) 에 존재하는 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에서 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.

본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 가능성을 갖는다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 예측에는 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물 각각에 대해 각 모델로의 각각의 골격 잔교 (dock) 에 대한 아미노산 측쇄 배좌의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 배좌, 및 상기 상호작용의 결합 스코어 일탈을 선택하기 위한 스코어링 기능을 갖는 상기 골격 및 측쇄 배좌 라이브러리의 용도가 포함된다.

MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 력 필드 (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815) 를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용될 수 있다.

본 발명의 방법은 MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 각각의 아미노산 대안물의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적인 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995) 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후, 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해 상기 포켓 라이브러리의 포켓 유형을 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 컴퓨터적인 방법 (Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 과 매우 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법은 또한 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경우 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대립유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수가 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수 있다.

골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자와 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치 변화를 허용한다. 이는 다시, 특정 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 이전의 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배좌의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.

최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 수반되는 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 수반되는 아미드 평면은 각각의 상기 Cα상에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 수반되는 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 수반되는 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다.

이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 수반되는 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지 각각의 수반되는 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.

생성되는 골격의 수는 여러 요인에 근거한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 수반되는 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 순응될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성시킨다.

MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배좌로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 근거한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 배치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배좌 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 배좌 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배좌의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.

상술된 골격/측쇄 배좌의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배좌와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체성 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배좌에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 스코어링 함수를 이용하여 펩티드 스코어를 유도한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 결합 친화도 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지20 개 아미노산 길이의 선택된 아미노산 연장물이다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. 골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배좌를 허용되는 배좌의 데이타베이스로부터 선택한다. 적절한 원자 정체성 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재평가하여, 결합 친화도를 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.

펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다.

수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소,또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자가 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될 때 가장 강하다.

정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 및 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.

친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.

반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.

하나의 구현예에서, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화도를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는 단백질에 대한 리간드의 결합 친화도를 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항목이 공식에 부가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항목에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지가 추정된다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 개질 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 개질 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔG_bind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 손실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG₀); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 기여 (ΔG_hb); 비교란 (unperturbed) 이온 상호작용의 기여 (ΔG_ionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔG_lipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 손실 (ΔG_rot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (E_VdW). 상기 항목을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:

[수학식 1]

(ΔG_bind) = (ΔG₀) + (ΔG_hb×N_hb) + (ΔG_ionic×N_ionic) + (ΔG_lipo×N_lipo) + (ΔG_rot+ N_rot) + (E_VdW).

여기서, N 은 특정 항목에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의구현예에서, ΔG₀, ΔG_hb, ΔG_ionic, ΔG_lipo및 ΔG_rot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 각각 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.

항목 N_hb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:

[수학식 2]

N_hb= Σ_h-bondsf (ΔR, Δα) × f (N_neighb) × f_pcs

f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황에 대한 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:

[수학식 3]

f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)

여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나

ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나

ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,

또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나

Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나

Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.

TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이다.

ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.

Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠_N/O-H..O/N의 편차이다.

f(N_neighb) 는 단백질 표면의 오목 및 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:

[수학식 4]

f(N_neighb) = (N_neighb/N_neighb,0)^α(여기서 α = 0.5 임).

N_neighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.

N_neighb.0는 상수 = 25 이다.

f_pcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:

A_polar/N_HB< 10Å²인 경우 f_pcs= β이거나

A_polar/N_HB> 10Å²인 경우 f_pcs= 1 이다.

A_polar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.

N_HB는 수소 결합의 수이다.

β는 그 값이 1.2 인 상수이다.

개질 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용의 기여로부터,동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, ΔG_ionic이 상술된 수소 결합에서와 유사한 방식으로 계산된다.

항목 N_lipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:

[수학식 5]

N_lipo= Σ_1Lf(r_1L[t1])

f(r_1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준으로 계산된다:

r_1L≤ Rl 인 경우 f(r_1L) =1,

R2 < r_lL> R1 인 경우 f(r_1L) = (r_1L-R1)/(R2-R1),

r_1L≥ R2 인 경우 f(r_1L) = 0

여기서, R1 = r_l ^vdw+ r_L ^vdw+ 0.5 이고

R2 = R1 + 3.0 이고

r_l ^vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고

r_L ^vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.

항목 N_rot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp³-sp³및sp³-sp²결합의 수로 고려된다. 말단 -CH₃또는 -NH₃의 회전은 고려되지 않는다.

최종 항목 E_VdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:

[수학식 6]

E_VdW= ε₁ε₂((r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)¹²/r¹²- (r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)⁶/r⁶).

여기서, ε₁및 ε₂는 원자 정체성에 근거하는 상수이며,

r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw는 반 데르 발스 원자 반경이고,

r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.

수학식 6 에 대해, 하나의 구현예에서, 상수 ε₁및 ε₂는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.

상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정에 대해서 목적하는 결과를 주는 임의의 적합한 수치값으로 변화될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다.

상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배좌, 원자 정체성 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 계수적 성질이, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배좌 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 데이타가 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다.

본 발명의 예측 방법은 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 실험적으로 미리 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프가 정확히 예측될 수 있는 것으로 공지된 상기 한계값이 결정될 수 있다.

상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하기 위한 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 상대적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 선택된 역치값을 초과하는 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 회 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 성질로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다. 당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적 방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다.

복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 처리 시간의 한계는 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 수 있음을 예견할 수 있다.

폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

실시예 2

합성 펩티드를 이용한 나이브 T 세포 분석 방법

MHC, 펩티드 및 T 세포 수용체 (TCR) 간의 상호작용은 T 세포 인지의 항원 특이성에 대한 구조적 근거를 제공한다. T 세포 증식 분석은 MHC 로의 펩티드 결합 및 TCR 에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인지를 평가한다. 본 실시예의 시험관 내 T 세포 증식 분석은 항원 제시 세포 (APCs) 및 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단구 세포 (PBMCs) 의 자극이 관여되었다. 자극은 시험관 내에서 합성 펩티드 항원을, 그리고 일부 실험에서는 전체 단백질 항원을 이용하여 수행되었다. 자극된 T 세포 증식은³H-티미딘 (³H-Thy) 을 이용하여 측정되었으며, 혼입된³H-Thy 의 존재는 세척된 고정 세포의 신틸레이션 카운팅을 이용하여 평가되었다.

12 시간 미만 동안 보관된 인간 혈액 연막 (buffy coat) 은 National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK) 에서 입수하였다. 피콜-페이크 (Ficoll-paque) 는 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, UK) 에서 입수하였다. L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖ 겐토마이신 및 0.1% 인간 혈청 알부민을 함유하는 일차 인간 임파구 배양용 무혈청 AIM V 배지는 Gibco-BRL (Paisley, UK) 에서 입수하였다. 합성 펩티드는 Pepscan (The Netherlands) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK) 에서 입수하였다.

연막을 가볍게 원심분리하여 적혈구 및 백혈구를 혈장 및 혈소판과 분리하였다. 최상층 (혈장 및 혈소판 함유) 을 제거하여 버렸다. 적혈구 및 백혈구를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 1:1 로 희석하고, 15 ㎖ 피콜-페이크 (Amersham Pharmacia, Amersham UK) 상에 적층하였다. 제조자가 추천하는 조건에 따라 원심분리를 수행하고, 혈청+PBS/피콜 페이트 중간층에서 PBMC 를 회수하였다. PBMC 를 PBS 와 혼합하고 (1:1), 원심분리로 수집하였다. 상청액을 제거하여 버리고, PBMC 펠렛을 50 ㎖ PBS 중에 재현탁하였다. 세포를 다시 원심분리로 펠렛화시킨 후 PBS 상청액을 버렸다. 50 ㎖ AIM V 배지를 이용하여 세포를 재현탁하고, 이 시점에서 계수하고, 트립판 블루 염료 배제를 이용한 생활성 (viability) 을 평가하였다. 세포를 다시 원심분리에 의해 수집하여 상청액을버렸다. 세포를 ㎖ 당 3 ×10⁷개 밀도로 동결 보관을 위해 재현탁하였다. 보관 배지는 90% (v/v) 열 불활성화 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, UK) 및 10% (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) 이었다. 세포를 조절되는 냉동 용기 (Sigma) 로 옮기고, 장기 보관을 위해 액체 N₂로 옮기기 전에 하룻밤 동안 -70℃ 에 놓아 두었다. 사용이 필요한 경우, 세포를 37℃ 수조에서 신속히 해동시킨 후 10 ㎖ 의 사전가온된 AIM V 배지로 옮겼다.

웰 당 2 ×10⁵PBMC 밀도로, 96 웰 평편 바닥 플레이트에서 PBMC 를 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다. PBMC 를 37℃ 에서 7 일 동안 인큐베이션 후³H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK) 펄스를 주었다. 본 연구를 위해, 표 1 의 임의 또는 전체 펩티드 또는 hGH 의 전체 서열에 속하는, 3 개 아미노산이 앞에 증가된 합성 펩티드 (15 머) 를 제조하거나, 표 2 또는 표 3 에 설명된 치환을 포함하는 펩티드를 제조하여 이용할 수 있었다.

각각의 펩티드를 20 명의 나이브 공여자에서 단리된 PBMC 에 대해 3 회씩 각각 스크리닝하였다. 이전에 면역원성인 것으로 나타난 2 개의 대조 펩티드 및 강력한 비회상 (non-recall) 항원 KLH 를 각각의 공여자 분석에 사용하였다.

대조 항원은 하기와 같았다:

펩티드	서열
C-32	비오틴-PKYVKQNTLKLATFlu 헤마글루티닌 307-319
C-49	KVVDQIKKISKPVQH클라미디아 (Chlamydia) HSP 60 펩티드
KLH	키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin) 의 전체 단백질

펩티드를 DMSO 에 최종 10mM 농도로 용해시키고, 이어서 상기 스톡 용액을 1/500 으로 AIM V 배지 (최종 농도 20 μM) 에 희석하였다. 펩티드를 평편 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하여, 100 ㎕ 중 2 및 20 μM 의 최종 농도를 얻었다. 해동된 PBMC 의 생활성을 트립판 블루 염료 배제에 의해 평가하고, 이어서 세포를 2 ×10⁶개 세포/㎖ 밀도로 재현탁하여, 100 ㎕ (2 ×10⁵개 PBMC/웰) 을 펩티드를 포함하는 각각의 웰에 옮겼다. 각각의 펩티드 농도에 대해 3 개 웰 배양물을 평가하였다. 플레이트를 37℃ 에서 5% CO₂의 가습 분위기 중에 7 일 동안 인큐베이션하였다. 세포에 1 μCi³H-Thy/웰을 18-21 시간 동안 펄스한 후 필터 매트 상에 수확하였다. Wallac 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 카운터 (Perkin Elmer) 또는 유사 기기를 이용하여 CPM 값을 측정하였다. 결과를 하기 식을 이용하여 결정되는 자극 지수로 표현하였다:

(시험 펩티드에 대한 증식 CPM/비처리 웰에서의 증식 CPM)

상기 종류의 나이브 T 세포 분석을 위해, 2.0 초과의 자극 지수를 양성 스코어로 간주하였다. 동일한 시험 펩티드가 1 명 초과의 공여자 표본에서 2.0 초과의 증식 지수를 얻은 경우, 이를 면역지배적 에피토프일 가능성의 증거로서 간주하였다.

Claims

생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, 인간 성장 호르몬 (hGH) 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 면역원성의 손실이 본래의 비개질 분자로부터 유래된 1 개 이상의 T 세포 에피토프를 제거하여 얻어지는 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역원성의 손실이 상기 분자에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시켜 얻어지는 분자.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 1 개의 T 세포 에피토프가 제거된 분자.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상의 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 이에 결합할 수 있는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인 분자.
제 5 항에 있어서, 상기 펩티드 서열이 표 1 에 나타낸 군으로부터 선택되는 분자.
제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프의 1-9 개의 아미노산 잔기가 변형된 분자.
제 7 항에 있어서, 1 개의 아미노산 잔기가 변형된 분자.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실인 분자.
제 9 항에 있어서, 1 개 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
제 10 항에 있어서, 기능적 단백질과 비상용성인 hGH 유전적 돌연변이를 형성하는 것으로 공지된 치환은 배제되는 분자.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 분자에서 유래되는 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수 감소를 위해 부가적으로 1 개 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
제 9 항에 있어서, 1 개 이상의 아미노산 치환이 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
제 13 항에 있어서, 기능적 단백질과 양립될 수 없는 hGH 유전적 돌연변이를 형성하는 것으로 공지된 치환은 배제되는 분자.
제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 복귀시키기 위해 부가적으로 추가 변형이 수행되는 분자.
제 15 항에 있어서, 부가적 추가 변형이 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실인 분자.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형이 상동성 단백질 서열을 참조하여 수행되는 개질 분자.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형이 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 수행되는 개질 분자.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 분석에서 평가되는 경우, 해당 야생형 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 가지고, 2.0 미만의 자극 지수를 나타내는 개질 분자.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 분석에서 평가되는 경우, 비개질 단백질 분자에 비해 자극 지수가 감소되는 개질 분자.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 개질 인간 성장 호르몬 (hGH) 분자를 코딩하는 DNA 서열.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 인간 성장 호르몬 (hGH) 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자와, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학 조성물.
하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 인간 성장 호르몬 (hGH) 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법:

(i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열 결정;

(ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;

(iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 또는 펩티드-MHC 착물과 T 세포의 결합에 의해 측정된, 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중 1-9 개 아미노산 잔기가 치환, 부가 또는 결실에 의해 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안;

(iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가; 및

(v) 임의로 단계 (ii) - (iv) 의 반복.
제 23 항에 있어서, 단계 (ii) 가 하기 단계들에 의해 수행되는 방법:

(a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 소정의 균일 크기를 갖는, 겹치는 아미노산 잔기 절편의 순차적 샘플링; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값의 합산에 의한, 각각의 상기 샘플링된 절편의 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어 계산; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료적 효용성을 실질적으로 감소시키기 않으면서 펩티드의 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한 개질에 적합한 1 개 이상의 상기 절편의 동정.
제 24 항에 있어서, 단계 (c) 는 하기에 의해, 12-6 반 데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 배좌 에너지 항목을 포함하도록 개질된 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 수행되는 방법:

(1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스의 제공;

(2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스의 제공;

(3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델 선택;

(4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격의 선택;

(5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정;

(6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값의 결정;

및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5) 를 반복.
표 1 에 나타낸 바와 같은 군으로부터 선택된, 비개질 인간 성장 호르몬 (hGH) 으로부터 생성되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는, 13머 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드.
제 26 항에 따른 13 머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상 연속 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열.
T 세포 분석에서 평가되는 경우, 야생형 hGH 서열과 100% 의 아미노산 동일성을 공유하고, 2.0 초과의 자극 지수를 나타내는 9-15머 펩티드 서열.
생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 hGH 의 제조를 위한, 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 서열의 용도.
T 세포 분석에서 평가되는 경우, 해당 야생형 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 가지고, 비개질 hGH 분자와 비교하여 감소된 자극 지수 또는 적어도 2.0 미만의 자극 지수를 나타내는 hGH 의 제조를 위한, 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 서열의 용도.