KR20040039328A - 변형된 펙터 ⅸ - Google Patents

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KR20040039328A
KR20040039328A KR10-2004-7003227A KR20047003227A KR20040039328A KR 20040039328 A KR20040039328 A KR 20040039328A KR 20047003227 A KR20047003227 A KR 20047003227A KR 20040039328 A KR20040039328 A KR 20040039328A
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protein
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KR10-2004-7003227A
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카프랜시스제이
카터그레이엄
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 구체적으로 인간 펙터 IX의 변형에 관한 것으로 변형으로 인해서 생체내(in vivo)에서 사용될 경우, 임의의 상응하는 미변형된 단백질 보다 실질적으로 비면역원성이거나 또는 면역원성이 낮은 펙터 IX 단백질을 유도하는 인간 펙터 IX의 변형에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 면역원성이 있는, 인간 펙터 IX에서 유래된 T-세포 에피토프 서열들에 관련된다.

Description

변형된 펙터 Ⅸ {Modified Factor Ⅸ}
치료용 단백질에 대한 원치 않는 면역 반응으로 인해서 치료용 단백질의 효능이 제한되는 많은 경우가 있다. 몇 몇의 마우스 모노클로날 항체는 많은 인간의 질병 환경에서 치료법으로서 희망을 보여주었지만, 어떤 경우에는 심각한 정도의 인간 항뮤린 항체 (HAMA) 반응이 유도되어 실패하였다 [Schroff, R. W. 등 (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. 등(1985) J.Immunol. 135: 1530-1535]. 모노클로날 항체의 경우, HAMA 반응을 감소시키고자 많은 기술이 개발되어 왔다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이러한 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구축물(construct) 중에 마우스 유전 정보는 감소시키는 반면에 최종 구축물 중에 인간 유전 정보는 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화된" 항체는, 몇 몇의 경우에 있어서, 환자에게서 여전히 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. 등(1999) Transplantation 68: 1417-1420].
항체가 면역반응을 상승시킬 수 있는 치료제로서 투여되는 폴리펩티드 분자의 유일한 부류는 아니다. 인간에게서 나타나는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 인간 기원의 단백질조차도 인간에게서 여전히 면역반응을 유도할 수 있다. 그 중에서도 주목할만한 예로는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 [Wadhwa, M. 등 (1999)Clin. Cancer Res.5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등 (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등 (1988)New Engl. J. Med.318: 1409-1413]의 치료 용도가 포함된다. 이와 같이 인간 단백질이 면역원성을 갖는 경우에는, 면역관용(immunological tolerance)의 단절이 없었다면 이러한 개체에서 이러한 단백질들에 작용하였을, 추정되는 면역관용의 단절이 있다.
예를 들면 단백질의 체질적 결핍이 있는 유전병에서, 예컨대 혈우병 A, 혈우병 B, 고셔병 (Gauchers disease) 및 많은 다른 예와 같은 병의 경우에서 처럼 인간 단백질이 대체요법으로서 투여되는 경우는 상황이 다르다. 상기 경우에는 치료용 대체 단백질이 처음부터 외래(foreign)분자로서 면역적으로 기능을 할 수 있고, 치료제에 대한 면역반응이 상승될 수 있는 개인의 경우는 치료의 효능이 상당히 상쇄될 가능성이 많다. 단백질 치료제가 숙주의 면역시스템에 의해 이종분자로서 인식이 되는지에 관계없이, 또는 그 분자에 대해 존재하는 관용(tolerance)이 극복되었다면, 단백질에 대한 면역반응의 기전은 동일하다. 면역 반응 유도의 열쇠는,MHC 클래스 II 분자상의 제시를 통하여 T-세포의 활성을 자극할 수 있는, 단백질내의 펩티드, 소위 "T-세포 에피토프"의 존재이다. 상기 T-세포 에피토프는 통상적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로, "T-세포 에피토프" 는, MHC 분자에 결합될 경우, T-세포 수용체 (TCR)에 의해 인식될 수 있으며, 적어도 원칙적으로는, TCR로 하여금 T-세포 반응을 촉진하는데 관여하게 하여 상기 T-세포의 활성을 유발할 수 있는 에피토프를 의미한다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포 선별 및 활성화에 있어 중심적인 역할을 하는 상당히 다형성(polymorphic)인 단백질의 군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR)은 이러한 단백질군의 우세한 이소타입(isotype)이지만, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능들을 수행한다. 인간 집단에서, 각 개인은 두 개 내지 네 개의 DR 대립유전자, 두 개의 DQ와 두 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 많은 DR 분자의 구조가 해석되었으며 이러한 구조는 펩티드의 소수성 잔기(포켓 잔기)를 체결하는(engage) 많은 소수성 포켓을 갖는 개방 말단형(open-ended)의 펩티드 결합 그루브인 것으로 보인다 [Brown 등 Nature (1993) 364: 33; Stern 등 (1994) Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 알로타입을 규명하는 다형성은 펩티드 결합 그루브내의 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 광범위한 다양성(diversity)에 기여하고, 집단 수준에서 외래 단백질을 인식하며 병원성 유기체에 대한 면역반응을 상승시키는 능력과 관련해서 최대의 융통성을 보장한다.
치료용 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 이 과정에서 외부 단백질은 삼켜지고 DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 제시되기 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 전문적인 항원 제시 세포(APC), 그 중에서도 예컨대 대식세포와 수지상세포(dendritic cell)에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 일정한 다른 공동수용체의 교차 결합과 함께, T-세포 표면상에 있는, MHC 클래스 II 펩티드 복합체를 인식할 수 있는 동족의 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 체결(engagement)은 T-세포 내의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 사이토카인들의 방출로 이어지고 나아가 B-세포와 같은 다른 림프구의 항체 생산을 활성화시키거나 또는 전면적인 세포성 면역반응으로서 T-킬러 세포를 활성화시킨다.
T-세포 에피토프의 동정은 에피토프 제거를 위한 첫 단계이지만, 당업계에서 에피토프 동정과 제거가 하나의 절차로 통합된 수 개의 명백한 경우가 있다. 요컨대 WO98/52976 및 WO00/34317은 인간 MHC 클래스 II DR 알로타입의 서브세트에 결합할 잠재성이 있는 폴리펩티드 서열을 동정하는 컴퓨터적 스레딩(threading) 접근법을 제시한다. 상기 제시에서는, 예측된 T-세포 에피토프가 관심 있는 단백질 내에서의 신중한 아미노산 치환을 사용하여 제거된다. 그러나 에피토프 동정을 위한 상기 절차 및 컴퓨터에 기본을 둔 방법[Godkin, A.J. 등(1998) J. Immunol. 161: 850-858; Sturniolo, T. 등 (1999) Nat. Biotechnol. 17: 555-561]들도, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 것으로 예측된 펩티드가 처리 경로 또는 다른 현상으로 인해, 모든 경우에, 특히, 생체내에서 T-세포 에피토프로 기능하는 것은 아닐 수도 있다.
마찬가지로, 합성 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 능력을 측정하기 위한 생체외(in vitro)방법도, 예를 들면 MHC 클래스 II 결합 면의 출처(source)로서 정의된 MHC 알로타입의 B-세포주를 사용하는 방법도 MHC 클래스 II 리간드 동정에 적용될 수 있다 [Marshall K.W. 등(1994) J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan 등 (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. 등 (1997) J. Immunol. 159: 3238-3246]. 그러나 상기의 기술도 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 적합하지 않을 뿐만 아니라, 결합하는 펩티드가 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 능력을 확인할 수 있는 것도 아니다.
최근 합성 펩티드와 조합하여 가용성의 재조합 MHC 분자의 복합체를 이용한 기술이 사용되어오고 있다 [Kern, F. 등 (1998) Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. 등 (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. 상기의 시약과 방법들은, 인간 또는 실험동물 대상체로부터 채취한 말초 혈액시료에서 유래된, 특정한 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T-세포 클론의 존재를 동정하는데 사용되나, 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 적합하지 않다.
T-세포 활성화의 생물학적인 분석법은, 시험 펩티드/단백질 서열이 면역반응을 유발할 수 있는가의 능력에 관한 판단을 제공하는데 대한 실질적인 선택권을 제공한다. 이러한 종류의 접근의 예로는 박테리아 단백질인 스타필로키나제에 대한 T-세포 증식 분석법을 이용한 Petra 등의 연구, 뒤이어 T-세포주를 자극하기 위해합성펩티드를 이용한 에피토프 맵핑이 [Petra, A.M. 등 (2002) J. Immunol. 168: 155-161] 있다. 유사하게, 파상풍 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T-세포 증식 분석법으로 상기 독소의 면역우세한 에피토프 부위를 정의하게 되었다[Reece J.C. 등 (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. WO99/53038에서는, 분리된 인간 면역세포의 서브 세트를 이용하고, 생체외에서 이들 세포의 분화를 촉진하며 관심 있는 합성 펩티드의 존재 하에서 세포의 배양 및 배양된 T-세포에서 임의의 유발된 증식의 측정으로, 시험 단백질의 T-세포 에피토프를 결정할 수 있는 접근법에 대해 공개한다. 동일한 기술이 또한 Stickler 등 [Stickler, M.M. 등 (2000) J. Immunotherapy 23:654-660]에 의해서도 설명되는데, 양 경우 모두에 있어서 상기 방법은 박테리아의 서브틸리신 내의 T-세포 에피토프들의 검출에 적용된다. 이러한 기술은, 원하는 면역세포의 서브세트(수지상세포들 CD4+ 및 또는 CD8+ T-세포들)를 얻기 위해서 세포 분리 기술의 조심스러운 적용 및 다수의 시토카인 보충제를 넣은 세포배양이 요구되며 그리고 제공된 다수의 시료를 이용한 신속한 처리를 요구하는 스크리닝에는 도움이 되지 않는다.
상기 기술한 바대로 그리고 그것의 결과로서, 원칙적으로는 치료제로서 가치가 있으나 본래는 면역원성이 있는 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T-세포 에피토프들을 동정하고 제거하며 또는 적어도 감소시키는 것이 바람직하다. 이러한 잠재적으로 치료제로서 가치 있는 분자들 중의 하나가 인간 펙터 IX (이하 FIX로 약칭함)이며, 이는 인간의 혈액 응고 경로의 중요한 구성성분이다.
FIX는 칼슘이온, 포스포리피드 및 펙터 VIIIa의 존재하에 펙터 X을 활성 형태로 전환시킴으로서 내재하는 혈액 응고 경로에 참여하는 비타민 K 의존성의 혈장 단백질이다. FIX의 주된 촉매적 능력은 펙터 X내의 특정 알기닌-이소루이신 결합에 특이성을 갖는 세린 단백질 분해효소로 작용하는 것이다. FIX의 활성화는 FIX에서 활성펩티드를 잘라내어 하나 이상의 이황화 결합으로 연결된 두 개의 사슬을 함유하는 활성화된 FIX를 생산하는 펙터 XIa 에 의해 일어난다. FIX의 결함은 열성의 X-연관된 혈우병 B의 원인이다.
본 발명은 인간 응고 펙터 IX(FIX)에 관한 것이며 프로펩티드(pro-peptide) (굵은 글씨체)와 활성펩티드(밑줄 있는 글씨체)를 포함하는 분비되는 형태의 FIX 단백질의 아미노산 서열은 단일 문자 코드로 나타내었으며 다음과 같다.
본 발명의 특별한 목적은 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시키는 방법으로 면역적 특성이 변형된, 변형된 FIX 단백질을 제공하는 것이다.
다른 연구자들도 FIX 분자[US 5,171,569; EP0195592; EP0430930] 및 이의 재조합 생산과 정제 [US 5,714,583; US 4,770,999]를 위한 절차를 제공하고 있다. 그러나 상기의 교시는 단백질의 면역원성 특성에 있어서 T-세포 에피토프의 중요성에 대해 다루지 않을뿐더러 본 발명의 절차에 따른 구체적이고 조절된 방법으로 상기 성질에 직접적으로 영향을 주는 것에 대해서는 인식하지 않고 있다. 인간 대상체에서 면역반응을 유도하는, 잠재성이 감소되거나 또는 결여된 FIX를 제공하는 것이 매우 바람직하다.
본 발명은 특히 인간에게, 구체적으로는 치료용으로 투여하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드로서 변형으로 인해서 인간 대상체에게 투여시 폴리펩티드가 유발하는 면역 반응이 감소된 경향을 갖는다. 본 발명은 구체적으로, 생체내(in vivo)에서 사용될 경우 임의의 상응하는 미(未)변형된 단백질 보다 실질적으로 비(非)면역원성이거나 또는 면역원성이 낮은 펙터 IX 단백질을 유도하는 인간 펙터 IX의 변형에 관한 것이다.
본 발명은 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하거나 그 수를 감소시키는 방식으로 면역 특성이 변형된, 변형된 형태의 FIX를 제공하는 것이다.
본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재성에 의해 잠재적인 T-세포 에피토프로 결정된, FIX의 1차 서열 내의 동정된 서열을 개시한다. 상기 개시는 특히 본 명세서에서 상기 제시되었고 433 아미노산 잔기를 함유하는 인간 FIX 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 사람에게서 면역원성이 있는 FIX의 1차 서열내의 주요부분을 개시하며 따라서 이는 이러한 지점의 면역원성 효율을 감소시키거나 또는 제거하기 위하여 서열의 변형을 수행하는데 요구되는 중요한 정보를 제공한다.
한 가지 구현예로는, 전체 분자에 대한 면역허용원(tolerogenic) 반응을 촉진하기 위한 목적으로 면역원성 부위를 함유하는 합성 펩티드가 약제 조성물로서 공급될 수 있다.
추가의 구현예로는 본 명세서에서 개시된 에피토프 부위 내의 변형된 FIX 분자가 약제 조성물로서 사용될 수 있다.
요약하자면 본 발명은 하기의 사항과 관련된 것이다.
생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미(未)변형된 분자보다 실질적으로 비(非)면역원성이거나 또는 면역원성이 낮으며 FIX의 생물학적 활성이 있는 변형된 분자;
상기 특정된 분자로서, 상기 면역원성의 소실은 본래의 미변형된 분자로부터 유래된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거하는 것에 의해 성취됨;
상기 특정된 분자로서, 상기 면역원성의 소실은 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입 (allotype)의 수의 감소에 의해 성취됨;
상기 특정된 분자로서, 하나의 T-세포 에피토프가 제거됨;
상기 특정된 분자로서, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프는, 클래스 II 상의 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 또는 T-세포와 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열임;
상기 특정된 분자로서, 상기 펩티드 서열은 표 1 에 표시된 군으로부터 선택됨;
상기 특정된 분자로서, 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프내의 1 내지 9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변경됨;
상기 특정된 분자로서, 아미노산 잔기의 변경은 특정한 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의해 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 추가 또는 결실임;
상기 특정된 분자로서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행됨;
상기 특정된 분자로서, (부가적으로) 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이, 상기 분자에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입 수의 감소를 위해 표 3에나타낸 바와 같이 수행됨;
상기 특정된 분자로서, 필요한 경우, 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 일반적으로 특정 아미노산 잔기(들)의 치환, 추가 또는 결실에 의한 부가적인 추가의 변경이 수행됨;
상기 특정된 FIX 분자로서, 하나 이상의 아미노산의 치환은 표 2 또는 표 3에서 특정된 임의의 아미노산에 대응하는 위치에서 수행됨;
상기 특정된 FIX 분자로서, 하나 이상의 아미노산의 치환은 표 2 또는 표 3에서 특정된 임의의 아미노산에 대응하는 위치에서 수행되지만, 혈우병B 돌연변이의 데이터베이스에서 기능 있는 단백질과는 상충된다고 알려진 임의의 치환은 제외됨;
MHC 클래스 II에 결합하는 활성이 있는 상기 변형된 펩티드 또는 임의의 펩티드를 함유하는 약학 조성물;
상기 및 하기에 정의된 바와 같은 임의의 상기 특정된 변형 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;
선택적으로는 약학적으로 수용 가능한 담체(carrier), 희석제(diluent) 또는 부형제(excipient)와 함께, 상기 및/또는 특허청구범위에서 정의된 FIX의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 함유하는 약학 조성물;
상기 언급된 특허청구범위 중 임의의 특허청구범위에서 정의된, 하기의 단계를 포함하는 FIX의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자의 제조방법 : (i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계; (ii) 생체외 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계; (iii) 생체외 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 측정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 변이체를 디자인하는 단계; (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및 (v) 임의적으로 단계 (ii) - (iv) 를 반복하는 단계;
상기 특정화된 방법으로서, 상기 단계 (iii)은 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중, 1 - 9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행됨;
상기 특정화된 방법으로서, 변경은 상동단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링기술을 참고로 하여 수행됨;
상기 특정화된 방법으로서, 상기 단계 (ii)는 하기 단계로 수행됨: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택 단계; (b) 소정의 균일한 크기를 가지며, 선택된 영역에서 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 중복되는 아미노산 잔기 단편을 연속적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 단편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 더하여 각각의 상기 샘플링된 단편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 펩티드의 치료 유용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전반적인 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위해서, 상기 단편에 대해 계산된MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기본으로, 변형에 적합한 하나 이상의 상기 단편을 동정하는 단계; 단계 (c) 는 하기 단계에 의해 12-6 반데르 발스 (van der Waal‘s) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 Boehm 스코어링 함수 (Boehm scoring function)를 사용하여 바람직하게 수행됨: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫 번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 두 번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (3) 상기 첫 번째 데이타 베이스로부터 모델을 선택하는 단계; (4) 상기 두 번째 데이타 베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계; (5) 각각의 샘플링된 단편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계; (6) 각각의 샘플링된 단편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값을 결정하는 단계; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계;
미변형된 FIX로부터 생성되며, 표 1에 나타낸 군으로부터 선택된 그리고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13mer T-세포 에피토프 펩티드, 및 생체 내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 낮은 면역원성을 갖는 FIX의 제조를 위한 이의 용도;
상기 특정된 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열, 및 생체 내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 낮은 면역원성을 갖는 FIX의 제조를 위한 이의 용도;
인간 FIX의 면역원성 부위(들)의 지도 작성을 위해 생물학적 T-세포 분석에서 합성 펩티드의 페널(panel)의 사용;
생체외에서 최소의 면역원성을 나타내는 변이체를 선택하기 위해 생물학적 T-세포 분석에서 FIX 단백질 변이체의 페널의 사용;
생체외에서 최소의 면역원성을 나타내는 펩티드 서열을 선택하기 위해 생물학적 T-세포 분석에서 합성 펩티드 변이체의 페널의 사용;
순수한(naive) T-세포 분석에서 2.0 미만의, 바람직하게는 1.8 미만의 자극 인덱스를 나타내는 단백질 변이체를 선택하기 위해 T-세포 자극의 생물학적 분석의 사용;
건강한 제공자로부터 분리된 PBMC를 사용한 FIX 단백질의 T-세포 에피토프 지도의 작성 및 하기의 단계를 포함하는 스크리닝 방법:
i) 7일 이하의 배양 기간 동안 합성펩티드 또는 전체단백질 면역원을 이용한 생체외 항원 1차 감작(priming)단계; ii) IL-2를 첨가하고 3일 이하의 배양단계; iii) 자가 조사된 PBMC에 1차 감작된 T-세포의 추가 및 4일의 추가의 배양기간동안 항원을 재 투여하는 단계 및 iv) 임의의 적당한 방법에 의한 증식 인덱스를 측정하는 단계;
순수한 T-세포 분석에서 1.8을 초과하는 바람직하게는 2.0을 초과하는 자극 인덱스를 유발 할 수 있는 펩티드 서열에서 유래된 FIX;
순수한 T-세포 분석에서 1.8을 초과하는, 바람직하게는 2.0을 초과하는 자극 인덱스를 갖는 펩티드 서열에서 유래된 FIX로, 여기에서 펩티드는 최소한도로 변형되며 그리고 순수한 T-세포분석으로 검사되며 그리고 2.0미만의 자극 인덱스를 갖는 것으로 밝혀짐;
야생형 단백질 서열과 100% 아미노산 동일성을 공유하는 펩티드 서열로부터 유래되고 T-세포 분석에서 1.8 이상 및 바람직하게는 2.0을 초과하는 자극 인덱스를 유발할 수 있는 FIX;
야생형 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 포함하도록 변형되고 T-세포 분석에서 2.0 미만의 자극 인덱스를 유발하는 상기 특정된 FIX 펩티드 서열;
T-세포 분석에서 개별적으로 시험한 경우 2.0 미만의 자극 인덱스를 유발하는 변형된 펩티드 서열을 포함하는 FIX 분자;
T-세포 분석에서 시험한 경우 미변형된 단백질 분자와 비교해서 감소된 자극 인덱스를 유발하는 변형을 포함하는 FIX 분자;
T-세포 분석을 이용해 면역원성 부위의 지도가 작성되며 그리고 그 후에 T-세포 분석에서 재시험한 경우 변형된 단백질이 모(미변형된)분자보다 적은 그리고 가장 바람직하게는 2.0 미만의 자극 인덱스를 유발하도록 변형된 FIX 분자;
혈우병 B 환자로부터 유래된 세포를 사용한 T-세포 분석을 이용해 면역원성 부위의 지도가 작성 되었고 그리고 그 후에 T-세포 분석에서 재시험한 경우, 변형된 단백질이 원래의(미변형된) 분자보다 적은 자극 인덱스를 유발하도록 변형된 FIX 분자.
본 발명의 이해에 따르면, "T-세포 에피토프" 라는 용어는 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/있거나 MHC 클래스 II와 복합체로 (반드시 측정 가능하게 활성화시키지는 않음) T-세포에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 본원 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은(본원에서 하기에 정의 됨) 펩티드 결합에 의해 서로 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20가지의 상이한 자연적으로 존재하는 아미노산이 있으며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 자연적으로 존재하는 아미노산은 모두 L-배치를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용한 통상적인 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드는, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것, 때로는 "올리고펩티드"로 불린다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 이상을 포함하며, "폴리펩티드"로 불린다. 관습상, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 보통 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 나아가, "펩티드" 에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 -즉 상이한 단백질의 수- 는 실제로 무한하다. "알파 탄소 (C)" 는, 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 단순 또는 복합적인 기 또는 부분구조를 포함할 수 있고, 펩티드의 차원과 비교하여 현저하게 변화할 수 있는 물리적 차원을 갖는, C에 대한 펜던트 기이다. 본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 1 차 아미노산 서열을 갖는 임의의 FIX류의 분자에 적용될 수 있고 따라서 본 발명은 유전 공학적 수단 또는 다른 방법에서 유래된 FIX 분자를 포함할 것이며 433개 내외의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 수의 본 발명에 개시된 펩티드 서열은 비인간 기원의 FIX 단백질로부터 유래된 펩티드 서열과 공통되거나 또는 비인간 FIX 단백질 기원의 서열과 적어도 실질적으로 동일하다. 따라서, 이러한 단백질 서열도 본 발명의 범위에 동등하게 속한다.
본 발명은 치료의 의도로 사람에게 도입된 가용성 단백질이 면역 반응을 유발하여, 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 발생을 야기하는 실제 현실을 극복하기 위해 착상되었다. 본 발명은 인간 숙주에 투여될 경우 면역 반응을 유도하는 성향이 변경된 FIX 단백질을 제공함으로서 상기 문제를 해결하고자 한다. 본 발명에서 기술된 방법에 따라, 발명가들은 이러한 단백질에 대해 면역반응을 일으키는 결정적인 T-세포 에피토프들을 함유하는 FIX 분자의 부위들을 발견하였다.
변형된 FIX를 유도하는 본 발명의 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(b) 생체외 또는 컴퓨터 이용기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계;
(c) 생체외 또는 컴퓨터 이용기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 결정된 바대로, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서, T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거시키는 방식으로 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체를 디자인하는 단계. 상기 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프가 다시 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방식으로 변형되지 않는 한, 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성됨; 및
(d) 재조합 DNA 기술에 따라 상기의 서열 변이체를 구축하고 주지의 재조합 기술에 따라 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계.
단계 (b) 에 따른 잠재적인 T-세포 에피토프의 동정은 종래의 선행 기술에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO98/59244; WO98/52976; WO 00/34317에 개시되어 있으며 그리고 이는 바람직하게는 FIX-유래된 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 성향을 동정하는데 사용될 수 있다.
계산에 의해 T-세포 에피토프를 동정하는 매우 효율적인 또 다른 방법은, 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예 1에 기재되어 있다.
상기 절차의 단계 (b)에 따른 분석의 결과 및 인간 FIX 단백질 서열에 관계되는 분석의 결과는 표 1에 제시된다.
펩티드는 13mer 이고, 아미노산은 단일 문자 코드를 사용하여 나타낸다.
상기 절차의 단계 (c) 및 (d) 에 따른 본 발명의 변형된 분자와 관련된 디자인 및 구축의 결과는 표 2 및 표 3 에 나타낸다.
T-세포 에피토프의 검출을 위한 추가의 기술적인 접근은 생물학적인 T-세포 분석을 통한다. 인간 FIX 분자내의 T-세포 에피토프의 검출을 위해서 특히 효과적인 방법은 표 1의 전부 또는 임의의 펩티드서열을 생체외 배양된 인간 T-세포에서 증식 반응을 유발하는 능력에 대하여 시험해보는 것이다. 바람직한 방법은 혈우병 B의 개인에게서 유래한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용하는 것인데, 이런 경우, 실제에 있어서는, 혈우병 환자 개인이 갖는 유전적 결함의 본질로 인해서 FIX 단백질 항원이 외래 단백질을 구성할 수도 있다. 이런 맥락에서, 상기 단백질은 생체내에서 강력한 항원을 대표할 가능성이 매우 크며 발명자들은 상기 환자로부터 유래된 PBMC로 생체외에서 폴리클론의 또는 모노클론의 T-세포주를 만드는 것이 이제는 쉽게 가능하게 그리고 상기 세포주가 단백질내의 T-세포 에피토프들의 지도 작성에 효과적인 실험재료로 사용될 수 있도록 확립하였다. 이는 생체외에서 T-세포에 항원(FIX) 자극을 수 회전(round) 가하고 곧바로 뒤어서 IL-2를 넣고 증식시킴으로서 달성될 수 있다. 폴리클론의 T-세포주 확립을 위해서는 통상적으로 2-3 회전의 항원 자극이면 많은 수의 항원 특이적 세포의 생산에 충분하다. 이러한 것들은 많은 수의 합성 펩티드를 스크리닝하는데 사용되며 (예를 들면 펩티드 풀의 형태로), 그리고 극저온으로 보관하여 나중에 사용할 수 있다. 7일 동안 FIX 항원과 PBMC를 함께 배양하는 것을 포함하는 초기 회전의 항원자극 후에, 뒤이은 항원 재자극은 가장 바람직하게는 항원제시 세포로서 자가 조사된 (irradiated) PBMC의 존재 하에 수행된다. 이러한 항원선택 회전은 3-4일 동안 진행되며 이의 중간 중간에 IL-2로 자극하는 것을 포함하는 확장기를 갖으며 IL-2는 약 9일의 총기간 동안 매 3일마다 첨가 할 수 있다. 최후의 재자극은, 약 4일 동안 IL-2로 자극되지 않은 "휴식중" 인 T-세포를 사용하여 수행된다. 이러한 세포는 가장 바람직하게는 상기와 같은 자가항원 제시세포를 이용해서, 약 4일 동안 항원(예를 들면, 합성 펩티드 또는 단백질 전체)으로 자극되며 뒤이어 증식반응이(만약 있다면) 측정된다. 증식 반응은 임의의 간편한 방법으로 측정 될 수 있으며 널리 알려진 방법은 예를 들면3H-티미딘 편입 분석법을 사용하는 것이다.
따라서 본 발명에서 상기 구체화된 방법은, T-세포주 또는 혈우병B 환자 개인에게서 취한 PBMC 시료에서 유래된 올리고클론의 배양체의 생산, 상기 세포주 또는 배양체를 합성 펩티드 또는 전체 단백질 제제(preparation)로 생체외에서 자극하는 것 및 만약 있다면 개별 합성 펩티드 또는 단백질의 증식 효과의 생체외 측정, 개별 합성 펩티드 또는 전체 단백질의 변형된 변이체의 생산 및 T-세포주 또는 배양체에서 상당한 증식반응을 촉진시키는 계속적인 능력에 대해 상기 변형된 펩티드 또는 단백질의 재시험을 포함한다.
종전에 치료용 대체 치료요법이 개시되었고 대체 치료요법으로 인해서 치료용 단백질에 대한 면역반응이 유도된 개인에게서 유래된 올리고클론 배양체의 T-세포주를 확립하는 것이 특히 유용하다. 이런 계획 하에서 소위 “방해 환자”라고 불리는 이러한 유형의 환자로부터 유래한 PBMC 시료를 이용하는 것이 특히 바람직한데, 이는 상당수의 이러한 개인의 T-세포 레퍼토리에 의해 정의된 펙터 IX 단백질의 에피토프 지도가 생체내 상황에서 제시 될 수 있는 가장 유력한 펩티드 에피토프를 대표할 것으로 기대 될 수도 있기 때문이다. 이러한 맥락에서, 종전에 증명된 면역반응이 있는 환자에게서 유래한 PBMC는 생체내 1차 감작(priming) 단계의 결과물을 구성하며 이런 환자로부터 유래한 PBMC 세포주의 사용이 원칙적으로 생체외에서 면역 재현 분석이라면, 이는 나아가 임의의 주어진 자극 펩티드 또는 단백질에 대한 훨씬 더 큰 정도의 증식 반응 능력이 있는 실질적인 이득을 제공한다. 이는 증식 측정의 수행에 있어 기술적 어려움을 감소시키며 이러한 상황에서 다수의 MHC 클래스 II 펩티드 리간드 및 따라서 다수의 또는 복합적인(즉, 겹치는) T-세포 에피토프들을 갖고 있는 것으로 컴퓨터를 이용해 본 발명에서 증명된 FIX의 경우처럼, 이는 면역적으로 우세한, 가능한 에피토프 계층(hierarchy)의 정립을 위한 기회를 제공 할 수도 있다.
종전의 FIX 대체 치료요법으로 FIX에 대한 면역반응이 유도된 개인에게서 유래된 올리고클론 배양체의 T-세포주를 확립하는 것이 특히 유용하기는 하지만, 이것이 생체내에서 의미가 있는 면역원성 에피토프의 지도 작성에 사용될 수 있는 유일한 세포 출처는 아니다. 건강한 제공자로부터 채취한 순수한 T-세포의 분석도 동등하게 사용될 수 있지만, 이러한 경우에는 임의의 개별 펩티드에 대해 계산된 자극 인덱스의 크기에 있어 그 정도가 낮을 가능성이 있어 배경 값으로부터 펩티드 또는 단백질에 의해 유도된 자극을 구별하기 위해서는 민감한 측정이 요구된다. 발명자는 주지의 기술을 이용한 상기 분석을 하면서, 2.0 이상의 자극 인덱스가, 유도된 증식의 유용한 측정값이라는 것을 확립했으며, 여기에서 자극 인덱스는 시험 (폴리) 펩티드에 대해 측정된 증식 값을 (즉3H-티미딘 편입 실험을 통한 분당 카운트) 시험 (폴리) 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 증식 값으로 나누어 얻는다. 이러한 유형의 적절한 방법은 실시예 2에 상세히 기술된다.
다수의 잠재적인 에피토프가 동정되었고 특히 많은 펩티드 서열이 생물학적 분석법에서 T-세포를 자극할 수 있는 것으로 밝혀진 경우에, 단백질의 구조적 특성이 MHC 클래스 II 제시 경로를 통해 면역 반응을 유발하는 경향과 관련되어 또한 인지 될 수 있다. 예를 들면 관심 있는 단백질의 결정 구조가 알려진 경우에 단백질내의 구조적인 결함의 증거를 위해 크리스탈로그래픽 B-펙터 값이 분석될 수 있고, 이 값은 생물학적으로 의미 있는 면역우세한 펩티드 에피토프에 근접하게 연관되어 있음을 제시하는 파라미터이다 [Dai G. 등 (2001) J. Biological Chem. 276. 41913-41920]. 이러한 분석이 FIX의 세린 단백질 분해효소 영역과 FIX의 EGF-유사영역의 결정구조에 대하여 수행된 경우 [PDB ID: lRFN, Hopfner, K.P. 등 (1999)Structure7:. 989], 세린 단백질 분해효소 영역의 235 아미노산 잔기 내에 평균 B-펙터 값을 넘는 적어도 11개의 피크가 있으며, 이는 세린 단백질 분해효소 영역 중에 다수의 면역우세한 에피토프 대한 높은 가능성을 시사한다. 이와 대조적으로, 이보다 작은(57 잔기) EGF-유사 영역은 평균 B-펙터 값을 넘는 두 개의 피크를 보이며 이는 생물학적으로 의미 있는 두 개의 T-세포 에피토프가 이 영역에 위치하고 있을 잠재성을 제시한다. 따라서, 본 발명의 계획 하에서 상기 데이터는, 표 2 와 표 3에 열거된 아미노산 치환들 중에서, 가장 바람직한 것은 EGF-유사 영역의 잔기번호 133-161내에 그리고 잔기 번호 250인 발린에서 시작하여 영역 내에 퍼져 있는 세린 단백질 분해효소 영역에 포함된 잔기가 치환된 것이다.
실제로는 많은 FIX 단백질 변이체가 만들어 질 것이고 바람직한 면역 및 기능적 특성에 대해 시험될 것이다. 혈우병B 돌연변이의 공중 데이터베이스를 참조할 수 있으며 [예를 들면 데이터베이스 "http://www.umds.ac.uk/molgen/"] 표 2 및 표 3에 열거된 치환 중에서 또한 혈우병 B의 원인 돌연변이로도 알려진 것은 분석에서 제외될 수 있거나, 또는 단백질의 기능적 활성을 회복하기 위해 선택하여 보상 돌연변이를 만들 수도 있다. 모든 경우에 있어서 단백질 변이체는, 비록 FIX 단편의 화학적 합성을 포함하는 다른 방법을 숙고해야 하지만, 가장 바람직하게는 주지된 재조합 DNA 기술을 이용해서 생산된다.
본 발명은 FIX 유사체에 관한 것으로 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환은, 단백질의 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프 활성의 실질적인 감소 또는제거를 초래하는 지점에서 수행된다. 모(parent)분자의 가장 면역원성이 있는 영역 내에서 아미노산 변형(예, 치환)이 일어난 FIX 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 주된 구현예는 FIX 분자에 대한 임의의 MHC 클래스 II 리간드가 변경되어 결합이 제거하거나 또는 그렇지 않다면 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수가 감소되도록 변경된 FIX 분자를 포함한다.
T-세포 에피토프들의 제거를 위해서, 아미노산 치환은 바람직하게는 T-세포 에피토프 활성의 제거 또는 실질적 감소가 성취될 것으로 예상되는 펩티드 서열내의 적당한 지점에서 수행된다. 실제로, 적당한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내의 제공된 포켓 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 동등하게 간주될 것이다. 펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정자 (anchor) 위치에 있는 클레프트의 제 1 포켓 내의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정자 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 의 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은, 전체 펩티드에 대한 전반적인 결합 친화도의 주요 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이 위치에서의 적합한 치환은, 포켓 내에 덜 용이하게 수용되는 잔기에, 예컨대 더욱 친수성인 잔기로의 치환에 대한 것이다. MHC 결합 클레프트 내의 다른 포켓 영역 내에서 결합과 동등한 위치에 있는 펩티드 중의 아미노산 잔기가 또한 고려되며, 이는 본 발명의 범위 내에 속한다.
주어진 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서의 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 단일 에피토프 내에서의 치환의 조합이 고려될 수 있으며 예를 들면 이는 개별적으로 정의된 에피토프가서로 중복될 경우에 특히 적합할 수 있다. 또한, 주어진 에피토프 내에서 단독의 아미노산 치환 또는 단일 에피토프 내에서 조합된 아미노산 치환은, MHC 클래스 II 결합 그루브와 관련해서 "포켓 잔기"와 동등시 되는 지점이 아니라, 펩티드 서열 중의 임의의 지점에서 수행될 수 있다. 치환은, 상동 구조 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 이용 기술(in silico)을 사용하여 생성된 구조적 방법을 참고로 하여 수행될 수 있고, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징에 기초할 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명에서 동정된 펩티드를 벗어난 부분에서의 아미노산 치환은, 열거된 펩티드 내에서 만들어진 치환(들)과 조합되어 만들어질 경우에 특히 고려될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 회복시키기 위한 변화가 고려될 수 있다. 이러한 보상적 변화 및 목적하는 활성을 갖는 변이체를 초래하는 FIX 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하는 변화 및 임의의 개시된 펩티드 중의 변화와 조합하여 한 변화는 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명이 변형된 FIX에 관한 것인 한, 상기 변형된 FIX 단백질 또는 변형된 FIX 단백질의 절편을 포함하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위내인 것으로 고려되어야만 한다. 다른 관점에서, 본 발명은 변형된 FIX 단백질을 코딩하는 핵산과 관련된 것이다. 더 나아간 관점에서는 본 발명은 변형된 FIX 단백질을 사용하는 인간의 치료적 처방 방법과 관련된다.
여전히 더 나아간 관점에서 본 발명은, 본 발명에서 개시된 서열과 동일성 또는 부분적으로 동일성을 갖는 유도된 분자 또는 펩티드를 함유하는 약학 제제를 사용한치료적 처방방법과 관련된다.
실시예1
단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합이며, 즉 이는 아미노산을 사슬로 서로 연결하는 결합으로 공유 결합이다. 상기 결합은 구조에 있어서는 평면이고, 본질적으로는 치환된 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 기를 포함하는 임의의 유기 화합물 기이다. 인접한 아미노산의 C를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:
O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 파선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때로는 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 마주보는 코너에는 C원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대하여는 실질적으로 회전이 없으므로, 따라서 폴리펩티드 사슬은 C원자를 연결하는 일련의 평면의 펩티드 연결을 포함한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배치를 정의하는데 있어 중요한 역할을 하는 두 번째 요인은 공통된 C연결 주위로 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 남아 있다고 가정하면 (일부 배치의 경우, 상기 원자의 평면성으로부터 약간의 이탈이 있을 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배치, 즉 이웃 잔기 사이에서 존재하는 대로의 구조를 정의한다. 상기 두 가지의 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φi,ψi(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드 2차 구조를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 기준점, 및 주어진 폴리펩티드에 대하여 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인지에 대한 정의는, 문헌에 정의되어 있다. 즉, 본원에 참고문헌으로 도입된 Ramachandran 등. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94를 참고하라.
본 발명의 방법은 임의의 단백질에 적용될 수 있으며, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브내 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해서 잘 디자인된 특이성을 갖는다는 발견에 부분적으로 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에 있는 아미노산의 정체(identity)에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다[Marshall, K.W., J. Immunol., 152:4946-4956 (1994)]. 만약 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 이 포켓 내에 수용될 수 있고, 바람직한 것은 방향족 측쇄이다. 만약 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 단지 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열의 어디에서 든지, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견되면, MHC 클래스 II에 의해 제한된 T-세포 에피토프가 존재할 잠재성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T-세포 에피토프와 연관될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략적으로 균일한 분포를 가정함).
본 발명을 구현하는 컴퓨터적 방법은 하기와 같이 T-세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로필한다:
(1) 소정의 길이의 펩티드 단편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 동정한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 큰 값을 지정한다 ; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 값의 약 2 배, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값은 2 로, 방향족 측쇄에 대한 값은 1 로 지정한다. (3) 존재하는 것에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이의 각각의 중복되는(overlapping) 아미노산 잔기 단편 (윈도우)에 대해 합산하고, 특정 단편(윈도우)에 대한 총 값을 그 단편(윈도우)의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기에, 바람직하게는 샘플링된 단편(윈도우)의 정중앙 근처의 잔기에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복되는 아미노산 잔기 단편 (윈도우)에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는, 그 특정 단편 (윈도우)에 존재하는 T-세포 에피토프의 가능성과 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3에 기재된 바에 따라 계산되어 부여된 값은 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅될 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T-세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 변형될 수 있다. 본 발명의 상기 특정 양태는 T-세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 알아낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 변형은 MHC 클래스 II 결합 특성을 변형시킬 수 있는 잠재성을 갖는다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여 T-세포 에피토프가 보다 큰 정확도로 예측될 수 있다. 상기 특정 양태에 따른 펩티드 내에 존재하는 T-세포 에피토프의 컴퓨터적 예측은, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조에 기반을 둔 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T-세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델을 이용하기 위한 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (C)위치의 공지된 변화를 수용하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20개의 대체 아미노산에 대한 각 모델과 도킹된 각각의 골격을 위한 아미노산 측쇄 배치의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적의 골격 및 측쇄 배치를 선택하기 위한 스코어링 함수 및상기 상호작용의 결합 스코어의 유도와 함께 상기 골격 및 측쇄 배치 라이브러리의 사용이 고려된다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 부르크하벤(Brookhaven)단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 발견되는 다수의 유사한 구조로부터의 상동성 모델링을 통해 유도될 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 역장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능)과 함께 시뮬레이션된 어닐링 함수를 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815)를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은, 적은 세트의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브 중의 각각의 위치에서 각각의 대체 아미노산에 대하여 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적 방법 [Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162,(1995)]; 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합적 특징을 정의하기 위해, 역시 비교적 적은 서브세트의 MHC 클래스 II 분자를 이용하고, 그 후에 추가의 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자 [Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)]를 인공적으로 생성시키기 위해, 이 포켓 라이브러리로부터의 포켓 유형을 '혼합 및 매칭' 시키는, 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또 다른 컴퓨터적 방법과는 상당히 상이하다. 상기 두 가지 종래 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체 합성의 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을갖는다. 따라서, 첫 번째 종래 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자에 대해서만 예측될 수 있다. 두 번째 종래 방법도 또한 한 분자에서 유사한 아미노산으로 배열된 포켓은 상이한 클래스 II 대립유전자의 상황에서 같은 결합 특성을 갖는다는 가정을 하며 그리고 포켓 라이브러리내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대립유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수도, 복잡한 실험을 통해 추가의 데이타를 생성해야만 하는 것 보다 추가의 모델을 만들어서 한층 더 증가될수 있다. 골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자와 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 C원자의 위치에 있어서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특정 포켓에서의 아미노산 결합을 스캐닝하는데 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 종래의 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배치를 대표하지 않을 가능성이 있어, 펩티드 결합 예측의 부정확으로 이어진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고 그리고 결합 그루브 내에 위치하는 각각의 11개 아미노산의 C원자 사이의 제곱근 평균 제곱(RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용 가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개)로부터 유도될 수있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-위치에 대한 RMS 수(값)이 50% 증가된다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 C위치를 결정하고 그리고 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50%가 되는 이 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구는 허용되는 모든 C위치를 나타낸다. 최소 RMS (root mean square) 편차(결합 그루브 중의 11 잔기의 위치 2에 동등한, 상기 언급한대로 포켓 1 중의 아미노산의 것)를 가지고 C로부터 작업을 하여, 구를 3차원적으로 격자상으로 나누고, 그리고 격자내 각 꼭지점(vertex)은 상기 아미노산의 가능한 C위치로서 사용된다. 뒤에 오는 아미노산에 대한 펩티드 결합에 상응하는, 뒤에 오는 아미드 평면은 각각의 상기 C위로 그래프트(graft) 되며 Φ와 Ψ각은 뒤에 오는 C를 위치시키기 위해 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 만약 뒤에 오는 C가 상기 C에 대한 허용된 위치의 구(Sphere of allowed position)내에 포함되면 이(di)펩티드의 방향은 받아들여진다. 반면 만약 구의 외부에 포함된다면 이(di)펩티드는 거절된다. 상기 과정이 각각의 뒤에 오는 C위치에 대해 반복되어서, 펩티드가 포켓 1 C'씨드(seed)'로부터 시작되어, 뒤에 오는 모든 9개의 C가 앞서 있는 C들의 모든 가능한 순열(permutation)로부터 위치될 때까지 반복 된다.
결합그루브내에 위치한 골격 C위치의 라이브러리를 생성하기 위해 포켓 1에 앞서 있는 단일 C에 대해 상기 과정을 한번 더 반복한다. 생성된 골격의 수는 하기의 여러 요소에 의존한다: '허용된 위치의 구'의 크기; 포켓 1 위치에서 '원구(primary sphere)' 의 격자 만들기의 세밀함; 뒤따르는 C들을 위치시키기 위해
Φ와Ψ 각의 단계적인 회전의 세밀함. 상기 과정을 이용해서, 큰 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 클수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브내에서 특정 펩티드에 대한 최적의 적합(fit)이 일어날 가능성이 더 높아진다.
결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자의 모델과의 도킹에 적합하지 않을 것이므로, 각 대립유전자에 대하여 이 대립유전자에 의해 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트가 만들어진다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께, 골격 라이브러리의 사용은, 허용된 각각의 골격과 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각각의 위치에서의 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄의 배치로 구성되는 방대한 데이터베이스를 생성한다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 그리고 아미노산 측쇄가 목적하는 위치의 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며 그리고 이 결합에 의존하는 원자의 생성된 위치가 주목된다(noted). 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자와의 상호작용이 주목되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 또는 거부된다: 지금까지 위치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배치 탐색의 엄격성 (stringency)은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정의 한계치의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인(flexible)것으로 공지된 경우 엄격성은 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유동성의 변이를 모방하도록 허용될 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 상기 배치 탐색을 반복하여 측쇄 배치의 방대한 데이타베이스를 생성한다.
상술된 골격/측쇄 배치의 거대한 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배치와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현이 사용된다. 따라서, 9 내지 20 개의 아미노산 사이에서 변하는 길이(길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨)의 각각의 가능한 펩티드를 하기 계산에 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: MHC 클래스 II 분자를 이 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 선택하고 그리고 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산의 각각의 허용되는 배치에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 스코어링 함수를 이용하여 유도된 펩티드 스코어 및 골격을 따라 있는 각각의 측쇄에 대해 반복한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 유지하며 그리고 선택된 모델에 대하여 허용된 각각의 골격에 대해 상기 절차를 반복한다. 모든 허용된 골격으로부터의 스코어를 비교하고, 가장 높은 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 모든 가능한 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델 대 펩티드 스코어를 나타낸다. 본 발명의 정황으로,결합 친화도 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 단편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 길이 약 9 내지 20 아미노산의 선택된 아미노산의 연결체이다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다.
골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 연속된 아미노산의 펩티드 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-원자의 배위(coordinate)를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 클레프트 내에 위치시키며 그리고 각각의 측쇄에 허용되는 배치를 허용되는 배치의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련 있는 원자의 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하여 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 리간드는 위치 지정 돌연변이형성(site directed mutagenesis)의 후보로 지정된다. 아미노산 치환은 지정된 리간드(그리고 따라서 관심 단백질 내에서)에서 수행되며, 그리고나서 이것이 결합 친화도를 소정 임계값 아래로 감소시키는지의 변화를 결정하기 위해 스코어링 함수를 이용해서 재시험한다. 이어서, T-세포 에피토프를 제거하기 위해 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입할 수 있다. 펩티드 리간드와 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합은 하기를 포함하는 비공유 상호작용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 : 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 대전된 기들 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이며 그리고 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 제공자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 제공자는 수소에 연결된 질소 또는 산소 또는 질소에 연결된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 연결되지 않은 산소, 연결된 수소가 없으며 1 또는 2개 연결을 갖는 질소 또는 단지 1 개의 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 연결된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH)는 수소 수용자 또는 제공자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이며 그리고 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 그러나 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 상당한 방향성이 있으며 그리고 제공자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될 때 가장 강하다. 정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며 그리고 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 및 아스파테이트 또는 글루타메이트 사이에서 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다. 친유성 상호작용은 단백질과 펩티드 리간드 사이에 일어나는 유리한 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에서 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매에의 노출은, 우리(cage) 같은 격자구조(clathrate structure)를 형성하면서 이를 둘러싼 용매 분자간의 수소 결합이 강제되어 매우 불리하다. 이의 결과로서 생긴 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성도 수소 수용자도 아닌 황일 수 있으며 그리고 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다. 반 데르 발스 결합은 3Å 내지 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며 그리고, 임의의 순간에, 전하 분포는 대칭이 아니다. 이러한 순간적인 전하의 비대칭은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 이의 결과로서 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 역으로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리됨에 따라, 원자 외부의 전자 구름이 겹치면서 점점 증가하는 강한 반발력이 우세하게 된다. 비록 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 상대적으로 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 반발력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다. 하나의 구현예에서는, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법)를 사용하여 결합 상수를 추정한다 [Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨]. 또 다른 구현예에서, T-세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정하기 위해 [Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨]스코어링 함수 (SCORE2 접근법)를 사용한다. 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있으며 그리고 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB")에 존재하는 경우에 있어 단백질에 대한 리간드의 결합 친화도를 추정하는데 사용된다. 그러므로, 스코어링 함수는 공지된 양성(positive)결합 데이타의 이점을 앉고 개발되었다. 양성과 음성(negative)결합자들 사이를 구별할 수 있기 위해서는, 반발항이 공식에 부가되어야만 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 영역에 근거한 에너지항을 이용하기보다 한쌍씩 친유성 상호작용을 계산함으로써 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 변형된 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 변형된 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (Gbind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 전반적인 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (G0); 1개 이상의 파트너가 중성인 경우에 있어 이상적인 수소 결합으로 부터의 기여 (Ghb); 교란되지 않은 이온성 상호작용으로 부터의 기여 (Gionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (Glipo); 리간드 내부 자유도의 동결, 즉 각각의 C-C 결합 주위로 회전 자유도의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (Grot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (EVdW). 상기 항을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:
여기서, N 은 특정 항에 대해 자격이 되는(qualifying) 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서,G0,Ghb,Gionic,Glipo및Grot는 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4. 항 Nhb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:
f(R, )는 이상적인 수소 결합으로부터의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:
여기서: 만약RTOL 이면 f1(R) = 1 또는
만약R0.4 + TOL 이면 f1 (R) = 1 - (R - TOL)/0.4 또는
만약R > 0.4 + TOL 이면 f1 (R) = 0 임.
그리고: 만약 < 30이면 f2 ( ) = 1 또는
만약 80이면 f2 ( ) = 1 - ( -30)/50 또는
만약 > 80이면 f2 ( ) = 0 임.
TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 허용되는 편차이다.
R은 H-O/N 수소 결합 길이의 이상적인 값 = 1.9Å로부터 편차이다.
는 수소 결합각 N/O-H..O/N의 이상적인 값인 180로 부터의 편차이다.
f(Nneighb) 는 단백질 표면의 오목부 및 볼록부를 구별하므로 따라서 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게(Weight)를 부여한다. 이 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:
Nneighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 5Å보다 가까이 있는 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb,0은 상수=25이다.
fpcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이며 따라서 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며 그리고 이의 값은 하기 기준에 따라 결정된다:
Apolar/NHB< 10Å2인 경우 fpcs= β 또는
Apolar/NHB 10Å2인 경우 fpcs= 1 이다.
Apolar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.
NHB는 수소 결합의 수이다.
β는 값=1.2 인 상수이다.
변형된 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용으로부터의 기여는, Gionic, 동일한 기하학적 의존성이 가정되었으므로, 상기 기술된 수소 결합으로부터의 것과 유사한 방식으로 계산된다. 항 Nlipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:
f(r1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l, 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대하여 하기 기준에 따라 계산된다:
r1L Rl 인 경우 f(r1L) =1
R2 < rlL> R1 인 경우 f(r1L) = (r1L-R1)/ (R2-R1)
r1LR2 인 경우 f(r1L) = 0
여기서: R1 = rl vdw+ rL vdw+ 0.5 그리고
R2 = R1 + 3.0 그리고
rl vdw는 원자 l 의 반 데르 발스 반경임 그리고
rL vdw는 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.
항 Nrot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp3-sp3및 sp3-sp2결합의 수로 고려된다. 말단 -CH3또는 -NH3의 회전은 고려되지 않는다.
최종 항 EVdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:
여기서, ε1및 ε2는 원자 정체성에 의존하는 상수이며, rl vdw+r2 vdw는 반 데르 발스 원자 반경이고, r 은 원자 쌍 사이의 거리이다. 수학식 6 과 관련해서, 하나의 구현예에서는, 상수 ε1및 ε2는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 과 관련해서, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.
상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형과 관련해서 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 그러므로, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 변할 수 있고, 따라서 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정과 관련해서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값이 사용될 수 있으며 그리고 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다. 상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배치, 원자 정체, 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 규명된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법 구축의 모듈적인 특성은 신규 모델이 쉽게 추가될 수 있으며 그리고 펩티드 골격 라이브러리 및 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시키기 위해 측쇄 배치 탐색 함수로 스캐닝될 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 레퍼토리가 쉽게 증가되도록 하거나, 또는 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 데이타가 이용 가능하다면 구조 및 회합된 데이타가 대체될 수 있게 한다. 본 발명의 예측 방법은 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 종래에 실험적으로 결정된 많은 수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대하여 보정될 수 있다. 계산된 데이터 대 실험 데이타의 비교에 의해 실험적으로 측정된 모든 T-세포 에피토프가 정확하게 예측된 것으로 알려진 값을 넘는 커트 값이 결정될 수 있다. 상기 스코어링 함수가 이용 가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 상대적으로 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야만 한다. 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 실제 결합 에너지 자체를 계산하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 구조(즉, 아미노산 서열)에 근거한 T-세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 것으로서의 비교 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 선택된 임계값을 넘는 결합 에너지는 리간드 중 T-세포 에피토프의 존재를 제시하는 것이다. 이러한 리간드는 이어서 1회 이상의 아미노산 치환을 거치고 그리고 결합 에너지가 다시 계산된다. 계산의 신속한 특성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 이러한 조작은 효율적인 비용으로 이용 가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 큰 투자는 요구되지 않는다. 당업자에게는 동일한 목적을 위해 이용 가능한 다른 소프트웨어가 사용될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 구체적으로, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어가 에너지 최소화와 함께 이용될 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK [Kuntz 등, J.Mol. Biol., 161:269-288 (1982)], LUDI [Boehm, H.J., J.Comput Aided Mol. Des., 8:623-632 (1994)] 및 FLEXX [Rarey M., 등, ISMB, 3:300-308 (1995)]. 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적 방법의 이용은 필요한 계산의 수행에 요구되는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 처리량을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '양성 결합자' 로 밝혀진 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크리닝'에 사용될 수 있는 것은 가능하다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 동력학적 계산을 위한 처리 시간에 있어서 한계는 상기 계산을 하는 소프트웨어의 디자인 및 현재 컴퓨터 하드웨어 기술의 한계 둘 다에의해 규정되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 작성 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가와 함께, 보다 처리 가능한 시간 틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B.R., 등, J.Comput.Chem., 4:187-217 (1983)] 그리고 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(l):31-47(1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G.D., 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].
실시예 2
합성펩티드를 이용한 순수한 (naive) T-세포 분석을 위한 방법
MHC, 펩티드 및 T-세포 수용체(TCR) 사이의 상호작용은 T-세포 인식의 항원 특이성에 대한 구조적인 근간을 제공한다. T-세포 증식 분석은 MHC에 대한 펩티드의 결합 및 TCR에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인식을 시험한다. 본 실시예의 생체외 T-세포 증식 분석은 항원제시세포(APC) 및 T-세포를 함유하는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극을 포함한다. 자극은 생체외에서 합성 펩티드 항원을 사용하고, 그리고 어떤 실험에서는 전체 단백질 항원을 사용해서 수행된다. 자극된 T-세포증식은3H-티미딘 (3H-Thy) 및 세척된 고정되어진 세포의 섬광계측을 이용하여 평가된, 편입되어진3H-Thy의 존재를 통하여 측정된다. 12시간 미만동안 보관된 인간 혈액의 백혈구연층(buffy coats)은 National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK)로부터 수득된다. Ficoll-paque는 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, UK)으로부터 수득된다. 초기(primary) 인간 림프구의 배양을 위한 무혈청의 AIM V 배지 및 L-글루타민, 50μg/ml 스트렙토마이신, 10μg/ml 겐토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 포함하는 것은 Gibco-BRL (Paisley, UK)로부터 수득된다. 합성 펩티드는 Pepscan (The Netherlands) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK)로부터 수득된다. 적혈구 및 백혈구는 백혈구연층의 부드러운 원심분리로 혈장과 혈소판으로부터 분리된다. 윗 상(top phase)(혈장과 혈소판을 포함하는)은 제거하여 폐기한다. 적혈구 및 백혈구는 인산염완충식염수에 1:1로 희석되고 그리고 15ml의 ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham UK) 위에 층을 이루어 올려진다. 원심분리는 제조자의 권고 조건대로 수행되며 그리고 PBMC는 혈장+PBS /ficoll paque 경계면으로부터 채취된다. PBMC는 PBS(1:1)와 섞고 원심분리를 하여 수집된다. 상층액은 제거되어 폐기되고 그리고 PBMC 침전(pellet)은 50ml의 PBS로 재현탁된다. 세포는 다시 원심분리를 통하여 침전되고 그리고 PBS 상층액은 폐기된다. 세포는 50ml AIM V 배지로 재현탁되고 그리고 이 시점에서 세포의 수를 세고 트리펜 블루 염색약 배제법을 사용하여 생존도(viability)를 평가한다. 세포는 다시 원심분리로 수집되고 그리고 상층액은 폐기된다. 세포는 ml당 3x107의 밀도로 액체질소에서의 보관을 위해 재현탁된다. 보관용 배지는 열로 불활성화된 90%(v/v)의 AB 인간 혈청(Sigma, Poole, UK)및 10%(v/v)의 DMSO (Sigma, Poole, LTK)이다. 세포는 조절되는 냉동 용기(Sigma)로 옮겨지고 그리고 -70℃에서 하룻 밤을 둔 후에 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겨진다. 사용을 위해 세포가 필요할 경우는, 세포를 37℃의 수욕조에서 빠르게 해동시킨 후에 미리 데워진 10ml의 AIM V 배지로 옮긴다. PBMC는 웰당 2xl05PBMC의 밀도로 평평한 바닥의 96웰 플레이트에서 단백질 및 펩티드 항원으로 자극된다. PBMC를 37℃에서 7일 동안 배양한 후3H-Thy(Amersham-Pharmacia, Amersham, UK)를 넣고 펄스(pulse)한다. 본 연구를 위해서, FIX 서열 전체에 또는 표 1의 전부 또는 임의의 펩티드에 걸치며, 3개의 아미노산씩 증가하여 앞으로 나아가는 합성 펩티드(15 mer)가 생성되거나 또는 표 2 또는 표 3에 상세히 기술된 치환을 포함하는 펩티드도 생성되어 사용될 수 있다. 20명의 순수한 제공자로부터 분리된 PBMC에 대하여 각 펩티드는 개별적으로 3중으로(in triplicate)스크리닝 된다. 종전에 면역원성이 있는 것으로 밝혀진 두 개의 대조 펩티드 및 강력한 비회상 항원 KLH가 각각의 제공자 분석에 사용되었다. 대조 항원은 하기와 같다.
펩티드 서열
C-32 바이오틴-PKYVKQNTLKLAT플루 헤마글루티닌 307-319
C-49 KVVDQIKKISKPVQH클라미디아(Chlamydia) HSP 60 펩티드
KLH 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌 유래의 전체 단백질
펩티드는 10mM의 최종 농도로 DMSO에 용해되고, 상기 원액은 그 후 AIM V배지로 1/500으로 희석된다 (최종 농도 20μM). 펩티드는 100㎕ 중에 최종 농도 2 및 20μM이 되도록 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 추가된다. 해동된 PBMC의 생존도(viability)는 트리판 블루 염색약 배제법으로 평가 되었고, 그 후 세포는 2xl06세포/ml의 밀도로 재현탁되었고 100㎕(2xl05PBMC/well)가 펩티드를 포함하는 각 웰에 전달되었다. 3중의 웰 배양체는 각 펩티드 농도에서 분석되었다. 플레이트는 37℃에서 5% CO2의 습한 대기 하에서 7일 동안 배양된다. 세포는 웰당 1μCi3H-Thy을 넣어 18-21시간 펄스(pulse)된 후 필터 메트(mat)위로 채취된다. CPM 값은 Wallac 마이크로 플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Perkin Elmer) 또는 이와 유사한 것을 이용하여 결정된다. 결과는 자극 지수로서 표현되며, 하기의 식을 사용하여 결정된다 :
시험 펩티드에 대한 증식 CPM / 처리되지 않은 웰에서의 증식 CPM
이러한 종류의 순수한 T-세포 분석에 있어서, 2.0을 초과하는 자극 인덱스는 양성 스코어로 간주된다. 동일한 펩티드가 두 개이상의 제공된 시료에서 2.0을 초과하는 자극 인덱스를 달성하는 경우에 이는 가능성이 높은 면역우세한 에피토프의 증거로 간주된다.

Claims (30)

  1. 생체내 (in vivo)에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미 (未)변형된 분자 보다 실질적으로 비(非)면역원성이거나 또는 면역원성이 낮으며 인간 펙터 IX의 생물학적 활성이 있는 변형된 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실은 본래 미변형된 분자로부터 유도된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거하는 것에 의해 성취되는 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실은 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입 (allotype) 수의 감소에 의해 성취되는 분자.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 하나의 T-세포 에피토프가 제거되는 분자.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프는 클래스 II 상의 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 또는 T-세포와 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 표 1 에 표시된 군으로부터 선택되는분자.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프에서 1 내지 9 개의 아미노산 잔기가 변경된 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, 하나의 아미노산 잔기가 변경된 분자.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경은 특정한 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 추가 또는 결실인 분자.
  10. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환은 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, 기능적인 단백질과는 상충되는, 인간 펙터 IX의 유전적 돌연변이를 형성하는 것으로 공지된 치환을 배제한 분자.
  12. 제 10 항에 있어서, 부가적으로 하나 이상의 아미노산 잔기 치환은, 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입 수의 감소를 위해 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
  13. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
  14. 제 13 항에 있어서, 기능적인 단백질과는 상충되는, 인간 펙터 IX의 유전적 돌연변이를 형성하는 것으로 공지된 치환을 배제한 분자.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 부가적인 추가의 변경이 수행되는 분자.
  16. 제 15 항에 있어서, 부가적인 추가의 변경은 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실인 분자.
  17. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 상동 단백질 서열을 참고로 하여 수행되는 변형된 분자.
  18. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 컴퓨터 이용 (in silico) 기술을 참고로 하여 수행되는 변형된 분자.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 야생형 단백질서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 갖으며 그리고 T-세포 분석으로 시험된 경우 2.0 미만의 자극 인덱스를 유발하는 변형된 분자.
  20. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 분석으로 시험된 경우 미변형 단백질 분자와 비교하여 감소된 자극 인덱스를 유발하는 변형된 분자.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 변형된 인간 펙터 IX 분자를 코딩하는 DNA 서열.
  22. 임의적으로는 약학적으로 수용 가능한 담체(carrier), 희석제(diluent) 또는 부형제(excipient)와 함께, 제 1 항 내지 제 21항 중 어느 한 항에서 정의된 인간 펙터 IX의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에서 정의된 인간 펙터 IX의 생물학적 활성을 갖는 하기 단계를 포함하는 변형된 분자의 제조 방법:
    (i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (ii) 생체외(in vitro) 또는 컴퓨터 이용기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계;
    (iii) 생체외 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의MHC 분자에 대한 결합의 결정, 또는 펩티드-MHC 복합체의 T-세포에 대한 결합에 의해 결정된 바대로 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중에서, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프내의 1 내지 9개의 아미노산 잔기가 치환, 추가, 또는 결실에 의해 변형되어진 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 변이체를 디자인하는 단계;
    (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고 그리고 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및
    (v) 임의적으로 단계 (ii) 내지 (iv) 를 반복하는 단계.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 하기 단계로 수행되는 방법: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택 단계; (b) 소정의 균일한 크기를 가지며 그리고 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복되는 아미노산 잔기 단편을 연속적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 단편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 더하여 각각의 상기 샘플링된 단편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 상기 단편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 근거로, 펩티드의 치료 유용성을 실질적으로 감소시키지 않고 펩티드에 대한 전반적인 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위해 변형에 적합한 하나 이상의 상기 단편을 동정하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 단계 (c)는 하기 단계에 의해 12-6 반데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 Boehm 스코어링 함수 (scoring function) 를 사용하여 수행되는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫 번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 두 번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (3) 상기 첫 번째 데이타 베이스로부터 모델을 선택하는 단계; (4) 상기 두 번째 데이타 베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계; (5) 각각의 샘플링된 단편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계; (6) 각각의 샘플링된 단편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값을 결정하는 단계; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계.
  26. 미변형된 인간 펙터 IX 으로부터 생성되며, 표 1에 나타낸 군으로부터 선택된 그리고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13mer T-세포 에피토프 펩티드.
  27. 제 26 항에 따른 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 서열.
  28. T-세포 분석으로 시험된 경우, 2.0 초과의 자극 인덱스를 유발하며 야생형인간 펙터 IX와 100%의 아미노산 동일성을 갖는 9 내지 15mer 펩티드 서열.
  29. 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로는 면역원성이 없거나 또는 낮은 면역원성을 갖는 인간 펙터 IX의 제조를 위한 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 펩티드의 서열의 용도.
  30. 상응하는 야생형의 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 갖으며 T-세포 분석으로 시험된 경우 미변형된 인간 펙터 IX 분자와 비교하여 감소된 또는 적어도 2.0미만의 자극 인덱스를 유발하는 인간 펙터 IX의 제조를 위한 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 펩티드의 서열의 용도.
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