CN1551888A

CN1551888A - 经修饰的人生长激素

Info

Publication number: CN1551888A
Application number: CNA028172779A
Authority: CN
Inventors: F��J��; F·J·卡尔; G·卡特
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2004-12-01
Also published as: JP2005501546A; BR0211991A; US20050020494A1; EP1427756A1; WO2003020761A1; HUP0402334A2; HUP0402334A3; PL369066A1; KR20040039323A; ZA200402602B; RU2004110238A; MXPA04001976A; CA2459138A1

Abstract

本发明涉及人生长激素(hGH)的修饰而导致人生长激素蛋白在体内使用时其基本无免疫原性或者比任一未经修饰的相应蛋白的免疫原性要低。本发明还涉及源自具有免疫原性的hGH的T细胞表位序列。

Description

经修饰的人生长激素

发明领域

本发明涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明特别涉及对人生长激素的修饰，该修饰使得体内使用时这些人生长激素蛋白基本上无免疫原性，或比任一未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。

发明背景

有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已开发了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。

抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)。在这些人蛋白具有免疫原性的情况下，可能发生了对这些蛋白的免疫耐受的破坏，否则对这些蛋白的免疫耐受将在这些受试者体内运行。

当人蛋白被作为替代治疗，例如在蛋白的组成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和许多其他疾病的遗传性疾病中，情况就不同了。在这些情况下，治疗学替代蛋白可能一开始就作为外来分子而产生免疫应答，并且当个体能够产生针对该治疗剂的免疫应答时，该治疗的功效将大打折扣。

不管该蛋白治疗剂被宿主免疫系统视作外来分子还是本来存在的对该分子的耐受被克服了，对该蛋白的免疫反应的机理是相同的。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。此类T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸残基序列。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。

MHC H类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用。人群中的每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。

针对治疗性蛋白的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。

T细胞表位的鉴定是消除表位的第一步，然而，本领域中少有将表位鉴定和表位去除整合为一个方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置换除去预测的T细胞表位。然而，在该方案和其他基于计算的表位鉴定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.) 161：850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)17：555-561]中，预测的能够结合MHC II类分子的肽可能不会在所有情况下(尤其是在体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的作用。

同样，例如用限定的MHC同种异型B细胞系作为MHC II类结合表面的来源以测量合成肽结合MHC II类分子的能力的体外方法可以应用于MHC II类配体的鉴定[Marshall K.W.等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.) 152：4946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫学杂志(J.Immunol.) 145：1799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol) 159：3238-3246]。然而，这些技术不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位，也不能确定结合肽能够起T细胞表位的作用。

最近利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合体的技术已经得到应用[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]。这些试剂和方法用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。

T细胞活化的生物学测定提供了一个解读试验肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的例子包括Petra等人用对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖进行测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图[Petra，A.M.等人(2002)免疫学杂志(J.Immunol.) 168：155-161]。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行T细胞增殖测定导致明确了该毒素免疫显性的表位区[Reece J.C.等人(1993)免疫学杂志(J.Immunol.) 151：6175-6184]。WO99/53038公开了一种方法，该方法利用分离的人免疫细胞亚型，促进它们的体外分化，在合成的目的肽存在时培养细胞，并测定培养的T细胞中任何诱导的增殖来确定受试蛋白的T细胞表位。同样的技术也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治疗杂志(J.Immunotherapy) 23：654-660]描述过，在这两个例子中，该方法都用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶的T细胞表位。这种技术需要小心应用细胞分离技术和补充多种细胞因子的细胞培养基以得到所需的免疫细胞亚型(树突状细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)，并且无助于使用多种供体样品的快通量筛选。

根据上述描述，由此可能期望鉴定、去除或至少减少给定的原则上具有治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。人生长激素(这里简写为hGH)是这些有治疗价值的分子之一。

天然的hGH是分子量为22kDa、具有191个氨基酸残基的垂体激素。已知还有通过另一剪接得到的另一种20kDa产物，其和22kDa形式的hGH相比具有某些改变的特性[Wada，M.等人(1997)Mol.Cell Endocrinol.133：99-107]。用重组技术在多种宿主生物包括大肠杆菌(E.coli)[Goeddel，D.等人(1979)自然(Nature) 281：544-548]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[Honjo，J.等人(1987)生物技术杂志(J.Biotech) 6：191-204]、酵母[Hiramatsu，R.等人(1991)应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol). 57：2052-2056]和动物细胞[Lupker，J.等人(1983)基因(Gene)24：281-287]中产生了该22kDa蛋白。hGH的药物制剂被用于治疗垂体性侏儒、小儿慢性肾衰竭和类似的适应症。除了能够促进生长，该蛋白还具有许多生物学活性，包括巨噬细胞的激活和胰岛素样作用[Chawler，R.(1993)Ann.Rev.Med.34：519；Edwards，C等人(1988)科学(Science) 239：769]。

本发明涉及人生长激素(hGH)和如下用单字母密码描述的分泌形式的hGH蛋白的氨基酸序列：

FPTIPLSRLFQNAMLRAHRLHQLAFDTYEEFEEAYIPKEQKYSFLQAPQASLCFSESIPTPSNRE

QAQQKSNLQLLRISLLLIQSWLEPVGFLRSVFANSLVYGASDSDVYDLLKDLEEGIQTLMGRLED

GSPRTGQAFKQTYAKFDANSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

本发明的一个特别的目的是提供经修饰的hGH蛋白，其中通过减少潜在的T细胞表位数而改变免疫特性。

其他人已经提供了hGH分子(包括经修饰的hGH)及其重组产生、纯化和治疗用途的方案[EP 0107890，US 4,517,181，EP0105759；US4,703,035；US 4,658,021；EP0022242；EP0001929；EP0001939；US4,342,832；US 4,601,980；US 4,604,359；US 4,634,677；US 4,898,830；US5,424,119；US 4,366,246；US 4,425,437；US 4,431,739；US 4,563,424；US4,571,421；EP 0131843；EP 0319049；US 4,831,120；US 4,871,835；US4,997,916；US 5,612,315；US 5,633,352；US 5,618,697；US 5,635,604；EP0127658；EP 0217814；US 5,898,030；EP0804223]，但是这些教导没有说明T细胞表位对于该蛋白免疫原性特性的重要性，也没有考虑根据本发明的方案以特异并受控的方式直接影响所述特性。这方面的一个例子是Lowman和Wells[Lowman H.B.& Wells J.A.(1993)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 243：564-578]所提供的，他们使用噬菌体展示技术产生了hGH的变体，该变体对于hGH受体的结合亲和性增加了约400倍。该高亲和性变体含有15处氨基酸替代，但是没有考虑该新变体分子的免疫学特性。

然而，如本文下面首次公开的，根据本发明方案，本发明人发现该高亲和性变体的这15处替换中，预测7处(在第10、14、42、45、54、176和179位)可提供免疫学上的益处。

非常希望提供具有减少或者没有可能在人类受试者中诱导免疫应答的hGH。

发明概述和描述

本发明提供了修饰形式的hGH，其中，通过减少或去除潜在的T细胞表位数目对hGH的免疫学特性进行修饰。

本发明公开了在hGH一级序列内鉴定到的由于具有与MHC II类分子结合的可能性而是潜在T-细胞表位的序列。该公开尤其涉及本文上面所给的人hGH蛋白序列，其含有191个氨基酸残基。

本发明公开了在人中具免疫原性的hGH一级序列的主要区域，因此，本发明提供了对这些序列进行修饰以消除或者降低这些位点的免疫原性效力所需的关键信息。

在一个实施方案中，含有免疫原性区的合成肽可以在药物组合物中提供以促进对整个分子的耐受原应答。

在另一个实施方案中，本文公开的在表位区内修饰的hGH分子可以用于药物组合物。

总之，本发明涉及下述内容：

●一种经修饰的分子，其具有hGH的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子；

●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的；

●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与来自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的；

●如上所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位；

●如上所述的分子，其中，所述原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体或通过呈递在II类分子上后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列；

●如上所述的分子，其中该肽序列选自如表1中所示的肽序列；

●如上所述的分子，其中在任何原本存在的T细胞表位中1-9个氨基酸残基，优选地1个氨基酸残基发生了改变；

●如上所述的分子，其中，氨基酸残基的改变为在特定位点处用另外的氨基酸残基替代原本存在的氨基酸残基、向原本存在的氨基酸残基添加另外的氨基酸残基或将原本存在的氨基酸残基缺失；

●如上所述的分子，其中，按表2所示进行一个或多个氨基酸残基的替代；

●如上所述的分子，其中(额外地)如表3中所示进行一个或多个氨基酸残基替代，以减少能够结合源自该分子的肽的MHC同种异型的数目；

●如上所述的分子，其中，如果必要，一般可通过替代、添加或缺失特定氨基酸进行额外的进一步改变，以恢复所述分子的生物学活性；

●如上所述的hGH分子，其中一个或多个氨基酸替代在相应于表2或表3中特定的任何氨基酸位置进行；

●如上所述的hGH分子，其中一个或多个氨基酸替代在相应于表2或表3中特定的任何氨基酸位置进行，但是排除已知形成与功能蛋白不匹配的hGH遗传突变的这类替代；

●药物组合物，其包含具有结合MHC II类活性的上面的肽或修饰肽的任何一种；

●DNA序列或分子，其编码如上或如下所定义的任何一种所述特异修饰的分子；

●药物组合物，其包含如上述和/或权利要求中定义的具有hGH生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；

●用于制备具有hGH生物学活性的修饰分子的方法，所述修饰分子为在以上引用的权利要求的任一项中所定义的修饰分子，所述方法包括以下步骤：(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；

●如上所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来进行的；

●如上所述的方法，其中，所述的改变是参照同源蛋白质序列和/或硅片上(in silico)建模技术进行的；

●如上所述的方法，其中以上步骤(ii)是通过下述步骤进行的：(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)然后由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；(c)通过对存在于抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合分值；和(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前提下改变肽的整体MHCII类结合分值；步骤(c)优选地通过下述步骤利用经改进而包含了12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm评分函数(scoringfunction)进行，所述步骤为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)提供所述MHC II类分子模型的容许肽主链(allowed peptide backbone)的第二数据库；(3)从第一数据库中筛选模型；(4)从第二数据库中筛选容许肽主链；(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定存在于每个抽样片段中的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)到(5)；

●选自表1的具有潜在的MHC II类结合活性且由未经修饰的hGH产生的13聚体(mer)T-细胞表位肽，及其在制备在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未修饰分子的hGH中的用途；

●由上述的13mer T-细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成的肽序列，及其在制备在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未修饰分子的hGH中的用途；

●在生物学T细胞测定中使用一组合成肽以对人hGH的免疫原性区作图；

●在生物学T细胞测定中使用一组hGH蛋白变体以选择显示体外最小免疫原性的变体；

●在生物学T细胞测定中使用一组合成肽以选择显示体外最小免疫原性的肽序列；

●使用T细胞刺激的生物学分析以选择在幼稚T细胞测定中刺激指数小于2.0、优选小于1.8的蛋白变体；

●用分离自健康供体的PBMC构建hGH蛋白的T细胞表位图和包括下面步骤的筛选方法：i)用合成肽或者完整蛋白免疫原进行体外抗原接触，培养时间长达7天；ii)加入IL-2并培养长达3天；iii)加入接触过抗原的T细胞到自体经照射的PBMC中并且用抗原再次攻击，培养时间为4天和iv)通过任何合适的方法测量增殖指数；

●在幼稚T细胞测定中能够引起刺激指数大于1.8、优选大于2.0的hGH衍生肽序列；

●在幼稚T细胞测定中刺激指数大于1.8、优选大于2.0的hGH衍生肽序列，其中肽被最小程度地修饰并在幼稚T细胞测定中检验发现其刺激指数小于2.0；

●hGH衍生肽序列和野生型蛋白序列具有100％的氨基酸同一性，并且能够在T细胞测定中引起的刺激指数为1.8或者更大、优选大于2.0；

●如上所述的hGH肽序列，其被修饰而和野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％，并且在T细胞测定中引起的刺激指数小于2.0；

●一种含有经修饰的肽序列的hGH分子，当该修饰的肽序列单独测试时，其在T细胞测定中引起的刺激指数小于2.0；

●一种含有经修饰的hGH分子，该修饰使得在T细胞测定中测试时引起比未修饰的蛋白分子降低的刺激指数；

●一种hGH分子，其中用T细胞测定对免疫原性区进行了作图，然后对其进行修饰，使得在T细胞测定中重新试验时，修饰的蛋白引起的刺激指数比亲本(未修饰的)分子小、最优选小于2.0。

术语″T细胞表位″根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHC II类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。

此处及后附权利要求中所用的术语“肽”是指包含两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸之间通过肽键(定义见下)相连。肽的生物生产中涉及20种不同的天然氨基酸，任意数量的所述氨基酸可按任意的顺序连接形成肽链或环。用于生物生产肽中的天然氨基酸全部具有L-构型。可应用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。一些肽仅包含少量的氨基酸单元。例如含有不到10个氨基酸单元的短肽有时被称作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸残基，例如达100个或更多个氨基酸残基的肽称作“多肽”。习惯上将含有3个或3个以上氨基酸的任何肽链看作“多肽”，而通常将“寡肽”视为特定类型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”应理解为也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的数量以及可形成的不同蛋白的数量实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。

本发明可应用于与此处公开的hGH具有基本上相同的一级氨基酸序列的任何hGH分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法获得的、可能包含多于或少于191个氨基酸残基的hGH分子。本公开的许多肽序列和从非人源hGH蛋白得到的肽序列一样或者至少和那些非人hGH蛋白得到的肽序列基本一样。这些蛋白序列因此同样都位于本发明范围之内。

本发明是为了克服实际应用中存在的下述问题，即将可溶性蛋白引入自体生物中可引发免疫应答，产生可与所述可溶性蛋白相结合的宿主抗体。本发明通过提供施用于人宿主时引起免疫应答的倾向发生改变的hGH蛋白以试图解决这个问题。根据本文描述的方法，发明人已经发现了含有驱动对该蛋白产生免疫应答的关键性T细胞表位的hGH分子区域。

本发明中形成经修饰的hGH的总的方法包括下述步骤：

(a)确定多肽或其中一部分的氨基酸序列；

(b)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；

(c)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定。构建此序列变体以避免由所述的序列变体产生新的潜在T-细胞表位，否则所述的新的潜在T细胞表位又通过此种方式进行修饰以基本上减弱或消除T-细胞表位活性；和

(d)根据已知的重组技术通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体。

对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公开了适当的方法，并优选用于鉴定从hGH衍生的肽对MHC II类分子的结合倾向。

在实施例1中公开了另一种非常有效的通过计算鉴定T-细胞表位的方法，它是本发明的优选实施方案。

涉及人hGH蛋白序列的根据上述方案中步骤(b)的分析结果列于表1。

表1：人hGH中具有潜在人MHC II类结合活性的肽序列

PTIPLSRLFQNAM， IPLSRLFQNAMLR， SRLFQNAMLRAHR，

RLFQNAMLRAHRL， NAMLRAHRLHQLA， AMLRAHRLHQLAF，

HRLHQLAFDTYEE， HQLAFDTYEEFEE， LAFDTYEEFEEAY，

DTYEEFEEAYIPK， EEFEEAYIPKEQK， EAYIPKEQKYSFL，

AYIPKEQKYSFLQ， QKYSFLQAPQASL， YSFLQAPQASLCF，

SFLQAPQASLCFS， ASLCFSESIPTPS， LCFSESIPTPSNR，

ESIPTPSNREQAQ， SNLQLLRISLLLI， LQLLRISLLLIQS，

QLLRISLLLIQSW， LRISLLLIQSWLE， ISLLLIQSWLEPV，

SLLLIQSWLEPVG， LLLIQSWLEPVGF， LLIQSWLEPVGFL，

QSWLEPVGFLRSV， SWLEPVGFLRSVF， EPVGFLRSVFANS，

VGFLRSVFANSLV， GFLRSVFANSLVY， RSVFANSLVYGAS，

SVFANSLVYGASD， NSLVYGASDSDVY， SLVYGASDSDVYD，

LVYGASDSDVYDL， SDVYDLLKDLEEG， DVYDLLKDLEEGI，

YDLLKDLEEGIQT， DLLKDLEEGIQTL， KDLEEGIQTLMGR，

EGIQTLMGRLEDG， QTLMGRLEDGSPR， TLMGRLEDGSPRT，

GRLEDGSPRTGQA， QAFKQTYAKFDAN， QTYAKFDANSHND，

AKFDANSHNDDAL， DALLKNYGLLYCF， ALLKNYGLLYCFR，

KNYGLLYCFRKDM， YGLLYCFRKDMDK， GLLYCFRKDMDKV，

LLYCFRKDMDKVE， YCFRKDMDKVETF， KDMDKVETFLRIV，

DKVETFLRIVQCR， ETFLRIVQCRSVE， TFLRIVQCRSVEG，

LRIVQCRSVEGSC， RIVQCRSVEGSCG

肽是13肽，氨基酸用单字母代码表示。

涉及本发明的经修饰分子的根据上述方案中步骤(c)和(d)的设计和构建结果列于表2和表3。

表2：导致人hGH T细胞表位去除的替代(WT＝野生型残基)

WT残基替代# 残基4 I A C D E G H K N P Q R S T6 L A C D E G H K N P Q R S T9 L A C D E G H K N P Q R S T10 F A C D E G H K N P Q R S T14 M A C D E G H K N P Q R S T15 L A C D E G H K N P Q R S T20 L A C D E G H K N P Q R S T23 L A C D E G H K N P Q R S T25 F A C D E G H K N P Q R S T28 Y A C D E G H K N P Q R S T31 F A C D E G H K N P Q R S T35 Y A C D E G H K N P Q R S T36 I A C D E G H K N P Q R S T42 Y A C D E G H K N P Q R S T44 F A C D E G H K N P Q R S T45 L A C D E G H K N P Q R S T52 L A C D E G H K N P Q R S T54 F A C D E G H K N P Q R S T58 I A C D E G H K N P Q R S T73 L A C D E G H K N P Q R S T75 L A C D E G H K N P Q R S T76 L A C D E G H K N P Q R S T78 I A C D E G H K N P Q R S T80 L A C D E G H K N P Q R S T81 L A C D E G H K N P Q R S T82 L A C D E G H K N P Q R S T83 I A C D E G H K N P Q R S T86 W A C D E G H K N P Q R S T87 L A C D E G H K N P Q R S T90 V A C D E G H K N P Q R S T92 F A C D E G H K N P Q R S T93 L A C D E G H K N P Q R S T96 V A C D E G H K N P Q R S T97 F A C D E G H K N P Q R S T101 L A C D E G H K N P Q R S T102 V A C D E G H K N P Q R S T103 Y A C D E G H K N P Q R S T110 V A C D E G H K N P Q R S T

111 Y A C D E G H K N P Q R S T113 L A C D E G H K N P Q R S T114 L A C D E G H K N P Q R S T117 L A C D E G H K N P Q R S T121 I A C D E G H K N P Q R S T124 L A C D E G H K N P Q R S T125 M A C D E G H K N P Q R S T128 L A C D E G H K N P Q R S T139 F A C D E G H K N P Q R S T143 Y A C D E G H K N P Q R S T146 F A C D E G H K N P Q R S T156 L A C D E G H K N P Q R S T157 L A C D E G H K N P Q R S T160 Y A C D E G H K N P Q R S T162 L A C D E G H K N P Q R S T163 L A C D E G H K N P Q R S T164 Y A C D E G H K N P Q R S T166 F A C D E G H K N P Q R S T170 M A C D E G H K N P Q R S T173 V A C D E G H K N P Q R S T176 F A C D E G H K N P Q R S T177 L A C D E G H K N P Q R S T179 I A C D E G H K N P Q R S T180 V A C D E G H K N P Q R S T

表3：导致相应于一个或多个MHC同种异型的潜在T-细胞表位去除的额外替代

WT替代残基残基6 L M W Y9 L I M V W Y11 Q H12 N A C G P T14 M F I V W Y15 L F I M V W Y16 R A C G P17 A D E H K N P Q R S T18 H P

19 R A C G P20 L F I M V W Y21 H P T22 Q A C G P T23 L W I M V W Y25 F W Y26 D P T29 E T30 E H31 F I V W33 E H T34 A I P T Y36 I F W Y39 E T44 F W Y45 L F I M W Y47 A C D E G H K N P Q R S T49 Q D H50 A D E H K N P Q R S T51 S T52 L F I M V W Y53 C H P T73 L F I M V W Y74 Q A C G P75 L F I M V W Y76 L F I M V W Y77 R A C G P78 I W Y79 S A C G P T80 L F I M V W Y81 L F I M V W Y82 L F I M V W Y83 I F W Y84 Q A C G P T85 S A C G P86 W A C D E G H K N P Q R S T87 L A C D E G H K M N P Q R S T W Y88 E P T90 V M W Y93 L F I M W Y

94 R A C G P95 S A C G P T96 V F I M W Y97 F M W Y98 A D E H K N P Q R S T99 N A C G H P T100 S A C G P T101 L F I M V W Y102 V F I M W Y104 G D E H K N P Q R S T105 A C D E H K N P Q R S T106 S A C D G H P107 D A C G P T108 S A C G P T109 D A C G H P T110 V M W Y112 D A C G P113 L F I M V W Y114 L F I M V W Y115 K A C G H P116 D A C G H P T117 L F I M W Y118 E A C G H P T119 E H P T120 G D E H K N P Q R S T121 I M W Y122 Q A C G H P T123 T A C G P124 L F I V W Y125 M F I V W Y126 G D E H K N P Q S127 R A C G P T128 L F I M V W Y129 E A C G P T130 D H P131 G C D E H K N P Q R S T132 S A C G P133 P T134 R P T135 T A C G P

136 G H P T139 F M W Y140 K A C G P141 Q A C G P142 T P143 Y W144 A D E H K N P Q R S T145 K P T147 D P T148 A D E H K N P Q R S T149 N A C G P T151 H P T156 L F I M V W Y157 L F I M W Y158 K A C G P159 N A C G H P T161 G D E H K N P Q S162 L F I M V W Y163 L F I V W Y165 C D E H K N P Q R S T167 R A C G H P168 K H P S T169 D A C G P170 M I V W Y171 D A C G P173 V M W Y175 T H176 F W Y177 L I M W Y178 R H P T179 I W Y180 V F I M W Y181 Q A C G P182 C F H L P T W Y183 R I P T V Y184 S A C D F G H I L M P T V W Y185 V A C D E F G H I K L M N P Q R S T W Y186 E I P T Y187 G F H I P T V W Y188 S F I P T V W Y

检测T细胞表位的另一个技术方法是通过生物学T细胞测定。对于检测人hGH分子内的T细胞表位，一个特别有效的方法将是检验表1中所有或者任何肽序列引起体外培养的人T细胞的增殖性应答的能力。优选的方法将是利用个体的外周血单核细胞(PBMC)，实际上，由于个体中的遗传缺陷，hGH蛋白抗原可以成为外来蛋白。从这种意义上说，该蛋白很可能代表体内的强抗原。这可以通过将T细胞进行几轮抗原(hGH)体外刺激后立即在IL-2存在下增殖而完成。为了建立多克隆T细胞系，2-3轮抗原刺激通常足够产生大量抗原特异性细胞。这些细胞被用于筛选大量的合成肽(例如以肽库的形式)，并且它们可以低温保藏以备用。在包括将hGH抗原和PBMC共同孵育7天后的最初一轮完成后，随后在最优选的作为抗原呈递细胞的自体经照射PBMC存在下，进行抗原的再次攻击。这些轮的抗原选择进行3-4天，并且引入包括用IL-2刺激的增殖阶段，可以每3天加入IL-2，总的时间约9天。最后的再次攻击用已经“静息”的T细胞(即没有被IL-2刺激已经约4天了)进行。如前所述使用最优选的自体抗原呈递细胞，用抗原(例如合成肽或完整蛋白)刺激这些细胞约4天，随后测量增殖应答(如果有的话)。可以用任何方便的方法测量增殖应答，一种公知的方法例如是使用³H-胸腺嘧啶掺入测定。

所以，本文上面所实施的方法包括产生来自个体的PBMC样品的T细胞系或者寡克隆培养物，其中所述个体为已经用hGH开始了先前的治疗性替代治疗，并且该替代治疗已经诱导了对该治疗蛋白的免疫应答。将来自这些个体的细胞系或者培养物与合成肽或者完整蛋白制品接触，体外测定增殖效果。对于任何单个的合成肽或者蛋白，可以生产变体并重新检验所述修饰肽或蛋白的促进T细胞系或培养物产生显著增殖性应答的后续能力。这样，例如可以在这种测定中检验含有表2或者表3中鉴定的任何替代或者组合替代的合成肽。

在该方案中，预期有许多这些个体的T细胞库所定义的hGH蛋白的表位图将代表能够进行体内呈递的大多数优势肽表位。在这种意义上说，来自在先前显示出免疫应答的病人的PBMC构成了体内接触治疗性蛋白的产物，并且如果来自这些个体的PBMC细胞系原则上是用于体外免疫记忆测定，它还提供了实际的好处：有能力对任何给定的刺激肽或蛋白进行更大幅度的增殖性应答。这降低了进行增殖测定的技术挑战，并且在这种情况下可以有机会定义免疫显性表位的可能的序位，如对于hGH，本文中通过计算发现其含有多种MHC II类肽配体并因此含有多种或者复杂的(即重叠的)T细胞表位。

尽管从以前用治疗性hGH替代治疗导致诱导对hGH产生免疫应答的个体建立寡克隆培养物的T细胞系是尤其有用的，但是这些个体不是唯一的可用于对体内相关的免疫原性表位作图的细胞的来源。也可以使用健康共同的幼稚T细胞，然而，此时对任何个体肽所得到的刺激指数的大小较低而需要敏感的测量从背景中看出该肽或蛋白所诱导的刺激。本发明人已经用熟知的技术建立了这种测定的实施方法，其中等于或大于2.0的刺激指数可用以测量诱导的增殖，其中刺激指数为测得的受试(多)肽的增殖分值(例如如果用³H-胸腺嘧啶掺入，则为每分钟的计数)与没用受试(多)肽接触的细胞中测得的增殖分值的商。这种类型的合适方法在实施例2中详述。

当在生物学测定中鉴定了多种潜在表位，尤其是发现许多肽序列能够刺激T细胞时，也可以进行该蛋白的结构特征与其通过MHC II类呈递途径引起免疫应答的倾向的认识。例如，当知道了目的蛋白的晶体结构时，可以分析晶体学B因子分值以证明该蛋白内的结构无序，该晶体学B因子分值参数被认为与邻近生物学相关的免疫显性肽表位相关[Dai G.等(2001)生物化学杂志（J.Biological Chem.) 276：41913-41920]。当在hGH晶体结构上进行这种分析[PDB ID：1HGU Chantalat，L.等人(1995)，蛋白质和肽通讯(Protein And Peptide Letters) 2：333 & PDB ID 1A22 Clackson，T.等人(1998)，分子生物学杂志((J.Mol.Biol.) 277：1111]时表明很可能在非受体结合结构中存在多个免疫显性表位[PDB ID 1HGU]，在该结构中有至少7个高于B因子平均分值的峰。该分析表明生物学相关的T细胞表位位于hGH序列的从41位谷氨酰胺残基开始的下游区。因此，在本发明方案中，在表2和表3中所列的氨基酸替代中，最优选的替代包括涉及42-180位残基中的那些残基的替代。

在实践中，将产生许多的变体hGH蛋白并且检验所需的免疫和功能特征。可以参考出版的文献中已知导致该分子功能特性改变的突变[Lowman H.B.& Wells J.A.(1993)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 243：564-578；Wells J.A.等人(1993)Recent Prog.Horm.Res. 48：253-275]，也可以将在表2和表3中列出的已知对该蛋白功能有害的突变排除于分析之外，或者备选地为了恢复该蛋白的功能活性，可以选择地进行补偿突变。在一切情况下，最优选通过熟知的重组DNA技术生产变体蛋白，虽然可以考虑包括hGH片段的化学合成的其他方法。本发明涉及这样的hGH类似物，其中至少一个氨基酸残基的替代在导致该蛋白的活性显著降低或一个或多个潜在T细胞表位被除去的位置处进行。最优选提供hGH分子，其中氨基酸修饰(例如替代)在亲本分子的免疫原性最强区进行。本发明主要的优选实施方案包括这样的hGH分子，其中改变任何MHC II类配体以消除肽对MHC同种异型的结合或者减少该肽结合MHC同种异型的数目。

为了除去T细胞表位，优选在所预测的肽序列中合适的位点进行氨基酸替代以完成T细胞表位活性的减小或者消除。实践中，合适的位点优选等同于在MHC II类结合沟所提供的口袋之一中结合的氨基酸残基。

最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代是替代为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替代为更亲水的残基。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内，所述位置为与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置。

可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这可能对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的″口袋残基″的位置，而是在所述肽序列内的任意位点上进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的硅片上(insilico)技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。

本发明的范围涉及经修饰的hGH，含有上述经修饰的hGH蛋白或经修饰的hGH蛋白片段的组合物及其相关的组合物应认为均落入本发明的范围内。另一方面，本发明涉及编码经修饰的hGH实体的核酸。另一方面本发明涉及利用经修饰的hGH蛋白对人进行治疗的方法。

又在另一个方面，本发明涉及用含有其序列和本文公开的序列相同或者部分相同的肽或者衍生分子的药物制剂进行治疗性治疗的方法。

实施例1

有多种因素对决定蛋白或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一个化合物。

连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：

由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。

第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是每一酰胺平面绕共有Cα键的转角。此后术语″转角″和″扭转角″是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地规定了多肽链的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和Ψ角的惯例，即在给定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是Ψ角的定义。参见Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。

本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHCII类分子结合沟的主要口袋1锚定位点对特定氨基酸侧链具有设计好的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位相关的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。

将本发明具体化的计算机方法描绘出肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选约两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予大约处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3中的描述计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。在这一方面本发明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-细胞表位的肽区域。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变MHC II类的结合特性。

依照本发明的另一方面，可利用考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用的更复杂计算方法来更精确地预测T-细胞表位。根据这一方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHCII类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸选项中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。

MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(″PDB″)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)来制备。也可以应用其他的建模方法。

本发明的方法与下述的其他计算方法有着显著的不同，这些方法在于：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样利用相对小的MHC II类分子亚组)然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变体造成仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，故其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中存在的主链构象，从而导致对肽结合的预测不准确。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，但为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C″-α位点的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。

自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。

生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。

用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。

在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C″-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。

肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。

亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。

范德华键是相距3-4的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1到2处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。

在一个实施方案中，利用Bhm评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的Bhm评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(″PDB″)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述Bhm函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的Bhm评分函数评估结合能。在经修饰的Bhm评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔG_bind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG₀)；理想氢键的贡献(ΔG_hb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔG_ionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔG_lipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔG_rot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(E_VdW)。考虑到这些项给出等式1：

(ΔG_bind)＝(ΔG₀)+(ΔG_hb×N_hb)+(ΔG_ionic×N_ionic)+(ΔG_lipo×N_lipo)+(ΔG_rot+N_rot)+(E_vdW)

其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG₀、ΔG_hb、ΔG_ionic、ΔG_lipo和ΔG_rot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。

N_hb项依照等式2计算：

N_hb＝∑_h-bondf(ΔR，Δα)× f(N_neighb)×f_pcs

f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：

f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)

其中：

如果ΔR＜＝TOL 则f1(ΔR)＝1，或者

如果ΔR＜＝0.4+TOL 则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，

或者

如果ΔR＞0.4+TOL 则f1(ΔR)＝0

并且：

如果Δα＜30° 则f2(Δα)＝1，或者

如果Δα＜＝80° 则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者

如果Δα＞80° 则f2(Δα)＝0

TOL是氢键键长中所能允许的偏差＝0.25

ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9的偏差

Δα是氢键键角∠_N/O-H..O/N与180°理想值的偏差

f(N_neighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：

f(N_neighb)＝(N_neighb/N_neighb，0)^α，其中α＝0.5

N_neighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5的非氢原子的数量。

N_neighb，0是常数＝25

f_pcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：

当A_polar/N_HB＜10²时 f_pcs＝β或

当A_polar/N_HB＞10²时 f_pcs＝1

A_polar是极性蛋白-配体接触面的大小

N_HB是氢键的数目

β是常数＝1.2

由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的Bhm评分函数时，离子相互作用的贡献ΔG_ionic用与上述有关氢键的类似方式计算。

N_lipo项按下述的等式5计算：

N_lipo＝∑_lLf(r_lL)

根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(r_lL)：

当r_lL＜＝R1时 f(r_lL)＝1

当R2＜r_lL＞R1时 f(r_lL)＝(r_lL-R1)/(R2-R1)

当r_lL＞＝R2时 f(r_lL)＝0

其中：R1＝r_l ^vdw+r_L ^vdw+0.5

R2＝R1+3.0

r_l ^vdw是原子l的范德华半径

r_L ^vdw是原子L的范德华半径

N_rot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp³-sp³及sp³-sp²键的数目。末端-CH₃或-NH₃的旋转未考虑进去。

最终，项E_vdw依照如下等式6计算：

E_vdw＝ε₁ε₂((r₁ ^vdw+r₂ ^vdw)¹²/r¹²-(r₁ ^vdw+r₂ ^vdw)⁶/r⁶)，

其中：ε₁和ε₂是取决于原子身份的常数

r₁ ^vdw+r₂ ^vdw是范德华原子半径

r是原子对间的距离。

关于式6，在一个实施方案中，ε₁和ε₂常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00。

应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分y函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。

如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。

本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。

应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。

本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。

实施例2

用合成肽测定幼稚T细胞的方法

MHC、肽和T细胞受体(TCR)的相互作用提供了T细胞识别的抗原特异性的结构基础。T细胞增殖测定检验肽与MHC的结合和TCR对MHC/肽复合体的识别。本实施例的体外T细胞增殖测定包括刺激含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞的外周血单核细胞(PBMC)。用合成肽抗原进行体外刺激，在某些实验中使用完整蛋白抗原。用³H-胸苷(³H-Thy)测量刺激的T细胞增殖并对洗涤的固定细胞进行闪烁计数估计掺入的³H-Thy的存在。

从国家血液部门(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存时间小于12小时的人血血沉棕黄层。从Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培养初级人淋巴细胞的无血清AIM V培养基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷兰)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。

对血沉棕黄层轻微离心从血浆和血小板中分离出红血球和白血球。除去并扔掉顶层部分(含有血浆和血小板)。在磷酸盐缓冲液(PBS)中1∶1稀释红血球和白血球并铺在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根据生产商推荐的条件进行离心并从血清+PBS/菲可帕克界面收获PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通过离心收集。除去并扔掉上清液，将PBMC沉淀重新悬浮在50ml PBS中。通过离心再次沉淀细胞并抛弃PBS上清液。用50ml AIM V培养基重新悬浮细胞并在此时计数并用锥虫蓝染料排除估计存活率。再次离心收集细胞并抛弃上清液。细胞重新悬浮以低温保藏，密度为3×10⁷/ml。保藏培养基为90％(v/v)热失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。将细胞转移到受调节的冰冻容器(Sigma)并且在转移到液氮以长期保存前将其置于-70℃过夜。当需要使用时，在37℃水浴中快速解冻然后转移到10ml预热的AIMV培养基。

在96孔平底板(PBMC密度为2×10⁵ PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下将PBMC孵育7天后用³H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脉冲。对于本研究，可以产生并使用以3个氨基酸递增而覆盖hGH全序列的合成肽(15聚体)或者得自表1的所有或者任何肽或者含有在表2或表3中详述的替代的肽。每种肽都单独地一式三份地针对从20个未接触抗原供体中分离的PBMC进行筛选。在每个供体测定中使用先前已经显示具有免疫原性的两种对照肽和一种强的非记忆抗原KLH。

对照抗原如下：

肽	序列
肽	序列	C-32	生物素-PKYVKQNTLKLAT流感血细胞凝集素307-319
C-49	KVVDQIKKISKPVQH衣原体HSP60肽	C-32	生物素-PKYVKQNTLKLAT流感血细胞凝集素307-319
C-49	KVVDQIKKISKPVQH衣原体HSP60肽	KLH	来自匙孔血蓝蛋白的完整蛋白

将肽溶解于DMSO中使其终浓度为10mM，然后将这些贮存液在AIMV培养基中稀释到原来的1/500(终浓度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其终浓度为2和20μM(体积为100μl)。通过锥虫蓝染料排除估计解冻的PBMC的存活率。然后将细胞重新悬浮(密度为2×10⁶个细胞/ml)，向每个含有肽的孔中移入100μl(2×10⁵个PBMC/孔)。在每个肽浓度下测定一式三份的孔培养物。在5％CO₂、37℃的潮湿空气中孵育平板7天。用1μCi ³H-Thy/孔的脉冲细胞18-21小时后收获到过滤垫上。用Wallac微量培养板β顶层平板计数器(Perkin Elmer)或类似仪器测定CPM值。结果表达为刺激指数，用下面的式子确定：

受试肽的增殖CPM

未处理孔的增殖CPM

对于这种幼稚T细胞测定，认为大于2.0的刺激指数是阳性分值。当同一受试肽在多于一个供体样品中得到的刺激指数大于2.0时，认为其为可能的免疫优势表位的证据。

Claims

1.一种经修饰的分子，其具有人生长激素(hGH)的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子。

2.如权利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的。

3.如权利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的。

4.如权利要求2或3所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位。

5.如权利要求2-4中任意一项所述的分子，其中，所述原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体或经呈递在II类分子上后显示出刺激或结合T-细胞的能力的肽序列。

6.如权利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列选自如表1所示的肽序列。

7.如权利要求2-6中任意一项所述的分子，其中，任何原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基发生了改变。

8.如权利要求7所述的分子，其中，有一个氨基酸残基发生了改变。

9.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是用其他的氨基酸残基在特定的位置处替代、添加或缺失原本存在的氨基酸残基。

10.如权利要求9所述的分子，其中，按表2所示进行一个或多个氨基酸残基的替代。

11.如权利要求10所述的分子，其中，排除已知形成与功能蛋白不匹配的hGH遗传突变的这类替代。

12.如权利要求10或11所述的分子，其中，另外还按表3所示进行一个或多个氨基酸残基的替代以减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量。

13.如权利要求9所述的分子，其中，按表3所示进行一个或多个氨基酸的替代。

14.如权利要求13所述的分子，其中，排除已知形成与功能蛋白不匹配的hGH遗传突变的这类替代。

15.如权利要求7-14中任意一项所述的分子，其中，通过其它进一步的改变恢复所述分子的生物学活性。

16.如权利要求15所述的分子，其中，其它进一步的改变是替代、添加或缺失特定的氨基酸。

17.如权利要求7-16中任意一项所述的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照同源蛋白序列进行的。

18.如权利要求7-16中任意一项所述的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照硅片上(in silico)建模技术进行的。

19.如权利要求1-18中任意一项所述的修饰分子，其与相应的野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％并且当在T细胞测定中检测时引起小于2.0的刺激指数。

20.如权利要求1-18中任意一项所述的修饰分子，当在T细胞测定中检测时与未修饰蛋白分子相比其引起降低的刺激指数。

21.编码权利要求1-20中任意一项所述的经修饰人生长激素(hGH)分子的DNA序列。

22.一种药物组合物，其包含上述任意一项权利要求中所定义的具有人生长激素(hGH)生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。

23.制备上述任意一项权利要求中所定义的具有人生长激素(hGH)生物学活性的经修饰分子的方法，该方法包括下述步骤：

(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；

(ii)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；

(iii)设计在已鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸被修饰的新序列变体，其中所述修饰为替代、添加或缺失任意原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定，或通过肽-MHC复合物与T-细胞的结合来确定；

(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需特性的变体；和

(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)。

24.如权利要求23所述的方法，其中，步骤(ii)是通过下述步骤进行的：

(a)选择具有已知氨基酸残基序列的所述肽的一个区域；

(b)由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；

(c)通过对存在于所述抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合分值；和

(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前提下改变肽的整体MHC II类结合分值。

25.如权利要求24所述的方法，其中，步骤(c)通过下述步骤利用经改进而包含了12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm评分函数进行，所述步骤为：

(1)提供MHC II类分子模型的第一数据库；

(2)提供所述MHC II类分子模型的容许肽主链的第二数据库；

(3)从所述的第一数据库中筛选模型；

(4)从所述的第二数据库中筛选容许肽主链；

(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；

(6)确定存在于每个抽样片段中的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述的模型和每一所述的主链重复步骤(1)到(5)。

26.一种选自表1所示序列的13mer T-细胞表位肽，其具有潜在的MHC II类结合活性且产生自未经修饰的人生长激素(hGH)。

27.一种肽序列，其由如权利要求26所述的13mer T-细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成。

28.与野生型hGH有100％氨基酸同一性的9-15mer肽序列，当在T细胞测定中检测时，其引起大于2.0的刺激指数。

29.如权利要求26-28中任意一项所述的肽序列的用途，用于生产在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰分子的hGH。

30.如权利要求26-28中任意一项所述的肽序列的用途，用于生产与相应野生型蛋白序列相比较氨基酸同一性小于100％并且当在T细胞测定中检测时引起比未修饰的hGH分子要低的刺激指数或者至少小于2.0的刺激指数的hGH。