CN1675363A - 葡萄球菌肠毒素b中的t细胞表位 - Google Patents

葡萄球菌肠毒素b中的t细胞表位 Download PDF

Info

Publication number
CN1675363A
CN1675363A CNA038197464A CN03819746A CN1675363A CN 1675363 A CN1675363 A CN 1675363A CN A038197464 A CNA038197464 A CN A038197464A CN 03819746 A CN03819746 A CN 03819746A CN 1675363 A CN1675363 A CN 1675363A
Authority
CN
China
Prior art keywords
molecule
seb
cell
peptide
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA038197464A
Other languages
English (en)
Inventor
F·J·卡尔
M·贝克
G·卡特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN1675363A publication Critical patent/CN1675363A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫学领域。本发明鉴定在葡萄球菌肠毒素B(SEB)中可引起免疫反应的决定簇。具体地本发明涉及鉴定SEB中的T细胞表位。本发明还涉及来自SEB的T细胞表位肽，通过所述T细胞表位肽，可产生免疫原性降低的经修饰SEB变体。

Description

葡萄球菌肠毒素B中的T细胞表位
发明领域
本发明涉及免疫学领域。本发明鉴定了在葡萄球菌肠毒素B(SEB)中可引起免疫反应的决定簇。具体地本发明涉及鉴定SEB中的T细胞表位。本发明还涉及衍生自SEB的T细胞表位肽，通过所述T细胞表位肽，可产生免疫原性降低的经修饰SEB变体。
发明背景
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已开发了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP 0239400；EP 0438310；WO91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)。在这些人蛋白具有免疫原性的情况下，可能发生了对这些蛋白的免疫耐受的破坏，否则对这些蛋白的免疫耐受将在这些受试者体内运行。
对治疗性蛋白的持续的抗体反应需要刺激T辅助细胞增殖和活化。对T细胞的刺激需要在T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间建立T细胞接合。接合的核心是T细胞上的T细胞受体(TCR)与APC表面的肽MHC II类复合体作用。所述肽来自抗原性蛋白的胞内加工。来自蛋白抗原的可经呈递在MHC II类分子上而刺激T-细胞活化的肽序列称为″T细胞表位″。此类T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸残基序列。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。已知对许多蛋白而言，少量的T辅助细胞表位可驱动T辅助细胞信号传导而导致对治疗性蛋白的可能为一个非常大的暴露表面决定簇库产生持续的、高亲和性的、类别转换抗体反应。
T细胞表位的鉴定是消除表位的第一步，并且非常希望在治疗性蛋白中鉴定T细胞表位。专利申请WO98/52976和WO00/34317中教导了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threading approaches)。这些教导中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置换除去预测的T细胞表位。然而，在该方案和其他基于计算的表位鉴定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)161：850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)17：555-561]中，预测的能够结合MHC II类分子的肽可能不会在所有情况下(尤其是在体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的作用。此外，对T细胞表位预测的计算方法通常不能预测表位是为DP或DQ限制的。
同样，例如用限定的MHC同种异型B细胞系作为MHC II类结合表面的来源以测定合成肽结合MHC II类分子的能力的体外方法可以应用于MHC II类配体的鉴定[Marshall K.W.等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.) 152：4946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫学杂志(J.Immunol.) 145：1799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol) 159：3238-3246]。然而，这些技术不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位，也不能确定结合肽能够起T细胞表位的作用。
最近利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合体的技术已经得到应用[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]。这些试剂和方法用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。
T细胞活化的生物学测定提供了一个解读受试肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的例子包括Petra等人用对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖进行测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图[Petra，A.M.等人(2002)免疫学杂志(J.Immunol.) 168：155-161]。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行T细胞增殖试验导致明确了该毒素免疫显性的表位区[Reece J.C.等人(1993)免疫学杂志(J.Immunol.) 151：6175-6184]。WO99/53038公开了一种方法，该方法利用分离的人免疫细胞亚型，促进它们的体外分化，在合成的目的肽存在时培养细胞，并测定培养的T细胞中任何诱导的增殖来确定受试蛋白的T细胞表位。同样的技术也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治疗杂志(J.Immunotherapy) 23：654-660]描述过，在这两个例子中，该方法都用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶的T细胞表位。这种技术需要小心应用细胞分离技术和补充多种细胞因子的细胞培养基以得到所需的免疫细胞亚型(树突状细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)。
根据上述描述，由此可能期望鉴定、去除或至少减少给定的原则上具有治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。葡萄球菌肠毒素B(SEB)是这些有治疗价值的分子之一。
SEB是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的肠毒素家族中的一员。其他成员包括血清型不同的称为A、C1、C2、C3、D、E和F的蛋白。认为这些蛋白是引起葡萄球菌食物中毒。对这类蛋白的治疗兴趣之一源于它们作为″超抗原″的功能，即所述分子可刺激人T细胞活化。它们的治疗性潜能已在癌的许多临床试验中进行了检验，其中达到了增强T细胞活性从而导致免疫介导的对肿瘤细胞生长的抑制这一目的。在一些情况下，已将毒素分子与抗体连接而提供细胞特异性靶向[Dohlstein，M等(1994)PNAS USA 91：8945-8949；Giantonio，B.J.等(1997)J.Clin.Oncol.15：1994-2007；Hansson，J.等(1997)PNAS USA 94：2489-2494；Alpaugh，K.R.等(1998)Clin.Cancer Res.4：1903-1914]。
本发明主要涉及肠毒素B。SEB的成熟氨基酸序列包含237个氨基酸残基，以单字母描述为包含如下序列：
ESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVR
VEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYR
SITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENS
FWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK
作为″超抗原″，葡萄球菌肠毒素为最强力的T细胞有丝分裂原，已知其在低于常见的T细胞有丝分裂原如植物血凝素103浓度时引起强的多克隆增殖。它们刺激大量的人CD4+和CD8+T细胞群。它们刺激T细胞的能力严格受MHC II类抗原限制。已经知道葡萄球菌肠毒素和其它超抗原毒素直接与T细胞受体和MHC II类结合。当这两种结构接触时，模拟强的同种异体反应通过T细胞受体的Vβ区刺激T细胞活化。最常见的对与MHC蛋白结合的抗原性肽的识别涉及T细胞受体的所有可变因素。相反，毒素对T细胞的刺激几乎仅通过T细胞受体的Vβ区。可认为毒素作为钳子使MHC II类的边侧与Vβ区处于紧挨T细胞受体的表面和MHC，在T细胞/APC接合形成时它们通常相互接触。
超抗原分子的这些和其它特定特性促进了将它们用于许多不同的实验性治疗策略，包括对癌的治疗。对于SEB毒素，Terman和同事们申请的一系列美国专利US，6,180,097；US，5,728,388；US，6,338,845；US，6,221,351；US，6,126,945和等同申请WO93/24136；WO98/26747；EP1103268和EP0511306一起详细描述了有关SEB基因、SEB蛋白(包括羧甲基化的SEB蛋白和SEB-抗体结合物及融合蛋白)的用途的现有技术。它们均是针对用于诱导癌细胞杀伤效应和癌治疗的方法或组合物。
例如EP0511306要求了包括SEB、SEB的同源物和具有作为超抗原的基本上相同生物学活性的SEB片段和与单克隆抗体结合的SEB偶联物在内的肠毒素分子的用途。
提供此类分子和偶联物用作癌治疗并且这样是有效的。但是由于SEB(也可能是任一连接的抗体成分)对人免疫系统的外源性，非常可能的是所引起的免疫反应可能不会限制任何第一次施用剂量的功效，但可能正好会限制接下来剂量的功效或引起明显的损害性副作用。所要求的药剂为仅针对癌症患者。对许多此类患者而言，由于之前的治疗方案或作为疾病的直接后果，他们的免疫系统可被抑制，并因此可降低基于SEB治疗的免疫原性结果。但是在其它患者中可能不存在此类限制，由此基于SEB的治疗是有利的。本发明的一个目的是首先明确SEB分子的免疫原性区域，从而提供引起有害免疫原性反应的潜在能力降低的基于SEB的组合物。此类组合物可用于较目前情况下更多种的临床适应症，包括非癌疾病。
相反，US，6,528,051认为使用SEB作为抗原，可产生针对其的特异性和保护性免疫反应。所述SEB作为胶体金复合体施用。
类似地，美国专利申请20010046501A1发展了在感染性疾病适应症的治疗性或预防性治疗方案中混合的SEA/SEB组合物的用途。该方法提供的组合物和治疗方案可通过耗竭幼稚(未活化)T细胞群而增强对抗原的特异免疫反应。
最近，美国专利申请20030009015A1提供了这样的超抗原疫苗制剂，其中超抗原的特性不再存在，但其结构足够完整地被免役系统识别而实现保护性接种。描述了在MHC II类结合区或TCR结合区中含有替代的SEB分子，并认为其足以达到所需的结果。认为替代用单字母代码表示包括61A、67Q、89A、94A和115A。
总体上，已采用了具有同样目的的策略来开发SEA毒素，例如美国专利申请20030039655A1认为其中SEA部分包含在表面暴露残基处的氨基酸替代的SEA-抗体偶联物可实现血清反应性的降低。与本申请不同的是，所述美国专利申请涉及能与宿主抗体相互作用的SEA分子的表面决定簇，而不是针对SEB中的T细胞表位。
由前述可见，虽然其他人已提供了包括经修饰SEB分子在内的SEB分子，但是这些教导既没有说明T细胞表位对该蛋白免疫原性的重要性，也没有意识到本发明的方案以特异性或受控制的方式直接影响所述特性。
因此，本发明的一个特定目的是提供这样的经修饰SEB蛋白，其中通过减少潜在的T细胞表位数而修饰其免疫特性。该免疫特性不同于完整蛋白通过MHC-TCR交联而作为T细胞活化的诱导剂这一功能特性。确切地说，本发明的一个目的是提供这样的SEB分子，其保留了超抗原活性但对治疗性施用的SEB诱导中和性免疫反应尤其是T细胞介导的中和抗体反应的能力降低。
在线性蛋白中T细胞表位的出处或位置文中称为″表位图谱″。本发明的一个目的是提供SEB的表位图谱。
本发明进一步的目的是提供这样的SEB类似物，其中事先绘制的T细胞表位作为MHC II类配体的能力或所述表位结合MHC II类分子而活化T细胞的能力下降。非常希望提供在人类受试者中具有降低的或没有能力诱导免疫反应的SEB，因此本发明的一个特定目的是提供这样的经修饰SEB蛋白，其中通过减少潜在的T细胞表位数而修饰其免疫特性。
总之，本发明涉及以下方面：
●在幼稚T细胞试验中使用一组合成肽来绘制SEB的免疫原性区；
●使用分离自20个或更多健康供体的PBMC，构建SEB蛋白的T细胞表位图谱，并且筛选方法涉及的步骤包括：i)体外抗原刺激，通过体外使用两种或多种浓度的合成肽免疫原培养不超过7天；使用含有生理比例的T细胞和抗原呈递细胞的PBMC制备物；以及ii)通过任一合适的方法测定诱导的增殖指数；
●SEB衍生肽序列，在幼稚T细胞试验中发现其引起的刺激指数大于1.8，并优选地大于2.0；
●在幼稚T细胞试验中发现其引起的刺激指数大于1.8，并优选地大于2.0的SEB衍生肽序列，其中所述肽经最小程度的修饰并对其进行了幼稚T细胞试验，发现其刺激指数小于2.0；
●SEB衍生肽序列，其与野生型蛋白序列具有100％氨基酸同一性并且在T细胞试验中发现其能引起的刺激指数为1.8或更大，并优选地大于2.0；
●如上所述的SEB肽序列，其经过修饰从而与相应野生型蛋白序列相比较氨基酸同一性小于100％并且当在T细胞试验中检测时引起的刺激指数小于2.0；
●SEB分子，其中使用T细胞试验已绘制了其免疫原性区，然后经修饰使得在T细胞试验中再次测定时，所述经修饰蛋白引起的刺激指数小于亲本(未经修饰的)分子并最优选地小于2.0；
●一种经修饰的分子，其具有SEB的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子；
●如上所述的分子，其中改变是在来自文中称为表位区R1、R2和R3的连续残基串的一个或多个残基处进行：
R1：KFTGLMENMKVLYDDNHVSAI；
R2：QFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRV；
R3：NKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDI
●如上所述的分子，其中改变是在来自包含以下序列的文中称为优选表位区R1a、R1b和R1c的连续残基串的一个或多个残基处进行：
R1a  KFTGLMENMKVLYDD，
R1b：GLMENMKVLYDDNHV，
R1c：ENMKVLYDDNHVSAI.
●如上所述的分子，其中改变是在来自包含序列SIKDTKLGNYDNVRV的文中称为优选表位区R2a的连续残基串的一个或多个残基处进行：
●如上所述的分子，其中改变是在来自包含序列DKYVDVFGANYYYQC的文中称为优选表位区R3a的连续残基串的一个或多个残基处进行：
●肽分子，其包含来自R1a，b，c-R3a或R1-R3任一序列中的13-15个连续残基；
●肽分子，其包含文中表1标识的任一序列中的13-15个连续残基；
●经修饰的SEB分子，其包含式I的氨基酸序列：
X0ESQPDPKPDELHKSSKFTGLX1ENX2KVLX3DDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSX4KD
TKX5GNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKX6X7DX8X9GANYYYQCYFSKKTNDINSHQT
DKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYL
TRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYND
NKMVDSKDVKIEVYLTTKKK，
其中X0为氢或靶向部分，如抗体、抗体结构域[Fab’、F(ab)2’、scFv、Fc结构域]、或其它蛋白或多肽；
X1＝A、G、P或M；
X2＝A、G、P或M；
X3＝T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或Y；
X4＝A或I；
X5＝H或L；
X6＝T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或Y；
X7＝H或V；
X8＝A、P、G或V；
X9＝T、H或F；
其中排除同时地X1＝M、X2＝M、X3＝Y、X4＝Y、X5＝L、X6＝Y、X7＝V、X8＝V且X9＝F；
●上述肽分子，其与来自表位区R1-R3或R1a-R3a的任一肽序列具有大于80％的氨基酸同一性；
●上述肽分子，其与来自文中表1标识的任一肽序列具有大于80％的氨基酸同一性；
●如上所述的肽序列，其可结合MHC II类；
●药物组合物，其包含具有结合MHC II类活性的上述肽或修饰肽的任何一种；
●DNA序列或分子，其编码如上或如下所定义的任何一种所述特异修饰的分子；
●药物组合物，其包含具有SEB生物学活性的经修饰分子；
●上述和/或权利要求中定义的药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
●用于制备具有SEB生物学活性的经修饰分子的方法，所述方法包括以下步骤：(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；
●如上所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来进行的；
●如上所述的方法，其中，所述的改变是参照同源蛋白质序列和/或硅片上(in silico)建模技术进行的；
●由上述T细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成的肽序列，及其在制备体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于任何未修饰分子并且具有SEB分子生物学活性的SEB中的用途；
●将使用幼稚T细胞活化试验在SEB中绘制T细胞表位位置与模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算机方案相结合的方法；
●定位SEB中T细胞表位的方法，其包括以下步骤：i)使用幼稚T细胞活化试验和合起来包含目标蛋白质序列的合成肽来鉴定可活化T细胞的表位区；ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案分析步骤(i)中鉴定的表位区，并由此在表位区中鉴定MHC II类配体；iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案鉴定表位区中包含的MHC配体的如下序列类似物，所述序列类似物不再结合MHC II类或者以较低的亲和性结合较少数量的MHC同种异型；iv)使用幼稚T细胞活化试验和完全包含在目标蛋白质中鉴定的表位区的合成肽或合起来包含在目标蛋白质中鉴定的表位区的合成肽，并在幼稚T细胞活化试验中与野生型(亲本)序列平行地测试序列类似物；
●根据上述方案的方法，其中步骤(ii)和(iii)使用WO 02/069232所教导的计算方法实施；
●根据上述方案的方法，其中任选地进行步骤(iv)；
●根据上述方案的方法，其中幼稚T细胞活化试验使用来自约20个或更多不相关供体的PBMC细胞进行；
●根据上述方案的方法，其中当在两个或多个独立供体样本中观察到刺激指数分值约2.0时，则发现了T细胞表位的位置；
●根据上述方案的方法，其中当在两个或多个独立供体样本中观察到刺激指数分值约2.0时则发现了T细胞表位的位置，且其中可使用计算体系在同一序列位置中确定一个或多个MHC II类配体；
●根据上述方案的方法，其中计算体系是根据WO 02/069232所教导的方法。
发明详述：
根据本发明的第一个实施方案，提供了SEB的T细胞表位图谱。所述SEB的表位图谱已用于设计这样的SEB类似物，其中在特定的位置处已进行了氨基酸替代，并且所具有的特定残基导致来自所述蛋白的活性显著降低或一个或多个潜在T细胞表位的去除。本发明提供了在亲本分子最具免疫原性的区域进行合适替代的例子，并且此类替代认为是本发明的实施方案。
共同拥有的申请WO 02/069232使用硅片上技术确定多种治疗性蛋白的MHC II类配体。对于如需要蛋白水解酶加工免疫原性肽和导致其体内呈递的其他生理步骤，下面这一点是清楚的，即通过基于计算机的方案可定义的整个肽库中相对小的子集具有最终的生物学相关。本发明人建立的体外(ex vivo)人T细胞活化试验可用于确定SEB的蛋白序列中支持T细胞活化并因此为该蛋白中与免疫原性最具生物学相关的区域。文中公开的SEB表位图谱通过应用此类方法而获得，因此所公开的方法也为本发明的一个实施方案。
根据该方法，检测合成肽引起体外培养的人T细胞产生增殖反应的能力。所述T细胞存在于外周血单核细胞(PBMC)层，易于通过熟知的方法从全血样本中获得。而且所述PBMC制备物含有生理比例的T细胞和抗原呈递细胞并因此为体外进行替代免疫反应的好的材料来源。本发明人已建立了在操作此试验时，刺激指数紧紧靠近2.0或大于2.0为一个有用的测定诱导增殖的参数。该刺激指数(SI)一般如下获得：所测定的针对受试肽的增殖分值(如使用3H-胸腺嘧啶掺入时每分钟放射性的计数)除以未与受试肽接触的细胞增殖分值。不引起反应的肽产生的SI＝1.0，而在实践中SI值在0.8-1.2的范围内是常见的。为了确保所记录分值的可信性，可将许多技术方法结合入此类试验的操作中。一般所有的测定均至少一式三份进行，并计算平均分值。如果所计算的SI＝＞2.0，则可对一式三份中分别的分值检查存在偏离数据的证据。将受试肽以至少两种不同的浓度与细胞接触，并且所述浓度之间一般最少有两倍浓度差异。此浓度范围提供了所述试验的动力学范围，并且在单个时间点例如第7天测定时尤其重要。在一些试验中可进行多时程测定，但是在任何情况下，也应以最少两种不同的浓度提供肽免疫原。同样，试验板中可包括对照肽，其中所述对照肽预期对大多数PBMC供体样本为反应性的。流感血细胞凝集素307-319(序列：PKYVKQNTLKLAT)和衣原体HSP60肽(序列：KVVDQIKKISKPVQH)是尤其合适的对照肽，但也可使用许多其他的例子。所述试验应优选地也使用强的完整蛋白质抗原如匙孔血蓝蛋白，所有的PBMC样本对该抗原预期会显示SI明显大于2.0。
尤其希望提供这样的SEB表位图谱，所述图谱与大范围可能的MHC同种异型相关。希望所述图谱有足够的代表性，使得可以设计或选择对大多数可能施用该蛋白质的患者引起T细胞免疫反应的能力消失或至少减小的经修饰蛋白质。因此在筛选方法的实践中，来自原初供体PBMC的T细胞收集自具有足够免疫多样性的供体库，以提供在人群中至少大于90％的MHC II类库(HLA-DR)的样本。如果欲对给定的合成肽检测幼稚T细胞反应，该肽实际上与来自多个分别供体的PBMC制品接触。供体的数量(或″供体库″的大小)实际上不可能小于20个不相关个体并且供体库中的所有样本根据他们的MHC II类单倍型进行预选择。
术语″原初供体″在本发明上下文中是指获自没有接受任何治疗来源SEB的个体的T细胞，但是认识到人群中的许多个体之前可能已经暴露于环境来源的外源性SEB和SEB样蛋白。在这类个体中可能存在回忆类型的反应，其特征在于在本发明的试验中显示出特别大的SI分值。这在一些个体中确实存在，其中例如某特定肽产生的SI分值为8.1。
本发明公开了研究免疫性幼稚T细胞的T细胞表位绘制方法。所述T细胞获自没有接受所述蛋白治疗的多个不同健康供体的外周血样本。本试验使用体外培养的PBMC，通过本领域的常规方法并涉及将PBMC与目标蛋白质代表性的合成肽接触，经合适的孵育时间后，测定肽诱导的T细胞活化如细胞增殖。测定可以任何合适的方法进行，并且可使用3H-胸苷掺入法，由此易于通过实验室仪器测定细胞内3H的量。将PBMC样本与合成肽接触而产生的细胞增殖程度与未用肽处理的PBMC样本相比较。也可参照一种或多种具有预期增殖作用的肽处理后的增殖反应。关于此，认为尤其有利的是使用具有已知MHC限制性的肽，尤其是对DP或DQ同种型具有MHC限制性的肽表位。
为了有利于对SEB组装表位图谱，产生了一组合成肽。每一合成肽为15个氨基酸残基长，所述合成肽与下一个肽在序列上有12个氨基酸残基的重叠，即每一连续肽依次渐增地添加3个氨基酸用于分析。这样肽的任一特定相邻对将绘制目标蛋白质中连续的18个氨基酸序列。对于SEB，总共需要77个肽来扫描全长的成熟蛋白。但是根据完整蛋白的序列长度，为了确保有用扫描C端，所用的最后两个肽为14mer和11mer。使用幼稚T细胞试验确定SEB T细胞图谱的一个尤其有效的方法在实施例1中提供。
本研究揭示了在2个或多个分别的供体样本中可引起明显增殖反应的5个肽序列。这些肽在表1中列出，并且为本发明的一个实施方案。
认为在表1中确定的每一肽可结合MHC II类并以足够的亲和性与至少一种相应的TCR结合，从而引起在试验系统中可检测到的增殖。这些标准使用来自两个或在一些情况下使用三个不相关PBMC样本的PBMC达到。认为这些肽包含所述分子的主要表位区，在SEB序列中聚集为文中所称的三个区域：分别为表位区R1、R2和R3，或R1a，b，c、R2a和R3a，后者分别是序列串R1、R2和R3的子序列串。
表1：可体外(ex-vivo)刺激来自2个或更多供体样本的人T细胞的SEB肽序列
    肽ID#     残基#* 肽序列 表位区
    P6     16  KFTGLMENMKVLYDD     R1a
    P7     19  GLMENMKVLYDDNHV     R1b
    P8     22  ENMKVLYDDNHVSAI     R1c
    P18     52  SIKDTKLGNYDNVRV     R2a
    P27     79  DKYVDVFGANYYYQC     R3a
包含序列KFTGLMENMKVLYDDNHVSAI的肽P6、P7和P8含有表位区R1a。需指出的是对于R1a表位，肽P6和P8中的每一肽与两个供体样本均反应，而中间的肽P7只与一个供体反应。在这种情况下，P7的反应产生一个尤其高的SI分值(8.1)，并且反应性样本也与P6和P8反应。由于在序列中每一连续肽的位相(phasing)，可能在2个或3个相邻肽之间具有同样的核心9碱基序列(即相同)。实际的位相取决于与N端的邻近、肽长度和通过对序列的每一依次增加扫描的″新″残基数。在R1a表位的情况下，可确定许多重叠的MHC II类配体(见图1)。包含序列SIKDTKLGNYDNVRV的肽P18含有表位区R2。包含序列DKYVDVFGANYYYQC的肽P27含有表位区R3。
应理解在SEB序列中的其它肽序列也可发挥T细胞表位的作用，并且此类序列也可用物理结合试验或使用虚拟方法如计算机技术检测为MHC配体。因此文中提供的生物学试验也在特定的供体样本中检测其他的反应性肽，其中此类样本可例如来自最近暴露于SEB或含有与SEB的肽序列相同或至少密切同源肽序列的任一其他毒素或非毒素蛋白环境的个体。尽管如此，仍认为文中公开的序列R1a、R2a和R3a代表构建其中一个或多个这些表位被弱化的经修饰SEB分子所需的关键信息。
根据本发明的方案，所述表位通过突变而导致序列不再能发挥T细胞表位的作用。可使用重组DNA方法进行靶序列的定向诱变，并且许多此类技术是可获得的且为本领域熟知。
本发明的目的是修饰至少一个或多个表1所述肽的氨基酸序列。文中公开了合适的修饰，其可达到降低或去除受试肽序列作为一种或多种MHCII类同种异型的配体而发挥T细胞表位的作用。一组此类合适的修饰通过式I提供。
根据该第二个实施方案，对所述蛋白质的合适修饰可包括特定残基的氨基酸替代或残基的组合。为了除去T细胞表位，优选在所预测的肽序列中合适的位点进行氨基酸替代以完成T细胞表位活性的减小或者消除。实践中，合适的位点优选等同于在MHC II类结合沟所提供的口袋之一中结合的氨基酸残基。最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代是替代为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替代为更亲水的残基。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内，所述位置为与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这可能对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的″口袋残基″的位置，而是在所述肽序列内的任意位点上进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的硅片上(in silico)技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。在蛋白质数据库中的SEB晶体结构模型在此方面是尤其有用的[PDB ID：3SEBPapageoriou，A.C.等(1998)，J Mol.Biol.277：61-79]。可考虑恢复变体分子结构或生物学活性的改变。此类补偿性改变也包括对多肽中特定氨基酸残基的删除或添加。
从蛋白质分子中去除表位的一个尤其有用的方法涉及使用文中示出的幼稚T细胞活化试验方案与硅片上技术的结合，其中所述硅片上技术根据共同拥有的申请WO 02/069232(此处引用作为参考)中描述的方案而开发。
该软件在肽MHC II类结合的相互作用水平上模拟抗原呈递过程，以提供对任一特定肽序列的结合分值。对人群中存在的许多主要MHC II类同种异型测定此分值。由于该方案可测试任意肽序列，可在肽与MHC II类结合沟相互作用的能力方面预测氨基酸替换、添加或删除的结果。由此可设计含有与MHC II类相互作用并作为免疫原性T细胞表位发挥作用的肽的数量减少的新序列组合物。如果使用任一供体样本进行生物学测试可评估与最多4种DR同种异型的结合，那么硅片上的方法可使用大于40种同种异型同时测试相同的肽序列。实践中，该方法可指导新序列变体的设计，其中所述新序列变体在与多种MHC同种异型相互作用的能力方面有所降低。
T细胞试验可在所述分子中确定三个免疫原性区R1a-R3a，且根据WO02/069232的软件方案可鉴定在每一表位中预测的MHC II类配体。而且，该系统还能在表位中确定导致肽序列和该系统中代表的基本上所有MHC II类同种异型之间的结合亲和性明显丧失的氨基酸替代。
通过破坏R1a表位区而提供了此组修饰的一个例子。替代组合M21A、M24A和Y28T导致表位R1a中的主要MHC II类配体弱化。
同样，对于在表位区R2中确定的MHC II类配体，替代I53A和L58H为示例性的可行变化。
对于表位区R3，合适的替代系列包括进行Y81T、V82H、V84A和F85T中的一种或多种变化。
在所有上述例子中，基于特定肽在MHC II类结合沟中的结合能力和基于SEB晶体结构模型PDB ID编号3SEB和1GOZ的结构考虑可产生备选的突变集合[对于3SEB，参见Papageoriou，A.C.等(1998)J.Mol.Biol.277：61-79。对于1GOZ，参见Baker M.D.等(2002)J.Biol.Chem.277：2756-2762]。
每一上述替代为本发明方法的示例，并且均为本发明方案优选的组合物。本领域技术人员清楚：多种备选的替代集合可达到去除不需要的表位的目的。但是认为所得到的序列与文中公开的特定组合物密切同源，并因此落入本发明的范围。
关于表位绘制和使用基于生物学的T细胞活化试验，组合了用于确定MHC II类配体和设计缺乏MHC II类配体的序列类似物的硅片工具的方法是尤其有效的方法，并且是本发明最优选的实施方案。根据该最优选实施方案的普遍性方法包括以下步骤：
i)使用幼稚T细胞活化试验和合成肽确定可活化T细胞的表位区，其中所述的合成肽合起来包含目标蛋白质序列；
ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合而分析在步骤(i)中确定的表位区并因此确定表位区中MHC II类配体的计算方案；
iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合而确定在表位区中所包含的MHC配体的序列类似物的计算方案，其中所述序列类似物不再结合MHC II类或以降低的亲和力结合至较少数目的MHC同种异型；
iv)使用幼稚T细胞活化试验和合成肽，其中所述的合成肽包含全部或合起来包含在目标蛋白质中确定的表位区，并在幼稚T细胞活化试验中与野生型(亲本)序列相平行地测试所述序列类似物；
术语″T细胞表位″根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHC II类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
此处及所附权利要求书中引用的术语″肽″为包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(定义在下文中)连接。有20种不同的天然存在氨基酸参与肽的生物产生，它们可以以任何数目及任意顺序连接形成肽链或环。用于肽生物产生中的天然存在氨基酸均具有L-构型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或两种不同构型的氨基酸的各种组合通过常规的合成法制备合成肽。某些肽仅包含为数不多的氨基酸单元。短肽，如具有少于10个氨基酸单元的短肽，有时称为“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸残基，例如高达100个或更多个残基，被称为“多肽”。按照惯例，认为“多肽”可为包含三个或多个氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常为特定类型的“短”多肽。因此，如此处所用，谈及“多肽”时也包括寡肽。而且任何谈及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一种不同排列都将形成不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数及因此形成的不同蛋白质的数目实际上是不受限的。
本发明的SEB分子可以几种方式中的任一种制备，但最优选采用常规的重组方法。使用蛋白质序列和文中提供的信息推导编码任一优选蛋白质序列的多核苷酸(DNA)是相对容易的方法。这可例如使用计算机软件工具如DNSstar软件包[DNAstar Inc，Madison，WI，USA]或类似软件进行。能编码本发明的优选多肽或其重要同源物的任一此类DNA序列均认为是本发明的实施方案。
作为总体方案，编码任一SEB蛋白序列的基因可使用基因合成制备并克隆入合适的表达载体。接下来将表达载体导入宿主细胞并选择和培养细胞。将优选的分子自培养基纯化并制剂为用于治疗性施用的制品。备选地，野生型SEB基因序列可例如遵循PCR克隆策略获得，其中使用来自金黄色葡萄球菌(S.aureaus)的DNA和PCR引物，并使用Horgan和Fraser[Fernandez，N.和Butcher，G.编辑的A Practical Approach(IRLPress，Oxford 1997)的第1卷第8章MHC，见Horgan C & Fraser J.，D，107-121页]的方法进行。所述野生型毒素基因可用作诱变并构建优选变体序列的模板。在这方面，尤其便利的是使用Higuchi等[Higuchi等(1988)Nucleic Acids Res.16：7351]描述的″重叠延伸PCR″策略，但是也易于使用其他方法和系统。然后将所改变的编码DNA通过常规方法在选择的宿主细胞系统如大肠杆菌中表达，从中回收并纯化所需要的SEB。合适的宿主细胞、纯化和试验方案为本领域熟知。
当通过重组DNA技术构建SEB分子时，可包括构建与其他蛋白结构域如抗体可变结构域融合的SEB分子。用于纯化和操作重组蛋白(包括融合蛋白)的方法为本领域熟知。必要的技术在下述文献中进行了充分说明，如″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，第二版(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait编辑，1984)；″Animal CellCulture″(R.I.Freshney编辑，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of Experimental Immunology″(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；″Gene Transfer Vectors for MammalianCells″(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；″Current Protocols inMolecular Biology″(F.M.Ausubel等编辑，1987)；″PCR：The PolymeraseChain Reaction″(Mullis等编辑，1994)；″Current Protocols inImmunology″(J.E.Coligan等编辑，1991)。
本发明可应用于与文中公开的一级氨基酸序列基本相同的任一SEB类分子，并因此包括通过基因工程方法或其他方法所衍生的SEB分子，并且可包括多于或少于239个氨基酸残基。葡萄球菌肠毒素A、C、C1、C2、D、E和F以及来自不同微生物源的其他相关毒素共有许多本公开的肽序列及共有许多与本公开的肽序列基本相同的肽序列。这些蛋白序列因此同样在本发明的范围内。
虽然本发明涉及经修饰的SEB，但认为含有此类经修饰SEB蛋白或含有经修饰SEB蛋白的片段的组合物及相关组合物均在本发明的范围内。在此方面的一个相关例子是开发肽介导的耐受诱导策略，其中将一个或多个公开的肽施用于具有免役治疗意向的患者。因此合成肽分子，例如其包含一个或多个在表1所列序列或更优选地全部或部分包含任一表位区R1a、R2a和R3a的序列均认为是本发明的实施方案。
在另一方面，本发明涉及编码经修饰SEB的核酸。在进一步的方面，本发明涉及使用经修饰的SEB蛋白治疗性治疗人的方法。在此方面，可将经修饰的SEB蛋白作为重组融合蛋白产生。在此方面，可将经修饰的SEB蛋白与抗体分子或抗体分子片段连接。连接可通过化学交联或更优选地，可将SEB-抗体作为重组融合蛋白产生。该融合分子可包含经修饰的SEB结构域与位于该融合蛋白N端的抗体结构域，但可考虑相反的方向。
与本发明的经修饰SEB分子连接的目标抗体特异性包括针对癌特异性抗原的抗体，所述癌特异性抗原的例子包括A33抗原[Heath，J.K.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.94：469-474]和GA733-1抗原[US，5,840,854]。也可考虑使用癌胚抗原并被多种抗体中的任一种靶向，其包括MFE23[Chester，K.A.等(1994)，Lancet 343：455]，A5B7[WO92/010159]，T84.66[US，5,081,235]，MN-14[Hansen，H.J.等(1993)，Cancer 71：3478-3485]，COL-1[US，5,472,693]，抗体KS1/4识别的40kDa糖蛋白抗原[Spearman等(1987)，J.Pharmacol.Exp.Therapeutics 241：695-703]，表皮生长因子受体(HER1)或相关受体如HER2，抗GD2抗体如抗体14.18[US，4,675,287；EP 0 192 657]，或前列腺特异的膜抗原的抗体[US，6,107,090]，也可考虑IL-2受体[US，6,013,256]，Lewis Y决定蔟，粘糖蛋白等。
当经修饰SEB蛋白与抗体序列融合的所有情况下，最希望使用这样的抗体序列，其中T细胞表位或能结合MHC II类分子或刺激T细胞或与MHC II类分子一起结合T细胞的序列已得以去除。
本发明现在通过下列实施例阐述。所述实施例谈及了下列图：
图1描述了在表位区R1a中鉴定的MHC II类配体。配体是使用实施例2的硅片上系统鉴定的。18种人DR同种异型的结合谱在此情况下以列(column)表示。所检测的配体为13-mer并且每一13-mer的残基数1以彩色区块表示。每一肽与每一18种同种异型结合相互作用的强度(高、中或低)根据主要展示而显示。
图2描述了在表位区R2中鉴定的MHC II类配体。配体是使用实施例2的硅片上系统鉴定的。18种人DR同种异型的结合谱在此情况下以列(column)表示。所检测的配体为13-mer并且每一13-mer的残基数1以彩色区块表示。每一肽与每一18种同种异型结合相互作用的强度(高、中或低)根据主要展示而显示。
图3描述了在表位区R3中鉴定的MHC II类配体。配体是使用实施例2的硅片上系统鉴定的。18种人DR同种异型的结合谱在此情况下以列(column)表示。所检测的配体为13-mer并且每一13-mer的残基数1以彩色区块表示。每一肽与每一18种同种异型结合相互作用的强度(高、中或低)根据主要展示而显示。
式I(见上文)描述了最优选的SEB结构，其中MHC II类配体通过分别在表位区R1a、R2a和R3a，以及R1a、R1b、R1c、R2a和R3a中替换而去除。
实施例1
MHC、肽和T细胞受体(TCR)的相互作用提供了T细胞识别的抗原特异性的结构基础。T细胞增殖试验检验肽与MHC的结合和TCR对MHC/肽复合体的识别。本实施例的体外T细胞增殖试验包括刺激含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞的外周血单核细胞(PBMC)。用合成肽作为抗原进行体外刺激。用3H-胸苷(3H-Thy)测量刺激的T细胞增殖并对洗涤的固定细胞进行闪烁计数估计掺入的3H-Thy的存在。
从国家血液部门(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存时间小于12小时的人血血沉棕黄层。从Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培养原代人淋巴细胞的无血清AIM V培养基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷兰)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
对血沉棕黄层轻微离心从血浆和血小板中分离出红血球和白血球。除去并扔掉顶层部分(含有血浆和血小板)。在磷酸盐缓冲液(PBS)中1∶1稀释红血球和白血球并铺在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根据生产商推荐的条件进行离心并从血清+PBS/菲可帕克界面收获PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通过离心收集。除去并扔掉上清液，将PBMC沉淀重新悬浮在50ml PBS中。通过离心再次沉淀细胞并抛弃PBS上清液。用50ml AIM V培养基重新悬浮细胞并在此时计数并用锥虫蓝染料排除估计存活率。再次离心收集细胞并抛弃上清液。细胞重新悬浮以低温保藏，密度为3×107/ml。保藏培养基为90％(v/v)热失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。将细胞转移到受调节的冰冻容器(Sigma)并且在转移到液氮以长期保存前将其置于-70℃过夜。当需要使用时，在37℃水浴中快速解冻然后转移到10ml预热的AIMV培养基。
在96孔平底板(PBMC密度为2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下将PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脉冲。对于本研究，产生并使用通过12个氨基酸重叠而覆盖SEB全序列的合成肽(15mer)。肽标识编号(ID#)和序列在表2中给出。
每种肽都单独地针对从20个未接触抗原供体中分离的PBMC进行筛选。在每个供体测定中使用先前已经显示具有免疫原性的两种对照肽和一种强的非记忆抗原KLH。在本研究中使用的对照抗原为流感血细胞凝集素307-319(序列：PKYVKQNTLKLAT)；衣原体HSP60肽(序列：KVVDQIKKISKPVQH)和匙孔血蓝蛋白。对于所有PBMC样本的组织类型使用商业可获得的试剂系统(Dynal，Wirral，UK)测定。根据供应商提供的方法以及标准的辅助试剂和琼脂糖电泳系统进行测定。
将肽溶解于DMSO中使其终浓度为10mM，然后将这些贮存液在AIMV培养基中稀释到原来的1/500(终浓度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其终浓度为2和20μM(体积为100μl)。通过锥虫蓝染料排除估计解冻的PBMC的存活率。然后将细胞重新悬浮(密度为2×106个细胞/ml)，向每个含有肽的孔中移入100μl(2×105个PBMC/孔)。在每个肽浓度下测定一式三份的孔培养物。在5％CO2、37℃的潮湿空气中孵育平板7天。用1μCi 3H-Thy/孔的脉冲细胞18-21小时后收获到过滤垫上。用Wallac微量培养板β顶层平板计数器(Perkin Elmer)或类似仪器测定CPM值。结果表达为刺激指数，其中刺激指数(SI)为用受试肽的增殖值(如放射性的每分钟计数)除以未接触受试肽的细胞所测定的值进行确定。
表2用于T细胞表位绘制的SEB合成肽列表
    肽ID# SEB；15mer肽序列 残基#
    P1     ESQPDPKPDELHKSS     1
    P2     PDPKPDELHKSSKFT     4
    P3     KPDELHKSSKFTGLM     7
    P4     ELHKSSKFTGLMENM     10
    P5     KSSKFrGLMENMKVL     13
    P6     KFTGLMENMKVLYDD     16
    P7     GLMENMKVLYDDNHV     19
    P8     ENMKVLYDDNHVSAI     22
    P9     KVLYDDNHVSAINVK     25
    P10     YDDNHVSAINVKSID     28
    P11     NHVSAINVKSIDQFL     31
    P12     SAINVKSIDQFLYFD     34
    P13     NVKSIDQFLYFDLIY     37
    P14     SIDQFLYFDLIYSIK     40
  肽ID# SEB；15mer肽序列 残基#
  P15   QFLYFDLIYSIKDTK     43
  P16   YFDLIYSIKDTKLGN     46
  P17   LIYSIKDTKLGNYDN     49
  P18   SIKDTKLGNYDNVRV     52
  P19   DTKLGNYDNVRVEFK     55
  P20   LGNYDNVRVEFKNKD     58
  P21   YDNVRVEFKNKDLAD     61
  P22   VRVEFKNKDLADKYK     64
  P23   EFKNKDLADKYKDKY     67
  P24   NKDLADKYKDKYVDV     70
  P25   LADKYKDKYVDVFGA     73
  P26   KYKDKYVDVFGANYY     76
  P27   DKYVDVFGANYYYQC     79
  P28   VDVFGANYYYQCYFS     82
  P29   FGANYYYQCYFSKKT     85
  P30   NYYYQCYFSKKINDI     88
  P31   YQCYFSKKTNDINSH     91
  P32   YFSKKTNDINSHQTD     94
  P33   KKTNDINSHQTDKRK     97
  P34   NDINSHQTDKRKTCM     100
  P35   NSHQTDKRKTCMYGG     103
  P36   QTDKRKTCMYGGVTE     106
  P37   KRKTCMYGGVTEHNG     109
  P38   TCMYGGVTEHNGNQL     112
  P39   YGGVTEHNGNQLDKY     115
  P40   VTEHNGNQLDKYRSI     118
  P41   HNGNQLDKYRSITVR     121
  P42   NQLDKYRSITVRVFE     124
  P43   DKYRSITVRVFEDGK     127
  P44   RSITVRVFEDGKNLL     130
  肽ID# SEB；15mer肽序列 残基#
  P45     TVRVFEDGKNLLSFD   133
  P46     VFEDGKNLLSFDVQT   136
  P47     DGKNLLSFDVQTNKK   139
  P48     NLLSFDVQTNKKKVT   142
  P49     SFDVQTNKKKVTAQE   145
  P50     VQTNKKKVTAQELDY   148
  P51     NKKKVTAQELDYLTR   151
  P52     KVTAQELDYLTRHYL   154
  P53     AQELDYLTRHYLVKN   157
  P54     LDYLTRHYLVKNKKL   160
  P55     LTRHYLVKNKKLYEF   163
  P56     HYLVKNKKLYEFNNS   166
  P57     VKNKKLYEFNNSPYE   169
  P58     KKLYEFNNSPYETGY   172
  P59     YFFNNSPYETGYIKF   175
  P60     NNSPYETGYIKFIEN   178
  P61     PYETGYIKFIENENS   181
  P62     TGYIKFIENENSFWY   184
  P63     IKFIENENSFWYDMM   187
  P64     IENENSFWYDMMPAP   190
  P65     ENSFWYDMMPAPGDK   193
  P66     FWYDMMPAPGDKFDQ   196
  P67     DMMPAPGDKFDQSKY   199
  P68     PAPGDKFDQSKYLMM   202
  P69     GDKFDQSKYLMMYND   205
  P70     FDQSKYLMMYNDNKM   208
  P71     SKYLMMYNDNKMVDS   211
  P72     LMMYNDNKMVDSKDV   214
  P73     YNDNKMVDSKDVKIE   217
  P74     NKMVDSKDVKIEVYL   220
  肽ID#   SEB；15mer肽序列   残基#
  P75   VDSKDVKIEVYLTTK   223
  P76   KDVKIEVYLTTKKK   226
  P77   KIEVYLTTKKK   229
使用T细胞增殖试验绘制SEB序列中的T细胞表位导致确定了3个免疫原性区R1a、R2a和R3a。可刺激明显反应的肽在表1中列出。反应性供体的同种异型限制性和对SEB肽记录的SI在表3中给出。
表3
肽ID# 肽序列     每一反应性样本的SI* 反应性同种异型
P6 KFTGLMENMKVLYDD     3.4，2.1 DRB1*04，DRB4*01；DRB1*07，DRB1*11，DRB3
    P7   GLMENMKVLYDDNHV     8.1 DRB1*04，DRB4*01
P8 ENMKVLYDDNHVSAI     4.43.1 DRB1*04，DRB4*01；DRB1*07，DRB1*09，DRB4*01
P18 SIKDTKLGNYDNVRV     2.25.12.0 DRB1*04，DRB4*01；DRB1*07，DRB1*09，DRB1*12，DRB1*15，DRB3，DRB5
P27 DKYVDVFGANYYYQC     2.35.32.5 DRB1*04，DRB4*01；DRB1*07，DRB1*09，DRB1*07，DRB1*11，DRB3
*SI＝刺激指数。所给出的数据是对每一反应性供体样本进行一式三份测定的平均值。所有肽在1μM和5μM测试。所给出的SI涉及两次测定中较高的测定。
实施例2设计具有改善的免疫原性特性的经修饰SEB序列
共同拥有的申请WO 02/069232中的方法用于分析表位区R1a、R2a和R3a。该系统使得可预测包括在生物学检测的表位区中的特定MHC配体，并且可提供特定MHC II类配体与特定MHC同种异型相互作用能力的″分值″。
MHC配体的同种异型限制性模式可用附图1-3中对每一表位区R1a-R3a所显示的同种异型限制性图描述。
该分析延伸至考虑在表位R1a-R3a的每一表位中的序列修饰。对序列变体测试后续的结合MHC II类的能力并且当仍结合MHC II类时测定它们的结合分值。确定了达到去除与所测试的多数MHC同种异型发生MHCII类结合的多个氨基酸替代。对所确定的替代进一步测试它们在SEB晶体结构模型PDB ID编号3SEB和1GOZ的相容能力[对于3SEB，参见Papageoriou，A.C.等(1998)J.Mol.Biol.277：61-79。对于1GOZ，参见Baker M.D.等(2002)J.Biol.Chem.277：2756-2762]。对野生型序列所选择的残基设计的突变检查其空间排斥、氢键形成、疏水相互作用及结构中的总体相容性。放弃引起空间排斥的替代。当侧链采用与原来残基类似的构型(旋转异构体)时，认为相容的替代是可接受的。如果多于一个替代满足这些标准，则优选与相邻侧链或骨架原子潜在形成氢键和/或有利地形成疏水接触或其他连接的残基。上述方法有利地使用Swiss Prot Deep View v3.7[Guex，N.和Peitsch，M.C.(1997)Electrophoresis 18：2714-2723]进行。该方法导致对每一表位区R1-R3优选地R1a-R3a的优选替代集合。对替代集合进行采编产生式I所述结构。经证实所有替代导致每一表位区R1-R3优选地R1a-R3a中的MHC II类配体去除。根据上述方案含有优选替代集合的SEB结构描述为式I。

Claims (16)

1.一种经修饰的分子，其具有葡萄球菌肠毒素B(SEB)的生物学活性，且当其在个体的体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子，其中(i)所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的，所述T-细胞表位是MHC II类配体或经呈递在II类分子上后显示出刺激或结合T-细胞的能力的肽序列，(ii)所述经修饰的分子，当在人T细胞增殖的生物学试验中作为完整蛋白测试时所显示的刺激指数(SI)小于未经修饰的亲本分子且小于2.0，以及(iii)欲去除的所述T细胞表位位于原始的未经修饰SEB分子中称为R1至R3的连续残基的一个或多个序列串中，所述序列串选自：
R1：KFTGLMENMKVLYDDNHVSAI；
R2：QFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRV；
R3：NKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDI.
2.根据权利要求1的经修饰SEB分子，其中欲去除的所述T细胞表位位于原始的未经修饰SEB分子中称为R1a，b，c，R2a和R3a的连续残基的一个或多个序列串中，所述序列串选自：
R1a：KFTGLMENMKVLYDD，
R1b：GLMENMKVLYDDNHV，或
R1c：ENMKVLYDDNHVSAI
R2a：SIKDTKLGNYDNVRV，
R3a：DKYVDVFGANYYYQC.
3.根据权利要求1或2的经修饰SEB分子，其中通过在所述序列串中替代一个或多个氨基酸残基去除了T细胞表位。
4.一种经修饰的分子，其具有葡萄球菌肠毒素B(SEB)的生物学活性，且当其在个体的体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子，其中所述免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的，所述T-细胞表位是MHC II类配体或经呈递在II类分子上后显示出刺激或结合T-细胞的能力的肽序列，所述经修饰的分子包含以下序列：
ESQPDPKPDELHKSSKFTGLX1ENX2KVLX3DDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSX4K
DTKX5GNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKX6X7DX8X9GANYYYQCYFSKKTNDINS
HQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTA
QELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWYDMMPAPGDKFDQS
KYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK，
其中
X1＝A、G、P或M；
X2＝A、G、P或M；
X3＝T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或Y；
X4＝A或I；
X5＝H或L；
X6＝T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或Y；
X7＝H或V；
X8＝A、P、G或V；
X9＝T、H或F；
其中排除同时地X1＝M、X2＝M、X3＝Y、X4＝Y、X5＝L、X6＝Y、X7＝V、X8＝V且X9＝F。
5.权利要求4的经修饰SEB分子，其中X1＝A、X2＝A、X3＝T、X4＝A、X5＝H、X6＝T、X7＝H、X8＝A且X9＝T。
6.权利要求4或5的经修饰SEB分子，其中所述分子当在T细胞增殖的生物学试验中作为完整蛋白测试时所显示的刺激指数(SI)小于未经修饰的亲本SEB分子且小于2。
7.DNA分子，其编码权利要求1至6中任意一项所述的经修饰SEB分子。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1至7中任意一项所述的经修饰SEB分子，并包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
9.一种肽序列，其作为具有葡萄球菌肠毒素B(SEB)生物学活性并包含一个或多个T细胞表位的分子的一部分，为MHC II类配体或经呈递在II类分子上后显示出刺激或结合T-细胞的能力的序列串；所述肽选自表1或表2。
10.根据权利要求9的肽序列，其包含来自任一所述序列串的13至15个连续的氨基酸残基。
11.根据权利要求9或10的肽序列，当在人T细胞增殖的生物学试验中检测时，其刺激指数(SI)大于2.0。
12.权利要求11的经修饰肽序列，其中所述修饰通过替代一个或多个氨基酸残基导致作为MHC II类配体的潜在T细胞表位去除，所述肽当在人T细胞增殖的生物学试验中检测时，其刺激指数(SI)小于2.0，优选地小于1.8。
13.根据权利要求12的肽的用途，用于制备如权利要求1所述的经修饰人SEB分子。
14.DNA分子，其编码权利要求9至13中任意一项所述的肽序列。
15.通过在未经修饰葡萄球菌肠毒素B(SEB)中定位T细胞表位而构建SEB的T细胞表位图谱的方法，其包括以下步骤：
(i)使用合成肽免疫原进行体外抗原刺激，其中使用了来自含有生理比例的T细胞和抗原呈递细胞的不相关供体样本的PBMC制备物；(ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案分析步骤(i)中鉴定的表位区，并由此在所述表位区中鉴定MHC II类配体；(iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案鉴定表位区中包含的MHC配体的如下序列类似物，所述序列类似物不再结合MHC II类或者以较低的亲和性结合较少数量的MHC同种异型；以及任选地(iv)使用幼稚T细胞活化试验和完全包含在SEB分子中鉴定的表位区的合成肽或合起来包含在SEB分子中鉴定的表位区的合成肽，并在幼稚T细胞活化试验中与亲本SEB序列平行地测试序列类似物。
16.权利要求15的方法，其中当在至少两个独立的供体样本中观察到刺激指数(SI)为2.0或大于2.0时则发现了特定T细胞表位的位置。
CNA038197464A 2002-08-21 2003-08-18 葡萄球菌肠毒素b中的t细胞表位 Pending CN1675363A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02018229.1 2002-08-21
EP02018229 2002-08-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1675363A true CN1675363A (zh) 2005-09-28

Family

ID=31896832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038197464A Pending CN1675363A (zh) 2002-08-21 2003-08-18 葡萄球菌肠毒素b中的t细胞表位

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20050240009A1 (zh)
EP (1) EP1530638A2 (zh)
JP (1) JP2005535351A (zh)
KR (1) KR20050042791A (zh)
CN (1) CN1675363A (zh)
AU (1) AU2003266289A1 (zh)
BR (1) BR0313638A (zh)
CA (1) CA2496242A1 (zh)
MX (1) MXPA05001873A (zh)
PL (1) PL373345A1 (zh)
RU (1) RU2005108044A (zh)
WO (1) WO2004018684A2 (zh)
ZA (1) ZA200502273B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103160519A (zh) * 2013-03-12 2013-06-19 张婉茹 金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫制剂及其制备方法和应用
CN107164338A (zh) * 2017-06-27 2017-09-15 镇江市卫克生物科技有限公司 一种重组溶瘤病毒及其应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
DK2109622T3 (en) 2007-01-03 2017-02-13 Morphotek Inc High affinity antibodies neutralizing staphylococcus enterotoxin B
WO2008157776A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Angelica Therapeutics, Inc. Modified diphtheria toxins
EP2268297A4 (en) 2008-02-29 2011-11-16 Angelica Therapeutics Inc MODIFIED TOXINS
KR101061017B1 (ko) * 2009-10-23 2011-08-31 (주) 수파드엘릭사 암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물
WO2014160121A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Humanized antibodies specific for staphylococcal enterotoxin b
JP2016519651A (ja) 2013-03-15 2016-07-07 アンジェリカ セラピューティックス，インク． 改質された毒素
CN104693292A (zh) * 2014-01-23 2015-06-10 中国人民解放军第三军医大学 金黄色葡萄球菌肠毒素b的b细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用
CN104693293A (zh) * 2014-01-23 2015-06-10 中国人民解放军第三军医大学 金黄色葡萄球菌肠毒素b的b细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用
CN103772493B (zh) * 2014-01-23 2015-09-30 中国人民解放军第三军医大学 金黄色葡萄球菌肠毒素b的b细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA01001631A (es) * 1998-08-13 2002-04-08 Walter Reed Army Inst Of Res D Vacunas de superantigenos bacterianos.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103160519A (zh) * 2013-03-12 2013-06-19 张婉茹 金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫制剂及其制备方法和应用
CN103160519B (zh) * 2013-03-12 2014-12-31 张婉茹 金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫制剂及其制备方法和应用
CN107164338A (zh) * 2017-06-27 2017-09-15 镇江市卫克生物科技有限公司 一种重组溶瘤病毒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050042791A (ko) 2005-05-10
JP2005535351A (ja) 2005-11-24
EP1530638A2 (en) 2005-05-18
ZA200502273B (en) 2005-09-19
CA2496242A1 (en) 2004-03-04
PL373345A1 (en) 2005-08-22
AU2003266289A1 (en) 2004-03-11
BR0313638A (pt) 2005-06-21
WO2004018684A2 (en) 2004-03-04
WO2004018684A3 (en) 2004-08-26
RU2005108044A (ru) 2005-09-20
US20050240009A1 (en) 2005-10-27
MXPA05001873A (es) 2005-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI357906B (en) Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccin
CN1547608A (zh) 经修饰的因子ix
CN1067679A (zh) 重组dna衍生的霍乱毒素亚基类似物
ZA200502273B (en) T-cell epitopes in staphylococcal enterotoxin B.
CN1771052A (zh) 治疗和预防葡萄球菌及其它细菌感染的方法和组合物
CN1675242A (zh) 促红细胞生成素中的t－细胞表位
KR20040103970A (ko) 변형된 펙터 ⅷ
CA2112466A1 (en) Methods and compositions for diagnosing lyme disease
CN1148449C (zh) 链球菌毒素c突变体及其使用方法
CN108578686A (zh) 一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法
CN104151406A (zh) 牛布鲁菌外膜蛋白Omp22、编码基因及其克隆方法和应用
CN1551888A (zh) 经修饰的人生长激素
IL146544A (en) Method of identifying a polynucleotide of a microbe that is expressed in vivo
CN101061136A (zh) 具有白介素－2中和能力的免疫治疗制剂
Tungtrakanpoung et al. Mimotope of Leptospira from phage-displayed random peptide library is reactive with both monoclonal antibodies and patients’ sera
CN100401064C (zh) 绘制并消除t细胞表位的方法
US20050074863A1 (en) T-cell epitodes in carboxypeptidase g2
Lo et al. The isolation of recombinant plasmids expressing secreted antigens of Pasteurella haemolytica A1 and the characterization of an immunogenic 60 kDa antigen
CN1658905A (zh) 经修饰的泻根素1
US7491402B2 (en) Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
CN117778363A (zh) 一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用
AU1901000A (en) Superantigens
Reid Molecular and Immunological Analysis of Recombinant Bacteroides forsythus Heat Shock Protein 60
CN1673371A (zh) 一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原i、其编码序列及其应用
NZ511943A (en) Superantigens

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication