JP2005535351A - ブドウ球菌エンテロトキシンｂのｔ細胞エピトープ - Google Patents

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Abstract

本発明は、免疫学の分野に関する。本発明は、免疫応答を誘起し得るブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)上の決定基を同定する。特に、本発明は、ＳＥＢ中のＴ細胞に対するエピトープの同定に関する。本発明はさらに、免疫原性の低減した改変ＳＥＢ変異体を創出することがそれによって可能になる、ＳＥＢ由来のＴ細胞エピトープペプチドに関する。

Description

(発明の分野)
本発明は、免疫学の分野に関する。本発明は、免疫応答を誘起し得るブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)上の決定基を同定する。特に、本発明は、ＳＥＢ中のＴ細胞に対するエピトープの同定に関する。本発明はさらに、免疫原性の低減した改変ＳＥＢ変異体を創出することがそれによって可能になる、ＳＥＢ由来のＴ細胞エピトープペプチドに関する。
(発明の背景)
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff，R.W. ら(1985) Cancer Res. 45：879−885；Shawler, D.L. ら(1985)J.Immunol.135：1530−1535頁]。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ反応を低減させようと多数の技術が開発されている[WO 89/09622；EP 0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D. (1990) Sem.Immunol. 2：449, 456；Rebello, P.R. ら(1999) Transplantation 68：1417-1420頁]。
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa, M. et al(1999) Clin.Cancer Res. 5：1353-1361]やインターフェロンアルファ２[Russo, D. et al (1996) Bri.J.Haem.94：300-305；Stein, R. et al(1988) New Engl.Med. 318：1409-1413]の治療上の使用が挙げられる。このようなヒトタンパク質が免疫原性となる状況では、さもなければその対象においてこれらのタンパク質に対して作動しているはずの免疫寛容が損なわれていることが推測される。
治療用タンパク質に対する抗体の応答が持続するためには、ヘルパーＴ−細胞の増殖および活性化が刺激される必要がある。Ｔ細胞が刺激されるには、Ｔ細胞と抗原提示細胞(ＡＰＣ)間にＴ細胞シナプスが確立される必要がある。シナプスのコアには、ＡＰＣ表面上のペプチドＭＨＣクラスII複合体と結合したＴ細胞上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)がある。ペプチドは、抗原タンパク質が細胞内で処理されて得られる。ＭＨＣクラスII分子上で提示されてＴ細胞の活性を刺激することのできるタンパク質抗原のペプチド配列が、「Ｔ細胞エピトープ」と呼ばれるものである。このＴ細胞エピトープは、一般に、ＭＨＣクラスII分子に結合することのできる任意のアミノ酸残基配列であると定義される。「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合したときにＴＣＲによって認識され、また少なくとも原則として、ＴＣＲと結合してＴ細胞応答を促進することによってＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味することは暗黙のうちである。多くのタンパク質では、少数のヘルパーＴ細胞エピトープが、ヘルパーＴシグナル伝達を駆使して、治療タンパク質上に露出した非常に広いレパートリーの表面決定基になり得るものに対する、持続性の、親和性の高い、クラススイッチ型の抗体応答をもたらし得ることを理解されたい。
Ｔ細胞エピトープの同定は、エピトープを除去する最初のステップとして認められており、治療用タンパク質のＴ細胞エピトープを同定することは非常に望ましい。特許出願WO98/52976およびWO00/34317は、ヒトＭＨＣクラスII ＤＲアロタイプのサブセットへの潜在的結合能力を有するポリペプチド配列を同定するための、計算によるスレッディング法を教示している。これらの教示では、問題のタンパク質内での慎重なアミノ酸置換を用いることによって、予想されるＴ細胞エピトープを除去する。しかし、このスキーム、ならびにエピトープを同定するための他の計算による手順[Godkin, A.J．ら(1998年)、J.Immunol. 第161巻：850〜858頁；Sturniolo, T.ら(1999年)、Nat.Biotechnol. 第17巻：555〜561頁]では、ＭＨＣクラスII分子を結合し得ると予想したペプチドが、処理経路または他の事象のために、あらゆる状況、特にin vivoでＴ細胞エピトープとして機能しないことがある。さらに、Ｔ細胞エピトープを予測するための計算による手法では、一般に、ＤＰもしくはＤＱに拘束されたエピトープを予測することができていない。
また、たとえば、明確なＭＨＣアロタイプのＢ細胞系統をＭＨＣクラスII結合表面の供給源として使用する、合成ペプチドのＭＨＣクラスII分子結合能を測定するin vitroでの方法[Marshall K.W.ら(1994年)、J.Immunol. 第152巻：4946〜4956頁；O'Sullivanら(1990年)J.Immunol. 第145巻：1799〜1808頁；Robadey C.ら(1997年)、J.Immunol 第159巻：3238〜3246頁]を、ＭＨＣクラスIIリガンドの同定に応用することもできる。しかし、このような技術は、非常に多様なＭＨＣアロタイプに対する多数の潜在的エピトープを選ぶスクリーニングに適合したものでもなければ、ペプチドを結合してＴ細胞エピトープとして機能する能力を確認することもできない。
最近では、組換え型ＭＨＣ分子の可溶性の複合体を合成ペプチドと併せて活用する技術が用いられるようになっている(Kern, F.ら(1998年)、Nature Medicine 第4巻：975〜978頁；Kwok, W.W.ら(2001年)、TRENDS in Immunol. 第22巻：583〜588頁］。このような試薬および手順は、ヒトまたは実験動物対象の末梢血サンプルに由来するＴ細胞クローンの存在を同定するのに使用され、特定のＭＨＣペプチド複合体を結合することができるが、非常に多様なＭＨＣアロタイプに対する多彩な潜在的エピトープのスクリーニングに適合したものではない。
Ｔ細胞活性化の生物学的アッセイが、試験ペプチド／タンパク質配列が免疫応答を誘起できる能力の示度を得る最も実際的な選択肢であることに変わりはない。この種の手法の例には、細菌タンパク質スタフィロキナーゼに対してＴ細胞増殖アッセイを使用した後、合成ペプチドを用いてＴ細胞系統を刺激しながらエピトープマッピングを行うPetraらの研究成果が含まれる[Petra, A.M.ら(2002年)、J.Immunol. 第168巻：155〜161頁]。同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを使用するＴ細胞増殖アッセイによっても、この毒素の免疫優勢のエピトープ領域が確定されている[Reece J.C.ら(1993年)、J.Immunol. 第151巻：6175〜6184頁]。WO99/53038は、単離したヒト免疫細胞サブセットを使用し、in vitroでその分化を促進し、その細胞を問題の合成ペプチドの存在下で培養し、誘発された培養Ｔ細胞の増殖を測定して、試験タンパク質のＴ細胞エピトープを決定する手法を開示している。Sticklerらも同じ技術を記載しており[Stickler, M.M. ら(2000年)、J.Immunotherapy 第23巻：654〜660頁]、どちらの例でも、その方法が細菌サブチリシン内のＴ細胞エピトープの検出に適用されている。このような技術では、所望の免疫細胞サブセット(樹状細胞、ＣＤ４＋およびまたはＣＤ８＋Ｔ細胞)を得るために、細胞単離技術および多種類のサイトカインを補充しての細胞培養を慎重に適用する必要がある。
上述のように、またその結果として、主に治療的に価値があるが、そもそも免疫原性のある所与のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のＴ細胞エピトープを同定し、除去し、または少なくとも低減することが望ましいはずである。治療目的で価値のあるこれらの潜在的な分子の１つが、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)である。
ＳＥＢは、黄色ブドウ球菌によって産生されるエンテロトキシンファミリーの一員である。他の構成員には、Ａ、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｄ、Ｅ、およびＦと呼ばれる血清学的に異なるタンパク質が含まれる。これらのタンパク質は、ブドウ球菌食中毒の原因物質であることが認められている。このクラスのタンパク質に向けられる治療上の関心の１つは、「超抗原」、すなわちヒトＴ細胞の活性を刺激し得る分子として機能できるその能力から来る。その潜在的治療能力は、Ｔ細胞の活性化を強化して、免疫を媒介として腫瘍細胞増殖を抑制することを目標としたいくつかの癌臨床治験で試験されている。ある事例では、毒素分子を抗体に連結して、細胞特異的なターゲッティングを提供している[Dohlstein, Mら(1994年)、PNAS USA第91巻：8945〜8949頁；Giantonio, B.J.ら(1997年)、J.Clin.Oncol. 第15巻：1994〜2007頁；Hansson, J.ら(1997年)、PNAS USA第94巻：2489〜2494頁；Alpaugh, K.R.ら(1998年)、Clin.Cancer Res. 第４巻：1903〜1914頁]。
本発明は、主としてエンテロトキシンＢに関する。ＳＥＢの成熟アミノ酸配列は、237個のアミノ酸残基を含んでおり、次の配列、
Figure 2005535351
を含む一文字表記で表される。「超抗原」として、ブドウ球菌エンテロトキシンは、植物性血球凝集素のような従来のＴ細胞マイトジェンの１／１０3の濃度で強度の多クローン性増殖を誘発することが知られている最も強力なＴ細胞マイトジェンである。すべてのものが大部分のヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。Ｔ細胞を刺激するそれらの能力は、ＭＨＣクラスII抗原によって厳格に拘束される。ブドウ球菌エンテロトキシンおよび他の超抗原毒素は、Ｔ細胞受容体とＭＨＣクラスIIとに直接に結合することを理解されたい。これら２構造が接触し、そうして強い同種反応性応答を模倣しながらＴ細胞受容体のＶ□領域を介してＴ細胞の活性化を刺激する。ＭＨＣタンパク質に結合した大抵の通常抗原ペプチドの認識には、Ｔ細胞受容体のすべての可変構成要素が寄与する。対照的に、この毒素は、ほとんど完全にＴ細胞受容体のＶ□領域のみを介してＴ細胞を刺激する。この毒素は、ＭＨＣクラスIIとＶ□の側方同士を噛み合わして、Ｔ細胞／ＡＰＣシナプス形成の際には常に互いに接触することになるはずのＴ細胞受容体とＭＨＣの表面を極めて接近させる鎹であると考えることができる。
超抗原分子は、これらの特性および他の特定の特性をもつことから、癌療法を含むいくつかの異なる試験的な治療戦略で使用されている。ＳＥＢトキシンの事例では、すべてTermanと同僚らによる一連の米国特許、すなわち米国特許第6180097号、米国特許第5728388号、米国特許第6338845号、米国特許第6221351号、米国特許第6126945号、ならびに同等特許のWO93/24136、WO98/26747、EP1103268、およびEP0511306が、ＳＥＢ遺伝子、カルボキシメチル化ＳＥＢタンパク質やＳＥＢ−抗体コンジュゲートおよび融合タンパク質を含むＳＥＢタンパク質の使用に関する分野を共同で詳述している。どれも癌細胞死滅作用を誘発することを目的とした方法およびまたは組成物、ならびに癌療法を対象としている。
したがってたとえば、EP0511306は、ＳＥＢ、ＳＥＢの相同体、および超抗原と本質的に同じ生物学的活性を有するＳＥＢ断片、ならびにモノクローナル抗体とのＳＥＢコンジュゲートを含むエンテロトキシン分子の使用について特許を請求している。
このような分子およびコンジュゲートは、癌療法として使用するために提供されており、それなりに有効であろう。しかし、ＳＥＢ(また任意の結合した抗体構成成分の可能性もある)がヒト免疫系に対して外来性であるために、免疫応答が誘発される見込みがかなりあり、これによって最初に投与された用量の効果が制限されることはないが、その後の用量についてはかなり効果が制限され、または有害な副作用が引き起こされかねない。特許を請求している薬剤は、癌患者のみを対象としている。そのような患者の多くでは、以前からの治療計画のために、あるいは自らの疾患の直接的な結果としてその免疫系が抑制されていることがあり、したがってＳＥＢ療法での免疫原の影響力が軽減することがある。しかし、このような制限は、ＳＥＢ療法を役立てることのできる他の患者には存在し得ない。本発明の目的は、有害な免疫原性応答が誘発される潜在的可能性が低減されたＳＥＢ系組成物を提供する最初のステップとして、ＳＥＢ分子の免疫原性領域を確定することである。このような組成物は、癌でない疾患を含む、現状よりも広い種類の臨床上の適応症に適用できるはずである。
対照として、米国特許第6528051号は、ＳＥＢを特異的および防御的な免疫応答を起こす抗原として使用することを企図している。ＳＥＢは、コロイド金錯体として投与される。
同様に、米国特許出願20010046501A1は、感染疾患の適応症向けの治療または予防処置計画での混合ＳＥＡ／ＳＥＢ組成物の使用を提案している。この手法は、未処置(非活性化)Ｔ細胞集団を除去して、抗原に対する特定の免疫応答を強化することのできる組成物および治療スケジュールを提供している。
より最近では、米国特許出願第20030009015A1が、超抗原の属性をもたないが、構造が免疫系によって認識されるのに十分な程度に無処置である超抗原ワクチン組成物を提供して、防御的なワクチン接種を実施している。ＭＨＣクラスII結合領域またはＴＣＲ結合領域内での置換を含むＳＥＢ分子が記載され、所望の成果を得るのに十分であるとみなされている。一文字記号を使用して、６１Ａ、６７Ｑ、８９Ａ、９４Ａ、および１１５Ａを含む置換が企図されている。
一般に、ＳＥＡトキシンを活用して同方向の戦略が採用されているが、たとえば、米国特許出願20030039655A1は、ＳＥＡ部分が、表面に露出した残基でのアミノ酸置換を含んでいる、血清反応性低減作用をもつＳＥＡ−抗体コンジュゲートを企図している。本明細書の場合とは対照的に、この出願は、宿主抗体と相互に作用することのできるＳＥＡ分子の表面決定基に関するものであり、ＳＥＢのＴ細胞エピトープを対象としていない。
前述の事項から、他の特許が改変ＳＥＢ分子を含むＳＥＢ分子を提供している場合、これらの教示は、タンパク質の免疫原性の性質に対するＴ細胞エピトープの重要性を扱ってもいなければ、本発明のスキームに従う明確かつ制御された方法の中で前記免疫原性に直接に影響を及ぼすことを考えてもいないことがわかる。
したがって、本発明の特定の目的は、潜在的なＴ細胞エピトープの数を減らすことによって免疫特性が改変されている改変ＳＥＢタンパク質を提供することである。この免疫特性は、全タンパク質分子がＭＨＣ−ＴＣＲ架橋を介してＴ細胞活性の誘発物質として働く機能的な能力とは異なる。むしろ、本発明の目的は、超抗原活性が保たれているが、治療目的で投与されたＳＥＢに対する免疫応答を中和させる能力、特にＴ細胞を媒介として抗体応答を中和させる能力が低減しているＳＥＢ分子を提供することである。
線状タンパク質配列内のＴ細胞エピトープの出所と位置を、本明細書では、「エピトープマップ」と呼ぶ。本発明の目的は、ＳＥＢのエピトープマップを提供することである。
本発明の別の目的は、予めマッピングされているＴ細胞エピトープの、ＭＨＣクラスIIリガンドとして機能する能力、およびまたはＭＨＣクラスII分子と合同でＴ細胞を活性化する能力が損なわれているＳＥＢ類似体を提供することである。ヒト対象において免疫応答を誘発する素質が低減しているか、または存在しないＳＥＢを提供することが非常に望ましく、したがって、本発明の特定の目的は、潜在的Ｔ細胞エピトープの数を減らすことによって免疫特性が変更されている改変ＳＥＢタンパク質を提供することである。
要するに、本発明は、以下の点に関する。すなわち、
・未処置Ｔ細胞アッセイで合成ペプチドパネルを使用して、ＳＥＢの免疫原性領域のマッピングを行うこと、
・20人以上の健常ドナーから単離したＰＢＭＣを使用する、ＳＥＢタンパク質のＴ細胞エピトープマップの構築、ならびに
i)生理的比率のＴ細胞対抗原提示細胞を含有するＰＢＭＣ調製物を用い、２種以上のペプチド濃度の合成ペプチド免疫原を、最長で７日間の培養期間にわたり使用する、in vitroでの抗原刺激と、ii)任意の適切な方法による誘発増殖指数の測定と、を含むステップを有するスクリーニング法の構築、
・未処置Ｔ細胞アッセイにおいて1.8、好ましくは2.0を超える刺激指数を誘起し得るＳＥＢ由来ペプチド配列、
・未処置Ｔ細胞アッセイでの刺激指数が1.8、好ましくは2.0よりも大きいＳＥＢ由来のペプチド配列であって、最小限に改変してあり、未処置Ｔ細胞アッセイで試験すると、刺激指数が2.0未満であることが判明するペプチド配列、
・野生型のタンパク質配列とのアミノ酸同一性が100％であり、Ｔ細胞アッセイで1.8以上、好ましくは2.0より大きい刺激指数を誘起し得るＳＥＢ由来ペプチド配列、
・野生型のタンパク質配列との100％未満のアミノ酸同一性を含むように改変され、Ｔ細胞アッセイで試験したとき2.0未満の刺激指数を誘起する、しかるべく指定されたＳＥＢペプチド配列、。
・その免疫原性領域が、Ｔ細胞アッセイを使用してマッピングされ、次いで、Ｔ細胞アッセイで再試験の際にその改変タンパク質が親(非改変)分子未満の刺激指数、最も好ましくは2.0未満である刺激指数を誘起するように改変されているＳＥＢ分子、
・ＳＥＢの生物学的活性を有し、実質的に非免疫原性であるか、またはin vivoで使用したとき同じ生物学的活性を有する任意の非改変分子よりも免疫原性が低い改変分子、
・本明細書でエピトープ領域Ｒ１、Ｒ２およびＲ３として規定される残基の連続鎖の１個または複数の残基が変更されている、しかるべく指定された分子、
Figure 2005535351
・本明細書で好ましいエピトープ領域Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃとして規定され、配列
Figure 2005535351
を含む残基の連続鎖の１個または複数の残基が変更されている、しかるべく指定された分子、
・本明細書で好ましいエピトープ領域Ｒ２ａとして規定され、配列ＳＩＫＤＴＫＬＧＮＹＤＮＶＲＶを含む残基の連続鎖の１個または複数の残基が変更されている、しかるべく指定された分子、
・本明細書で好ましいエピトープ領域Ｒ３ａとして規定され、配列ＤＫＹＶＤＶＦＧＡＮＹＹＹＱＣを含む残基の連続鎖の１個または複数の残基が変更されている、しかるべく指定された分子、
・配列Ｒ１ａ、ｂ、ｃ〜Ｒ３ａまたはＲ１〜Ｒ３のいずれかに由来する13〜15個の連続的した残基を含むペプチド分子、
・本明細書の表１の同定された配列のいずれかに由来する13〜15個の連続的した残基を含むペプチド分子、
・次式Ｉ
Figure 2005535351
［式中、
Ｘ0は、水素、または抗体、抗体ドメイン［Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ)２’、ｓｃＦｖ、Ｆｃ−ドメイン］などの標的指向性部分、または別のタンパク質もしくはポリペプチドであり、
Ｘ1＝Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＭであり、
Ｘ2＝Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＭであり、
Ｘ3＝Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＹであり、
Ｘ4＝ＡまたはＩであり、
Ｘ5＝ＨまたはＬであり、
Ｘ6＝Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＹであり、
Ｘ7＝ＨまたはＶであり、
Ｘ8＝Ａ、Ｐ、Ｇ、またはＶであり、
Ｘ9＝Ｔ、Ｈ、またはＦであり、
それによって、同時に、Ｘ1＝Ｍ、Ｘ2＝Ｍ、Ｘ3＝Ｙ、Ｘ4＝Ｙ、Ｘ5＝Ｌ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｖ、Ｘ8＝Ｖ、およびＸ9＝Ｆが除外されている。］のアミノ酸配列を含む改変ＳＥＢ分子。
・エピトープ領域Ｒ１〜Ｒ３またはＲ１ａ〜Ｒ３ａに由来するペプチド配列のいずれかとのアミノ酸同一性が80％より高い上記のペプチド分子、
・本明細書の表１で同定されるペプチド配列に由来するペプチド配列とのアミノ酸同一性が80％より高い上記のペプチド分子、。
・ＭＨＣクラスIIを結合することのできる上記のようなペプチド配列、
・ＭＨＣクラスIIに結合する活性を有する上記のペプチドまたは改変ペプチドのいずれかを含む薬剤組成物、
・上記および以下で規定するような前記の指定された改変分子のいずれかをコードするＤＮＡ配列または分子、
・ＳＥＢの生物学的活性を有する改変分子を含む薬剤組成物、
・任意選択で薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形剤を添加する、上記および／または特許請求の範囲で規定する薬剤組成物、。
・ＳＥＢの生物学的活性を有する改変分子の製造方法であって、(i)ポリペプチドまたはその部分のアミノ酸配列を決定するステップと、(ii)in vitro技術もしくはin silico技術または生物学的アッセイを使用するペプチドのＭＨＣ分子への結合状態の判定を含む任意の方法によって、タンパク質のアミノ酸配列内の１種または複数の潜在的なＴ細胞エピトープを同定するステップと、(iii)in vitroもしくはin silico技術または生物学的アッセイを使用しながらペプチドのＭＨＣ分子への結合状態によって判定されるＴ細胞エピトープの活性が実質的に低減または消失するように改変された、同定された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１個または複数のアミノ酸が新しい配列変異体を設計するステップと、(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、前記変異体を試験して、望ましい特性を有する１種または複数の変異体を同定するステップと、(v)任意選択でステップ(ii)〜(iv)を繰り返すステップと、を含む方法、
・ステップ(iii)を、もとから存在するいずれかのＴ細胞エピトープ中の１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって実施する、しかるべく指定された方法、
・相同タンパク質配列および／またはin silicoモデリング技術に関して前記の変更を行う、しかるべく指定された方法、
・上記で特定したＴ細胞エピトープペプチドの少なくとも９個の連続したアミノ酸残基からなるペプチド配列、ならびに免疫原性が実質的にないか、または任意の非改変分子よりも低く、かつin vivoで使用したときにＳＥＢの生物学的活性を有するＳＥＢの製造でのその使用、
・未処置Ｔ細胞活性化アッセイと、ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームとを使用して、ＳＥＢ中のＴ細胞エピトープの位置をマッピングする協調的方法、。
・ＳＥＢ中のＴ細胞エピトープの位置づける方法であって、
i)未処置Ｔ細胞活性化アッセイおよび対象のタンパク質配列を集合的に含む合成ペプチド配列を使用して、Ｔ細胞を活性化することのできるエピトープ領域を同定するステップと、
ii)ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、ステップ(i)で同定されたエピトープ領域を分析し、それによってエピトープ領域内のＭＨＣクラスIIリガンドを同定するステップと、
iii)ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、ＭＨＣクラスIIともはや結合しない、またはより少ないＭＨＣアロタイプとより低い親和性でしか結合しないエピトープ領域内に含まれるＭＨＣリガンドの配列類似体を同定するステップと、
iv)未処置Ｔ細胞活性化アッセイ、および対象のタンパク質内で同定されたエピトープ領域を完全に、または集合として含む合成ペプチドを使用して、その配列類似体を、未処置Ｔ細胞活性化アッセイで野生型(親)配列と並行して試験するステップと
を含む方法。
・ステップ(ii)および(iii)を、WO02/069232が教示しているような計算による手法を使用して実施する、上記スキームに従う方法、
・ステップ(iv)を任意選択で実施する、上記スキームに従う方法、
・未処置Ｔ細胞活性化アッセイを、約20以上の無関係なドナーに由来のＰＢＭＣ細胞を使用して実施する、上記スキームに従う方法、
・２種以上の独立したドナーサンプルで約2.0の刺激指数スコアが認められるときにＴ細胞エピトープの位置が判明する、上記スキームに従う方法、
・２種以上の独立したドナーサンプルで約2.0の刺激指数スコアが認められるときにＴ細胞エピトープの位置が判明する、上記スキームに従う方法、
・２種以上の独立したドナーサンプルで約2.0の刺激指数スコアが認められるときにＴ細胞エピトープの位置が判明し、計算システムを使用して同じ配列位置内で１種または複数のＭＨＣクラスIIリガンドを同定することのできる、前記スキームに従う方法、
・前記の計算システムがWO02/069232によって教示されている方法に従うものである、前記スキームに従う方法、
(発明の詳細な説明)
本発明の第１の実施形態によれば、ＳＥＢのＴ細胞エピトープマップが提供される。ＳＥＢのエピトープマップは、特定の位置で、特定の残基によってアミノ酸置換を行って、タンパク質の１個または複数の潜在的なＴ細胞エピトープが除去され、またはその活性が実質的に低減されているＳＥＢ類似体を設計する際に有用である。本発明は、親分子の最も免疫原性のある領域内での適切な置換の例を提供し、そのような置換を本発明の実施形態であるとみなす。
共同所有の出願WO02/069232では、in silico技術を使用して、治療上関心が持たれている多数のタンパク質のＭＨＣクラスIIリガンドを確定している。しかし、タンパク質分解による処理、およびin vivoで免疫原性ペプチドの提示をもたらす他の生理的ステップが必要であるなどの理由のために、全ペプチドレパートリーのうちの比較的小規模なサブセットが、最終的な生物学的関連性をもつことははっきりしている。発明者らは、ex vivoヒトＴ細胞活性化アッセイを使用して、Ｔ細胞の活性化を支持することができ、そのためにこのタンパク質の免疫原性の問題に生物学的に最も関連性のある、ＳＥＢのタンパク質配列内の領域を同定できることを確立した。本明細書で開示するＳＥＢのエピトープマップは、このような手法を適用して得られたものであり、開示する方法はしたがって、本発明の実施形態でもある。
この方法によれば、合成ペプチドを、in vitroで培養したヒトＴ細胞の増殖応答を誘起する能力があるか試験する。Ｔ細胞は全血サンプルから周知の手段によって容易に得られる末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)層内に存在する。さらに、ＰＢＭＣ調製物はＴ細胞と抗原提示細胞を生理的比率で含有しており、したがってin vitroで代理免疫反応を実施するための良好な材料供給源である。発明者らは、このようなアッセイを実施する際、刺激指数2.0付近が、増殖が誘発されたことの有用な基準となることを確立した。刺激指数(ＳＩ)は、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア(たとえば3Ｈ−チミジンの取込みを使用する場合では、１分あたりの放射能カウント)を、試験ペプチドと接触させていない細胞で測定されたスコアで割ることによって普通に導かれる。応答を誘起していないペプチドでは、ＳＩ＝1.0が得られるが、実際には0.8〜1.2の範囲のＳＩ値は注目に値しない。いくつかの技術的手順をこのようなアッセイの操作に組み込んで、記録されたスコアの信頼度を確実にすることができる。通常、判定は少なくとも３通りに行い、平均スコアを計算することができる。計算されたＳＩが＞2.0である場合、３通りの個々のスコアを、範囲外のデータの形跡があるか調べることができる。試験ペプチドは少なくとも２種の異なる濃度の細胞と接触させるが、その濃度は、通常最小で２倍の濃度差を有するはずである。このような濃度範囲は、アッセイの動的な面を補い、たとえばプラス７日目での単一時点判定を行う場合に特に重要である。いくつかのアッセイでは、複合的な時間経過での判定を行うが、いずれにせよ、このようなアッセイも、少なくとも２種の異なる濃度で用意されたペプチド免疫原を使用して行われることになる。同様に、ＰＢＭＣドナーサンプルの大多数が応答性であるという見込みのある対照ペプチド含有物を各アッセイプレートに含めることもできる。インフルエンザ赤血球凝集素ペプチド307-309、すなわち配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ、およびクラミジアＨＳＰ 60ペプチド配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨが、特に適切な対照ペプチドであるが、他の多くの例を活用することができる。アッセイでは、好ましくは、すべてのＰＢＭＣサンプルが2.0よりもかなり大きいＳＩを示すことが予想される、キーホールリンペット由来ヘモシアニンなどの強力な全タンパク質抗原も使用すべきである。
考えられる広いスペクトルのＭＨＣアロタイプに関連したＳＥＢエピトープマップを提供することが特に望ましい。マップは、そのタンパク質が投与される可能性のある患者の大多数について、そのタンパク質の、Ｔ細胞によって駆動される免疫応答を誘起する能力が消失し、もしくは少なくとも緩和されている改変タンパク質の設計または選択を十分に可能にするものであることが望ましい。したがって、スクリーニング方法を実施する際には、ヒト集団中に実在するＭＨＣクラスIIレパートリー(ＨＬＡ−ＤＲ)が少なくとも90％以上であるサンプルを提供するのに十分な免疫多様性のあるドナープールから、未処置ドナーのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を収集する。所与の合成ペプチドに対する未処置Ｔ細胞応答を検出する場合では、実際はそのペプチドを単離して多数の別々のドナーに由来するＰＢＭＣ調製物と接触させ、ドナーの数(または「ドナープール」サイズ)は、実際上の目的では、無関係な個体が20種類未満であることはなく、ドナープール中のサンプルはすべて、そのＭＨＣクラスIIハプロタイプに従って予め選択することができる。
用語「未処置ドナー」とは、本発明では、治療目的でＳＥＢ供給源を与えられていない個体から得たＴ細胞を意味するが、しかし、集団中の多くの個体が、環境中の外来ＳＥＢおよびＳＥＢ様タンパク質源に以前に曝されているかもしれないことは認知されている。そのような個体では、本明細書のアッセイに関してはＳＩスコアが特に大きいことを特徴とする再現型の応答が見込まれる。これは、一例では特定のペプチドが8.1のＳＩスコアを与える場合に、ある種の個体で実際に見受けられた。
本発明は、本明細書で、免疫に関して未処置のＴ細胞を活用するＴ細胞エピトープマッピングの方法を開示する。Ｔ細胞は、多数の異なる健常ドナーからの末梢血サンプルから得、対象のタンパク質がそのドナーに内在する分子であってもよいが、ドナーには、たとえば治療目的で投与された、外来供給源由来の対象のタンパク質が与えられていない。アッセイは、当業界で一般的な手順を使用してin vitroで培養したＰＢＭＣを用いて実施し、ＰＢＭＣを対象のタンパク質である合成ペプチド種と接触させるものであり、その後、適切な期間インキュベートし、ペプチドによって誘発された、細胞増殖などのＴ細胞活性化を測定する。測定は、任意の適切な手段によって行い、たとえば、3Ｈチミジンの取込みを利用することができ、それによると、細胞材料への3Ｈの蓄積が研究室の機器を用いて容易に測定される。ＰＢＭＣサンプルと合成ペプチドのそれぞれの組合せについて、非ペプチド処理ＰＢＭＣサンプルでわかったものと比べた細胞増殖の度合いを調べる。増殖作用が期待される１種または複数のペプチドで処理した後にわかった増殖応答を当てはめてもよい。これに関しては、既知の広いＭＨＣ拘束性を有するペプチド、特にＤＰまたはＤＱアイソタイプへのＭＨＣ拘束性を有するペプチドエピトープを使用すると特に有利であると考えられる。
ＳＥＢのエピトープマップの作成を容易にするために、一連の合成ペプチドを作成した。ペプチドはそれぞれ、長さが15アミノ酸残基であり、それぞれ系列の次のペプチドと12アミノ酸残基が重複しており、すなわち、系列の連続的な各ペプチドによって、更なる３個のアミノ酸が徐々に分析に加えられた。この過程で、任意の所与の隣接するペプチドの対によって、18個のアミノ酸の連続した配列がマッピングされた。ＳＥＢでは、完全な成熟タンパク質の走査を可能にするのに合計77個のペプチドが必要であった。しかし、完全タンパク質の配列長さのために、Ｃ末端の走査の実用性を確保しようとすると、最後の２本のペプチドが14量体と11量体になった。ＳＥＢのＴ細胞マップを確定するのに特に有効な、未処置Ｔ細胞アッセイを使用する方法を実施例１に示す。
この研究では、２種以上の個々のドナーサンプルで有意な増殖応答を誘起し得る５種のペプチド配列が発見された。そのペプチドは、表１に示し、これらを本発明の実施形態とする。
表１の同定されたペプチドはそれぞれ、ＭＨＣクラスIIを結合し、このアッセイ系で検出可能な増殖バースト誘起するのに十分な親和性で少なくとも１個の同系統のＴＣＲを結合し得ることが示唆される。２種、または場合によっては３種の無関係なＰＢＭＣサンプルから得たＰＢＭＣを使用して、これらの判断基準に達した。これらのペプチドは、分子の主要なエピトープ領域を含んでいると考えられ、ＳＥＢ配列中の３ゾーンに対するクラスターを、本明細書では、それぞれエピトープ領域Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３と称し、またはそれぞれの鎖Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の副鎖であるＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａと称する。
Figure 2005535351
エピトープ領域Ｒ１ａは、配列ＫＦＴＧＬＭＥＮＭＫＶＬＹＤＤＮＨＶＳＡＩを含むペプチドＰ６、Ｐ７、およびＰ８によって包含される。Ｒ１ａエピトープについては、ペプチドＰ６およびＰ８がそれぞれ、２種のドナーサンプルと反応性であるのに対し、介在するペプチドＰ７がそのドナーの一方としか反応性でないことに留意されたい。この例では、Ｐ７の反応で特に高いＳＩスコア(8.1)が得られ、反応性のサンプルは、Ｐ６およびＰ８とも反応性である。連続的な各ペプチドの配列が段階的に移行するために、２種または３種の隣接するペプチド間で同じコア９量体配列が共有される(すなわち、共通である)ことが可能である。厳密な段階的移行は、Ｎ末端への近接度に応じて変わり、ペプチドの長さ、ならびに配列が連続的に増大していくごとに走査された「新しい」残基の数と関連付けられる。Ｒ１ａエピトープの場合では、いくつかの重複するＭＨＣクラスIIリガンドを同定することができた(図１を参照)。
エピトープ領域Ｒ２は、配列ＳＩＫＤＴＫＬＧＮＹＤＮＶＲＶを含むペプチドＰ１８によって包含される。
エピトープ領域Ｒ３は、配列ＤＫＹＶＤＶＦＧＡＮＹＹＹＱＣを含むペプチドＰ２７によって包含される。
ＳＥＢ配列内の別のペプチド配列もＴ細胞エピトープとして機能できるはずであり、そのような配列は、in vitroで物理的結合アッセイを使用して、またはたとえば計算技術を使用するバーチャルな手段を使用して、ＭＨＣリガンドとして検出できることを理解されたい。さらに、本明細書で示すような生物学的アッセイでは、特定のドナーサンプル中の別の反応ペプチドを検出することができ、そのサンプルは、環境中でＳＥＢ、またはＳＥＢと同一または少なくとも非常に相同的なペプチド配列を含む他の任意の毒素もしくは非毒素タンパク質に曝されて間もない個体からのものでよい。それにもかかわらず、本明細書では、開示する配列Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａが、これらのエピトープの１種または複数が含まれている改変ＳＥＢ分子の構築に必要なクリティカルな情報であるとみなす。
本明細書のスキームの下で、エピトープは、突然変異によって欠陥を生じて、Ｔ細胞エピトープとして機能できない配列となる。標的配列の定方向突然変異生成を実現するのに組換えＤＮＡ法を使用することが可能であるが、そのような数多くの技術が利用可能であり、当業界でよく知られている。
上記の表１のペプチドのうちの少なくとも１種または複数のアミノ酸配列を改変することが本発明の目的である。本明細書では、対象ペプチド配列が、１種または複数のＭＨＣクラスIIアロタイプのリガンドとなるレベルでＴ細胞エピトープとして機能できる能力を低減し、または消失させる目的を達成する適切な改変例を開示する。そのような適切な一連の改変例を式Ｉに示す。
この第２の実施形態によれば、タンパク質の適切な改変例には、特定の残基または残基の組合せのアミノ酸置換が含まれる。Ｔ細胞エピトープを除去するためには、アミノ酸置換は、Ｔ細胞エピトープの活性の実質的な低減または消失が実現することが予想されるペプチド配列内の適切な点で行うことが好ましい。実際には、適切な点は、ＭＨＣクラスII結合溝内に設けられている１ポケット内で結合するアミノ酸残基であることが好ましい。ペプチドのいわゆる「Ｐ１」または「Ｐ１アンカー」位置の、開裂部の最初のポケット内での結合を変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基とＭＨＣクラスII結合溝の最初のポケットとの結合相互作用の質は、完全ペプチドに対する全体としての結合親和性の主要な決定要因であると認められている。ペプチドのこの位置での適切な置換は、ポケット内でより容易に適応しない残基への置換、たとえば、より親水性の残基への置換となる。ＭＨＣ結合開裂部内の他のポケット領域内での結合に対応する位置にあるペプチドのアミノ酸残基も考慮に入れ、本発明の範囲に含める。
所与の潜在的Ｔ細胞エピトープ内での単一のアミノ酸置換が、そのエピトープを除去することのできる最も好ましい経路であることを理解されたい。単一エピトープ内での置換の組合せを企図してもよく、たとえば、確定された個々のエピトープが互いに重なり合っている場合に特に適切となり得る。さらに、ＭＨＣクラスII結合溝については、「ポケット残基」でない位置での、アミノ酸置換を所与のエピトープ内で単独に行うことも、または単一のエピトープ内で組み合わせて行うこともできるが、ペプチド配列内ではどの点でも行うことができない。置換は、当業界で知られているin silico技術を使用して生み出される相同的な構造または構築方法に即して行うことができ、分子の既知の構造的特徴を基にしてよい。タンパク質データバンクに含まれているＳＥＢの結晶構造モデルは、これに関して特に有用である[PDB ID：３ＳＥＢ Papageoriou, A.C.ら(1998年)、J.Mol.Biol. 第277巻：61〜79頁]。変異体分子の構造または生物学的活性を回復させるための変更を企図してもよい。そのような代償的な変更または変更には、ポリペプチドの特定のアミノ酸の欠失または付加も含まれよう。
タンパク質分子からエピトープを除去する特に有効な手段は、本明細書で概略を述べた未処置Ｔ細胞活性化アッセイスキームと、参照により全体が本明細書に援用される共同所有の出願WO02/069232に記載のスキームに従って開発されたin silicoツールとの協調的使用である。
このソフトウェアは、ペプチドＭＨＣクラスIIが結合相互作用を示すレベルで抗原提示の過程を刺激して、任意の所与のペプチド配列についての結合スコアを提供する。集団中に実在する多種類の主なＭＨＣクラスIIアロタイプについてこのようなスコアを決定する。このスキームでは、どんなペプチド配列も試験できるので、ペプチドの、ＭＨＣクラスII結合溝と結合できる能力に関するアミノ酸の置換、付加、または欠失の結果を予測することができる。その結果として、ＭＨＣクラスIIと相互に作用することができ、したがって免疫原性Ｔ細胞エピトープとして機能することのできるペプチドが含まれる数が減少している新しい配列組成物を設計することができる。任意の所与の１ドナーサンプルを使用する生物学的アッセイによって、最高で４種のＤＲアロタイプへの結合を評価できる場合、in silicoプロセスでは、＞40種のアロタイプを同時に使用して、同じペプチド配列を試験することができる。実際には、この手法を、多種類のＭＨＣアロタイプと相互に作用する能力に欠陥のある新しい配列変異体の設計に向けることができる。
Ｔ細胞アッセイでは、分子内の３箇所の免疫原性領域Ｒ１ａ〜Ｒ３ａを確定することができ、WO02/069232のスキームに従うソフトウェアシステムでは、それぞれのエピトープ内の予想されるＭＨＣクラスIIリガンドを同定することができた。また、このシステムではさらに、ペプチド配列と、このシステムで表された本質的にすべてのＭＨＣクラスIIアロタイプ間の結合親和性をかなり損失させる、エピトープ内のアミノ酸置換を同定することができる。
このような一連の改変の一例は、Ｒ１ａエピトープ領域の破壊によってもたらされる。Ｍ２１Ａ、Ｍ２４ＡおよびＹ２８Ｔの置換セットによって、主要なＭＨＣクラスIIリガンドのエピトープＲ１ａ内に欠陥が生じる。
同様に、エピトープ領域Ｒ２内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドでは、置換Ｉ５３ＡおよびＬ５８Ｈが、好例となる可能な変更である。
エピトープ領域Ｒ３では、適切な一連の置換は、変更Ｙ８１Ｔ、Ｖ８２Ｈ、Ｖ８４ＡおよびＦ８５Ｔのうちの１種または複数を含む。
上記のどの例でも、所与のペプチドの、ＭＨＣクラスII結合溝内で結合する能力、ならびにＳＥＢの結晶構造モデルの調査に基づく考慮すべき構造上の問題を根拠に、代替突然変異のセットを見つけることができるＰＤＢ ＩＤ番号３ＳＥＢおよび１ＧＯＺ［３ＳＥＢについては、Papageoriou, A.C.ら(1998年)、J.Mol.Biol. 第277巻：61〜79頁参照。１ＧＯＺについては、Baker M.D.ら(2002年)、J.Biol.Chem. 第277巻：2756〜2762頁参照］。
上記の置換はそれぞれ、この方法の実例であり、本発明の計画に従う好ましい組成物である。当業者には言うまでもないが、代替置換セットが多数あれば、望ましくないエピトープを除去する目的の達成に到達できるはずである。しかし、得られる配列は、本明細書で開示する特定の組成物と非常に相同的であることが認められるはずであり、したがって本発明の範囲に入る。
ＭＨＣクラスIIリガンドを同定し、ＭＨＣクラスIIリガンドを欠いている配列類似体を設計するためのin silicoツールを使用し、併せて、任意選択でＴ細胞活性化の生物学的アッセイを使用してエピトープマッピングおよび再試験を行う複合的手法は、特に有効な方法であり、本発明の最も好ましい実施形態である。この実施形態による一般法は、
i)未処置Ｔ細胞活性化アッセイおよび対象のタンパク質配列を集合的に含む合成ペプチドを使用して、Ｔ細胞を活性化することのできるエピトープ領域を同定するステップ、
ii)ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、ステップ(i)で同定されたエピトープ領域を分析し、それによってエピトープ領域内のＭＨＣクラスIIリガンドを同定するステップ、
iii)ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、ＭＨＣクラスIIともはや結合しない、またはより少ないＭＨＣアロタイプとより低い親和性でしか結合しないエピトープ領域内に含まれるＭＨＣリガンドの配列類似体を同定するステップ、ならびに任意選択で、
iv)未処置Ｔ細胞活性化アッセイ、および対象のタンパク質内で同定されたエピトープ領域を完全に、または集合として含む合成ペプチドを使用して、その配列類似体を、未処置Ｔ細胞活性化アッセイで野生型(親)配列と並行して試験するステップ
を含む。
用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、本発明の理解によれば、ＭＨＣクラスIIを結合することができ、Ｔ細胞を刺激し、かつ／またはＭＨＣクラスIIとの複合体になって(必ずしも測定可能な活性化がなくとも)Ｔ細胞も結合することのできるアミノ酸配列を意味する。
用語「ペプチド」とは、本明細書および添付の特許請求の範囲では、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、(本明細書の以下で定義する)ペプチド結合によって結合している。自然に存在する20種類の異なるアミノ酸が、生物によるペプチド産生に関与しており、これらのアミノ酸は、任意の数で結合して、ペプチドの鎖または環を形成することができる。生物によるペプチド産生に用いられる、自然に存在するアミノ酸はすべて、Ｌ型立体配置をとっている。合成ペプチドは、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、または２種の異なる立体配置のアミノ酸の様々な組合せを利用しながら、従来の合成法を使用して調製することができる。ある種のペプチドは、数個のアミノ酸単位しか含んでいない。たとえばアミノ酸単位が10個未満である短いペプチドを、時に「オリゴペプチド」と呼ぶ。他のペプチドは、たとえば最高で100個以上の多数のアミノ酸残基を含んでおり、「ポリペプチド」と呼ぶ。慣例によって、「ポリペプチド」は、３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖であるとみなされることもあり、「オリゴペプチド」は、通常は特定の種類の「短い」ポリペプチドであるとみなされる。したがって、本明細書では、「ポリペプチド」への言及があれば、オリゴペプチドも含んでいることを理解されたい。さらに、「ペプチド」への言及は、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含んでいる。アミノ酸は種々の取合せごとに、異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成され得るポリペプチドの数、すなわちタンパク質の種類は、事実上無限である。
本発明のＳＥＢ分子は、いく通りかのいずれかの手段で調製することができるが、常法どおりの組換え法を活用して行うことが最も好ましい。本明細書が提供するタンパク質配列および情報を使用して、好ましいタンパク質配列のいずれかをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡ)を導き出すことは、比較的容易な手順である。これは、たとえば、ＤＮＳｓｔａｒソフトウェアスーツ[DNAstar Inc、米国ウィスコンシン州マディソン]または同様のものなど、コンピューターソフトウェアツールを使用して実現することができる。本明細書の好ましいポリペプチドまたはその重要な相同物をコードすることのできるそのようなＤＮＡ配列はどれも、本発明の実施形態であるとみなすべきである。
一般スキームとして、ＳＥＢタンパク質配列のいずれかをコードする遺伝子を、遺伝子合成を使用して作製し、適切な発現ベクターにクローン化することができる。次いでその発現ベクターを、宿主細胞に導入し、細胞の選択および培養を行う。好ましい分子を培地から精製し、配合を行って治療用投与向けの製剤にする。あるいは、たとえば、黄色ブドウ球菌由来ＤＮＡとＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲクローニング戦略、ならびにHorganおよびFraser［Horgan C ＆ Fraser J.D、ＭＨＣ第１巻第８章、「A Practical Approach」、107〜121頁、Fernandez, N.＆ Butcher, G.編、IRL Press、英国オックスフォード、1997年］が記載しているプロトコルに従って、野生型ＳＥＢ遺伝子配列を得ることができる。野生型毒素遺伝子は、突然変異を誘発し、好ましい変異体配列を構築するための鋳型として使用することができる。これに関して、Higuchiら[Higuchiら(1988年)、Nucleic Acids Res. 第16巻：7351頁]が記載している「オーバーラップ伸長ＰＣＲ」の戦略を使用すると特に好都合であるが、他の方法およびシステムも容易に適用できるはずである。次いで、変更されたコードＤＮＡを、大腸菌など選択した宿主細胞系の中で従来の手段によって発現させ、そこから所望のＳＥＢを回収し、精製する。適切な宿主細胞、精製およびアッセイのスキームは、当業界でよく知られている。
ＳＥＢ分子の構築を組換えＤＮＡ技術によって実施してよい場合、他のタンパク質ドメイン、たとえば抗体の定常部ドメインと融合したＳＥＢ分子を含むこともできる。融合タンパク質を含む組換えタンパク質の精製および操作の方法は当業界でよく知られている。必要な技術は、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第２版(Sambrookら、1989年)；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait，編、1984年)；「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney，編、1987年)；「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」(D.M. Weir＆ C.C. Blackwell，編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. Miller ＆M.P.Calos編、1987年)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel ら編、1987年)；「PCR：The polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994年)；「Current Protocols in Immunology」(J.E. Coliganら編、1991年)などの文献で十分に説明されている。
本発明は、主要なアミノ酸配列が本明細書で開示するものとほぼ同じ分子からなるいかなるＳＥＢ種にも適用することができ、したがって遺伝子工学手段または他の方法によって得られたＳＥＢ分子を含むことになり、239個程度のアミノ酸残基を含んでいてよい。
ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、Ｃ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、およびＦだけでなく、異なる微生物供給源に由来する他の同類毒素も、同じくこの開示のペプチド配列の多くを備え、また同じく開示する表のものとほぼ同じ配列のペプチド配列を多数有する。このようなタンパク質配列は、したがって等しく本発明の範囲に入る。
本発明が、改変ＳＥＢに関するものである限り、そのような改変ＳＥＢタンパク質もしくは改変ＳＥＢタンパク質断片を含む組成物ならびに関連組成物は、本発明の範囲内であるとみなすべきである。この点で直接関係のある例には、開示されたペプチドの１種または複数を免疫療法の目的で患者に投与する、ペプチド媒介型寛容性導入戦略の開発もあり得るはずである。したがって、たとえば、表１に示した１種または複数の配列、より好ましくはエピトープ領域Ｒ１ａ、Ｒ２ａおよびＲ３ａのいずれかの全体または部分を含む配列を含む合成ペプチド分子は、本発明の実施形態とみなす。
もう１つの態様では、本発明は、改変ＳＥＢの実体をコードする核酸に関する。別の態様では、本発明は、改変ＳＥＢタンパク質を使用するヒトの治療処置方法に関する。この態様では、改変ＳＥＢを組換え型融合タンパク質として生成することができる。この態様では、改変ＳＥＢタンパク質を抗体分子または抗体分子の断片に連結することができる。連結は、化学的架橋剤によって行うことができ、またはより好ましくは、ＳＥＢ抗体を組換え融合タンパク質として生成することもできる。融合分子は、改変ＳＥＢドメインと共に、融合分子のＮ末端に向かって配向をとる抗体ドメインを含んでいてよいが、逆の配向を企図してもよい。
本明細書の改変ＳＥＢ分子への連結について望ましい抗体特異性には、癌特異的抗原に対するものが含まれ、その例には、Ａ３３抗原[Heath, J.K.ら(1997年)、Proc.Natl,Acad.Sci U.S.A. 第94巻：469〜474頁]およびＧＡ７３３−１抗原[米国特許第5840854号]が含まれる。癌胎児性抗原の使用を企図してもよく、癌胎児抗原は、数多くの抗体のいずれの標的ともなり得るが、それには、ＭＦＥ２３[Chester, K.A.ら(1994年)、Lancet 第343巻：455頁]、Ａ５Ｂ７[W092/010159]、Ｔ８４．６６[米国特許第5081235号]、ＭＮ−１４[Hansen, H.J.ら、(1993年)、Cancer 第71巻：3478〜3485頁]、ＣＯＬ−１[米国特許第5472693号]、抗体ＫＳ１／４によって認識される４０ｋＤａの糖タンパク質抗原[Spearmanら(1987年)、J.Pharmacol.Exp.Therapeutics 第241巻：695〜703頁]、上皮細胞成長因子受容体(ＨＥＲ１)もしくはＨＥＲ２などの同類受容体、抗体１４．１８などの抗ＧＤ２抗体[米国特許第4675287号、EP0192657]、または前立腺特異膜抗原に対する抗体[米国特許第6107090号]、ＩＬ−２受容体[米国特許第6013256号]、Ｌｅｗｉｓ Ｙ決定基、ムチン糖タンパク質が含まれ、または他を企図することもできる。
どの例でも、改変ＳＥＢタンパク質を抗体配列と融合させて作製する場合、Ｔ細胞エピトープ、あるいはＭＨＣクラスII分子に結合し、またはＴ細胞を刺激し、またはＭＨＣクラスII分子と共同でＴ細胞に結合することのできる配列が除去されている抗体配列を使用することが最も望ましい。
ここで、本発明を以下の実験実施例によって説明する。実施例では、以下の図を参照されたい。
(図面の簡単な説明)
図１は、エピトープ領域Ｒ１ａ内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。リガンドは実施例２のin silicoシステムを使用して同定している。この場合では、18種のヒトＤＲアロタイプの結合プロフィールを柱状に表示している。検出されたリガンドは13量体であり、各13量体の残基番号１が、色付きのブロックによって確認される。18種のアロタイプそれぞれに関して、各ペプチドの結合相互作用の強度(高、中、または低)を表示の記号解説に従って示す。
図２は、エピトープ領域Ｒ２内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。リガンドは実施例２のin silicoシステムを使用して同定している。この場合では、18種のヒトＤＲアロタイプの結合プロフィールを柱状に表示している。検出されたリガンドは、13量体であり、各13量体の残基番号１が、色付きのブロックによって確認される。18種のアロタイプそれぞれに関して、各ペプチドの結合相互作用の強度(高、中、または低)を表示の記号解説に従って示す。
図３は、エピトープ領域Ｒ３内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。リガンドは実施例２のin silicoシステムを使用して同定している。この場合では、18種のヒトＤＲアロタイプの結合プロフィールを柱状に表示している。検出されたリガンドは13量体であり、各13量体の残基番号１が、色付きのブロックによって確認される。18種のアロタイプそれぞれに関して、各ペプチドの結合相互作用の強度(高、中、または低)を表示の記号解説に従って示す。
式Ｉは、ＭＨＣクラスIIリガンドが、エピトープ領域Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａならびにＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａ内での置換によってそれぞれ除去されている、最も好ましいＳＥＢ構造を示す。
(実施例１)
ＭＨＣペプチドとＴ細胞受容体(ＴＣＲ)間の相互作用は、Ｔ細胞による認識が抗原特異性であることの構造的根拠となる。Ｔ細胞増殖アッセイでは、ペプチドのＭＨＣへの結合およびＴＣＲによるＭＨＣ／ペプチド複合体の認識を試験する。この実施例のin vitro Ｔ細胞増殖アッセイは、抗原提示細胞(ＡＰＣ)およびＴ細胞を含む末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を刺激するものである。刺激は、合成ペプチドを抗原として使用してin vitroで与える。3Ｈ−チミジン(3Ｈ−Ｔｈｙ)を使用して、刺激されたＴ細胞増殖を測定し、洗浄した固定細胞をシンチレーションカウンターでカウントして、取り込まれた3Ｈ−Ｔｈｙの存在を評価する。
保存が12時間未満であるヒト血液の軟膜は、National Blood Service(Addenbrooks Hospital、英国ケンブリッジ)から入手した。Ficoll−paqueは、Amersham Pharmacia Biotech(英国Amersham)から入手した。初代ヒトリンパ球を培養するための、Ｌ−グルタミン、50μｇ/ｍｌのストレプトマイシン、10μｇ/ｍｌのゲントマイシン、および0.1％のヒト血清アルブミンを含有するSerum free ＡＩＭ Ｖ培地は、Gibco-BRL(英国ペーズリー)から入手した。合成ペプチドは、Pepscan(オランダ)およびBabraham Technix(英国ケンブリッジ)から入手した。
血しょうから赤血球および白血球を分離し、軟膜を穏やかな遠心分離にかけて血小板を分離した。(血しょうおよび血小板を含有する)最上相を除去し、廃棄した。赤血球および白血球をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で１：１希釈した後、15ｍｌのficoll-paque (Amersham Pharmacia、Amersham、英国)上に層状に重ねた。製造者の推奨条件に従って遠心分離を行い、血清＋ＰＢＳ／ficoll paqueの界面からＰＢＭＣを収集した。ＰＢＭＣをＰＢＳ(１：１)と混合し、遠心分離によって収集した。上清を除去し、廃棄し、ＰＢＭＣペレットを50ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を遠心分離によって再度ペレット状にし、ＰＢＳ上清を廃棄した。50ｍｌのＡＩＭ Ｖ培地を用いて細胞を再懸濁し、この時点でカウントを行い、トリパンブルー色素排除法を使用して生存度を評価した。遠心分離によって細胞を再度収集し、上清を廃棄した。細胞を最懸濁して、１ｍｌあたり３×１０7個の密度で低温貯蔵した。貯蔵培地を90％(v/v)の熱によって失活させたＡＢヒト血清(Sigma、プール、英国)および10％(v/v)のＤＭＳＯ(Sigma、プール、英国)とした。細胞を調整冷凍容器(Sigma)に移し、−70℃で終夜おいた後、液体Ｎ2に移しかえて長期保存に備えた。使用する必要が生じたとき、37℃の温水浴中で細胞をすばやく解凍した後、10ｍｌの予め温めてあるＡＩＭ Ｖ培地に移した。
96穴平底プレート中で、密度をウェルあたりＰＢＭＣ ２×１０5個とし、ＰＢＭＣをタンパク質およびペプチド抗原で刺激した。ＰＢＭＣを37℃で７日間インキュベートした後、3Ｈ−Ｔｈｙ(Amersham-Pharmacia、Amersham、英国)でパルス標識した。この研究では、連続する各ペプチドが12アミノ酸重複している合成ペプチド(15量体)を作製して、ＥＰＯの全配列を網羅した。ペプチドＩＤ番号および配列を表２に示す。
各ペプチドを、20人の未処置ドナーから単離されたＰＢＭＣに対して個々にスクリーニングにかけた。免疫原性があり強力な非再現性(non-recall)抗原ＫＬＨであることが予めわかっている２種の対照ペプチドを各ドナーアッセイで使用した。この研究で使用した対照抗原は、インフルエンザ赤血球凝集素307-319(配列：ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ)、クラミジアＨＳＰ 60ペプチド(配列：ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ)、およびキーホールリンペットヘモシアニンであった。
市販の試薬系(Dynal、英国ウィラル)を使用して、すべてのＰＢＭＣサンプルの組織型を試験した。アッセイは、供給業者の推奨プロトコル、ならびに標準の補助試薬およびアガロース電気泳動系に従って実施した。
ペプチドをＤＭＳＯに溶解させて、最終濃度を10ｍＭとし、次いでその保存溶液をＡＩＭ Ｖ培地で1/500希釈した(最終濃度20μＭ)。ペプチドを平底96穴プレートに加えて、100μｌ中２μＭおよび20μＭの最終濃度とした。解凍したＰＢＭＣの生存度をトリパンブルー色素排除法によって評価し、次いで細胞を２×１０6細胞/ｍｌの密度で再懸濁し、100μｌ(２×１０5 ＰＢＭＣ/ウェル)を、ペプチドを含む各ウェルに移した。３通りのウェル培養物を各ペプチド濃度で試験した。プレートをＣＯ2 ５％の加湿雰囲気中、37℃で７日間インキュベートした。細胞を１μＣｉの3Ｈ−Ｔｈｙ/ウェルで18〜21時間かけてパルス標識した後、フィルターマットに収集した。Wallac microplate beta topプレートカウンター(Perkin Elmer)を使用してＣＰＭ値を決定した。結果は、刺激指数として示したが、ここで、刺激指数(ＳＩ)は、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア(たとえば、１分あたりの放射能カウント)を、試験ペプチドと接触させていない細胞で測定されたスコアで割ることによって導かれる。
Figure 2005535351
Figure 2005535351
Figure 2005535351
Figure 2005535351
Ｔ細胞増殖アッセイを使用してＳＥＢ配列中のＴ細胞エピトープのマッピングを行った結果、３箇所の免疫原性領域Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａが同定された。有意な応答を刺激し得るペプチドを表１に示してある。ＳＥＢペプチドに応答性のドナーのアロタイプ拘束性および記録されたＳＩを表３に示す。
Figure 2005535351
(実施例２)
免疫原性プロフィールが改善されている改変ＳＥＢ配列の設計：
エピトープ領域Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａの分析には共同所有の出願WO02/069232の方法を使用した。このシステムは、生物学的手法で検出されたエピトープ領域内に含まれる特定のＭＨＣリガンドの予測を可能にし、所与のＭＨＣクラスIIリガンドの、特定のＭＨＣアロタイプと相互に作用する能力について「スコア」を与える。
ＭＨＣリガンドに対するアロタイプ拘束性パターンは、添付の図１〜３のエピトープ領域Ｒ１ａ〜Ｒ３ａそれぞれについて提供されるようなアロタイプ拘束性のチャート表示を使用して示すことができる。
エピトープＲｌａ〜Ｒ３ａそれぞれの範囲内の配列の改変を考えるところまで分析を進めた。ＭＨＣクラスII結合能が持続しているか、およびそれが残っている場合にはその結合スコアがいくつであるか、配列変異体を試験した。試験した大半のＭＨＣアロタイプでＭＨＣクラスII結合を消失させた、複合的なアミノ酸置換を確定した。同定された特定の置換を、ＳＥＢ結晶構造モデルＰＤＢ ＩＤ番号３ＳＥＢおよび１ＧＯＺ[３ＳＥＢについては、Papageoriou, A.C.ら(1998年)、J.Mol.Biol. 第277巻：61〜79頁を参照。１ＧＯＺについては、Baker M.D.ら(2002年)、J.Biol.Chem. 第277巻：2756〜2762頁を参照]内で適応する能力があるか、さらに試験した。野生型配列の選択された残基上に設計した突然変異を、立体的な衝突、水素結合の形成、疎水性相互作用、および構造中でのその全般的な適応について調査を行った。立体的な衝突を生じた置換を除外した。側鎖が元の残基と同様の立体配置(回転異性体)をとっているときに適応した置換は許容されるとみなした。２種以上の置換がこれらの判断基準を満たした場合、近隣の側鎖もしくは骨格の原子と水素結合を形成し、かつ／または好都合な疎水性の接触または他の会合を形成する可能性のある残基の方を選んだ。上記手順はSwiss Prot Deep View v3.7 [Guex, N.およびPeitsch, M.C. (1997年)、Electrophoresis 第18巻：2714〜2723頁]を使用して双方向性に実施した。この過程でエピトープ領域Ｒ１〜Ｒ３、好ましくはＲ１ａ〜Ｒ３ａそれぞれにとって好ましい置換セットがもたらされた。これら置換セットを編集して式Ｉに示す構造を作り出した。どの置換でもエピトープ領域Ｒ１〜Ｒ３、好ましくはＲ１ａ〜Ｒ３ａそれぞれの範囲内でＭＨＣクラスIIリガンドが除去されたことが確認された。上記スキームの従う最も好ましいセットを含むＳＥＢ構造を式Ｉに示す。
エピトープ領域Ｒ１ａ内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。 エピトープ領域Ｒ２で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。 エピトープ領域Ｒ３内で同定されたＭＨＣクラスIIリガンドを示す。

Claims (16)

  1. ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)の生物学的活性を有し、実質的に非免疫原性であるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで使用したときに個体において同じ生物学的活性を有する任意の非改変分子よりも免疫原性が低い改変分子であって、
    （ｉ）前記の免疫原性の消失が、もともとの非改変分子に由来する１種または複数のＴ細胞エピトープの除去によって実現され、前記Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスIIリガンド、またはクラスII上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示すペプチド配列であり、
    （ｉｉ）前記改変分子が、生物学的ヒトＴ細胞増殖アッセイで全タンパク質として試験したときに、非改変親分子より小さく、かつ２．０未満の刺激指数(ＳＩ)を示し、
    （ｉｉｉ）前記の除去されるＴ細胞エピトープが、Ｒ１〜Ｒ３と称する、もともとの非改変ＳＥＢ分子の１本または複数の残基連続鎖上に位置し、前記鎖は、
    Figure 2005535351
     から選択される改変分子。
  2. 除去される前記Ｔ細胞エピトープが、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｃ、Ｒ２ａ、およびＲ３ａと称する、もともとの非改変ＳＥＢ分子の１本または複数の残基の連続鎖上に位置し、前記鎖は、
    Figure 2005535351
    から選択される、請求項１に記載の改変ＳＥＢ分子。
  3. 前記Ｔ細胞エピトープが、前記鎖内の１個または複数のアミノ酸残基の置換によって除去されている、請求項１または２に記載の改変ＳＥＢ分子。
  4. ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)の生物学的活性を有し、実質的に非免疫原性であるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで使用したときに個体において同じ生物学的活性を有する任意の非改変分子よりも免疫原性が低い改変分子であって、前記の免疫原性の消失が、もともとの非改変分子に由来する１種または複数のＴ細胞エピトープの除去によって実現され、前記Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスIIリガンド、またはクラスII上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示すペプチド配列であり、前記改変分子が、次の配列、
    Figure 2005535351
     ［ここで、
    Ｘ1＝Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＭであり、
    Ｘ2＝Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＭであり、
    Ｘ3＝Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＹであり、
    Ｘ4＝Ａ、またはＩであり、
    Ｘ5＝Ｈ、またはＬであり、
    Ｘ6＝Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＹであり、
    Ｘ7＝Ｈ、またはＶであり、
    Ｘ8＝Ａ、Ｐ、Ｇ、またはＶであり、
    Ｘ9＝Ｔ、Ｈ、またはＦであり、
    それによって、同時に、
    Ｘ1＝Ｍ、Ｘ2＝Ｍ、Ｘ3＝Ｙ、Ｘ4＝Ｙ、Ｘ5＝Ｌ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｖ、Ｘ8＝Ｖ、およびＸ9＝Ｆが除外されている。］
    を有する改変分子。
  5. Ｘ1＝Ａ、Ｘ2＝Ａ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｔ、Ｘ7＝Ｈ、Ｘ8＝Ａ、およびＸ9＝Ｔである、請求項４に記載の改変ＳＥＢ分子。
  6. 生物学的Ｔ細胞増殖アッセイで全タンパク質として試験したときに、親の非改変ＳＥＢ分子よりも小さくかつ２未満の刺激指数(ＳＩ)を示す、請求項４または５に記載の改変ＳＥＢ分子。
  7. 請求項１から６のいずれかで特定した改変ＳＥＢ分子をコードするＤＮＡ分子。
  8. 請求項１から７のいずれかで特定した改変ＳＥＢ分子と共に、薬剤として許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬剤組成物。
  9. ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)の生物学的活性を有し、ＭＨＣクラスIIリガンド、またはクラスII上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す配列トラックである１種または複数のＴ細胞エピトープを含む分子の部分であり、ペプチドが、表１または表２から選択されるペプチド配列。
  10. 前記鎖のいずれかに由来する１３〜１５個の連続したアミノ酸残基を含む、請求項９に記載のペプチド配列。
  11. 生物学的ヒトＴ細胞増殖アッセイで試験したときに２．０よりも大きい刺激指数(ＳＩ)を示す、請求項９または１０に記載のペプチド配列。
  12. 改変の結果、１個または複数のアミノ酸残基の置換によってＭＨＣクラスIIリガンドである潜在的Ｔ細胞エピトープが除去されており、生物学的ヒトＴ細胞増殖アッセイで試験したときに２．０、好ましくは１．８未満の刺激指数(ＳＩ)を示す、請求項１１に記載の改変ペプチド配列。
  13. 請求項１で定義した改変ヒトＳＥＢ分子を製造するための、請求項１２に記載のペプチドの使用。
  14. 請求項９から１３のいずれかで特定したペプチド配列をコードするＤＮＡ分子。
  15. 非改変ＳＥＢ中のＴ細胞エピトープの位置を突き止めてブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ）のＴ細胞エピトープマップを構築する方法であって、
    （ｉ）合成ペプチド免疫原を用い、生理的比率のＴ細胞対抗原提示細胞を含有する無関係なドナーサンプル由来のＰＢＭＣ調製物を使用してｉｎ−ｖｉｔｒｏでの抗原刺激を行うステップ、
    （ｉｉ）ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを適用して、ステップ（ｉ）で同定されたエピトープ領域を分析し、それによって前記エピトープ領域内のＭＨＣクラスIIリガンドを同定するステップ、
    （ｉｉｉ）ペプチドリガンドと１種または複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを適用して、ＭＨＣクラスIIともはや結合しない、またはより少ないＭＨＣアロタイプとより低い親和性でしか結合しないエピトープ領域内に含まれるＭＨＣリガンドの配列類似体を同定するステップ、ならびに任意選択で、
    （ｉｖ）未処置Ｔ細胞活性化アッセイ、およびＳＥＢ分子内で同定されたエピトープ領域を完全に、または集合として含む合成ペプチドを使用して、前記配列類似体を、未処置Ｔ細胞活性化アッセイで親ＳＥＢ配列と並行して試験するステップ
    を含む方法。
  16. ２．０以上の刺激指数(ＳＩ)が少なくとも２種の独立したドナーサンプルで認められるときに、特定のＴ細胞エピトープの位置が判明する、請求項１５に記載の方法。
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