KR101061017B1

KR101061017B1 - 암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101061017B1
Application number: KR1020090101003A
Authority: KR
Inventors: 한장희; 이선희
Original assignee: (주) 수파드엘릭사
Priority date: 2009-10-23
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-08-31
Also published as: JP5751519B2; JP2013507954A; EP2491944A4; US20120245091A1; EP2491944A2; US8530421B2; KR20110044374A; EP2692353A2; WO2011049289A2; EP2692353A3; CN102711792A; WO2011049289A3

Abstract

본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 CD99 및 그의 동족체(family), 즉, CD99, CD99L2, 및 PBDX(or XG)의 세포밖부위 중 고도보존부위(highly conserved resion, HCR) I - III에서 유래한 폴리펩타이드 또는 그의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이용 약학 조성물 즉, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

혈관내피세포, 혈관외유출 억제, 항암

Description

암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting growth and/or metastasis of cancer cells}

본 발명은 CD99 및 그의 동족체(family), 즉, CD99, CD99L2, 및 PBDX(or XG)의 세포밖부위 중 고도보존부위(highly conserved resion, HCR) I - III에서 유래한 폴리펩타이드 또는 그의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이용 약학 조성물 즉, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관내피세포의 관형성 및 암세포의 혈관외유출(transendothelial migration)을 억제함으로써, 암세포의 성장과 전이를 억제할 수 있다.

발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받을 뿐 아니라, 혈관신생에 의해 암세포가 전이되게 된다. 암세포는 특정부위에서 무한 성장을 할 뿐만 아니라, 기존의 성장부위를 이탈하여 새로운 부위로 이동하여 성장을 하는데 이러한 과정을 전이(metastasis)라고 한다. 전이과정은 암세포가 이동성이 높은 중간엽성 세포로 변화하여 기존 조직에서 이탈하는 단계, 주위 결합조직과 모세혈관을 침윤하고 이동하는 단계, 혈관 내에서 이동한 후 혈관 밖으로 유출하는 단계, 결합조직 내에서의 이동 및 새로운 부위에서의 성장단계 등으로 구분할 수 있다.

종양세포의 전이과정에서 세포유착분자의 세포표면 발현과 활성화 조절은 매우 중요한 역할을 한다 (Zetter, B. R. (1993). Adhesion molecules in tumor metastasis. Semin Cancer Biol. 4: 219). 종양세포의 전이 과정은 세포유착물질의 세포면 발현 형태나 활성도의 조절을 통하여 이루어지며, 전이현상의 온전한 이해를 위해서는 세포 유착 분자들뿐만 아니라 이들의 발현과 기능을 조절하는 물질에 대한 이해가 필수적이다. (Bailly, M., Yan, L., Whitesides, G. M., Condeelis, J. S., and Segall, J. E. (1998). regulation of Protusion Shape and Adhesion to the sustratum during chemoacic esponses of mammalian carcinoma cells. Exp Cell Res. 241: 285; Frisch, S. M., Vuori, K., Ruoslahti, E., and Chan-Hui., P. (1996). Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol 134: 793; 및 Hannigan, G. E., Leung-Hagesteijn, C. , Fitz-Gibbon, L., Coppolino, M. G., Radeva, G., Filmus, J., Bell, J. C., and Dedhar, S. (1996). Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new β1-integrin-linked protein kinase. Nature 379: 91).

본 발명자들은 CD99 분자가 활성화되면 β₁인테그린(β₁integrin)의 기능을 변화시켜, 암세포가 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에 부착하는 것을 억제함으로써, 암전이 과정에 관여할 수 있음을 개시한 바 있다(Suh JS., 2001. Control of invasiveness of human breast carcinoma cell line MCF-7 by CD99 molecule. Kangwon National University). 또한, 본 발명자는 CD99로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편이 CD99를 효과적으로 활성화시킴으로써, 백혈구의 혈관외유출 또는 암세포의 성장 및/또는 전이를 억제할 수 있다는 것을 개시한 바 있다 (국제특허공개 제WO 2007/037601호).

한편, CD99는 CD99L2와 PBDX(or XG)와 함께 CD99 family를 구성한다 (Fouchet C, Gane P, Huet M, Fellous M, Rouger P, Banting G, Cartron JP, Lopez C. 2000. A study of the coregulation and tissue specificity of XG and MIC2 gene expression in eukaryotic cells. Blood 95:1819; Suh YH, Shin YK, Kook MC, Oh KI, Park WS, Kim SH, Lee IS, Park HJ, Huh TL, Park SH. 2003. Cloning, genomic organization, alternative transcripts and expression analysis of CD99L2, a novel paralog of human CD99, and identification of evolutionary conserved motifs. Gene 307:63; Park SH, Shin YK, Suh YH, Park WS, Ban YL, Choi HS, Park HJ, Jung KC. 2005. Rapid divergency of rodent CD99 orthologs: implications for the evolution of the pseudoautosomal region. Gene 353(2):177). 상기 CD99 동족체(family)는 당질화된 세포밖부위, 세포막횡단부위와 세포내부위로 구성된 제1형 막횡단 단백질들이다. CD99와 CD99L2 사이의 보존부위인 HCR I - III는 CD99의 세포 밖 부위에 위치하며, CD99 단백질 간의 상호결합과 CD99의 β₁인테그린(β₁integrin) 비활성화 기능에 중요한 역할을 한다 (Suh JS., 2009. CD99 activation attenuates the adhesion of MCF-7 cells to laminin, fibronectin, and collagen IV by reducing β₁integrin activity. Kangwon National University). HCR II는 PBDX(or XG)에도 존재한다. 또한, 본 발명자들은 CD99 및 그의 동족체로부터 유래된 특정 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질이 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있음을 발견하여 특허출원을 완료한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2009-0016456호).

본 발명자들은 CD99 및 그의 동족체, 즉, CD99, CD99L2, 및 PBDX(or XG)의 고도보존부위(highly conserved resion, HCR)로부터 유래된 특정 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 그의 융합단백질이 염증 반응 억제 활성 이외에도 혈관신생 및 암세포의 혈관외유출을 억제할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 CD99, CD99L2, 및 PBDX(or XG)의 HCR들로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 그의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이용 약학 조성물 즉, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 제외한다); 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 제외한다); 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 상기 폴리히스티딘 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 또다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 제외한다); 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 상기 Fc 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관신생 및 암세포의 혈관외유출을 억제함으로써, 암세포의 성장 및 전이를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 암세포의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명자들은 CD99 HCR III에서 유래한 폴리펩타이드가 CD99 분자와 결합하여 β₁인테그린을 비활성화시킬 수 있다는 점에 착안하여, CD99 및 그의 동족체, 즉, CD99 (서열번호 1), CD99L2 (서열번호 2), PBDX(or XG) (서열번호 3) 들의 고도보존부위(highly conserved region, HCR)들로부터 다양한 길이의 리간드를 제조하여 β₁인테그린 비활성화 여부를 조사하였다. 놀랍게도, CD99 및 그의 동족체의 HCR로부터 유래된 특정 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 내피세포와 암세포의 β₁인테그린을 비활성화함으로써, 혈관신생과 암세포의 내피세포횡단이동을 억제하며 따라서 항암 활성을 나타낼 수 있음을 발견하였다.

특히, 상기 서열들을 분석한 결과, Leu-Xaa-Asp의 서열이 β₁ 인테그린 비활성화에 대한 최소 단위인 것이 새롭게 밝혀졌다. 상기 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 Ser, Gly, Ala, 또는 Glu 로서 서열번호 11 내지 14의 펩타이드이다. 즉, 상기 Leu-Xaa-Asp의 서열을 포함하고, CD99, CD99L2, 또는 PBDX(or XG)로부터 유래하는 서열이 β₁ 인테그린을 비활성화시킴으로써, 내피세포의 혈관신생과 암세포의 전이를 억제하고, 따라서 항암 활성을 나타낼 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 제외한다); 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열 번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물, 즉 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역 또는 Fc 영역과의 융합 단백질을 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물을 포함한다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로서, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 Fc 영역은 폴리펩타이드의 혈액내 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CD99, CD99L2와 PBDX(or XG)를 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20 내지 33의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 클로닝 벡터로 사용가능한 벡터로는 공지된 다양 한 벡터를 사용할 수 있으며, 예를 들면, pPICZα A, B, C (Invitrogen사, 미국) 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 클로닝 벡터는 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA(예를 들어, 서열번호 34)가 삽입되어 있는 벡터, 예를 들면 pET28a(+) 벡터(Novagene사, 미국)를 사용할 수 있다. 또한 Fc 영역을 코딩하는 DNA(예를 들어, 서열번호 35의 염기서열로 구성된 cDNA)를 통상의 벡터, 예를 들면 pET28a(+) 벡터(Novagene사, 미국)에 삽입시켜 제조한 벡터를 사용할 수 있다. 상기 벡터는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 통상의 방법으로 삽입시켜 제조할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 벡터는 유전자 치료의 목적으로 유전자 치료용 조성물에 직접 함유되거나, 형질전환체 제조를 위해 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 포함한다. 상기 숙주세포로는 상기한 폴리펩타이드가 효과적으로 발현될 수 있다면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주(예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 피키아 속(Pichia genus) 균주(예를 들어, X-33 Pichia; Invitrogen사, 미국) 등을 바람직한 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 암세포의 성장 및 전이를 효과적으로 억제함으로써, 유방암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암을 비롯한 다양한 고형암 또는 골수성 백혈병 등의 암환자에게 투여될 수 있으며, 그 투여용량은 통상 각 환자의 연령, 체중 및 환자의 증상에 따라 일반적으로 변화시킬 수 있는 용량, 예를 들어 1일 약 0.01 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 폴리펩타이드의 합성

서열번호 4와 5의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 20과 21의 cDNA 단편들을 pET28a(+)-Fc 벡터(인간의 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열번호 35의 염기서열로 구성된 cDNA를 pET28a(+) 벡터에 삽입시켜 제조한 벡터)에 삽입하여 pET28a-CD99L2EXT-Fc와 pET28a-PBDX(or XG)EXT-Fc 벡터를 제조하였다.

즉, PCR을 통해 서열번호 20과 21의 cDNA 단편을 얻은 뒤 말단부위를 EcoRI으로 절단한 후, 결합효소를 이용하여 cDNA 단편들을 동일한 제한효소로 절단된 pET28a(+)-Fc 벡터에 결합함으로써 pET28a-CD99L2EXT-Fc와 pET28a-PBDX(or XG)EXT-Fc벡터를 제조하였다.

얻어진 발현 벡터를 BL21(DE3) 세포에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 LB배지에서 약 4 내지 6시간 배양한 후, 흡광도(A600)가 0.4-0.6이 되었을 때 7 내지 9시간 동안 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) (1.4 mM)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리를 통하여 침전시킨 후, 인산 완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 다시 침전시켜 배지에 있는 불순물을 제거하였다. SDS-PAGE 겔을 통해서 발현이 유도되었는지 여부를 확인하였다.

발현된 단백질의 분리를 위해 8M 우레아 완충액 (8M urea, 0.01M Tris-Cl, 0.1M NaH₂PO₄)을 사용했으며, 분리 단계에 따라 pH 농도를 8.0, 6.3, 4.5 등으로 제조하여 사용하였다. 단백질분해효소 억제제들 (1mM PMSF, 10 ㎍/㎖ leupeptin, 1 ㎍/㎖, pepstatin, 1 ㎍/㎖ aprotinin)이 첨가된 pH 8.0 완충액으로 세포를 용해한 후에 4°C, 13000 rpm의 조건에서 20분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 히스티딘 결합 수지(His binding resin)인 Ni-NTA His Bind Resin(Novagen사, 미국)과 1 ㎖ 에펜도르프 튜브 상에서 혼합한 후에 4°C에서 16 시간 동안 반응시켜, 발현된 단백질의 히스티딘과 수지의 결합을 유도하였다. 얻어진 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 버리고, pH 6.3 완충액으로 세척하였다. PBS로 투석한 후, 정량하여 냉장 보관하였다.

서열번호 6 내지 14의 펩타이드는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

상기에서 얻어진 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 cDNA 서열은 하기 표 1 과 같다.

단백질명칭	단편	폴리펩타이드	cDNA
CD99FL	1 ∼ 185	서열번호 1	서열번호 17
CD99L2FL	1 ∼ 262	서열번호 2	서열번호 18
PBDX(or XG)FL	1 ∼ 180	서열번호 3	서열번호 19
CD99L2EXT	26 ∼ 184	서열번호 4	서열번호 20
PBDX(or XG)EXT	18 ∼ 136	서열번호 5	서열번호 21
CD99HCRI-7	26 ∼ 32	서열번호 6	서열번호 22
CD99HCRII-7	53 ∼ 59	서열번호 7	서열번호 23
CD99L2HCRI-7	30 ∼ 36	서열번호 8	서열번호 24
CD99L2HCRII-7	119 ∼ 125	서열번호 9	서열번호 25
PBDX(orXG)HCRII-7	25 ∼ 31	서열번호 9	서열번호 26
CD99L2HCRIII-8	145 ∼ 152	서열번호 10	서열번호 27
CD99HCRI-3	28 ∼ 30	서열번호 11	서열번호 28
CD99HCRII-3	55 ∼ 57	서열번호 12	서열번호 29
CD99L2HCRII-3	121 ∼ 123	서열번호 13	서열번호 30
PBDX(or XG)HCRII-3	27 ∼ 29	서열번호 13	서열번호 31
CD99L2HCRI-3	32 ∼ 34	서열번호 14	서열번호 32
CD99L2HCRIII-3	150 ∼ 152	서열번호 14	서열번호 33

FL: 전 서열(full length), EXT: 세포밖부위(external domain), HCR: 고도보존부위(highly conserved region)

실시예 2. 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드를 PBS에 용해시켜, 부피 100 ㎕ 중 3 ㎍의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 인간제대정맥 내피세포와 세포외기질 간의 부착 억제 시험

서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드가 인간제대정맥 내피세포 (HUVEC; human umblical vein endothelial cell)의 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 부착에 미치는 영향을 측정하였다.

세포외 기질 성분의 하나인 파이브로넥틴을 96 웰(well) 세포배양판에 도말하여 자외선 하에서 건조하였다. HUVEC을 웰당 5 x 10⁴이 되도록 준비한 다음, 실시예 2에서 제조한 서열번호 4 내지 14의 펩타이드 용액을 3 ㎍의 농도로 세포에 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포외 기질에 유착되어있는 세포를 걷어낸 다음 트리판-블루(Trypan-blue)용액으로 염색하고, 혈구계산기(hemacytometer)를 사용하여 유착한 세포수를 측정하였다. 그 결과는 도 1a 내지 도 1c와 같다. 도 1a 및 도 1b에서 사용한 대조군 폴리펩타이드는 CD99의 세포내부위에서 유래한 QKKKLCF와 LCF를 각각 사용하였다.

도 1a 및 도 1b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 처리한 경우, 파이브로넥틴에 유착한 내피 세포의 갯수가 대조군에 비해서 약 30 ∼ 60% 정도 감소된다. 또한, 융합단백질인 CD99L2EXT-Fc와 PBDX(or XG)-Fc로 처리한 경우에도 유사한 결과를 얻었다 (도 1c). 이때 사용한 대조군 폴리펩타이드는 human IgG Fc로서 서열번호 16의 폴리펩타이드이다.

시험예 2. 시험관 내(in vitro) 혈관신생 억제능 시험

본 발명에 따른 폴리펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다.

일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔 (Matrigel)을 24-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그 (plug)를 형성하게 된다. HUVEC을 8 x 10⁴ cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 24 well 세포배양판에 접종한 후, 기초 피브로블라스트 성장 인자 (basic Fibroblast Growth Factor; bFGF, 150 ng/㎖)와 실시예 2로부터 제조된 서열번호 4 내지 14의 펩타이드 용액 (3 ㎍/㎖)을 각각 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰하였으며, 그 결과는 도 2a와 2b와 같다. 이 때 사용한 대조군 펩타이드들 및 Fc는 시험예 1에서 사용한 것들과 동일한 펩타이드들이다.

도 2a 내지 2c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유한 단백질 용액으로 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다. 또한, 융합단백질인 CD99L2EXT-Fc와 PBDX(or XG)-Fc로 처리한 경우에도 유사한 결과를 얻었다(도 2c).

시험예 3. 암세포의 침윤 억제능 시험

인테그린(integrin)의 리간드인 파이브로넥틴(fibronectin)을 트랜스웰에 미리 도말한 후, 5 x 10⁵개의 사람 유방암 세포주 MCF-7을 트랜스웰의 상단부에 넣고 배양하였다. 24시간 경과 후, 세포가 80% 이상 자라면 서열번호 4 내지 14의 펩타이드를 3 ㎍의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 0.1% BSA를 가하고, 트랜스웰 하단부에는 침윤유도배지(NIH 3T3 세포를 0.005% 비타민 C, 1% BSA, DMEM 혈청제거 배양액에서 24시간 동안 배양하여 얻은 배양상층액)를 넣어준 후 24시간 주기로 트랜스웰의 하단부로 이동한 세포 수를 3회에 걸쳐 측정하였다. 각각의 시험은 3회씩 수행하여 그 결과를 통계처리 하였다. 대조군으로서 사용한 대조군 펩타이드들 및 Fc는 시험예 1에서 사용한 것들과 동일한 펩타이드들이다. 그 결과는 도 3a 내지 3c와 같다.

도 3a 내지 3c에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 서열번호 4 내지 14의 펩타이드를 처리한 경우, 대조군 펩타이드를 처리한 군에 비해서 인간 유방암 세포의 세포외 물질을 침윤하는 정도가 약 60% 수준으로 억제된다. 혈관 밖으로 빠져나온 암세포는 바닥막이나 주위 결합조직을 침윤하는 과정을 거쳐 새로운 부위로 전이하는 것을 감안할 때, 본 발명의 폴리펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가짐을 알 수 있다.

시험예 4. 암세포의 시험관 내( in vitro ) 혈관외유출 억제능 시험

인간 제대 정맥 내피세포를 보이덴 챔버 (Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 4 내지 14의 펩타이드 용액 (3 ㎍/㎖)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 사람 유방암 세포주 MCF-7를 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 유방암 세포의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 3회 이상 반복하였으며, 결과는 도 4a 내지 4c와 같다. 도 4a 내지 4c에서, 대조군 펩타이드들 및 Fc는 시험예 1에서 사용한 것들과 동일한 펩타이드들이다.

도 4a 내지 4c에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 처리한 경우, 인간 유방암 세포의 혈관외 유출이 약 60 내지 80% 수준으로 억제된다. 혈관 내로 침윤한 암세포가 혈관을 따라 이동하다가 장기로 전이되기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 폴리펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.

도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 폴리펩타이드가 사람 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 파이브로넥틴에 대한 부착도에 미치는 영향을 나타낸다.

도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 폴리펩타이드가 사람 제대정맥 내피세포의 관형성 에 미치는 영향을 나타낸다.

도 3a 내지 도 3c는 사람 유방암 세포주 MCF-7에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, 파이브로넥틴에의 침윤도를 나타낸다.

도 4a 내지 도 4c는 사람 유방암 세포주 MCF-7에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, MCF-7 세포의 혈관외 유출도를 나타낸다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for inhibiting growth and/or metastasis of cancer cells <130> PN0314 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu 20 25 30 Pro Asp Asn Glu Asn Lys Lys Pro Thr Ala Ile Pro Lys Lys Pro Ser 35 40 45 Ala Gly Asp Asp Phe Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn 50 55 60 Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys Pro Met Pro Asn Pro Asn 65 70 75 80 Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala 85 90 95 Asp Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly 100 105 110 Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gly Val Ile Pro 115 120 125 Gly Ile Val Gly Ala Val Val Val Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser 130 135 140 Phe Ile Ala Tyr Gln Lys Lys Lys Leu Cys Phe Lys Glu Asn Ala Glu 145 150 155 160 Gln Gly Glu Val Asp 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cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 993

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 제외한다);

서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및

서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이 드는 제외한다);

서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및

서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 영역이 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1의 28 ∼ 30번 또는 55 ∼ 57번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 96개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (단, 94 ∼ 97번의 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이 드는 제외한다);

서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 2의 32 ∼ 34번, 73 ∼ 75번, 121 ∼ 123번, 또는 150 ∼ 152번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드; 및

서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 3의 27 ∼ 29번의 펩타이드를 포함하는 3 내지 130개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 서열번호 4 내지 14의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 Fc 영역이 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.