CN107973839B - 抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽及其应用。该活性肽包括如下序列:Asn‑Val‑Phe‑Thr‑Val‑Ser‑Pro,可应用特异性抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移和侵袭,以及血管生成,增强化药疗效,从而可用于治疗成纤维细胞生长因子及其受体介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤,包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌等。本发明还公开了包含该肽的抗肿瘤药物和制备方法等。
Description
技术领域
本发明属于肽技术领域,特别涉及一种抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽及其应用。
背景技术
维持机体组织的内稳态依赖复杂的生长因子信号网络的调控,成纤维细胞生长因子(FGFs)及其受体(FGFR1-4)组成的信号网络在调控细胞与细胞之间相互作用中发挥着重要作用。根据序列同源性及系统发生的差异,可将已发现的包括18个成员的哺乳动物成纤维细胞生长因子家族(FGFs,包括FGF1-FGF10和FGF16-FGF23)分为6个亚家族:FGF1和FGF2;FGF3、FGF7、FGF10和FGF22;FGF4、FGF5和FGF6;FGF8、FGF17和FGF18;FGF9、FGF16和FGF20;FGF19、FGF21和FGF23。前期研究已明确前5个亚家族的成员属于自分泌/旁分泌配体,它们通过调节细胞的增殖、存活、迁移和分化,调控机体一系列的生物学功能,包括脑的发育、肢体的分化、躯干的形成和肿瘤的发生发展等。最后1个由FGF19、FGF21和FGF23组成的亚家族具有依赖于Klotho蛋白的内分泌调节作用,调控胆汁酸、胆固醇、葡萄糖、维生素D和磷酸盐的体内稳态。成纤维细胞生长因子家族成员通过与细胞表面受体FGFR结合,引起FGFR二聚化,使FGFR的胞浆近膜区和胞内的两个酪氨酸激酶区(TK1和TK2)相互接近而自身磷酸化,激活胞内信号转导通路,介导细胞增殖、迁移和侵袭等生物学活性。
FGFs在体内分布广泛且具有多种重要的生物学功能,其时空表达及表达水平受到严谨的调控。研究表明,属于自分泌/旁分泌配体的FGFs家族成员及其相应受体表达的异常上调与多种肿瘤的恶性进展和化疗敏感性密切相关(参见Brooks AN,Kilgour E,SmithPD.Molecular pathways:fibroblast growth factor signaling:a new therapeuticopportunity in cancer.Clin Cancer Res,2012,18(7):1855-1862;Sun C,Fukui H,HaraK,et al.FGF9from cancer-associated fibroblasts is a possible mediator ofinvasion and anti-apoptosis of gastric cancer cells.BMC cancer,2015,15:333;Huang Y,Jin C,Hamana T,et al.Overexpression of FGF9in prostate epithelialcells augments reactive stroma formation and promotes prostate cancerprogression.International journal of biological sciences,2015,11(8):948-960;Hendrix ND,Wu R,Kuick R,et al.Fibroblast growth factor 9has oncogenicactivity and is a downstream target of Wnt signaling in ovarian endometrioidadenocarcinomas.Cancer research,2006,66(3):1354-1362;Mizukami T,Togashi Y,Naruki S,et al.Significance of FGF9gene in resistance to anti-EGFR therapiestargeting colorectal cancer:Asubset of colorectal cancer patients withFGF9upregulation may be resistant to anti-EGFR therapies.Molecularcarcinogenesis,2017,56(1):106-117;Basu M,Mukhopadhyay S,Chatterjee U,etal.FGF16promotes invasive behavior of SKOV-3ovarian cancer cells throughactivation of mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathway.J BiolChem.2014,289(3):1415-1428;Chamorro MN,Schwartz DR,Vonica A,et al.FGF-20andDKK1are transcriptional targets of beta-catenin and FGF-20is implicated incancer and development.EMBO J.2005,24(1):73-84;Jeffers M,Shimkets R,PrayagaS,et al.Identification of a novel human fibroblast growth factor andcharacterization of its role in oncogenesis.Cancer Res.2001,61(7):3131-3138;Facchiano A,Russo K,Facchiano AM,et al.Identification of a novel domain offibroblast growth factor 2controlling its angiogenic properties.J BiolChem.2003,278(10):8751–8760;Yang ZL,Cheng K,Han ZD.Effect of bFGF on the MCF-7cell cycle with CD44(+)/CD24(-):promoting the G0/G1→G2/S transition.JBreast Cancer.2012,15(4):388–392;Fan L,Xie H,Chen L,et al.AnovelFGF2antagonist peptide P8with potent antiproliferation activity.TumourBiol.2014,35(10):10571–10579;Katoh Y,Katoh M.FGFR2-related pathogenesis andFGFR2-targeted therapeutics.International journal of molecular medicine,2009,23(3):307-311;Matsumoto K,Arao T,Hamaguchi T,et al.FGFR2gene amplificationand clinicopathological features in gastric cancer.British journal of cancer,2012,106(4):727-32;Su X,Zhan P,Gavine PR,et al.FGFR2amplification hasprognostic significance in gastric cancer:results from a large internationalmulticentre study.British journal of cancer,2014,110(4):967-975;L'Hote CG,Knowles MA.Cell responses to FGFR3signalling:growth,differentiation andapoptosis.Experimental cell research.2005,304(2):417-31.)。
FGFs/FGFRs作为恶性肿瘤治疗的靶点,目前处于临床研发阶段的主要为抗体蛋白类(处于I期临床试验阶段的单抗MFGR1877S和I/II期的融合蛋白FP-1039)和小分子抑制剂(处于II期临床试验阶段的AZD4547和BGJ398),存在着生产成本高和毒副作用大等问题。此外,随着恶性肿瘤的进展,化疗敏感性降低严重影响了临床治疗效果。因此,以FGFs/FGFRs作为恶性肿瘤治疗的靶点,研究能抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的特效药具有重要的社会现实意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽。
本发明的另一目的在于提供所述抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯;所述的活性肽优选为由序列Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro组成的肽,或为在Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro肽的N末端和/或C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基;更优选在Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro肽的C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基,对于在C末端增加氨基酸残基的情况,在本发明的具体实施方式中,所述肽的具体实例是序列为Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser的肽。
本发明中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法;其中氨基酸或氨基酸残基可以指L-型的氨基酸,也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式中,氨基酸或氨基酸残基指L-型的氨基酸或氨基酸残基;其中,氨基酸或氨基酸残基可以根据其侧链性质的相似性而分成以下组:疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。通常,处于同组中的氨基酸或氨基酸残基具有相似的性质。根据氨基酸残基的相似性,本发明还提供了类似于Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro的肽。例如,可以通过将Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸。这些肽也涵盖在本发明的保护范围内。
使用本领域已知的方法,包括序列Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro的肽与高分子物质可以形成缀合物,其中,高分子物质通常是药学上可接受的水溶性多聚物部分,该缀合物一般能显示出延长肽的循环半衰期的效应。例如,PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中,缀合物由缩合活化的PEG来形成,其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代。缀合物也可以是包括序列Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。
所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽的制备,采用现有技术中的公知方法进行,可以用多肽自动合成仪进行化学合成。
所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤药物,包含上述抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽,其药学上可接受的盐或酯等。
所述的抗肿瘤药物还包括化疗药物。
所述的化疗药物包括但不限于本发明具体实施方式中的顺铂。
所述的肿瘤包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌等。
所述的抗肿瘤药物还可以含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。
所述的抗肿瘤药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型,包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂等。
所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成、和/或增强化药疗效的药物中的应用。
所述的成纤维细胞生长因子包括但不限于本发明具体实施方式中的成纤维细胞生长因子9(FGF9)。
所述的细胞为肿瘤细胞、内皮细胞和/或平滑肌细胞。
所述的肿瘤细胞包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌细胞。
所述的内皮细胞包括但不限于血管内皮细胞。
所述的平滑肌细胞包括但不限于包裹血管的平滑肌细胞。
所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制Erk1/2、P38、Akt、JNK的活化(磷酸化)的药物中的应用。
所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备增强化药疗效的药物中的应用。
本发明中所述的抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽能够通过噬菌体展示技术筛选得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1、经多轮筛选和鉴定,本发明获得了一种肽,该肽特异性抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移和侵袭,以及血管生成,增强化药疗效,从而可用于治疗成纤维细胞生长因子及其受体介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤,包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌等。该肽可以采用现有多肽合成技术生成,成本低,但是效果好,安全性高,适用范围广。
2、本发明针对以FGFs/FGFRs作为恶性肿瘤治疗的靶点,目前处于临床研发阶段的抗体类和小分子抑制剂存在着生产成本高和毒副作用大等问题,提供的活性肽采用现有技术合成,属于靶向药物,一方面较现有的抗体类靶向药物生产成本低,另一方面较现有的广谱化药毒副作用小,具备良好的产业化前景。
3、本发明的技术方案包括能够通过噬菌体展示来筛选得到的活性肽(通过噬菌体展示筛选获得活性肽的序列,然后通过自动肽合成仪合成活性肽)及其药学上可接受的盐或酯的合成和制备方法;活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移和侵袭,以及血管生成,增强化药疗效,用于治疗成纤维细胞生长因子及其受体介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤的组合物中的应用。
附图说明
图1是活性肽抑制肿瘤细胞增殖的结果图;其中,图A和B分别为将SGC-7901或RT-112细胞用无血清培养基饥饿培养24h,再用不同药物(空白对照组、20ng/ml FGF9处理组、不同浓度(1μM,4μM,16μM)的活性肽处理组、不同浓度(1μM,4μM,16μM)的活性肽和20ng/mlFGF9的共处理组)处理48h,噻唑兰显色(MTT法)后检测570nm的光吸收值(OD),分别按公式[(FGF9处理组的OD值-活性肽与FGF9共处理组的OD值)/(FGF9处理组的OD值-对照组的OD值)]×100%和公式[(对照组的OD值-活性肽处理组的OD值)/对照组的OD值]×100%计算活性肽与FGF9共处理组和单独活性肽处理组的抑制率的统计分析结果。
图2是活性肽抑制细胞迁移图;其中,图A~D为将SGC-7901和RT-112细胞用无血清培养基饥饿培养24h后,用200μL的枪头在孔内垂直划三条平行直线,再用不同药物(空白对照组、16μM活性肽组、20ng/ml FGF9组和16μM活性肽+20ng/ml FGF9组)处理48h后的划痕面积变化图及迁移抑制率的统计分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示有统计学差异)。
图3是活性肽抑制细胞侵袭图;其中,图A~D为将SGC-7901和RT-112细胞用无血清培养基饥饿培养24h,将细胞重悬后铺于涂有Matrigel的Transwell小室的上室中,再用不同药物(空白对照组、20ng/ml FGF9、16μM活性肽+20ng/ml FGF9组)处理24h,4%的多聚甲醛固定,结晶紫染色图及侵袭细胞数统计分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示有统计学差异)。
图4是活性肽对MAPKs和PI3K/Akt激酶活化的影响图;其中,图A和B为将SGC-7901和RT-112细胞用无血清培养基饥饿培养24h后,再用不同药物(对照组、20ng/ml FGF9处理组、不同浓度(1μM,4μM,16μM)的活性肽和20ng/ml FGF9的共处理组)处理后的免疫印迹图及灰度值的统计分析结果(图C~J;*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示有统计学差异)。
图5是活性肽增强肿瘤细胞对化药敏感性的结果图;其中,图A和图B为Westernblotting检测SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞株中FGF9的表达水平;图C和图D为Western blotting检测SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞培养上清中FGF9的表达水平;图E、F、G和H为Western blotting检测活性肽对SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞分泌表达至培养上清中的FGF9激活信号分子Erk1/2的影响;图I和图J为MTT法检测活性肽对SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞顺铂敏感性的影响(*p<0.05,**p<0.01表示有统计学差异)。
图6是活性肽增强化药诱导的细胞凋亡图;其中,图A~D为将SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9或SGC-7901和RT-112细胞用无血清培养基饥饿培养24h,分组加药处理48h,其中图A和图B:空白对照组、活性肽组(16μM)、顺铂组(A图:1μg/ml,B图:3.2μg/ml)、活性肽+顺铂共处理组;图C和图D:空白对照组、顺铂组(C图:1μg/ml,D图:3.2μg/ml)、顺铂+20ng/mlFGF9组、顺铂+活性肽+FGF9共处理组,通过Annexin V-FITC/PI双染色结合流式细胞术检测各处理组中细胞凋亡的情况;图E~H为细胞凋亡率的统计分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示有统计学差异)。
图7是活性肽及其与化药联用的体内抗肿瘤作用效果图;图A和图B为肿瘤体积变化曲线图;图C和图E为剥取的肿瘤;图D和图F为肿瘤重量的统计分析结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示有统计学差异)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1活性肽的合成
通过固相肽合成方法,使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)来合成如以下序列所示的肽:Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser,其中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下:首先,保护氨基酸单体上的反应性基团:氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护;并对以下特定氨基酸进行侧链保护:对Asn的侧链保护基为三苯甲基(Trt),对Ser和Thr的侧链保护基为叔丁基(tBu)。然后,以N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂,使受保护的氨基酸依次偶联,偶联每次40min。在15%(v/v)乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(体积比为1:1:1)存在的情况下,肽与三氟乙酸(85%(v/v))在室温反应120min,从而从聚合体支持物上切割下来,同时脱除保护基并将C末端酰胺化。接着用无水乙醚沉淀肽,然后用无水乙醚多次洗涤,充分除去硫醇。在水/叔丁醇(体积比为1:1)中沉淀,冷冻干燥,得到粗肽。粗肽在30min内以反向HPLC纯化,以37~42%(v/v)乙晴/0.9%(v/v)TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此得到合成肽,经HPLC检测,其纯度≥95%。
实施例2活性肽对肿瘤细胞存活率的影响
将胃癌细胞株SGC-7901(购自南京科佰生物科技有限公司)和膀胱癌细胞株RT-112(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)置于96孔板的孔中。SGC-7901细胞在添加了10%(v/v)胎牛血清的1640培养基中,而RT-112细胞在添加了10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中分别培养过夜,弃去培养基,加入无血清1640或DMEM培养基继续培养24h。弃去培养基,分别在各孔中等体积加入含20ng/ml FGF9(成纤维细胞生长因子9,购自PeproTech公司)、不同稀释度(1μM,4μM,16μM)的实施例1制备的活性肽、以及活性肽和20ng/ml FGF9的混合物的1640或DMEM培养基,孵育48h。按照MTT法,即噻唑兰显色后检测570nm的光吸收值(OD),分别按公式[(FGF9处理组的OD值-活性肽与FGF9共处理组的OD值)/(FGF9处理组的OD值-对照组的OD值)]×100%和公式[(对照组的OD值-活性肽处理组的OD值)/对照组的OD值]×100%计算活性肽与FGF9共处理组和单独活性肽处理组的抑制率。
结果显示(图1A和1B),单独加入20ng/ml FGF9可显著促进SGC-7901和RT-112细胞增殖;当加入不同稀释度的实施例1制备的活性肽和20ng/ml FGF9的混合物时,SGC-7901和RT-112细胞受20ng/ml FGF9影响而增殖的幅度明显减少,减少的量呈肽剂量依赖性,当活性肽浓度达到16μM时,增殖抑制率分别接近90%和80%。
实施例3活性肽对细胞迁移的影响
检测实施例1制备的活性肽对FGF9刺激的SGC-7901和RT-112细胞迁移的影响。简而言之,将SGC-7901和RT-112细胞接种于12孔板中,分别在含10%(v/v)胎牛血清的1640培养基和DMEM培养基中培养过夜。弃去培养基,加入无血清的1640或DMEM培养基继续培养24h。当细胞的汇合率约80%时,用200μl枪头在孔内垂直划三条平行直线。弃培养液,PBS缓冲液洗涤三次以去除刮起的漂浮细胞。分组加药处理48h,设空白对照组、实施例1制备的活性肽(16μM)组、FGF9(20ng/ml)组和实施例1制备的活性肽(16μM)+FGF9(20ng/ml)组。倒置显微镜下观察0h、24h和48h时各组细胞划痕区面积的动态变化。
结果显示(图2A-2D),FGF9可明显促进SGC-7901和RT-112细胞的迁移,实施例1制备的活性肽显著降低FGF9的促迁移能力。而单独实施例1制备的活性肽对SGC-7901和RT-112细胞的迁移能力无显著影响。
实施例4活性肽对细胞侵袭的影响
检测实施例1制备的活性肽对FGF9刺激的SGC-7901和RT-112细胞侵袭的影响。简而言之,将SGC-7901和RT-112细胞接种于12孔板中,分别在含10%胎牛血清的1640培养基和DMEM培养基中培养过夜。弃去培养基,加入无血清的1640或DMEM培养基继续培养24h。PBS缓冲液洗涤,胰酶消化,离心收集细胞。PBS缓冲液洗2遍后用无血清培养基重悬细胞。将Matrigel(基质胶)用无血清1640或DMEM培养液按体积比1:20稀释,取50μL均匀地涂在Transwell上室聚碳酸酯膜上,避免产生气泡。37℃静置1h。取0.2ml细胞悬液加入小室(上室),0.5ml含10%(v/v)胎牛血清的1640或DMEM培养基加入孔板下室。设空白对照组、FGF9(20ng/ml)组、实施例1制备的活性肽(16μM)+FGF9(20ng/ml)组。加药处理培养24h后,用4%的多聚甲醛固定30min,结晶紫染色25min。高倍倒置显微镜下观察、拍照并计数膜下表面细胞数。
结果显示(图3A-3D),FGF9可明显促进SGC-7901和RT-112细胞侵袭,实施例1制备的活性肽显著降低FGF9的促细胞侵袭能力。
实施例5活性肽对MAPKs和PI3K/Akt激酶活化的影响
检测实施例1制备的活性肽对FGF9刺激的SGC-7901和RT-112细胞中MAPKs通路的Erk1/2、P38和JNK以及PI3K/Akt通路的Akt信号分子活化水平的影响。简而言之,将SGC-7901和RT-112细胞接种于6孔板中,分别在含10%(v/v)胎牛血清的1640培养基和DMEM培养基中培养过夜。弃去培养基,加入无血清的1640或DMEM培养基继续培养24h。先用不同稀释度(1μM,4μM,16μM)的实施例1制备的活性肽与细胞混合预处理5min,对照组(阳性和阴性)都加等体积PBS缓冲液。然后,在活性肽预处理的细胞和阳性对照组细胞中分别加入20ng/ml FGF9刺激15min,阴性对照组加入等体积PBS缓冲液。经PBS缓冲液洗涤后,加入RIPA裂解液裂解细胞,然后进行10%(w/v)SDS-PAGE电泳。电泳后转膜至PVDF膜上,先加入抗Erk1/2、P38、Akt、JNK、phospho-Erk1/2(p-Erk1/2)、phospho-P38(p-P38)、phospho-Akt(p-Akt)、phospho-JNK(p-JNK)和GAPDH的兔单克隆抗体(购自Cell Signaling Technology公司),然后加入HRP(辣根过氧化物酶)偶连的羊抗兔抗体(购自Bio-Rad公司)孵育,最后用ECL检测免疫印迹结果。
结果显示,实施例1制备的活性肽在胃癌SGC-7901细胞中以剂量依赖性的方式抑制FGF9诱导的Erk1/2、P38、JNK的活化(磷酸化),当活性肽的浓度达到16μM时,FGF9诱导的Erk1/2、P38、JNK的活化几乎被完全抑制(图4A和图4C-4F)。此外,实施例1制备的活性肽在膀胱癌RT-112细胞中以剂量依赖性的方式抑制FGF9诱导的Erk1/2、Akt、JNK的活化(磷酸化),当活性肽的浓度达到16μM时,FGF9诱导的Erk1/2、Akt、JNK的活化几乎被完全抑制(图4B和图4G-4J)。
实施例6活性肽对化疗敏感性的影响
检测实施例1制备的活性肽对化疗敏感性的影响。在筛选(先通过G418(遗传霉素)进行筛选)获得稳定高表达FGF9的SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞株的基础上,通过Western blotting检测细胞培养上清中FGF9的表达量变化,随后检测实施例1制备的活性肽对细胞培养上清中FGF9活性的影响。最后通过MTT法检测实施例1制备的活性肽对化疗(顺铂)敏感性的影响。
结果显示,与SGC-7901和RT-112细胞相比,G418(遗传霉素)筛选获得的SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞株显著高表达FGF9(图5A和5B)。相应地,与SGC-7901和RT-112细胞的培养上清相比,SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞的培养上清中FGF9的含量显著增加(图5C和5D)。SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞的培养上清可以明显刺激SGC-7901和RT-112细胞胞内信号分子Erk1/2的活化。而实施例1制备的活性肽与SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞的培养上清预孵育后,可以显著抑制SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞的培养上清对SGC-7901和RT-112细胞胞内信号分子Erk1/2的活化作用(图5E-5H)。MTT结果显示(图5I和5J),SGC-7901和SGC-7901/FGF9细胞对顺铂的IC50分别为1.233±0.151μg/ml和1.807±0.162μg/ml,RT-112和RT-112/FGF9细胞对顺铂的IC50分别为3.121±0.331μg/ml和4.096±0.362μg/ml,表明高表达FGF9降低胃癌细胞和膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。而实施例1制备的活性肽预处理4h后,SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9细胞对顺铂的IC50分别为0.998±0.113μg/ml和2.959±0.317μg/ml,表明实施例1制备的活性肽可通过抑制FGF9的活性进而增强肿瘤细胞对化药(顺铂)的敏感性。
实施例7活性肽对化药诱导的细胞凋亡的影响
检测实施例1制备的活性肽对化药诱导的细胞凋亡的影响。将SGC-7901/FGF9和RT-112/FGF9分别按2×105个/孔置于6孔板中,将SGC-7901和RT-112细胞分别按1.5×105个/孔置于6孔板中。培养过夜,弃去培养基,分别用无血清1640和DMEM培养基饥饿培养24h。分组加药处理48h,用预冷的PBS缓冲液洗涤2~3次,丢弃PBS缓冲液,用0.25%的胰酶消化细胞,收集细胞,将细胞转移到流式管中,250×g,4℃离心5min;离心后丢掉上清液,用500μl的1×PBS缓冲液重悬细胞,250×g,4℃离心5min;离心后丢弃上清液,每个样品加入500μl新配的1×工作液(10mM Hepes/NaOH,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)将细胞重悬,加入5μl的Annexin V和10μl的PI溶液,混合均匀后避光染色5min;流式细胞仪检测各处理组中细胞凋亡的情况,并用FCS软件分析实验结果。
结果如图6所示,其中,图A和图B:空白对照组、活性肽(16μM)组、顺铂组(A图:1μg/ml,B图:3.2μg/ml)、活性肽(16μM)+顺铂(A图:1μg/ml,B图:3.2μg/ml)共处理组;图C和图D:空白对照组、顺铂组(C图:1μg/ml,D图:3.2μg/ml)、顺铂(C图:1μg/ml,D图:3.2μg/ml)+20ng/ml FGF9组、顺铂(C图:1μg/ml,D图:3.2μg/ml)+活性肽(16μM)+FGF9(20ng/ml)共处理组。结果显示,与对照组相比,实施例1制备的活性肽可显著增加SGC-7901/FGF9细胞的凋亡率(细胞凋亡率从14.59%增至21.82%),与顺铂处理组相比,实施例1制备的活性肽与顺铂联用显著增加对SGC-7901/FGF9细胞的促凋亡作用(细胞凋亡率由33.60%增至43.93%)(图6A和图6E)。相似地,与对照组相比,实施例1制备的活性肽可显著增加RT-112/FGF9细胞的凋亡率(细胞凋亡率从10.50%增至20.99%),与顺铂处理组相比,实施例1制备的活性肽与顺铂联用显著增加对RT-112/FGF9细胞的促凋亡作用(细胞凋亡率由36.76%增至51.83%)(图6B和图6F)。外源FGF9下调顺铂对SGC-7901和RT-112细胞的促凋亡作用,而实施例1制备的活性肽可拮抗外源FGF9对顺铂诱导的SGC-7901和RT-112细胞凋亡的抑制作用(图6C,6D,6G和6H)。
实施例8活性肽及其与化药联用的体内抗肿瘤作用
检测实施例1制备的活性肽及其与化药联用的体内抗肿瘤作用。将4×106个SGC-7901/FGF9细胞或8×106个RT-112/FGF9细胞腋下皮下注射到5周龄的雌性BALB/c-nu裸鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。待裸鼠的肿瘤体积(1/2×a×b2mm3)约为200mm3时,将荷瘤裸鼠随机分为4组:对照组(生理盐水)、实施例1制备的活性肽组(25mg/kg)、顺铂组(3mg/kg)和实施例1制备的活性肽(25mg/kg)+顺铂(3mg/kg)处理组,每组4~6只裸鼠。每两天瘤体内注射实施例1制备的活性肽一次;顺铂一周腹腔注射两次;对照组注射生理盐水。三天测量一次瘤体积。待对照组裸鼠的负瘤体积约为2000mm3时,脱颈处死,解剖剥取肿瘤,称量瘤重。
结果显示,在胃癌细胞荷瘤裸鼠中(图7A,7C,7D),实施例1制备的活性肽治疗组的抑瘤率为46.85%,顺铂组的抑瘤率为63.67%,活性肽+顺铂处理组的抑瘤率达83.24%,均能显著抑制胃癌肿瘤的生长;与顺铂单独处理组相比,实施例1制备的活性肽联合顺铂处理组的抑瘤作用显著增强。在膀胱癌细胞荷瘤裸鼠中(图7B,7E,7F),实施例1制备的活性肽治疗组的抑瘤率为35.49%,顺铂组的抑瘤率为56.52%,实施例1制备的活性肽+顺铂处理组的抑瘤率达73.76%,均能显著抑制膀胱癌肿瘤的生长;与顺铂单独处理组相比,实施例1制备的活性肽联合顺铂处理组的抑瘤作用显著增强。上述结果表明,实施例1制备的活性肽不仅能显著抑制胃癌和膀胱癌的肿瘤生长,还能增强化疗药物顺铂的体内抗肿瘤疗效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 活性肽
<400> 1
Asn Val Phe Thr Val Ser Pro
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 活性肽
<400> 2
Asn Val Phe Thr Val Ser Pro Gly Gly Gly Ser
1 5 10
Claims (9)
1.一种抑制恶性肿瘤并增强化疗药物疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯,其特征在于,该活性肽的序列为:Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser。
2.权利要求1所述的抑制恶性肿瘤并增强化疗药物疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.一种抗肿瘤药物,其特征在于:包含权利要求1所述的抑制恶性肿瘤并增强化疗药物疗效的活性肽,其药学上可接受的盐或酯。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物,其特征在于:所述的抗肿瘤药物还包括化疗药物。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物,其特征在于:所述的化疗药物为顺铂。
6.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物,其特征在于:所述的肿瘤为胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌。
7.根据权利要求3~6任一项所述的抗肿瘤药物,其特征在于:所述的抗肿瘤药物还可以含有一种或至少两种药学上可以接受的载体,所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
8.权利要求1所述的抑制恶性肿瘤并增强化疗药物疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移、侵袭,以及血管生成的药物中的应用。
9.权利要求1所述的抑制恶性肿瘤并增强化疗药物疗效的活性肽或其药学上可接受的盐或酯在制备增强化疗药物疗效的药物中的应用,其特征在于:所述的化疗药物为顺铂。
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