CN112028971B - 抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向拮抗肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明中公开了一种抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向拮抗肽及其应用。该靶向拮抗肽选自如下任一序列：(a)由His‑Ala‑Leu‑Pro‑Met‑Trp‑Ser‑His‑Met‑Pro‑Ala‑Ala组成的肽；(b)在His‑Ala‑Leu‑Pro‑Met‑Trp‑Ser‑His‑Met‑Pro‑Ala‑Ala的N末端和/或C末端增加一个或多个氨基酸残基组成的肽。本发明中的靶向拮抗肽可采用现有多肽合成技术生成，成本低，安全性高，可特异性抑制成纤维细胞生长因子(FGFs)刺激的细胞增殖、迁移和侵袭，以及血管生成，因此，可将其用于治疗FGFs/FGFR3介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤，适用范围广。

Description

抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向拮抗肽及其应用
技术领域
本发明属于肽技术领域，特别涉及一种抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向拮抗肽及其应用。
背景技术
成纤维细胞生长因子(FGFs)通过结合和激活成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)启动下游多条信号级联通路，在生理条件下参与机体正常生长、分化、新陈代谢和器官形成。然而，FGFs/FGFRs信号失调亦导致机体发生病理性改变，产生恶性肿瘤、软骨发育不良和X连锁低磷佝偻病等疾病。
FGFR3是FGFRs家族的重要成员之一，FGFR3基因改变(突变、易位或扩增)存在于多种肿瘤中，包括膀胱癌、人胶质母细胞瘤、黑色素瘤、结直肠癌和胃癌等。研究表明，FGFR3在膀胱癌肿瘤组织中呈高表达，可促进膀胱癌细胞的生长和转移。FGFR3活化还与肿瘤耐药相关，FGFR3在曲妥珠单抗耐药的胃癌细胞中表达上调，FGFR3/AKT信号轴是介导胃癌细胞对曲妥珠单抗产生耐药的信号通路。此外，FGFR3参与多种肿瘤的血管生成。FGFR3通过上调单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的表达，调控肝癌的血管生成和转移，FGFR3促肝癌细胞转移与其增强血管生成密切相关。在尿路上皮癌中，FGFR3诱导血管生成表型，并显著影响患者预后。FGF2是FGFR3的高亲和力配体，在肿瘤缺氧的微环境中，巨噬细胞释放FGF2，刺激血管内皮细胞增殖，并通过上调血管生成关键分子的表达，促进血管生成。已报道人骨肉瘤细胞中脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)通过上调FGF2和FGFR3的表达，促进FGF2/FGFR3介导的管腔形成，诱导血管生成，且APE1、FGF2和FGFR3的高表达以及微血管密度与骨肉瘤患者的不良预后呈正相关。FGFR3的另一高亲和力配体FGF18，通过结合血管内皮细胞的FGFR3，激活胞内的PI3K/AKT和ERK通路，促进肿瘤微环境血管生成。上述研究表明FGFs/FGFR3参与调控肿瘤细胞的转移和血管生成，可能是潜在的抗肿瘤细胞转移和血管生成的治疗靶点(参见Williams S V,Hurst C D,Knowles M A.Oncogenic FGFR3 gene fusions in bladdercancer.Hum Mol Genet,2013,22(4):795-803；Frattini V,Pagnotta S M,Tala,et al.Ametabolic function of FGFR3-TACC3 gene fusions in cancer.Nature,2018,553(7687):222-227；Kikuchi A,Suzuki T,Nakazawa T,et al.ASP5878,a selective FGFRinhibitor,to treat FGFR3-dependent urothelial cancer with or withoutchemoresistance.Cancer Sci,2017,108(2):236-242；Liao X,Chen J,Liu Y,etal.Knockdown of long noncoding RNA FGFR3-AS1 induces cell proliferationinhibition,apoptosis and motility reduction in bladder cancer.Cancer Biomark,2018,21(2):277-285；Piro G,Carbone C,Cataldo I,et al.An FGFR3 autocrine loopsustains acquired resistance to trastuzumab in gastric cancer patients.ClinCancer Res,2016,22(24):6164-6175；Liu X,Jing X,Cheng X,et al.FGFR3promotesangiogenesis-dependent metastasis of hepatocellular carcinoma viafacilitating MCF-1-mediated vascular formation.Med Oncol,2016,33(5):46；BertzS,AbeéC,Schwarz-Furlan S,et al.Increased angiogenesis and FGFR proteinexpression indicate a favourable prognosis in bladder cancer.Virchows Arch,2014,465(6):687-695；Kuwabara K,Ogawa S,Matsumoto M,et al.Hypoxia-mediatedinduction of acidic/basic fibroblast growth factor and platelet-derivedgrowth factor in mononuclear phagocytes stimulates growth of hypoxicendothelial cells.Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(10):4606-4610；Mignatti P,Rifkin D B.Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion.PhysiolRev,1993,73(1):161-195；Klein S,Giancotti F G,Presta M,et al.Basic fibroblastgrowth factor modulates integrin expression in microvascular endothelialcells.Mol Biol Cell,1993,4(10):973-982；Ren T,Qing Y,Dai N,et al.Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1induced upregulation of fibroblast growth factor 2and its receptor 3 induces angiogenesis in human osteosarcoma cells.CancerSci,2014,105(2):186-194；Guo P,Wang Y,Dai C,et al.Ribosomal protein S15apromotes tumor angiogenesis via enhancing Wnt/beta-catenin-induced FGF18expression in hepatocellular carcinoma.Oncogene,2018,37(9):1220-1236.)。
目前以FGFs/FGFRs作为恶性肿瘤治疗靶点，处于临床试验阶段的药物主要为受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和中和单克隆抗体(mAbs)，如：靶向包括FGFR1-2和VEGFR1-3等激酶受体的Lucitanib(E3810)是一种非选择性的酪氨酸激酶抑制剂。临床试验显示，FGFRs异常的实体肿瘤患者对Lucitanib治疗表现有效，但同时出现高血压、虚弱和蛋白尿等副作用；第二代选择性FGFRs酪氨酸激酶抑制剂有效降低了非选择性抑制剂的脱靶效应所造成的并发症，包括AZD4547、BGJ398和JNJ-42756493等少数进入临床试验阶段的靶向FGFRs的选择性抑制剂，但这些抑制剂在显著抑癌的同时也伴有高磷血症等副作用。
与酪氨酸激酶抑制剂相比，中和抗FGFR单克隆抗体的特异性更强，目前已有两种抗FGFR单克隆抗体进入临床试验，分别是MGFR1877S和FPA144。MGFR1877S是一种通过阻碍受体二聚化发挥抑癌作用的FGFR3特异性单抗；而FPA144是一种靶向FGFR2b亚型的单抗，阻止配体结合和下游信号通路的激活，并通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性发挥抗肿瘤活性。由此可见，以FGFs/FGFRs为靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂和中和单克隆抗体也存在着小分子化合物抑制剂和抗体普遍存在的毒副作用大或生产成本高等缺陷。鉴于靶向小肽类药物具有选择性好、毒副作用小和生产成本低等优势，以FGFs/FGFR3为靶点，研发抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向小肽类药物具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯。
本发明的另一目的在于提供所述靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物和/或抑制血管生成的药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供所述靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子(FGFs)刺激的细胞增殖、迁移、侵袭、和/或血管生成的药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯；所述的靶向拮抗肽选自如下任一序列：
(a)由His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala(SEQ ID NO.1)组成的肽；
(b)在His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala(SEQ ID NO.1)的N末端和/或C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基组成的肽。
所述序列(b)中的肽优选为在His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala的C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基组成的肽；进一步优选为在His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala的C末端增加4个氨基酸残基组成的肽，如His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO.2)。
本发明中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法；其中氨基酸或氨基酸残基可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式中，氨基酸或氨基酸残基指L-型的氨基酸或氨基酸残基；其中，氨基酸或氨基酸残基可以根据其侧链性质的相似性而分成以下组：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。通常，处于同组中的氨基酸或氨基酸残基具有相似的性质。根据氨基酸残基的相似性，本发明还提供了类似于His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala的肽。例如，可以通过将His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸。这些肽也涵盖在本发明的保护范围内。
使用本领域已知的方法，包括序列His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala的肽与高分子物质可以形成缀合物，其中，高分子物质通常是药学上可接受的水溶性多聚物部分，该缀合物一般能显示出延长肽的循环半衰期的效应。例如，PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中，缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代。缀合物也可以是包括序列His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。
所述的靶向拮抗肽的制备，可采用现有技术中的公知方法进行，如可以用多肽自动合成仪进行化学合成等。
所述的靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物和/或抑制血管生成的药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和/或侵袭的药物。
所述的肿瘤包括但不限于胃癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、骨肉瘤、肺癌或乳腺癌等；优选为胃癌。
所述的抑制血管生成的药物包括抑制内皮细胞增殖、迁移、侵袭，和/或抑制内皮细胞形成管腔的药物。
所述的内皮细胞包括但不限于血管内皮细胞；优选为脐静脉内皮细胞；更优选为人脐静脉内皮细胞。
所述的靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子(FGFs)刺激的细胞增殖、迁移、侵袭、和/或血管生成的药物中的应用。
所述的成纤维细胞生长因子优选为成纤维细胞生长因子2(FGF2)。
所述的细胞为肿瘤细胞或内皮细胞。
所述的肿瘤细胞包括但不限于胃癌细胞、膀胱癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、尿路上皮癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞或乳腺癌细胞等；优选为胃癌细胞。
所述的内皮细胞包括但不限于血管内皮细胞；优选为脐静脉内皮细胞；更优选为人脐静脉内皮细胞。
一种抗肿瘤和/或抑制血管生成的药物，包含上述靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯。
所述的药物还可以含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。
所述的药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、以包含FGFR3配体结合区的分子为靶标，经多轮筛选和鉴定，本发明获得了一种肽，该肽特异性抑制FGFs刺激的细胞增殖、迁移和侵袭，以及血管生成，从而可用于治疗FGFs/FGFR3介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤，包括但不限于胃癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、骨肉瘤、肺癌或乳腺癌等。该肽可以采用现有多肽合成技术生成，成本低，但是效果好，安全性高，适用范围广。
2、本发明针对以FGFs/FGFR3作为恶性肿瘤治疗靶点，目前处于临床试验阶段的小分子化合物抑制剂和抗体存在着毒副作用大和生产成本高等问题，提供的拮抗肽采用现有技术合成，属于靶向药物，一方面较现有的抗体类靶向药物生产成本低，另一方面较现有的小分子化合物抑制剂毒副作用小，具备良好的产业化前景。
3、本发明的技术方案包括能够通过噬菌体展示来筛选得到的拮抗肽(通过噬菌体展示筛选获得拮抗肽的序列，然后通过自动肽合成仪合成拮抗肽)及其药学上可接受的盐或酯的合成和制备方法；拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制FGFs刺激的细胞增殖、迁移和侵袭，以及血管生成，用于治疗FGFs/FGFR3介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤的组合物中的应用。
附图说明
图1是拮抗肽抑制肿瘤细胞增殖的结果图；其中，A为拮抗肽与FGF2共处理，以及单独拮抗肽处理的BGC-823细胞抑制率的统计分析结果；B为拮抗肽与FGF2共处理，以及单独拮抗肽处理的KATOШ细胞抑制率的统计分析结果；C为拮抗肽与FGF2共处理，以及单独拮抗肽处理的HUVEC细胞抑制率的统计分析结果。
图2是拮抗肽抑制肿瘤细胞迁移图；其中，A为不同处理后的BGC-823、KATOШ和HUVEC细胞的结晶紫染色图；B为不同处理后的BGC-823细胞的迁移细胞数统计分析结果；C为不同处理后的KATOШ细胞的迁移细胞数统计分析结果；D为不同处理后的HUVEC细胞的迁移细胞数统计分析结果(图中：**p<0.01，***p<0.001表示有统计学差异，ns表示无显著性差异)。
图3是拮抗肽抑制肿瘤细胞侵袭图；其中，A为不同处理后的BGC-823、KATOШ和HUVEC细胞的结晶紫染色图；B为不同处理后的BGC-823细胞的侵袭细胞数统计分析结果；C为不同处理后的KATOШ细胞的侵袭细胞数统计分析结果；D为不同处理后的HUVEC细胞的侵袭细胞数统计分析结果(图中：*p<0.05，***p<0.001表示有统计学差异，ns表示无显著性差异)。
图4拮抗肽抑制血管内皮细胞管腔形成图；其中，A为不同处理后的HUVEC细胞形成管腔网格的显微观察结果；B为不同处理后的HUVEC细胞形成管腔网格的数量的统计分析结果(**p<0.01，***p<0.001表示有统计学差异，ns表示无显著性差异)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的成纤维细胞生长因子2(FGF2)购自PeproTech公司。
实施例1拮抗肽的合成
通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)合成如下序列所示的肽：His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala，其中氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下：首先，保护氨基酸单体上的反应性基团：氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护；并对以下特定氨基酸进行侧链保护：对His的保护基团为三苯甲基(Trt)，对Ser的侧链保护基为叔丁基(tBu)。然后，以N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，使受保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40min。在15％(v/v)乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(体积比为1：1：1)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85％(v/v)；TFA)在室温反应120min，从而从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基并将C末端酰胺化。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(体积比为1：1)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30min内以反向HPLC纯化，以37～42％(v/v)乙晴/0.9％(v/v)TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此得到合成肽，经HPLC检测，其纯度≥95％。
实施例2拮抗肽对肿瘤细胞存活率的影响
将胃癌细胞BGC-823、KATOШ和血管内皮细胞HUVEC(BGC-823和KATOШ细胞来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，HUVEC细胞来源于杭州仟诺生物科技有限公司)铺于96孔板中。BGC-823细胞在添加了10％(v/v)胎牛血清(FBS)的1640培养基中培养过夜，KATOШ细胞在添加了10％(v/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基中培养过夜，血管内皮细胞HUVEC在添加了10％(v/v)FBS和1％(v/v)内皮细胞生长添加物(ECGS)的F-12KNutrient Mixture(1X)培养基(购自Thermo Fisher Scientific公司)中培养过夜。然后将BGC-823细胞的培养基替换为含肝素(2.5μg/ml)和2％(v/v)FBS的1640培养基，将KATOШ细胞的培养基替换为含肝素(2.5μg/ml)、2％(v/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基，将HUVEC细胞的培养基替换为含肝素(2.5μg/ml)、2％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12K Nutrient Mixture(1X)培养基，同时加入实施例1制备的拮抗肽(25μM、50μM、100μM或150μM)继续培养12h。加入FGF2(40ng/ml)，单独拮抗肽组不加FGF2，孵育48h。按照MTT法即噻唑兰显色后检测570nm的光吸收值(OD)，分别按如下公式计算拮抗肽与FGF2共处理组和单独拮抗肽处理组的抑制率：
拮抗肽与FGF2共处理组抑制率＝[(FGF2处理组的OD值－拮抗肽与FGF2共处理组的OD值)/(FGF2处理组的OD值－对照组的OD值)]×100％；
单独拮抗肽处理组抑制率＝[(对照组的OD值－拮抗肽处理组的OD值)/对照组的OD值]×100％。
结果如图1所示：结果显示实施例1制备的拮抗肽显著抑制FGF2诱导的BGC-823、KATOⅢ和HUVEC细胞增殖，单独拮抗肽对胃癌和血管内皮细胞增殖无显著抑制作用。
实施3拮抗肽对细胞迁移的影响
将胃癌细胞BGC-823、KATOШ和血管内皮细胞HUVEC铺于6孔板中。BGC-823细胞在添加了10％(v/v)FBS的1640培养基中培养过夜，KATOШ细胞在添加了10％(v/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基中培养过夜，血管内皮细胞HUVEC在添加了10％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12K NutrientMixture(1X)培养基中培养过夜。然后将BGC-823细胞的培养基替换为1640培养基，将KATOШ细胞的培养基替换为含0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基，将HUVEC细胞的培养基替换为含1％(v/v)ECGS的F-12K NutrientMixture(1X)培养基，继续培养24h。胰酶消化，离心收集细胞，用细胞相应的无血清培养基重悬细胞后计数。取0.2ml细胞悬液加入Transwell小室的上室，取0.6ml含10％(v/v)FBS的1640培养基加入BGC-823细胞相应组别的下室，取0.6ml含10％(v/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基加入KATOШ细胞相应组别的下室，同时取0.6ml含10％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12K Nutrient Mixture(1X)培养基加入HUVEC细胞相应组别的下室，除对照组外其他组加入肝素(2.5μg/ml)。设对照组(在上、下室中加入PBS)、FGF2(40ng/ml)组(在上、下室中加入FGF2)、实施例1制备的拮抗肽(150μM)+FGF2(40ng/ml)组(在上、下室中加入FGF2和拮抗肽)、实施例1制备的拮抗肽(150μM)组(在上、下室中加入拮抗肽)。加药处理培养14h，用4％的多聚甲醛固定30min，结晶紫染色25min。倒置显微镜下观察、拍照并计数膜下表面细胞数。
结果如图2所示：结果显示FGF2促进BGC-823、KATOⅢ和HUVEC细胞迁移，而实施例1制备的拮抗肽可显著抑制FGF2对上述胃癌和血管内皮细胞迁移的促进作用。单独实施例1制备的拮抗肽对细胞迁移无显著影响。
实施例4拮抗肽对细胞侵袭的影响
将胃癌细胞BGC-823、KATOШ和血管内皮细胞HUVEC铺于6孔板中。BGC-823细胞在添加了10％(v/v)FBS的1640培养基中培养过夜，KATOШ细胞在添加了10％(w/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基中培养过夜，血管内皮细胞HUVEC在添加了10％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12K NutrientMixture(1X)培养基中培养过夜。然后将BGC-823细胞的培养基替换为1640培养基，将KATOШ细胞的培养基替换为含0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基，将HUVEC细胞的培养基替换为含1％(v/v)ECGS的F-12K NutrientMixture(1X)培养基，继续培养24h。胰酶消化，离心收集细胞，用细胞相应的无血清培养基重悬细胞后计数。Matrigel(基质胶)用无血清的1640和F-12KNutrient Mixture(1X)培养基按1:20(体积比)稀释，取50μL均匀地涂在Transwell上室的聚碳酸酯膜上，避免产生气泡，37℃静置1h。取0.2ml细胞悬液加入上室，取0.6ml含10％(v/v)FBS的1640培养基加入BGC-823细胞相应组别的下室，取0.6ml含10％(v/v)FBS、0.15％(w/v)碳酸氢钠、0.011％(w/v)丙氨酸和0.25％(w/v)葡萄糖的1640培养基加入KATOШ细胞相应组别的下室，同时取0.6ml含10％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12K Nutrient Mixture(1X)培养基加入HUVEC细胞相应组别的下室，除对照组外其他组加入肝素(2.5μg/ml)。设对照组(在上、下室中加入PBS)、FGF2(40ng/ml)组(在上、下室中加入FGF2)、实施例1制备的拮抗肽(150μM)+FGF2(40ng/ml)组(在上、下室中加入FGF2和拮抗肽)、实施例1制备的拮抗肽(150μM)组(在上、下室中加入拮抗肽)。加药处理培养14h，用4％的多聚甲醛固定30min，结晶紫染色25min。倒置显微镜下观察、拍照并计数膜下表面细胞数。
结果如图3所示：结果显示FGF2可明显促进BGC-823、KATOШ和HUVEC细胞侵袭，Transwell上室中的细胞穿越膜上的Matrigel侵袭至滤膜下表面的细胞数较对照组显著增加，而实施例1制备的拮抗肽则显著下调侵袭至滤膜下表面的细胞数，抑制FGF2对上述胃癌和血管内皮细胞侵袭的促进作用。而单独实施例1制备的拮抗肽对胃癌和血管内皮细胞的侵袭能力无显著影响。
实施例5拮抗肽对血管内皮细胞管腔形成的影响
将血管内皮细胞HUVEC铺于6孔板，用含10％(v/v)FBS和1％(v/v)ECGS的F-12KNutrient Mixture(1X)培养基培养过夜。然后将培养基替换为含1％(v/v)ECGS的F-12KNutrient Mixture(1X)培养基，继续培养24h。胰酶消化进行细胞计数。实验前将200μL的枪头和96孔板放在-20℃的冰箱预冷，Matrigel提前放4℃冰箱或者冰上解冻。第二天取50μLMatrigel铺于96孔板，放置37℃培养箱孵育1h，取100μL细胞悬液(细胞数为1×104)铺于Matrigel上。设对照组(加入PBS)、FGF2(40ng/ml)组、实施例1制备的拮抗肽(200μM)+FGF2(40ng/ml)组、实施例1制备的拮抗肽(200μM)组。处理6小时后显微镜下观察管腔形成并拍照。ImageJ软件统计管腔网格的数量。
结果如图4所示：与对照组相比，FGF2处理组HUVEC形成管腔网格的数量明显增加，而实施例1制备的拮抗肽则显著下调FGF2诱导HUVEC形成的管腔网格的数量，抑制FGF2诱导的管腔形成。而单独实施例1制备的拮抗肽对HUVEC的管腔形成无显著影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 抗肿瘤细胞转移和血管生成的靶向拮抗肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向拮抗肽
<400> 1
His Ala Leu Pro Met Trp Ser His Met Pro Ala Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向拮抗肽
<400> 2
His Ala Leu Pro Met Trp Ser His Met Pro Ala Ala Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (6)

1.一种靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯，其特征在于，所述的靶向拮抗肽的序列为：由His-Ala-Leu-Pro-Met-Trp-Ser-His-Met-Pro-Ala-Ala组成的肽。
2.权利要求1所述的靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物和/或抑制血管生成的药物中的应用，其特征在于：
所述的肿瘤为胃癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肺癌或乳腺癌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞增殖、迁移和/或侵袭的药物；
所述的抑制血管生成的药物为抑制内皮细胞增殖、迁移、侵袭，和/或抑制内皮细胞形成管腔的药物；
所述的内皮细胞为血管内皮细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
5.权利要求1所述的靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移、侵袭、和/或血管生成的药物中的应用，其特征在于：
所述的成纤维细胞生长因子为成纤维细胞生长因子2；
所述的细胞为肿瘤细胞或内皮细胞；
所述的肿瘤细胞为胃癌细胞、膀胱癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞或乳腺癌细胞；
所述的内皮细胞为血管内皮细胞。
6.一种抗肿瘤和/或抑制血管生成的药物，其特征在于：包含权利要求1靶向拮抗肽或其药学上可接受的盐或酯。
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