KR101463098B1 - ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체에 약물이 접합된 약물 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체, 상기 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 및 상기 약물 복합체 또는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

Description

ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체에 약물이 접합된 약물 복합체 및 이의 용도 {Cytotoxic drug conjugated c-Met-targeting full agonist human antibody and use thereof}
본 발명은 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체, 상기 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 및 상기 약물 복합체 또는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
간세포 성장인자/산란 인자 (Hepatocyte Growth factor/scatterring factor, HGF/SF)는 다면발현성 사이토카인 (pleiotropic cytokine)으로서 발생과정에서 다양한 기능을 한다. HGF/SF는 수용체인 c-Met 티로신 키나제에 결합하여 표적세포의 이동성, 침입, 증식, 생존, 형태변화 등 다양한 생체반응을 유도한다 (Jiang et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology. 53:35-69, 2005). HGF/SF는 중간엽 기원의 사이토카인으로 간세포는 물론 다른 상피성 세포인 내피세포, 색소세포, 조혈세포, 골세포 등에 작용하여 수용체인 c-Met을 통하여 상기 반응을 활성화시킨다고 보고되었다 (Tamagnone and Comoglio, Cytokine & Growth factor Rev. 8:129-142, 1997).
본 발명자들은 "HGF/SF-Met signaling의 장애가 간세포의 일상적 기능에는 영향을 미치지 않지만, 간세포가 손상된 경우의 재생과정에 부정적 영향을 미친다"는 결과를 발표한 바 있으며, 그 이후 간뿐만이 아니라 피부가 손상될 경우에도 HGF/SF와 c-Met가 분비되는 것을 확인하였다. 즉 과다증식성 피부조직에서 HGF/SF와 c-Met가 대량으로 분비되기 때문에 피부조직의 증식이 촉진되는 것이다. 그러나 c-Met는 피부와 모낭에서 발견되는 데 반하여, HGF/SF는 평소에는 모낭에서만 발현되며 피부가 손상을 입은 후에야 피부에서 발견되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 HGF/SF는 피부가 손상을 입을 때까지는 활동을 개시하지 않다가, 피부가 손상을 입은 후에 상처 주변부에서 특히 활발하게 활동한다 (Journal of Cell Biology 177(1):151-162, 2007). 따라서 HGF/c-Met은 피부재생과 회복을 직접적으로 조절한다고 알려져 있다 (Nakamura et al., Nature. 342:440-443, 1993; Huh et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:4477-4482, 2004).
생체 외 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 환경에서의 연구를 통하여 HGF/SF는 신경계에도 역시 작용하며 특히 운동신경세포 보호 기능에 대한 많은 연구들이 보고되어 있다 (Novak et al., Journal of Neuroscience. 20:326-337, 2000). 또한 심장 손상 회복 (Nakamura et al., J Clin Invest. 106:1511-1519, 2000)등의 일반적인 장기 손상 이후의 방어적 생리학적 기작에도 중요한 기능을 담당하고 있음이 제안되었고, 실제로 HGF/MET 경로가 신경 경색, 진행성 신장염, 간경화와 폐섬유증의 과정에 관계하며 HGF가 이러한 퇴행성 질병의 병변에 과발현되어 조직손상의 생리학적 방어기전으로 보호활성을 나타냄이 입증되었다 (Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008).
그러므로 HGF/SF는 중추신경계 신경세포의 사멸을 막고 더 나아가 신경퇴행성질환 즉 파킨슨씨 질환과 신경경색으로 유도되는 허혈증 및 알츠하이머 질환의 치료제로서, 그리고 다양한 원인에 의한 심장, 신장, 간 및 폐의 손상 및 궤양성 상처가 발생한 이후의 재생성 치료 개념의 제제로서 개발될 가능성이 제시되고 있다.
반면에 HGF/c-Met 신호전달의 과다 활성이 내피계열의 다양한 세포의 악성종양화와 혈관형성에 관련되고, 이러한 관점에서 c-Met을 표적으로하는 길항성 c-Met 항체가 항암제로서 사용될 수 있을 것이라는 가능성이 제시되었다 ( Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 예를 들어, 하나의 가지를 갖는 c-Met 항체가 HGF의 c-Met 이량체화에 의한 활성화를 음성적으로 조절하여 이식 마우스 모델에서 효율적으로 종양성장을 억제함이 보고된 바 있다 (Jin et al, Cancer Research 68(11): 4360-4368, 2008; Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 또한 T-세포 치료법에서 암세포 표면항원을 선택적으로 인식하는 T-세포 유전자조작에도 암세포에 과발현되는 항원에 대한 항체가 T 세포의 연결을 위한 종양 표적화에 활용되고 있다(Sadelain, The Cancer Journal 15(6):451-455, 2009). 그러나, c-Met에 대한 아고니스트 항체 (agonistic antibody)가 항암제의 대체제로 사용될 수 있음이 보고된 바는 없다.
한편, 항암제로 사용되는 세포독성 약물인 독소루비신 등은 세포주기를 타겟으로 하므로 독성이 암세포의 증식 정도에 의존적이다. 또한, 임상치료 효과를 얻기 위해 일반적으로 최대 허용량 근처에서 사용되고 있다. 그러나, 이러한 항암제들은 빠르게 증식하는 세포를 죽일 뿐, 정상 세포와 암세포 또는 암 조직을 차별화하지 못하여 암세포가 아닌 다른 세포를 사멸시키고, 고농도로 사용시 구토 등의 부작용을 일으킴이 보고되고 있다. 또한, 장기 치료 시 항암제에 대한 내성을 야기시킬 수 있어 세포독성 약물이 암세포만 표적하여 사멸시키는 향상된 치료 요법이 절실히 요구되고 있다. 아울러, 기존의 약물들은 종양이 성장함에 따라 산소가 부족해지는 저산소 종양 (hypoxic tumor) 상태에서는 치료효과가 약해지는 단점이 있었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 암세포에 특이적으로 세포독성 약물을 전달하고, 암세포에서 세포독성 약물들이 효과를 나타내기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명자들이 개발한 신규한 c-Met에 대한 아고니스트 항체에 독소루비신을 접합한 약물 복합체가 기존의 독소루비신이 독성을 나타내는 농도보다 낮은 농도에서도 암세포 특이적으로 성장을 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 약물 복합체 또는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체를 제공하며, 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, c-Met에 특이적인 인간항체에 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체를 제공한다.
본 발명에서 용어 “CDR (Complementarity determining region)"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
본 발명에서 용어 “c-Met"이란 HGF (hepatocyte growth factor)의 수용체로서, 본 발명에서 Met 또는 Met 수용체와 혼용되어 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 본 발명의 인간항체는 HGF/c-Met 신호전달을 유도할 뿐만 아니라, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하여 HGF의 모방체 (mimic)로서 작용하여서 아고니스트 항체로서의 기능을 수행할 수 있다. c-Met은 저산소 조건에서 발현이 더욱 유도되는 특징이 있다. 따라서, c-Met에 특이적인 인간항체는 저산소 종양 (hypoxia tumor)세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에서 용어 "c-Met에 특이적인 인간항체"는 c-Met에 특이적으로 결합할 수 있는 인간항체를 의미할 수 있으며, 그의 제조 방법 및 서열들은 대한민국 특허출원 제10-2011-0054177호의 명세서 전체를 참조할 수 있다.
본 발명에서 항체 (antibody)는 전체 항체 (whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F (ab')2 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 본 발명의 목적상 상기 인간항체는 단일클론항체일 수 있다. 본 발명의 인간항체는 모든 구조가 인간으로부터 유래 되었기 때문에 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있다. 따라서 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
바람직하게 상기 c-Met에 특이적인 인간항체는 중쇄 가변영역에 시스테인 잔기를 추가할 수 있다. 이와 같이 추가된 시스테인은 디설파이드 결합 (disulfide bond)를 환원하여 자유 티올 기 (thiol group)가 노출되도록 하여 약물과 접합하기 위한 작용기로 사용될 수 있다. 상기 시스테인 잔기는 1개 이상이 추가될 수도 있으며, 티올-반응성 시약과 부위-특이적으로 커플링될 수 있다. 이와 같은 시스테인 잔기는 링커와 연결되어 상기 인간항체와 세포독성 약물과 접합할 수 있도록 한다. 상기 시스테인 잔기는 효과적으로 세포독성 약물을 접합시키면서도 상기 인간항체가 표적으로 하는 c-Met과의 결합능력을 저해하지 않는 한 중쇄 가변영역 뿐 아니라, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 또는 경쇄의 불변영역에 추가될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 c-Met 특이적인 항체인 B7 항체 및 상기 항체의 중쇄 가변영역에 시스테인을 포함한 변형된 B7 항체 모두 FACS 분석 결과, c-Met에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (도 11). 이와 같은 결과는 독성약물 접합을 위해 시스테인을 추가하는 변형을 가하더라도 본 발명의 인간항체는 c-Met에 대한 결합력이 감소되지 않는다는 것을 뒷받침하는 것으로 약물 접합에 시스테인을 이용할 수 있다는 것을 시사한다.
상기 c-Met에 특이적인 인간항체는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간항체일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 7의 중쇄 가변영역에 시스테인 잔기가 추가된 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간항체일 수 있다.
또한, 상기 c-Met에 특이적인 인간항체는 서열번호 13으로 기재된 중쇄 불변영역의 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 인간항체일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 가변영역, 및 서열번호 13으로 기재된 중쇄 불변영역의 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변영역으로 이루어진 인간항체일 수 있다.
상기 세포독성 약물은 링커 (linker)에 의해 c-Met 특이적인 인간항체에 접합되는 것일 수 있다. 상기 링커는 혈류에 안정하여 항체가 체내 혈액 순환 시 약물이 항체로부터 분리되는 것을 막아 표적에 도달할 때까지 상기 약물이 전구체 약물 (prodrug) 상태로 유지되어 정상적인 조직에 입히는 피해를 최소화할 수 있는 특징을 가지는 물질은 제한없이 사용될 수 있으나, 그 예로 히드라존 (hydrazone) 또는 펩타이드 링커일 수 있다. 히드라존 링커는 알데히드, 케톤과 히드라진 반응으로 카르보닐기 >C=0가 >C=N-NH2로 변해 얻어지는 링커로 산성 조건에 약해서 산성 조건에서 히드라존 링커가 분리되어 결합된 세포독성 약물이 분리되어 세포독성을 나타낼 수 있게 할 수 있다. 펩타이드 링커는 펩타이드 결합을 이루는 링커를 포함하며, 세포 내 프로테아제 (protease) 에 의해 절단되어 세포독성 약물이 분리되어 세포독성을 나타낼 수 있게 한다. 상기 세포독성 약물은 시프 염기 (shiff base)에 의해 인간 항체에 접합될 수 있다.
본 발명에서 용어, "시프 염기 (shiff base)"란 아릴 또는 알킬기에 결합된 질소가 탄소-질소 이중 결합 (C=N)을 포함하는 작용기를 가진 화합물을 의미하며, 일반식으로는 R1R2C=NR3로 기재될 수 있다. 이는 항체의 친핵성 작용기가 링커의 친전사성 작용기를 공격하여 공유결합을 형성하는 것이다. 상기 식에서 R 기들은 유기체로 이에 제한되지는 않으나, 수소, 알킬, 페닐 등을 포함할 수 있다.
상기 세포독성 약물은 바람직하게는 [링커-Val (Valine)-Cit (citrulline)] 또는 [링커-시프 염기]에 의해 인간항체에 접합된 것일 수 있다. 이와 같은 결합은 공유결합에 의할 수 있다. 상기 링커는 N-말레이미도프로피오나미도-에틸렌글리콜 (N-maleimidopropionamido-ethyleneglycol)일 수 있다.
[링커-Val (Valine)-Cit (citrulline)]에 의해 인간항체에 접합된 경우에는 세포 내 생체 내 프로테아제와 같은 효소에 의해서 세포독성 약물이 절단되어 분리될 수 있고, [링커-시프 염기]에 의해 인간항체에 접합된 경우에는 생체 내 산성 조건에 의해 세포독성 약물이 절단되어 분리될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 실시예 4에서 [링커-Val (Valine)-Cit (citrulline)]에 의해 세포독성 약물인 독소루비신이 결합하는 반응을 수행하였으며 (도 12 내지 14), 실시예 5에서 [링커-시프 염기]에 의해 세포독성 약물인 독소루비신이 결합하는 반응을 수행하였다 (도 15).
상기 [링커-Val (Valine)-Cit (citrulline)] 또는 [링커-시프 염기]에 세포독성 약물을 공유 결합으로 연결한 후, 상기 결합체를 시스테인 잔기가 추가된 c-Met 특이적 인간항체를 디설파이드 결합을 환원하도록 하여 노출된 티올기와 반응시켜서 링커에 결합된 약물 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 변형된 B7 항체에 독소루비신이 안정적으로 접합된 것을 확인하였다 (도 17).
본 발명에서 용어, "세포독성 약물"은 암 치료제로 사용될 수 있는 약물은 제한 없이 포함되나, 그 예로 독소루비신 (Doxorubicin), 카보플라틴 (파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴 (Cisplatin), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 이포스파미드 (Ifosfamide), 니드란 (Nidran), 질소머스타드 (메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신 (Bleomycin), , 미토마이신 C (Mitomycin C), 시타라빈 (Cytarabine), 플루로우라실 (Flurouracil), 젬시타빈 (Gemcitabine), 트리메트렉세이트 (Trimetrexate), 메토크렉세이트 (Methotrexate), 에토포시드 (Etoposide), 빈블라스틴 (Vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 알림타 (Alimta), 알트레타민 (Altretamine), 프로카바진 (Procarbazine), 탁솔 (Taxol), 탁소텔 (Taxotere), 토포테칸 (Topotecan) 및 이리노테칸 (Irinotecan)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 상기 암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
바람직하게 본 발명의 치료 가능한 암은 본 발명의 약물 복합체를 이용하여 선택적으로 사멸시킬 수 있는 암은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 또는 신경계의 암이 있으며, 구체적으로 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 (central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 목적상 c-Met을 발현하는 암일 수 있다. c-Met은 저산소 조건에서 발현이 더욱 유도되며, 이와 같은 저산소 조건은 암이 증식함에 따라 혈관이 생성이 촉진되어 암에서 일어나는 현상이다. 따라서, 더 바람직하게 상기 암은 저산소 종양 (hypoxic tumor)일 수 있다. 이와 같은 저산소 종양은 기존의 약물로는 치료가 어려운 단점이 있었으나, 본 발명의 조성물은 c-Met에 특이적인 항체에 세포독성 약물을 접합함으로써 기존 약물의 치료 단점을 극복한 장점이 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 약물 복합체가 세포 내로 엔도사이토시스에 의해 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 클라쓰린 피복 소공 (clathrin-coated pit) 기능으로 진행된다. 세포 내로 이동된 약물 복합체는 클라쓰린에서 떨어지고, 세포 내 다른 베지클과 융합한 다음, 엔도좀-라이소좀 (endosome-lysosome) 경로로 진행된다. 이어서 엔도좀의 산성 환경에 있는 프로테아제가 링커를 절단하고, 활성화된 자유 약물은 라이소좀 막을 통과하여 세포질로 이동한 후, 약물의 분자 타겟에 결합함으로써 암세포의 세포 주기는 정지되고 아폽토시스에 의해 암세포가 죽게 될 수 있다. 이와 같은 엔도사이토시스에 의한 도입은 본 발명의 항체가 아고니스트 항체의 특징을 갖기 때문이다.
상기 복합체는 세포 내 프로테아제 또는 세포 내 산성 조건에 의해서 세포 독성 약물이 분리되어 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제하여 암을 치료할 수 있다. 이와 같은 세포 내 산성 조건은 pH 5.0 내지 5.5이일 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 기존의 세포독성 약물보다 낮은 농도에서 암을 치료할 수 있어서, 과량의 약물 주입에 의한 부작용을 줄일 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 독소루비신이 접합된 변형된 B7항체가 기존의 독소루비신의 세포독성 효과가 나타나는 농도보다 낮은 농도에서 선택적으로 A549 세포의 성장을 감소시키는 것을 확인하였다 (도 18). 이와 같은 결과는 본 발명의 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 조성물이 암 치료에 효과가 있다는 것을 뒷받침하는 것이다. 이와 같이, 기존의 세포독성 약물보다 낮은 농도에서 암을 치료할 수 있는 이유는 상기 세포독성 약물이 접합된 항체가 상기 약물을 암세포에 특이적으로 이동시킬 수 있기 때문이다.
본 발명의 암 질환의 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약물 복합체 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
약물 복합체, 약학적 조성물, 암은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 암 조직에 국소 투여한다.
상기 "개체"는 본 발명의 약물 복합체 또는 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 대상을 제한 없이 포함하나, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 질환의 치료용 약물 복합체 또는 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암 질환의 치료 또는 예방용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 항암 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 항암 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 약물 복합체는 c-Met에 특이적인 인간화 항체를 이용하여 c-Met이 과발현된 암세포에 선택적으로 세포독성 약물이 작용하도록 하여 부작용을 줄이는 효과가 있으며, 기존의 세포독성 약물이 작용하는 농도보다 낮은 농도로 작용할 수 있어서 환자의 고통을 줄일 수 있는 효과가 기대된다. 아울러, 기존의 약물이 치료하기 힘들었던 저산소 종양의 치료를 가능하게 하는 등 암 치료제 시장에 새로운 대안이 될 수 있을 것이다.
도 1은 c-Met 다클론 파지 항체에 대한 ELISA를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 c-Met 단클론 파지에 대한 핑거 프린팅을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3a는 중쇄 발현 벡터 pNATABH_B7를 나타내는 벡터맵이고, 도 3b는 경쇄 발현 벡터 pNATABL_B7를 나타내는 벡터맵이다.
도 4는 항체의 발현 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 정제된 항체를 전기영동한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 6은 독소루비신이 접합된 B7 항체의 모식도를 나타낸다.
도 7은 변형된 B7 항체의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터맵이다.
도 8은 변형된 B7 항체의 클로닝에 사용된 삽입 DNA의 PCR결과를 나타낸 도이다.
도 9는 변형된 B7 항체의 클로닝에 사용된 삽입 DNA의 제한 효소 절단 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 변형된 B7 항체의 정제 결과를 SDS-PAGE 전기영동으로 확인한 도이다.
도 11은 변형된 B7 항체의 c-Met에 특이적 결합여부를 FACS로 확인한 도이다.
도 12는 독소루비신 유도체 (linker-Val-Cit-Glu-dox)의 합성 과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 13은 독소루비신 유도체 (linker-Val-Cit-Glu-dox)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 linker-Val-Cit-Glu의 MALDI-TOF 질량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 독소루비신 유도체 (dox-linker)의 합성 과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 16은 변형된 B7 항체의 환원 및 산화 과정을 통한 항체 어셈블리 과정을 나타낸 도이다.
도 17은 독소루비신이 접합된 B7 항체의 Protein A 컬럼 정제 및 흡광도 확인을 나타낸 도이다.
도 18은 독소루비신이 접합된 B7 항체의 세포성장 분석을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: c- Met 특이적 인간항체인 B7 항체의 제조
<1-1> 라이브러리 파지의 제조
다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7×1010를 2×YT CM [Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)를 포함하는 배지(3 ℓ)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후 (OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파지 (helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YT CM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리 (4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG (Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl (sigma, S7653)을 첨가하여 용해시키고, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리 (8000 rpm, 20분, 4℃)하고, 펠렛을 PBS에 현탁시킨 다음, 원심분리 (12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 제조하였다.
<1-2> 패닝 ( Panning ) 과정
정제된 c-Met (Extracellular Domain)-Fc 30㎍을 4㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]에 가하여 용해시키고, 이를 면역흡착튜브 (Immunosorb tube, Nunc 470319)에 넣은 다음, 회전기 (rotator)에 4℃에서 16시간 동안 적용하여 c-Met을 상기 튜브의 벽면에 코팅하였으며, PBS에 4%로 용해된 탈지분유 (skim milk, BD,232100)를 사용하여 블로킹하였다.
상기 코팅된 면역튜브에 상기 <1-1>에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고, PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균 (XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서 (2차: 13번, 3차: 23번) 동일한 방법으로 2차, 3차 패닝을 수행하였다 (표 1).
패닝에 따른 항체의 역가비교
패닝횟수 파지의 유입수 파지의 결합수 세척횟수 항원의 양
1회 4.0X1013 4.5X107/2.7X107/3.9X107 5회 30㎍
2회 6.0X1013 7.5X106 13회 30㎍
3회 6.0X1013 6.0X109 23회 30㎍
상기 표 1에서 보듯이, 패닝의 횟수가 증가할수록 항체의 역가가 상승함을 알 수 있었다.
<1-3> 파아지 ELISA 에 의한 파아지 항체 스크리닝
1차부터 3차까지 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물 (stock)을 5 ㎖의 1차 배지 (2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl2)에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간 (OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2차 배지 (2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG)에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 세포를 원심분리한 후 (4500 rpm, 15 분, 4℃), 상등액 (패닝된 poly scFv-파아지)을 새 튜브로 옮겼다. 96웰 면역 플레이트 (NUNC 439454)에 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 용해된 탈지분유 (4 %)를 사용하여 각 웰을 블로킹하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2㎖으로 세척하고, 패닝된 poly scFV-파아지를 원액 및 5, 25, 125, 625, 3125배 희석한 용액을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-M13-HRP (Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD 정제 (Sigmap 8787-TAB)를 PC 완충용액[C6H8O7·H2O(Sigma, C0706) 5.1 g, Na2HPO4(Sigma, S7907) 7.3 g)에 용해시킨 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (도 1). 도 1은 c-Met 다클론 파지 항체에 대한 ELISA를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 항원에 대한 결합능이 각각 2차 다클론 scFv-파아지 풀 (pools)부터 증강하기 시작하여 3차에 결합능이 포화상태에 이르렀음을 확인할 수 있었다.
<1-4> 단일 클론 항체 선별
상기 결합능이 큰 다클론 파아지 항체군에서 얻은 콜로니를 2×YTCM, 2% 글루코스, 5 mM MgCl2 배지 1 ㎖이 포함된 96-웰 플레이트에서, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 OD600 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 1 ㎖의 1차 배지에 희석한 다음, 96-deep 웰 플레이트에서 37℃에서 OD600 값이 0.5~0.7 되도록 2~3시간 배양하였다. M1 헬퍼 파아지를 MOI값이 1:20이 되도록 감염시킨 후, 2차 배지에서 30℃의 조건하에 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리 (4500 rpm, 15 분, 4℃)한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리 (8000 rpm, 20분, 4℃)한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리 (12000 rpm, 10분, 4℃)하여 상등액을 취해 새 튜브에 옮겨 4℃에서 보관하였다. 이후, 96웰 면역 플레이트에 항원을 웰당 100 ng씩을 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후, PBS에 용해시킨 탈지분유 (4%)를 사용하여 각 웰을 블로킹하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 세척한 다음 상기 방법으로 수득한 단일클론 scFv-파아지 (each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20 (0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 씻어준 후 2차 항체인 항-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 세척한 후에, 발색하여 흡광도 490 ㎚에서 측정하였다 (표 2).
Figure 112011094309988-pat00001
상기 표 2에서 보듯이, 항원에 대한 결합능이 1 이상인 23개의 단일 파아지 클론들을 선별할 수 있었다.
<1-5> 핑거 프린팅에 의한 단일 클론 파지의 확인
1차 선별된 c-Met-Fc에 대한 16개 단일 클론 세포 1 ㎕와 Taq. DNA polymerase (젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머 (pYG100-F) 및 역방향 프라이머 (pYG100-R) 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR (iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 이때, PCR 프로그램의 조건은, 95℃-5min x 1 cycle, (95℃-20sec, 48℃-40sec, 72℃-1min) x 34 cycle, 72℃-5min x 1cycle 이다.
pYG100-F: 5'-cagctatgaccatgattacg-3'(서열번호 17)
pYG100-R: 5'-cttattagcgtttgccatct-3'(서열번호 18)
상기 콜로니 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 (Seakem LE, CAMERES 50004)에서 확인하였고, BstNI (Roche11288075001, 10 U/㎕) 0.2 ㎕를 가하여 37℃에서 2~3시간 반응시켰다. 반응 조건은 10X 완충용액 3 ㎕, PCR 산물 10 ㎕, BstNI(10 U/㎕) 0.2 ㎕ 및 증류수 16.8 ㎕이다.
상기 절단된 산물을 DNA 폴리아크릴 아마이드 겔 (30% acrylamide (Bio-RAD,161-0156) 2.66 ㎖, 10 XTBE 1 ㎖, dH2O 6.27 ㎖, 10% APS(sigma,A3678) 70 ㎕, TEMED(Bio-RAD,161-0801) 7 ㎕)에서 BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 의해 그 다양성을 확인하였다 (도 2). 도 2는 cMet 단클론 파지에 대한 핑거 프린팅을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 대해 다양성이 확인되었고, 15종의 서로 다른 항체가 선별되었음을 확인할 수 있었다.
<1-6> 염기서열 분석에 의한 단일 클론 파지의 확인
cMET-Fc에 대해 15 종류의 단일 파아지 클론을 2×YTCM, 2% 글루코스, 5 mM MgCl2 배지 (5 ㎖)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA 정제 키트 (Nuclogen 5112)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 서열 분석을 의뢰하였다 (솔젠트, 한국) (표 3).
Figure 112011094309988-pat00002
상기 표 3에서 보듯이, 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역을 확인하였고 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 아미노산 서열을 분석하였으며, 서로 다른 서열을 갖는다는 점을 확인할 수 있었다.
<1-7> 전체 IgG 변환분석
c-Met에 대한 단일 클론 파아지 항체들을 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕ 와 10 pM/㎕ 하기의 중쇄 정방향 프라이머(NATVH4-2)와 중쇄 역방향 프라이머(NATJH-ALL Nhe I), 10X 완충액 5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 이때, PCR 프로그램의 조건은, 95℃-2min x 1 cycle, (95℃-20sec, 55℃-40sec, 72℃-1min) x 30 cycle, 72℃-5min x 1cycle 이다.
NATVH4-2: 5'-TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTACAGCAGTG-3'(서열번호 19)
NATJH-ALL Nhe I: 5'-GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA-3'(서열번호 20)
또한, 경쇄도 하기의 경쇄 정방향(NATVL4) 및 역방향 프라이머(NATJL2-R)를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행 하였다.
NATVL4: 5'-TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC-3'(서열번호 21)
NATJL2-R: 5'-GAGGAGAGATCTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'(서열번호 22)
PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트 (Qiagen)로 정제한 후, pNATABH 벡터 1 ㎕ (10 ng), 중쇄 (100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, Ligase (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치하여 상기 벡터와 연결함으로써, 중쇄를 발현하는 벡터인 pNATABH_B7을 제작하였다 (도 3a). 도 3a는 중쇄 발현 벡터 pNATABH_B7를 나타내는 벡터 맵이다. 상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Amp 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 중쇄 DNA를 추출하였다.
한편, 경쇄는 pNATABL 벡터를 사용하여 상기와 같은 방법으로 경쇄를 발현하는 벡터인 pNATABL_B7을 제작하고 (도 3b), 이로부터 경쇄 DNA를 추출하였다. 도 3b는 경쇄 발현 벡터 pNATABL_B7를 나타내는 벡터맵이다. 상기 수득한 DNA의 CMV-proF 프라이머 (서열번호 23: AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰 하였다 (솔젠트). 그 결과, 전체 IgG로 전환한 c-Met-Fc에 대한 15개의 클론 파아지의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
<1-8> 항체 발현 및 정제
B7 파지의 가변부위를 pNATAB 벡터에 클로닝한 중쇄 및 경쇄 DNA와 PEI 시약을 혈청이 없는 DMEM 배지에 혼합하여 293E 세포에 처리하고, 이를 배양하였다. 상기 293E 세포가 100 mm 플레이트 70% 정도 자랐을 때 중쇄 및 경쇄 DNA 각 6㎍, PEI(#23966, Polysciences, USA) 20㎍을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시킨 후, 세포에 처리해 주었다. 24시간 후에 혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아 준 후, 이틀에 한번씩 배지를 회수하고 새로운 배지로 갈아 주었다. 회수한 배지는 2차 항체 (Goat Anti-human IgG, (Fc), Thermo, #31413)를 이용한 웨스턴 블럿 방법으로 항체 발현을 확인 하였다 (도 4). 도 4는 항체의 발현여부를 확인하기 위한 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진으로서, Non-reducing은 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하지 않는 비환원 조건에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타내고, reducing은 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 환원 조건에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타내며, 1 내지 4차는 48시간 마다 배지를 교체하면서 얻어진 각 시료의 순서를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 비환원 조건에서는 약 240kDa의 분자량을 나타내고, 환원조건에서는 항체의 중쇄와 경쇄가 분리되어 상기 2차 항체에 의하여 검출될 수 있는 약 55kDa의 중쇄 부분을 확인하였으므로, 상기 제조방법에 의하여 항체가 적절하게 제조되었음을 알 수 있었다.
발현이 확인된 배지는 원심 분리 후, 0.22 ㎛ 필터(#PR02890 Millipore, USA)를 이용하여 여과하였다. 10 ㎖ column에 400 ㎕의 Protein A Bead (#17-1279-03 GE, Sweden)를 충진하고, PBS로 씻어준 후(약 50㎖), c-Met B7 항체가 발현된 배지를 흘려 주었다. Peri-start 펌프(Bio-rad, EP-1 Econo-pump)를 사용하여 1분에 0.8 ㎖씩 흘러들어 가게 해 주었다. 배지가 모두 컬럼을 통과 한 후 PBS로 씻어 준 후 (약100㎖), 0.1 M glycine-HCl (#G7126, Sigma, USA)로 정제된 c-Met B7 항체를 회수하였다. 회수된 단백질은 1M Tris pH 9.0 (#T-1503, Sigma, USA)를 이용하여 pH를 중화시켜 준 후, PBS를 이용하여 투석을 실시하였다. 정제된 항체는 BCA (Thermo, #23228, #1859078) 용액을 가지고 정량을 수행하였고, SDS-PAGG를 통해 정제가 잘 되었는지, 항체 구조를 잘 이루고 있는지, 정량은 잘 되었는지 확인하였다 (도 5). 도 5는 정제된 항체를 전기영동한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, Non은 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하지 않는 비환원 조건에서 전기영동을 수행한 결과를 나타내고, Reducing은 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 환원조건에서 전기영동을 수행한 결과를 나타내며, #1과 #2는 2회의 정제실험의 결과로서 얻어진 각각의 항체를 의미한다. 도 5에서 보듯이, 상기 정제된 항체는 비환원 조건에서는 약 240kDa의 분자량을 나타내고, 환원조건에서는 항체의 중쇄와 경쇄가 분리되어 약 55kDa의 중쇄부분과 약 26kDa의 경쇄부분으로 분리됨을 확인하였으므로, 상기 정제방법에 의하여 항체가 적절하게 정제되었음을 알 수 있었다.
실시예 2: 추가 시스테인 ( extra Cys )을 포함하는 B7 c- Met 항체 제조 (Modification of B7)
<2-1> 항체의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 c-Met을 표적하는 B7 항체에 세포독성 약물을 결합시키기 위해 추가 Cys를 포함하는 항체를 제작하였다. B7의 중쇄를 발현시키는 플라스미드를 주형으로 하고, Cys의 코돈인 TGC를 포함하는 프라이머를 합성제작하였다. 250 μM dNTP 혼합물, 각 1 μM의 정방향 프라이머 (서열번호 24), 역방향 프라이머 (서열번호 25), DNA taq 중합효소 (enzynomics) 1 unit을 PCR 버퍼 조건으로 혼합하여 PCR을 수행하였다. 그리고 PCR 사이클로는 95℃ 5분간 가열 후, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분 30초로 원하는 삽입 DNA 절편을 제조하였다 (도 8). 얻어진 DNA는 PCR Purification Kit (Nucleogen)을 사용하여 정제하였다.
상기 PCR 조건에 사용한 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5'-TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTACAGCTACAGGAGTG-3' (서열번호 24)
역방향 프라이머: 5'-GAGGAGGCTAGCGCATGAGGAGACGGTGA-3' (서열번호 25), 밑줄 친 서열은 추가 Cys의 상보 코돈을 나타낸다.
약 1 μg의 삽입 DNA 절편과 pNATAB 중쇄 벡터를 NheI (New England Biolab, #R0131) 5 unit으로 37℃에서 2 시간 반응 후, SfiI (New England Biolab, #R0123) 5 unit을 더 추가한 후 50℃에서 2시간 더 반응시켰다 (도 9). 얻어진 DNA는 PCR Purification Kit (Nucleogen)을 사용하여 정제하였다. 제한효소로 절단하여 얻어진 삽입 DNA를 벡터와 라이게이션하기 위해 50 ng의 벡터와 6 ng의 삽입 DNA (몰비율로 벡터 : 삽입 DNA = 1: 3)의 혼합액에 1 unit의 T4 DNA ligase (Roche #481220)를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응혼합액 5 ㎕를 DH5α competent cell 50 ㎕에 섞고, heat shock 방법으로 형질전환하였다. 앰피실린을 포함한 LB 아가 플레이트에 키워 생성된 콜로니를 서열분석을 하여 확인 후 얻어진 플라스미드를 정제하였다.
클로닝된 항체의 서열을 분석한 결과, 경쇄 가변영역의 핵산 서열을 서열번호 12, 아미노산 서열을 서열번호 11로, 경쇄 불변영역의 핵산 서열을 서열번호 16, 아미노산 서열을 서열번호 15로, 중쇄 가변영역의 핵산 서열을 서열번호 10, 아미노산 서열을 서열번호 8로, 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 각각을 서열번호 1, 2, 3으로 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 각각을 서열번호 4, 5, 6으로 나타냈다.
<2-2> 항체 발현 및 정제
상기 <2-1>에서 클로닝한 변형된 B7 항체 (modified B7 c-Met antibody)를 발현시키기 위하여, 293E 세포를 사용하였다. 293E 세포가 100 mm 플레이트 70% 정도 자랐을 때 중쇄, 경쇄 DNA 각각 15 ㎍, PEI (#23966, Polysciences, USA) 20 ㎍을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 상기 세포에 처리해 주었다. 24시간 후에 혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아준 후, 이틀에 한번 씩 배지를 회수하고 새로운배지로 갈아주었다. 회수한 배지는 2차 항체 (Goat Anti-human IgG, (Fc), Thermo, #31413)를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 항체발현을 확인하였다.
발현이 확인된 배지는 원심분리 후, 0.22 ㎛ 필터 (#PR02890 Millipore, USA)를 이용하여 걸러주었다. 10 ㎖ column에 400 ㎕의 Protein A Bead (#17-1279-03 GE, Sweden)를 충진하고, PBS로 씻어준 후, 약 50 ㎖의 변형된 B7 항체가 발현된 배지를 흘려주었다. Peri-start 펌프 (Bio-rad, EP-1 Econo-pump)를 사용하여 1분에 0.8 ㎖씩 흘러들어가게 해주었다. 배지가 모두 컬럼을 통과한 후, 약 100 ㎖의 PBS로 씻어준 후, 0.1 M glycine-HCl (#G7126, Sigma, USA)로 정제된 변형된 B7 항체를 회수하였다. 회수된 단백질은 1M Tris pH 9.0 (#T-1503, Sigma, USA)를 이용하여 pH를 중화시켜 준 후, PBS를 이용하여 투석을 실시하였다. 정제된 항체는 BCA (Thermo, #23228, #1859078) 용액을 가지고 정량을 수행하였고, SDS-PAGE를 통해 정제가 잘되었는지, 항체 구조를 잘 이루고 있는지, 정량은 잘되었는지 확인하였다 (도 10).
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 및 코마시블루 염색을 통해 정제가 잘 되었고, 정량적 및 구조적으로도 형성이 잘 되어 있음을 확인하였다.
실시예 3: FACS 분석
본 발명의 인간항체인 변형된 B7 항체가 c-Met에 특이적으로 잘 결합하는지 FACS 분석법을 통해 확인하였다. c-Met 수용체가 잘 발현되는 것으로 알려진 A549와, c-Met이 과발현된 Cos-7 세포를 준비하여 PBS로 2번 씻어준 뒤 트립신을 처리하여 세포를 떨어뜨리고, PBS로 씻어준 뒤, 1% BSA 단백질을 넣은 PBS(PBA buffer)에 각 세포를 풀어주었다. 그다음 상기 실시예 2에서 정제한 변형된 B7 항체를 4℃에서 1:100 의 비율로 1시간 동안 처리해 준 후, PBA buffer로 씻어준 뒤 8000 rpm에서 1분간 원심분리기를 통해 세포를 침전시키는 방법으로 동일하게 3번 변형된 B7 항체를 씻어낸 뒤 인간항체를 탐지하는 2차 형광항체 (invitrogen, Alexa Fluor 488 goat anti-human IgG, #A11013)를 1:100으로 희석하여 20분간 처리해주었다. 앞에서와 동일하게 세포를 세척한 후, FACS 분석기기 (BD CantoIIFlow Cytometer)를 사용하여 결과를 얻었다 (도 11).
그 결과, 변형된 B7 항체가 원래의 c-Met을 특이적으로 인식하는 B7 항체의 특징을 상실하지 않고, c-Met에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (도 11).
실시예 4: 독소루비신 유도체 합성 및 생체 내 효소에 의한 세포독성 약물 방출 분석
Rink amide MBHA resin (0.59 mmole/g) 50 mg을 poly-prep chromatography column (Biorad, #731-1550)에 넣고 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride), DMF 5 ㎖씩으로 5분씩 팽윤 (swelling)시켰다. 20% 피페리딘 (peridine)을 포함하는 DMF 용액 10 ㎖을 넣고, 5분간 상온에서 회전 쉐이커 (rotational shaker)로 교반하면서 Fmoc 반응기를 deprotection하였다 (9 rpm). 메틸렌 클로라이드 (10 ㎖, 3번), DMF (10 ㎖, 2번)로 레진을 세척하고 여기에 FmocGlu(O-2- phiPr)OH (86.5 mg, 6 equiv)benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrridino-phosphonium hexafluoro-phosphate (PyBOP, 92 mg, 6 equiv), N,N-diisopropylethylamine (31 ㎕, 6 equiv)를 5 ㎖의 DMF에 녹여 넣고, 1.5 시간 동안 상온에서 일정한 속도 (9 rpm)로 교반하였다. 메틸렌 클로라이드와 DMF로 앞에서와 동일하게 세척하고, TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 테스트하여 반응의 완결을 확인하였다. 이후 Fmoc deprotection, protected amino acid coupling을 단계적으로 진행하여, Cit (citrulline), Val (Valine)도 순서대로 coupling하였다 (도 12, 레진 결합된 Val-Cit-Glu).
마지막 아미노산의 Fmoc deprotection 후, 100 mg/㎖의 SM (PEG)8 (Piearce, #22108)을 포함하는 DMSO 용액을 0.3 ㎖ (1.5 equiv) 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. TNBS 테스트를 하여 반응의 완결을 확인하고, 세척 후, phiPr 기를 다음과 같이 deprotection하였다. 2% TFA (trifluoroacetic acid)를 포함하는 메틸렌 클로라이드 10 ㎖을 넣고, 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 세척 후, 10 mg/㎖의 독소루비신 DMF 용액 (sigma, #D1515) 96 ㎕, HOBt (hydroxybenzotriazole) 1 mg, HCTU (2-(6-Chloro-1H-benzotriazole- 1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) 3 mg을 5 ㎖의 DMF에 녹여 넣고 상온에서 교반하였다. 메틸렌 클로라이드, DMF로 세척 후, cleavage cocktail, TFA : TIS (triisopropylsilane) : 물 (95:2.5:2.5) 용액을 넣고 상온에서 교반하면서 반응시켜, 레진으로부터 독소루비신이 접합된 펩타이드 (doxorubicin (dox) conjugated peptide)를 분리해냈다 (도 12, linker-Val-Cit-dox). 얻어진 펩타이드 유도체 혼합액에 공기를 흘려주어 TFA를 날려 제거해주고, ice cold n-hexane : diethyl ether (1:1) 용액 1 ㎖을 넣어 펩타이드 유도체 혼합물을 침전시키고, 4℃, 13000 rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 얻어진 펠렛을 DMSO 300 ㎕에 녹이고, HPLC (agilent 1100)로 분리하였다 (도 13). 고정상으로는 Zorbax C18 (5 ㎛, 4.6 mm × 15 cm)를 사용하였고, 이동상으로 Buffer A (0.1% TFA를 포함하는 H2O)와 Buffer B (0.1% TFA를 포함하는 CH3CN)를 사용하여 분리하였다. 사용된 농도 구배 조건은 다음과 같다: 5 분간 5% B 후에, 1 ㎖/min으로 35분 이상 5-60% 직선 농도 구배. 합성된 펩타이드 유도체 linker-Val-Cit-Glu는 MALDI-TOF mass spectrometry (Applied Biosystems)에 의해 확인되었다 (도 14). MS [M+H]+: 977.5 (calcd), 977.2 (obsd). 펩타이드 유도체 linker-Val-Cit-Glu-dox는 물질의 특성에 의해 MALDI-TOF mass spectormeter에서 검출되지 않았으나, 합성과정에서 생성되는 주요물질로서, 독소루비신의 흡광도(Absorabnce at 495 nm)를 가지고 있었다.
실시예 5: 독소루비신 유도체 합성 및 생체 내 산성도에 의한 세포독성 약물 방출 분석 ( modification of doxorubicin - conjugated via Schiff base )
H-Phe-H-Novasyn TG resin (Novabiochem, #04-12-3712, 0.24 mmole/g) 55 mg을 poly-prep chromatography column (Biorad, #731-1550)에 넣고 메틸렌 클로라이드, DMF 5 ㎖씩으로 5분씩 팽윤시켰다. 100 mg/㎖의 SM(PEG)8 (Piearce, #22108)을 포함하는 DMSO 용액을 0.1 ㎖ (1.1 equiv) 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 1 ㎖의 TFA로 한번 세척 후, cleavage cocktail (acetic acid : water : dichloromethane : methanol = 10 : 5 : 63 :21) 1.5 ㎖을 넣고 상온에서 30분간 교반하여 알데히드 링커 (도 15)를 레진으로부터 분리해냈다. 메탄올로 레진을 2번 세척하여 분리된 링커 혼합액을 모으고 공기로 용매를 제거하였다. Ice cold n-hexane: diethyl ether (1:1) 용액 1 ㎖을 넣어 알데히드 링커 혼합물을 침전시키고 4℃, 13000 rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 이를 물 0.2 ㎖에 녹였다. 독소루비신 5 mg을 알데히드 링커 용액 0.1 ㎖과 혼합하여 0.05 M 인산 나트륨 (pH 5.8) 버퍼조건으로 맞추고 (최종 1 ㎖ scale), 상온에서 밤새 교반하였다. 이렇게 만들어진 dox-linker 혼합용액을 분리 과정 없이 그대로 변형된 B7 항체와의 접합반응에 사용하였다.
실시예 6: 변형된 B7 항체의 독소루비신 접합 ( conjugation of doxorubicin to B7 modifed antibody , 도 6)
0.714 mg/㎖의 변형된 B7 항체 50 ㎕를 PBS (phosphate base saline) 버퍼조건에서 1 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) 24 ㎕를 넣고 (최종 0.2 ㎖ scale), 상온에서 5분간 교반하여 부분적으로 디설파이드 결합 (disulfide bond)를환원하도록 하여 추가 Cys이 충분히 자유 티올 기 (thiol group)를 노출하도록 하였다. ZebaSpin Desalting Columns, 7K MWCO (Thermo, #89882)를사용하여 염을 제거하고 얻어진 환원된 변형된 B7에 50 mM dhAA (dehydro-ascorbic acid) 6.4 ㎕를넣고 3시간 동안 다시 산화시켜 항체 어셈블리를 수행하였다 (도 16). ZebaSpin Desalting Columns, 7K MWCO (Thermo, #89882)를 사용하여 염을 제거하고, PBS 버퍼조건에서 과량의 linker-Val-Cit-Glu-dox 혹은 dox-linker 용액을 넣고, 4℃에서 2시간 반응하였다. 얻어진 독소루비신이 접합된 B7 항체를 protein A 컬럼을 거쳐 정제하였다. 이때 얻어진 분획에 대해 NanoQuant (Tecan, infinite200)로 280 nm, 495 nm에서 O.D 값을 측정하여 변형된 B7 항체에 독소루비신이 접합되었는지 확인하였다 (도 17).
그 결과, 변형된 B7 항체에 독소루비신이 안정적으로 접합된 것을 확인하였다 (도 17).
실시예 7: WST -1 세포 성장 분석 ( Cell proliferation assay )
독소루비신이 접합된 변형된 B7 항체가 c-Met과 결합을 통해 세포성장에 어떠한 영향을 미치는지 알고자, WST-1 분석법 (세포성장분석)을 진행하였다. 구체적으로, 100 mm 플레이트에서 키우던 A549세포를 트립신 처리하여 떼어낸 다음 96 웰 플레이트에 5000개씩 깔고 하루 뒤 원래 있던 배지를 3% 혈청이 함유된 RPMI 배지에서 하루동안 키웠다. 독소루비신 (dox)과 독소루비신이 접합된 변형된 B7 항체 (dox conjugated B7)를 각 농도별로 웰에 처리하고, 24 시간 후, WST-1 용액을 10 ㎕ 씩 2시간 동안 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 처리해 준 다음 NanoQuant (Tecan, infinite200)으로 450nm에서 O.D 값을 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, B7 항체를 처리하고, 24시간 후에 확인한 결과 독소루비신의 세포독성 효과가 나타나는 농도보다 낮은 농도에서 선택적으로 A549 세포의 성장을 감소시키는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 독소루비신이 접합된 변형된 B7 항체가 c-Met에 결합하여 선택적으로 세포 내에 독소루비신을 방출함으로써 세포성장을 억제하는 역할을 하는 것으로 볼 수 있었다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 독소루비신이 접합된 변형된 B7 항체가 암세포에 선택적으로 작용하는 치료제로 이용될 수 있음을 시사하는 것이며, 특히, 기존의 약물로는 치료가 어려운 저산소 종양 (hypoxic tumor)에서 특이적으로 작용할 수 있는 것을 시사한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology A&R therapeutics co., ltd. <120> Cytotoxic drug conjugated c-Met-targeting full agonist human antibody and use thereof <130> PA110824/KR <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a heavy chain variable region <400> 1 Gly His Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region <400> 2 Glu Ile Ser His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region <400> 3 Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a light chain variable region <400> 4 Thr Gly Thr Ile Ser Asp Ile Gly Thr Tyr Asp Phe Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a light chain variable region <400> 5 Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a light chain variable region <400> 6 Ser Ser Tyr Thr Asp Asn Arg Gly Leu Val Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region <400> 7 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu 35 40 45 Ser Gly His Tyr Trp Ser Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Ala Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Glu 85 90 95 Tyr Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region with extra cysteine <400> 8 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu 35 40 45 Ser Gly His Tyr Trp Ser Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Ala Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Glu 85 90 95 Tyr Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Cys 130 135 140 <210> 9 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region <400> 9 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgcag 60 gtacagctac aggagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcgctgtca gtggtgggtc cctcagtggt cactattgga gctgggtccg tctgccccca 180 gggaaggggc tggagtggat tggagaaatc agtcatagtg gtaataccaa ttacaactcg 240 tccctcaaga gtcgagcctc catatccata gacacgtcca agaatgagta ctccttgaac 300 ctgaagtctg tgaccgccgt ggacacggcc gtgtattact gtgcgagatt ctacggtgac 360 tacccctctt cttacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 420 <210> 10 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region with cysteine <400> 10 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgcag 60 gtacagctac aggagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcgctgtca gtggtgggtc cctcagtggt cactattgga gctgggtccg tctgccccca 180 gggaaggggc tggagtggat tggagaaatc agtcatagtg gtaataccaa ttacaactcg 240 tccctcaaga gtcgagcctc catatccata gacacgtcca agaatgagta ctccttgaac 300 ctgaagtctg tgaccgccgt ggacacggcc gtgtattact gtgcgagatt ctacggtgac 360 tacccctctt cttacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 tgc 423 <210> 11 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region <400> 11 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ile Ser Asp Ile 35 40 45 Gly Thr Tyr Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Phe Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile 85 90 95 Ser Gly Phe Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr 100 105 110 Thr Asp Asn Arg Gly Leu Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 115 120 125 Val Leu Arg Ser 130 <210> 12 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region <400> 12 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgcag 60 tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gccagtcgat caccatctcc 120 tgcactggaa ccatcagtga cattggcact tatgattttg tctcctggta ccaacataag 180 cccggcaagg cccccaaact cctgattttt gatgtcaata atcggccctc aggggtttct 240 agtcgcttct ctggctccaa gtctgacaat acggcctccc taagcatctc tggattccag 300 gctgaagacg aggctgatta ctactgcagc tcatatacag acaacagagg ccttgtcctt 360 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta agatct 396 <210> 13 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region (CH1~CH3) <400> 13 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 14 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region (CH1~CH3) <400> 14 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctctttcc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 15 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain constant region <400> 15 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 16 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain constant region <400> 16 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 120 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 180 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 240 aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 300 aacaggggag agtgt 315 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYG100-F primer <400> 17 cagctatgac catgattacg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYG100-R primer <400> 18 cttattagcg tttgccatct 20 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH4-2 primer <400> 19 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tacagcagtg 50 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJH-ALL NheI primer <400> 20 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL4 primer <400> 21 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagtctgccc tgactcagcc 50 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL2-R primer <400> 22 gaggagagat cttaggacgg tcagcttggt ccc 33 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-proF primer <400> 23 aaatgggcgg taggcgtg 18 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 24 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtacagc tacaggagtg 50 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 25 gaggaggcta gcgcatgagg agacggtga 29

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 모두 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 모두 포함하는 경쇄 가변영역을 모두 포함하는 c-Met에 특이적인 인간항체에, 세포독성 약물이 접합된 약물 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간항체는 중쇄 가변영역에 시스테인이 추가된 것인 약물 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간항체는 c-Met에 대한 아고니스트 (agonist) 항체인 것인 약물 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인간항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 경쇄 가변영역은 서열번호 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 약물 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인간항체는 서열번호 13으로 기재된 중쇄 불변영역 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 불변영역을 추가로 포함하는 것인 약물 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 링커 (linker)에 의해 인간 항체에 접합된 것인 약물 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커는 히드라존 (hydrazone) 또는 펩타이드 링커인 것인 약물 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포독성 약물이 시프 염기 (Schiff base)에 의해 인간 항체에 접합된 것인 약물 복합체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 [링커-Val (Valine)-Cit (citrulline)] 또는 [링커-시프 염기]에 의해 인간항체에 접합된 것인 약물 복합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포독성 약물은 독소루비신 (Doxorubicin), 카보플라틴 (파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴 (Cisplatin), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 이포스파미드 (Ifosfamide), 니드란 (Nidran), 질소머스타드 (메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신 (Bleomycin), , 미토마이신 C (Mitomycin C), 시타라빈 (Cytarabine), 플루로우라실 (Flurouracil), 젬시타빈 (Gemcitabine), 트리메트렉세이트 (Trimetrexate), 메토크렉세이트 (Methotrexate), 에토포시드 (Etoposide), 빈블라스틴 (Vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 알림타 (Alimta), 알트레타민 (Altretamine), 프로카바진 (Procarbazine), 탁솔 (Taxol), 탁소텔 (Taxotere), 토포테칸 (Topotecan) 및 이리노테칸 (Irinotecan)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 약물 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 c-Met을 발현하는 암인 것인 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 암은 저산소 종양 (hypoxic tumor)인 것인 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 복합체는 세포 내로 엔도사이토시스에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 복합체는 세포 내 프로테아제에 또는 세포 내 산성 조건에 의해서 세포독성 약물이 분리되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항의 약물 복합체를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  17. 제11항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.



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