CN110590956B

CN110590956B - 由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体

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Publication number: CN110590956B
Application number: CN201910928031.6A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 迟象阳; 于长明; 李建民; 徐俊杰; 付玲; 房婷; 张军; 陈旖; 王美荣; 陈郑珊; 刘威岑
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: CN110590956A

Abstract

本发明公开了一种由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述重链和轻链的可变区均具有独特的CDR区。本发明提供的双特异性抗体通过亲本抗体的筛选和组合，引入了新的中和机制，具有浓度依赖的furin酶切PA83抑制活性以及LF切割MEK抑制活性，具有比亲本抗体单独或者混合使用更显著的抗体中和活性和动物保护率，显示其在制备用于治疗和/或预防炭疽芽胞杆菌感染疾病药物中的良好应用前景。

Description

由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体

技术领域

本发明公开了一种双特异抗体，属于多肽技术领域，更具体地，属于免疫球蛋白技术领域。

背景技术

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰氏阳性的芽胞杆菌。炭疽芽胞杆菌是一种在世界范围内流行的人畜共患致死性传染病-炭疽病的病原体。炭疽病通常在一些蹄类动物中传播，人类感染炭疽的主要原因是与动物或者畜产品频繁接触。临床中人类炭疽病按照其感染途径可分为三种：皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽，三种炭疽病均可能造成死亡，而其中吸入性炭疽致死率高达90％。虽然炭疽病在人类中自然传播的发生率较低，但是由于炭疽杆菌的芽胞极强的存活能力，且致死率极高、来源广泛、成本低廉、易于培养，因此多年来炭疽芽胞杆菌一直被作为一种潜在的生物武器进行管控，美国将其列为A类生物战剂。2001年美国发生的炭疽邮件攻击事件，造成22例炭疽感染，其中5例病患最终死亡，并且数千人被列为潜在感染人群，炭疽攻击事件所带来的生物威胁一度引起全世界的恐慌。近年来随着国际反恐的发展，对炭疽的防控研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。

炭疽芽胞杆菌的主要致病因子包括三种毒素蛋白和以γ键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜，其中荚膜能够阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽杆菌分泌的三种毒素蛋白分别是保护性抗原(PA 83kDa)，致死因子(LF 85kDa)和水肿因子(EF 89kDa)。毒素LF是具有锌金属蛋白酶活性，能够激活靶细胞的MAPK信号途径。毒素EF具有腺苷酸环化酶活性，通过钙调蛋白的激活，使靶细胞的cAMP浓度升高。毒素PA能够与靶细胞表面受体(CMG-2/TEM-8)结合，靶细胞膜上的Furin酶切除PA(PA83)氨基端20kDa(PA20)肽段后，留在细胞膜上的63kDa(PA63)肽段发生寡聚化，形成的七聚体最多结合三个LF或者EF，PA与LF形成的复合物称为致死毒素(LT)，PA与EF形成的毒素称为水肿毒素(ET)，PA与LF或EF形成的复合物通过内吞作用进入胞内并释放LF和EF，发挥LF和EF的毒性作用。可见PA在炭疽芽胞杆菌毒素侵染宿主的过程，并最终造成宿主细胞伤害或死亡中起到了至关重要的作用。

PA蛋白的空间结构由四个结构域构成：PA结构域1(1～258位氨基酸残基)中包含Furin酶的作用位点；PA结构域2(259～487位氨基酸残基)在PA由孔前蛋白转变为孔蛋白释放LF/EF的过程发挥重要作用；PA结构域3(488～595位氨基酸残基)是PA63自发聚合成七聚体的重要功能区域；PA结构域4(596～735位氨基酸残基)是PA与细胞表面受体结合的区域。四个结构域相互作用共同为PA发挥生物学功能起着不可替代的作用。

1.炭疽芽胞杆菌的防治手段

炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗两方面。PA在炭疽芽胞杆菌侵染宿主细胞的过程中发挥了不可替代的中心作用，研究表明以PA作为靶点的炭疽预防和治疗手段是非常安全有效的。目前炭疽的预防主要是接种炭疽疫苗，美国FDA唯一批准的炭疽疫苗AVA(Anthrax Vaccine Adsorbed)和英国使用的炭疽疫苗AVP(Anthrax VaccinePrecipitated)，都是以PA作为主要免疫活性成分。研究和实践表明，AVA和AVP疫苗能够有效激发人类和动物针对炭疽的保护性免疫。然而，AVA和AVP疫苗应用于炭疽预防仍存在一定问题：疫苗产生保护性免疫的窗口期长，难以满足暴露后预防的需求；疫苗中同时含有三种毒素因子，对人体安全是一种潜在的威胁；疫苗产品批次间效果一致性差；难以保存。近年来新兴的新一代炭疽疫苗重组PA疫苗，能够更快地激发人体保护性免疫反应，成分单一且更容易保证批次之间的一致性。重组PA疫苗的临床研究已经证明了其安全性和有效的免疫原性。

目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出现以下情况，临床上往往不能奏效：①未能及时服用抗菌素：抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽胞后的48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗，但炭疽感染的潜伏期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊，错过最佳治疗时机；②人体耐药性：抗生素滥用使部分人群对多种抗生素产生抗药性，一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；③炭疽杆菌的人为改构：将抗生素抗性基因导入炭疽杆菌使抗生素失效，在技术上已完全可能(前苏联曾研制出具有18种抗生素抗性的超级炭疽杆菌)。抗生素在繁殖体阶段若不能有效阻断炭疽感染，一旦进入毒素阶段，抗生素就毫无作用。抗生素对吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用。抗生素只能杀死人体组织内的部分芽胞和细菌，却不能抵抗细菌在体内产生的大量毒素。而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中和抗体因具有保护性高，在人体内可以发挥特有的补体依赖细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，半衰期长，性质稳定等优点，尤其将中和抗体与抗生素联合应用时，可以相互弥补，最大可能发挥治疗作用，因此中和抗体已成为目前最有前景的炭疽治疗药物。

单克隆抗体药物主要通过结合一个特定的表位，起到一定的生物学功能，诸如阻断蛋白相互作用，激活或调节受体功能；抗体的Fc片段还能起到诱导ADCC或CDC效果。自1986年第一个抗体上市以来，FDA和EMA分别批准了55个和62个治疗性抗体药物(含生物类似药，不含Fc融合蛋白)，临床应用不断增加。针对炭疽保护性抗原的单抗药物有了较为深入的研究，同时也明确了这些单抗所针对的抗原中和表位。

已有的研究表明，抗LF/EF抗体能阻断LT/ET发挥活性，保护动物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽胞的攻击。但是无论是被动免疫还是治疗，效果均不及抗PA抗体。抗PA中和性抗体的作用要比针对炭疽毒素其他组分的中和性抗体更加重要。在感染初期，因荚膜表面有PA的存在，抗PA抗体能与芽胞结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制出芽或通过氧化杀死正在出芽的芽胞，因此，抗PA抗体具有抗芽胞的活性。芽胞被巨噬细胞吞噬后，导致巨噬细胞裂解，释放繁殖体，并伴有一定量的PA、LF及EF的分泌表达，蛋白酶水解PA，装配成七聚体，结合LF和EF后内吞入细胞发挥毒素作用。抗PA抗体可以通过抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用。研究显示，针对炭疽PA的单克隆抗体能够保护细胞免受炭疽毒素和炭疽芽胞杆菌的攻击，特别是对吸入性炭疽具有保护作用。

报道的已明确中和表位的单抗数量众多，还有大量未解析抗原表位的中和单抗尚在研究当中。Siu-Kei Chow等人在研究过程中发现了一些非中和抗体，甚至单独使用时具有毒素增强功能，但这种抗体却能够协助中和抗体发挥更好的效果，研究强调了非中和抗体在炭疽治疗中的重要性。然而，针对非中和单抗以及非中和表位的研究一直以来少见报道。由于生物恐怖的潜在威胁，人工改造炭疽毒素对于已知抗体的中和表位也存在可能，因此将针对非中和表位的炭疽抗体充分合理应用，能够为炭疽的治疗提供更多可供选择的手段，也能为人工改造炭疽毒素带来的生物恐怖威胁提供有效的应对措施。

2.双特异抗体药物的发展

构建同时靶向2个不同表位双特异性抗体的概念起源于20世纪80年代。Coloma等构建了第1个IgG和单链抗体(scFv)的融合蛋白，从而实现了单个分子的双特异性结合能力。虽然单克隆抗体一直以来被广泛应用预防和治疗感染性疾病往往具有良好的效果，是被动免疫治疗的重要组成部分，但是单抗应用于治疗也具有一定的缺陷，比如当病原体抗原突变率高或者毒性机制较为复杂时，单抗往往由于仅能够针对一个功能表位而无法发挥良好的疗效。为了克服上述单克隆抗体的缺陷，可同时结合两个抗原或表位的抗体，即基于单克隆抗体的双特异性抗体得到了迅猛发展。双特异性抗体领域中的真正兴奋来自于偶联两种(或更多种)特异性的能力，同时引入使用亲本分子不存在的新功能，比起单纯将两种亲本分子混合的治疗方法能起到1+1>2的治疗效果。

目前有两种已获准上市的双特异性抗体，catumaxomab和blinatumomab；超过50种双特异性抗体产品处在临床评价阶段，可见双特异抗体药物用于疾病治疗已获得广泛认可。根据不同的组成部分以及构建方式，双特异性抗体可以分为许多种类。例如，根据结构左右对称性分为对称结构和不对称结构，根据IgG分子完整性分为类完整抗体和类抗体片段，以及根据抗原结合区域的数量构型分为两价、三价、四价或更多价的构型等。不同的双特异性抗体设计各有利弊，但是以临床治疗为目的的双特异性抗体设计都要解决同样的问题：第一，保证两对(或以上)不同轻链与重链的正确偶合或配对；第二，保持每个单克隆抗体各自结合域的独立性，同时结合不同表位时互相之间不会产生空间位阻的干扰；第三，抗体分子要易于用哺乳动物细胞进行表达，不需要复杂的蛋白修饰工艺，有较好的成药性。由于抗体轻链和重链之间是通过恒定区配对结合的，不同抗体的轻重链在一起表达的时候会产生错配，因此保持轻链和重链的正确偶合一直是双特异性抗体构建的一个关键点。选择合适的双特异抗体构建模式对于后续双特异抗体药物的开发有着至关重要的意义。

因此本发明的目的就是提供易于制备、使用安全系数高、具有优异保护效果的针对PA非中和表位的抗炭疽PA毒素的全人源双特异抗体。双特异抗体的构建不仅保留亲本抗体的活性和机制，还增强了中和活性并引入了新的作用机制，起到了1+1>2的效果。本发明成果将为炭疽治疗提供更多的供选择手段，也能为人工改造炭疽毒素带来的生物恐怖威胁提供有效的应对措施。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗炭疽杆菌PA抗原两个表位的双特异性抗体，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述抗体重链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第26-35位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第53-59位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第98-110位氨基酸残基所示，所述抗体重链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第26-33位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第51-58位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第97-116位氨基酸残基所示，以及

所述抗体轻链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第89-97位氨基酸残基所示，所述抗体轻链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第89-96位氨基酸残基所示。

在一个优选的实施方案中，所述抗体重链的第一可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述抗体重链的第二可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，以及

所述抗体轻链的第一可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述抗体轻链的第二可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

在一个更为优选的实施方案中，所述抗体重链的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。

在另一个更为优选的实施方案中，所述抗体轻链的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示。

在又一个更为优选的实施方案中，所述抗体重链的第一可变区和所述抗体重链的第二可变区以柔性短肽连接，所述柔性短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

在另一个更为优选的实施方案中，所述抗体轻链的第一可变区和所述抗体轻链的第二可变区以柔性短肽连接，所述柔性短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。

可选择地，所述抗体重链的第一可变区位于重链的N端，所述抗体轻链的第一可变区位于轻链的N端。

可选择地，所述抗体重链的第二可变区位于重链的N端，所述抗体轻链的第二可变区位于轻链的N端。

其次，本发明还提供了一种编码上述抗体的多核苷酸，编码所述抗体重链的第一可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述抗体重链的第二可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示，以及

编码所述抗体轻链的第一可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述抗体轻链的第二可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：8所示。

在一个优选的实施方案中，编码所述抗体重链的恒定区的多核苷酸的序列如SEQID NO：10所示，，编码所述抗体轻链的恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：12所示。

更为优选地，编码所述抗体重链的第一可变区和所述抗体重链的第二可变区之间的柔性短肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：14所示，编码所述抗体轻链的第一可变区和所述抗体重链的第二可变区之间的柔性短肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：16所示。

最后，本发明还提供了上述抗体在制备用于治疗和/或预防炭疽芽胞杆菌感染疾病药物中的应用。

在本发明技术方案的设计中，具有重链第一可变区和轻链第一可变区的抗体被定义为2A6，具有重链第二可变区和轻链第二可变区的抗体被定义为8A7。由于8A7在体外完全没有中和活性，而2A6在细胞水平有亚中和活性，无法达到100％保护，仅在高剂量时提供部分保护。由于2A6与抗原PA结合的解离速度较快(K_off＝3.72E-3 1/S)，导致2A6的亲和力较低，K_D仅为261nM；而8A7的亲和力较高，K_D达到1.66nM，比2A6高两个数量级。双特异性抗体2A6-8A7和8A7-2A6与PA结合的亲和力常数KD分别为2.29nM和3.29nM，较亲本抗体2A6亲和力高两个数量级。8A7可变区的引入，大大提高了双特异抗体分子的亲和力。

在抗体中和活性实验中，2A6和8A7以摩尔比1:1混合时，EC50可达0.8448nM；双特异抗体2A6-8A7的中和活性比将二者混合的活性还要强，EC50达到0.2816nM，说明起到了1+1>2的效果，高于将两种亲本抗体以1:1混合使用时的效果。

在对小鼠的保护研究中，8A7和2A6单独使用时，在与PA摩尔比为1:1时体内均无法提供保护，8A7和2A6在1:1混合的条件下可以实现保护，而双特异性抗体2A6-8A7也同样可以提供良好的保护，在与毒素摩尔比为0.5:1时还可以达到100％的保护；在与毒素摩尔比为0.3:1时能明显延长老鼠的存活时间。说明双特异抗体可以在动物体内发挥良好的保护效果。

抗体抑制LF切割MEK验证实验显示，8A7促进了LF对MEK的降解，具有毒素增强的作用；2A6在短时间内可以起到一定的抑制MEK切割活性，但是随着与毒素孵育时间的增加，抗体的抑制作用降低，但是双特异抗体2A6-8A7，以及亲体抗体混合使用的2A6+8A7组，均能很好地抑制MEK切割。

在furin酶切抑制实验中，双特异性抗体2A6-8A7能够抑制furin酶切PA83，而两个亲本抗体2A6、8A7均无此活性，将二者1:1混合后也没有该活性；并且该活性是浓度依赖的。可见双特异抗体较亲本抗体引入了新的中和机制，起到1+1>2的作用效果。

附图说明

图1. 2A6和8A7抗体单独及混合后的对细胞及动物的保护曲线图；

图2.抗体分子表达质粒构建图谱；

图3.双特异抗体结构示意及分子量验证图谱；

图4.双特异抗体与PA的亲和曲线；

图5.ELISA测定双特异抗体分子与PA其不同结构域的亲和曲线；

图6.双特异抗体体外细胞实验的中和活性图谱；

图7.双特异抗体大鼠攻毒保护实验的中和活性图谱；

图8.抗体抑制LF切割MEK验证实验图谱；

图9.抑制PA和LF结合并入胞的免疫荧光实验图谱；

图10.抑制PA与受体结合并入胞的Western Blot实验图谱；

图11.抑制Furin酶切PA的SDS-PAGE实验图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1：2A6和8A7单抗的协同效果评价

1.1体内协同效果评价

在前期的研究中(专利号CN201510031493.X)，为了获得全人源单克隆抗体，对一名男性志愿者免疫了重组PA疫苗。在特定的时间点采集志愿者外周血，并通过流式进行单细胞的分选。通过单细胞PCR扩增重、轻链基因天然配对的抗体基因，并筛选单克隆抗体，将获得的单抗基因连接至pcDNA3.4载体中构建全分子抗体表达质粒，并将表达质粒转染至293F细胞中进行表达，通过Protein A亲和层析进行抗体的纯化并定量。将PA结合抗体进行两两配对协同实验，实验过程如下：

1)实验前一天，将小鼠单核巨噬细胞J774A.1以每孔3.5×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板中，于37℃在5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

2)实验当天，将rPA和rLF稀释于MEM+10％FBS培养基中，终浓度为rPA和rLF各100ng/mL。

3)在稀释好的毒素中保持第一种单抗浓度恒定(或者不加第一种抗体)，将第二种单抗以首孔1μg/mL依次进行3倍稀释，每个样品设11个稀释度。以不加入待测抗体仅含毒素(10×毒素)的对照孔作为死亡对照，以仅加入培养基的对照孔作为存活对照，于37℃孵育1小时。

4)将96孔细胞培养板中J774A.1细胞的培养基替换成孵育后的每孔100μL的毒素-血清混合液，将细胞置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4小时。

5)将细胞培养上清替换成每孔100μL 1mg/mL的MTT，继续培养4小时。

6)弃去细胞培养上清，每孔加入100μL的MTT溶解液。

7)待完全溶解后，以630nm为参考波长，检测570nm波长处的吸光值。每个样品设置两个复孔，细胞活力以(OD_测量孔-OD_死亡对照)/(OD_死亡对照-OD_存活对照)计算，用GraphPad Prism 5拟合抗体浓度和细胞存活曲线。

1.2体外协同效果评价

1)体重160～180克的雄性Fisher 344大鼠，随机分组，每组5只。

2)配制毒素，攻毒剂量为10μg rPA/只和10μg rLF/只。将2A6和8A7抗体与毒素以一定摩尔比混合，另设一组不含待测抗体仅注射毒素的死亡对照组，PBS定容至200μL。

3)通过尾静脉注射进行毒素攻毒。在48小时内观察大鼠的存活情况，记录死亡大鼠的死亡时间，计算从攻毒到死亡的时间长度，使用GraphPad Prism 5作大鼠存活曲线。

结果：2A6和8A7为两株在细胞模型和动物模型中均无保护活性的两株抗体，将两种抗体混合以后在细胞水平和动物体内均达到良好的保护效果。结果如图1所示，将2A6和8A7以不同摩尔比例混合后联用，发现2A6和8A7在摩尔比例为1:1时中和效果最佳，细胞保护达到100％，动物保护达到100％。总之，两个非保护性抗体2A6和8A7，在1:1混合比时在体内外实现了100％的保护。

实施例2：:2A6-8A7和8A7-2A6双特异抗体分子构建和制备

2.1构建双可变区抗体分子表达质粒

1)PCR构建双可变区抗体分子。设计带有限制性内切酶位点和保护碱基的引物，如表1所示。按表2中的模板和引物组合配制PCR反应体系，并进行第一轮PCR。以第一步PCR产物为模板，按表3中的模板和引物组合配制PCR反应体系，进行第二轮PCR。通过两轮PCR，将2A6和8A7的重链可变区通过天然柔性连接肽ASTKGP(DNA序列gcctccaccaagggccca)连接，将2A6和8A7的轻链可变区通过天然柔性连接肽TVAAP(DNA序列actgtggctgcacca)连接，将双可变区连接至抗体重链和轻链恒定区形成双可变区全长分子。分别将2A6和8A7置于N端，构建2A6-8A7 DVD-Ig和8A7-2A6 DVD-Ig。

PCR反应体系配方：

PCR反应条件：

2)将切胶纯化后的第二轮重叠延伸PCR产物，以及pcDNA载体用限制性内切酶EcoRI和Not I酶切，对目的片段进行切胶回收。使用T4 DNA连接酶，将抗体的重链和轻链抗体全长基因分别连接至pcDNA载体上，转化入DH5α感受态中，涂布于Amp抗性LB平板上。

3)菌落PCR鉴定，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，vector NTI分析序列，比对正确的为抗体重链表达载体和轻链表达载体。

表1.引物名称及序列

表2.第一轮PCR体系模板及引物组合

表3.第二轮重叠延伸PCR体系模板及引物组合

结果：构建成功的4个质粒图谱如图2所示，目的基因中含有kozak序列、信号肽、第一个抗体的可变区、天然柔性连接肽、第二个抗体的可变区、抗体恒定区。之所以选择DVD-Ig分子(Dual-variable domains Ig,DVD-Ig)是因为它能够同时结合两个表位，并且不会引入非常长的连接肽从而被酶切或者引入免疫原性，并且能够正确偶合避免样品出现异质性。

2.2哺乳动物细胞表达双特异抗体

1)接种2×10⁶个Expi 293F细胞至30mL Expi293^TM Expression Medium培养基中，于37℃在5％CO₂的悬浮细胞培养摇床中，以120rpm转速培养过夜。

2)细胞密度达到3×10⁶cells/mL，取25ml细胞至125ml摇瓶中。

3)取重、轻链pcDNA表达质粒各30μg，用1.5ml的

I Reduced-SerumMedium培养基稀释。取80μL ExpiFectamine^TM 293Reagent，用1.5ml的

Imedium稀释，轻轻混匀后室温静置5min。

4)将稀释的DNA加入到稀释的ExpiFectamine^TM 293Reagent中，轻轻混合，室温孵育20～30min以形成复合物，将复合物加到细胞中。

5)转染后16～18h加入150μl Enhancer 1和1.5mL Enhancer 2，于37℃在5％CO₂的悬浮细胞培养摇床中，以120rpm转速培养，转染后144h收样品。

2.3亲和层析纯化双特异抗体

1)将收取的Expi 293F细胞转染样品，于4℃，8000rpm转速离心收取上清。

2)利用Protein A亲和层析柱进行纯化，先用PBS(pH 7.4)平衡层析柱。

3)将细胞表达上清上样，再用0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脱。

4)每1ml洗脱物加入100μl 1M Tris-HCl(pH 9.0)进行中和。

5)纯化后获得的单抗用PBS(pH 7.4)进行透析，更换缓冲液。

6)使用BCA Protein assay kit测定浓度后贮存于-80℃备用。

结果：由于DVD模式的双特异抗体能够保证两对不同轻链与重链的正确偶合或配对，因此我们将2A6和8A7抗体构建成DVD-Ig形式的双特异抗体分子。如图3所示，图3A的示意图为构建的具有抗体分子2A6和8A7双可变区的抗体分子DVD-Ig。将2A6的重链V区和轻链V区连接到8A7的N端构建2A6-8A7 DVD-Ig；将8A7的重链V区和轻链V区连接到2A6的N端构建8A7-2A6 DVD-Ig。针对重链和轻链可变区各自的连接分别设计了天然柔性连接肽(重链：ASTKGP，轻链：TVAAP)，2A6-8A7和8A7-2A6分子通过瞬时转染HEK293F细胞重组表达，通过SDS-PAGE鉴定2A6-8A7和8A7-2A6 DVD-Ig的分子量和蛋白纯度。如图3B所示，在还原的条件下，2A6-8A7和8A7-2A6产生两条带，重链64kDa和轻链36kDa；对照单抗产生两条带，重链分子量为50kDa和轻链为25kDa。在非还原条件下，双特异抗体有一条将近200kDa的条带，而对照抗体全长分子量为150kDa。与理论值相符，说明双特异抗体表达量高，样品均一性良好。

实施例3：双特异抗体与PA的结合活性鉴定

3.1SPR测定双特异抗体与PA结合亲和力

1)使用Biacore系统通过表面等离子体共振(SPR)技术，测定抗原抗体的亲和力。先用0.4M的EDC(N-ethyl-N′-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimide)和0.1M NHS(N-hydroxysuccinimide)按体积比1:1混合后活化CM5芯片表面，时间为7min。

2)用10mM醋酸钠(pH 5.0)将抗人Fc抗体稀释成20μg/m L，流过CM5芯片表面5min。剩余未结合蛋白的活化位点用1M,pH 8.5乙醇胺进行封闭，以上三步流速均为10μL/min。抗体固定量为10 000RU。

3)将待测抗体捕获到2通道，1通道作为对照通道。采用single cycle kinetics的方法，将稀释成不同浓度梯度的待测抗体蛋白流过1、2通道，进样时间60s，解离时间180s，流速设为30μL/min。再生时用3M MgCl₂，20μL/min流速，再生60s，将捕获的待测抗体进行洗脱。

4)将得到的数据用Biacore evaluation软件1：1binding model拟和，得到抗原抗体结合速率(ka)，解离速率(kd)，二者相除计算其亲和力(KD)大小。

表4.抗体与PA的结合活性鉴定数据

抗体	抗原	K<sub>on</sub>(1/Ms)	K<sub>off</sub>(1/s)
				2A6	PA	1.42E4	3.72E-3
8A7	PA	7.53E4	1.25E-4
				2A6-8A7	PA	5.81E4	1.33E-4
8A7-2A6	PA	5.57E4	1.83E-4

结果：通过SPR技术能够非常准确地测定双特异抗体及其亲本抗体的亲和力常数，结果如图4所示，由于2A6与抗原PA结合的解离速度较快(K_off＝3.72E-3 1/S)，导致2A6的亲和力较低，K_D仅为261nM；而8A7的亲和力较高，K_D达到1.66nM，比2A6高两个数量级。2A6-8A7和8A7-2A6与PA结合的亲和力常数KD分别为2.29nM和3.29nM，较亲本抗体2A6亲和力高两个数量级。说明8A7可变区的引入，大大提高了双特异抗体分子的亲和力。

3.2ELISA鉴定抗体结合的抗原结构域

1)ELISA板用PA、PA四种结构域蛋白以2μg/mL的浓度包被，于4℃放置过夜。

2)用ELISA洗液(PBS+0.1％吐温-20)清洗3次。甩干洗液，彻底拍净孔内残余液体，每孔加入100μL 3％脱脂奶粉，于37℃封闭1h。

3)ELISA板用洗液洗3次，首孔加入10nM待测抗体，并进行2倍梯度浓度稀释，于37℃孵育1h。

4)ELISA板用洗液洗4次，每孔加入100μL用洗液1:100000稀释的HRP标记抗人IgG-Fc二抗，于37℃孵育1h。

5)ELISA板用洗液洗4次，每孔加入50μL显色液A液，再加入50μL显色液B液，显色15min后，用2mol/L硫酸溶液终止显色反应。在酶标仪上以630nm为参考波长，检测450nm波长处的吸光值。

表5.ELISA鉴定抗体与抗原不同结构域的结合活性

结果：通过ELISA测定了双特异抗体分子2A6-8A7和8A7-2A6与PA及其不同结构域的结合活性。如图5所示，2A6只能与PA全分子结合，而8A7与PA结构域3结合活性较强(EC50＝0.06nM)，与PA结构域2和4微弱结合；2A6-8A7和8A7-2A6都能与PA的四个结构域结合，且保留了8A7的结合特征，即与结构域3结合较为强烈，EC50分别为0.20和0.06nM。但是2A6-8A7与四个结构域的结合都弱于8A7-2A6。可见，DVD-Ig分子的N端可变区相较于分子内可变区更大程度地影响着双特异抗体的亲和力和结构域特异性。

实施例4：双特异抗体的体内和体外中和活性鉴定

4.1细胞实验测定体外中和活性

1)将J774A.1小鼠单核巨噬细胞以每孔3.5×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板中，于37℃在5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

3)稀释好的毒素每孔110μL加入到空96孔板中(除首孔外)。首孔加入220μL，内含待测单抗、100ng/mL rPA和rLF的MEM+10％FBS培养基。将首孔进行对倍稀释，每个样品设12个稀释度。同时以不加入待测抗体仅含毒素(1μg/mL rPA和rLF)的对照孔作为死亡对照，以仅加入培养基的对照孔作为存活对照，37℃孵育1h。

4)将96孔细胞培养板中J774A.1细胞的培养基，替换成孵育后的每孔100μL的毒素-血清混合液，将细胞置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4小时。

6)弃去细胞培养上清，每孔加入100μL的MTT溶解液。待完全溶解后，以630nm为参考波长，检测570nm波长处的吸光值。每个样品设置两个复孔，细胞活力以(OD_测量孔-OD_死亡对照)/(OD_死亡对照-OD_存活对照)计算百分比，用GraphPad Prism 5拟合抗体浓度和细胞存活曲线，计算单抗的IC50。

结果：如图6所示，8A7在体外完全没有中和活性，而2A6在细胞水平有亚中和活性，无法达到100％保护，仅在高剂量时提供部分保护。而2A6和8A7以摩尔比1:1混合时，EC50可达0.8448nM；双特异抗体2A6-8A7的中和活性比将二者混合的活性还要强，EC50达到0.2816nM，说明起到了1+1>2的效果。但8A7-2A6的EC50为5.25nM。总之，双特异抗体2A6-8A7的体外中和活性最高，高于将两种亲本抗体以1:1混合使用时的效果。

4.2大鼠攻毒实验测定体内中和活性

1)体重160～180克的雄性Fisher 344大鼠，随机分组，每组5只。

2)配制毒素，攻毒剂量为10μg rPA/只和10μg rLF/只。将待测抗体与毒素以一定摩尔比混合，另设一组不含待测抗体仅注射毒素的死亡对照组，加入PBS至200μL。

3)通过尾静脉注射进行毒素攻毒。在48小时内观察大鼠的存活情况，记录死亡大鼠的死亡时间，计算从攻毒到死亡的时间长度，使用GraphPad Prism5作大鼠存活曲线。

结果：如图7所示，PBS组在60min左右全部死亡，8A7和2A6单独使用时，在与PA摩尔比为1:1时体内均无法提供保护，8A7和2A6在1:1混合的条件下可以实现保护，而2A6-8A7也同样可以提供良好的保护，在与毒素摩尔比为0.5:1时还可以达到100％的保护；在与毒素摩尔比为0.3:1时能明显延长老鼠的存活时间。说明双特异抗体可以在动物体内发挥良好的保护效果。

实施例5：单抗和双特异抗体的中和机制研究

5.1抑制LF切割MEK验证的Western Blot实验

1)以6×10⁵cells/ml的浓度将J774A.1细胞接种于6孔板中，接种体积2ml，37℃培养过夜。

2)待测抗体与PA83和LF以摩尔比1:1:1混合至2.5ml培养基中，37℃孵育1h。

3)移除细胞培养皿中上清，将抗原抗体混合物各取2ml加入细胞，孵育1h。使LT毒素与抗体充分结合后，入胞并切割MEK。

4)吸出细胞培养上清，将细胞用2ml预冷PBS洗两次，加入新鲜配制的含蛋白酶抑制剂RIPA裂解液，用细胞刮刀将细胞尽可能刮下。超声30s×10个循环。吸出100μL样品，向每个样品中加入20μL非还原型6×SDS上样缓冲液，4℃12000rpm离心10min。

5)SDS-PAGE：每个样品取20μL样品在4–12％SDS-PAGE胶中上样，140V运行55min。

6)将胶上的蛋白电转至硝酸纤维素膜，300mA运行60min。后将膜置于6ml脱脂奶粉封闭液中封闭60min。将膜与5ml含25μl anti-MEK N端的抗体的脱脂奶粉杂交，4℃孵育过夜。TBST洗膜后与5ml 1:5000稀释的HRP偶联的抗鼠二抗杂交，37℃孵育1h。TBST洗膜后显色拍照。

7)将膜置于5ml剥离液中浸泡10min。TBST洗膜后，将膜置于6ml脱脂奶粉封闭液中封闭60min。将膜与5ml 1:5000稀释的HRP偶联抗actin抗体的脱脂奶粉杂交，37℃孵育1h。TBST洗膜后显色拍照。

8)使用Image J软件对图像进行灰度分析，比较加入待测抗体后LF对MEK N端的切割情况。

结果：毒素LF是具有锌金属蛋白酶活性，能够切割靶细胞中MEK1蛋白，从而激活靶细胞的MAPK信号途径，因此设计了抗体抑制LF切割MEK验证实验，验证抗体在炭疽毒素攻击靶细胞时发挥的保护作用。如图8所示，8A7在与毒素孵育40min时造成几乎100％的MEK被降解，而此时仅含毒素的孔仅有50％的MEK被切割，说明8A7促进了LF对MEK的降解，具有毒素增强的作用；而2A6在40min时具有一定的抑制作用，可是在70min时MEK的降解程度与对照没有显著性差异，说明2A6在短时间内可以起到一定的抑制MEK切割活性，但是随着与毒素孵育时间的增加，抗体的抑制作用降低，推测是由于2A6的亲和力过低，造成无法长时间保持与PA结合从而抑制LF的降解作用；而双特异抗体2A6-8A7，以及亲体抗体混合使用的2A6+8A7组，均能很好地抑制MEK切割。

5.2抑制PA和LF结合于细胞表面并入胞的免疫荧光实验

1)实验前一天接种J774A.1细胞至12孔板，细胞密度3.5×10⁵cells/ml，每孔1ml。

2)实验当天，将经荧光标记的PA和LF混合用培养基稀释，加入待测抗体，共孵育30min，加入细胞共孵育30min。

3)倒出液体，用PBS冲洗位于玻片上的细胞两次

4)用4％多聚甲醛于室温固定细胞10min

5)倒出液体，用PBS洗两次，每次洗5min

6)用封闭液(含2％BSA的PBS)的于室温封闭30min。

7)取出玻片并翻转放至载玻片上，用DAPI封固剂封片，室温孵育30min。

8)荧光显微镜下观测。

结果：通过免疫荧光实验可以清晰地观测到，抗体在抑制毒素作用于靶细胞过程中，是否抑制了毒素与靶细胞表面受体的结合，从而抑制PA和LF形成的毒素复合物进入靶细胞。如图9所示，8A7抗体组较仅含有PA和LF的对照孔，在细胞聚集了更多的PA，而2A6没有聚集作用。DVD 2A6-8A7和8A7-2A6也可以起到聚集PA的作用，说明保留了8A7的作用机制；但是2A6-8A7和8A7-2A6的LF荧光强度明显低于其他样品孔，说明双特异抗体虽然能够聚集PA，但却没有结合相应量的LF，这种效果在亲本抗体的样品孔中并不明显。以上结果说明8A7能够聚集PA，因此在单独使用8A7和毒素时会加剧细胞死亡的速度；2A6-8A7和8A7-2A6虽然能够聚集PA，但是二者却降低了LF的荧光值，说明2A6可能发挥了一定的作用机制，并且2A6-8A7可能存在与亲本抗体不同的中和机制。

5.3抑制PA结合于细胞表面并入胞的Western Blot实验

1)以3.5×10⁵cells/ml的浓度将J774A.1细胞接种于6孔板中，接种体积2ml，37℃培养过夜。

2)将待测抗体和PA83以摩尔比1:1混合至1ml培养基中，37℃孵育1h。移除上清，将抗原抗体混合物加入细胞，37℃孵育45min，使复合物与细胞表面受体充分结合，内吞入胞。

3)吸出细胞培养上清，预冷PBS洗两次，加入刚配制的含蛋白酶抑制剂RIPA裂解液，用刮刀将细胞尽可能刮下。超声30s×10个循环。吸出100μL样品，向每个样品中加入20μL非还原型6×SDS上样缓冲液，4℃12000rpm离心10min。

4)SDS-PAGE：每个样品取20μL上样于4-12％SDS-PAGE胶中，140V运行55min。

5)将胶上的蛋白电转至硝酸纤维素膜，300mA运行60min，将膜置于6ml封闭液中封闭60min。将膜与5ml含10μl PA兔多抗的脱脂奶粉4℃孵育过夜。TBST洗膜后与5ml 1:5000稀释的HRP偶联的抗兔二抗杂交，37℃孵育1h。TBST洗膜后显色拍照。

6)将膜置于5ml剥离液中浸泡10min。TBST洗膜后，将膜置于6ml脱脂奶粉封闭液中封闭60min。将膜与5ml 1:5000稀释的HRP偶联抗actin抗体的脱脂奶粉杂交，37℃孵育1h。TBST洗膜后显色拍照。

7)使用Image J进行图像灰度分析，比较加入待测抗体后，PA83、PA63和PA七聚体等蛋白条带的变化。

结果：为进一步确定双特异抗体对PA与细胞结合、PA83切割成PA63、SDS和热稳定PA63多聚体形成的影响，设计了抑制PA结合于细胞表面并入胞Western Blot实验。稳定的多聚体形成只能发生在受体运输PA63入胞且内体内为酸性环境时。PA83并不能入胞，而PA63几乎是立刻被脂筏运输至细胞内部。如图10所示，与对照相比，几种抗体对PA与细胞的结合都没有影响，说明这几种抗体均无法抑制PA与受体的结合；2A6-8A7不同于其它抗体，其PA83条带较8A7明显增强，而PA63条带较8A7没有明显增强，说明2A6-8A7可能抑制了PA83与细胞表面受体结合后酶切成PA63的过程；而对照在较大分子量处出现了SDS稳定的PA多聚体，而2A6、2A6-8A7，8A7-2A6均抑制了该多聚体的形成，说明2A6抗体可能影响了PA pore的形成，2A6-8A7则保留了2A6的该机制。

5.4抑制Furin酶切PA的SDS-PAGE实验

1)将33pmol(6.6μg)的待测抗体与36pmol(3μg)的PA83混匀，并做不加待测抗体的对照，用1M Tris配制成20μL的酶切反应体系，保证Furin酶切后PA63仍为单体。37℃放置1h。

2)加入1μl Furin酶，37℃放置1h。

3)加入4μl 6×非还原SDS上样缓冲液。

4)将样品经4-12％SDS-PAGE胶分离鉴定。

结果：为进一步验证抗体2A6-8A7是否较亲本抗体引入了新的中和机制—抑制PA83酶切成PA63，进行了furin酶切抑制实验。如图11所示，抗体2A6-8A7能够抑制furin酶切PA83，而两个亲本抗体2A6、8A7均无此活性，将二者1:1混合后也没有该活性；并且该活性是浓度依赖的。可见构建的双特异抗体较亲本抗体引入了新的中和机制，起到1+1>2的作用效果。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(121)

<223> 2A6重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ala Val His Thr Ser Lys Asn Gln Tyr

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Ala Gly Thr Phe Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Asn Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 363

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(363)

<223> 2A6重链可变区DNA序列

<400> 2

caggtgcagc tgcaagagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt attactggag ctggatccgc 120

cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggctacatct attacagtgg gagaacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacg atggcagtac acacgtctaa gaaccagtac 240

tccctgaggc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tttatttctg tgcgacaggt 300

gatggtgggg tagctggtac ttttgacttc tggggccagg gaaacctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(108)

<223> 2A6轻链可变区氨基酸序列

<400> 3

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile His Ser Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Val Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(324)

<223> 2A6轻链可变区DNA序列

<400> 4

gaaatagtga tgacgcagtc tccagcctcc ctgtctgtgt ctccagggga aggagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtattcac agcaacttag actggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccagactcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tgtcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgtgtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagactttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcccctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acga 324

<210> 5

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(127)

<223> 8A7重链可变区氨基酸序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Ser Gly His Tyr Gly Ser Gly Ser Phe His Leu Pro Glu

100 105 110

Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 381

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(381)

<223> 8A7重链可变区氨基酸序列

<400> 6

gaggtgcagc tgttggagtc tggaggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cagctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggacgg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtgataa catttactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240

atgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccctat attactgtgc gaaattctcc 300

ggtcactatg gttcggggag ttttcatctt cctgaatatt tccagcactg gggccagggc 360

accctggtca ccgtctcctc a 381

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(107)

<223> 8A7轻链可变区氨基酸序列

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Ile Arg

100 105

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(321)

<223> 8A7轻链可变区DNA序列

<400> 8

gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaagccg 120

gggaaagccc ctaaggtcct gatctataag gcgtctagat tagaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatactt attggacgtt cggccaaggg 300

accaaggtgg aaatcatacg a 321

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(330)

<223> 重链恒定区氨基酸序列

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 10

<211> 990

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(990)

<223> 重链恒定区DNA序列

<400> 10

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(106)

<223> 轻链恒定区氨基酸序列

<400> 11

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 318

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)..(318)

<223> 轻链恒定区DNA序列

<400> 12

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gttcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(6)

<223> 重链天然柔性连接肽氨基酸序列

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro

1 5

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(18)

<223> 重链天然柔性连接肽DNA序列

<400> 14

gcctccacca agggccca 18

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(5)

<223> 轻链天然柔性连接肽氨基酸序列

<400> 15

Thr Val Ala Ala Pro

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(15)

<223> 轻链天然柔性连接肽DNA序列

<400> 16

actgtggctg cacca 15

Claims

1.一种由两个炭疽非保护性抗体组成的新型双特异保护性抗体，其特征在于，所述抗体的重链和轻链的可变区分别由抗炭疽杆菌PA抗原两个不同表位的可变区串联组成，所述抗体重链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第26-35位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第53-59位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：1第98-110位氨基酸残基所示，所述抗体重链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQID NO：5第26-33位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第51-58位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5第97-116位氨基酸残基所示，所述抗体重链的第一可变区和所述抗体重链的第二可变区以柔性短肽连接并位于重链的N端，所述柔性短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，以及

所述抗体轻链的第一可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3第89-97位氨基酸残基所示，所述抗体轻链的第二可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第27-32位氨基酸残基所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第50-52位氨基酸残基所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7第89-96位氨基酸残基所示，所述抗体轻链的第一可变区和所述抗体轻链的第二可变区以柔性短肽连接并位于轻链的N端，所述柔性短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的第一可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗体重链的第二可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，以及

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的第一可变区位于重链的N端，所述抗体轻链的第一可变区位于轻链的N端。

6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的第二可变区位于重链的N端，所述抗体轻链的第二可变区位于轻链的N端。

7.一种编码根据权利要求2所述抗体的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体重链的第一可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述抗体重链的第二可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述抗体重链的第一可变区和所述抗体重链的第二可变区之间的柔性短肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：14所示，以及

编码所述抗体轻链的第一可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述抗体轻链的第二可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：8所示，编码所述抗体轻链的第一可变区和所述抗体轻链的第二可变区之间的柔性短肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：16所示。

8.一种编码权利要求3或4所述抗体的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体重链的恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：10所示，编码所述抗体轻链的恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：12所示。

9.权利要求1-6任一所述的抗体在制备用于治疗和/或预防炭疽芽胞杆菌感染疾病药物中的应用。