CN102030827A

CN102030827A - 一种高亲和力的抗her2单克隆抗体

Info

Publication number: CN102030827A
Application number: CN2009100579545A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 李博华; 王皓; 侯盛; 赵磊
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: CN102030827B

Abstract

本发明公开了一种具有高亲和力的抗HER2单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。所述抗体包括Trastuzumab单抗重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代。这些突变抗体与Trastuzumab相比具有更高的亲和力活性，抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。

Description

一种高亲和力的抗HER2单克隆抗体

技术领域

本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗HER2单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

ErbB2，又名HER2/neu，是EGFR家族的第二个成员，ErbB2通过与EGFR家族中其它三位成员构成异源二聚体，从而发挥生物学作用。目前尚未发现能与ErbB2直接结合的配体。编码ErbB2的neu基因最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到，人类体细胞内neu基因的同源基因，称为HER2，位于17号染色体的长臂(17q21.1)，编码的产物ErbB2由1255个氨基酸组成，分子量约为185kDa，其中720-987位属于酪氨酸激酶活性域。ErbB2除了通过PI3K及MAPK信号通路发挥作用，还可降低cyclin D及c-myc的表达，进而降低cyclin-dependentkinase(cdk)抑制剂p27kipl的表达，cdk2的活性失抑制而导致细胞的增殖[Nahta，R.and F.J.Esteva(2007).″Trastuzumab：triumphs and tribulations.″Oncogene 6(25)：3637-43.]。

HER2分子具有以下的特点，因此成为乳腺癌治疗的靶点：1.HER2的表达水平与乳腺癌的发病机理及预后相关；2.肿瘤的HER2表达水平及基因拷贝数远高于正常组织，有效的减轻了HER2靶向治疗药物的毒性；3.HER2表达阳性的肿瘤细胞比例很高，而且在肿瘤细胞表面高表达，因此在患者体内可以靶向大多数的肿瘤细胞；4.HER2在原发肿瘤及转移灶均有表达，因此HER2靶向治疗对原发及转移病灶均有效[Hatake，K.and N.Tokudome，et a1.(2007).″5.Tanstuzumab treatment for breast cancer.″Intern Med 46(3)：149-50.]。

曲妥珠单抗(Trastuzumab，Herceptin)是由美国Genentech公司开发的靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年美国FDA批准Trastuzumab与紫杉醇联合作为一线治疗方案用于HER2/neu过表达的转移性乳腺癌的治疗，或是作为单药用于治疗至少已经过一个周期化疗的HER2/neu过表达的转移性乳腺癌。Trastuzumab不仅对HER2受体有高度亲和力，同时还解决了鼠源性抗体应用于人体的免疫源性问题。临床试验结果表明，单独应用Trastuzumab的有效率为11.6％～16％，而与化学药物联合治疗的有效率可达50％。与单独化疗相比，进展期复发乳腺癌患者的生存期延长，死亡率降低。

Trastuzumab可能通过以下机制发挥抗肿瘤作用：1.抑制受体信号传导。HER2可以活化多种信号传导通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab减少了这些信号通路的传导，将细胞阻滞于调定点，诱导细胞凋亡。受体信号传导的降低是由于Trastuzumab介导的HER2受体内化及降解。2.通过调节p27kipl阻滞细胞于G1调定点。Trastuzumab处理的细胞被阻滞于G1调定点，细胞增殖减少。细胞阻滞于G1调定点与细胞周期依赖的激酶抑制蛋白p27kipl相关。3.诱导细胞凋亡。4.抑制血管形成。高表达HER2的肿瘤细胞新生血管及VEGF的表达显著增加。体外研究表明Trastuzumab处理后，内皮细胞的迁移能力下降；体内研究结果显示Trastuzumab处理后，乳腺癌肿瘤体积减小，微血管密度降低。5.免疫效应机制。体外研究表明，Trastuzumab可有效地诱导HER2高表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应，而对于HER2低表达的乳腺癌细胞则无此作用。NK细胞、单核细胞及巨噬细胞等效应细胞表面的Fcγ受体可识别IgG1 Fc段，抗体与效应细胞表面的Fcγ受体相互反应，通过释放胞浆颗粒杀伤抗体包被的靶细胞。由于Trastuzumab与HER2过表达的肿瘤细胞高亲和力结合，因而这些细胞比HER2低表达细胞更容易受到细胞毒性杀伤。Trastuzumab还可诱导补体介导的肿瘤细胞溶解。动物实验中观察到，补体成分可在肿瘤组织中沉积并激活。6.抑制HER2细胞外区的脱落。HER2高表达的细胞通过缓慢的蛋白酶解作用，全长的HER2受体可被酶切产生110kDa的细胞外区，在HER2阳性细胞的培养上清中可以检测到HER2细胞外区的存在，而截短的95kDa N末端膜相关片段激酶活性提高。进展期乳腺癌患者血清HER2细胞外区水平升高与预后不良、高转移率、激素及化疗抵抗相关。体外研究证实Trastuzumab可以阻断HER2细胞外区的酶解及脱落。7.抑制DNA修复。体外研究显示Trastuzumab可与许多化疗药物产生协同效应。Trastuzumab或联合化疗药物促进DNA损伤，并抑制DNA的修复，最终导致细胞凋亡。

抗体亲和力的提高能够增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功能同时降低抗体的用量。因此，通过在临床上广泛使用具有较好治疗效果的Trastuzumab的基础上，通过有限的几个突变，显著的提高Trastuzumab的亲和力，最终得到具有更强抗肿瘤活性的新型的Trastuzumab突变抗体。

发明内容

本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力的抗HER2单克隆抗体突变体。这些突变抗体与Trastuzumab相比具有更高的亲和力活性，能够更加有效的识别HER2抗原。高亲和力的抗HER2单克隆抗体突变体可用于制备治疗乳腺癌的药物。与Trastuzumab相比，突变抗体亲和力提高，抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。

本发明公开了：

1，一种高亲和力的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO：5所示的重链可变区和/或如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述氨基酸位点为重链可变区第55、102位，轻链可变区第28、30、92、93位氨基酸的位置。

2，上述抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或苏氨酸取代。

3，上述1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少2倍。

4，上述3所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，且重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列不同时为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

5，上述1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少10倍。

6，上述5所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9，且重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列不同时为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

7，上述1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少20倍。

8，上述7所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO：9。

9，一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗HER2单克隆抗体和可药用的载体。

10，上述1至9任一所述的抗HER2单克隆抗体或其制剂在制备抗乳腺癌药物中的用途。

11，上述10的用途，其中乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。

更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先参照Carter，P.and L.Presta，eta1.(1992).″Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.″Proc Natl Acad Sci U S A 89(10)：4285-9.公开的抗HER2单抗资料及序列，构建了抗HER2人源化抗体的轻、重链可变区和恒定区基因，然后通过表达、纯化，获得申请人自行构建的人源化Trastuzumab抗体(WT)。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR的方式对人源化Trastuzumab抗体(WT)进行构建，其构建与表达、纯化的方法与未突变的人源化Trastuzumab抗体(WT)相同。所述突变抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第55、102位，轻链可变区第28、30、92、93位氨基酸的位置。取代氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或苏氨酸。

对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为pcDNA3.1(+)，pDR1，pDHFF之一。

本发明的申请人对上述Trastuzumab突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，我们构建的Trastuzumab突变抗体的亲和力与市售的Trastuzumab的亲和力相似。相对于Trastuzumab(商品名：Herceptin)，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：轻链可变区第28位精氨酸、第30位精氨酸、第92位谷氨酸或第93位脯氨酸取代的突变抗体(L28R、L30R、L92E或L93Y)，重链可变区第55位赖氨酸或苏氨酸、第102位苏氨酸或脯氨酸或赖氨酸取代的突变抗体(H55K、H55T、H102T或H102Y或H102K)，亲和力提高了至少2倍。针对上述重链可变区和/或轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合突变，亲和力均提高了10倍以上，最终提高亲和力程度最高的组合突变抗体为：重链可变区第55位赖氨酸、第102位脯氨酸，以及轻链可变区第92位谷氨酸三个突变点同时取代的突变抗体(H55K，H102Y，L92E)。

以上实验结果说明，高亲和力的Trastuzumab突变抗体，其最佳突变位点为重链可变区第55、102位，轻链可变区第92位氨基酸的位置；最佳取代的氨基酸为赖氨酸、脯氨酸、和谷氨酸。并且，多个单点组合突变抗体的亲和力要高于单点突变抗体。

本发明公开上述高亲和力的Trastuzumab突变抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述Trastuzumab突变抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使Trastuzumab突变抗体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含高亲和力的Trastuzumab突变抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或治疗肿瘤的药物使用。

本发明中Trastuzumab突变抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。

本发明公开的Trastuzumab突变抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，包括：1、与芳香酶抑制剂联合：芳香酶抑制剂选自：依西美坦、氨鲁米特、洛太米特、吡鲁米特、阿那斯曲唑、曲洛斯坦、睾内酯、福美司坦、阿他美坦、1-甲基-1，4-雄甾二烯-3，17-二酮(MAD)、酮康唑、法卓唑、莱曲唑、伏罗佐和阿那斯卓唑等；2、与化疗剂联合：化疗剂的例子包括：阿霉素、表柔比星、5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺(CYTOXANTM)、硫替哌、白清安、塔克索德(例如，帕利他塞(

利Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Taxotere，Rhone-PoulencRorer，Antony，France))、氨甲碟呤、顺铂、长春碱、博来霉素、表鬼臼毒素吡喃葡萄苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春花新碱、维诺瑞宾(Vinorelbine)、卡铂(Carboplatin)、表鬼臼毒素噻吩糖苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基碟呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯波霉素(见美国专利No.4,675,187)、苯丙氨酸氮芥和其它相关的氮芥子类等；3、与激素类制剂联合：作用为调节或抑制作用于肿瘤的激素的激素制剂：如他莫昔芬和奥那普斯通(onapristone)；其它抗雌激素类：如雷洛昔吩(Evista)、芳族酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃西芬、凯西酚(Keoxifene)以及LY117018；以及抗雄激素类：如氟他胺和尼鲁米特，以及上述物质药学上可接受的盐、酸或衍生物；4、与mTOR抑制剂和/或HKI-272联合：mTOR抑制剂包括中性的三环化合物雷帕霉素类(西罗莫司)和其它的雷帕霉素类化合物，包括，例如：雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物、其它抑制mTOR活性的大环内酯化合物、和其它通过阻断细胞周期从G1期向S期的进展而阻止细胞复制的化合物或配体或其可药用盐；5、与紫杉类化合物联用：其代表药物是紫杉醇(泰素，paclitaxe1)和多西紫杉醇(泰索帝，taxotere)；6、与喜树碱和病毒联合：所述病毒选自：新城疫病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、小核糖核酸病毒和粘液瘤病毒；喜树碱选自：伊立替康、托泊替康、9-氨基喜树碱、依沙替康、卡仑尼替星、卢比替康、勒托替康和高喜树碱；7、与抗EGFR抗体、或与抗EGFR抗体和细胞毒性剂联用：所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或人源化mAB(matuzumab)，所述细胞毒性剂可以是化疗剂，优选选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素和依立替康，也可以是VEGF受体抑制剂、小分子氨酸激酶抑制剂、抗血管生成药或细胞因子等。本发明公开的Trastuzumab突变抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明所指的乳腺癌为HER2表达阳性的乳腺癌，包括转移后的乳腺癌、复发后的乳腺癌等等，这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有预防和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

附图说明

图1.Trastuzumab重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图中第一行序列表示Trastuzumab的重链、轻链的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序列。其中有下划线的地方表示构建突变体的突变点。

图2.Trastuzumab突变体的流式检测图，分别检测各突变体浓度达到饱和浓度。WT，表示申请人自行构建的未突变的Trastuzumab抗体

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cloned human and mouse kappa immunoglobulinconstant and J region genes conserve homology in functional segments.Hieter PA，Max EE，Seidman JG，Maizel JV Jr，Leder P.Cell.1980 Nov；22(1 Pt 1)：197-207.)和文献(The nucleotidesequence of a human immunoglobulin C gammal gene.Ellison JW，Berson BJ，Hood LE.NucleicAcids Res.1982 Jul 10；10(13)：4071-9.)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。

实施例2.抗HER2人源化抗体trastuzumab的表达载体构建

参照Carter，P.and L.Presta，et al.(1992).″Humanization of an anti-p185HER2 antibody forhuman cancer therapy.″Proc Natl Acad Sci U S A 89(10)：4285-9.公开的抗人HER2单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗人HER2单克隆抗体trastuzumab重链可变区基因(Her2VH)及轻链可变区基因(Her2VL)。图1显示了trastuzumab重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。以Her2VH基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此人源化重链基因的5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3’端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列见为：ATG GATTTT CAG GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCCTCA GTC ATA ATA TCC AGA GGA。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段Her2VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(Her2VHCH)。

以Her2VL基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟，得到PCR产物Her2VLCL，其5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3’端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为：ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT TTCAGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA GTC ATA ATA TCC AGA GGA与前相同。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段C2B8VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1载体(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体pcDNA3.1(Her2VLCL)。

实施例3.人源化抗体的稳定表达与纯化

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(Her2VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1(Her2VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化人源化抗体trastuzumab。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。

实施例4.Trastuzumab突变体的构建及表达

采用overlapPCR的方式进行Trastuzumab抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法与Trastuzumab人源化抗体相同。构建的抗体突变体共15个，分别为Hmut1到Hmut15，突变抗体的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO2和SEQ IDNO 4，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：5～18。

实施例5.Trastuzumab突变体的ELISA鉴定

将HER2膜外区蛋自按照Carter et al.的方法进行表达纯化，然后包被ELISA板，37度，孵育2小时；然后将固定浓度的抗体与等比稀释好的HER2膜外区蛋白室温孵育1小时。然后通过鉴定孵育抗体抗原复合物中游离的抗体的量，最终计算出亲和力的大小。具体请参见【Carter P，et al.(1992)Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancertherapy.Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-4289.；Friguet B，Chaffotte AF，Djavadi-Ohaniance L，Goldberg ME(1985)Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibodycomplexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immunol Methods 77：305-319.】。突变体Hmut1到Hmut15的具体亲和力常数请见表1。其中，我们构建的Trastuzumab抗体的亲和力与市售的Trastuzumab的亲和力相似。

相对于未突变的原本Trastuzumab抗体，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：Hmut3亲和力提高了9.75倍；Hmut6，9，10，11，亲和力至少提高2倍。两点或三点的组合突变抗体，亲和力均提高了10倍以上。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体Hmut15，其亲和力最终提高了22.17倍。

相对于市售的Trastuzumab，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：Hmut3亲和力提高了12.8倍；Hmut1，2，5，6，7，9，10，11，亲和力至少提高2倍。两点或三点的组合突变抗体，亲和力均提高了10倍以上。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体Hmut15，其亲和力最终提高了29.1倍。

表1.竞争性ELISA检测抗体突变体的亲和力

实验误差用SD表示，来源于独立重复三次实验结果。WT为申请人自行构建的未突变的Trastuzumab抗体序列；Herc表示为市售Herceptin。

实施例6.流式细胞术检测抗体亲和力

将1640/DM培养的SK-BR-3细胞(ATCC HTB-30)以2*10⁴个细胞每管均匀分配到流式管中，抗体以相同的浓度等倍比稀释加入流式管中与细胞进行孵育(冰上孵育30min)；将配好的1％NBS的PBS缓冲液，2ml每管洗涤细胞。300g，5min离心；充分洗涤三次；将1∶500稀释配好的FITC-GAH的二抗加入流式管，避光冰上孵育30min；然后用1％NBS的PBS缓冲液洗涤三次，200μl重悬，进行流式检测(见图2)。

序列表

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

<120>一种高亲和力的抗HER2单克隆抗体

<160>18

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列

<400>1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr ValAsp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>3

<211>321

<212>DNA

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列

<400>3

cgtactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列

<400>4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>120

<212>PRT

<213>Trastuzumab抗体重链可变区氨基酸序列

<400>5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>6

<211>107

<212>PRT

<213>Trastuzumab抗体轻链可变区氨基酸序列

<400>6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>7

<211>107

<212>PRT

<213>Hmut1突变体轻链可变区氨基酸序列

<400>7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>Hmut2突变体轻链可变区氨基酸序列

<400>8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>9

<211>107

<212>PRT

<213>Hmut3突变体轻链可变区氨基酸序列

<400>9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Glu Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>10

<211>107

<212>PRT

<213>Hmut4突变体轻链可变区氨基酸序列

<400>10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Lys Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>11

<211>107

<212>PRT

<213>Hmut5突变体轻链可变区氨基酸序列

<400>11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Tyr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>12

<211>120

<212>PRT

<211>Hmut6突变体重链可变区氨基酸序列

<400>12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Lys Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>13

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut7突变体重链可变区氨基酸序列

<400>13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>14

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut8突变体重链可变区氨基酸序列

<400>14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>15

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut9突变体重链可变区氨基酸序列

<400>15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>16

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut10突变体重链可变区氨基酸序列

<400>16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>17

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut11突变体重链可变区氨基酸序列

<400>17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Lys Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>18

<211>120

<212>PRT

<213>Hmut15突变体重链可变区氨基酸序列

<400>18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Lys Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims

1.一种高亲和力的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO：5所示的重链可变区和/或如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述氨基酸位点为重链可变区第55、102位，轻链可变区第28、30、92、93位氨基酸的位置。

2.权利要求1所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或苏氨酸取代。

3.权利要求1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少2倍。

4.权利要求3所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，且重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列不同时为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

5.权利要求1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少10倍。

6.权利要求5所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9，且重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列不同时为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

7.权利要求1或2所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合HER2的亲和力与Trastuzumab相比提高至少20倍。

8.权利要求7所述的抗HER2单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9。

9.一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗HER2单克隆抗体和可药用的载体。

10.上述1至9任一所述的抗HER2单克隆抗体或其制剂在制备抗乳腺癌药物中的用途。

11.上述10的用途，其中乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。