CN102167741A - 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗TNF-抗体4H16，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。本发明还公开了4H16抗体的制备方法以及编码4H16抗体的核苷酸序列、含该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的4H16抗体与D2E7单抗相比，具有更高的抗体亲和力和更强的TNF-中和能力，可用于制备治疗自身免疫性疾病药物。

Description

一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术
TNF-α是体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。TNF-α是一种可溶性的同源三聚体亚基，分子量为17kD(Smith，et al.，J.Biol.Chem.262：6951-6954，1987)。也发现有跨膜结合的前体TNF-α，分子量为26kD(Kriegler，et al.，Cell 53：45-53，1988)。单核巨噬细胞在受到内毒素和其他一些刺激物刺激后，能够分泌TNF-α和TNF-β，另外其他一些细胞也能分泌TNF-α。
TNF-α在类风湿关节炎、细菌或病毒感染、慢性炎症、自身免疫病如艾滋病(AIDS)、恶性肿瘤和/或神经退行性疾病等的病理进程中起十分关键的作用。TNF-α单克隆抗体可以中和TNF-α，在体内对TNF-α的活性起到了负调节的作用。而且有大量研究表明，TNF-α还是引起脓毒性休克综合症的主要介质。脓毒性休克综合症患者血清中TNF-α水平升高预示着死亡率或致残率升高。临床上应用TNF-α抗体或者其受体对脓毒性休克综合症有一定疗效。
此外，TNF-α是促进HIV无症状感染状态进入AIDS的主要介质之一，而针对TNF-α的单克隆抗体能够中和TNF-α的活性，在体内对TNF-α的活性进行负调节，可去除患者从无症状感染状态进入AIDS的诱因，达到一定的AIDS治疗目的。将TNF-α的单克隆抗体与其他AIDS药物联合应用，拮抗由TNF-α过多所引起的副作用，将会明显提高疗效。
最初科学家们制备获得的是鼠源抗TNF-α单克隆抗体，用于中和TNF-α的治疗。但研究发现鼠源单抗作为治疗药物存在许多缺陷，这是因为鼠源单抗用于人体具有强烈的免疫原性，体内消除快，半衰期短，导致临床疗效有限，副作用大。随着人源化单抗技术的发展，克服了抗TNF-α鼠源单抗的缺陷。其中人鼠嵌合抗TNF-α单抗(Infliximab，
Figure GSA00000033569400021
)是利用基因工程上游构建技术制备获得的，其可变区仍取自鼠源TNF-α单抗，保留了与肿瘤坏死因子可溶性片段和跨膜区结合的特异性和亲和力(Ka＝1010M-1)，恒定区为人IgG1的恒定区所取代，体内半衰期大大延长。另外还有已经在国外批准上市的TNF-α抑制剂有肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白(Enbrel，Amgen公司)和抗肿瘤坏死因子α全人单抗(Humira，Abbott公司)。
从作用的靶点和作用特异性的角度来说，上述几种药物的作用机理几乎是完全相同的。但上述抗体或融合蛋白都存在不同程度的免疫原性高、特异性低和/或稳定性不够等问题，因此，本领域迫切需要建立既能够保持或提高抗体的亲和力和特异性，又能够降低或基本消除抗体免疫原性的抗TNF-α抗体，从而进一步提高临床应用的安全性和有效性。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗TNF-α抗体4H16。
更具体地，本发明公开了全人源抗TNF-α抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示；
本发明公开了上述全人源抗TNF-α抗体，重链氨基酸序列为SEQ IDNO：10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；
本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗TNF-α抗体；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗TNF-α抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，编码全人源抗TNF-α抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗TNF-α抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示，编码全人源抗TNF-α抗体轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示；
本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)；
本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-K1细胞；
本发明进一步公开了上述全人源抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗TNF-α单链抗体；全人源抗TNF-α完整抗体分子真核表达载体的构建；全人源抗TNF-α完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗TNF-α完整抗体分子的纯化。
本发明最后公开了上述的全人源抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途。其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病。
本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明：与D2E7(adalimumab单抗，Abbott公司)、中国发明专利申请号200310108440.0申请日2003年11月6日发明名称为《全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物》中公开的7B3比较起来，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力和更强的TNF-α中和能力。
附图说明
图1.抗TNF-α抗体4H16阻断TNF-α与可溶性P75受体的结合实验结果；
图2.抗TNF-α抗体4H16阻断TNF-α与U-937细胞表面受体的结合实验结果；
图3.抗TNF-α抗体4H16拮抗TNF-α介导的L929细胞的杀伤效应实验结果；
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例抗体的制备
(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(NucleicAcids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
(2)cDNA的制备
收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(3)引物设计
参考文献(Immunotechnology，1998，3：271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列见Immunotechnology，1998，3：271-278。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有Not I位点的序列atg cgg ccg c。
(4).噬菌体抗体库的构建及筛选
采用(2)中的cDNA和(3)中的引物，利用recombinant Phage antibody system试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibodysystem试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人TNF-α(rhTNF-α)”购自R&D公司。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人TNF-α单链抗体4H16ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了4H16ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8分别显示了4H16ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
(5)全人源抗体在真核细胞中的表达
以4H16ScFv基因和pGEM-T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段4H16VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)进行连接，构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(4H16VHCH)。
以4H16ScFv基因和pGEM-T/CL截体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物，其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段4H16VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(Invitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(4H16VLCL)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(4H 16VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(4H16VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418(Invitrogen公司产品)和250μg/ml Zeocin(Invitrogen公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)(KPL公司)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgG1，κ(Sigma)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)((Southern Biotechnology Associates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB显色液于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体4H16。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了全人源抗体4H16的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了全人源抗体4H16的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。
实验例
7B3：按照中国专利申请号200310108440.0，申请日2003年11月6日，发明名称《全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物》中公开的方法制备得到。
实验例1.抗TNFα抗体的亲和力检测
运用Biacore T100系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离子体激元共振(SPR)检测TNFα抗体的亲和力常数。将重组人TNFα(R&D公司产品)通过氨基共价结合与CM5生物传感芯片(Biacore)上，将①全人源抗体4H16；②全人源抗体adalimumab(Humira，D2E7，市售产品)；③阳性对照全人源抗TNFα抗体7B3；④阴性对照抗体Trastuzumab(以PBS/0.05％TWEEN-20(ICI Americas)(去污剂)配溶液，配成不同的浓度(2倍比浓度稀释)，以50μl/min的流速通过芯片。每次检查之后，用5μl 50mM盐酸水溶液以3μl/min的流速洗涤，从而将残留的抗体从固定化的配体上洗脱下来。用BIAevalution软件(T100evalution 2.0版，Biacore)，通过非线性回归法分析结合曲线。结果如表1所示，全人源抗体4H16的KD值显著低于全人源抗体adalimumab和全人源TNFα抗体7B3，说明全人源抗体4H16对TNFα的亲和力高于adalimumab和全人源抗体TNFα抗体7B3，实验结果见表1
表1亲和力实验结果
Figure GSA00000033569400061
实验例2.抗TNF-α抗体4H16阻断TNF-α与可溶性P75受体的结合实验10μg/ml的P75受体-Fc融合蛋白(按照中国专利申请号01132074.5申请日2001年10月31日发明名称为《肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及其融合基因与产物》中公开的方法制备得到)包被酶标板，37℃反应2小时；3％的BSA封闭板孔，4℃反应过夜。PBS将生物素标记的TNF-α(为R&D公司产品210-TA-050，使用Pierce公司EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit 21425标记获得)稀释至10ng/ml，用该稀释液将全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16(本发明抗体)、D2E7(adalimumab单抗，Abbott公司)、7B3及阴性对照抗体Trastuzumab(Genentech)稀释至10μg/ml，并连续2倍比稀释，将稀释好的样品及对照品加入洗涤后的酶标板中，100μl/孔，37℃反应1小时；洗涤酶标板，PBS按照1∶1000稀释HRP-avidin(Zymed)，100μl/孔加入酶标板，37℃反应1小时；洗涤酶标板，HRP底物TMB的A液和B液(晶美生物)等体积混合后，100μl/孔加入酶标板，室温避光反应10分钟；每孔加入100μl浓度为0.5M的硫酸终止反应，酶标仪读取490nm的光吸收值。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见表2和图1。
表2
Figure GSA00000033569400071
实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16阻断TNF-α与P75受体的结合的IC50最小，因此其与TNF-α的亲和力最高。
实验例3.抗TNF-α抗体4H16阻断TNF-α与U-937细胞表面受体的结合实验
U937细胞(ATCC CRL1593)细胞培养于含10％胎牛血清(JRH)的RPMI-1640培养液(GIBCO)中，细胞表面表达TNF-α受体。对数生长期细胞计数后，200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用含1％胎牛血清的PBS重悬，调整细胞密度至1×106/ml，将细胞分至流式细胞术检测管中，100μl/管。PBS将异硫氰酸荧光素(FITC，Amresco)标记的TNF-α(为R&D公司产品210-TA-050，使用透析法标记获得)稀释至100ng/ml，用该稀释液将全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16(本发明抗体)、D2E7(adalimumab单抗，Abbott公司)、7B3及阴性对照抗体Trastuzumab(Genentech)稀释至100μg/ml，并连续2倍比稀释，将稀释好的样品及对照品加入流式管中，100μl/管，4℃避光反应1小时；含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀重悬于300μl含1％胎牛血清的PBS，流式细胞仪检测每管的荧光强度。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见表3和图2。
表3
Figure GSA00000033569400081
实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16阻断TNF-α与U937细胞表面受体的结合的IC50最小，因此其与TNF-α的亲和力最高。实验例4.抗TNF-α抗体4H16拮抗TNF-α介导的L929细胞的杀伤效应实验
L929细胞(ATCC CCL-1)细胞培养于含10％胎牛血清(JRH)的RPMI-1640培养液(GIBCO)中。对数生长期细胞消化计数后，200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用前述培养液重悬，调整细胞密度至1×105/ml，将细胞加至96孔培养板中，100μl/孔，置37℃，5％CO2培养箱培养过夜。次日，取培养液加入放线菌素D(华美生物)至浓度为20μg/ml，TNF-α(R&D公司产品210-TA-050)至浓度为4ng/ml，用含放线菌素D和TNF-α的培养液将全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16(本发明抗体)、D2E7(adalimumab单抗，Abbott公司)、7B3及阴性对照抗体Trastuzumab(Genentech)稀释至1μg/ml，并连续2倍比稀释，将稀释好的样品及对照品加入接种L929细胞的96孔培养板内，100μl/孔，设置复孔，37℃，5％CO2培养箱培养20小时；新鲜配制的非同位素细胞增殖检测试剂(Promega)，即MTS和PMS按20∶1比例混合后，20μl/孔加入96孔培养板中，培养箱内继续培养3小时，酶标仪检测490nm的光吸收，630nm为参比波长。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见表4和图3。
表4
Figure GSA00000033569400091
实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16拮抗TNF-α介导的L929细胞杀伤作用的IC50最小，因此其与TNF-α的亲和力最高，中和TNF-α的能力最强。
实验例5.抗TNF-α抗体4H16拮抗TNF-α诱导的小鼠死亡实验
D半乳糖胺致敏的小鼠注射重组人TNF-α可诱导小鼠死亡。1μg重组人TNF-α(R&D公司产品210-TA-050)及20mg D半乳糖胺(Amresco)腹腔注射，可诱导80-90％C57BL6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)死亡。在本实验例中，先给予一定量的各种抗体腹腔注射，30分钟后，再给予1μg重组人TNF-α及20mg D半乳糖胺腹腔注射，观察各种抗体的保护效果。各组注射剂量及结果见下表5。
表5
以上实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16拮抗TNF-α诱导的小鼠死亡的效果最佳，因此该抗体在小鼠体内中和TNF-α的能力最高。实验例6.抗TNF-α抗体4H16抑制TNF-α诱导的家兔发热反应实验
重组人TNF-α静脉注射新西兰大白兔，可诱导发热反应。5μg/kg的重组人TNF-α诱导的家兔发热反应约为0.5℃。本实验例中，新西兰大白兔(来源？)静脉注射5μg/kg的重组人TNF-α和各种抗体的不同剂量的混合物，注射前及注射后60分钟监测受试动物的体温，以评价各种抗体中和重组人TNF-α生物效应的能力。各组注射剂量及结果见下表6。
表6
Figure GSA00000033569400101
以上实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体4H16抑制TNF-α诱导的家兔发热反应的效果最佳，因此该抗体在家兔体内中和TNF-α的能力最优。
一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
SEQUENCE LISTING
<110>百迈博药业有限公司
 
<120>一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
 
<160>12
 
<170>Patentln version 3.2
 
<210>1
<211>990
<212>DNA
<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列
 
<400>1
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg    60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg   120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca   180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc   240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc   300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga   360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct   420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg   480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac   540
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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc   660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag   720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc   780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg   840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg   900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg   960
cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa                                    990
 
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列
 
<400>2
 
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp lle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>3
<211>318
<212>DNA
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列
 
<400>3
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga    60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg    120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc    180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa    240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc    300
ttcaacaggg gagagtgt                                                  318
 
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列
 
<400>4
 
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
            20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
        35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
    50                 55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
 
<210>5
<211>378
<212>DNA
<213>全人源抗体4H16重链可变区核苷酸序列
 
<400>5
caggtcacct tgagggagtc tggtcctgcg ctggtgaaac ccacacagac cctcacactg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggaa tgtgtgtgag ctggatccgt    120
cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcactcattg attgggatga tgataaatac    180
tacagcacat ctctgaagac caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg    240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata    300
cttgtggata tagtggctac gattacaaat gatgcttttg atgtctgggg ccaagggaca    360
atggtcaccg tctcttca                                                  378
 
<210>6
<211>126
<212>PRT
<213>全人源抗体4H16重链可变区氨基酸序列
 
<400>6
 
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Leu Val Asp Ile Val Ala Thr Ile Thr Asn Asp Ala
            100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>7
<211>330
<212>DNA
<213>全人源抗体4H16轻链可变区核苷酸序列
 
<400>7
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca    180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctccaga gctcactttc    300
ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgt                                     330
 
<210>8
<211>110
<212>PRT
<213>全人源抗体4H16轻链可变区氨基酸序列
 
<400>8
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
 
<210>9
<211>1368
<212>DNA
<213>全人源抗体4H16的重链核苷酸序列
 
<400>9
caggtcacct tgagggagtc tggtcctgcg ctggtgaaac ccacacagac cctcacactg     60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggaa tgtgtgtgag ctggatccgt    120
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atggtcaccg tctcttcagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc    420
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cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc    780
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<210>10
<211>456
<212>PRT
<213>全人源抗体4H16的重链氨基酸序列
 
<400>10
 
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Leu Val Asp Ile Val Ala Thr Ile Thr Asn Asp Ala
            100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
        115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
            180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
        195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
        275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
    290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
                325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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<211>648
<212>DNA
<213>全人源抗体4H16的轻链核苷酸序列
 
<400>11
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca    180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctccaga gctcactttc    300
ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgt actgtggctg caccatctgt cttcatcttc    360
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac    420
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac    480
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc    540
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat    600
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt                 648
 
<210>12
<211>216
<212>PRT
<213>全人源抗体4H16的轻链氨基酸序列
 
<400>12
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215

Claims (9)

1.一种全人源抗TNF-α单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗TNF-α单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示。
3.编码权利要求1所述的全人源抗TNF-α单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示。
4.编码权利要求2所述的全人源抗TNF-α单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示，轻链的核苷酸序列为SEQ IDNO：11所示。
5.含有权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞，为CHO-K1细胞。
7.权利要求1或2所述的全人源抗TNF-α单克隆抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗TNF-α单链抗体、全人源抗TNF-α完整抗体分子真核表达载体的构建、全人源抗TNF-α完整抗体分子在CHO细胞中的表达和全人源抗TNF-α完整抗体分子的纯化四个步骤。
8.权利要求1或2所述的全人源抗TNF-α单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病。
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