KR20230109853A

KR20230109853A - 항-vegfr2(kdr) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230109853A
Application number: KR1020220005624A
Authority: KR
Inventors: 남주령; 이원섭; 유진산
Original assignee: 주식회사 파멥신
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-21
Also published as: WO2023136647A1

Abstract

본 발명은 향상된 특성을 나타내는 항-VEGFR2(KDR) 개량 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체의 말단에 Tie-2 결합 단백질 도메인을 결합한 융합단백질, 상기 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성(angiogenesis)과 관련된 질환의 진단 또는 치료용 조성물, 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 융합단백질 이외의 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

항-VEGFR2(KDR) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 {Fusion Protein Comprising Modified Anti-VEGFR2(KDR) Antibody and Use Thereof}

VEGFR2/KDR는 일차적인 혈관신생 수용체이며, VEGF 이소형인 A, C, D 및 E와 결합하고, 내피 세포 분화뿐만 아니라 VEGF의 미토겐성, 혈관신생성 및 침투성-강화 효과에 중요하다. 항- VEGFR2 항체는 공지된 모든 VEGF 이소형이 VEGFR2/KDR에 결합하여 시그널링을 시작하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 종양은 더 많은 수의 VEGF를 분비하는 반면, 수용체의 수는 상대적으로 일정하게 유지되기 때문에, 수용체를 표적하는 것은 아주 높은 수준의 VEGF 이소형의 존재하에서 조차 완전하게 시그널링을 억제하는 확률을 증가시킨다.

신생혈관형성 (angiogenesis)이라 함은 내피세포의 성장, 분열, 이동 등에 의하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 것을 의미하며, 성인에서는 상처의 치료, 여성의 생식사이클 등의 특별한 경우를 제외하고는 발생하지 않는다. 그러나 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성 (age-related macular de유전자ration), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 건선 (psoriasis) 및 만성 염증(chronic inflammation)등과 같은 질병에서 과도한 신생혈관의 형성이 보고 되어 있으며 (Cameliet andJain, Nature, 407:249, 2000), 이러한 이유로 신생혈관 억제제를 이용하여 질병치료 특히 종양의 치료를 하고자 하는 노력이 많이 기울어지고 있다.

1971년 Dr. J. Folkman에 의해, 종양의 성장과 전이는 신생혈관형성 의존적이고, 따라서 항 신생혈관형성에 초점을 맞춘 치료법은 고형암에 대한 새로운 치료제가 될 수 있을 것이라는 가설이 제기된 이후, 과도한 신생혈관형성 기작의 억제와 관련된 연구는 다수 연구진들의 관심을 끌어왔다 (Ferrara and Kerbel, Nature, 435:967, 2005). 신생혈관형성 과정의 진행양상은 신생혈관형성 유발 인자들과 신생혈관형성 저해 인자들의 종합적인 밸런스에 의해서 결정되며, 여러 단계의 복잡하고 순차적인 과정에 의해서 진행된다. 그 과정을 살펴보면, 우선 종양이나 상처 난 조직에서 분비되는 혈관내피성장인자 (Vasicular Endothelial Growth Factor, VEGF)를 비롯한 다양한 신생혈관형성 유발 인자들이 주변에 있는 기존 혈관내피세포의 해당 수용체에 결합함으로써, 혈관내피세포들을 활성화시켜 혈관내피세포들의 투과성을 증가시키게 되고, 기저막 단백분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP)와 같은 단백질 분해효소를 분비함으로써, 혈관내피세포 주변의 기저막과 세포외기질을 분해시켜, 혈관내피세포들이 기존의 모세혈관으로부터 벗어나 신생혈관형성 유발 인자를 분비하는 조직을 향해 이동·증식하게 된다. 이동·증식한 혈관내피세포들은 혈관 내 튜브 구조를 이루고, 마지막으로 혈관내피세포의 구조적 지지대인 혈관주위세포 (pericyte)가 유입되면서 안정하고 성숙한 혈관형성이 이루어지게 된다. 이때 혈관내피세포로부터 분비되는 엔지오포이에틴 1 (angiopoietin 1, Ang1)은 그것의 수용체인 Tie-2와 결합함으로써, 혈관주위세포의 유입과 혈관의 안정화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Suri et al., Cell,87:1171, 1996). 한편, Ang1과 Tie-2의 상호작용을 저해하는 길항자 (antagonist)로써 알려져 있는 엔지오포이에틴 2 (angiopoietin 2, Ang2)는 Tie-2에 대하여 Ang1과 비슷한 수준의 친화도를 나타내고 있기 때문에, Ang1에 의해서 유도되는 Tie-2의 인산화과정을 경쟁적으로 저해할 수 있다 (Maisonpierre et al., Science, 277:55, 1997). 하지만, Ang2의 기능은 세포의 형태나 실험방식에 따라 Tie-2의 인산화를 유도하기도 하는 것으로 보고된 바 있으며 (Kim et al., Oncogene, 19:4549, 2000), 신생혈관형성 초기단계에서 혈관내피세포와 혈관주위세포 사이의 상호작용을 저해함으로써, 혈관을 불안정하게 만들고, VEGF와 같은 자극에 대해서 혈관내피세포를 민감하게 만드는 것으로도 보고된 바 있다 (Klagsbrun and Moses, Chem. Biol., 6:R217, 1999; Veikkola and Alitalo, Semin Cancer Biol., 9:211, 1999; Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000). 특히, Ang1의 경우 정상조직에서 비교적 광범위하게 발현되어지고 (Maisonpierre et al., Science, 277:55,1997), 종양조직에서는 발현이 높지 않은 경향 (Hayes et al., Br. J. Cancer, 83:1154, 2000)을 보이는 반면, Ang2는 혈관신생형성 정도가 큰 암 조직이나 혈관 리모델링이 활발한 정상조직인 태반, 자궁, 난소 등에서 과발현 양상을 보인다는 사실은 (Kong et al., Cancer Res., 61:6248, 2001; Ahmad et al., Cancer, 92:1138,2001) 상대적으로 Ang2가 Ang1 보다 높아지는 경우, 결과적으로 종양 신생혈관형성의 시작을 개시하는 것으로 추정케 하고 있다. 따라서, Ang2가 Tie-2 신호전달 기작에 있어서 작용자 (agonist)로써의 역할도 가능한 것으로 추측되고 있으며 종합해 볼 때, 엔지오포이에틴과 Tie-2의 신호전달 기작은 아직 명확하게 규명되어 있지 않아 추가적인 연구가 필요한 것으로 보이지만, Ang1과 Ang2는 신생혈관형성에 중요하면서도, 서로 다른 역할을 수행하는 것으로 해석되고 있다.

엔지오포이에틴은 약 50개의 아미노산으로 구성된 N-말단 도메인 ([0004] N-도메인)과 215개의 아미노산으로 구성된 coiled coil 도메인 (C-도메인) 그리고 약 215개의 아미노산으로 구성된 Fibrinogen-like domain (F-도메인)으로 구성되어 있으며, 이중 N- 및 C-도메인은 엔지오포이에틴의 다중체 형성에 관여하며, F-도메인은 수용체인 Tie-2 결합에 관여한다 (Davis et al., Nat. Strut. Biol., 10:38, 2003). Tie-2의 신호가 작동하기위하여 필요한 인산화는 다른 타이로신 카이네이즈 수용체처럼 수용체의 이중화 (dimerization)를 통해서 이루어지며, 이를 위해서는 엔지오포이에틴이 다중화 (multimerization)되어야 한다는 사실 (Procopio et al., J. Biol. Chem., 274:30196, 1999; Schlessinger, Cell, 103:211, 2000)은 신생혈관형성 저해를 이용하는 신약개발 전략의 표적으로서, 이들 리간드가 이용될 수 있음을 시사하고 있다. 특히, Davis et al.은 Tie-2의 인산화를 위한 엔지오포이에틴의 최소 모듈은 유전공학적 방법을 통해서 확인한 결과, 테트라머 (tetramer)이며, 다이머 (dimer)로 모듈을 구성한 경우 길항제로써 사용될 수 있다고 주장한 바 있다 (Davis et al., Nat. Strut.Biol., 10:38, 2003). 또 다른 연구에서도 Ang1 다이머 변이체는 Tie-2에 대한 신호전달을 효과적으로 진행시키지 못한다는 사실이 보고된 바 있다 (Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:5547, 2004). 다시말해서, Ang1이 길항제로써의 역할이 보고된 바 없음에도 불구하고, 이 분자의 올리고머 패턴을 변형시킴으로써 Tie-2에 대한 신호전달을 저해한 것은, 결국 엔지오포이에틴의 다중화 (multimerization)를 막는 전략이 Tie-2 신호전달기작을 막을 수 있는 방편이 될 수 있음을 시사하고 있다. 보고된 엔지오포이에틴과 Tie-2와의 결합 구조에 따르면, 엔지오포이에틴내의 Tie-2 결합부위를 확인할 수 있으며 Ang1 및 Ang2와 Tie-2간의 결합구조가 유사함을 확인할 수 있다 (Barton W.A. et al., Nat. Struct. Biol., 13:524, 2006). 따라서 본 연구진은 엔지오포이에틴, 특히 본 발명에서는 Ang2의 Tie-2 결합부위를 기존항체에 융합시킨 이중표적항체를 제작함으로써, 신생혈관형성을 효과적으로 억제하고자 하였다.

신생혈관형성에 관여하는 인자로는 혈관내피세포 성장인자 (VEGF), 상피 성장인자 (EGF), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 전환 성장인자 (TGFb), 섬유아세포 성장인자 (FGF) 등이 있으며 이중 내피세포 성장인자는 내피세포의 성장, 분화 이동에 직접적으로 관여하는 내피세포 특이적 인자로 4종의 상이한 이소형(VEGF165, VEGF121, VEGF189, VEGF206)이 존재하며 태반을 제외한 모든 인간조직에서 VEGF165가 가장 풍부한 이소형이다(Tisher et al., J Biol Chem, 266: 11947, 1991).

내피세포 성장인자 (VEGF)는 in situ에서 내피 전구체 (혈관 모세포)의 분화로부터의 새로운 혈관 형성을 조절하며, 배아조직(Breier et al., Development (Camb), 114:521, 1992), 대식세포, 상처치유 동안의 증식 상피 각질 세포(Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375, 1992) 에서 발현되고, 염증과 결부된 조직부종의 원인일 수 있다(Ferrara et al., Endocr. Rev., 13:18, 1992). In situ 하이브리다이제이션 연구에 의하면, 다형성 아교모세포종, 혈관모세포종, 중추신경계 신생물 및 에이즈-결부 카포시 육종 (Plate et al., nature 359:845,1992; Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993; Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153, 1993; Nakamura et al., AIDS Weekly. 13(1), 1992)을 포함하여 다수의 인간 종양주에서 VEGF가 고도로 발현된다는 것이 증명되었다. 고수준의 VEGF는 저산소증 유도혈관 신생에서도 관찰되었다(Shweiki et al., Nature 359:843, 1992).

VEGF의 생물학적 기능은 VEGF에 대하여 고친화성을 가지는 VEGF 수용체를 통하여 매게되는데, 상기 수용체는 배아형성(embryo유전자sis) 동안 (Millauer et al., Cell, 72: 835, 1993) 및 종양 형성 동안 내피세포에서 선택적으로 발현된다. 일반적으로 VEGF 수용체 (VEGFR)는 그의 아미노말단 세포외 수용체 리간드-결합 도메인에 여러 개, 일반적으로 5개 또는 7개의 면역글로불린 유사 루프를 가지는 것을 특징으로 하는 클래스 III 수용체형 타이로신키나제이다 (Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2027, 1993). 다른 두 부위는 키나제 인서트 도메인이라 칭해지는 가변성 길이의 친수성 인터키나제 서열의 삽입에 의해 중단되는 카르복시-말단 세포내 촉매 도메인 및 막통과 부위를 포함한다 (Terman et al., Oncogene, 6: 1677, 1991). VEGFR은 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2와 같은 다른 수용체도 VEGF에 결합할 수 있기는 하지만, fms-유사 타이로신 키나제 수용체 (flt-1), 또는 VEGFR-1(Shibuya et al., Onco유전자, 5: 519, 1990; WO 92/14248; Terman et al., Onco유전자, 6:1677, 1991) 및 키나제 인서트 도메인 포함 수용체/태아간 키나제(KDR/flk-1), 또는 VEGFR-2(Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026,1991)를 포함한다. 다른 타이로신 키나제 수용체인 VEGFR-3 (flt-4)는 VEGF 호몰로그인 VEGF-C 및 VEGF-D에 결합하며 림프관의 발달에서 중요한 역할을 한다.

고수준의 Flk-1은 신경아교종을 침윤하는 내피세포에 의해 발현된다. (Plate et al., Nature 359:845, 1992). Flk-1 수준은 인간 아교모세포종에 의해 생성되는 VEGF에 의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993). 아교모세포종 결부 내피세포 (GAEC) 에서 Flk-1이 고수준으로 발현된다는 사실은, Flk-1 전사체가 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에 수용체 활성이 아마도 종양 형성동안 유도된다는 것을 나타낸다. 이러한 상향조절은 종양에 매우 근접한 혈관내피세포에서만 발생한다. 중화 항-VEGF 모노클노날 항체(mAb)로 VEGF 활성을 차단하면 누드 생쥐에서 인간 종양이식편의 성장이 억제되는데(Kim et al., Nature 362: 841, 1993), 이는 종양 관련 혈관 신생에 있어서의 VEGF가 직접적인 역할을 한다는 것을 나타내는 것이다.

VEGF 리간드가 종양세포에서 상향조절되고, 그의 수용체가 종양 침윤 혈관내피세포에서 상향 조절되기는 하지만, 혈관 신생과 결부되지 않은 정상세포에서는 VEGF 리간드 및 그의 수용체의 발현은 낮다. 따라서 이러한 정상 세포는 VEGF와 그의 수용체 사이의 상호 작용을 차단하여 혈관 신생이 억제되게 되고, 따라서 종양성장이 일어나지 않는다.

고수준의 VEGFR-2는 신경교종에 침윤하는 내피세포에 의해 발현되며, 인간 아교모세포종에 의해 생성된 VEGF에의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993). VEGFR-2 전사체는 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에, 아교모세포종 관련 내피세포(GAEC)에서 고수준의 VEGFR-2 발현되는 것은 종양 형성 동안 수용체 활성이 유도된다는 것을 나타낸다.

VEGF는 다양한 유형의 종양에서 높은 수준으로 발현되고(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992; Dvorak et al., J. Exp. Med., 174:1275, 1991), 새롭게 생긴 모세혈관은 VEGF-생산성 종양 포 주위에 모여든다(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992). VEGF 발현은 빠르게 성장하는 종양과 연계된 것들처럼, 저산소증 조건하에서 강하게 상향-조절된다(Shweiki et al., Nature, 359:843, 1992). 아바스틴(Avastin)과 같은 항체에 의한 VEGF 중화는(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov., 3(5):391, 2004; Avery et al., Ophthalmology, 113(3):363, 2006) 암 또는 AMD와 같은 다른 혈관 신생 질환을 억제하기 위해 임상적으로 승인된 요법이다. 그러나, VEGF 차단에 대한 내성이 화학요법과 병용되는 경우에서조차 발견되었다. 이 내성은 리모델링된 맥관구조 및 다른 혈관신생 인자의 증가된 발현과 관련될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에는 암 및 혈관신생과 관련된 다른 질환을 억제하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

티로신 키나제 억제제(TKI) 및 항-KDRP 항체 둘 모두가 KDR-매개된 혈관신생을 억제할 수 있다 하더라도, 항체 접근은 TKI에 비해 장점을 갖는다. TKI와 대조적으로, 항-KDR 항체는 더 특이적인 KDR 표적제이다(즉, 항-KDR 항체는 다른 VEGF 수용체를 억제하지 않는다). 이러한 높은 특이성 때문에, 항-KDR 항체는 표적 이탈 효과(off-target effect) 및 덜 특이적인 TKI에 의해 야기된 독성을 제한하고/하거나 회피할 수 있다(Witte et al., Cancer Metastasis Rev., Jun;17(2):155, 1998).

단지 하나의 리간드(VEGF-A)와만 결합하는 아바스틴과는 달리, 항-KDR 항체는 모든 공지의 VEGF가 VEGFR2/KDR에 결합하는 것을 방지하는 것으로 예상된다. 항-KDR 항체는 단순히 VEGF-A를 차단하는 것 보다는 종양 혈관신생에 대해 더욱 강력한 억제 효과를 가질 수 있다. 항-KDR 항체를 이용한 요법이 아바스틴 내성의 경우에 효과적일 수 있다는 가능성이 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하였으며, 항체 말단에 Ang2의 Tie2 결합부위를 융합시켜 융합단백질을 제작함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 VEGFR2/KDR에 대한 향상된 결합력을 갖는 항체 말단에 수용성 리간드인 Tie-2 결합 단백질 도메인이 융합된 형태의 융합단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 Tie-2 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로,

상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와 병용투여하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 VEGFR2/KDR, Tie2를 동시에 표적하는 융합단백질로, 기존의 VEGFR2/KDR를 표적으로 하는 항체보다 친화도가 향상된 항체를 포함함으로써, 종양을 치료하는데 있어서 기존의 치료제보다 더 효능이 좋은 병용 치료 및 단독 치료법을 제공할 수 있다. VEGFR2/KDR에의 향상된 결합력을 나타내어, 목적하는 암/종양 또는 혈관신생 저해제 관련된 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, Ang2에 의한 Tie2의 활성을 동시에 저해함으로써, 단독처리 보다 우수한 신생혈관저해 능력을 갖는다.

도 1은 6A6의 중쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 2는 6A6의 경쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 3은 성장조절인자에 의해 성장이 유도된 HUVEC세포에서 항체의 활성을 보여주는 결과이다.
도 4는 선별된 융합단백질의 물성(aggregation tendency)이 개선되었음을 보여주는 결과이다.
도 5은 선별된 융합단백질의 결합력을 SPR로 확인한 결과이다.
도 6은 성장조절인자에 의해 HUVEC세포의 이동을 저해할 수 있음을 확인한 결과이다.
도 7은 선별된 융합단백질의 항암 효능을 인간 HCC 모델 (Human HCC model)에서 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 Tie-2 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

본 발명에 따른 융합단백질 중 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 완전인간화 항체의 개량 항체이다. 특히, 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 (등록특허 10-0883430)의 개량 항체이다.

본 출원의 발명자들은 완전인간항체 라이브러리로부터 발명되었으며, VEGFR-2/KDR을 표적으로 하면서 동시에 마우스나 렛트 유래의 flk-1(VEGFR-2 상동체)에 대해서도 반응성을 가지는 유일한 항체를 개량하였다. 해당 항체는 임상시험을 통하여 그 우수성이 입증되었으나, 항체 단백질의 항원에 대한 결합력이 다소 낮은편이며, 생체내 반감기가 짧다. 이를 개량하여 면역항암제로써의 효능 증대, 혈관신생과 관련된 질환들에서의 효능 증대가 예상된다.

기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하였다. 그 결과, 본 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체보다 높은 결합력을 가지며, 세포내 효능이 더 좋은 항체를 개발하여, 항체가 목적하는 면역항암제 또는 혈관신생과 관련된 질병의 치료제로써의 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

상기 개량 항체는 다음과 같은 방법으로 스크리닝하였다. 먼저 6A6의 CDR 영역 서열과 프레임워크(frame work: FR) 서열을 확인하고, CDR grafting 기법을 사용하여, 중쇄 CDR 서열을 human germline VH3 서열에 이식하고, 경쇄 CDR 서열을 human germline VK1에 이식하였다.

CDR grafting(이식)이란 일반적으로 마우스 단클론 항체의 가변부위 서열을 암호화 하는 DNA를 분리하고 유전자 클로닝을 통하여 CDR 서열을 확보한 다음 in silico 상으로 적합한 인간항체 서열 안으로 CDR 서열을 이식하여 만드는 방법이다(Hou S, et al. Humanization of an anti-CD34 monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based on computer-assisted molecular modelling. J Biochem. 2008;144(1):115-20; 및 Kashmiri SV, De Pascalis R, Gonzales NR, Schlom J. SDR grafting--a new approach to antibody humanization. Methods. 2005;36(1):25-34). 위의 방법을 활용하여 human germline VH1/VL1을 갖는 6A6의 프레임워크를 human germline VH3/VK1으로 치환하였다.

상기 치환된 항체의 친화도를 향상시키기 위하여, 경쇄와 중쇄의 CDR3 염기서열에 돌연별이를 유도하는 라이브러리를 구축하고, 재조합 KDR D1~D3-Fc 융합 단백질을 이용하여, 항체를 스크리닝하였다. 항체 스크리닝은 파아지 디스플레이를 사용하여 스크리닝 하였다.

이를 바탕으로, 본 발명은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명의 융합단백질은 VEGFR2/KDR 및 Tie2 각각에 특이적으로 결합할 수 있다. "이특이적" 또는 "이중특이적"은 2개의 상이한 타겟에 특이적으로 결합하여 타겟의 활성을 조절할 수 있는 결합 단백질의 특성으로, 예를 들어 각 타겟에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단백질, 또는 이의 단편에 의해 제조될 수 있으며, 2개의 구분된 항원 결합 암 (arm: 2개 타겟에 대한 특이성)을 보유하고, 이에 결합하는 각각의 항원에 대하여 1가이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항-VEGFR2/KDR 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 단클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 영역은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 본 발명은 서열번호 3의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

본 발명에 있어, 상기 VEGFR2/KDR 및 Tie2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다. 각 가변 영역은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 영역과 1개의 경쇄 가변 영역이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

VEGFR2/KDR 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10^-6M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9M 내지 10^-10 M, 10^-5M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

본 발명은 서열번호 8의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 10의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 8의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

상기 상동성은 청구된 서열번호의 서열 전체와 비교하여 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명은 명세서 중 기재된 융합단백질의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합단백질의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 융합단백질은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

상기 Tie-2 결합 단백질 도메인은 Tie-2에 결합하는 단백질 도메인으로 Ang2의 Tie2 결합부위를 포함한다. 예를 들어, 인간 Ang2의 F278~F496 잔기를 포함할 수 있으며 서열번호 18의 서열을 포함할 수 있다.

상기 Tie-2 결합 단백질 도메인은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체의 말단 예를 들어 중쇄 말단, 구체적으로 중쇄 C 말단에 결합할 수 있다.

한국등록특허 제10-1224468호에 VEGFR2/KDR 및 Tie-2 결합 단백질 도메인을 포함하는 DIG 0001 물질이 기재되어 있으나, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체를 포함하고, 항-VEGFR2(KDR) 항체의 C-말단에 Tie-2 결합 단백질 도메인(hAng2 F278~F496)이 결합되어, 차이가 있다.

상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 Tie-2 결합 단백질 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n 또는 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 9의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 Tie-2 결합 단백질 도메인을 코딩하는 서열번호 17의 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산을 분리하여 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 융합단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 융합단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질을 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 융합단백질의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

상기 융합단백질 중 포함된 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 혈관신생은 이전에 존재한 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 의미하며, "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 융합단백질로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 당뇨병성 족부궤양(diabetic Foot Ulcers), 만성 신부전 (chronic kidney failure), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases), 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 패혈증(sepsis), 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 융합단백질을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 융합단백질을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 융합단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 종양 또는 암환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 융합단백질의 기작 방해 용도 및 이를 통한 종양 또는 암의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.

치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 융합단백질을 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.

본 발명은 예를 들어, 상기 융합단백질의 치료적 유효량을 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환의 치료방법이 제공된다. 상기 혈관신생 질환의 치료는 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 융합단백질의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물, 또는 상기 혈관신생 질환의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 여기에 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내 융합단백질의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 융합단백질의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 ㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물은 다른 혈관신생 저해제 관련된 질병의 치료제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 융합단백질을 포함하는 약학 조성물은 융합단백질을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 융합단백질을 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. (공개특허 10-2015-0089329) 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

또한, 본 발명의 융합단백질은 다른 제제, 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 이러한 관점에서 상기 융합단백질을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.

상기 다른 혈관신생 질환 치료제는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다. 이를 통해 서로의 저항성을 극복시키고 효능을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에서 다른 혈관신생 질환 치료제와 병용 투여되는 경우 융합단백질과 다른 혈관신생 질환 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 대상체에게 투여한 후, 활성 성분으로서 융합단백질을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하거나, 상기 조성물을 대상체에게 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 상기 대상체에게 투여한다. 경우에 따라서, 상기 조성물을 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물과 동시에 대상체에게 투여할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. CDR grafting(이식)

6A6의 CDR 서열을 Kabat 넘버링, IMGT 프로그램을 통하여 확인하고, 이를 Hunam germline VH3/VK1에 이식하는 클로닝을 수행하였다. 도 1에 중쇄 CDR 이식 서열을 표기하였으며, 도 2에 경쇄 CDR 이식 서열을 표기하였다.

실시예 2. 친화도 증진을 위한 변이체 제작 및 선별

CDR grafting된 항체의 친화도 증진을 위한 최적화를 수행하였다. 경쇄와 중쇄의 CDR3의 원래 DNA 서열을 70% 보존하며 랜덤화(randomize)시키는 소프트-랜덤화(soft-randomization)법을 활용하여, 경쇄 CDR3와 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입한 프라이머를 제작하였다. 이를 사용한 PCR을 통해 변이가 도입된 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역 코딩 DNA 단편을 확보하였다. 이 DNA 단편을 각각 scFv 파지 파지미드의 경쇄 가변영역 및 scFv 파지 파지미드의 중쇄 가변영역과 치환하여, 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리와 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 각각 제작하였다.

변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 페놀-클로로포름 정제 후 전기천공법을 사용하여 대장균주 XL-1 Blue에 형질전환 하였다. 형질전환 효율 분석 및, DNA 서열 분석을 통해 다양성이 확보된 것을 확인한 후, 500 ml 규모로 배양하여 파지 발현을 유도하고, PEG-침전법을 이용하여 경쇄와 중쇄의 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리 제작하였다.

각 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 바이오패닝을 실시하였다. 96-웰 면역 플레이트에 항원 (KDR1~3 domian-Fc)을 2 mg/㎖로 100 ml씩 웰에 넣고 4℃ 오버나이트 (overnight) 시켰다. 다음날 항원 코팅 플레이트 (coating plate)는 PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱한 후 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200 ml를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 2x YT-TET(tetracycline 10㎍/㎖) 성장 배지 (growth medium) 2ml에 XL1-Blue 스톡 (stock) 50 ml를 넣고 37 ℃, 200 rpm에서 2시간 정도 키운 후 13 ml를 더 첨가하여 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 키워주었다. 차단 (blocking) 2시간이 지나면 1X PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱하였다. 워싱한 각 웰에 변이체 라이브러리를 와 4% BSA를 동일한 양으로 섞은 후 200 ml씩 첨가하여 실온에서 30분간 로킹(rocking)한 후 2시간을 반응시켰다. 파지 라이브러리 반응이 끝나면 상층액은 버리고 0.1% PBST로 5번 워싱하고 PBS로 5번 워싱하였다. 각 웰에 100 mM TEA(trimethylamine) 100ml를 넣은 후 실온에서 10분간 흔들어 주었다. 10분 지나면 각 웰에 1M Tris(pH 7.5) 50 ml를 넣고 섞어주었다. 상등액 (supernatant)은 OD₆₀₀ 0.5가 된 XL1-blue 10ml에 넣어 37℃에서 30분간 감염 (infection)시켰다. 감염이 끝나면 100 ml는 아웃풋 타이터 (output titer)로 사용하고 나머지는 6,000 rpm, 10분간 원심분리 하였다. 상층액은 버리고 침전물은 라지 스퀘어 플레이트 (large square plate: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose)에 스프레딩 (spreading)하여 37℃에서 오버나이트 인큐베이션 (overningt incubation) 하였다. 아웃풋 타이터로 남겨둔 100ml는 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석 (dilution)하여 CM 플레이트에 스프레딩하여 37℃에서 오버나이트하였다. 다음날 스퀘어 플레이트에 자란 콜로니 (colony)는 2x YT 배지 50ml을 넣은 후 룹 (loop)을 사용하여 긁어 모은 후 6000 rpm, 10분 원심분리하여 상층액은 버리고 침전액 (precipitate)에 대하여 1차 패닝 스톡 (panning stock)을 만들고 2x YT 배양 배지 (growth media: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose) 100 ml을 500 ml 삼각플라스크에 넣은 후 OD₆₀₀ 0.2 되게 세포를 넣고 200 rpm, 37℃에서 OD 0.5가 될 때까지 키워주었다. OD₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 세포를 배양한 후에 헬퍼 파지 (helper phage: M13KO7 mutant)을 세포의 20배가 되게 넣어주었다. 헬퍼 파지를 넣고 37℃, 30분 감염 (infection)시킨 후 6000 rpm, 10 min 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 세포는 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + Kan. 70㎍/㎖ + 1mM IPTG + 5mM MgCl₂) 100ml로 교체하여 넣어준 후 200 rpm, 30℃, 오버나이트하였다. 다음날 자란 세포는 7000 rpm, 10분, 원심분리하고 같은 방법으로 한번 더 원심분리하였다. 모은 상층액은 상층액의 1/5 (v/v) 20% PEG/2.5m NaCl 를 넣고 아이스 (ice)에서 1시간 침전시켰다. 침전시킨 후 9000 rpm, 1시간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 PBS 5ml로 침전액 (precipitate)을 풀어준 후 0.45 mm 필터 (filter)에 여과한 후 4℃에 보관하여 이를 다음 번 패닝 (panning) 과정에서 사용하였다. 이 과정을 3~4번 반복하여 항원에 결합하는 항체를 ELISA를 수행하여 확인하였다.

그 후 선별과정에서는 결합을 유지하는 능력의 정량적 평가지표로서 scFv의 해리 속도 상수 K_dis를 측정하였다.

실시예 3. 항원에 대한 고친화력을 가진 항체선별 (Off-rate screening)

선별된 항체의 항원에 대한 결합력을 Octet (Fortebio)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 KDR1~3 domain을 바이오센서 (biosensor)에 고정 (immobilize)한 후 scFv 형태로 발현된 후보항체를 넣고 결합시킨 후, 해리 속도 상수를 측정하였다. 선별된 최적화 클론 5종에 대한 해리 속도 상수 측정 결과 [표 1] 를 도시하였다.

[표 1] 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 해리속도 상수

실시예 4. 융합단백질 제작

융합단백질 제작을 위하여 선별한 scFv 파지항체를 IgG형태로 전환하였다. IgG형태 전환은 분자생물학적 기법을 사용하여 수행하였다. 선별한 E. Coli 클론에서 파지미드 (Phagemid)를 추출, PCR기법을 사용하여 가변영역을 증폭하였다. 증폭한 중쇄 가변영역을 중쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfusess-hchg1)에 삽입하고, 증폭한 경쇄 가변영역은 경쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfuse2ss-hclk)에 삽입하여, IgG 형태의 DNA 클로닝을 완료하여, IgG1 형태로 전환하였다. 위의 전환된 중쇄불변영역의 C-말단에 Linker(G4S서열)를 포함한 Tie2 결합 도메인(hAng2 단백질의 276번 아미노산부터 496번 아미노산까지)을 유전자 합성하여 융합하였다. 위의 융합단백질 중 포함된 항-VEGFR2/KDR 항체들을 임시발현하여, 가장 발현이 안정적으로 유도되는 항체로 LHL-G1을 선별하였다. 선별된 항체의 염기서열은 [표 2, 3]에 나타내었다.

[표 2] 선별된 항체의 CDR 서열

[표 3] 선별된 항체의 서열

실시예 5. 융합단백질 발현

IgG 형태의 일시 발현은 Expi293F 발현 시스템 키트 (Expi293F expression system kit: Thermo Fisher Scientific, US)을 사용하였다. Kit에 포함된 Expi293 세포를 전용 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 125 rpm 오비탈 쉐이커 상 부유배양 하였다. 3일마다 3 X 10⁵ cells/ml 되도록 계대배양 하였으며, 발현 벡터 도입시에는 3 X 10⁶ cells/ml 되도록 세포수를 조정 한 후 사용하였다. 유전자 도입은 전용 시약인 Expifectamine을 사용하였으며, 세포현탁액 1 ml 당 발현 벡터 DNA 1 mg과 Expifectamine 2.7 μl을 함유하는 Lipid-DNA 복합체를 제작, 세포현탁액에 첨가하였으며, 도입 16-18시간 후 인헨서 (Enhancer) 1/2를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이후 동일 조건에서 3-4일간 배양 후 원심분리하여 IgG 함유 상등액을 취하였다.

실시예 6. 융합단백질의 정제

취득한 상등액을 Protein A 컬럼(GE Healthcare)에 주입하여 친화력 크로마토그래피를 통해 IgG를 정제하였다. 컬럼을 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0)으로 평형화 시킨 후 상등액을 주입, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) 용액으로 세정한 후, 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5)로 용출 후 1 M Tris로 중화하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US)를 사용한 투석 과정을 통해 PBS로 용매를 교체하였다. 이후 Vivaspin (Satorius, DE)을 사용하여 필요 농도로 농축하여 분주 후 -80℃에서 보관하였다.

실시예 7. 융합단백질의 결합 특이성 분석

선별된 융합단백질의 항원에 대한 결합력을 SPR(Biacore T200, Cytiva)를 사용하여 측정하였다. 융합단백질을 capture하고 항원단백질을 analyte로 사용하여 분석하였다. Human antibody capture kit를 사용하여, manufacturer's instruction에 따라, CM5 chip 표면에 anti-Human IgG(Fc) antibody를 고정하였다. 위의 senser chip에 융합단백질을 2ug/ml 농도로 PBS-P running buffer에 희석하여 10ul/min 유속으로 주입하여 180~190 RU에 도달하도록 한다. 항원을 농도별로 PBS-P running buffer에 희석하여 30ul/min 유속으로 3분간 주입하고, 해리 시간은 5분으로 분석하였다. 매 cycle마다 결합되어 있는 융합단백질을 제거하기 위해 regeneration solution(3M MgCl₂)을 30ul/min 유속으로 1분 동안 주입하였다. 실험 결과는 BIA evalution software version 1.0의 1:1 binding model을 이용하여 산출하였다. [표 4]에 결합력을 나타내었으며, 도 5에 SPR sensergram을 나타내었다.

[표 4] 항원에 특이적으로 결합하는 융합단백질의 결합력

* 6A6xTie2는 한국등록특허 제10-1224468호의 DIG 0001 물질에 해당함

[표 5]

실시예 8. 융합단백질의 중화능력 확인 (HUVEC viability assay)

융합단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. HUVEC은 Lonza (cat# C2519A)사에서 구매한 세포를 사용하였으며, VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) 배지를 사용하여, 2% gelatin 이 coating된 plate에서 culture한다. Culture 는 37 ℃, 5% Co2 incubator 에서 수행한다. assay에는 passage 10 이내의 세포를 사용하며, 0.5% heat inactivated FBS가 포함된 M199 medium(Gibco, cat#11043-023)으로 96well plate에서 well 당 1X10⁴ cells 을 이용하여 수행하였다. Assay는 여러 농도로 희석된 융합단백질을 assay plate에 먼저 처리한 후에 세포를 well 마다 1X10⁴ cells을 넣어 준 후, 30분간 incubator에서 배양한다. 30분간의 배양 후, VEGF165(R&D, cat#293-VE) 30 ng/mL 또는 Ang1(R&D, cat#923-AN/CF) 200 ng/mL의 농도로 well 마다 처리하였다. 3일간 37℃ CO₂ incubator에서 배양한 후 viability를 측정하였다. Viability는 promega사의 CellTier Glo-Luminescent Cell viability Assay Kit (cat no. G7571)를 사용하여 살아 있는 세포내의 ATP를 정량하였다(도 3). 도 3에서 보여지듯이 선별된 융합단백질은 VEGF165에의한 효능을 농도별로 저해 하였으며, VEGF165와 Ang1을 동시에 처리한 군에서도 대조군 대비 우수한 저해 능력을 나타내었다.

실시예 9. 융합단백질의 열안정성 확인

선별된 후보 융합단백질의 열안정성을 Optim 1000(Pall corporation)를 이용하여 측정하였다. 열안정성 확인을 위하여 Tagg (aggregation initiation temperature)과 Tm (transition temperature)을 측정하였다. Tagg는 침전이 발생하기 시작하는 온도를 나타내는 지표로 콜로이드 안정성을 측정하는 것으로, 구체적으로는 266nm와 473nm 파장을 이용하여 온도가 올라가면서 입자의 크기가 커지는 것을 측정하였다. Tm은 단백질이 구조가 변형되는 온도를 측정하는 것으로 단백질 내부에 존재하는 트립토판이 외부에 노출되는 정도를 측정하는 것이다. 분석 결과는 표 6에 나타내었다. [표 6] 확인 결과 LHL-G1, LHL-G1xTie2 모두 6A6, 6A6xTie2 보다 개선된 열 안정성을 갖는다.

[표 6] 선별된 융합단백질의 열안정성

실시예 10. HPLC-SEC (Aggregate의 확인)

후보 융합단백질의 Aggregate분석은 Potein A affinity column으로 정제된 시료를 사용하여 분석하였으며, Waters alliance e2695(UV/Vis detector 2489) 장비를 사용하여 Size exclusion chromatography (SEC)를 수행하였다. 분석결과 Main peak의 %가 개선된 것이 확인되며, Main peak 이외에 Low molecular weight(LMW)와 High molecular weight(HMW) 모두 감소하여, Aggregate가 5% 이하로 개선되었음을 확인하였다(도 4).

실시예 11. VEGF165와 Angiopoietin1에 의해 유도되는 혈관내피세포의 이동 분석 (HUVEC migration assay)

선별된 후보 융합단백질의 혈관내피세포에서의 이동 억제 효능을 확인하기위하여 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell, 인간탯줄 정맥 내피세포)를 사용하였으며, 세포의 이동은 현미경 촬영 후 Image J 소프트웨어를 사용하여 이동면적을 수치화 하였다.(도 6). HUVEC은 Lonza (cat# C2519A)사에서 구매한 세포를 사용하였으며, VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) 배지를 사용하여, 2% gelatin 이 coating된 plate에서 culture한다. Culture 는 37℃, 5% Co2 incubator 에서 수행한다. Assay 하루 전에 0.5% heat inactivated FBS가 포함된 M199 medium(Gibco, cat#11043-023)으로 배지를 교체하여, overnight serum starvation을 수행한다. 융합단백질과 Growth factor (VEGF165 30ng/mL, Ang1 200ng/mL)는 0.5% heat inactivated FBS가 포함된 M199 medium로 희석하여 준비한다. Transwell(Costar, cat#3422)의 바닥에 0.2% gelatin을 이용하여 coating한후 dry한다. Transwell의 bottom well(24well)에 융합단백질과 Growth factor를 처리하고, Coating된 Transwell 내부에 serum stravation된 HUVEC세포를 1x10^5 개수로 넣고, 37℃ CO₂ 인규베이터에서 3시간 반응한 후, 0.5% crystal violet 용액에 담가 세포를 염색한다. Transwell내부의 세포는 제거하고, 염색된 이동 세포를 현미경으로 촬영한다. 현미경 촬영 후, Image J 소프트웨어를 사용하여 염색된 세포의 면적을 수치화 하였다. 분석 결과 6A6xTie2 보다 더 좋은 이동 억제 효능을 확인하였다.

실시예 12. Human HCC model에서의 항암효과 확인 시험

HCC70 세포(인간 유방암, ATCC, CRL-2315, 58033362)는 10% FBS, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지를 사용하여, 37℃ CO2 incubator에서 배양하여 준비한다. 종양 세포는 매주 1회 정기적으로 계대 배양하여 준비하고, SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.2mL 혼합물(기본 배지: Matrigel=100μL: 100μL)에 5 X 10^6 HCC70 세포를 피하 접종하였다. 평균 종양의 크기가 181.1 mm3에 도달했을 때 융합단백질 투여를 시작하였다. 일주일에 두번 2주간 총4회의 융합단백질을 i.v. injection하였으며, 총 21일을 관찰하였다. 관찰된 종양의 크기를 측정하여 종양 성장 억제(TGI)값을 계산하였다. TGI(%)계산 수식은 아래와 같다.

TGI(%) = (1 - (TVTreatment/Dn - VTreatment/D1)/ (TVControl/Dn - TVControl/D1)) X 100%.

Vehicle 및 처리 그룹 간의 종양 부피를 비교하기 위해 일원 ANOVA 및 T-TEST를 수행했다. 투여 기간 및 모니터링 기간 동안 각 그룹의 종양 성장 곡선은 (도 7)에 나타내었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Pharmabcine Inc. <120> Fusion Protein Comprising Modified Anti-VEGFR2(KDR) Antibody and Use Thereof <130> P21-B272 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR3 <400> 3 Ala Arg Ser Tyr Arg Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR1 <400> 4 Asn Leu Gly Asp Val Asn 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR2 <400> 5 Tyr Asp Ala 1 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR3 <400> 6 Gln Ala Pro Thr Thr Asn Glu Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 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tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggata caccttcagc agctactgga tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gcctcgaatg ggtgtcagag attaatcctg gcaacggtca tactaactac 180 aacgagaagt tcaagtcacg gttcaccatc tccagagaca agtccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacattgg 300 ggcccgagtc ttacttctcc ctttgactac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tcc 363 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 33 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcagataa ccttggagat gtaaatgtac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gatgccgacc ggccctcagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtaattc tgggaatgat gccactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaagca ccaacaaaca acgatcctta taccttcggc 300 cagggcacca aggtggaaat caagcggacc 330 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Asn Ser Gly Asn Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Pro Thr Asn Asn Asp Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 35 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain <400> 35 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 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Gly Leu Thr Gly 115 120 125 Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser 130 135 140 Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met 145 150 155 160 Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn 165 170 175 Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile 180 185 190 Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr 195 200 205 Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 225 230 235 240 Val Ser Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asp Asn Leu 245 250 255 Gly Asp Val Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro 260 265 270 Val Leu Val Met Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu 275 280 285 Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser 290 295 300 Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp 305 310 315 320 Arg Thr Ser Glu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 325 330 335 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 340 345 350 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 355 360 365 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 370 375 380 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 385 390 395 400 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 405 410 415 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 435 440

Claims

VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 Tie-2 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로,
상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체는 서열번호 8의 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 Tie-2 결합 단백질 도메인은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체의 중쇄 C 말단에 결합하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 Tie-2 결합 단백질 도메인은 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 링커는 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 융합단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
제6항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
제7항의 발현벡터를 포함하는, 형질전환 세포.
다음 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법:
(a) 제8항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와의 병용투여용 조성물.