KR20230109854A

KR20230109854A - 항-vegfr2(kdr) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230109854A
Application number: KR1020220005625A
Authority: KR
Inventors: 남주령; 이영애; 이원섭; 유진산
Original assignee: 주식회사 파멥신
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-21
Also published as: WO2023136648A1

Abstract

본 발명은 향상된 특성을 나타내는 항-VEGFR2(KDR) 개량 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체의 말단에 DLL4 (Delta-like ligand 4) 결합 단백질 도메인을 결합한 융합단백질, 상기 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성(angiogenesis)과 관련된 질환의 진단 또는 치료용 조성물, 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 융합단백질 이외의 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

항-VEGFR2(KDR) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 {Fusion Protein Comprising Modified Anti-VEGFR2(KDR) Antibody and Use Thereof}

VEGFR2/KDR는 일차적인 혈관신생 수용체이며, VEGF 이소형인 A, C, D 및 E와 결합하고, 내피 세포 분화뿐만 아니라 VEGF의 미토겐성, 혈관신생성 및 침투성-강화 효과에 중요하다. 항-VEGFR2 항체는 공지된 모든 VEGF 이소형이 VEGFR2/KDR에 결합하여 시그널링을 시작하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 종양은 더 많은 수의 VEGF를 분비하는 반면, 수용체의 수는 상대적으로 일정하게 유지되기 때문에, 수용체를 표적하는 것은 아주 높은 수준의 VEGF 이소형의 존재하에서 조차 완전하게 시그널링을 억제하는 확률을 증가시킨다.

신생혈관형성 (angiogenesis)이라 함은 내피세포의 성장, 분열, 이동 등에 의하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 것을 의미하며, 성인에서는 상처의 치료, 여성의 생식사이클 등의 특별한 경우를 제외하고는 발생하지 않는다. 그러나 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성 (age-related macular denaturation), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 건선 (psoriasis) 및 만성 염증(chronic inflammation)등과 같은 질병에서 과도한 신생혈관의 형성이 보고 되어 있으며 (Cameliet andJain, Nature, 407:249, 2000), 이러한 이유로 신생혈관 억제제를 이용하여 질병치료 특히 종양의 치료를 하고자 하는 노력이 많이 기울어지고 있다.

1971년 Dr. J. Folkman에 의해, 종양의 성장과 전이는 신생혈관형성 의존적이고, 따라서 항 신생혈관형성에 초점을 맞춘 치료법은 고형암에 대한 새로운 치료제가 될 수 있을 것이라는 가설이 제기된 이후, 과도한 신생혈관형성 기작의 억제와 관련된 연구는 다수 연구진들의 관심을 끌어왔다 (Ferrara and Kerbel, Nature, 435:967, 2005). 신생혈관형성 과정의 진행양상은 신생혈관형성 유발 인자들과 신생혈관형성 저해 인자들의 종합적인 밸런스에 의해서 결정되며, 여러 단계의 복잡하고 순차적인 과정에 의해서 진행된다. 그 과정을 살펴보면, 우선 종양이나 상처 난 조직에서 분비되는 혈관내피성장인자 (Vasicular Endothelial Growth Factor, VEGF)를 비롯한 다양한 신생혈관형성 유발 인자들이 주변에 있는 기존 혈관내피세포의 해당 수용체에 결합함으로써, 혈관내피세포들을 활성화시켜 혈관내피세포들의 투과성을 증가시키게 되고, 기저막 단백분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP)와 같은 단백질 분해효소를 분비함으로써, 혈관내피세포 주변의 기저막과 세포외기질을 분해시켜, 혈관내피세포들이 기존의 모세혈관으로부터 벗어나 신생혈관형성 유발 인자를 분비하는 조직을 향해 이동·증식하게 된다. 이동·증식한 혈관내피세포들은 혈관 내 튜브 구조를 이루고, 마지막으로 혈관내피세포의 구조적 지지대인 혈관주위세포 (pericyte)가 유입되면서 안정하고 성숙한 혈관형성이 이루어지게 된다.

위의 혈관형성과정중 정상적 혈관튜브형성을 이루는 주요 인자중 하나가 DLL4이다. DLL4는 VEGF에 의해 특이적으로 유도되며, Notch 수용체에 작용하여 혈관신생성 발아를 적절하게 조절하는 역할을 담당한다. DLL4를 차단하면 혈관신생 부위 말단의 세포에서 외측 억제(lateral inhibition)의 결실이 나타나서 과도한 발아가 이루어진다. 그 결과로 지나치게 많으면서도 생산성은 떨어지는 혈관신생 반응이 높아지며 산소를 공급하는 관류가 나빠져서 암의 주변에 저산소 상태를 유도한다고 한다. 암 실험모델에서 DLL4 신호전달의 활성화는 혈관신생을 향상시킨 반면에 억제하면 암의 성장이 저해되는 것으로 나타났다(Lobov IB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 27;104(9):3219-24).

상기 DLL4는 Notch 수용체에 대한 리간드 중 하나로, 포유동물에는 현재까지 4 종류의 Notch 수용체(Notch1~4)와 5 종류의 Notch 리간드(Jagged-1, Jagged-2, DLL1, DLL3, DLL4)가 존재하는 것으로 알려져 있으며, Notch 신호전달체계의 경우 한 세포의 Notch 리간드가 다른 세포의 Notch 수용체에 결합함으로 시작되는데, 반드시 서로 다른 세포간의 직접적인 상호작용을 통해서만 활성화된다 (Bray SJ, Nat Rev Mol Cell Biol ., 7(9):678, 2006).

Notch 리간드가 Notch 수용체에 결합하면 우선 ADAM 메탈로프로테아제 (ADAM metalloprotease)가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 바깥쪽 근접부위가 끊어지고, 이어 감마-세크레타제 (gamma-secretase) 복합체가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 안쪽 근접부위를 끊어 NICD(Notch Intracellular Domain)가 유리되고, NICD는 핵으로 이동, RBPJ/CSL 전사 인자 (transcription factor)와 결합하여 Hes, Hey 같은 염기성 헬릭스-룹-헬릭스 (basic helix-loop-helix) 단백질 등의 Notch 타겟 유전자의 발현을 유도한다. 이처럼 Notch 신호전달체계는 해당 세포가 처한 상황에 따라 증식/분화/자멸(apoptosis) 등의 운명을 결정하며, 정상 줄기세포 및 암 줄기세포의 유지에도 중요한 역할을 한다.

기본적으로 모든 Notch 수용체가 모든 Notch 리간드와 결합할 수 있지만, 이러한 다양한 결합의 조합은 해당 세포들이 처한 미세환경에서 선택적으로 조절된다. 예를 들어 DLL4는 태아발달 과정에서 혈관신생 시 내피세포에 강하게 발현되며, 주변 내피세포에 발현되는 Notch1과 Notch4와 결합하지만, 이 중 DLL4-Notch1 결합이 배타적으로 가장 중요하며(Yan M, Vasc Cell, 2011), 이 결합을 통해 혈관신생이 진행된다. 이러한 사실은 유전자결핍실험 등을 통해 잘 밝혀져 있다 (Duarte et al ., Genes Dev , 2004; Gale et al ., PNAS, 2004; Krebs et al ., Genes Dev, 2004).

따라서, DLL4-Notch1 결합을 저해한다면 혈관신생을 억제할 수 있으며, 이에 따라 종양 등의 다양한 질환을 치료할 수 있다. 이미 암치료에 있어 Avastin(bevacizumab) 등을 이용해 VEGF를 억제하면 혈관형성이 억제되어 종양의 관류 (perfusion)가 감소함에 따라 종양 크기가 줄어드는 한편, DLL4를 표적으로 하여 주변 세포에서 발현되는 Notch1 과의 결합을 억제하면 혈관들이 비정상적으로 많이 생성(hypersprouting)되지만 온전한 기능을 수행하지 못해(non-functional) 종양의 관류가 감소하고, 결과적으로 종양 크기가 줄어든다(Thurston et al ,, Nat Rev Cancer , 7(5):327, 2007)는 점이 입증되어 있다.

따라서, 본 연구진은 Notch1, 특히 본 발명에서는 Notch1의 DLL4 결합부위를 기존항체에 융합시킨 이중표적항체를 제작함으로써, 신생혈관형성을 효과적으로 억제하고자 하였다.

신생혈관형성에 관여하는 인자로는 혈관내피세포 성장인자 (VEGF), 상피 성장인자 (EGF), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 전환 성장인자 (TGFb), 섬유아세포 성장인자 (FGF) 등이 있으며 이중 내피세포 성장인자는 내피세포의 성장, 분화 이동에 직접적으로 관여하는 내피세포 특이적 인자로 4종의 상이한 이소형(VEGF165, VEGF121, VEGF189, VEGF206)이 존재하며 태반을 제외한 모든 인간조직에서 VEGF165가 가장 풍부한 이소형이다(Tisher et al., J Biol Chem, 266: 11947, 1991).

내피세포성장인자 (VEGF)는 in situ에서 내피 전구체 (혈관 모세포)의 분화로부터의 새로운 혈관 형성을 조절하며, 배아조직(Breier et al., Development (Camb), 114:521, 1992), 대식세포, 상처치유 동안의 증식 상피 각질 세포(Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375, 1992) 에서 발현되고, 염증과 결부된 조직부종의 원인일 수 있다(Ferrara et al., Endocr. Rev., 13:18, 1992). In situ 하이브리다이제이션 연구에 의하면, 다형성 아교모세포종, 혈관모세포종, 중추신경계 신생물 및 에이즈-결부 카포시 육종 (Plate et al., nature 359:845,1992; Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993; Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153, 1993; Nakamura et al., AIDS Weekly. 13(1), 1992)을 포함하여 다수의 인간 종양주에서 VEGF가 고도로 발현된다는 것이 증명되었다. 고수준의 VEGF는 저산소증 유도혈관 신생에서도 관찰되었다(Shweiki et al., Nature 359:843, 1992).

VEGF의 생물학적 기능은 VEGF에 대하여 고친화성을 가지는 VEGF 수용체를 통하여 매개되는데, 상기 수용체는 배아형성(embryo유전자sis) 동안 (Millauer et al., Cell, 72: 835, 1993) 및 종양 형성 동안 내피세포에서 선택적으로 발현된다. 일반적으로 VEGF 수용체 (VEGFR)는 그의 아미노말단 세포외 수용체 리간드-결합 도메인에 여러 개, 일반적으로 5개 또는 7개의 면역글로불린 유사 루프를 가지는 것을 특징으로 하는 클래스 III 수용체형 타이로신키나제이다 (Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2027, 1993). 다른 두 부위는 키나제 인서트 도메인이라 칭해지는 가변성 길이의 친수성 인터키나제 서열의 삽입에 의해 중단되는 카르복시-말단 세포내 촉매 도메인 및 막통과 부위를 포함한다 (Terman et al., Oncogene, 6: 1677, 1991). VEGFR은 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2와 같은 다른 수용체도 VEGF에 결합할 수 있기는 하지만, fms-유사 타이로신 키나제 수용체 (flt-1), 또는 VEGFR-1(Shibuya et al., Onco유전자, 5: 519, 1990; WO 92/14248; Terman et al., Onco유전자, 6:1677, 1991) 및 키나제 인서트 도메인 포함 수용체/태아간 키나제(KDR/flk-1), 또는 VEGFR-2(Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026,1991)를 포함한다. 다른 타이로신 키나제 수용체인 VEGFR-3 (flt-4)는 VEGF 호몰로그인 VEGF-C 및 VEGF-D에 결합하며 림프관의 발달에서 중요한 역할을 한다.

고수준의 Flk-1은 신경아교종을 침윤하는 내피세포에 의해 발현된다. (Plate et al., Nature 359:845, 1992). Flk-1 수준은 인간 아교모세포종에 의해 생성되는 VEGF에 의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993). 아교모세포종결부 내피세포 (GAEC)에서 Flk-1이 고수준으로 발현된다는 사실은, Flk-1 전사체가 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에 수용체 활성이 아마도 종양 형성동안 유도된다는 것을 나타낸다. 이러한 상향조절은 종양에 매우 근접한 혈관내피세포에서만 발생한다. 중화 항-VEGF 모노클노날 항체(mAb)로 VEGF 활성을 차단하면 누드 생쥐에서 인간 종양이식편의 성장이 억제되는데(Kim et al., Nature 362: 841, 1993), 이는 종양 관련 혈관 신생에 있어서의 VEGF가 직접적인 역할을 한다는 것을 나타내는 것이다.

VEGF 리간드가 종양세포에서 상향조절되고, 그의 수용체가 종양 침윤 혈관내피세포에서 상향 조절되기는 하지만, 혈관 신생과 결부되지 않은 정상세포에서는 VEGF 리간드 및 그의 수용체의 발현은 낮다. 따라서 이러한 정상 세포는 VEGF와 그의 수용체 사이의 상호 작용을 차단하여 혈관 신생이 억제되게 되고, 따라서 종양성장이 일어나지 않는다.

고수준의 VEGFR-2는 신경교종에 침윤하는 내피세포에 의해 발현되며, 인간 아교모세포종에 의해 생성된 VEGF에의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993). VEGFR-2 전사체는 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에, 아교모세포종 관련 내피세포(GAEC)에서 고수준의 VEGFR-2 발현되는 것은 종양 형성 동안 수용체 활성이 유도된다는 것을 나타낸다.

VEGF는 다양한 유형의 종양에서 높은 수준으로 발현되고(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992; Dvorak et al., J. Exp. Med., 174:1275, 1991), 새롭게 생긴 모세혈관은 VEGF-생산성 종양 포 주위에 모여든다(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992). VEGF 발현은 빠르게 성장하는 종양과 연계된 것들처럼, 저산소증 조건하에서 강하게 상향-조절된다(Shweiki et al., Nature, 359:843, 1992). 아바스틴(Avastin)과 같은 항체에 의한 VEGF 중화는(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov., 3(5):391, 2004; Avery et al., Ophthalmology, 113(3):363, 2006) 암 또는 AMD와 같은 다른 혈관 신생 질환을 억제하기 위해 임상적으로 승인된 요법이다. 그러나, VEGF 차단에 대한 내성이 화학요법과 병용되는 경우에서조차 발견되었다. 이 내성은 리모델링된 맥관구조 및 다른 혈관신생 인자의 증가된 발현과 관련될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에는 암 및 혈관신생과 관련된 다른 질환을 억제하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

티로신 키나제 억제제(TKI) 및 항-KDRP 항체 둘 모두가 KDR-매개된 혈관신생을 억제할 수 있다 하더라도, 항체 접근은 TKI에 비해 장점을 갖는다. TKI와 대조적으로, 항-KDR 항체는 더 특이적인 KDR 표적제이다(즉, 항-KDR 항체는 다른 VEGF 수용체를 억제하지 않는다). 이러한 높은 특이성 때문에, 항-KDR 항체는 표적 이탈 효과(off-target effect) 및 덜 특이적인 TKI에 의해 야기된 독성을 제한하고/하거나 회피할 수 있다(Witte et al., Cancer Metastasis Rev., Jun;17(2):155, 1998).

단지 하나의 리간드(VEGF-A)와만 결합하는 아바스틴과는 달리, 항-KDR 항체는 모든 공지의 VEGF가 VEGFR2/KDR에 결합하는 것을 방지하는 것으로 예상된다. 항-KDR 항체는 단순히 VEGF-A를 차단하는 것 보다는 종양 혈관신생에 대해 더욱 강력한 억제 효과를 가질 수 있다. 항-KDR 항체를 이용한 요법이 아바스틴 내성의 경우에 효과적일 수 있다는 가능성이 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하였으며, 항체 말단에 Notch1의 DLL4 결합부위를 융합시켜 융합단백질을 제작함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 VEGFR2/KDR에 대한 향상된 결합력을 갖는 항체 말단에 DLL4 결합 단백질 도메인이 융합된 형태의 융합단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 DLL4 (Delta-like ligand 4) 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로,

상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와 병용투여하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 VEGFR2/KDR, DLL4를 동시에 표적하는 융합단백질로, 기존의 VEGFR2/KDR를 표적으로 하는 항체보다 친화도가 향상된 항체를 포함함으로써, 종양을 치료하는데 있어서 기존의 치료제보다 더 효능이 좋은 병용 치료 및 단독 치료법을 제공할 수 있다. VEGFR2/KDR에의 향상된 결합력을 나타내어, 목적하는 암/종양 또는 혈관신생 저해제 관련된 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, Notch1에 의한 DLL4의 활성을 동시에 저해함으로써, 단독처리 보다 우수한 신생혈관저해 능력을 갖는다.

도 1은 6A6의 중쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 2는 6A6의 경쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 3a, 도 3b는 제작된 융합단백질의 결합력을 SPR로 확인한 결과이다.
도 4는 두가지 항원에 동시결합능력을 SPR로 확인한 결과이다.
도 5은 성장조절인자에 의한 HUVEC세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인한 결과이다.
도 6은 혈관내피세포에서 항체의 VEGFR-2 인산화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 FACS를 이용하여 혈과내피세포에서의 융합단백질의 결합능을 확인한 결과이다.
도 8은 세포 표면에 발현시킨 hDLL4에 대한 융합단백질의 결합능을 FACS를 이용하여 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 DLL4 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

본 발명에 따른 융합단백질 중 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 완전인간화 항체의 개량 항체이다. 특히, 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 (등록특허 10-0883430)의 개량 항체이다.

본 출원의 발명자들은 완전인간항체 라이브러리로부터 발명되었으며, VEGFR-2/KDR을 표적으로 하면서 동시에 마우스나 렛트 유래의 flk-1(VEGFR-2 상동체)에 대해서도 반응성을 가지는 유일한 항체를 개량하였다. 해당 항체는 임상시험을 통하여 그 우수성이 입증되었으나, 항체 단백질의 항원에 대한 결합력이 다소 낮은편이며, 생체내 반감기가 짧다. 이를 개량하여 면역항암제로써의 효능 증대, 혈관신생과 관련된 질환들에서의 효능 증대가 예상된다.

기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하였다. 그 결과, 본 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체보다 높은 결합력을 가지며, 세포내 효능이 더 좋은 항체를 개발하여, 항체가 목적하는 면역항암제 또는 혈관신생과 관련된 질병의 치료제로써의 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

상기 개량 항체는 다음과 같은 방법으로 스크리닝하였다. 먼저 6A6의 CDR 영역 서열과 프레임워크(frame work: FR) 서열을 확인하고, CDR grafting 기법을 사용하여, 중쇄 CDR 서열을 human germline VH3 서열에 이식하고, 경쇄 CDR 서열을 human germline VK1에 이식하였다.

CDR grafting(이식)이란 일반적으로 마우스 단클론 항체의 가변부위 서열을 암호화 하는 DNA를 분리하고 유전자 클로닝을 통하여 CDR 서열을 확보한 다음 in silico 상으로 적합한 인간항체 서열 안으로 CDR 서열을 이식하여 만드는 방법이다(Hou S, et al. Humanization of an anti-CD34 monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based on computer-assisted molecular modelling. J Biochem. 2008;144(1):115-20; 및 Kashmiri SV, De Pascalis R, Gonzales NR, Schlom J. SDR grafting--a new approach to antibody humanization. Methods. 2005;36(1):25-34). 위의 방법을 활용하여 human germline VH1/VL1을 갖는 6A6의 프레임워크를 human germline VH3/VK1으로 치환하였다.

상기 치환된 항체의 친화도를 향상시키기 위하여, 경쇄와 중쇄의 CDR3 염기서열에 돌연별이를 유도하는 라이브러리를 구축하고, 재조합 KDR D1~D3-Fc 융합 단백질을 이용하여, 항체를 스크리닝하였다. 항체 스크리닝은 파아지 디스플레이를 사용하여 스크리닝 하였다.

이를 바탕으로, 본 발명은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명의 융합단백질은 VEGFR2/KDR 및 DLL4 각각에 특이적으로 결합할 수 있다. "이특이적" 또는 "이중특이적"은 2개의 상이한 타겟에 특이적으로 결합하여 타겟의 활성을 조절할 수 있는 결합 단백질의 특성으로, 예를 들어 각 타겟에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단백질, 또는 이의 단편에 의해 제조될 수 있으며, 2개의 구분된 항원 결합 암 (arm: 2개 타겟에 대한 특이성)을 보유하고, 이에 결합하는 각각의 항원에 대하여 1가이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항-VEGFR2/KDR 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 단클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 영역은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 본 발명은 서열번호 3의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

본 발명에 있어, 상기 VEGFR2/KDR 및 DLL4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다. 각 가변 영역은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 영역과 1개의 경쇄 가변 영역이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

VEGFR2/KDR 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10^-6M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9M 내지 10^-10 M, 10^-5M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

본 발명은 서열번호 8의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 10의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 8의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.

상기 상동성은 청구된 서열번호의 서열 전체와 비교하여 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명은 명세서 중 기재된 융합단백질의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합단백질의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 융합단백질은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

상기 DLL4 결합 단백질 도메인은 DLL4에 결합하는 단백질 도메인으로 Notch1의 DLL4 결합부위를 포함한다. 예를 들어, 인간 Notch1의 EGF 유사 도메인을 포함할 수 있으며 서열번호 18의 서열을 포함할 수 있다.

상기 DLL4 결합 단백질 도메인은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체의 말단 예를 들어 경쇄 말단, 구체적으로 경쇄 N 말단에 결합할 수 있다.

한국등록특허 제10-1569083호에 VEGFR2/KDR 및 DLL4 결합 단백질 도메인을 포함하는 DIG-KN 물질이 기재되어 있으나, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체를 포함하고, 항-VEGFR2(KDR) 항체의 경쇄 N-말단에 DLL4 결합 단백질 도메인(Notch1 EGF 유사도메인)이 결합되어, 차이가 있다.

상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 DLL4 결합 단백질 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n 또는 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 9의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DLL4 결합 단백질 도메인을 코딩하는 서열번호 17의 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산을 분리하여 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 융합단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 융합단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질을 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 융합단백질의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

상기 융합단백질 중 포함된 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 혈관신생은 이전에 존재한 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 의미하며, "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 융합단백질로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 당뇨병성 족부궤양(diabetic Foot Ulcers), 만성 신부전 (chronic kidney failure), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases), 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 패혈증(sepsis), 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 융합단백질을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 융합단백질을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 융합단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 종양 또는 암환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 융합단백질의 기작 방해 용도 및 이를 통한 종양 또는 암의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.

치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 융합단백질을 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.

본 발명은 예를 들어, 상기 융합단백질의 치료적 유효량을 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환의 치료방법이 제공된다. 상기 혈관신생 질환의 치료는 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 융합단백질의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물, 또는 상기 혈관신생 질환의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 여기에 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내 융합단백질의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 융합단백질의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 ㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물은 다른 혈관신생 저해제 관련된 질병의 치료제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 융합단백질을 포함하는 약학 조성물은 융합단백질을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 융합단백질을 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. (공개특허 10-2015-0089329) 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

또한, 본 발명의 융합단백질은 다른 제제, 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 이러한 관점에서 상기 융합단백질을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.

상기 다른 혈관신생 질환 치료제는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다. 이를 통해 서로의 저항성을 극복시키고 효능을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에서 다른 혈관신생 질환 치료제와 병용 투여되는 경우 융합단백질과 다른 혈관신생 질환 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 대상체에게 투여한 후, 활성 성분으로서 융합단백질을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하거나, 상기 조성물을 대상체에게 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 상기 대상체에게 투여한다. 경우에 따라서, 상기 조성물을 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물과 동시에 대상체에게 투여할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. CDR grafting(이식)

6A6의 CDR 서열을 Kabat 넘버링, IMGT 프로그램을 통하여 확인하고, 이를 Hunam germline VH3/VK1에 이식하는 클로닝을 수행하였다. 도 1에 중쇄 CDR 이식 서열을 표기하였으며, 도 2에 경쇄 CDR 이식 서열을 표기하였다.

실시예 2. 친화도 증진을 위한 변이체 제작 및 선별

CDR grafting된 항체의 친화도 증진을 위한 최적화를 수행하였다. 경쇄와 중쇄의 CDR3의 원래 DNA 서열을 70% 보존하며 랜덤화(randomize)시키는 소프트-랜덤화(soft-randomization)법을 활용하여, 경쇄 CDR3와 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입한 프라이머를 제작하였다. 이를 사용한 PCR을 통해 변이가 도입된 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역 코딩 DNA 단편을 확보하였다. 이 DNA 단편을 각각 scFv 파지 파지미드의 경쇄 가변영역 및 scFv 파지 파지미드의 중쇄 가변영역과 치환하여, 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리와 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 각각 제작하였다.

변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 페놀-클로로포름 정제 후 전기천공법을 사용하여 대장균주 XL-1 Blue에 형질전환 하였다. 형질전환 효율 분석 및, DNA 서열 분석을 통해 다양성이 확보된 것을 확인한 후, 500 ml 규모로 배양하여 파지 발현을 유도하고, PEG-침전법을 이용하여 경쇄와 중쇄의 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리 제작하였다.

각 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 바이오패닝을 실시하였다. 96-웰 면역 플레이트에 항원 (KDR1~3 domian-Fc)을 2 mg/㎖로 100 ml씩 웰에 넣고 4℃ 오버나이트 (overnight) 시켰다. 다음날 항원 코팅 플레이트 (coating plate)는 PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱한 후 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200 ml를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 2x YT-TET(tetracycline 10㎍/㎖) 성장 배지 (growth medium) 2ml에 XL1-Blue 스톡 (stock) 50 ml를 넣고 37 ℃, 200 rpm에서 2시간 정도 키운 후 13 ml를 더 첨가하여 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 키워주었다. 차단 (blocking) 2시간이 지나면 1X PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱하였다. 워싱한 각 웰에 변이체 라이브러리를 와 4% BSA를 동일한 양으로 섞은 후 200 ml씩 첨가하여 실온에서 30분간 로킹(rocking)한 후 2시간을 반응시켰다. 파지 라이브러리 반응이 끝나면 상층액은 버리고 0.1% PBST로 5번 워싱하고 PBS로 5번 워싱하였다. 각 웰에 100 mM TEA(trimethylamine) 100ml를 넣은 후 실온에서 10분간 흔들어 주었다. 10분 지나면 각 웰에 1M Tris(pH 7.5) 50 ml를 넣고 섞어주었다. 상등액 (supernatant)은 OD₆₀₀ 0.5가 된 XL1-blue 10ml에 넣어 37℃에서 30분간 감염 (infection)시켰다. 감염이 끝나면 100 ml는 아웃풋 타이터 (output titer)로 사용하고 나머지는 6,000 rpm, 10분간 원심분리 하였다. 상층액은 버리고 침전물은 라지 스퀘어 플레이트 (large square plate: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose)에 스프레딩 (spreading)하여 37℃에서 오버나이트 인큐베이션 (overningt incubation) 하였다. 아웃풋 타이터로 남겨둔 100ml는 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석 (dilution)하여 CM 플레이트에 스프레딩하여 37℃에서 오버나이트하였다. 다음날 스퀘어 플레이트에 자란 콜로니 (colony)는 2x YT 배지 50ml을 넣은 후 룹 (loop)을 사용하여 긁어 모은 후 6000 rpm, 10분 원심분리하여 상층액은 버리고 침전액 (precipitate)에 대하여 1차 패닝 스톡 (panning stock)을 만들고 2x YT 배양 배지 (growth media: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose) 100 ml을 500 ml 삼각플라스크에 넣은 후 OD₆₀₀ 0.2 되게 세포를 넣고 200 rpm, 37℃에서 OD 0.5가 될 때까지 키워주었다. OD₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 세포를 배양한 후에 헬퍼 파지 (helper phage: M13KO7 mutant)을 세포의 20배가 되게 넣어주었다. 헬퍼 파지를 넣고 37℃, 30분 감염 (infection)시킨 후 6000 rpm, 10 min 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 세포는 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + Kan. 70㎍/㎖ + 1mM IPTG + 5mM MgCl₂) 100ml로 교체하여 넣어준 후 200 rpm, 30℃, 오버나이트하였다. 다음날 자란 세포는 7000 rpm, 10분, 원심분리하고 같은 방법으로 한번 더 원심분리하였다. 모은 상층액은 상층액의 1/5 (v/v) 20% PEG/2.5m NaCl 를 넣고 아이스 (ice)에서 1시간 침전시켰다. 침전시킨 후 9000 rpm, 1시간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 PBS 5ml로 침전액 (precipitate)을 풀어준 후 0.45 mm 필터 (filter)에 여과한 후 4℃에 보관하여 이를 다음 번 패닝 (panning) 과정에서 사용하였다. 이 과정을 3~4번 반복하여 항원에 결합하는 항체를 ELISA를 수행하여 확인하였다.

그 후 선별과정에서는 결합을 유지하는 능력의 정량적 평가지표로서 scFv의 해리 속도 상수 K_dis를 측정하였다.

실시예 3. 항원에 대한 고친화력을 가진 항체선별 (Off-rate screening)

선별된 항체의 항원에 대한 결합력을 Octet (Fortebio)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 KDR1~3 domain을 바이오센서 (biosensor)에 고정 (immobilize)한 후 scFv 형태로 발현된 후보항체를 넣고 결합시킨 후, 해리 속도 상수를 측정하였다. 선별된 최적화 클론 5종에 대한 해리 속도 상수 측정 결과[표 1] 와 아미노산 서열 [표 2, 3]을 표시하였다.

[표 1] 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 해리속도 상수

실시예 4. 융합단백질 제작

융합단백질 제작을 위하여 선별한 scFv 파지항체 중 가장 해리상수가 낮은 D4를 IgG형태로 전환하였다. IgG형태 전환은 분자생물학적 기법을 사용하여 수행하였다. 선별한 E. Coli 클론에서 파지미드 (Phagemid)를 추출, PCR기법을 사용하여 가변영역을 증폭하였다. 증폭한 중쇄 가변영역을 중쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfusess-hchg1)에 삽입하고, 증폭한 경쇄 가변영역은 경쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfuse2ss-hclk)에 삽입하여, IgG 형태의 DNA 클로닝을 완료하여, IgG1 형태로 전환하였다. 위의 전환된 경쇄불변영역의 N-말단에 Linker(G4S서열)를 포함한 DLL4 결합 도메인(Notch1 EGF유사도메인)을 유전자 합성하여 융합하였다. 제작된 항체의 염기서열은 표 2, 3에 나타내었다.

[표 2] 선별된 항체의 CDR 서열

[표 3] 선별된 항체의 서열

실시예 5. 융합단백질 발현

IgG 형태의 일시 발현은 Expi293F 발현 시스템 키트 (Expi293F expression system kit: Thermo Fisher Scientific, US)을 사용하였다. Kit에 포함된 Expi293 세포를 전용 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 125 rpm 오비탈 쉐이커 상 부유배양 하였다. 3일마다 3 X 10⁵ cells/ml 되도록 계대배양 하였으며, 발현 벡터 도입시에는 3 X 10⁶ cells/ml 되도록 세포수를 조정 한 후 사용하였다. 유전자 도입은 전용 시약인 Expifectamine을 사용하였으며, 세포현탁액 1 ml 당 발현 벡터 DNA 1 mg과 Expifectamine 2.7 μl을 함유하는 Lipid-DNA 복합체를 제작, 세포현탁액에 첨가하였으며, 도입 16-18시간 후 인헨서 (Enhancer) 1/2를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이후 동일 조건에서 3-4일간 배양 후 원심분리하여 IgG 함유 상등액을 취하였다.

실시예 6. 융합단백질의 정제

취득한 상등액을 Protein A 컬럼(GE Healthcare)에 주입하여 친화력 크로마토그래피를 통해 IgG를 정제하였다. 컬럼을 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0)으로 평형화 시킨 후 상등액을 주입, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) 용액으로 세정한 후, 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5)로 용출 후 1 M Tris로 중화하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US)를 사용한 투석 과정을 통해 PBS로 용매를 교체하였다. 이후 Vivaspin (Satorius, DE)을 사용하여 필요 농도로 농축하여 분주 후 -80℃에서 보관하였다.

실시예 7. 융합단백질의 결합 특이성 분석

선별된 융합단백질의 항원에 대한 결합력을 SPR(Biacore T200, Cytiva)를 사용하여 측정하였다. 융합단백질을 캡쳐 (capture)하고 항원단백질을 분석물 (analyte)로 사용하여 분석하였다. 단백질 A 칩 (Protein A chip)을 사용하여, 제조사의 지시 (manufacturer's instruction)에 따라 표면에 융합단백질을 고정하였다. 위의 센서칩 (senser chip)에 융합단백질을 5ug/ml 농도로 PBS-T running buffer에 희석하여 10ul/min 유속으로 주입하여 약 200 RU에 도달하도록 한다. 항원을 농도별로 PBS-T running buffer에 희석하여 30ul/min 유속으로 4분간 주입하고, 해리 시간은 10분으로 분석하였다. 매 cycle마다 결합되어 있는 융합단백질을 제거하기 위해 regeneration solution(10mM Glycine-HCl, pH1.5)을 30ul/min 유속으로 1분 동안 주입하였다. 실험 결과는 BIA evalution software version 1.0의 1:1 binding model을 이용하여 산출하였다. 표 4에 결합력을 나타내었으며, 도 3a 및 도 3b에 SPR sensergram을 나타내었다.

[표 4] 항원에 특이적으로 결합하는 융합단백질의 결합력

실시예 8. 항원에 대한 융합단백질의 동시결합 능력 확인

선별된 융합단백질이 두가지 항원에 대하여 동시결합할 수 있음을 SPR(Biacore T200, Cytiva)를 사용하여 확인하였다. 단백질 A 칩 (Protein A chip)을 사용하여, 제조사의 지시 (manufacturer's instruction)에 따라 표면에 융합단백질을 고정하였다. 위의 센서칩 (senser chip)에 융합단백질을 5ug/ml 농도로 PBS-T running buffer에 희석하여 약 200RU에 도닥하도록 한다. 먼저 PBS-T running buffer에 희석된 100nM hKDR-ECD를 30ul/min 유속으로 주입하여 120초 동안 결합시킨 후, PBS-T running buffer를 사용하여 60초 30ul/min 유속으로 흘려준다. 재생 (Regeneration) 없이 PBS-T running buffer에 희석된 200nM hDLL4를 30ul/min 유속으로 주입하여 120초 동안 결합시킨 후, PBS-T running buffer를 사용하여 60초 30ul/min 유속으로 흘려준다. 두 항원의 동시 합 결과는 도 4에 나타내었다.

실시예 9. 융합단백질의 HUVECs의 증식능 확인

제작된 융합단백질의 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)의 증식능 변화를 비교하기 위하여, 융합단백질 및 비교 대조군 항체 (6A6, 6A6xDLL4, D4, Minod-Fc)를 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)에 처리하였다. 6A6xDLL4은 표 5에 기재된 바와 같다. Minod-Fc은 서열번호 18의 Notch1과 Fc를 융합시킨 단백질이다.

[표 5]

간략히 요약하면, HUVEC (LONZA, Cat No. C2519A) 세포는 VascuLife medium complete kit(Lifeline cell technology, Cat No. #LCT-LL-0005) 배지를 사용하여 2% gelatin이 coating 된 plate에서 배양하였다. Culture는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 incubation 하였다. Assay에 사용한 HUVECs은 passage 10 이내의 세포를 사용하였으며, 0.5% heat inactivated FBS 가 포함된 M199 medium (Gibco, Cat No. #11043-023)으로 96-well plate에 1X10⁴ cells/well을 접종하였다. 각 항체를 250nM, 50nM, 10nM, 2nM 로 희석하여 assay plate의 해당 well에 처리한 후 30분간 incubation하였다. 그 후, VEGF165(R&D systems, Cat No. 293-VE)를 well마다 100ng/mL의 농도로 처리하였다. VEGF와 약물을 처리하지 않은 음성대조군(VEGF-/Ab-,) 과 VEGF 처리만 처리한 양성대조군(VEGF+/Ab-)을 포함하여 3일간 37℃ CO2 incubator에서 배양하였다. 생존도 (Viability) 측정은 CellTier Glo-Luminescent Cell viability Assay kit(Promega, Cat No. G7571)를 사용하여 살아 있는 세포내의 ATP를 검출하여 측정하였다.

시험 결과, 6A6 비교군 및 6A6 백본 (backbone)을 가진 6A6xDLL4 비교군에 비해 최적화 항체인 D4 비교군과 D4 백본을 가진 D4xDLL4 시험군에서 VEGF165에 매개되는 HUVEC 증식능을 더 크게 저해하였으며 이들 모두 농도-의존적인 양상을 보였다. 위의 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 10. 융합단백질의 VEGFR-2 인산화 억제 변화

융합단백질의 KDR(VEGFR-2) 탈인산화 능력을 확인하기 위하여, 융합단백질 및 대조군 항체(6A6, 6A6xDLL4, D4, Minod-Fc)를 Western blot analysis 를 통하여 비교하였다.

요약하면, HUVEC (LONZA, Cat No. C2519A) 세포 배양은 VascuLife medium complete kit(Lifeline cell technology, Cat No. #LCT-LL-0005) 배지를 사용하여 6-well plate에 8X10⁵cells/well 농도로 접종하였으며 37℃, 5% CO₂ 조건에서 하루 동안 배양하였다. HUVEC 세포에 각 항체를 125nM, 25nM 로 30분간 처리한 후, VEGF165(R&D, Cat No. 293-VE)를 각 well마다 50ng/mL의 농도로 10분간 처리하였다. VEGF와 약물을 처리하지 않은 음성대조군(VEGF-/Ab-)과 VEGF만 처리한 양성대조군(VEGF+/Ab-)을 포함하였다. 약물을 처리한 HUVEC은 Phosphate-buffered saline으로 세척 후, lysis buffer(Thermo scientific, RIPA buffer & phosphatase inhibitors)를 넣고 얼음위에서 10분간 세포용해(cell lysis)시켰다. 용해된(lysed) 세포는 세포 스크래퍼 (cell scraper)를 사용하여 긁어모은 후 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 상층액만 얻었다. 얻어진 상층액은 BCA 단백질 정량법을 이용하여 총 단백질 (total protein)을 정량 후, 4~15% grade SDS-PAGE gel에 20μg씩 로딩 (loading) 하여 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후, Western blot analysis를 위해 Nitrocellulose membrane(Bio-rad, Trans-Blot Turbo Transfer System)에 transfer 하였다. Nitrocellulose membrane blot에 blocking buffer [5% skim milk/TBS-T (0.1% Tween20, Tris-based saline)]를 가하여 상온에서 1시간동안 blocking 하였다. TBS-T buffer로 세척 후, 1차 항체 (p-VERFR2(Y1175), cell signaling)를 1:1000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시키고 세척하였다. 2차 항체(anti-rabbit-HRP)는 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T buffer로 세척 후, ECL (Enhanced chemiluminescence) solution (Thermo Fisher Scientific, Cat No. 34096)을 처리하여 반응시킨 후 Luminescent Image Analyzer (GE Healthcare, Amersham Imager 680)을 이용하여 이미지를 얻었다.

시험 결과, 6A6 비교군 및 6A6xDLL4 비교군에서 VEGF165에 매개되는 VEGFR2 인산화가 농도의존적인 양상으로 부분적으로 저해(partial inhibition)함을 보인 반면, 최적화 항체인 D4 비교군과 D4xDLL4을 동량 처리한 시험군에서는 VEGFR2가 거의 완전히(almost completely) 탈인산화됨을 보였다. 위의 결과는 도 6에 나타내었다.

실시예 11. FACS를 이용한 KDR(VEGFR-2) 결합능 확인

융합단백질의 HUVEC에 대한 결합활성을 알아보기 위하여, 융합단백질 및 대조군 항체(6A6, 6A6xDLL4, D4, Minod-Fc)를 이용하여 FACS 분석을 실시하였다.

요약하면 HUVEC (LONZA, Cat No. C2519A) 세포는 VascuLife medium complete kit(Lifeline cell technology, Cat No. #LCT-LL-0005) 배지와 2% 젤라틴 (gelatin)이 코팅 (coating)된 플레이트 (plate)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포를 FACS buffer(0.5% FBS, 0.05% sodium azide in PBS)에 2x10⁷cells/ml 농도로 조제하여 FACS tubed에 50 uL씩 분주하였다. 5nM 농도의 각 항체를 100 ul씩 FACS tube에 섞은 후 4 ℃에서 30분 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 tube에 FACS buffer 2mL씩 첨가하여 1500 rpm, 3분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 세포를 현탁한(re-suspension) 후, anti-human IgG-PE antibody(1:200, Bethyl, #A80-248PE)를 100 ul씩 넣은 후 4 ℃에서 20분 동안 반응시켰다. 각 FACS tube에 FACS buffer 2mL씩 첨가한 후 1500rpm, 3분간 원심분리하였다. 분리된 상층액을 제거하고 FACS buffer를 200 ul씩 넣어 현탁한 후, FACS (Beckton Dickinson, Lyric)를 이용하여 결합활성을 분석하였다.

시험 결과, Minod-Fc를 제외한, VEGFR2를 타겟으로 하는 6A6와 6A6xDLL4, D4, D4xDLL4 모두 HUVEC에 결합함을 확인하였다. 또한 D4와 D4xDLL4가 6A6와 6A6xDLL4 비해 결합 활성이 개선된 것으로 나타났다. 위의 결과는 도 7에 나타내었다.

실시예 12. 세포 표면에 발현되는 hDLL4와 항체의 결합능 확인

세포 표면에 DLL4가 발현되는 세포를 제작하기 위하여 HEK293 세포에 pcDNA-hDLL4를 형질전환시켰다.

요약하면, GeneArt에서 합성된 pcDNA-hDLL4 vector를 HEK293 세포에 lipofectaminTM 2000(Invitrogen #1168-019, USA)을 이용하여 형질주입(transfection)하였으며, neomycin(Gibco #10131, 50mg/mL)을 첨가하여 선별한 후 자란 모든 세포들을 모아 pool 상태로 배양하였다. 이후 Limiting dilution 방법을 통해 배양하여 단일 콜로니 23종을 얻었으며, 단일 콜로니 가운데 hDLL4를 잘 발현하는(highly overexpressed) 세포주 1종을 선택하여 실험을 진행하였다. 선별된 세포를 FACS buffer(0.5% FBS, 0.05% sodium azide in PBS)에 2x10⁷cells/mL로 농도로 조제하여 FACS tube에 50 uL씩 분주하였다. 5nM 농도의 융합단백질 및 대조군 항체(6A6, 6A6xDLL4, D4, D4xDLL4, Minod-Fc)를 세포가 들어 있는 FACS tube에 100 uL씩 넣고 4 ℃에서 30분 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 tube에 FACS buffer 2mL씩 첨가한 후 1500 rpm, 3분간 원심 분리한다. 상층액을 제거한 후, 세포를 잘 현탁한 후, anti-human IgG-PE antibody(1:200, BioLegend, #A80-248PE)를 100 ul씩 넣은 후 4℃에서 20분 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 FACS tube에 FACS buffer 2mL씩 첨가한 후 1500rpm, 3분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액을 제거하고 FACS buffer를 200 ul씩 넣어 현탁한 후, FACS (Beckton Dickinson, Lyric)를 이용하여 결합활성을 분석하였다.

시험 결과, DLL4를 타겟으로 하는 Minod domain을 포함하고 있는 Minod-Fc, 6A6xDLL4 및 D4xDLL4만 DLL-4가 발현된 HEK293 (DLL4-overexpressed HEK293) 세포에 결합하였으며 Minod-Fc 단독보다는 융합단백질 6A6xDLL4, D4xDLL4에서 결합을 잘하는 것으로 나타났다. 6A6와 D4는 DLL-4가 발현된 HEK293에 결합하지 않았다. 위의 결과는 도 8에 나타내었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Pharmabcine Inc. <120> Fusion Protein Comprising Modified Anti-VEGFR2(KDR) Antibody and Use Thereof <130> P21-B291 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR3 <400> 3 Ala Arg His Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR1 <400> 4 Asn Leu Gly Asp Val Asn 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR2 <400> 5 Tyr Asp Ala 1 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR3 <400> 6 Gln Ala Pro Thr Asn Asn Asp Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 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caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacattgg 300 ggcccgagtc ttacttctcc ctttgactac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tcc 363 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 29 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcagataa ccttggagat gtaaatgtac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gatgccgacc ggccctcagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtaattc tgggaatgat gccactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaagca ccaaccacgc atctgcctta taccttcggc 300 cagggtacca aggtggaaat caagcggacc 330 <210> 30 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Asn Ser Gly Asn Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Pro Thr Thr His Leu Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 31 gaggtgcagc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggata caccttcagc agctactgga tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gcctcgaatg ggtgtcagag attaatcctg gcaacggtca tactaactac 180 aacgagaagt tcaagtcacg gttcaccatc tccagagaca agtccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacattgg 300 ggcccgagtc ttacttctcc ctttgactac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tcc 363 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 33 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcagataa ccttggagat gtaaatgtac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gatgccgacc ggccctcagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtaattc tgggaatgat gccactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaagcg ccaaccaaaa acgtccctta taccttcggc 300 cagggcacca aggtggaaat caagcggacc 330 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Asn Ser Gly Asn Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Pro Thr Lys Asn Val Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain <400> 35 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu 115 <210> 36 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain <400> 36 Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 1 5 10 15 Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 20 25 30 Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 35 40 45 Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln 50 55 60 Cys Ile Cys Met Pro Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys 100 105 110 Arg Gly Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg 115 120 125 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro 130 135 140 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 145 150 155 160 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 165 170 175 Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr 180 185 190 Lys Val Thr Val Leu Gly 195

Claims

VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편; 및 DLL4 (Delta-like ligand 4) 결합 단백질 도메인을 포함하는 융합단백질로,
상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체는 서열번호 8의 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 경쇄 가변영역을 포함하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 DLL4 결합 단백질은 서열번호 18의 서열을 포함하는 Notch1인 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 DLL4 결합 단백질 도메인은 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체의 경쇄 N 말단에 결합하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 DLL4 결합 단백질 도메인은 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 링커는 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 융합단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
제7항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
제8항의 발현벡터를 포함하는, 형질전환 세포.
다음 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법:
(a) 제9항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는 다른 치료제와의 병용투여용 조성물.