CN110022903A - Met抗体药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了结合并且杀伤表达MET的肿瘤细胞且有效地治疗表达MET的癌症的抗体‑药物缀合物(ADC)。还提供了缀合MET抗体以生成这类ADC的新化合物和方法。

Description

MET抗体药物缀合物
本发明提供了一种抗体药物缀合物(ADC)，其具有结合与细胞毒性剂缀合的MET的IgG4抗体，本发明还提供了用于其制备的方法、含有MET ADC的药物组合物，及其在治疗各种癌症中的用途。
ADC的一般概念是众所周知的，旨在利用单克隆抗体(mAb)的特异性来选择性地向表达抗原的肿瘤细胞递送有效的细胞毒性药物。尽管有众所周知的概念，但必须仔细选择ADC的各个方面，以完全实现具有改善效能和耐受性的靶向治疗的目标，包括适合的抗原靶标、结合该抗原靶标的适当抗体、细胞毒性有效负荷、接头、缀合方法和释放机制。尽管在过去几十年中取得了进步，但人们普遍认识到，即使熟练的技术人员也经常遇到与ADC的化学和物理稳定性相关的显著问题，这产生无效乃至有毒的化合物。例如，吉姆单抗奥佐米(gemtuzumab ozogamicin)(以前作为销售)是一种抗CD33 ADC，2000年5月被FDA批准用于治疗急性髓性白血病。然而，随后在2010年6月，当临床试验显示肝毒性、某些患者组的致命并发症、患者死亡增加以及与常规癌症疗法相比没有额外的疗效益处时，它随后退出市场。与亲本抗体本身相比，ADC可具有显著更短的消除半衰期。可能需要氨基酸变化以充分克服这些问题。通常必须改变抗体、接头和药物以产生具有改善的效能和耐受性的靶向ADC疗法。此外，减少、消除和/或避免这类特性所需的结构变化通常不是常规的或不源自普通常识。
MET是酪氨酸激酶超家族的成员，其为人肝细胞生长因子(HGF)的人受体。HGF是与MET结合的唯一配体。HGF与MET的结合导致受体二聚化或多聚化、胞内区域中多个酪氨酸残基的磷酸化、催化活化和下游信号传导。认为HGF/MET途径的激活在胚胎发育、细胞增殖、迁移、形态发生、存活和伤口愈合的正常过程中是重要的，但其失调被认为在癌症发展、转移和药物抗性中起作用。MET也通过配体非依赖性机制激活，包括受体超表达、扩增和突变。HGF和MET也是抗癌疗法的靶标。例如，onartuzumab，在本领域中也称为单臂5D5、OA5D5或MetMAb，其为衍生自MET激动性单克隆抗体5D5的人源化、单价、拮抗性抗MET抗体(参见例如Spigel,D.R.等人,(2013)Randomized Phase II Trial of Onartuzumab in CombinationWith Erlotinib in Patients With Advanced Non Small-Cell Lung Cancer,J.Clinical Oncology,2013；31(32):4105-4114；和Xiang H.等人,Onartuzumab(MetMAb)：Using Nonclinical Pharmacokinetic and Concentration–Effect Data to SupportClinical Development,Clin Cancer Res.19(18):5068-5078(2013))。Onartuzumab与MET结合并与MET保留在细胞表面，阻止HGF结合和随后的MET磷酸化以及下游信号传导活性和细胞反应。尽管早期对onartuzumab治疗癌症的可能性感到兴奋，但由于在晚期临床试验中缺乏具有临床意义的效能，因此onartuzumab的开发最终终止(参见例如Spigel,D.R.等人,Onartuzumab plus erlotinib versus erlotinib in previously treated stage IIIband IV NSCLC：results from the pivotal phase III randomized,multicenter,placebo-controlled METLung(OAM4971g)global trial.J Clin Oncol.,32,摘要8000(2014))。同样，Amgen和Aveo Oncology分别终止了他们的HGF抗体ficlatuzumab(以前称为AV-299)和利妥木单抗(rilotumumab)(以前称为AMG102)的所有临床开发，两者都以高亲和力和特异性结合HGF配体，以抑制HGF/c-Met的生物活性。更具体地，Aveo Oncology报道，对血管内皮生长因子(VEGF)信号通路和表皮生长因子受体(EGFR)突变均呈阳性的患者经历了更高的停药率，促使终止ficlatuzumab的研发。据报道，Amgen决定终止利妥木单抗的开发是基于与仅化疗组相比，利妥木单抗和化疗治疗组死亡数增加的发现(参见例如Cunningham,D.等人,Phase III,randomized,double-blind,multicenter,placebo(P)-controlled trial of rilotumumab plus epirubicin,cisplatin and capecitabine asfirst-line therapy in patients with advanced MET-positive gastric orgastroesophageal junction(G/GEJ)cancer：RILOMET-1 study.J Clin Oncol.,33:(增刊；摘要4000)(2015))。
WO 2010/059654描述了各种MET抗体，包括高亲和力拮抗性抗体，其结合至MET的α-链内的表位，并且在存在或不存在HGF的情况下和在以突变为特征的肿瘤中诱导MET的内化和/或降解，所述突变赋予对已知MET拮抗剂的抗性。据报道，WO 2010/059654中公开的MET抗体之一LY2875358对MET没有功能性(即可忽略的)激动剂活性(参见例如Zeng,W.等人,(2013)第104届AACR年会,海报#5465)。该抗体已在晚期胃癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的临床试验中进行了研究。其世界卫生组织(WHO)推荐的国际非专利名称(INN)是emibetuzumab。WHO Drug Information,第29卷,第1期,2015,pp.82-83。
WO 2016094455和Fu,Y.等人,(2014)公开了具有IgG1抗体的ADC，所述抗体与MET结合，MET与微管蛋白抑制剂DM1或多柔比星类似物在链间半胱氨酸位点缀合(Fu,Y.等人,c-Met is a Potential Therapeutic Target for Antibody Drug Conjugates inBreast Cancer,37th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium(海报#P2-16-03)(2014))。
如本领域众所周知的，“[p]hysical and chemical ADC,linker payload,andmAb instability could potentially impact the toxicity,immunogenicity,andefficacy of the molecule(Ross,P.L.和Wolfe,J.L.,Physical and ChemicalStability of Antibody Drug Conjugates：Current Status,J.of PharmaceuticalSciences,105:391-397(2016)).”。实际上，当试图通过一般地遵循本领域教导(例如“Antibody-Drug Conjugates”(2013)Springer.Ducry,Laurent(Ed.))来创造包含WO2010/059654的各种抗MET抗体的MET ADC时，本发明人遇到了显著问题，所述问题与可与内源性人IgG4交换的半mAb形成相关，或与相对于靶向受体MET的增加的激动剂性质相关。实际上，需要涉及不同抗体、有效负荷、接头和/或缀合策略的广泛改造努力，以避免或充分克服这些问题。在相关领域中没有提出结构变化以及克服这些问题所需的实际变化。此外，几种变化不是常规的或不源自公知常识，并且结构改造的结果是令人惊讶和有利的。因此，广泛的研究努力导致鉴定了新的缀合方法、有效负荷中间体和令人惊讶的稳定、良好耐受和有效的MET ADC。
因此，本发明提供了以高亲和力结合MET并有效中和HGF对MET活化的ADC。另外，MET ADC使MET抗体和细胞毒性剂(即MMAE)在细胞表面上共定位并有效释放细胞毒性剂，同时引发最小或不引发功能性MET激动剂活性。令人惊讶的是，在具有MET表达的肿瘤细胞中，与未缀合的亲本抗体emibetuzumab相比，这些MET ADC表现出至少相当的诱导MET内化和降解的能力。此外，本文提供的MET ADC，与相应的单一活性剂的组合相比，在治疗MET表达肿瘤(相对于单一活性剂和/或单一活性剂的组合)中表现出增加的效能，包括难以治疗的癌症(例如肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和肾癌)、特征在于具有RAS活化(例如一种或多种KRAS突变)的那些、低MET表达肿瘤或对一种或多种抗MET抗体和/或一种或多种MET小分子抑制剂、包括但不限于merestinib具有抗性或已经变得抗性的肿瘤。另外，本文提供的MET ADC在循环中非常稳定，表现出体内稳定性、物理和化学稳定性，包括但不限于热稳定性、溶解性、低自缔合性和药代动力学特征，这对于治疗癌症中ADC的研发和/或使用是可接受的。令人惊讶的是，它们还显示具有与emibetuzumab相当的物理和化学稳定性。
本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)重链，其包含重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，它们分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列组成；和
ii)轻链，其包含轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，它们分别由SVSSSVSSIYLH(SEQID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成；且
其中n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第一重链，和
(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的第一轻链，
且其中n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)第一重链和第二重链，其中重链各自包含重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，它们分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ IDNO：3)的氨基酸序列组成；和
ii)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，它们分别由SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成；且
其中n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)第一重链和第二重链，其中重链各自包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)；和
ii)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)；且
其中n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第一重链；和
ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一轻链，
且其中n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)第一重链和第二重链，其中重链各自包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；
和
ii)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，且n为1-9。
本发明的另一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含(i)两个重链(HC)多肽和两个轻链(LC)多肽，其中两个HC多肽的氨基酸序列均由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成，且两个LC多肽的氨基酸序列均由SEQ IDNO：9的氨基酸序列组成，两个第二多肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，且n为1-9。
本发明还提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐,，其中A是C8-H241-IgG4或emibetuzumab。
本发明还提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐,，其中n为1-9。
除其中n为1-9的式I化合物外，本发明还提供了包含其中n为1-9的式I化合物的混合物的组合物。式I化合物的混合物可以被表征为由术语“药物与抗体比”(即DAR)表示的分布。
可以通过首先确定每种其中n是1-9的式I化合物的药物负荷分配来计算DAR值。这可以通过使用本领域已知的分析技术实现，例如分光光度测定法、辐射测定法、疏水相互作用色谱法和质谱法。更具体地，获得用于混合物的通过电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-ToF)的解旋转质谱。基于离子计数对每个n值的各个峰进行积分。将每个n值的离子计数除以所有峰值离子计数的总和，然后乘以100％，得到药物负荷分布。
药物负荷分布(％)＝(其中n为1-9的式I化合物的离子计数除以离子计数总和)乘以100(％)。对表示特定n值的每个峰重复计算。
接下来，将其中n为1-9的每种式I化合物的药物负荷分布(％)乘以其相应值n并将所得结果除以100。得到的商表示具有针对混合物特性的特定n值的每种式I化合物的加权DAR贡献。最终，DAR贡献的总和提供了混合物的平均DAR。
DAR贡献＝(具有特定n值的每种式I化合物的药物负荷分配(％))x(n)/100。
平均DAR＝∑(DAR贡献)。
本发明提供了包含式I化合物的混合物的组合物，其中平均DAR为2-6。
本发明还提供了组合物，其中平均DAR为2-5。
本发明还提供了组合物，其中平均DAR为3-4。
本发明还提供了组合物，其中平均DAR为3.3。
式I的具体化合物为：
其中n为1-9；或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个实施方案是药物组合物，其包含上述MET ADC的任意一种或其盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一个实施方案是上述MET ADC的任意一种或其盐，用于疗法。
本发明的另一个实施方案是述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗癌症。
本发明的另一个实施方案是上述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗癌症，其中MET由患者肿瘤表达。
本发明的另一个实施方案是上述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗：i)癌症，其中MET由患者肿瘤以低、中等或高水平表达；和/或ii)荷有一种或多种RAS(包括但不限于KRAS)、BRAF、P53和/或PI3K突变的肿瘤。在这类发明的不同实施方案中，MET ADC在治疗其中MET由患者肿瘤以低、中等或高水平表达的癌症和/或含有一种或多种RAS(包括但不限于KRAS)BRAF、P53和/或PI3K突变的肿瘤中的应用可以进一步包括在对该患者施用本发明的MET ADC或其盐的步骤之前鉴定需要治疗癌症的患者的步骤。
本发明的另一个实施方案是前述MET ADC的任一种或其盐，用于治疗胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾乳头癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌和肺癌，包括但不限于NSCLC和SCLC，以及胆管癌，或黑素瘤，包括但不限于眼色素层黑素瘤。
本发明的另一个实施方案是一种治疗癌症的方法，包括对有此需要的人体患者施用有效量的前述MET ADC的任意一种或其盐。
本发明还提供了一种治疗胰腺癌的方法，该方法包括给有此需要的患者施用有效量的式I化合物或其盐。
本发明还提供了式I的化合物或其盐，用于治疗结肠直肠癌。
本发明还提供了式I的化合物或其盐，用于治疗癌症。
本发明还提供了式I的化合物或其盐，用于治疗胰腺癌。
本发明还提供了可用于制备式I化合物的某些中间体化合物。具体的中间体化合物是式II的化合物。
应理解，本发明的化合物可以作为立体异构体存在。本发明的实施方案包括所有对映异构体、非对映异构体及其混合物。优选的实施方案是单一非对映异构体，更优选的实施方案是单一对映异构体。就此，应理解在式I化合物中为式Ia的化合物。
还应理解，在式II的化合物中为式IIa的化合物。
图1描绘了相对于Alexa 488标记的emibetuzumab，MET-ADC#1和emibetuzumab与HT-29肿瘤细胞上的细胞表面MET的竞争性结合的结果。如清楚所示，MET-ADC#1结合与未缀合的亲本MET抗体emibetuzumab的结合高度相当。通过FACS分析确定与细胞表面MET的结合。
图2显示测量Caki-1细胞中pan-AKT磷酸化(pAKT)诱导的体外生物测定结果，表明MET-ADC#1与emibetuzumab相比没有增加的激动剂活性。
图3显示MET-ADC#1在胰腺肿瘤BXP3细胞中表现出类似于emibetuzumab的内化活性，正如对用MET-ADC#1、emibetuzumab、同种型对照ADC(即hIgG4 Lys-MMAE)或同种型对照(即hIgG4)处理后细胞中细胞表面MET变化进行的FACS分析所确定的。
图4显示体外HT-29细胞杀伤试验中MET-ADC#1的活性。在该测定中，MET-ADC#1在杀伤HT-29细胞方面高度有效。
图5显示体外RKO细胞杀伤试验中MET-ADC#1的活性。在该测定中，MET-ADC#1在杀死RKO细胞方面高度有效。
图6显示MET-ADC#1和MET-ADC#7(即C8-H241-IgG2-Cys-MMAE)在体内HT-29异种移植物模型中的功效。
图7显示MET-ADC#1在体内BxPC-3异种移植物模型中的功效。
图8显示MET-ADC#1在体内KP-4异种移植物模型中的功效。
图9显示MET-ADC#1在体内Hs746t异种移植物模型中的功效。
图10显示MET-ADC#1在体内Calu-6异种移植物模型中的功效。
图11显示MET-ADC#1在体内胆管癌PDX模型中的功效。
术语“MET受体”和“MET”在本文中可互换使用，除非另有说明，否则意指结合人肝细胞生长因子的人受体酪氨酸激酶及其功能活性突变形式。MET的具体实例包括例如由GenBank保藏号NM_000245中提供的核苷酸序列编码的人多肽，或由GenBank保藏号NP_000236中提供的多肽序列编码的人蛋白质。MET通常在本领域中通过其他名称提及，包括但不限于c-MET、cMET、c-Met或其他变体。MET的结构图示为：
SEMA:Sema结构域
PSI：神经丛素(plexin)，信号素(semaphorins)，和整联蛋白结构域IPT：4种免疫球蛋白，神经丛素，和转录因子结构域
TM：跨膜区
JM：近膜结构域
KD：激酶结构域
人MET的胞外结构域具有例如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。然而，SEQ ID NO：11的氨基酸1-24包含信号序列。因此，除非另有说明，否则本文所用的术语“MET-ECD”是指分别在SEQ ID NO：11的氨基酸25和932开始和结束的成熟蛋白质(即SEQ ID NO：12)。SEMA结构域由MET的N-末端的约500个氨基酸残基组成，并含有α-链(SEQ ID NO：11的氨基酸残基25-307(即SEQ ID NO：13)和部分β-链(SEQ ID NO：11的氨基酸残基308-519(即SEQ IDNO：14))。
如本文所用，关于肿瘤或细胞系的MET的细胞表面表达，术语“低”，“中等”和“高”分别意指每个细胞具有小于约10万、大于约10万和大于约50万个受体。
除非另有说明，否则本文所用的术语“抗体”意指包含通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)的免疫球蛋白分子。每条链的氨基末端部分包括约100至约120个氨基酸的可变区，其主要负责通过其中包含的CDR进行抗原识别。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。
如本文所用，术语“C8-H241-IgG4”是指抗体，其包含：两条轻链，它们各自具有如SEQ ID NO：9中的氨基酸序列；和两条重链，它们各自具有如SEQ ID NO：23中的氨基酸序列。
如本文所用，术语“emibetuzumab”是指抗体，其包含：两条轻链，它们各自具有如SEQ ID NO：9中的氨基酸序列；和两条重链，它们各自具有如SEQ ID NO：23中的氨基酸序列，并且描述在WHO Drug Information,Proposed International Nonproprietary Names(INN)List 111,第28卷,第2期,2014年7月中。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”预期是指在抗体的HC和LC多肽的可变区内发现的不连续抗原结合位点。其他人已经描述了这些特定区域，包括Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和North等人,J.Mol.Biol.,406,228-256(2011)，其中定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或亚组。
CDR散布于更保守的区域，称为框架区(“FR”)。每个LCVR和HCVR由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的三个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，并且重链的三个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR包含与抗原形成特异性的相互作用的大多数残基。LCVR和HCVR区域内CDR氨基酸残基的编号和定位符合已知规则(例如Kabat(1991)Chothia(1987)和/或North(2011))。
术语“药学上可接受的盐”包括与分子的酸性部分结合存在的碱加成盐或与式I化合物的碱性部分结合存在的酸加成盐。这些盐包括药学上可接受的盐，例如Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(Eds.),Wiley-VCH,New York,2002中列出的那些，它们是本领域技术人员已知的。
除了药学上可接受的盐之外，本发明还考虑了其他盐。它们可以在化合物的纯化中或在其它药学上可接受盐的制备中用作中间体，或者可用于本发明化合物的鉴定、表征或纯化。
如本文所用，术语“患者”是指动物，例如哺乳动物，并且包括人。人是优选的患者。
还认识到，本领域技术人员可通过向目前显示症状的患者施用有效量的式I化合物来治疗易感癌症。因此，术语“治疗”意指其中可能存在现有病症和/或其症状的进展减缓、中断、阻止、控制或停止的所有过程，但不一定表示完全消除所有症状。
如本文所用，术语“表面等离子共振(SPR)”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcoreTM系统(BiacoreLife Sciences Division,GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
如本文所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原或抗体片段-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成复合物，其在生理条件下相对稳定。用于确定抗体是否与抗原结合的方法是本领域众所周知的，包括例如SPR(参见本文实施例6)，或针对抗原(即MET)天然配体(即HGF)的竞争性结合测定，或针对亲本抗体(emibetuzumab)和MET ADC的竞争性结合测定(参见本文实施例8)等。例如，如在本发明的上下文中使用，“结合”MET的抗体包括以如下KD结合MET-ECD(或SEMA结构域或其α链部分)的抗体：小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM，如SPR测定中所测量(参见例如本文的实施例6)。优选地，本发明的MET ADC以如下KD结合MET-ECD(或SEMA结构域或其α链部分)：约50nM-约0.1nM，约15nM-约0.1nM，约15nM-约1.0nM，约10nM-约1.0nM，约7.5nM-约1.0nM，约6nM-约1.0nM，约3nM-约1.0nM，约1nM-约0.1nM，约0.75nM-约0.1nM，约0.5nM-约0.1nM，如SPR测定中所测定的，该测定法设计用于避免或消除对亲和力测定的亲合影响(即非亲合结合)(参见例如本文的实施例6)。
应当理解，在描述本发明的化学式中，A与氮(N)的波状键代表基团A的赖氨酸残基，其中A是结合MET的IgG4抗体。因此，本发明提供了可用于制备式I化合物的式III化合物。
其中
表示A的官能化赖氨酸残基
本发明的一个实施方案提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐
其中
A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)包含分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、
RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；和
ii)包含分别由SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链；且
n为1-9。
本发明另外的实施方案提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链；和
ii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链；且
n为1-9。
本发明的另一个实施方案是式I的化合物或其药学上可接受的盐
其中
A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)第一重链和第二重链，其中重链各自包含分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和ii)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含分别由SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；
且
n为1-9。
在这类发明的其他实施方案中，A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
i)第一重链和第二重链，其中两个重链均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；
和
ii)第一轻链和第二轻链，其中两个轻链均包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
此外，在这类发明的不同实施方案中，MET ADC诱导细胞表面MET的HGF-不依赖性和EGF-不依赖性内化和/或降解。
在本文公开的MET ADC化合物的一些实施方案中，两者均来源于抗-MET克隆C8-H241(详细描述在WO 2010/059654中)的SEQ ID NO：7的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：8的轻链可变区氨基酸序列可以用于形成结合MET的MET抗体的抗原结合位点。
本发明的另一个实施方案是结合MET的MET ADC，包含：(a)两个第一多肽，其中两个第一多肽均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；和(b)两个第二多肽，其中两个第二多肽均包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案是药物组合物，其包含MET ADC，包含：(a)两个第一多肽，其中两个第一多肽均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；和(b)两个第二多肽，其中两个第二多肽均包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一个实施方案是治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐
其中
A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
iii)包含分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；和
iv)包含分别由SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链；
且n为1-9。
本发明的另一个实施方案是治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
iii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链；和
iv)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链；
且n为1-9。
本发明的另一个实施方案是治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐
其中
A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
iii)第一重链和第二重链，其中重链各自包含分别由GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：1)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：2)和ARANWLDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
iv)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含分别由SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：4)、YSTSNLAS(SEQ ID NO：5)和QVYSGYPLT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列组成的轻链CDRLCDR1、LCDR2和LCDR3；
且n为1-9。
在治疗癌症的这类方法的另外的实施方案中，A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
iii)第一重链和第二重链，其中两个重链均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；
和
iv)第一轻链和第二轻链，其中两个轻链均包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
此外，在这类治疗癌症方法的不同实施方案中，MET ADC诱导细胞表面MET的HGF-不依赖性和EGF-不依赖性内化和/或降解。
在本文公开的治疗癌症方法的一些实施方案中，两者均来源于抗-MET克隆C8-H241(详细描述在WO 2010/059654中)的SEQ ID NO：7的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：8的轻链可变区氨基酸序列可以用于形成结合MET的MET抗体的抗原结合位点。
本发明的另一个实施方案是治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的式I的化合物，该化合物结合MET并且包含：(a)两个第一多肽，其中两个第一多肽均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；和(b)两个第二多肽，其中两个第二多肽均包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案是包含MET ADC的药物组合物的用途，所述MET ADC包含：(a)两个第一多肽，其中两个第一多肽均包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；和(b)两个第二多肽，其中两个第二多肽均包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在使用本发明的MET ADC化合物的至少一种治疗癌症的方法的一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾乳头癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌和肺癌，包括但不限于NSCLC和SCLC，以及胆管癌，或黑素瘤，包括但不限于眼色素层黑素瘤。
在本发明的一些实施方案中，提供了用至少一种本发明的MET ADC化合物治疗癌症的方法，其中肿瘤的特征在于包含具有一个或多个KRAS突变的细胞。本发明的其他实施方案还提供治疗癌症的方法，包括将药学有效量的前述MET ADC之一或其盐施用于有此需要的患者，其中MET由患者的肿瘤以低、中等或高水平表达和/或肿瘤对一种或多种抗MET抗体(例如emibetuzumab等)和/或一种或多种MET的小分子抑制剂(例如Crizotinib、merestinib等)具有抗性或已变得抗性，包括但不限于荷有KRAS突变的肿瘤。在这种发明的各种实施方案中，其中MET由患者肿瘤以低、中或高水平表达和/或其中肿瘤对一种或多种抗-MET抗体(例如emibetuzumab等)和/或一种或多种MET的小分子抑制剂(例如Crizotinib，merestinib等)具有抗性或已经变得抗性、包括但不限于具有KRAS突变的肿瘤的癌症的治疗方法，可进一步包括以下步骤：对患者施用MET ADC或其盐的步骤之前，通过测量患者肿瘤表达的MET水平和/或评估患者的肿瘤是否包含具有一种或多种KRAS突变的细胞，鉴定需要治疗癌症的患者。
可以使用本领域熟知的技术、通过重组表达制备MET抗体。
尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但真核细胞是优选的，并且最优选哺乳动物宿主细胞，因为这样的细胞更可能组装和分泌正确折叠且具有免疫活性的抗体。用于表达本发明使用的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-minus CHO细胞，如Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20,1980中所述，与DHFR选择标记一起使用，例如如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159:601-21,1982所述]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间期限来产生抗体，或者更优选地，足以允许将抗体分泌到其中使宿主细胞在本领域已知的适当条件下生长的培养基中。可以使用标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收抗体。
通过将编码HCVR的DNA与编码重链恒定区的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码HCVR区的分离的DNA转化为全长重链基因。人类以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。包含这些区域的DNA片段可以例如通过标准PCR扩增获得。优选地，重链恒定区是IgG型，且更优选IgG4亚型。
通过将编码LCVR的DNA可操作地连接到编码轻链恒定区的另一DNA分子，可以将编码LCVR区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
本发明还提供上述MET ADC的任意一种或其盐，用于疗法。
本发明还提供上述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗癌症。
本发明还提供上述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗其中表达MET的癌症。
本发明还提供上述MET ADC的任意一种或其盐，用于治疗胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾乳头癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌和肺癌，包括但不限于NSCLC和SCLC，以及胆管癌，或黑素瘤，包括但不限于眼色素层黑素瘤。
本发明还提供治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的上述METADC的任意一种或其盐。
术语“癌症”(或“癌”)是指增殖性疾病，例如肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈癌、直肠癌、肛区的癌症、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、结直肠癌(CRC)、食道癌、黑素瘤、包括但不限于眼色素层黑素瘤、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾癌、肾乳头状癌、甲状腺细胞癌、肾盂癌，包括任何上述癌症的顽固性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
如本文所用，术语“有效量”是指为剂量的量，其有效治疗病症、例如本文所述的结肠直肠癌。本领域技术人员可以通过使用常规技术并通过观察在类似情况下获得的结果容易地确定有效量。在确定有效量或剂量时，考虑许多因素，包括但不限于待施用的化合物；如果使用的话共同施用的其他活性剂；哺乳动物的种类；其大小、年龄和一般健康状况；病症例如结肠直肠癌的牵涉程度或严重程度；个体患者的反应；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；其他伴随药物的使用；和其他相关情况。有效量也是其中治疗有益效果超过MET ADC或其盐的任何有害作用的量。
有效量至少是赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的最小量，但小于总有害量。换句话说，本发明抗体的有效量或治疗有效量是在哺乳动物、优选人中减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上缓慢或停止)癌细胞浸润到外周组织器官中；抑制(即在某种程度上缓慢或停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状的量。本发明的MET ADC的有效量可以以单剂量或多剂量施用。此外，本发明的MET ADC的有效量可以以多剂的量施用，所述量如果不是超过一次施用将小于有效量。
如在医学领域中众所周知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。剂量可以根据疾病的类型和严重程度而进一步变化。典型的剂量可以是例如在约10mg-约1000mg；优选地约50mg-约500mg；更优选地约200mg-约500mg；甚至更优选地约200mg-约400mg,甚至更优选地约200mg-约300mg；甚至更优选地约225mg-约275mg；甚至更优选地约250mg-约275mg的范围；然而，设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。每日肠胃外剂量方案可以是约250μg/kg-约10mg/kg。可以通过定期评估来监测进展，并相应地调整剂量。
在本发明的一些实施方案中，可以静脉内施用单剂量的本发明的MET ADC以治疗成年患者的癌症。静脉内施用的典型单剂量可以是例如在约10mg-约1000mg；优选地约10mg-约500mg；更优选地约10mg-约500mg；更优选地约10mg-约400mg；更优选地约10mg-约350mg；更优选地约10mg-约300mg；甚至更优选地约10mg-约275mg；甚至更优选地约10mg-约250mg；甚至更优选地约10mg-约200mg；甚至更优选地约10mg-约175mg；甚至更优选地约10mg-约150mg；或最优选地约10mg-约125mg的范围；然而，设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。或者，用于本发明MET ADC静脉内施用的典型单剂量可以为例如约.2mg/kg-约15mg/kg体重；更优选地约.2mg/kg-约10mg/kg；甚至更优选地约.2mg/kg-约7.5mg/kg；甚至更优选地约.2mg/kg-约5mg/kg；甚至更优选地约.2mg/kg-约4mg/kg；甚至更优选地约.2mg/kg-约3mg/kg；甚至更优选地约.2mg/kg-约2.5mg/kg；或最优选地约.2mg/kg-约2mg/kg。这样的剂量可以静脉内施用例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。可以通过定期评估来监测进展，并相应地调整剂量。
对本发明的这些MET ADC的建议量受制于大量治疗判断。选择适合剂量和时间安排的关键因素是获得的结果。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定病症、个体患者的临床状况、病症的原因、抗体的递送部位、抗体的特定类型、施用方法、施用方案以及医生所知的其他因素。
本发明的MET ADC可用作人用药物中的药物，通过各种途径施用。因此，本发明还提供了包含任何一种前述MET ADC和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。最优选地，此类组合物用于肠胃外施用。本文所用的术语肠胃外包括静脉内、肌内、皮下或腹膜内施用。通过静脉内或腹膜内或皮下施用的肠胃外递送是优选的。静脉内施用是最优选的。用于这种施用的适合媒介物是本领域众所周知的。
药物组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存在所提供的容器中的条件下是稳定的，所提供的容器包括例如密封的小瓶、注射器或其它递送装置，例如笔。因此，在制备制剂后，药物组合物可以无菌过滤，否则其它方式制成无微生物污染。
本发明的ADC可以单独或以与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂合并的药物组合物的形式、以单剂量或多剂量施用于人受试者(其比例和性质由溶解度和化学性质决定，包括所选化合物的稳定性、所选择的施用途径和标准药学实践。这样的药物组合物被设计为适合于所选的施用方式，且酌情使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、包括但不限于氯化钠、稳定剂等。所述组合物可根据例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy,L.V.Allen,Editor,第22版,Pharmaceutical Press(2012)中公开的常规技术设计，该文献提供了从业者通常所知的制剂技术概要。用于药物组合物的适合载体包括任何材料，当与本发明的抗体组合时，其保留分子的活性并且不与受试者的免疫系统反应。本发明化合物虽然本身有效，但也可以以其药学上可接受盐的形式配制和施用，以便于结晶、增加溶解度等。
式I化合物可以通过化学领域中已知的方法或通过本文所述的新方法制备。制备式I化合物的方法和用于制备式I化合物的新中间体提供了本发明的进一步特征，并在以下方法中示例。
通常，其中n为1-9的式I化合物可以由式II的化合物制备(方案1)。更具体地，使式II的化合物与其中n为1-9的式III化合物在溶剂如磷酸盐缓冲的盐水和DMSO中反应，得到式I的化合物。
方案1
通常，式III化合物可以通过使MET抗体式IV)的赖氨酸基团与2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯反应来制备(方案2)。更具体地，使式IV化合物A，其为MET单克隆抗体如C8-H241-IgG4或更具体地为emibetuzumab，在溶剂如磷酸盐缓冲盐水和DMSO中与2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯反应，得到式III化合物，其中n代表2-叠氮基乙酰基-赖氨酸基团的数量，为1至9。典型地使用摩尔过量的2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯与式IV化合物的量，为11:1至5:1。优选地，2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯与式IV化合物的摩尔比约为9:1至6:1。更优选地，所述摩尔比约为7.75:1。通过改变反应条件，包括2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯与式IV化合物的摩尔比以及其他标准技术，可以在该步骤中控制n的值及其对平均药物抗体比(DAR)的贡献。
方案2
其中
表示A的官能化赖氨酸残基
通常，式II化合物可由式V化合物制备(方案3)。更具体地，使式V化合物与(4-硝基苯基)碳酸(1R,9S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-基-9-基-甲基酯在碱如二异丙基乙胺存在下反应，得到式II化合物。该反应典型地在溶剂如二甲基甲酰胺中进行。式V化合物可以通过首先使式VI化合物与式VII化合物在碱如二异丙基乙胺和活化剂如羟基苯并三唑存在下反应来制备。该反应通常在溶剂如二甲基甲酰胺中进行。所得偶合产物与碱如氢氧化锂水溶液在溶剂如甲醇中反应，得到式V化合物。
可以如制备例和实施例中所述制备式VI化合物。式VII化合物可以通过本领域普通技术人员所理解的方法制备，包括国际申请公开号WO 2002/088172中公开的方法。
方案3
制备例和实施例
缩写(未穷尽列表)
DAR：药物与抗体比
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺
HOBt：羟基苯并三唑
PBS：磷酸盐缓冲盐水
MMAE：一甲基澳瑞他汀(auristatin)E
DMF：二甲基甲酰胺
TFA：三氟乙酸
DMSO：二甲亚砜
MeOH：甲醇
LiOH：氢氧化锂
EA：乙酸乙酯
PE：石油醚
TCEP：三(2-羧乙基)膦
DCM：二氯甲烷
Std.Err：标准误差
AVG：平均
MFI：平均荧光强度
制备例1
(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯的合成
向(2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-溴-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲基酯(9.5g,23.92mmoles)在乙腈(200mL)中的溶液中加入4-(羟基甲基)-2-硝基苯酚(4g,23.65mmoles)。将该混合物冷却至0℃，同时搅拌。向该反应体系中缓慢地加入氧化银(27.3g,117.81mmoles)。将该混合物保持在10℃，同时搅拌20hr。过滤该材料，用乙酸乙酯(200mL)洗涤。真空浓缩该材料。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物(EA:PE＝5:1)，得到(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(9.80g,85.37％收率)，为黄色固体。MS m/z 508(M+Na)。
制备例2
(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(2-氨基-4-(羟基甲基)苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯的合成.
向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(9.8g,20.19mmoles)在乙酸乙酯(150mL)中的溶液中加入四氢呋喃(150mL)和二氧化铂(0.98g,4.32mmoles)。用氢气将反应容器吹扫3次。将该混合物保持在10℃，同时搅拌20hr。过滤该材料，用乙酸乙酯洗涤，真空浓缩该材料，得到(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(2-氨基-4-(羟基甲基)苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(8.1g,88.09％收率)，为无色油状物。MS m/z 456(M+H)。
制备例3
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-丙酰氨基)-4-(羟基甲基)苯氧基)-3,4,5-三乙酰氧基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲基酯的合成
向3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酸(5.74g,18.44mmoles)中加入四氢呋喃(100mL)。将该混合物冷却至0℃，同时搅拌。向该反应体系中缓慢地加入草酰氯(5mL,57.63mmoles)。然后向该反应混合物中加入3滴DMF。将该混合物保持在10℃，同时搅拌2小时。蒸发浓缩该材料，得到相应的酰氯。将(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(2-氨基-4-(羟基甲基)苯氧基)-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(8g,17.57mmoles)溶于二氯甲烷(200mL)，在搅拌下向容器中加入二异丙基乙胺(6mL,34.40mmoles)。将该混合物冷却至0℃，同时搅拌。将上述酰氯溶于20ml DCM，滴加至该反应混合物中。将该混合物保持在10℃，同时搅拌2小时。用NaHCO3水溶液(50mL)使反应淬灭。用二氯甲烷(100ml x 3)萃取该混合物，弃去水相。用Na2SO4干燥该材料，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物(DCM:EA＝1:1)，得到(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-丙酰氨基)-4-(羟基甲基)苯氧基)-3,4,5-三乙酰氧基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲基酯(7.9g,60.06％收率)，为黄色油。MS m/z 749(M+H)。
制备例4
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基氧基)甲基)-苯氧基)-3,4,5-三乙酰氧基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)-羰基氨基)丙酰氨基)-4-(羟基甲基)苯氧基)-3,4,5-三乙酰氧基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(7.2g,9.62mmoles)在二氯甲烷(250mL)和吡啶(3mL,37.10mmoles)中的混合物冷却至0℃。向该反应混合物中滴加在20mL DCM中的氯甲酸4-硝基苯酯(7.73g,38.35mmoles)。将该混合物保持在0℃，同时搅拌2hr。用NaHCO3水溶液(150ml)使反应淬灭。用二氯甲烷(150mL x 3)萃取该混合物，弃去水相。用Na2SO4干燥该材料，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物(PE:EA)，得到(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基氧基)甲基)-苯氧基)-3,4,5-三乙酰氧基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(7.02g,79.88％收率)。MS m/z 914.1(M+H)。
制备例5
(3S,4S,6S)-6-[2-(3-氨基丙酰基氨基)-4-[[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]氧基甲基]苯氧基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(即NH2-β-Glucn-MMAE)的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙酰氧基-6-[2-[3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丙酰基氨基]-4-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯氧基]四氢吡喃-2-甲酸甲酯(155mg,0.17mmol)和(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺(MMAE)(146mg,0.17mmol)溶于DMF(2mL)，向该溶液中加入DIPEA(36μL,0.21mmol)和HOBt(8mg,0.059mmol)。在室温搅拌过夜。加入MeOH(1mL)和1N LiOH(1mL)。浓缩，通过HPLC纯化(柱；Phenomenex Luna 5μm C18AXIA填充的30x 75mm柱,流动相；A：0.1％TFA水溶液,B：0.1％TFA乙腈溶液，监测；214nM,流速；85mL/min.,梯度；10-38％,梯度时间；8min.)。用冻干机干燥采集的级分，得到期望的产物(3S,4S,6S)-6-[2-(3-氨基丙酰基氨基)-4-[[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]氧基甲基]苯氧基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(NH2-β-Glucn-MMAE)(122mg,收率64％).MS m/z 1130(M+H)。
制备例6
(3S,4S,6S)-6-[2-[3-(9-双环[6.1.0]壬-4-炔基甲氧基羰基氨基)丙酰基氨基]-4-[[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]氧基甲基]苯氧基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(Octyn-β-Glucn-MMAE)的合成
将(3S,4S,6S)-6-[2-(3-氨基丙酰基氨基)-4-[[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]氧基甲基]苯氧基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(61mg,0.054mmol)(NH2-β-Glucn-MMAE)溶于DIPEA(19μL,0.109mmol)、(4-硝基苯基)碳酸(1R,9S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-基-9-基-甲酯(22mg,0.066mmol)和DMF(0.5mL)的混合物。在室温搅拌过夜。浓缩，通过HPLC纯化(柱；Phenomenex Luna 5uμm C18 AXIA填充的30x 75mm柱,流动相；A：10mM碳酸氢铵(pH＝10)水溶液,B：乙腈,监测；214nm,流速；85mL/min.,梯度；10-46％,梯度时间；8min)，得到期望的产物(3S,4S,6S)-6-[2-[3-(9-双环[6.1.0]壬-4-炔基甲氧基羰基氨基)丙酰基氨基]-4-[[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]氧基甲基]苯氧基]-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-甲酸(Octyn-β-Glucn-MMAE)(45mg,收率64％)MS m/z 1306(M+H)。
实施例1：抗-MET抗体的表达和纯化
用于产生本文提供的MET ADC的抗MET抗体可以基本上如下表达和纯化：
含有SEQ ID NO：24的DNA(编码具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链多肽)和SEQ ID NO：10的DNA(编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链多肽)的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体用于通过电穿孔转染中国仓鼠细胞系CHOK1SV(Lonza Biologics PLC,Slough,United Kingdom)。该表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS的基因。GS的表达允许谷氨酰胺的生化合成，谷氨酰胺是CHOK1SV细胞所需的氨基酸。转染后，细胞用50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(sulfoximine)(MSX)进行大量选择。MSX对GS的抑制用于增加选择的严格性。将表达载体cDNA整合到宿主细胞基因组的转录活性区中的细胞针对CHOK1SV野生型细胞进行选择，所述CHOK1SV野生型细胞表达内源水平的GS。将转染的汇合物以低密度接种以允许稳定表达细胞的接近克隆生长。可以筛选主-孔的抗MET IgG表达，然后根据需要在无血清悬浮培养物中放大。一旦鉴定出适合的细胞系，则可以根据需要在无血清悬浮培养物中按比例放大。将其中已分泌抗MET IgG的澄清培养基应用于已用相容缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)或Tris缓冲液(pH7.4)平衡的蛋白A亲和柱。洗涤柱以除去非特异性结合成分。例如，通过pH梯度(如0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5-3.0)洗脱结合的抗MET IgG。检测和/或收集抗体级分，例如通过280nm处的吸光度截取、SDS-PAGE或分析性大小排阻。可通过常规技术有效除去可溶性聚集体和多聚体，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。可以使用常规技术浓缩和/或无菌过滤抗MET IgG。在这些色谱步骤后的抗MET MET的纯度大于90％，优选地大于98％。抗MET IgG可以立即在-70℃冷冻或在4℃储存数月。
实施例2：Emibetuzumab的缀合
A部分：Emibetuzumab和β-Glucn-MMAE的缀合
应理解，如实施例2的A部分中所述的缀合结果为如下所示的MET-ADC#1缀合物的混合物。
将抗MET抗体emibetuzumab在PBS缓冲液(pH7.0-7.2)中稀释至终浓度10mg/mL。将新鲜制备的2mg/mL 2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶于无水DMSO中的溶液加入，至2-叠氮基乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯与抗体溶液的最终比例为7.75-10摩尔当量(确切的比例取决于2-叠氮基乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的来源和纯度)。将反应混合物在37℃温育2.5小时，或者在22℃±2℃温育>3小时，同时适度搅拌。温育期后，使用脱盐柱、制备型尺寸排阻色谱(pSEC)、切向流过滤(TFF)或透析从样品中除去过量的未反应或氧化的2-叠氮基乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯。将具有2-叠氮基乙酸酯的抗体浓度调节至8-10mg/mL。将溶解在无水DMSO中的辛炔-β-Glucn-MMAE(制备6)加入，至辛炔-β-Glucn-MMAE与抗体的最终比例为10-15:1摩尔当量。然后将混合物在37℃温育>8小时，或者在22℃±2℃温育>16小时，同时轻轻混合。温育后，将样品交换到期望的缓冲液中，并使用脱盐柱、制备型尺寸排阻色谱(pSEC)、切向流过滤(TFF)或透析除去过量的辛炔-β-Glucn-MMAE。
为了确定药物与抗体比(DAR)，在PBS中制备～1mg/mL的50μl ADC样品。接下来，加入1.5μl的2.5U/mL N-Glycanase和1.5μl的5X N-Glycanase反应缓冲液，然后在37℃温育4小时，以从抗体中除去N-连接的糖基化。电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-ToF)用于确定最终平均DAR。使样品通过Agilent Poroshell 300SB-C3色谱柱，使用0.1％甲酸中的10-80％乙腈梯度，然后使用Agilent 6230ToF MS以正离子模式进行ToF-MS分析，采集率为500-10,000m/z，每秒扫描1次。
ADC的DAR可以计算为n和总离子计数百分比的乘积：DAR贡献＝n x总数的百分比。例如，对于n＝2的值，DAR贡献是2x 0.203＝0.41。平均DAR是DAR贡献的总和。可检测的最高n可取决于仪器灵敏度。
如表1所示，将基本上如上文本实施例2中所述制备的MET-ADC#1缀合物的混合物的平均DAR测定为约3.3。
表1
B部分：使用可替代接头缀合Emibetuzumab和β-Glucn-MMAE
以基本上如上文实施例2中所述的方法，可以使用各种长度的替代接头代替2-叠氮基乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯，如4-偶氮丁酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯、叠氮基-PEG4-NHS酯或叠氮基-PEG8-NHS酯，以制备其他MET ADC的混合物，其分别在本文中具体称为MET-ADC#2、MET-ADC#3或MET-ADC#4。
C部分：Emibetuzumab和Mal-C-vc-PABC-MMAE的缀合
使用本领域众所周知的方法，在优化的条件下通过缀合emibetuzumb和马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羰基-一甲基澳瑞他汀E(即Mal-C-vc-PABC-MMAE)产生MET-ADC#6缀合物的混合物，所述优化的条件得到DAR约为3.3-3.8的MET-ADC#6缀合物的混合物。
实施例4：离体小鼠血浆中接头-有效负荷缀合物稳定性
ADC的一个重要特征是抗体和有效负荷(细胞毒性)之间接头的稳定性。从毒性和效能角度来看，血液中有效负荷的快速释放可能是有害的。作为深入了解接头组成对接头-有效负荷缀合的外周血稳定性的影响的手段，使用在鼠血浆中的定时温育方法进行离体评估。使用鼠基质中的离体血浆接头-有效负荷缀合物稳定性来评估由MET-ADC#2、MET-ADC#3和MET-ADC#4内的接头赋予的缀合物稳定性程度。MET-ADC#2、MET-ADC#3和MET-ADC#4的接头-有效负荷稳定性特性通过在每个ADC在37℃掺和鼠血浆72小时后测量DAR(药物与抗体比)来表征。将血浆温育后的DAR与温育前的初始DAR进行比较(表2)。使用基于珠的抗人IgG免疫亲和捕获方法测定每个ADC的DAR。捕获ADC后，将样品去糖基化(在珠上)，使用酸洗脱并如报道的在使用LC-MS系统(Q-TOF)检测重链和轻链结构之前还原(参见例如Kaur,S.等人,Bioanalytical assay strategies for the development of antibody-drugconjugate biotherapeutics.Bioanalysis,2013,5(2):201-226)。离体鼠血浆发现显示了接头赋予的缀合物稳定性的等级顺序是MET-ADC#2>MET-ADC#3>MET-ADC#4。数据表明，具有增加的疏水性含量的较短接头赋予增加的与MET抗体emibetuzumab缀合物的稳定性。
表2
MET ADC分子 初始DAR 在鼠血浆中温育后剩余的初始DAR的％(72hr./37℃)
MET-ADC#2 4.7 112.5
MET-ADC#3 3.6 42.2
MET-ADC#4 3.7 12.9
实施例5：小鼠中的药代动力学和接头-有效负荷缀合物稳定性
MET-ADC#1和MET-ADC#2的总IgG和缀合的IgG有效负荷药代动力学在单次静脉注射(IV)剂量2.5mg/kg的单剂量水平后在雄性CD-1小鼠中表征，以评估其暴露在体内系统中的分布和接头-有效负荷稳定性。使用基于珠的抗人IgG免疫亲和捕获方法测定总IgG浓度和缀合的IgG有效负荷。捕获ADC后，将总IgG样品还原、烷基化并用胰蛋白酶处理，然后使用LC-MS检测重链。对于IgG缀合的有效负荷分析，另外用β-葡萄糖醛酸酶处理样品，其导致糖苷键的水解并从抗体中释放(即去缀合)有效负荷(MMAE)。通过LC-MS/MS定量释放的有效负荷以确定缀合的IgG有效负荷浓度。
小鼠PK参数列于表3中。来自总IgG的鼠PK参数(Cmax、AUC、CL和T1/2)，与MET-ADC#1的缀合IgG有效负荷分析相比，是合理类似的(表3)。MET-ADC#1的总IgG和缀合的IgG有效负荷来源清除率(CL)值为0.4mL/hr/kg，而消除半衰期(T1/2)值分别为～187小时和～125小时。来自两个分析的可比较的CL值表明MET-ADC#1的接头-有效负荷组分在鼠血液循环中是稳定的。
MET-ADC#2的总IgG和缀合的IgG有效负荷来源清除率(CL)值显示约2倍的差异(表3)，其值分别为0.3和0.6mL/hr/kg。MET-ADC#2的消除半衰期(T1/2)值分别在总IgG和缀合的IgG有效负荷测定中分别为175和80小时。对于MET-ADC#2观察到的总IgG和缀合的IgG有效负荷CL值的较大差异表明，该分子在体内可能不如MET-ADC#1稳定。
表3
＊IgG CP＝缀合的IgG有效负荷
a平均最大观测血清浓度
b从0到最后小时或至无穷时的血清浓度-时间曲线下的面积
c稳态时的分布容量
d消除半衰期
e总机体清除率
实施例6：Emibetuzumab和MET-ADC#1与MET-ECD的结合分析
表面等离子体共振生物传感器如2000、3000或T100(Biacore Life Sciences Division,GE Healthcare,Piscataway,NJ)可用于根据本领域已知的方法测量抗体和ADC的结合动力学和亲和力。除非另有说明，否则所有试剂和材料均可从AB(Upsala,Sweden)购买，测量可在37℃进行，以模拟生理条件。
简言之，可以将样品溶解在HBS-EP缓冲液(150mM氯化钠，3mM EDTA，0.005％(w/v)表面活性剂P-20和10mM N-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)中，pH7.4或7.6)。可以使用在所有四个流动池(Fc)上含有固定化蛋白A(其可以使用标准NHS-EDC胺偶联产生)的CM5S传感器芯片来应用捕获方法。通过最初稀释到运行缓冲液中可以制备0.5μg/mL的抗体或ADC样品，然后可以以10μl/min的流速测试它们的捕获达1分钟。基于捕获的量，可以相应地调整抗体或ADC浓度或注射时间以靶向约25RU至35RU之间的期望的捕获量。通过稀释到运行缓冲液中，可以制备终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2和0(空白)nM的MET-ECD。每个分析循环可以由如下组成：(1)在分开的流动池(Fc2、Fc3和Fc4)上捕获抗体样品；(2)以100μL/min的速度在所有Fc上注射250μL(150秒)MET-ECD；(3)返回缓冲液流20分钟以监测解离阶段和(4)以10μL/min在所有Fc上用5μL(30秒)注射甘氨酸pH1.5再生芯片表面。可以使用标准双参比处理数据，并使用Biacore T100评估软件2.0版或Biacore T200评估软件1.0版拟合1:1结合模型，以确定结合率(kon,M-1s-1单位)、解离速率(koff,s-1单位)、Rmax(RU单位)和结合亲和力KD(nM)。
平衡解离常数(KD)由关系式KD＝koff/kon计算。
如上所述测试MET-ADC#1，以确定其与MET-ECD的结合动力学和结合亲和力。结果总结在下表4中。MET-ADC#1与MET-ECD结合的结合亲和力(KD)与emibetuzumab相当。
表4：MET ADC和Emibetuzumab与MET-ECD的结合动力学和亲和力
根据3次在37℃的独立实验测定(±Std Dev)
实施例7：与emibutuzumab比较MET-ADC#1不具有增加的激动剂活性
本领域已充分证明了产生高结合亲和力MET抗体而没有显著激动剂活性的困难。例如，Sato等报道“the discovery of therapeutic antibodies against MET has beenvery difficult,and antibodies that compete with HGF typically act as agonistsby dimerizing the receptor(Sato等人,Neoplasia,11:4pp.355-364,(2009)引述Prat,M.等人,J Cell Sci 111(Pt 2),237-247(1998))。另外，WO 1996/38557和WO 2010/059654都描述了各种MET抗体(分别包括5D5和OptD11)，其显示具有激动剂活性。因此，为临床环境开发的一些MET抗体(例如5D5)被设计为单价的(即单臂)，以试图将这种cMET抗体的激动活性降低至可接受水平用于抗癌活性临床研究，条件是将抗体修饰成单价(即单臂)抗体(Jin,H.等人,MetMab,the one-armed 5D5 anti-c-Met antibody,inhibits orthotopicpancreatic tumor growth and improves survival.Cancer Res 68,4360-4368(2008))。然而，可以预期降低化合物相对于其与MET结合的效价(与二价相比为单价)会降低其体内抗肿瘤活性。Liu,L.等人,Clin Cancer Res；20(23)；6059–70(2014)之前报道了使用HGF和激动剂二价MET抗体5D5作为阳性对照，使用一组体外生物测定法来表征各种MET抗体(包括C8-H241-IgG4)的激动剂特性。Liu等人(2014)之前报道了，emibetuzumab在与MET结合后仅诱导pan-AKT的弱和瞬时磷酸化，而pan-AKT的这种弱磷酸化不会刺激七(7)功能性MET激动剂生物试验中的生物活性。然而，在相同的功能测定中，由MET抗体5D5和OptD11诱导的更高水平的AKT磷酸化与细胞增殖、迁移和抗凋亡(即对于用作癌症治疗剂的预期用途而言不期望的活性)相关良好(Liu等人,(2014))。
因为已经报道了MET激动性抗体增加了肝细胞增殖和毒性，所以可以使用磷-AKT测定来测试MET-ADC的MET激动剂活性。简言之，Caki-1细胞可在含有0.1％BSA的无血清培养基中饥饿过夜，然后以5μg/mL用ADC或裸MET抗体处理期望的持续时间。例如，可以通过MSD ELISA分析细胞裂解物的pan-AKT的磷酸化。
在基本上如上文本实施例7中所述进行的体外磷-AKT生物测定中，确定MET-ADC#1具有与其未缀合的亲本抗体emibetuzumab相同的低至无激动剂活性(参见图2)。在相同的测定中，激动性二价MET抗体optD11用作阳性对照(参见图2)。令人惊讶的是，与MET-ADC#1和/或未缀合的emibetuzumab相比，与emibetuzumab一起使用的其他缀合方法(例如MET-ADC#6(参见图2))导致MET-ADC缀合物具有显著增加的激动剂活性。
实施例8:MET-ADC#1与结肠癌细胞系HT-29上的细胞表面MET的结合与未缀合的亲本MET Ab emibetuzumab相当
结肠癌细胞系HT-29(ATCC,Manassas,VA；目录#HTB38D)在表面表达高水平的MET并且荷有至少BRAF、P53和PIK3突变。为了确定与未缀合的亲本抗体相比，MET-ADC#1中是否维持对细胞表面MET的结合亲和力，可以将HT-29结肠癌细胞悬浮在FACS缓冲液中，含有Alexa 488标记的emibetuzumab，和2倍稀释度100nM的未标记emibetuzumab或MET-ADC#1，在冰上45分钟。可以用缓冲液洗涤细胞两次，并且可以使用FACS分析来测量MET-ADC或MET抗体与Alexa 488标记的emibetuzumab竞争结合HT-29肿瘤细胞表面上的MET的能力。
基本上如上文实施例8中所述进行实验，确定MET-ADC和MET抗体与细胞表面上表达的MET蛋白的结合。如图1所示，MET-ADC#1显示出对HT-29表达的细胞表面MET的结合活性，与未缀合的亲本MET抗体emibetuzumab相当(图1)。
实施例9：MET-ADC#1和Emibetuzumab表现出对细胞表面MET内化的相当的活性
为了测量MET-ADC#1是否与其亲本MET抗体emibituzumab类似地诱导MET内化，将细胞用终浓度为33nmol/L的MET-ADC#1、emibetuzumab、对照IgG4-Lys-MMAE或对照IgG4处理过夜，并用无酶解离溶液解离。用2mg/mL Alexa Fluor 488标记的Lilly专利MET检测抗体(其结合与emibetuzumab不同的表位)将解离的细胞标记1小时。通过FACS针对每个样品获得10,000个事件。将结果绘制为emibetuzumab或MET-ADC#1处理的样品相对于对照IgG4或对照IgG4-Lys-MMAE的百分比。MET-ADC#1显示出与emibetuzumab相当的内化率(图3)。
实施例10：MET-ADC#1杀伤超表达MET的肿瘤细胞，与各种已知的赋予抗性的突变无关
已显示结肠癌细胞系HT-29表达高水平的MET(约161,000MET受体/细胞)以及荷有BRAF突变。因此，HT-29细胞系可用于确定测试的MET-ADC是否可以在体外杀伤超表达MET的肿瘤细胞。
简言之，可将在100μL培养基中的2-3x 103个细胞/孔接种在96孔板中，并在37℃、5％CO2下温育过夜。MET-ADC、MET抗体、对照MMAE或缀合至MMAE的对照hIgG4(以半胱氨酸缀合抗体)，可在无血清培养基中以1:3稀释，从100nM(最终)开始，在50μL中以3x浓度稀释至HT-29细胞中。在37℃、5％CO2加湿培养箱中细胞再生长5-6天结束时，将平板平衡至室温30分钟，然后可以加入100μL/孔CellTiter-试剂(Promega Corp.,Fitchburg,WI)以评估细胞活力。可以通过测量发光来确定细胞活力。
基本上如本实施例10中所述进行的测定证明，MET-ADC#1比亲本抗MET抗体emibetuzumab、游离MMAE或emibetuzumab和游离MMAE的组合更好地杀伤表达MET的HT-29肿瘤细胞。更具体地，MET-ADC#1杀伤HT-29细胞的EC50＝0.038+/-0.007nM和更高，并且在所有测定中还包括与MMAE赖氨酸缀合的非结合对照hIgG4(即hIgG4-Lys-MMAE)，以确认细胞杀伤是抗原依赖性的。令人惊讶的是，MET-ADC#6比MET-ADC#1的活性低，表明具有相同抗体的优化连接、有效负载和缀合方法在抗肿瘤活性方面存在差异。亲本抗体，emibetuzumab和hIgG4-MMAE对照在HT-29细胞中未显示出显著的细胞杀伤活性。有意思的是，ABB-399，一种包含抗MET抗体ABT-700的MET-ADC，通过半胱氨酸残基与MMAE缀合，在HT-29杀伤试验(Strickler,J.H.等人)中显示EC50＝9.0+/-1.4nM，该试验基本上如本实施例10的A部分所述进行。与ABBV-399相比，使用MET-ADC#1观察到的200倍更高的杀伤HT-29肿瘤细胞的效能仅是MET-ADC#1与ABBV-399之间令人惊讶的功能差异的一个例子。
在使用其他细胞的类似实验中，MET-ADC#1杀伤超表达MET的RKO(BRAF，PIK3)、CXF-269L(TP53)和LS411N(BRAF，PIK3)结肠癌细胞，尽管有所示下游突变(数据未显示)和不同水平的MET表达(即MET密度分别约为16,000-50,000、185,000和198,000个受体/细胞)。此外，MET-ADC#1显示出比MET-ADC#6(即emibetuzumab-Mal-vc-PABC-MMAE)优异的杀伤活性。
实施例11：肿瘤细胞MET表达水平与对MET-ADC敏感性的相关性
基本上如上文实施例10中评估MET受体密度所述，可以测试各种肿瘤细胞系和正常人细胞的MET-ADC诱导的细胞杀伤活性。通过使用QIFIKIT(Dako)对培养细胞上的细胞表面抗原进行间接免疫荧光染色来测定MET细胞表面密度。简言之，可以如上所述从培养瓶中收获细胞用于FACS分析，将其加入到96孔板中并在4℃下与5μg/mL的emibetuzumab或hIgG4一起温育。温育45分钟后，可以将细胞在冰上与在FACS缓冲液中1:50稀释的FITC缀合的抗体一起温育1小时。然后可以洗涤细胞，并且可以使用Becton Dickinson LSRII流式细胞仪通过QIFIKIT珠的间接免疫荧光染色来确定受体数量。
基本上如实施例10和11中所述进行的实验的结果总结在表10中。简言之，MET-ADC#1杀伤具有低至16,000个受体/细胞的RKO肿瘤细胞，但在杀伤具有类似受体数目的正常人内皮细胞方面效果较差。总体而言，除了自分泌HGF-KP4外，MET受体数量与杀伤活性相关，自分泌HGF-KP4在较低受体密度下显示增强的杀伤，并且CFPAC-1由于内化不良而变得具有抗性。与MET-ADC#1观察到的结果形成鲜明对比的是，据报道，对ABBV-399的敏感性而言，ABBV-399介导的肿瘤细胞杀伤具有MET细胞表面分子>100,000的近似阈值，ABBV-399为包含MET抗体ABT-700的MET ADC，ABT-700通过半胱氨酸残基与一甲基澳瑞他汀E缀合(参见Strickler,J.H.等人,Phase 1,open-label,dose-escalation and expansion study ofABBV-399,an antibody drug conjugate(ADC)targeting c-Met,in patients(pts)withadvanced solid tumors,J.Clin.Oncol.34,(增刊；摘要2510)(2016))。此外，MET-ADC#1在各种超表达MET的肿瘤中表现出细胞杀伤活性，包括胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌；肝癌、成胶质细胞瘤；肺癌、前列腺癌和头颈癌(表10)。如果肿瘤细胞对MMAE敏感而不分泌HGF，则MET-ADC#1可以杀伤肿瘤细胞，近似阈值为MET细胞表面密度>32,000受体/细胞。
表10
实施例12：在CRC(HT-29)、胰腺(Bxpc3和KP-4)、胃(Hs746t)和肺(Calu-6)癌小鼠异种移植模型中肿瘤生长的抑制
6-至7-周龄的雌性无胸腺裸鼠可商购获得，包括来自Harlan Laboratories(Indianapolis，IN)。使小鼠适应环境一周，并在正常的低脂肪(4.5％)饮食中随意喂食，这可以在研究期间持续。肿瘤细胞可购自ATCC，并可在细胞培养基中培养，如RPMI 1640(LifeTechnologies)，含有L-谷氨酰胺，25mM HEPES补充10％FBS和1mM丙酮酸钠。可以分离细胞，用无血清培养基洗涤，然后在无血清RPMI 1640中以50x 106个细胞/mL的终浓度重悬浮。可以在受试小鼠的后胁腹皮下注射在无血清生长培养基和Matrigel(Becton Dickinson，Bedford，MA)的1:1混合物中的约5x 106的肿瘤细胞。可以每周两次进行肿瘤和体重测量。在治疗之前，可以使用随机化算法基于肿瘤大小随机分组小鼠。当平均肿瘤体积达到100mm3时，可以开始治疗。将随机分组的小鼠分成不同组，每周一次通过尾静脉注射给予抗体。
MET-ADC和对照hIgG4-MMAE可在给药前在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备。肿瘤大小可通过卡尺测量确定。肿瘤体积(mm3)可以从公式A2x B x 0.536估算，其中A较小的垂直直径，且B为较大的垂直直径。可以将肿瘤体积数据转换为对数标度以均衡跨时间和治疗组的方差。可以使用SAS PROC MIXED软件(SAS Institutes Inc,Cary,NC)、通过时间和处理的双向重复测量ANOVA分析对数体积数据。在每个时间点将治疗组与指定的对照组进行比较。
A部分：如上文实施例12中所述生成携带HT-29结肠癌肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠，并用MET-ADC#1和MET-ADC#7每周处理一次，连续3周。结果总结在表11中。图6示出MET-ADC#1、MET-ADC#7(即C8-H241-IgG2-Cys-MMAE)和hIgG4-Cys-MMAE对照在1mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的处理结果。
当在HT-29异种移植物中测试时，与hIgG4-Cys-MMAE或MET-ADC#7相比，MET-ADC#1显示出极优异的功效(参见图6)。在基本上如实施例12中所述进行的单独实验中，未缀合的亲本抗体emibetuzumab不抑制HT-29肿瘤生长(数据未显示)。
表11.HT-29小鼠异种移植物模型中MET-ADC功效的概述＊
＊所有这些实验均通过i.p.使用3mg/kg x3 Q7D。
^所有这些实验均通过i.p.使用1mg/kg x3 Q7D。
B部分：胰腺癌细胞系BxPC-3和KP-4具有低水平的细胞表面MET表达。在使用BxPC-3或KP-4细胞的基本上如本实施例12中所述产生的胰腺癌异种移植模型中，与对照hIgG4-Lys-ADC相比，MET-ADC#1显示出显著的抗肿瘤活性(分别参见图7或图8)。
C部分：胃癌细胞系Hs746T以中等水平表达细胞表面MET并且荷有MET外显子14缺失。可以开发使用Hs746T癌细胞的胃癌异种移植模型，以评估MET-ADC在这种类型的胃癌中的活性。
使用具有MET外显子14遗漏的Hs746T癌细胞的胃癌异种移植模型基本上如上文实施例12中所述产生。具有Hs746T异种移植物的小鼠用IgG4 Lys-ADC对照(3mg/kg)和MET-ADC#1处理。简言之，用3mg/kg MET-ADC#1每周一次处理4周的小鼠Hs746T细胞异种移植物导致比IgG4 Lys-MMAE对照处理显著更高的抗肿瘤功效(图9)。结果显示：MET-ADC#1在胃癌Hs746t模型中诱导了持久且完全的肿瘤消退。对于Calu-6非小细胞肺癌模型，在用MET-ADC#1处理后观察到初始肿瘤消退和稳定的疾病状态(图10)。
实施例13：不同癌症类型的患者来源异种移植物(PDX)模型中的肿瘤生长抑制
可以获得源自患者的肿瘤样品，并且可以将来自个体患者的肿瘤片段植入单个免疫受损的小鼠中并使其生长直至其达到约100-200mm3的体积。MET-ADC或hIgG4同种型对照ADC可以每周一次施用，连续4周，剂量为5mg/kg。肿瘤可通过电子卡尺每周测量两次。也可以定期评估体重。肿瘤体积可使用下式计算：A2x B x 0.536，其中A是较小的垂直直径，且B为较大的垂直直径。
A部分：本领域已知胰腺肿瘤超表达MET并具有超过90％的KRAS突变(Yabar,C.S.和Winter,J.M.,Gastroenterol Clin N Am 45：429-445(2016))。将来自40个人胰腺癌患者的胰腺肿瘤样品单独植入不同的免疫受损小鼠(即每只小鼠携带来自患者的胰腺肿瘤的一个肿瘤)，基本上如上文实施例12中所述进行。治疗的40个患者来源的异种移植物中的38个在每周施用5mg/kg MET-ADC#1后进行评估，持续共四次剂量。几乎所有测试的PDX肿瘤都显示出在肿瘤细胞上具有中等至高水平的MET表达(数据未显示)。
简言之，与对照hIgG4-ADC治疗的荷有PDX肿瘤的动物相比，MET-ADC#1显著减小了胰腺癌PDX肿瘤的体积：
CR：完全响应(肿瘤体积<＝14mm3)：8
PR：部分响应(％消退<＝-50％和肿瘤体积>14mm3)：9
SD：稳定的疾病(％δT/C<＝10％和％消退>-50％)：7
PD：进行性疾病(％δT/C>10％)：16
ORR：总体响应率(总40内的CR+PR)：43％
DCR：疾病控制率：(总40内的CR+PR+SD)：60％
在基本上如上文实施例13中所述进行的实验中，MET-ADC#1显示出比吉西他滨和abraxane(注射用白蛋白结合紫杉醇)的组合(即胰腺癌的标准护理疗法)更好的功效，其中无进展生存(PFS)概率降低近2倍(危险比＝0.56)(数据未显示)。肿瘤被确定具有在细胞表面上表达的高水平的MET。通常，胰腺肿瘤表现出KRAS突变、高基质含量以及对靶向治疗、化学疗法或小分子MET抑制剂的抗性。
B部分：来自37名人结肠直肠癌患者的结肠直肠肿瘤样品被单独植入不同的免疫受损小鼠(即每只小鼠携带一种源自患者胰腺肿瘤的肿瘤)，基本上如上文实施例13中所述进行。评估来自37名患者来源的每周施用1或3mg/kg MET-ADC#1的异种移植物的数据，共计4个剂量。与MET-ADC#1在胰腺癌PDX模型中显示的显著的抗肿瘤活性形成鲜明对比，与荷有PDX肿瘤的对照hIgG4-ADC处理的动物相比，MET-ADC#1在结肠直肠癌PDX模型中几乎不显示出活性。更具体地，MET-ADC#1给药导致5.4％(2/37)完全反应(CR)和8％(3/37)稳定疾病(SD)。
C部分：将来自4名人胆管癌患者的肿瘤样品单独植入不同的免疫受损小鼠(即每只小鼠携带一种源自患者胆管癌肿瘤的肿瘤)，基本上如上文本实施例13中所述进行。患者来源的异种移植物每周施用5mg/kg MET-ADC#1的剂量，总计4个剂量。如图11所示，MET-ADC#1显著抑制肿瘤生长。
对于本实施例13中描述的研究，在MET-ADC#1处理期间未观察到体重的显著减轻。

Claims (18)

1.下式的抗体-药物缀合物(ADC)：
其中A为结合MET的IgG4抗体并且包含：
(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第一重链，和
(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的第一轻链，
且其中n为1-9。
2.权利要求1的ADC，其中A包含：
(a)第一重链和第二重链，其中重链各自包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；和
(b)第一轻链和第二轻链，其中轻链各自包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的ADC，其中第一重链与第一轻链形成链间二硫键，且第二重链与第二轻链形成链间二硫键，且第一重链与第二重链形成两个链间二硫键。
4.权利要求1-3任一项的ADC，其中A被糖基化。
5.组合物，包含权利要求1-4任一项的ADC的混合物，其中n为1-9，且平均DAR为2-5。
6.权利要求5的组合物，其中平均DAR为2.9-4。
7.权利要求6的组合物，其中平均DAR为2.9-3.3。
8.权利要求5-7任一项的组合物，其中该组合物诱导在肿瘤细胞上表达的细胞表面MET的内化和/或降解。
9.权利要求5-8任一项的组合物，其中该组合物在体外增殖、血管发生和/或迁移生物测定中缺少显著的功能性激动剂活性。
10.权利要求1-4任一项的ADC或其盐，用于疗法。
11.权利要求1-4任一项的ADC或其盐，用于治疗癌症。
12.权利要求11的ADC或其盐，其中所述癌症是胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾乳头状癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌或肺癌、NSCLC、SCLC、胆管癌、黑素瘤或眼色素层黑素瘤。
13.权利要求11-12任一项的ADC或其盐，其中所述癌症的特征在于包含具有一种或多种RAS、KRAS、BRAF、P53、外显子14和/或PI3K突变的细胞。
14.药物组合物，包含权利要求1-4任一项的ADC或其盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
15.治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的权利要求1-4任一项的ADC或其盐。
16.权利要求15的方法，其中所述癌症是人的胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾乳头状癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌或肺癌、NSCLC、SCLC、胆管癌、黑素瘤或眼色素层黑素瘤。
17.权利要求15-16任一项的方法，其中所述癌症的特征在于包含具有选自RAS、KRAS、BRAF、P53、外显子14和/或PI3K的一种或多种突变的细胞。
18.下式的化合物
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