KR102084806B1 - 인테그린 αvβ6에 대한 항체 및 암을 치료하기 위한 그의 용도 - Google Patents

인테그린 αvβ6에 대한 항체 및 암을 치료하기 위한 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인테그린 αvβ6에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 각종 암의 치료 및 진단에 유용할 뿐만 아니라 αvβ6을 검출하는 데 유용하다.

Description

인테그린 αvβ6에 대한 항체 및 암을 치료하기 위한 그의 용도 {ANTIBODIES TO INTEGRIN αvβ6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER}
본 출원은 2012년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 61/600,499 및 2012년 2월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 61/602,511을 우선권 주장하며, 이들 가출원은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
간단한 개요
본원에는 인테그린 αvβ6에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 및 암을 치료하기 위해 그를 사용하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 항체는 15H3 항체를 포함한다. 15H3 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 뮤린 모노클로날 항체이다. 이러한 15H3 뮤린 항체의 키메라 및 인간화 형태 뿐만 아니라 그의 인간 형태가 본 발명에 의해 포괄된다. 15H3 항체의 키메라, 인간화 및 인간 형태는 뮤린 15H3 항체와 실질적으로 동일한 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고, 인테그린 αvβ6에 특이적으로 결합한다. 뮤린 15H3 항체의 3개 중쇄 가변 영역 CDR은 서열 3 (H-CDR1), 서열 4 (H-CDR2), 및 서열 5 (H-CDR3)에 제공된 바와 같은 서열을 갖는다. 뮤린 15H3 항체의 3개 경쇄 CDR은 서열 6 (L-CDR1), 서열 7 (L-CDR2), 및 서열 8 (L-CDR3)에 제공된 바와 같은 서열을 갖는다. 임의로, αvβ6에 특이적으로 결합하는 뮤린 15H3 항체와 실질적으로 동일한 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 인간화 항체에서는, 중쇄 가변 영역의 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 1개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 2개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 4개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30 중 적어도 하나는 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유되고; 위치 H72는 D 또는 Q에 의해 점유되고; 위치 H73은 T 또는 K에 의해 점유되고; 위치 H75는 T 또는 S에 의해 점유되고; 위치 H78은 V 또는 A에 의해 점유되며; 위치 93은 A 또는 V에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기 중 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하는 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 각각의 CDR 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 2의 것이다. 한 측면에서, 본원에는 서열 3 (CDR1), 서열 4 (CDR2), 및 서열 5 (CDR3)에 제시된 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 서열, 및 서열 6 (CDR4), 서열 7 (CDR5), 및 서열 8 (CDR6)에 제시된 바와 같고 각각의 CDR 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 인테그린 αvβ6에 특이적으로 결합하는 키메라 또는 인간화 항체가 제공된다. 다른 경우와 마찬가지로 이 경우에도 본 출원에서 카바트(Kabat) 넘버링은 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서의 위치를 기재하기 위해 사용된다.
본 발명은 또한, HA (서열 9)에 대해 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 LA (서열 10)에 대해 90% 이상 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어, 인간화 항체)를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 프레임워크 영역 내에 1개 이상의 뮤린 15H3 복귀돌연변이를 갖는 HA (서열 9)에 대해 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 LA (서열 10)에 대해 90% 이상 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. "가변 쇄 프레임워크 영역 내에 1개 이상의 뮤린 15H3 복귀돌연변이를 갖는"다는 것은 수용자 가변 쇄 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 공여자 뮤린 15H3 항체 내의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 교체되는 것을 의미한다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 1개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 2개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 4개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 모두가 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30 중 적어도 하나는 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유되고; 위치 H72는 D 또는 Q에 의해 점유되고; 위치 H73은 T 또는 K에 의해 점유되고; 위치 H75는 T 또는 S에 의해 점유되고; 위치 H78은 V 또는 A에 의해 점유되며; 위치 93은 A 또는 V에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기 중 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하는 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 각각의 CDR 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 2의 것이다.
본 발명은 또한, HB (서열 11), HF (서열 12), HG (서열 13), HK (서열 14), HL (서열 15), HM (서열 16), HN (서열 17), HO (서열 18), HQ (서열 19), HR (서열 20), HS (서열 21), HT (서열 22), 또는 HU (서열 23)에 대해 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 대해 90% 이상 동일한 경쇄 가변 영역, 및 이들의 모든 조합 (즉, 항체는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나와 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함할 수 있다)을 포함하는 항체 (예를 들어, 인간화 항체)를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 HA, HB, HF, HG, HK, HL, HM, HN, HO, HQ, HR, HS, HT, HU에 대해 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 LA, LB, LC, LD, LE, LF 또는 LG에 대해 95% 이상 동일한 경쇄 가변 영역, 및 이들의 모든 조합 (즉, 항체는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나와 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함할 수 있다)을 포함한다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 1개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 2개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30 중 적어도 하나는 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유되고; 위치 H72는 D 또는 Q에 의해 점유되고; 위치 H73은 T 또는 K에 의해 점유되고; 위치 H75는 T 또는 S에 의해 점유되고; 위치 H78은 V 또는 A에 의해 점유되며; 위치 93은 A 또는 V에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기 중 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하는 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산 잔기에 의해 점유된다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 실질적으로 서열 2의 것이다. 임의로, 이들 실시양태 중 어느 것에서도, 중쇄 가변 영역의 CDR은 서열 1의 것이고, 경쇄 가변 영역의 CDR은 각각의 CDR 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 2의 것이다. 본원에 기재된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 신호 펩티드에 임의로 융합된다. 예시되는 중쇄 뮤린 신호 펩티드는 서열 33에 제시되어 있고; 예시되는 중쇄 인간 신호 펩티드는 서열 34에 제시되어 있으며; 예시되는 경쇄 뮤린 신호 펩티드는 서열 35에 제시되어 있고; 예시되는 경쇄 인간 신호 펩티드는 서열 36에 제시되어 있다.
본원에 기재된 항체의 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 임의로 융합되고, 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 임의로 융합된다. 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역일 수 있거나 또는 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태, 예를 들어 천연 인간 불변 영역과 비교해서 Fc감마 수용체에 대한 결합성이 감소된 것일 수 있다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형이다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 서열 30을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 불변 영역은 서열 31을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 서열 32를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 불변 영역은 서열 31을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, 상기 항체는 세포독성제에 접합된다 (즉, 항체-약물 접합체). 본 발명의 특정 항체는 인간 αvβ6에 대한 친화도가 15H3 항체의 뮤린 버전 보다 더 크다. 일부 기타 항체는 인간 αvβ6에 대한 친화도가, 경쟁 결합 검정 또는 포화 결합 검정 (예컨대, 본 실시예에 기재된 것)에 의해 결정된 바와 같이 15H3 항체의 뮤린 버전 보다 10배 이하 더 낮거나, 바람직하게 6배 이하 더 낮거나, 보다 바람직하게 5배 이하 더 낮거나, 더욱 더 바람직하게 2배 이하 더 낮다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 인간화 항체는 인간 αvβ6에 대한 친화도가, 인간 αvβ6에 대한 뮤린 15H3 항체의 친화도의 약 10배 이내, 바람직하게 약 5배 이내, 보다 바람직하게 약 2배 이내이다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 인간화 항체는 인간 αvβ6에 대한 겉보기 해리 상수 (kd)가 0.1 nM 내지 10 nM, 바람직하게 0.1 nM 내지 5 nM, 보다 바람직하게 0.1 nM 내지 2 nM, 0.5 nM 내지 2 nM, 또는 0.5 nM 내지 1.5 nM의 범위 이내이다.
또한, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 항체 중 어느 것의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 추가로, 암 환자에게 상기 언급된 바와 같은 항체의 유효 요법을 투여하는 것을 포함하는, 상기 암 환자의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체를 세포독성제에 접합시킨다. 암은 αvβ6 항원을 발현하는 것이다. 임의로, 암은 방광암, 두경부암 (구순암, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암 및 후두암 포함), 피부암, 폐암, 췌장암, 자궁암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 자궁경부암, 결장암, 전립선암, 난소암, 위암, 또는 간암이다. 임의로, 암은 편평 세포 암종 또는 선암종이다.
도 1은 선택 인간화 15H3 중쇄 가변 영역 (상부 2개 패널) 및 경쇄 가변 영역 (하부 2개 패널)을 수반한 모 뮤린 mAb (15H3으로서 지칭됨)의 아미노산 서열을 정렬한 것이다.
도 2는 HB 중쇄를 갖는 항체 및 모 뮤린 항체 (m15H3으로서 지칭됨)를 이용하여 인간 αvβ6을 발현하는 293F 세포 상에서의 경쟁 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 3a-c는 항체 HBLC 및 HTLC를 이용하여 αvβ6을 발현하는 FDC-P1 세포 및 293F 세포 상에서의 포화 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 4는 HB, HL 및 HN 중쇄를 갖는 항체 및 모 뮤린 항체 (m15H3으로서 지칭됨)를 이용하여 αvβ6을 발현하는 293F 세포 상에서의 경쟁 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 5는 HB, HQ 및 HR 중쇄를 갖는 항체 및 모 뮤린 항체 (m15H3으로서 지칭됨)를 이용하여 αvβ6을 발현하는 293F 세포 상에서의 경쟁 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 6은 HM 중쇄를 갖는 항체 및 모 뮤린 항체 (m15H3으로서 지칭됨)를 이용하여 αvβ6을 발현하는 293F 세포 상에서의 경쟁 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 7은 HB, HL, HS, HT 및 HU 중쇄를 갖는 항체 및 모 뮤린 항체 (m15H3으로서 지칭됨)를 이용하여 αvβ6을 발현하는 293F 세포 상에서의 경쟁 결합 연구 결과를 도시한 것이다.
도 8은 종양 마이크로 어레이로부터의 방광암 샘플 상에서 IHC에 의한 αvβ6 단백질 발현 분석을 도시한 것이다.
도 9a-9f는 세포독성 검정에서 모 마우스와 유사한 반응을 나타낸 인간화 15H3 항-αvβ6 ADC를 도시한 것이다.
도 10은 누드 마우스에서 디트로이트(Detroit) 562 두경부암 세포주의 이종이식편 연구 결과를 도시한 것이다. 용량이 상기 도면 상에 표시되어 있다. 첫 번째 투여 시기는 종양 크기가 대략 100 ㎣에 도달하는 때이다.
도 11은 누드 마우스에서 HPAFII 췌장암 세포주의 이종이식편 연구 결과를 도시한 것이다. 용량 및 투여 시기가 상기 도면 상에 표시되어 있다.
도 12는 누드 마우스에서 BxPC-3 췌장암 세포주의 이종이식편 연구 결과를 도시한 것이다. 용량 및 투여 시기가 상기 도면 상에 표시되어 있다.
상세한 설명
본 발명은 특히, αvβ6에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 및 그의 접합체를 제공한다. 이러한 항체는 αvβ6 발현과 연관된 병태 (각종 암 포함)의 치료 및 진단에 유용할 뿐만 아니라 αvβ6을 검출하는 데 유용하다. αvβ6에 특이적으로 결합하는 항체는 β6 인테그린 서브유닛 단독 및/또는 αvβ6 인테그린 복합체와 특이적으로 결합하지만, αv 서브유닛 단독과는 그렇지 못하다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성성분으로 확인 및 분리되고/되거나 이러한 구성성분으로부터 회수된 항체 및/또는 재조합적으로 생성되는 항체를 지칭한다. "정제된 항체"는 간섭 단백질 및 그의 생성 또는 정제로부터 발생하는 기타 오염물질이 전형적으로 적어도 50% w/w 없는 항체이지만, 이러한 항체가 그의 사용을 용이하게 하기 위한 과량의 제약상 허용되는 담체(들) 또는 기타 비히클과 조합될 가능성을 배제하지는 않는다. 간섭 단백질 및 기타 오염물질은, 예를 들어 항체가 단리되거나 재조합적으로 생성되는 세포의 세포성 구성성분을 포함할 수 있다. 종종, 항체는 간섭 단백질, 및 생성 또는 정제로부터의 오염물질이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 없다. 뮤린, 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한, 본원에 기재된 항체는 단리되고/되거나 정제된 형태로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 바와 같은 항체의 특성을 나타내고, 특별한 어떠한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4816567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628]; 및 [Marks et al. (1991) J. Mol . Biol., 222:581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있거나 또는 다른 방법에 의해 제조할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 모노클로날 항체이다.
그의 표적 항원에 대한 모노클로날 항체의 특이적 결합성은 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1 이상의 친화도를 의미하고, 하나 이상의 비관련 표적에 대해서 발생하는 비특이적 결합 보다는 규모 면에서 검출가능한 수준으로 더 높고 이러한 비특이적 결합과는 구별가능하다. 특이적 결합성은 특별한 관능기들 간의 결합 형성 또는 특별한 공간 적합도 (예를 들어, 자물쇠와 열쇠 유형) 형성에 따른 결과일 수 있는 반면 비특이적 결합성은 통상적으로 반 데르 발스 힘(van der Waals force)의 결과이다. 항체는 공지된 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯(Western blot), 방사성면역검정, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정 또는 면역침전 검정과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 면역검정 시스템에 의해 αvβ6에 대한 특이적 결합에 관하여 검정할 수 있다.
무손상 항체의 기본 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)와 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식에 대해 책임이 있는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 초기에는, 절단가능한 신호 펩티드에 연결되어 발현된다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능에 대해 책임이 있는 불변 영역을 규정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되는데, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] 참조; 그의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다).
각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 상기 2개의 결합 부위가 동일하다. 상기 쇄는 모두, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 지칭되기도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 쇄로부터의 CDR은 이러한 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄와 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 배정하는 것은 문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)], 또는 [Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. 카바트는 또한, 상이한 중쇄 간의 상응하는 잔기 또는 상이한 경쇄 간의 상응하는 잔기에 동일한 번호를 배정하는, 광범위하게 사용되는 넘버링 관례 (카바트 넘버링)를 제공한다.
용어 "항체"는 무손상 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 항체 단편은 표적과의 특이적 결합을 놓고, 그들이 유래된 무손상 항체와 경쟁하는데, 이러한 단편은 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디(diabody), Dab, 나노바디(nanobody), 및 Fv를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있거나, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한, 디아바디 (동종이량체성 Fv 단편) 또는 미니바디(minibody) (VL-VH-CH3), 이중특이적 항체 등을 포함한다. 이중특이적 또는 이관능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 용어 "항체"는 항체 단독 (네이키드 항체) 또는 세포독성제에 접합된 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합되는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속되는 아미노산으로부터 형성될 수 있거나 또는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속되는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매에 대한 노출시에도 보존되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매로의 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로, 독특한 공간적 입체형태 내에 3개 이상, 보다 통상적으로 5개 이상 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
동일하거나 중복되는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원과의 결합을 놓고 또 다른 항체와 경쟁할 수 있는 한 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검정으로 확인할 수 있다. 항체의 에피토프는 또한, 접촉 잔기를 확인하기 위해 그의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 규정될 수 있다. 또 다른 한편, 한 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖고 있다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 경우, 2개의 항체는 중복되는 에피토프를 갖고 있다.
항체들 간의 경쟁은 시험 중인 항체가 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된다 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 과량의 시험 항체 (예를 들어, 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x 이상)가 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 참조 항체의 결합을 50% 이상, 바람직하게 75%, 90% 또는 99% 억제하는 경우에, 시험 항체는 참조 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체들 (경쟁하는 항체들)은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체들, 및 발생되는 입체 장애를 위해 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체들을 포함한다.
용어 "환자"는 어느 한 가지 치료적 처치를 받는 인간 및 기타 포유동물 대상체를 포함한다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 어느 임상 단계에서 αvβ6-발현성 암의 임상적 또는 진단적 증상의 발병 후에 대상체에게 항-αvβ6 항체 또는 항체-약물 접합체를 투여함으로써, 상기 질환의 임상적 또는 진단적 증상을 감소시키거나 없앰으로써 입증된 바와 같이, 환자에게서 αvβ6-발현성 암의 진행을 느리게 하거나, 중지시키거나 또는 역전시키는 것을 지칭한다. 치료는, 예를 들어 특정 증상의 중증도 감소, 증상 수 감소, 또는 재발 빈도 감소를 포함할 수 있다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적 치환으로 분류하기 위하여, 다음 아미노산 치환은 보존적 치환으로 간주된다: 세린이 트레오닌, 알라닌 또는 아스파라긴에 의해 치환되고; 트레오닌이 프롤린 또는 세린에 의해 치환되며; 아스파라긴이 아스파르트산, 히스티딘 또는 세린에 의해 치환되고; 아스파르트산이 글루탐산 또는 아스파라긴에 의해 치환되며; 글루탐산이 글루타민, 리신 또는 아스파르트산에 의해 치환되고; 글루타민이 아르기닌, 리신 또는 글루탐산에 의해 치환되며; 히스티딘이 티로신 또는 아스파라긴에 의해 치환되고; 아르기닌이 리신 또는 글루타민에 의해 치환되며; 메티오닌이 이소류신, 류신 또는 발린에 의해 치환되고; 이소류신이 류신, 발린 또는 메티오닌에 의해 치환되며; 류신이 발린, 이소류신 또는 메티오닌에 의해 치환되고; 페닐알라닌이 티로신 또는 트립토판에 의해 치환되며; 티로신이 트립토판, 히스티딘 또는 페닐알라닌에 의해 치환되고; 프롤린이 트레오닌에 의해 치환되며; 알라닌이 세린에 의해 치환되고; 리신이 글루탐산, 글루타민 또는 아르기닌에 의해 치환되며; 발린이 메티오닌, 이소류신 또는 류신에 의해 치환되고; 트립토판이 페닐알라닌 또는 티로신에 의해 치환된다.
서열 동일성 (%)은 카바트 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬된 항체 서열을 이용하여 결정한다. 정렬 후, 대상 항체 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 가변 영역)이 참조 항체의 동일 영역과 비교되는 경우, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 간의 서열 동일성 (%)은 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 둘 다 내의 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치 수를 상기 두 영역의 정렬된 위치 총 수로 나누고 (갭은 계산되지 않음) 100을 곱하여 %로 전환시킨 것이다.
특정 범위의 값의 지정은 이러한 범위 내이거나 이 범위를 규정하는 모든 정수를 포함한다.
항체 이펙터 기능은 Ig의 Fc 도메인(들)에 의해 기여된 기능을 지칭한다. 이러한 기능은, 예를 들어 항체-의존성 세포성 세포독성, 항체-의존성 세포성 식세포작용 또는 보체-의존성 세포독성일 수 있다. 이러한 기능은, 예를 들어 포식 또는 용해 활성을 지닌 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 수행될 수 있거나, 또는 보체계의 구성성분에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, Fc-결합성 세포 또는 보체 구성성분에 의해 매개된 상기 효과(들)로 인해, αvβ6 표적화 세포의 억제 및/또는 고갈이 발생한다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)-발현성 세포를 동원할 수 있고, 이들을 항체-코팅된 표적 세포와 병렬시킬 수 있다. FcγRIII (CD16), FcγRII (CD32) 및 FcγRI (CD64)을 포함한, IgG에 대한 표면 FcR을 발현하는 세포는 IgG-코팅된 세포를 파괴시키기 위한 이펙터 세포로서 작용할 수 있다. 이러한 이펙터 세포는 단핵구, 대식세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다. IgG에 의한 FcγR의 진입은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP)을 활성화시킨다. ADCC는 막 세공-형성성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통하여 CD16+ 이펙터 세포에 의해 매개되는 반면, 식세포작용은 CD32+ 및 CD64+ 이펙터 세포에 의해 매개된다 (문헌 [Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30]; [Uchida et al., 2004, J. Exp . Med. 199:1659-69]; [Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65]; [Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res . Treat. 53:199-207] 참조). ADCC 및 ADCP 이외에도, 세포-결합된 항체의 Fc 영역은 또한, 보체 전통적 경로를 활성화시켜 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유발시킬 수 있다. 보체계의 C1q는 항체의 Fc 영역이 항원과 복합체를 형성할 때 이러한 영역에 결합한다. C1q가 세포-결합된 항체에 결합하는 것이 C4 및 C2의 단백질분해적 활성화와 관련된 사건의 캐스케이드(cascade)를 개시시켜 C3 전환효소를 발생시킬 수 있다. C3 전환효소에 의해 C3을 C3b로 절단시키면, C5b, C6, C7, C8 및 C9를 포함한 말단 보체 구성성분이 활성화될 수 있다. 집합적으로, 이들 단백질은 항체-코팅된 세포 상에 막-공격 복합체 세공을 형성한다. 이들 세공은 세포막 완전성을 붕괴시켜 표적 세포를 사멸시킨다 (문헌 [Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2] 참조).
용어 "항체-의존성 세포성 세포독성" 또는 ADCC는 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 보유하고 있는 면역 세포 (이펙터 세포로서 지칭되기도 함)의 상호 작용에 좌우되는 세포 사멸을 유도시키기 위한 메카니즘이다. 이러한 이펙터 세포는 자연 킬러 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 그들의 항원-결합 부위를 통하여 표적 세포에 결합된 Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 부착된다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 이펙터 세포 활성의 결과로서 일어난다.
용어 "항체-의존성 세포성 식세포작용" 또는 ADCP는 항체-코팅된 세포를 전부 또는 부분적으로, Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 결합하는 포식 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 내재화시키는 과정을 지칭한다.
용어 "보체-의존성 세포독성" 또는 CDC는 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인(들)이 표적 세포 막 내에 구멍을 형성시켜 주는 일련의 효소 반응을 활성화시키는, 세포 사멸을 유도시키기 위한 메카니즘을 지칭한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체, 예컨대 항체-코팅된 표적 세포 상의 항원-항체 복합체는 보체 구성성분 C1q에 결합하고 이를 활성화시켜, 결국에는 표적 세포 사멸을 유도하는 보체 캐스케이드를 활성화시킨다. 보체를 활성화시키면, 백혈구 상에 보체 수용체 (예를 들어, CR3)를 결합시킴으로써 ADCC를 촉진시키는 표적 세포 표면 상에 보체 구성성분이 침착될 수도 있다.
"세포독성 효과"는 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 지칭한다. "세포증식억제성 효과"는 세포 증식의 억제를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "세포독성제"는 세포에 대해 세포독성 및/또는 세포증식억제성 효과를 갖는 작용제를 지칭한다. 세포독성제를 항체와 접합시킬 수 있거나 또는 항체와 조합해서 투여할 수 있다.
용어 "제약상 허용되는"은 동물, 및 더욱 특히 인간에게 사용하기 위해, 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나 승인가능하거나, 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인식된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "제약상 상용성인 성분"은 이를 이용하여 항-αvβ6 항체를 전달하는, 제약상 허용되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
"제약상 허용되는 염"이란 표현은 항-αvβ6 항체 또는 그의 접합체, 또는 항-αvβ6 항체와 함께 투여된 작용제의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시되는 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌 비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함한다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 반대 이온의 봉입을 수반할 수 있다. 반대 이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시켜 주는 어떠한 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 더우기, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 하전된 다수 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우는 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 본원에서는, 제약상 허용되는 염이 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
문맥상 달리 명백하지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값의 표준 편차 내의 값을 포괄한다.
I. 표적 분자
달리 표시하지 않는 한, αvβ6은 인간 αvβ6을 의미한다. 예시적인 β6 인간 서열은 진뱅크 등록 번호 AAA36122로 배정된다. 예시적인 αv 인간 서열은 NCBI NP_002201.1로 배정된다.
II. 본 발명의 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 뮤린 15H3 항체, 및 키메라, 인간화 및 인간 15H3 항체를 제공한다.
인간 αvβ6에 대한 본 발명의 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 및 인간 형태의 마우스 15H3 항체)의 친화도는 바람직하게, 인간 αvβ6에 대한 마우스 15H3 항체의 친화도와 등가이거나, 인간 αvβ6에 대한 마우스 15H3 항체의 친화도 보다 크거나, 또는 인간 αvβ6에 대한 뮤린 항체 15H3의 친화도 보다 10배 이내, 5배 이내 또는 2배 이내 더 약한데, 예를 들어 바람직하게 인간 αvβ6에 대한 마우스 15H3 항체의 친화도 보다 10배 이하 더 약하고, 보다 바람직하게 5배 이하 더 약하며, 보다 더 바람직하게 2배 이하 더 약하다. 그의 표적 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 한 가지 방법은 항체의 겉보기 해리 상수를 결정하는 것이다. 본 발명은 뮤린 15H3의 겉보기 해리 상수와 본질적으로 동일한 (즉, 실험 오차 범위 이내) 겉보기 해리 상수를 갖는 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 및 인간 형태의 마우스 15H3 항체) 뿐만 아니라 인간 αvβ6에 대한 뮤린 항체 15H3의 해리 상수 보다 더 낮거나 더 높은 해리 상수를 갖는 항체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 및 인간 형태의 마우스 15H3 항체)는 인간 αvβ6에 대한 뮤린 15H3 항체의 겉보기 해리 상수의 0.1 내지 10배의 범위 이내, 또는 바람직하게 0.1 내지 5배의 범위, 0.1 내지 2배의 범위 또는 심지어 0.5 내지 2배의 범위 이내의 겉보기 해리 상수를 갖는다. 일부 측면에서, 인간 αvβ6에 대한 항체의 겉보기 해리 상수 (kd)는 바람직하게 0.1 nM 내지 5 nM의 범위 이내, 보다 더 바람직하게 0.1 nM 내지 5 nM의 범위 이내, 보다 바람직하게 0.1 nM 내지 2 nM, 또는 0.5 nM 내지 1.5 nM의 범위 이내이다. 키메라, 인간화 및 인간 15H3 항체는 마우스 15H3 항체와 마찬가지로 CHO 세포로부터 재조합적으로 발현된 형태 및/또는 천연 형태의 인간 αvβ6에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 키메라, 인간화 및 인간 15H3 항-αvβ6 항체는 인간 αvβ6에 대한 결합을 놓고 뮤린 15H3과 경쟁한다.
바람직한 항체는 단독으로 (즉, 네이키드 항체로서) 또는 세포독성제에 접합된 경우에 배양 하에, 동물 모델에서 또는 임상 시험에서 증식하는 암성 세포 상에서 나타낸 바와 같이 암을 억제한다 (예를 들어, 세포의 성장, 전이 및/또는 유기체 치사를 억제한다). 동물 모델은 αvβ6 발현성 인간 종양 세포주를 적당한 면역결핍성 설치류 균주, 예를 들어 무흉선 누드 마우스 또는 SCID 마우스 내로 이식함으로써 형성시킬 수 있다. 이들 종양 세포주는 피하 주사함으로써 고형 종양으로서 또는 정맥내 주사함으로써 파종성 종양으로서 면역결핍성 설치류 숙주 내에 정립시킬 수 있다. 일단 숙주 내에 정립되면, 이들 종양 모델을 적용하여 본 실시예에 기재된 바와 같이 항-αvβ6 항체 또는 그의 접합 형태의 치료적 효능을 평가할 수 있다.
B. 항체
인간화 항체는 비-인간 "공여자" 항체로부터의 CDR을 인간 "수용자" 항체 서열 내로 이식한, 유전자 조작한 항체이다 (예를 들어, 특허 [Queen, US 5,530,101 및 5,585,089]; [Winter, US 5,225,539]; [Carter, US 6,407,213]; [Adair, US 5,859,205]; 및 [Foote, US 6,881,557] 참조). 수용자 항체 서열은 예를 들어, 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합물, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 또는 배선 영역 서열일 수 있다. 중쇄에 대한 바람직한 수용자 서열은 배선 VH 엑손 VH1-46 및 J 엑손 (JH), 엑손 JH-4이다. 경쇄의 경우, 바람직한 수용자 서열은 엑손 VK2-30 (당업계의 문헌에서 KV2-30으로서 지칭되기도 함) 및 J 엑손 Jκ-2이다. 중쇄에 대한 또 다른 바람직한 수용자 서열은 배선 VH 엑손 VH1-8 또는 VH1-3, 및 J 엑손 (JH), JH-1, JH-2, JH-3, JH-4, 또는 JH-5를 포함한다. 경쇄에 대한 또 다른 바람직한 수용자 서열은 엑손 VK2-29 (당업계의 문헌에서 KV2-30으로서 지칭되기도 함), 및 J 엑손 Jκ-1, Jκ-2, Jκ-3, Jκ-4 또는 Jκ-5를 포함한다. 따라서, 인간화 항체는 전적으로 또는 실질적으로 비-인간 공여자 항체로부터의 일부 또는 모든 CDR, 및 존재할 경우, 전적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 중쇄로부터의 1개 이상, 2개 이상 및 통상적으로 3개 모든 CDR, 및 존재할 경우, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화 경쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 경쇄로부터의 1개 이상, 2개 이상 및 통상적으로 3개 모든 CDR, 및 존재할 경우, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 일부 측면에서, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 또는 인간 항체 내의 CDR은 상응하는 잔기 (카바트에 의해 규정된 바와 같음)의 적어도 60%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 간에 동일한 경우에 비-인간 항체 내의 상응하는 CDR과 실질적으로 동일하거나 또는 실질적으로 이로부터 비롯된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 인간 항체 내의 CDR은 각각의 CDR 내에 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 있는 경우에 비-인간 항체 내의 상응하는 CDR과 실질적으로 동일하거나 또는 실질적으로 이로부터 비롯된다. 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 카바트에 의해 규정된 상응하는 잔기의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우에 각각 실질적으로 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 비롯된다. 본 발명의 일부 인간화 항체에서, 이러한 항체의 중쇄 가변 프레임워크 영역 내에 1개 이상의 뮤린 15H3 복귀돌연변이가 존재한다.
인간화 항체가 종종, 마우스 항체로부터의 6개 모든 CDR (바람직하게, 카바트에 의해 규정된 바와 같음)을 포함하긴 하지만, 이들은 마우스 항체로부터의 모든 CDR 보다 적은 CDR (예를 들어, 3, 4 또는 5개 이상 CDR)을 이용하여 제조할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002]; [Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320:415-428, 2002]; [Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999]; [Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000] 참조).
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산을, CDR 입체형태 및/또는 항원과의 결합성에 대한 그들의 가능한 영향력을 기준으로 하여 치환용으로 선택할 수 있다. 이러한 가능한 영향력을 연구 조사하는 것은 모델링하거나, 특별한 위치에서의 아미노산의 특징을 조사하거나, 또는 특별한 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발 효과를 실험적으로 관찰하는 것이다.
예를 들어, 특정 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 간에 상이할 경우, 인간 프레임워크 아미노산은 아미노산이 다음과 같을 것으로 합리적으로 예상되는 경우에 마우스 항체로부터의 등가 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다:
(1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하거나;
(2) CDR 영역에 인접하거나;
(3) 그렇지 않으면 CDR 영역과 상호 작용하거나 (예를 들어, CDR 영역의 약 6 Å 이내에 있다); 또는
(4) 중쇄와 경쇄 간의 상호 작용을 매개한다.
15H3 항체가 마우스 항체로서 확인되긴 하였지만, 본 출원은 또한, 인간 15H3 항체를 포괄한다. 용어 "인간 15H3 항체"란, 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래되고, 뮤린 15H3 항체의 CDR과 실질적으로 동일한 CDR을 갖고 유사한 특성, 즉 αvβ6에 대한 결합 특이성을 표시하는 항체를 의미한다. 일부 측면에서, 인간 15H3 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역과 실질적으로 동일한 중쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 경쇄 가변 영역과 실질적으로 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 15H3 항체는 인간 항체가 아닌데, 예를 들어 본 발명의 15H3 항체는 뮤린, 키메라 또는 인간화 항체이다.
본 발명은 중쇄 가변 영역이 HA (서열 9)에 대해 90% 이상의 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 LA (서열 10)에 대해 90% 이상의 동일성을 나타내는 15H3 항체를 제공한다. 일부 측면에서, 항체는 인간화 항체이고, 중쇄 가변 프레임워크 영역 내에 1개 이상의 뮤린 15H3 복귀돌연변이가 존재한다. 추가적으로, 본 발명은 인간화 중쇄 가변 영역이 서열 11 내지 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, 인간화 경쇄 가변 영역이 서열 10 및 24 내지 29에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 15H3 항체 (및 이들의 모든 조합물)를 제공한다. 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 인간화 경쇄 가변 영역이 서열 10에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 24에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 25에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 26에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 27에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 28에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 29에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 일부 측면에서, 이들 항체는 인간화 항체이고, 각각의 항체 내의 복귀돌연변이 중 일부 또는 전부가 보존된다. 달리 말하면, 이러한 항체에서는, 바람직하게, 위치 H28, H30, H72, H73, H75, H78, 또는 H93 중 1개 이상이 뮤린 15H3 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30 중 적어도 하나는 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유된다. 임의로, 이러한 어느 항체에서도, 위치 H28 및 H30은 S에 의해 점유되고; 위치 H72는 D 또는 Q에 의해 점유되고; 위치 H73은 T 또는 K에 의해 점유되고; 위치 H75는 T 또는 S에 의해 점유되고; 위치 H78은 V 또는 A에 의해 점유되며; 위치 93은 A 또는 V에 의해 점유된다. 바람직하게, 상기 기재된 항체, 예를 들어 중쇄 가변 영역이 서열 11 내지 23에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 서열 10 및 24 내지 29에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 15H3 인간화 항체 중 어느 것에서도, CDR 영역은 마우스 공여자 항체, 즉 뮤린 15H3 항체의 CDR 영역 (서열 3-8)과 동일하거나 실질적으로 동일하다. CDR 영역은 카바트에 의해 규정된 바와 같다. 본 발명의 항체는 항체 HBLA, HBLB, HBLC, HBLD, HBLE, HBLF, HBLG, HLLA, HLLB, HLLC, HLLD, HLLE, HLLF, HLLG, HMLA, HMLB, HMLC, HMLD, HMLE, HMLF, HMLG, HNLA, HNLB, HNLC, HNLD, HNLE, HNLF, HNLG, HRLA, HRLB, HRLC, HRLD, HRLE, HRLF, HRLG, HSLA, HSLB, HSLC, HSLD, HSLE, HSLF, HSLG, HTLA, HTLB, HTLC, HTLD, HTLE, HTLF, HTLG, HULA, HULB, HULC, HULD, HULE, HULF, 및 HULG를 포함한다.
또 다른 가능한 변이는 CDR 내의 특정 잔기를 인간 CDR 서열로부터의 상응하는 잔기, 전형적으로 상기 예시된 인간화 항체를 설계하는 데 사용된 인간 수용자 서열의 CDR로부터의 상응하는 잔기로 치환시키는 것이다. 일부 항체에서는, CDR의 단지 일부, 즉 결합을 위해 필요한 CDR 잔기의 서브세트 (SDR로 명명됨)가 인간화 항체 내에서의 결합을 유지시키는 데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR 내에 있지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로, 또는 문헌 [Gonzales et al., Mol. Immunol. 41:863 (2004)]에 기재된 바와 같이, 코티아(Chothia) 초가변 루프 (문헌 [Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987] 참조)를 벗어나 있는 카바트 CDR의 영역으로부터, 앞서의 연구를 근거로 하여 확인할 수 있다 (예를 들어, CDR H2 내의 잔기 H60-H65는 종종 요구되지 않는다). 1개 이상의 공여자 CDR 잔기가 부재하거나 또는 전체 공여자 CDR이 생략된 위치에서의 상기 인간화 항체에서, 이러한 위치를 점유하고 있는 아미노산은 수용자 항체 서열 내의 상응하는 위치 (카바트 넘버링에 따름)를 점유하고 있는 아미노산 또는 보존적 치환일 수 있다. 이와 같이 포함될 CDR 내의 공여자 아미노산을 수용자 아미노산으로 치환시킨 수는 경쟁 고려 사항들 간의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체 내의 마우스 아미노산의 수를 감소시켜, 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 있어서 잠재적으로 유리하다.
본원에서의 바람직한 실시양태에서, 인간화 및 인간 15H3 항체의 CDR 영역은 뮤린 15H3 항체의 CDR 영역 (서열 3-8)과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 본원에 기재된 어느 항체에서도, CDR 영역은 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 뮤린 15H3 항체의 CDR 영역 (즉, 서열 3-8)일 수 있다. 본원에 기재된 어느 항체에서도, CDR 영역은 각각의 CDR 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 뮤린 15H3 항체의 CDR 영역 (즉, 서열 3-8)일 수 있다. 본원에 기재된 어느 항체에서도, CDR 영역은 중쇄의 CDR1 및 CDR2, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 임의로 CDR3 내에 0, 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 뮤린 15H3 항체의 CDR 영역 (즉, 서열 3-8)일 수 있다. 분자 모델링 및 실험적 추론에 의해, 본원에 기재된 어느 항체에서도, 보존적 아미노산 치환이, 예를 들어 경쇄의 CDR1 내의 위치 24, 25, 32, 33, 및/또는 34, 경쇄의 CDR2 내의 위치 53-56, 중쇄의 CDR1 내의 위치 31 및/또는 32, 및/또는 중쇄의 CDR2 내의 위치 61-65에서 이루어질 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 어느 항체에서도, 다음 3개 위치가 상응하는 인간 아미노산으로써 대체될 수 있었다: 중쇄의 CDR2 내의 위치 64에서의 리신이 글루타민으로써 대체될 수 있고, 경쇄의 CDR1 내의 위치 24에서의 리신이 아르기닌으로써 대체될 수 있으며, 경쇄의 CDR2 내의 위치 54에서의 류신이 아르기닌으로써 대체될 수 있다.
C. 불변 영역의 선택
본원에 기재된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성, 항체 의존성 세포성 식세포작용 및/또는 보체 의존성 세포독성이 요망되는 지의 여부에 좌우된다. 예를 들어, 인간 이소형 IgG1 및 IgG3은 강력한 보체-의존성 세포독성을 갖고 있고, 인간 이소형 IgG2는 보체-의존성 세포독성이 약하며, 인간 IgG4는 보체-의존성 세포독성이 결여된다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한, 인간 IgG2 및 IgG4 보다 더 강력한 세포 매개된 이펙터 기능을 유도시킨다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄와 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통하여 연결되는 단일 쇄 항체로서 표현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체들 간에 알로타이프(allotypic) 변이 및 이소알로타이프(isoallotypic) 변이를 나타내는데, 즉 상기 불변 영역은 하나 이상의 다형성 위치에서 상이한 개체들 간에 상이할 수 있다. 이소알로타이프는 이소알로타이프를 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 이소형의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 알로타이프와 상이하다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에서의 1개 또는 수 개의 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단 리신은 분자의 특정 비율 또는 모두에서 유도되거나 생략될 수 있다. 치환은 이펙터 기능, 예컨대 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해 (예를 들어, 문헌 [Winter et al., 미국 특허 번호 5,624,821]; [Tso et al., 미국 특허 번호 5,834,597]; 및 [Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서의 반감기를 연장시키기 위해 (예를 들어, 문헌 [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 이루어질 수 있다.
예시되는 치환은 아미노산 위치 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, 또는 332에서 천연 아미노산을 시스테인 잔기로 아미노산 치환시키는 것, 바람직하게는 인간 IgG1 이소형에서 S239C 돌연변이시키는 것 (불변 영역의 치환은 EU 인덱스에 따른다)을 포함한다 (US 20100158909 참조). 부가 시스테인 잔기의 존재로 인해, 쇄간 디술피드 결합 형성이 가능해진다. 이러한 쇄간 디술피드 결합 형성은 입체 장애를 유발시킴으로써, Fc 영역-FcγR 결합 상호 작용의 친화도를 감소시킬 수 있다. IgG 불변 영역의 Fc 영역 내에 도입되거나 이러한 영역에 근접하여 도입된 시스테인 잔기(들)는 또한, 치료제 (예를 들어, 약물의 말레이미드 유도체와 같이 티올 특이적 시약을 이용하는 커플링 세포독성 약물)와 접합하기 위한 부위로서 제공될 수 있다. 치료제의 존재는 입체 장애를 유발시킴으로써, Fc 영역-FcγR 결합 상호 작용의 친화도를 추가로 감소시킨다. 위치 234, 235, 236 및/또는 237 중 어느 곳에서의 다른 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다 (예를 들어, US 6,624,821, US 5,624,821 참조).
항체의 생체내 반감기는 또한, 그의 이펙터 기능에 영향을 미칠 수 있다. 항체의 반감기는 그의 치료 활성을 변형시키기 위해 증가되거나 감소될 수 있다. FcRn은 β2-마이크로글로불린과 비-공유적으로 연합되는 MHC 부류 I 항원과 구조상 유사한 수용체이다. FcRn은 조직 전반에 걸쳐 IgG의 이화작용 및 그들의 통과세포외배출(transcytosis)을 조절한다 (문헌 [Ghetie and Ward, 2000, Annu . Rev . Immunol. 18:739-766]; [Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113] 참조). IgG-FcRn 상호 작용은 pH 6.0 (세포내 소포의 pH)에서 일어나지만, pH 7.4 (혈액의 pH)에서는 그렇지 못하는데; 이러한 상호 작용으로 인해, IgG는 순환계 내로 다시 재활용될 수 있다 (문헌 [Ghetie and Ward, 2000, Ann . Rev . Immunol. 18:739-766]; [Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113] 참조). FcRn 결합에 관여하는 인간 IgG1 상의 영역을 지도화하였다 (문헌 [Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604] 참조). 인간 IgG1의 위치 Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, 또는 Asn434에서의 알라닌 치환은 FcRn 결합성을 증강시킨다 (문헌 [Shields et al., 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604] 참조). 이들 치환을 정착시킨 IgG1 분자는 보다 긴 혈청 반감기를 갖고 있다. 결과적으로, 이들 변형된 IgG1 분자는 그들의 이펙터 기능을 수행할 수 있으므로, 비변형된 IgG1과 비교해서 보다 장시간에 걸쳐 그들의 치료적 효능을 발휘할 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증가시키기 위한 기타 예시적인 치환은 위치 250에서의 Gln 및/또는 위치 428에서의 Leu를 포함한다. EU 넘버링이 불변 영역 내의 모든 위치에 대해 사용된다.
보존된 Asn297에 공유적으로 부착된 올리고사카라이드는 FcγR에 결합할 수 있는 IgG의 Fc 영역의 능력에 관여한다 (문헌 [Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69]; [Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31] 참조). 이러한 IgG 상의 글리코형을 조작하는 것은 IgG-매개된 ADCC를 상당히 개선시킬 수 있다. 이러한 글리코형에 이등분 N-아세틸글루코사민 변형물을 부가하거나 (문헌 [Umana et al., 1999, Nat . Biotechnol. 17:176-180]; [Davies et al., 2001, Biotech . Bioeng. 74:288-94] 참조) 또는 상기 글리코형으로부터 푸코스를 제거하는 것은 (문헌 [Shields et al., 2002, J. Biol . Chem. 277:26733-40]; [Shinkawa et al., 2003, J. Biol . Chem. 278:6591-604]; [Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33] 참조) IgG Fc와 FcγR 간의 결합을 개선시킴으로써, Ig-매개된 ADCC 활성을 증강시키는 IgG Fc 조작의 2가지 예이다.
인간 IgG1 Fc 영역의 용매-노출된 아미노산을 전체 치환시키면, 변경된 FcγR 결합 친화성을 지닌 IgG 변이체가 생성되었다 (문헌 [Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604] 참조). 모 IgG1과 비교한 경우, Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334, 또는 Ser298/Glu333/Lys334에서 Ala로의 치환과 관련된 이들 변이체의 서브세트는 FcγR에 대한 결합 친화성과 ADCC 활성 둘 다가 증가되었다는 것을 입증해준다 (문헌 [Shields et al., 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604]; [Okazaki et al., 2004, J. Mol . Biol. 336:1239-49] 참조).
항체의 보체 고정 활성 (C1q 결합성과 CDC 활성 둘 다)은 Lys326 및 Glu333에서의 치환에 의해 개선될 수 있다 (문헌 [Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575] 참조). 인간 IgG2 주쇄 상에서의 동일한 치환은 C1q에 잘 결합하지 못하고 보체 활성화 활성이 심각하게 결핍되는 항체 이소형을, C1q에 결합하면서도 CDC를 매개할 수 있는 것으로 전환시킬 수 있다 (문헌 [Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75] 참조). 항체의 보체 고정 활성을 개선시키기 위한 몇 가지 다른 방법들이 또한 적용되어 왔다. 예를 들어, IgM의 18개-아미노산 카르복실-말단 테일 조각을 IgG의 카르복실-말단에 이식하면, 그들의 CDC 활성이 크게 증강된다. 이는 심지어, 통상적으로 검출가능한 CDC 활성이 전혀 없는 IgG4를 이용한 경우에서도 관찰된다 (문헌 [Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:2226-36] 참조). 또한, IgG1 중쇄의 카르복시-말단에 인접하여 위치한 Ser444를 Cys로 치환시키면, 단량체성 IgG1에 비해 200배 증가된 CDC 활성을 지닌 IgG1의 테일-대-테일 이량체화가 유도되었다 (문헌 [Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22] 참조). 또한, C1q에 대한 특이성을 지닌 이중특이적 디아바디 구축물은 CDC 활성을 부여하기도 한다 (문헌 [Kontermann et al,, 1997, Nat . Biotech. 15:629-31] 참조).
보체 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320, 및 322 중 하나 이상을 상이한 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 Ala로 돌연변이시킴으로써 감소시킬 수 있다. 상기 3개 잔기 중 어느 하나 대신 Gly, Ile, Leu, 또는 Val과 같은 기타 알킬-치환된 비이온성 잔기, 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비-극성 잔기를 사용하면, C1q 결합성이 감소되거나 없어지기도 한다. Ser, Thr, Cys, 및 Met을 잔기 320 및 322에 사용하여 (318은 아니다) C1q 결합 활성을 감소시키거나 없앨 수 있다. 318 (Glu) 잔기를 극성 잔기로 대체시키는 것이 C1q 결합 활성을 변형시킬 수는 있지만, 이러한 활성을 없애지는 못한다. 잔기 297 (Asn)을 Ala로 대체시키면 용해 활성이 제거되지만, C1q에 대한 친화성은 단지 약한 수준으로만 감소된다 (약 3배 더 약해진다). 이러한 변경으로 인해, 보체 활성화에 필요한 탄수화물의 존재 및 글리코실화 부위가 파괴된다. 이러한 부위에서의 기타 어떠한 치환도 글리코실화 부위를 파괴한다. 다음 돌연변이 및 그의 어떠한 조합도 C1q 결합성을 감소시킨다: D270A, K322A, P329A, 및 P311S (문헌 [WO 06/036291] 참조).
인간 불변 영역에 대한 언급은 천연 알로타이프 내의 다형성 위치를 점유하고 있는 잔기의 모든 순열 또는 모든 천연 알로타이프를 수반한 불변 영역을 포함한다. 또한, 천연 인간 불변 영역과 비교해서 1, 2, 5 또는 10개 이하의 돌연변이가 존재할 수 있는데, 예컨대 Fc감마 수용체 결합성을 감소시키거나 또는 FcRN에 대한 결합을 증가시키기 위해 상기 지적된 것이 존재할 수 있다.
D. 항체의 발현
키메라 또는 인간화 항체는 전형적으로, 재조합 발현에 의해 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 전형적으로, 천연적으로 회합된 또는 이종 프로모터 영역을 포함한, 항체 쇄의 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 바람직하게, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 상기 벡터가 적당한 숙주 내로 혼입되면, 이러한 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고 수준 발현, 및 교차반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지시킨다.
포유동물 세포가 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 절편을 발현시키는 데 바람직한 숙주이다 (문헌 [Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)] 참조). 무손상 이종 단백질을 분비할 수 있는 적합한 수 많은 숙주 세포주가 당업계에서 개발되어 왔으며, 이는 CHO 세포주 (예를 들어, DG44), 각종 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 비-항체-생산 골수종 (Sp2/0 및 NS0 포함)을 포함한다. 바람직하게, 상기 세포는 비인간이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서 (문헌 [Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)] 참조), 및 필수 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 시토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다 (문헌 [Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)] 참조).
αvβ6에 대항한 인간 항체는 다음에 기재되는 각종 기술에 의해 제공될 수 있다. 인간 항체를 생성하는 방법은 문헌 ([Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)]; [Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664]; 및 [Engleman et al., US Patent 4,634,666] 참조)의 트리오마(trioma) 방법; 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함한 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 사용 (예를 들어, 문헌 [Lonberg et al., WO93/12227 (1993)]; [US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806]; [Nature 148, 1547-1553 (1994)]; [Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; [Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)] 참조), 및 파지 디스플레이 방법 (예를 들어, 문헌 [Dower et al., WO 91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 및 US 5,565,332] 참조)을 포함한다.
일단 발현되면, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한, 당업계의 표준 과정에 따라서 항체를 정제할 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
III. 핵산
본 발명은 추가로, 상기 언급된 중쇄 및 경쇄 중 어느 것을 코딩하는 핵산을 제공한다. 전형적으로, 이러한 핵산은 또한, 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩티드를 코딩한다. 핵산 상의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위해 조절성 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 존재할 수 있거나 또는 하나 이상의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 핵산은, 예를 들어 중복 올리고뉴클레오티드의 고체 상태 합성 또는 PCR에 의해 합성할 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은, 예를 들어 발현 벡터 내에서 하나의 연속되는 핵산으로서 연결될 수 있거나 또는 분리될 수 있는데, 예를 들어 그 자신의 발현 벡터 내로 각각 클로닝될 수 있다. 예시적인 핵산이 서열 37 (뮤린 중쇄), 서열 38 (뮤린 경쇄), 서열 39 (HA), 서열 40 (HB), 서열 41 (HL), 서열 42 (HT), 서열 43 (HN), 서열 44 (HU), 서열 45 (LA), 서열 46 (LC), 서열 47 (LF), 서열 48 (LG), 서열 49 (뮤린 중쇄 신호 펩티드), 서열 50 (인간 중쇄 신호 펩티드), 서열 51 (뮤린 경쇄 신호 펩티드), 및 서열 52 (인간 경쇄 신호 펩티드)에 제시된다. 핵산은 단리된 형태로 제공될 수 있다. 단리된 핵산 분자는 그의 천연 환경의 구성성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것, 또는 비-자연 발생인 것이다.
IV. 항체 약물 접합체
항-αvβ6 항체를 세포독성 모이어티 (그의 제약상 상용성인 염 포함)과 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 항체와 접합시키기에 특히 적합한 모이어티는 세포독성제 (예를 들어, 화학요법제), 전구약물 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다 (이들 부분은 집합적으로, 치료제로서 지칭된다). 예를 들어, 항-αvβ6 항체를 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 독소 (예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포사멸제, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 또는 디프테리아(diphtheria) 독소)와 접합시킬 수 있다. 유용한 부류의 세포독성제의 예는, 예를 들어 DNA 부홈 결합제, DNA 알킬화제, 및 튜불린(tubulin) 억제제를 포함한다. 예시적인 세포독성제는, 예를 들어 아우리스타틴(auristatin), 캄프토테신, 두오카르마이신, 에토포시드, 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1, DM2, DM3, DM4), 탁산, 벤조디아제핀 (벤조디아제핀 함유 화합물 포함) (예를 들어, 피롤로[1,4]벤조디아제핀, 인돌리노벤조디아제핀 및 옥사졸리디노벤조디아제핀) 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 치료제를 단백질, 및 특히 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9]; [Senter, Cancer J., 2008, 14(3):154-169] 참조).
치료제 (예를 들어, 세포독성제)는 그것이 항체를 (예를 들어, 가수분해에 의해, 항체 분해에 의해 또는 절단제에 의해) 절단 제거하지 않는 한, 그의 활성을 감소시키는 방식으로 접합될 수 있다. 이러한 치료제는 αvβ6-발현성 암 세포의 세포내 환경에서는 절단에 대해 감수성이지만, 세포외 환경에 대해서는 실질적으로 감수성이지 않은 절단가능한 링커를 이용하여 항체에 부착시킬 수 있기 때문에, 상기 접합체는 αvβ6-발현성 암 세포에 의해 내재화되는 경우에 (예를 들어, 엔도솜 내에서, 또는 예를 들어, pH 감수성 또는 프로테아제 감수성을 통하여, 리소솜성 환경 하에 또는 포낭 환경 하에) 항체로부터 절단된다. 상기 치료제는 비-절단가능한 링커를 이용하여 항체에 부착시킬 수도 있다.
전형적으로, ADC는 치료제와 항-αvβ6 항체 사이에 링커 영역을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 링커는 세포내 조건 하에서 절단가능할 수 있으므로, 이러한 링커를 절단하면 치료제가 세포내 환경 하에 (예를 들어, 리소솜 또는 엔도솜 또는 포낭 내에서) 항체로부터 방출된다. 링커는 예를 들어, 리소솜성 또는 엔도솜성 프로테아제를 포함한, 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 펩티딜 링커는 길이가 2개 이상의 아미노산이거나 또는 3개 이상의 아미노산이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123] 참조). αvβ6-발현성 세포에 존재하는 효소에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 가장 전형적이다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커를 사용할 수 있다 (예를 들어, Phe-Leu 또는 Val-Cit 펩티드를 포함하는 링커). 링커는 또한, 비-절단가능한 링커, 예컨대 치료제 (예를 들어, 약물)에 직접적으로 부착되고 항체의 분해에 의해 방출되는 말레이미도-알킬렌 링커 또는 말레이미드-아릴 링커일 수 있다.
전형적으로, 링커는 세포외 환경에 대해 실질적으로 감수성이지 않은데, 이는 ADC가 세포외 환경 하에 (예를 들어, 혈장 내에) 존재하는 경우, ADC의 샘플 중의 링커의 약 20% 이하, 전형적으로 약 15% 이하, 보다 전형적으로 약 10% 이하, 보다 더 전형적으로 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하가 절단된다는 것을 의미한다. 링커가 세포외 환경에 대해 실질적으로 감수성이 아닌지의 여부는, 예를 들어 혈장을 (a) ADC ("ADC 샘플")와 (b) 등 몰량의 접합되지 않은 항체 또는 치료제 ("대조군 샘플") 둘 다와 함께 예정된 시간 (예를 들어, 2, 4, 8, 16 또는 24시간) 동안 독립적으로 인큐베이션한 다음, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, ADC 샘플 내에 존재하는 접합되지 않은 항체 또는 치료제의 양을 대조군 샘플 내에 존재하는 것과 비교함으로써 결정할 수 있다.
링커는 또한, 세포성 내재화를 증진시킬 수 있다. 링커는 치료제와 접합된 경우에 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 ADC의 링커-치료제 부분의 환경에서) 세포성 내재화를 증진시킬 수 있다. 또 다른 한편, 링커는 치료제와 항-αvβ6 항체 둘 다와 접합된 경우에 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 ADC의 환경에서) 세포성 내재화를 증진시킬 수 있다.
예시적인 항체-약물 접합체는 아우리스타틴에 기반한 항체-약물 접합체를 포함하는데, 이는 약물 성분이 아우리스타틴 약물이라는 것을 의미한다. 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 미세관 역학 및 핵 및 세포 분할을 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 항암 활성을 지니고 있다. 전형적으로, 아우리스타틴에 기반한 항체-약물 접합체는 아우리스타틴 약물과 항-αvβ6 항체 사이에 링커를 포함한다. 이러한 링커는, 예를 들어 절단가능한 링커 (예를 들어, 펩티딜 링커) 또는 비-절단가능한 링커 (예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체일 수 있다. 아우리스타틴은, 예를 들어 아우리스타틴 E와 케토산 간에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 AEB 및 AEVB를 각각 생성할 수 있다. 기타 아우리스타틴은 MMAF 및 MMAE를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조는 미국 공개 번호 7,659,241, 7,498,298, 2009-0111756, 2009-0018086 및 7,968,687 (이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
예시적인 아우리스타틴에 기반한 항체 약물 접합체는 다음에 나타낸 바와 같은 vcMMAE, vcMMAF 및 mcMMAF 항체 약물 접합체, 또는 이들의 제약상 허용되는 염을 포함하는데, 하기에서 Ab는 본원에 기재된 바와 같은 항체이고 val-cit는 발린-시트룰린 디펩티드를 나타낸다:
Figure 112014086566516-pct00001
약물 로딩은 p로써 나타내는데, 이는 항체당 약물-링커 분자의 수이다. 상황에 따라서, p는 항체당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타내는데, 이는 평균 약물 로딩으로 지칭된다. p는 1 내지 20의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 8의 범위이다. 일부 바람직한 실시양태에서, p가 평균 약물 로딩을 나타내는 경우, p는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5이다. 특정 제제 내에서 항체당 약물의 평균 수는 통상적인 수단, 예컨대 질량 분광분석법, HIC, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 명확히 규명할 수 있다. 일부 측면에서, 항-αvβ6 항체는 이러한 항체의 시스테인 잔기를 통하여 약물-링커에 부착시킨다. 일부 측면에서, 시스테인 잔기는 항체 내로 조작시킨 것이다. 기타 측면에서, 시스테인 잔기는 쇄간 디술피드 시스테인 잔기이다.
V. αvβ6에 대한 기타 항체
뮤린 15H3 항체, 및 키메라, 인간화 또는 인간 형태의 15H3 항체 뿐만 아니라 αvβ6의 세포외 도메인에 결합하는 기타 항체를 본 발명의 일부 방법, 특히 방광암을 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 바람직하게, 이러한 실시양태에서는, 항체를 세포독성제에 접합시킨다. 항-αvβ6 항체의 수집은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 공개 번호 20100330103 및 20110294982 및 미국 특허 번호 7,465,449; 7,943,742 및 6,692,741 참조; 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
αvβ6에 대한 기타 항체는 αvβ6 또는 그의 하나 이상의 세포외 도메인으로 면역화시킴으로써 새로이 제조할 수 있다. 면역원에 대항하여 기타 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 뮤린, 기니아 피그, 영장류, 토끼 또는 래트 모노클로날 항체를 생성시키는 것은 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies , A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)] (모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 이러한 면역원은 펩티드 합성 또는 재조합 발현에 의해 천연 공급원으로부터 수득할 수 있다.
인간화, 키메라 또는 베니어링된(veneered) 형태의 비-인간 항체를 제조할 수 있다. 인간화 항체를 생성시키기 위한 일반적 방법론은 문헌 [Queen, US 5,530,101 및 5,585,089]; [Winter, US 5,225,539]; [Carter, US 6,407,213]; [Adair, US 5,859,205]; 및 [Foote, US 6,881,557]에 기재되어 있다. 키메라 항체는 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합한 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전적으로, 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하고 있고, 약 3분의 2가 인간 서열이다. 베니어링된 항체는 CDR 중 일부 및 통상적으로 전부를 보유하고 있고 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기 중 일부를 보유하고 있지만, B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수있는 기타 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어 노출된 잔기 (문헌 [Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991] 참조)를 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체시킨 인간화 항체 유형이다. 그 결과는 CDR이 전적으로 또는 실질적으로 비-인간 항체로부터 비롯되고 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 상기 치환에 의해 보다 더 인간과 유사하게 만들어진 항체이다.
αvβ6에 대항한 인간 항체는 상기 언급된 바와 같은 각종 기술에 의해 제공될 수 있다.
경우에 따라, 경쟁적 결합 검정 또는 그 밖의 방법에 의해, 예시적인 항체, 예컨대 15H3 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프 특이성을 갖는 어떠한 항체도 선택할 수 있다.
VI. 치료적 적용
본 발명의 항체는 단독으로 또는 항-αvβ6 항체 약물 접합체로서 사용하여 암을 치료할 수 있다. 이러한 암 중 일부는 단백질 수준 (예를 들어, 상기 예시된 항체 중 하나를 이용한 면역검정에 의해 측정함) 또는 mRNA 수준에서 측정된 검출가능한 수준의 αvβ6을 나타낸다. 이러한 암 중 일부는 동일한 유형, 바람직하게 동일한 환자로부터의 비암성 조직과 비교해서 상승된 수준의 αvβ6을 나타낸다. 치료받을 수 있는 암 세포 상에서의 αvβ6의 예시 수준은 세포당 1,000 내지 200,000개의 αvβ6 분자이긴 하지만, 보다 고 수준이나 저 수준도 치료할 수 있다. 일반적으로, 보다 고 카피 수, 예를 들어 세포당 약 15,000개 이상의 αvβ6 분자 수가 고형 종양을 치료하는 데 바람직하다. 임의로, 암 내의 αvβ6 수준은 치료를 수행하기 전에 측정한다.
αvβ6 발현과 연관되고 치료를 받을 수 있는 암의 예는, 예를 들어 방광암, 두경부암 (예를 들어, 구순암, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암 및 후두암 포함), 피부암, 폐암, 췌장암, 자궁암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 결장암, 전립선암, 난소암, 위암, 및 간암을 포함한다. 한 측면에서, 편평 세포 암종 및 선암종이 αvβ6 발현과 연관되고 치료를 받을 수 있는 암의 예이다. 치료는 이들 종류의 원발성 또는 전이성 종양을 갖는 환자에게 적용할 수 있다. 치료는 또한, 치료를 받은 적이 없는 환자, 통상적인 치료 (예를 들어, 호르몬, 타목시펜(tamoxifen), 헤르셉틴(herceptin))에 대해 불응성인 환자, 또는 상기 치료에 대한 반응 후에 재발된 적이 있는 환자에게 적용할 수 있다. 항-αvβ6 항체 및 그의 접합체를 사용하여, αvβ6을 발현하는 암을 치료할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항-αvβ6 항체 또는 그의 접합체를 사용하여 αvβ6-발현성 방광암, 두경부암 (예를 들어, 구순암, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암 및 후두암 포함), 피부암, 폐암, 췌장암, 자궁암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 결장암, 전립선암, 난소암, 위암, 또는 간암이 있는 대상체를 치료한다. 한 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항-αvβ6 항체 또는 그의 접합체를 사용하여 αvβ6-발현성 편평 세포 암종 또는 선암종이 있는 대상체를 치료한다.
본 출원은 αvβ6 단백질이 방광암 세포의 표면 상에 발현된다는 사실을 처음으로 신뢰할 수 있게 개시한 것으로 여겨진다. 따라서, αvβ6-지향적 치료법을 사용하여 αvβ6-발현성 방광암을 앓고 있는 환자를 치료할 수 있다 (예를 들어, 항-αvβ6 항체, 펩티드, 또는 그의 접합체). 방광암을 치료하기 위한 αvβ6-지향적 치료법은 본원에 개시된 항체 및 접합체, 예를 들어 키메라, 인간 및 인간화 15H3 항체 및 그의 접합체를 포함하지만, 이러한 항체 또는 치료법으로 제한되지 않는다.
인간, 인간화 또는 키메라 항체는 단독으로 또는 그의 접합체로서, 암의 한 가지 이상의 징후 또는 증상의 발병을 지연시키고/시키거나, 그 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가 악화를 억제시키고/시키거나 개선시키는 데 유효한 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여한다. 이러한 요법은 치료상 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 일부 경우에서, 치료적 효능은 병력 대조군 또는 동일한 환자에게서의 과거 경험과 비교해서 개개의 환자에게서 관찰할 수 있다. 다른 경우에서, 치료적 효능은 치료받지 않은 환자의 대조군 집단과 비교해서 치료받은 환자 집단 내에서의 전임상 또는 임상 시험으로 입증할 수 있다.
모노클로날 항체에 대한 예시적인 투여량은, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg 환자 체중, 보다 전형적으로 1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 15 mg/kg, 1 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 30 mg/kg, 2 mg/kg 내지 20 mg/kg, 2 mg/kg 내지 15 mg/kg, 2 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 30 mg/kg, 3 mg/kg 내지 20 mg/kg, 3 mg/kg 내지 15 mg/kg, 3 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 항체 약물 접합체에 대한 예시적인 투여량은, 예를 들어 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.3 mg/kg 내지 3 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 3 mg/kg, 1 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 대상체 체중, 또는 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg 체중 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg), 또는 고정된 투여량으로서 10-1,500 또는 200-1,500 mg이다. 일부 방법에서는, 환자에게 1.5 mg/kg 이상, 2 mg/kg 이상 또는 3 mg/kg 이상의 용량으로 3주마다 1회 또는 그 이상으로 투여한다. 투여량은 세포독성 약물의 실체, 투여 빈도, 환자의 병태 및 만약에 있다면, 기존 치료에 대한 반응, 및 기타 요인들 중에서도, 장애가 급성인지 만성인지의 여부에 좌우된다.
투여는 전형적으로 비경구이지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 투여는 또한, 종양 내로 직접 국한될 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의해 전신 순환계 내로 투여하는 것이 바람직하다. 정맥내 투여는 예를 들어, 30 내지 90분과 같은 기간에 걸쳐 주입하거나 또는 단일 볼루스 주사함으로써 이루어질 수 있다.
투여 빈도는 기타 요인들 중에서, 순환시 항체 또는 접합체의 반감기, 환자의 병태 및 투여 경로에 좌우된다. 빈도는 예를 들어, 환자의 병태 또는 치료하고자 하는 암의 진행 상의 변화에 대해 반응하여 매일, 매주, 매월, 분기별로 또는 불규칙적 간격일 수 있다. 정맥내 투여에 대한 예시적인 빈도는 지속적인 치료 과정 내내 매주 2회 내지 분기별로 투여하는 것이지만, 더 많거나 더 적은 빈도로 투여하는 것이 또한 가능하다. 정맥내 투여에 대한 기타 예시적인 빈도는 지속적인 치료 과정 내내 매주 투여하거나, 또는 4주 마다 또는 3주 마다 3회 투여하는 것이지만, 더 많거나 더 적은 빈도로 투여하는 것이 또한 가능하다. 피하 투여의 경우, 예시되는 투여 빈도는 매일 내지 매월이지만, 더 많거나 더 적은 빈도로 투여하는 것이 또한 가능하다.
투여된 투여량 수는 암의 성질 (예를 들어, 급성 또는 만성 증상을 나타내는 지의 여부) 및 치료에 대한 장애의 반응에 좌우된다. 일부 측면에서, 급성 장애이거나 또는 만성 장애의 급성 악화의 경우에는 1 내지 10회 용량이 종종 충분하다. 종종, 임의로 분할된 형태의 단일 볼루스 용량이 급성 장애이거나 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발 동안 반복할 수 있다. 만성 장애의 경우에는, 항체를 1, 5 또는 10년 이상 동안 또는 환자의 일생 동안 규칙적 간격, 예를 들어 매주, 격주로, 매월, 분기별로, 6개월 마다 투여할 수 있다.
비경구 투여하기 위한 제약 조성물은 바람직하게 멸균성이고, 실질적으로 등장성이며, GMP 조건 하에 제조한다. 제약 조성물은 단위 투여 형태 (즉, 단일 투여용 투여 형태)로 제공될 수 있다. 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 제제화할 수 있다. 이러한 제제는 선택된 투여 경로에 좌우된다. 주사의 경우, 항체를 수성 용액 중에서, 바람직하게 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 식염수 또는 아세테이트 완충제 (주사 부위에서의 불쾌감을 감소시키기 위함) 중에서 제제화할 수 있다. 이 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화 작용제를 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 주사용 증류수와 구성하기 위한 동결건조된 형태일 수 있다. 액상 제제 중의 항체의 농도는 예를 들어, 1-100 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 약물 접합체를 이용한 치료를 화학요법, 방사선, 줄기 세포 치료, 수술, 치료하고자 하는 장애에 대항하여 유효한 기타 치료와 조합할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 항체 및 항체 약물 접합체는 치료하고자 하는 특별한 질환에 대한 표준 치료인 기타 치료법 (예를 들어, 최첨단의 표준 치료 또는 제2차 또는 제3차 치료, 또는 심지어 구조 치료법)과 함께 투여될 것이다. αvβ6에 대한 항체 및 항체 약물 접합체와 함께 투여될 수 있는 유용한 부류의 기타 작용제는, 예를 들어 기타 표적화 치료법 및/또는 비-표적화 치료법 둘 다를 포함한다. 그의 예들은 암성 세포 상에 발현된 기타 수용체에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체, αvβ6 표적화 펩티드 또는 그의 접합체, 항튜불린제 (예를 들어, 아우리스타틴), DNA 부홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 단핵(백금), 이핵(백금) 및 삼핵 백금 착물 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 항대사물, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이온 투과 담체, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 예비-형성성 화합물, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
VII. 기타 적용
항-αvβ6 항체는 임상적 진단 또는 치료의 상황에서 또는 연구시 αvβ6을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 암 상에서의 αvβ6의 발현은 이러한 암이 본 발명의 항체를 이용하여 치료받을 수 있다는 지표를 제공한다. 상기 항체는 αvβ6을 보유하는 세포 및 각종 자극에 대한 그의 반응을 검출하는 데 있어서 실험실 연구용 연구 시약으로서 판매될 수도 있다. 이러한 용도에서는, 모노클로날 항체를 형광 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, αvβ6에 대한 검정을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 수반하는 키트 형태로 공급될 수 있다. 본원에 기재된 항체를 사용하여 αvβ6 단백질 발현을 검출할 수 있고, 특정 암이 항-αvβ6 ADC를 이용한 치료를 받을 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 상기 항체를 또한 사용하여, 예를 들어 친화성 크로마토그래피에 의해 αvβ6을 정제할 수 있다.
상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 기타 공개공보, 등록 번호 등은 각 개별적 항목이 참조로 포함된다고 구체적이고도 개별적으로 표시되는 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다. 특정 서열의 상이한 버전이 상이한 시점에 특정 등록 번호와 연관이 있는 경우, 이는 본 출원의 유효 출원일에 상기 등록 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 적용 가능한 경우 등록 번호에 대해 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원 이전을 의미한다. 본 발명의 어떠한 특색, 단계, 요소, 실시양태 또는 측면도 달리 구체적으로 표시되지 않는 한은 기타 어느 것과도 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명을 명료하고도 이해시킬 목적으로 예시 및 실시예를 통하여 일부 상세히 기재하긴 하였지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
실시예
물질
다음 실시예에 기재된 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC), 미국 국립 암 연구소 (NCI), 또는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; 독일 브라운슈바이그) (DMSZ)에 의해 명시된 조건에 따라서 배양 하에 유지시켰다. 디트로이트 562 세포주, HPAFII 세포주, 및 BxPC3 세포주는 ATCC로부터 수득하였다. 프리스타일(FreeStyle)™ 293-F (인비트로젠 코포레이션(InVitrogen Corp)) 인간 상피 신장 세포 및 상응하는 형질감염체는 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 유지시켰다. 세포 배양 시약을 인비트로젠 코포레이션 (미국 캘리포니아주 칼스배드), 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니데일) 및 기타 공급업자로부터 수득하였다. 2차 항체 시약은 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 구입하였다. 재조합 인간 αvβ6은 사내에서 제조하였다. 재조합 αvβ3 및 αvβ8은 알앤디 시스템즈(R&D Systems; 미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입하였다. 프리스타일™ 293-F 세포는 내인성 인테그린 αv를 발현하는데, 이들을 인간, 시노몰구스(cynomolgus) 또는 뮤린 인테그린 β6을 코딩하는 완전한 길이의 cDNA로 안정적으로 형질감염시켜 HEK293F:huβ6, HEK293F:시노β6 및 HEK293F:muβ6 세포주를 각각 생성시켰다. 빈(empty) 벡터로 형질감염시킨 HEK293F 세포 (HEK293F:벡터)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 내인성 마우스 인테그린 αv를 발현하는 마우스 3T3 및 FDC-P1 세포를 인간 및 마우스 인테그린 β6에 대한 완전한 길이의 cDNA 클론으로 형질감염시켜 3T3:huβ6 및 FDC-P1:muβ6을 각각 생성시켰다.
방법론:
포화 결합 검정
다음 항원 발현성 세포주를 사용하여 포화 결합 연구를 수행하였다: 293F:huβ6; 293F:시노β6; FDCP1:muβ6 및 래트 NBT-II. 0.25 내지 0.5 x 106개의 항원 발현성 세포를 96-웰 v-바닥 플레이트 내로 각 웰 별로 등분하였다. m15H3, h15H3(HBLC) 및 h15H3(HTLC)을 등가 수준의 비오틴으로 직접 표지시키고, 이를 0.1 pM 내지 150 nM의 범위의 농도로 세포에 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제 (PBS, 2% 소 태아 혈청, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.02% NaN3)에서 3회 세척하며, FACS 완충제 중에서 PE 접합된 스트렙타비딘 (0.5 ㎍/ml)과 함께 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제에서 3회 세척한 다음 재현탁시켰다. 벡톤 디킨슨 바이오사이언시스 FACS칼리버(Becton Dickinson Biosciences FACSCalibur; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 결합을 검출하였다. 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software; 미국 캘리포니아주 라호이아)를 이용하여 겉보기 Kd를 계산하였다.
ELISA
96-웰 맥시소르브(Maxisorb) 플레이트 (눈크(Nunc))를 4℃ 하에 밤새 PBS 중에 희석된 1 ㎍/ml의 재조합 인간 αvβ6, αvβ3 및 αvβ8로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중에서 0.05% 트윈(Tween) 20 (PBS-T)으로 세척하였다. 세척 완충제를 제거하고, 플레이트를 실온 하에 30분 동안 TBS 차단 완충제 (TBS + 1 mM MnCl2, 0.05% 트윈 20, 1% BSA)에서 차단시켰다. 플레이트를 세척한 다음, 4.6 ng/ml 내지 10 ㎍/ml의 범위의 농도로 TBS 차단 완충제 중에 희석시킨 비오티닐화 항체 (m15H3 또는 h15H3)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 1 ㎍/ml의 HRP-스트렙타비딘과 함께 1시간 동안 인큐베이션하며, 세척한 다음, TMB 기질과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 1 M H2SO4를 이용하여 상기 반응을 중지시켰다. 퓨젼(Fusion) HT 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer; 미국 매사추세츠주 월섬))를 이용하여 450 nm 하에서의 흡광도를 판독하였다.
경쟁 결합 검정
293F:huβ 및 HEK293F:시노β6 세포주를 사용하여 경쟁 결합 검정을 수행하였다. 1x105개의 항원 발현성 세포를 얼음 상에서 96-웰 v-바닥 플레이트의 각 웰에 등분하였다. 세포를 2 nM 알렉사플루오르(AlexaFluor)-647 표지된 뮤린 15H3 및 증가 농도 (0.024 nM 내지 100 nM)의 비표지된 인간화 15H3 구축물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, PBS로 3회 세척하였다. 세포를 펠릿화하고, 125 ㎕의 PBS/BSA에 재현탁시켰다. 포화된 형광 신호의 비율 (%)을 이용하여 유동 세포측정법에 의해 형광을 분석하여, 결합되고 표지된 뮤린 15H3의 비율 (%)을 결정하고, 연속해서 기울기가 가변적인 S자 모양의 용량-반응 곡선에 상기 데이터를 근사시킴으로써 EC50을 추정하였다.
정량적 유동 세포측정 분석
제조업자 (DAKO A/S; 덴마크 글로스트룹)에 의해 기재된 바와 같은 DAKO QiFiKit 유동 세포측정 간접 검정 및 1차 항체로서 뮤린 αvβ6 mAb를 사용하여, 세포 표면 상에서의 αvβ6 카피 수의 정량을 결정하고, 벡톤 디킨슨 FACScan 유동 세포측정기로 평가하였다.
세포독성 검정
종양 세포를 37℃ 하에 96시간 동안 항-αvβ6 항체 약물 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 비-결합성 (h00) ADC를 음성 대조군으로서 사용하였다. 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 검정 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation; 미국 위스콘신주 매디슨))을 이용하여 세포 생존율을 결정하고, 그 결과를 퓨젼 HT 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 결과를 IC50으로서 기록하였는데, 이는 비히클-처리된 세포 (대조군 = 100%)와 비교해서 생존율을 50% 감소시켜주는 데 필요한 화합물의 농도이다.
항체 약물 접합체의 생성
항-αvβ6 항체의 항체 약물 접합체를 US20050238649에 기재된 바와 같이 제조하였다. 약물 링커 vcMMAE 및 mcMMAF는 둘 다 US20050238649에 기재되어 있는데, 이 특허는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
생체내 활성 연구
누드 (nu / nu) 마우스 (군당 7 내지 10마리 동물)에게 배양 하에 성장시킨 종양 세포를 이식하였다. 25% 매트리겔(matrigel) 중의 5x105개 세포를 이용하여 디트로이트 562 (ATCC)를 이식하였고, 25% 매트리겔 중의 1x106개 세포를 이용하여 HPAFII (ATCC)를 이식하였다. 종양 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때 (q4d x 4 복강내 주사) 인간화 αvβ6 ADC 또는 비결합성 대조군 ADC를 투여하기 시작하였다. 캘리퍼를 이용하여 종양 부피를 모니터링하였고, 종양 부피가 대략 800 ㎣에 도달하면 동물을 안락사시켰다. 1마리 이상의 동물을 안락사시킬 때까지 각 군에 대한 평균 종양 부피 플롯을 지속하였다. 모든 동물 처리 과정은 국제 실험 동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)가 인증한 시설 내에서 기관내 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜 하에 수행하였다.
면역조직화학적 ( IHC ) 염색
방법
다중-종양 마이크로어레이 (TMA) (cat# MC5001)를 미국 바이오맥스 인크.(US Biomax Inc.)로부터 구입하였다. 모든 샘플을 본드-맥스(Bond-Max)™ 자동-염색기 (레이카(Leica)) 상에서 처리하였다.
FFPE 조직의 IHC 염색:
다중-종양 어레이 블록 MC5001로부터의 파라핀 절편을 수반한 슬라이드를, 본드(Bond)™ 데왁스(Dewax) 용액 (레이카, cat# AR9222)을 이용하여 72℃ 하에 탈파라핀화시킨 다음, 탈수시켰다. EDTA에 기반한 본드™ 에피토프 회복 용액 2 (레이카, cat# AR9640)을 이용하여 95 내지 100℃ 하에 20분 동안 항원 회복을 수행하였다. 슬라이드를 단백질 블록 (DAKO cat# X0909)으로 30분 동안 처리한 후, 25℃ 하에 45분 동안 5 ㎍/ml의 1차 항체 뮤린 항-인테그린 β6 클론 437216 (RnD MAB#41551)과 함께 인큐베이션하였다. 이소형-부합된 뮤린 IgG2b (Zymed#02-6300)를 배경 염색을 위한 음성 대조군으로서 5 ㎍/ml 사용하였다. 자동화 IHC 염색을 위해, 알칼리성 포스파타제 - 패스트 레드(Fast Red)에 기반한 검출 키트 (본드™ 폴리머 AP 레드 검출 키트; 레이카, cat# DS9305)를 사용하였다. 발색체 현상 후, 절편을 헤마톡실린으로 대비 염색시키고, 커버슬립을 덮었다. 병리학자가 슬라이드를 평가하고 스코어를 기록한 다음, 올림푸스(Olympus) BX41 현미경을 이용하여 영상을 찍었다.
동결 조직의 IHC :
조직을 고정시키기 위해, 동결 절편을 수반한 슬라이드를 -20℃ 하에 10분 동안 아세톤에서 인큐베이션하였다. 페록스애볼리쉬(PeroxAbolish) (바이오캐어 (Biocare) cat# PXA96) 과산화물 차단용 시약을 25℃ 하에 15분 동안 적용하여 내인성 과산화효소를 켄칭하였다. 슬라이드를 순차적으로, 각각 25℃ 하에 15분 동안 아비딘 블록 (벡터 cat#SP-2001)에서 인큐베이션한 다음, 비오틴 블록 (벡터 cat#SP-2001)에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 60분 동안 10 ㎍/ml의 1차 항체 인간화 항-인테그린 β6 클론 15H3과 함께 인큐베이션하였다. 1차 및 2차 항체는 50 mM MnCl을 함유하는 본드™ 1차 항체 희석제 (레이카 cat#AR9352)에서 제조하였다. 인간 IgG (앤셀(Ancell) cat#295-010)를 배경 염색을 위한 음성 대조군으로서 10 ㎍/ml 사용하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 비오티닐화 염소 항-인간 2차 항체 (잭슨(Jackson) cat#109-066-098)을 5 ㎍/ml 사용하였고, 이를 25℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 비오티닐화 2차 항체를 검출하기 위하여, VECTASTAIN 엘라이트(Elite) ABC 시약 (벡터 cat#PK-7100)을 25℃ 하에 30분 동안 적용하였다. 본드™ 폴리머 리파인(Polymer Refine) 검출용 키트 (레이카 cat# DS9800)를 DAB 발색체 현상에 사용하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대비 염색시키고, 커버슬립을 덮었다. 병리학자가 슬라이드를 평가하고 스코어를 기록한 다음, 올림푸스 BX41 현미경을 이용하여 영상을 찍었다.
결과
1. 마우스 항체의 결합성
뮤린 αvβ6 모노클로날 항체 15H3 항체 및 그의 선택 인간화 버전에 대한 KD를 인간, 시노, 래트 및 마우스에 대해 결정하였다. 래트를 제외한, 유전자 조작시킨 세포주 (293F:huβ6, 293F:시노β6 또는 FDC-P1:muβ6)를 이용하여, 인테그린 β6 오르토로그(ortholog)에 대한 경쟁 및 포화 결합 연구를 수행하였다. 이와 같이 유전자 조작시킨 세포주는 재조합 β6 쇄와 쌍을 이루는 내인성 αv를 발현하여 내인성 αv와 재조합 β6으로 구성된 이종-이량체성 수용체를 생성시킨다. 내인성 αvβ6을 발현하는 래트 NBT-II 방광 암종 세포를 이용하여, 래트 αvβ6에 대한 친화도를 결정하였다.
Figure 112014086566516-pct00002
15 H3 항체의 생성
약 5 x 106개의 3T3:huβ6 형질감염체를 복강내 주사하여 BALB/c 마우스를 3회 면역화시켰다. 융합시키기 3일 전에, 마우스에게 정제된 재조합 인간 αvβ6를 정맥내 (6 ㎍) 및 복강내 (30 ㎍)로 최종 주사하였다. 비장 및 림프절로부터 수거된 림프구를, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 P3X63Ag8.653 골수종 세포에 융합시켰다. 융합된 세포를 하이브리도마 성장 배지 (4 mM 글루타민, 10% 태아 클론 I, 10% 클로닝 인자 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 IMDM)에서 밤새 회수하였다. 회수 후, 세포를 침강시킨 다음, 반-고체 배지에 도말하였다. 반-고체 배지는 하이브리도마 선별용인 경우에는 HAT가 부가된 하이브리도마 성장 배지로 보충시킨 클론매트릭스(CloneMatrix) 배지로 이루어졌고, IgG-생성용인 경우에는 클론디텍트(CloneDetect)로 이루어졌다. 하이브리도마를 37℃ 하에 10일 동안 인큐베이션하였다. 10일경에 클론픽스에프엘(ClonePixFL) (몰레큘라 디바이시스)을 이용하여, IgG를 생산하는 하이브리도마 클론을 골라내고, HT가 부가된 IgG-고갈된 하이브리도마 성장 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 옮겼다. 하이브리도마 배양 상청액을 293F:huβ6 형질감염체 상에서 스크리닝하고, 검출을 위해 알렉시플루오르(Alexifluor)-647 표지된 2차 항체를 이용하여 양성 클론을 확인하였다. 상기 플레이트를 FMAT 8200 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 판독하였다. 293F:huβ6 및 293F:시노β6과는 결합되지만, 293F:벡터와는 그렇지 않은 하이브리도마를 직접 접합시키기 위해 확대시켰다. 이와 같이 직접 접합시킨 항체 패널을 결합 및 세포독성 검정에서 시험하였다. m15H3을 리드(lead) 항체로서 선택하였는데, 이는 이것이 다중 αvβ6-양성 종양 세포주 상에서 ADC로서 세포독성 활성을 나타내었고, 인간 및 시노몰구스 형태의 항원과 거의 동등한 수준의 친화도를 가졌기 때문이다. 마우스 15H3 및 인간화 15H3의 특이성은 FMAT 및 FACS 결합 연구에서 확증되었는데, 이러한 연구에서는 상기 항체가 293F:huβ6 형질감염체와는 결합되지만, αvβ5-양성 모 세포주 (293F:벡터)와는 그렇지 않은 것으로 나타났다. m15H3 및 h15H3의 결합 특이성은 또한 ELISA에 의해 확증되었는데, 여기서는 상기 항체가 재조합 인간 αvβ6과는 결합되지만, αvβ3 또는 αvβ8과는 그렇지 않았다.
인간화 항체의 설계 및 시험
본 실시예에서 인간화하기 위한 공여자 항체 또는 출발점은 뮤린 15H3 항체이다. 중쇄의 경우에는 VH1-46 및 JH4로써 제공되고 경쇄의 경우에는 VK2-30 및 Jk2로써 제공된 게놈 서열을 사용하였다.
제1 인간화 라운드에서는, 13개 위치가 중쇄에서 확인되었고 (H28, H30, H38, H40, H41, H48, H66, H67, H69, H71, H72, H93, 및 H108), 6개 위치가 경쇄에서 확인되었는데 (L21, L22, L36, L37, L45 및 L63), 이 위치에서 인간 수용자 서열은 공여자 서열과 상이하였고, 항원과 직접적으로 접촉하는 것에 따른 결과로서 항체 결합성에 영향을 미칠 수 있어, CDR의 입체형태에 영향을 미치거나 또는 중쇄와 경쇄 간의 패킹에 영향을 미친다. 이들 위치의 상이한 순열에 복귀돌연변이를 도입하여, 8개의 인간화 중쇄와 5개의 인간화 경쇄를 만들었다. 복귀돌연변이가 진하게 밑줄처져 있다 (표 2 및 3). 나머지 위치는 인간 수용자 서열로부터의 잔기에 의해 점유된다.
Figure 112014086566516-pct00003
Figure 112014086566516-pct00004
이어서, 인간화 중쇄 및 경쇄의 상기 쇄 순열을 나타내는 인간화 항체를 발현시켰다. 중쇄 모두가 발현되었지만, HB 중쇄 만이 주목할 만한 결합을 명확하게 보여주었다 (도 2). 경쇄는 모두 HB 중쇄와 함께 결합된 것으로 나타났다.
제1 인간화 라운드로부터의 결합 데이터에 기초하여, 제2 인간화 라운드를 수행하였다. H28, H30, H72, 및 H93 이외의 3개 위치 H73, H75, H78이 중쇄에서 확인되었는데, 이 위치에서 인간 수용자 서열은 공여자 서열과 상이하였고, 항원과 직접적으로 접촉하는 것에 따른 결과로서 항체 결합성에 영향을 미칠 수 있어, CDR의 입체형태에 영향을 미치거나 또는 중쇄와 경쇄 간의 패킹에 영향을 미친다. L21, L22, L36, L37, L45, 및 L63 이외의 1개 위치 L4가 경쇄에서 확인되었다. 이들 위치의 상이한 순열에 복귀돌연변이를 도입하여, 10개의 부가 인간화 중쇄와 1개의 부가 인간화 경쇄를 만들었다. 복귀돌연변이가 진하게 밑줄처져 있다 (표 4 및 5). 나머지 위치는 인간 수용자 서열로부터의 잔기에 의해 점유된다.
Figure 112014086566516-pct00005
Figure 112014086566516-pct00006
모든 중쇄 (HO 및 HK 제외)가 발현되었다. 결합 곡선이 도 4 내지 7에 도시되어 있다.
EC50이 다음 표 6에 요약되어 있다.
Figure 112014086566516-pct00007
발현 데이터
포르말린-고정된 파라핀 포매 조직 (FFPE)을 이용하여 각종 종양 유형의 면역조직화학적 분석을 위해 항-β6 클론 437216 (알앤디 시스템즈)을 사용하였다.
다중 종양 어레이에서 αvβ6에 대한 발현 데이터 요약
Figure 112014086566516-pct00008
동결 조직을 이용하여 각종 종양 유형의 면역조직화학적 분석을 위해 항-β6 클론 437216 (알앤디 시스템즈)을 사용하였다.
동결 조직 샘플에서 αvβ6에 대한 발현 데이터 요약
Figure 112014086566516-pct00009
포르말린-고정된 파라핀 포매 조직 (FFPE) 및 동결 조직을 이용하여 각종 정상 조직 유형의 면역조직화학적 분석을 위해 항-β6 클론 437216 (알앤디 시스템즈)을 또한 사용하였다. 정상적인 유방, 췌장, 식도, 후두, 폐, 피부, 자궁, 유방, 결장, 전립선, 위 및 난소 모두는 β6 발현이 전혀 없었다.
15H3 항체를 또한 사용하여 동결 종양 및 정상 조직 샘플을 염색하였다. 정상 조직 샘플은 β6 발현에 대해 음성이었다. 삼중 음성 유방암의 23% (3/13)가 약한 수준 내지 강력한 β6 발현을 나타내었다. 췌장암 샘플의 100% (5/5 샘플), 폐암 샘플의 100% (10/10) 및 위암 샘플의 100% (10/10)가 강력한 β6 발현을 나타내었다.
뮤린 15 H3 ADC 의 시험관내 항-종양 활성
시험관내에서의 항-αvβ6 ADC의 항-종양 활성을, 세포독성 검정을 이용하여 측정하였다. 정량적 FACS 분석에 의해 각종 세포주에서의 αvβ6 발현에 관한 조사를 수행하였다. 다음 표를 참조하면, 뮤린 15H3 ADC (vcMMAE 또는 mcMMAF (둘 다 US20050238649에 기재된 소분자 및/또는 링커)와 접합된 뮤린 15H3 항체)가 αvβ6 세포를 사멸시키는 데 유효하였다.
Figure 112014086566516-pct00010
도 9는 인간화 15H3 항-αvβ6 ADC가 세포독성 검정에서 모 마우스와 유사한 반응을 나타냈다는 것을 보여준다.
인간화 항-αvβ6 ADC 의 생체내 항-종양 활성
췌장암 (HPAFII, BxPC-3) 및 두경부암 (디트로이트 562) 모델을 사용하여, 생체내에서 선택 인간화 αvβ6 ADC (항체당 평균 4개 약물)의 항-종양 활성을 입증하였다 (도 10-12). vcMMAE와 접합된 αvβ6 ADC는 비처리된 ADC 및 대조군 ADC와 비교해서 상당한 종양 지연 또는 종양 퇴행을 나타내었다. h15H3-vcMMAE(4)는 항체당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 모 뮤린 항체의 인간화 형태의 항체 약물 접합체를 지칭한다. h00-vcMMAE(4)는 항체당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 비-결합 대조군 항체의 항체 약물 접합체를 지칭한다. h15H3-1은 HBLC 구축물이고, h15H3-2는 HLLC 구축물이며, h15H3-3은 HTLC 구축물이다.
서열
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Figure 112014086566516-pct00012
Figure 112014086566516-pct00013
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SEQUENCE LISTING <110> Seattle Genetics, Inc. <120> ANTIBODIES TO INTEGRIN ALPHA VBETA6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER <130> AVB6-00112PC <150> US 61/600,499 <151> 2012-02-17 <150> US 61/602,511 <151> 2012-02-23 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> murine heavy chain variable region <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gln Lys Ser Ser Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Arg Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> murine light chain variable region <400> 2 Asp Val 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<212> DNA <213> Artificial <220> <223> human light chain variable region signal peptide <400> 52 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagt 57 <210> 53 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human IgG1 heavy chain constant region <400> 53 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 54 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human kappa light chain constant domain <400> 54 actgtggcgg cgccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 55 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human IgG1 heavy chain constant region S239C mutant <400> 55 gctagcacca agggcccatc tgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagctg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgaacctgt gacagtgtcc 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtgtgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

Claims (32)

  1. 중쇄 가변 영역은 HB (서열 11), HT (서열 22), HL (서열 15), HU (서열 23), HM (서열 16) 또는 HN (서열 17)에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    경쇄 가변 영역은 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는,
    인테그린 αvβ6에 특이적으로 결합하는 단리된 인간화 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, HB (서열 11)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, HT (서열 22)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, HL (서열 15)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, HU (서열 23)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, HN (서열 17)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, HM (서열 16)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LA (서열 10), LB (서열 24), LC (서열 25), LD (서열 26), LE (서열 27), LF (서열 28) 또는 LG (서열 29)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편인 항체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 인간 중쇄 불변 영역에 융합되고, 경쇄 가변 영역이 인간 경쇄 불변 영역에 융합되는 것인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG1 이소형인 항체.
  11. 제9항에 있어서, 중쇄 불변 영역이, 천연 인간 불변 영역과 비교해서 Fc감마 수용체에 대한 결합성이 감소된 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태인 항체.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제에 접합되는 항체.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제약 조성물.
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