CN101798351B - 人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头。本发明还提供了该融合蛋白的编码序列、含有该编码序列的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法。本发明的融合蛋白可用于抑制T细胞的增殖，从而诱导免疫耐受性。

Description

人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TIM-1Fc的重组表达。

背景技术

初始CD4+Th细胞接受抗原活化后可向至少两种表型与功能不同的细胞亚群分化：Th1与Th2细胞。它们是免疫调节的核心，Th细胞分化成Th1与Th2受多种因素的调节，包括抗原的种类与提呈途径、APC类型、细胞因子、转录因子与信号转导途径以及细胞微环境因素等的综合作用。尽管对Th1与Th2亚群的功能及Th细胞分化的调节了解很多，但对两者的特异性表面分子知之甚少，为了寻找能够区分Th1与Th2的细胞表面标志，2002年Monney等发现并鉴定了表达于T细胞的一个新基因家族TIM(T cell immunoglobulin mucin，TIM)，随后有关TIM的大量发表在Nature和Science等杂志上，成为T细胞最新研究的热点。

T细胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin mucin，下文简称“TIM”)是新近发现的表达在T细胞表面与细胞活化相关的重要新分子。研究显示，小鼠TIM基因家族位于1lb1.1，目前共发现8个基因，包括编码蛋白TIM1～4和4个假想蛋白TIM5～8。在人类，TIM家族只有3个基因，定位于染色体5q33.2，相应于小鼠的TIM-1、TIM-3，但没有TIM-2。由于TIM-4为TIM-1的配体表达于树突状细胞表面，而TIM-3、TIM-1则分别选择性的表达于Th1与Th2细胞，凸现人类TIM家族中TIM-3、TIM-1在免疫调节中的作用。TIM蛋白是一类具有共同基序的跨膜糖蛋白，其基本结构包括免疫球蛋白(Ig)样区、粘蛋白样区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区，其中IgV样区包括4个保守的半胱氨酸，粘蛋白区各成员之间有较大的变化，但均富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，粘蛋白区有很多糖基化位点。这些成员胞内区约含42～77个氨基酸，都包含一个胞内酪氨酸激酶磷酸化基序，为小鼠和人类同源物中最高度保守的区域。其中TIM-1胞质结构域有含一个高度保守的酪氨酸激酶磷酸化活化基序；但TIM-3包含一个与其他成员不同的保守性酪氨酸激酶磷酸化基序，能与胞质中SH2结构域结合，介导的胞内抑制信号。人TIM-1最先被鉴定为甲型肝炎病毒的细胞受体，它表达在肾脏与肝脏，因此最初克隆时命名为甲肝病毒细胞受体(hepatitis A virus cellular receptor，HAVcr1)。HAV感染后，可与TIM-1的自然配体竞争结合在Th2细胞上的TIM-1，从而阻断TIM-1与其配体结合后提供的向Th2细胞诱导的信号转导，改变T细胞的分化以及Th1细胞与Th2细胞的平衡。在体内，TIM-1是CD4+T细胞活化必须的共刺激信号，过度表达可引起IL-4的明显增加；抗TIM-1抗体可以降低IL-13等Th2细胞因子的产生，从而减轻哮喘的症状。进一步研究人T细胞TIM-1的信号传导发现，TCR/CD3信号所需的ZAP70和IL-2诱导的T细胞激酶的活化需要TIM-1胞内酪氨酸的磷酸化激活，通过TIM-1的表达形成PI3K和ITK复合物，活化T细胞的信号传导，提示TIM-1分子及其信号通路是T细胞介导疾病良好的选择性靶点。

因此，利用TIM-1-Fc重组蛋白阻断T细胞的活化来诱导免疫耐受，对于器官移植排斥反应的治疗具有重要潜在临床应用价值。

迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业生产蛋白质的宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是：易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；比细胞易于培养，从而可降低生产成本。

然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要的缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体，必须对包涵体进行变性-溶解-复性处理。这一过程获得的产物回收率很低，也影响了蛋白质活性；另外，大肠杆菌等原核表达系统无蛋白的糖基化功能，不能满足蛋白糖基化获得的活性。

发明内容：

本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋白Fc部分和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。

本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列选自：

1)编码上述融合蛋白的核酸序列；

2)1)所述的核酸序列的互补序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体上述核酸序列。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞被前述表达载体转化。

本发明第五方面提供了一种制备上述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)提供上述的宿主细胞；

2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；

3)分离出所述的融合蛋白。

本发明采用哺乳动物细胞表达系统，并在目的蛋白的N端连接分泌信号肽，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象。本发明的其它优点和特征可在阅读了下文详细描述后更清楚地明了。

附图说明

图1为Tim-1-Fc的Westernblot检测图和SDS-PAGE图，其中：泳道A：未转染CHO细胞上清(含血清)；泳道B：转染48小时后CHO细胞培养上清(无血清)；泳道C：转染48小时后CHO细胞培养上清(含血清)；泳道D：转染48小时后CHO细胞(无血清)；泳道E：转染48小时后CHO细胞(含血清)；泳道F：阳性对照(～74kD含Fc重组蛋白)；MK：蛋白分子量标准(泳道C箭头表示转染48小时后CHO细胞培养上清中做Westernblot可以检测到Tim-1-Fc蛋白的表达)。

图2为Tim-1-Fc重组蛋白的Western-blot鉴定结果，其中泳道A：纯化后蛋白样品；MK：蛋白分子量标准。

图3为Tim-1-Fc重组蛋白的细胞活性检测图。

图4为Tim-1-Fc重组蛋白对小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制作用。

图5为Tim-1-Fc重组蛋白对同种MLR反应的抑制作用。

图6为Tim-1-Fc重组蛋白对人淋巴细胞的抑制作用。

具体实施方式

如上所述，本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋白Fc部分和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。

在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别包括抗体。本发明的多肽还可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。

此处所用的术语“包含”指的是融合蛋白中除了人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头之外还可以有其它氨基酸序列，只要这些氨基酸序列的存在对于所述融合蛋白的所需生物活性没有实质性的影响即可。此处所用的术语“融合蛋白的所需生物活性”指的是抑制T细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞)的增殖、阻断T细胞的活化，从而诱导免疫耐受。

在上述发明的一个优选实施方案中，所述融合蛋白由人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头组成。

在上述发明的一个优选实施方案中，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是哺乳动物T细胞免疫球蛋白粘蛋白，优选是人T细胞免疫球蛋白粘蛋白，更优选是人Tim-1、Tim-3和Tim-4。作为一个更优选的实施方案，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-1的胞外区序列(具体序列如下所示(SEQ ID NO：3)SVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPMTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLL)。

此处所用的术语“人免疫球蛋白Fc部分”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。在一个优选的实施例中，本发明所用的人免疫球蛋白Fc部分包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域。在更优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。在一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分由SEQ ID NO：4所示的序列编码。

在本发明的一个优选实施方案中，所述融合蛋白由人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头组成，其中所述人免疫球蛋白Fc部分是人Tim-1的胞外区序列，所述人免疫球蛋白Fc部分由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。

在一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分通过接头(即连接肽)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白连接。所述接头可选择多种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)或其它氨基酸的组合，例如可选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为10-15个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分的C端通过所述接头和T细胞免疫球蛋白粘蛋白的N端相连。在另一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分的C端通过接头和T细胞免疫球蛋白粘蛋白的N端相连。另外，本领域技术人员也可选择使人免疫球蛋白的铰链区多肽序列直接与T细胞免疫球蛋白粘蛋白相连。最佳的连接肽长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。在本发明的一个优选实施例中，使人免疫球蛋白的铰链区多肽序列直接与T细胞免疫球蛋白粘蛋白相连。

另外，如本领域技术人员所能预见到的，本发明的“人免疫球蛋白Fc部分”和“T细胞免疫球蛋白粘蛋白”还涵盖了具有相同或相似生物活性的所述多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了T细胞免疫球蛋白粘蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。

应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核酸序列。这些变化也涵盖在本发明的范围之内。

本发明另一方面提供了一种编码上述融合蛋白的分离的核酸序列或其互补序列。另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与所述核酸序列具有高度相同性(同源性)，如有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在高度严谨条件下相互杂交。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在高度严谨条件下与本发明核酸序列杂交的核酸序列。

本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，构建本发明核酸序列的方法可以是：首先，合成编码T细胞免疫球蛋白粘蛋白的核酸序列：从基因库中搜索目标蛋白(如人Tim-1胞外区)的cDNA序列，用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法等合成目标基因；其次，在合成得到的cDNA序列前段连接一段编码IgK分泌信号(如小鼠IgK分泌信号)的序列，使得编码的IgK分泌信号在T细胞免疫球蛋白粘蛋白(如人Tim-1胞外区)的N端。然后，从cDNA库中钓取人的编码免疫球蛋白Fc片段的序列，并通过任选的接头将其与前述T细胞免疫球蛋白粘蛋白(如人Tim-1胞外区)连接(例如连接在T细胞免疫球蛋白粘蛋白的C端)。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。

本发明第三方面提供了携带上述核酸序列的表达载体。“表达载体”指一种DNA构建物，它含有的DNA序列与能使DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列操作性相连。这些控制序列包括实现转录的启动子、控制该转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单地是潜在的基因组插入物。在某些场合，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。一旦转化到合适宿主中，该载体能不依赖于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些情况下，其本身整合入基因组中。哺乳动物细胞培养表达的典型的表达载体例如以pRK5(EP307,247)，pSV16B(WO 91/08291)和pVL1392(Pharmingen)为基础。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体除了包含上述核酸序列外，还含有编码分泌信号肽的核酸序列。所述分泌信号肽是小鼠IgK分泌信号肽，其连接在目的蛋白的N端(即所述核酸序列的3′端连接在编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列的5′端)。在一个优选的实施方案中，所述编码分泌信号肽的核酸序列是SEQ IDNO：2所示的序列；ATGGCATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC)。

本发明第四方面提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。优选的方法是电转化方法。

在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞表达系统是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。

本发明另一方面提供了一种制备上述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)提供一宿主细胞(如上所述)，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含上述核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；

2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；

3)分离出所述的融合蛋白。

具体而言，本发明采用哺乳动物细胞表达系统，并在目的蛋白的N端连接分泌信号肽，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象。同时，本发明将IgK分泌信号与人的Tim-1-Fc基因融合，从而提高了Tim-1-Fc的可溶性表达。

在本发明的一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞表达系统是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。

在一个优选的实施方案中，所述核酸序列编码的氨基酸序列包含IgK分泌信号、T细胞免疫球蛋白粘蛋白、以及人免疫球蛋白的Fc部分，其中IgK分泌信号在T细胞免疫球蛋白粘蛋白的N端。所述IgK分泌信号肽宜为小鼠IgK分泌信号肽。另外，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白和人免疫球蛋白的Fc部分之间还可以任选地存在接头。所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是哺乳动物T细胞免疫球蛋白粘蛋白，优选是人T细胞免疫球蛋白粘蛋白，更优选是人Tim-1、Tim-3和Tim-4。作为一个更优选的实施方案，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-1的胞外区序列。所述人免疫球蛋白Fc部分包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，但缺少CH1结构域。

随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。

最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的分离纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的本发明的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

在本发明的一个优选实施方案中，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-1的胞外区序列，其与人IgG抗体Fc部分(hinge-CH2-CH3)相连，所述宿主细胞为CHO细胞，所述表达载体为pcDNA3.1。

在一个优选实施方案中，具体方法包括如下步骤：

1.大量扩增带有小鼠IgK信号肽编码序列-Tim-1-Fc基因的pcDNA3.1载体：将筛选获得的带有小鼠IgK信号肽编码序列-Tim-1-Fc基因的pcDNA3.1(pcDNA3.1-Tim-1-Fc)转化入大肠杆菌DH5α感受态中，经过氨苄青霉素抗性的平板筛选转化子，将筛选得到的阳性重组菌DH5α/pcDNA3.1-Tim-1-Fc单菌落，接种到氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床震荡培养14小时，然后按照1％比例转到新的氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床震荡培养14小时后，Invitrogen公司质粒大抽试剂盒抽提质粒。

2.转染CHO细胞，诱导表达Tim-1-Fc融合蛋白：转染时，CHO细胞达到75～85％的融合，按照Lipofectamine^TM-2000转染试剂说明书将pcDNA3.1-Tim-1-Fc转染进CHO细胞。培养48h后，收集细胞上清液。

3.分离纯化Tim-1-Fc融合蛋白：取上清液进行树脂亲和层析，经过洗涤、洗脱、脱盐，即得到纯化后的Tim-1-Fc融合蛋白，经过SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色验证蛋白的大小及检测其浓度。

本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，DNA序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作可按照本领域已知的技术进行(参见Sambrook ct al.，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cola Spring Harbor，NY，1989)。

本发明Tim-1的表达方法，以Fc作为融合蛋白标签，采用真核表达系统表达具有以下优势：

1.抗蛋白酶解：在细胞内，蛋白酶解受到严密控制，通过降解空闲或错误折叠的蛋白维持细胞的稳定性。宿主表达的重组蛋白很容易被当成空闲蛋白被酶解，从而降低表达水平。Fc融合表达时，可能促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。

2.增加重组蛋白的表达量：蛋白表达是一个很复杂的过程，通常依赖于mRNA的稳定性、转录效率、转录调控等，而重组蛋白的高效表达依赖于mRNA的拷贝数和稳定性、有效的转录起始和延伸(强有效的启动子)、翻译的增强(密码子偏好性)。Fc与蛋白融合表达时表达量明显增加，但确切的机理尚不清楚。

3.促进蛋白正确折叠：虽然大肠杆菌的表达体系是重组蛋白的首选表达方式，但是由于缺乏蛋白折叠机制，表达很多真核蛋白，尤其是富含二硫键的蛋白时，很难形成正确结构，一旦蛋白大量表达，来不及正确折叠导致形成非活性的包涵体。采用真核表达体系，就可以避免此类问题的出现。为了防止此类问题的出现，分子伴侣和折叠酶的共表达、分泌表达、融合表达等策略相继出现。Fc融合标签可以增强可溶性，可能是由于Fc具有独特的结构，如亲水的表面和高度疏水的内核，从而增强所融合蛋白的可溶性。

4.通过蛋白质糖基化提高蛋白质活性：真核表达系统能满足蛋白糖基化获得活性的需求。

本领域技术人员能够理解，本发明的上述所有优选技术方案可以任意方式相互组合，出于使文本简明的目的，本文不再对这些组合进行逐一描述。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1 Tim-1基因的人工合成

根据基因库中搜索到的人的Tim-1基因序列人工合成方法获得人的Tim-1基因，并在其N端(5′端)添加小鼠的IgK分泌信号，按照密码子的简并性消除在本实验中所用的酶切位点；合成好的Tim-1亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1载体中，扩增并抽提含有Tim-1基因的载体质粒pcDNA3.1-Tim-1。

小鼠IgK分泌信号-Tim-1的序列如下所示(SEQ ID NO：1；斜体下划线部分表示小鼠IgK分泌信号)：

TCTGTAAAGGTTGGTGGAGAGGCAGGTCCATCTGTCACACTACCCTGCCACTACAGTGGAGCTGTCACATCCATGTGCTGGAATAGAGGCTCATGTTCTCTATTCACATGCCAAAATGGCATTGTCTGGACCAATGGAACCCACGTCACCTATCGGAAGGACACACGCTATAAGCTATTGGGGGACCTTTCAAGAAGGGATGTCTCTTTGACCATAGAAAATACAGCTGTGTCTGACAGTGGCGTATATTGTTGCCGTGTTGAGCACCGTGGGTGGTTCAATGACATGAAAATCACCGTATCATTGGAGATTGTGCCACCCAAGGTCACGACTACTCCAATTGTCACAACTGTTCCAACCGTCACGACTGTTCGAACGAGCACCACTGTTCCAACGACAACGACTGTTCCAATGACGACTGTTCCAACGACAACTGTTCCAACAACAATGAGCATTCCAACGACAACGACTGTTCTGACGACAATGACTGTTTCAACGACAACGAGCGTTCCAACGACAACGAGCATTCCAACAACAACAAGTGTTCCAGTGACAACAACTGTCTCTACCTTTGTTCCTCCAATGCCTTTGCCCAGGCAGAACCATGAACCAGTAGCCACTTCACCATCTTCACCTCAGCCAGCAGAAACCCACCCTACGACACTGCAGGGAGCAATAAGGAGAGAACCCACCAGCTCACCATTGTACTCTTACACAACAGATGGGAATGACACCGTGACAGAGTCTTCAGATGGCCTTTGGAATAACAATCAAACTCAACTGTTCCTAGAACATAGTCTACTG

实施例2 pcDNA3.1-Tim-1-Fc表达载体的构建

从人cDNA库中钓取人IgG1的Fc片段(hinge-CH2-CH3)，将钓取的人Fc片段克隆到pcDNA3.1-Tim-1上，测序验证构建质粒的准确性；采用Invitrogen的中抽试剂盒，按照说明书抽提获得重组的质粒DNA即pcDNA3.1-Tim-1-Fc。

人IgG1的Fc片段序列如下所示(SEQ ID NO：4)：

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

实施例3 重组Tim-1-Fc蛋白的获得

1、诱导表达

将测序正确的pcDNA3.1-Tim-1-Fc利用Lipofectamine^TM-2000转染到融合率达到75-85％的CHO细胞中，培养48h后，收集细胞及其上清液。通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。通过Western-blot验证目标蛋白正确性(图1)。

2、蛋白质的纯化

按照上述的融合蛋白表达的最优条件，扩大培养体积，收集上清，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白Tim-1-Fc，最终蛋白产品的纯度一般不低于80％。通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

实施例4 重组Tim-1-Fc蛋白的鉴定

Western-blot检测验证目标蛋白正确性。

纯化的重组Tim-1-Fc蛋白样品加入6×上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，pH6.8)混匀，于100℃水浴煮沸5min后，冷却后上样，同时上样预染蛋白分子量标准。样品蛋白经12％SDS-PAGE电泳分离。随后以80V恒定电压，于冰浴下将聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，丽春红染色并标记大小和方向。在封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST溶液)室温孵育2h后，将膜与适当浓度的一抗溶液(稀释于含5％脱脂奶粉的TBST中)4℃封闭过夜。TBST中洗3次，每次15min，然后与稀释于抗体稀释液中的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1h，TBST洗3次，每次15min。将Western印迹发光检测试剂中的A液和B液等体积混匀，室温孵育5min，于凝胶成像分析检测仪上进行检测。结果显示在Marker 62KD的位置有大量蛋白存在，与重组Tim-1-Fc蛋白的分子大小一样(图2)。

实施例5 Tim-1-Fc蛋白活性检测

采用尼龙毛柱法分离小鼠脾脏T淋巴细胞，以5×105/孔细胞接种于96孔板中，ConA刺激，并在含有10％的胎牛血清的1640培养基中加入纯化的Tim-1-Fc蛋白，以不加Tim-1-Fc蛋白的细胞组为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况。结果显示在一定蛋白浓度下，重组的Tim-1-Fc蛋白能够明显的抑制T细胞的增殖(图3)。

实施例6 Tim-1-Fc蛋白对小鼠CD4+T细胞、CD8+T细胞以及同种MLR反应的抑制作用

分离小鼠脾脏T淋巴细胞，采用CD4+或CD8+磁珠分离CD4+T细胞、CD8+T细胞，以5×105/孔细胞培养于96孔板中，ConA刺激，并在含有10％的胎牛血清的1640培养基中加入纯化的Tim-1-Fc蛋白，以不加Tim-1-Fc蛋白的细胞组作为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况，结果显示在一定蛋白浓度下，重组的Tim-1-Fc蛋白能够明显的抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞的增殖(图4)。分离BALB/c小鼠脾脏细胞，采用Tris-NH4Cl去除红细胞后加入终浓度为80ug/ml的丝裂霉素C，37℃孵育1小时后用RPMI1640洗涤三次后计数作为刺激细胞备用；分离C57小鼠脾脏淋巴细胞，计数作为反应细胞，以刺激细∶反应细胞分别为1∶20、1∶10、1∶5的比例加入96孔板中，每孔加至200ul含有10％的胎牛血清的1640培养基并含不同浓度的Tim-1-Fc蛋白，以不加Tim-1-Fc蛋白的细胞组作为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况，结果显示重组的Tim-1-Fc蛋白能够抑制同种MLR反应(图5)。

实施例7 Tim-1-Fc蛋白对人淋巴细胞的抑制作用

分离正常献血员外周血淋巴细胞，以5×105/孔细胞接种于96孔板中，ConA刺激，并在含有10％的AB血清的1640培养基中加入Tim-1-Fc蛋白，以不加Tim-1-Fc蛋白的细胞组为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况，结果显示在一定蛋白浓度下，重组的Tim-1-Fc蛋白能够明显的抑制T细胞的增殖(图6)。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<110>第二军医大学免疫学研究所

<120>人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达

<130>100982

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠IgK分泌信号-Tim-1的编码序列

<400>1

atggcatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcctct     60

gtaaaggttg gtggagaggc aggtccatct gtcacactac cctgccacta cagtggagct    120

gtcacatcca tgtgctggaa tagaggctca tgttctctat tcacatgcca aaatggcatt    180

gtctggacca atggaaccca cgtcacctat cggaaggaca cacgctataa gctattgggg    240

gacctttcaa gaagggatgt ctctttgacc atagaaaata cagctgtgtc tgacagtggc    300

gtatattgtt gccgtgttga gcaccgtggg tggttcaatg acatgaaaat caccgtatca    360

ttggagattg tgccacccaa ggtcacgact actccaattg tcacaactgt tccaaccgtc    420

acgactgttc gaacgagcac cactgttcca acgacaacga ctgttccaat gacgactgtt    480

ccaacgacaa ctgttccaac aacaatgagc attccaacga caacgactgt tctgacgaca    540

atgactgttt caacgacaac gagcgttcca acgacaacga gcattccaac aacaacaagt    600

gttccagtga caacaactgt ctctaccttt gttcctccaa tgcctttgcc caggcagaac    660

catgaaccag tagccacttc accatcttca cctcagccag cagaaaccca ccctacgaca    720

ctgcagggag caataaggag agaacccacc agctcaccat tgtactctta cacaacagat    780

gggaatgaca ccgtgacaga gtcttcagat ggcctttgga ataacaatca aactcaactg    840

ttcctagaac atagtctact g                                               861

<210>2

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠IgK分泌信号肽编码序列

<400>2

atggcatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcc        57

<210>3

<211>268

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人Tim-1的胞外区序列

<400>3

Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys

1               5                   10                  15

His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys

            20                  25                  30

Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His

        35                  40                  45

Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser

    50                  55                  60

Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser

65                  70                  75                  80

Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met

                85                  90                  95

Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr

            100                 105                 110

Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr

        115                 120                 125

Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr Val Pro Thr Thr

    130                 135                 140

Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Leu Thr

145                 150                 155                 160

Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile

                165                 170                 175

Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val

            180                 185                 190

Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser

        195                 200                 205

Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly

    210                 215                 220

Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr

225                 230                 235                 240

Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn

                245                 250                 255

Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu

            260                 265

<210>4

<211>993

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人免疫球蛋白Fc部分的编码序列

<400>4

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg     60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg    120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca    180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc    240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc    300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga    360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct    420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg    480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac    540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag    600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc    660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag    720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc    780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg    840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg    900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg    960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                 993

Claims (8)

1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白，所述人免疫球蛋白Fc部分和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者直接相连，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-1的胞外区序列，

所述人免疫球蛋白Fc部分由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。

2.一种分离的核酸序列，所述核酸序列选自：

1)编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列；

2)1)所述的核酸序列的互补序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的核酸序列。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码分泌信号肽的核酸序列，所述核酸序列的3′端连接在编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列的5′端。

5.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述编码分泌信号肽的核酸序列是SEQ ID NO：2所示的序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求3、4或5所述的表达载体转化。

7.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)提供权利要求6所述的宿主细胞；

2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；

3)分离出所述的融合蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

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