CN109265549A - 一种具有中和活性的抗人Tim-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有中和活性的抗人Tim‑1抗体HF22，所述抗体具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。本发明同时提供了编码所述抗体HF22的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体和宿主细胞。本发明提供的抗体为全人源抗体，能够特异性的与人Tim‑1相结合，从而可用于诊断和治疗与Tim‑1相关的疾病；同时HF22能够显著的抑制病毒的感染，从而可用于治疗病毒感染所引起的疾病。

Description

一种具有中和活性的抗人Tim-1抗体
技术领域
本发明本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种具有中和活性的抗人Tim-1抗体HF22。
背景技术
Tim-1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-1)，又称人甲型肝炎病毒受体-1(human hepatitis A virus receptor，hHAVcr-I)或肾损伤分子-1(kidney injury molecule 1，KIM-1)，是Tim家族基因中第一个被发现的分子。Tim-1表达于CD4+T细胞，在抗原刺激初期即开始转录，为T细胞的激活提供共刺激信号，参与T细胞的增殖与分化，并可以抑制外周耐受的发生。Tim-1基因编码蛋白为I型跨膜蛋白，是一个由N末端免疫球蛋白V区结构域(IgV)、黏蛋白样结构域、跨膜区和一个带有磷酸化基序的胞质尾区构成。
Tim-1的配体能够协同刺激T细胞的增殖和细胞因子的产生。Tim-1和表达在树突状细胞表面的Tim-4分子结合，协同刺激了T细胞的增殖和活化，尤其对Th2型细胞具有较强的效应，具有免疫调节功能。研究表明，Tim-1在自身免疫疾病如多发性硬化(multiplesclerosis，MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等，以及过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性湿疹中发挥着重要的作用(王敬瑜，I型T细胞免疫球蛋白粘蛋白-1(Tim-1)的表达、纯化及活性测定)。
近期的研究表明，除了免疫调节功能，Tim-1作为多种病毒如埃博拉病毒、马尔堡病毒(Andrew S.Kondratowicz etl，(2011)T-cell immunoglobulin and mucin domain 1(TIM-1)is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburg virus，PNAS，108(20)：8426-8431)、zika病毒(R Hamel etl.(2015)，Biology of Zika virusinfection in human skin cells，J Virol.89(17):8880-96)、甲型肝炎病毒、艾滋病毒等病毒的共受体在起作用。实验研究表明阻断Tim-1的功能能显著抑制上述病毒的感染，但目前仍没有上市的人Tim-1中和性抗体。因此研究抗人Tim-1的中和抗体，对于治疗自身免疫疾病、过敏性疾病以及抑制有关病毒的感染具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供一种抗人Tim-1的抗体。
本发明的目的之二，在于提供一种诊断与人Tim-1相关的疾病的手段及产品。
本发明的目的之三，在于提供一种治疗与人Tim-1相关的疾病的手段和药物组合物。
本发明的目的之四，在于提供一种防治病毒感染的手段和药物组合物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面一种抗人Tim-1的抗体，其特征在于，包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区；其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、7、8所示。
进一步，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的抗体的核苷酸序列，其中，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
编码本发明的抗体分子的DNA序列可由本领域技术人员熟知的方法来获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列可按需要从确定的DNA序列或基于对应的氨基酸序列来合成。
编码受体框架序列的DNA对于本领域技术人员是广泛可得的并且可基于其已知的氨基酸序列来容易地合成。分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。所需DNA序列可完全或部分地利用寡核苷酸合成技术合成。可适当地采用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
本发明的第三方面提供了一种表达载体，包含本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明中的表达载体包括(但不限于)由Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体；市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体、M13噬菌体、Mu噬菌体、P1噬菌体、P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数噬菌体、T2噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种表达载体的任意一种，且表达载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。
为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子，或包含本发明第三方面所述的表达载体。
在本发明中，任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统，或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的抗体。
进一步，所述抗体还包括药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物还可包括一种或多种其它治疗剂。治疗剂可包含抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列等。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用，包括：
1)本发明第一方面所述的抗体在制备诊断与Tim-1相关的疾病的产品中的应用；
2)本发明第一方面所述的抗体在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
3)本发明第一方面所述的抗体在制备防治病毒感染的药物组合物中的应用；
4)本发明第二方面所述的核酸分子制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
5)本发明第三方面所述的表达载体在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
6)本发明第四方面所述的宿主细胞在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
7)本发明第五方面所述的药物组合物在制备治疗与Tim-1相关的疾病的产品中的应用。
进一步，1)所述产品包括试剂盒、试纸、芯片等。其中，所述芯片包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的上述单克隆抗体或其片段；所述蛋白免疫检测试剂盒；所述蛋白免疫检测试剂盒包括上述单克隆抗体或其片段。
进一步，3)中所述的病毒为以Tim-1作为共受体的病毒。
优选的，所述病毒为埃博拉病毒、马尔堡病毒、zika病毒、甲型肝炎病毒、艾滋病毒。
更为优选的，所述病毒为马尔堡病毒、埃博拉病毒。
本发明涵盖与所述抗体的氨基酸序列或者编码该抗体的任何核苷酸序列具有一定程度的序列一致性或序列同源性的序列，本发明中，“同源性”可等同于“一致性”。
本领域技术人员还将理解的是，抗体可以进行各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的缺失。
本发明还包括将上述抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成所得到的包括人源与非人源抗体，并具有与HF22抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。缺失、取代、插入或添加可以同时发生，并且被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然类型或非天然类型的。
本发明的CDR可包括变体，例如当将本文中所公开的CDR回复突变为不同的框架区时。通常，个体变体CDR与本文所述序列的氨基酸同一性为至少70％或80％，更典型地具有优选至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的渐增的同一性。
如本发明所用，“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。可通常彼此置换的其它氨基酸包括(但不限于)：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)，天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)，天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)，以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。
在本发明中，“框架”指除去被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由CDR分隔的连续区域(FRl、FR2、FR3和FR4)。
本发明的抗体包括在单克隆抗体或其CDR移植的抗体片段上利用单点突变或多点组合突变对抗体恒定区/CDR区部分氨基酸/进行改造及优化后的抗体片段或scFv抗体。
在本发明中，全人源化的抗体具有包含人受体框架区以及本发明具体提供的一个或多个CDR的可变域。框架区不需要具有与受体抗体的框架区完全相同的序列。例如，可将不常见的残基改变成对于该受体链种类或类型更常见的残基。备选地，可改变在受体框架区中的选定残基以使得它们对应于供体抗体中相同位置处所发现的残基。
在本发明中，抗体分子可仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。对于产生包含重链和轻链的产物，可使用两种载体(编码轻链多肽的第一载体以及编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。或者，可使用单一载体，载体包括编码重链和轻链多肽的序列。
本发明公开的抗体和片段从宿主细胞以良好水平表达。因此，抗体和/或结合片段的性质适合用于商业规模的表达。
在本发明中，药物组合物包含本发明的上述单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。包含本发明的单克隆抗体或其抗体片段或其结合物的药物组合物可以只包含抗体或其抗体片段或其结合物作为活性成分。一般来说，优选情况下，将所述药物组合物制备成通过制药学技术领域中公知的适合方法、通过将其与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂。本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。
本发明的药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。
本发明的药物组合物的最佳给药途径的选择会受到几个因素的影响，包含组合物中活性分子的物理化学性质、临床表现的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，可与载剂一起制备本发明的单克隆抗体，其中载剂将保护它们以防止快速释放(诸如控释制剂)，该载剂包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可在本发明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。进一步地，单克隆抗体可包被有防止抗体失活的材料或化合物、或与这样的材料或化合物同时给药。例如，单克隆抗体可与适当的载剂(例如脂质体或稀释剂)一起给药。
本发明的药物组合物的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。优选的给药途径是静脉注射，但并不限于此。
口服剂型可被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶或膏剂。这些制剂可包含药学赋形剂，其中药学赋形剂包括但并不限于：成粒剂和崩解剂，结合剂，润滑剂，防腐剂，着色剂、调味剂或甜味剂，植物油或矿物油，湿润剂，和增稠剂。
由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液、汉克溶液、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。
由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克溶液(Hank’s solution)、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。
在本发明中，用于检测或测定Tim-1的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
在本发明中，对于Tim-1相关的疾病没有限制，只要它是与表达Tim-1的相关的疾病即可，例如癌症、自体免疫性疾病和过敏性疾病、病毒感染引起的疾病。
在本发明中，与Tim-1相关的疾病可以通过用本发明的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达Tim-1的细胞来诊断。根据所需的诊断方法，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段或其结合物的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种全人源的抗人Tim-1的抗体，该抗体特异性强、亲和力高、稳定性好，能在较低剂量结合Tim-1分子。
本发明的抗体可有效的抑制以Tim-1为共受体的病毒的感染，为相关病毒感染疾病提供了一种治疗手段。
附图说明
图1为Tim-1抗体的蛋白电泳鉴定及ELISA结合实验图；其中，图A为蛋白电泳鉴定图；图B为结合实验图；
图2为假病毒对细胞的感染活性图，其中，图A为埃博拉假病毒，图B为马尔堡假病毒；
图3为抗Tim-1抗体对病毒的中和活性检测结果图，其中，图A为埃马尔堡假病毒，图B为埃博拉假病毒。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1筛选Tim-1抗体
1、构建噬菌体抗体库
从人淋巴细胞中提取mRNA，反转录成cDNA，使用与抗体可变区基因两侧保守区互补的引物，通过多聚酶链反应(PCR)分别扩增抗体可变区的重链(VH)和轻链(VL)基因，构建文库；插入噬菌体载体后表达scFv单链抗体，scFv由VH和VL之间通过人工接头相连。
2、抗人Tim-1抗体的筛选
(1)噬菌体分别黏附人Tim-1-Fc蛋白、以人Fc蛋白为阴性对照，保留结合Tim-1-Fc蛋白而不结合人Fc的噬菌体。
(2)反复洗涤去除非特异性结合，洗脱并收集与Tim-1结合的噬菌体；
(3)再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。
3、PCR鉴定
选用scFv 5′及3′端引物扩增待测scFv基因，经琼脂糖电泳鉴定。
4、抗体可变区基因序列的测定、分析
送北京奥科生物技术有限公司进行阳性克隆的抗体可变区基因序列测定,对测序结果用DNAMAN和数据库进行检索分析。
5、结果
通过上述步骤筛选出了抗人Tim-1的单克隆抗体HF22，经序列比对，获得了编码HF22单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列和编码HF22单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列，其中重链的CDR1-3序列如SEQ ID NO.1～3所示，轻链的CDR1-3序列如SEQ IDNO.6、7和8所示。
实施例2单克隆抗体HF22的扩增
1、材料
Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱：北京本元正阳生物技术有限公司产品；pcDNA3.1质粒：Invitrogen；其余试剂和材料的来源同实施例1。
2、方法和结果
(1)将实施例1获得的单克隆抗体HF22轻链可变区基因，轻链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒，得含单克隆抗体HF22轻链基因的载体；将实施例1获得的单克隆抗体HF22重链可变区基因，重链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒，获得含单克隆抗体HF22重链基因的载体。
(2)将含有单克隆抗体HF22轻链基因的载体、重链基因的载体共转染转入哺乳动物细胞中，进行表达。
(3)收集表达上清，加入1mL pH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液并用1mol/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把上清液加入已经用pH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液平衡好的Protein ASepharose CL 4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。
(4)用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1mol/L pH 8.5 TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01mol/L的PBS透析72h。
(5)取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，冻干后于-20℃保存。
实施例3单克隆抗体HF22的Tim-1蛋白的特异性检测
1、方法
采用ELISA法检测单克隆抗体HF22的特异性。
(1)在ELISA板中包被5μg/ml的人Tim-1融合蛋白，4℃过夜；
(2)用脱脂奶粉封闭未结合的位点，然后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
(3)配置不同浓度的抗人Tim-1抗体HF22及对照抗体，加入步骤(2)的ELISA板条中，37℃孵育1h，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
(4)加入HRP-标记的羊抗人抗体，37℃孵育30min，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。
2.结果
结果如图1所示，抗体HF22能有效的结合Tim-1抗原蛋白，且呈剂量依赖关系。
实施例4假病毒的构建及感染
1、假病毒包装：
(1)将10cm培养皿中的HEK 293T细胞培养长至80％；
(2)马尔堡假病毒(Marburg)的构建：
取1ml转染buffer加入以下转染成分：Marburg-GP质粒14μg，PNL-4.3-luc7μg，转染试剂PEI 63μl，RT混合作用15min后加入到HEK-293T细胞中；
埃博拉假病毒(EBOV)的构建：
取14μg pcDNA4-GPC07质粒与7μg HIV假病毒包装质粒pNL4-3.Luc.R-E-质粒混匀，用PEI共转至HEK 293T细胞中。
(3)转染6h后，用PBS清洗细胞，充分去除可能残留的血清成分，加入无血清的DMEM培养基，继续培养48h后，收集细胞上清，3000rpm/min离心10min，用0.45μm的滤膜过滤后，分装为200μl/管，保存于-80℃低温冰箱中。
2、假病毒感染
(1)将24孔培养板中的HEK 293T细胞长至70％～80％；
(2)弃去培养基，PBS清洗细胞两次，将病毒按比例加入到24孔板中，37℃，2100rpm离心感染2h，转移至37℃培养箱中继续感染4h后，弃掉病毒液，用PBS清洗细胞两次，加入含10％血清的完全培养基DMEM继续培养48h；
(3)靶细胞荧光值检测：弃去培养基，PBS清洗细胞两次，加入裂解液冰上放置10min至细胞裂解充分；取10μl细胞裂解物转移到白色的96孔反应板中加入荧光素酶底物为50μl检测荧光素酶活性值。
4、结果
病毒的检测结果如图2所示，随着病毒稀释度的增加，假病毒的感染效果降低。
实施例5假病毒的中和实验
4倍稀释的假病毒在感染HEK-293-T细胞的过程中分别加入Tim-1抗体进行中和实验，用实验室制备的Tim-3抗体H1作为无关抗体对照。具体步骤：
1、将24孔培养板中的HEK 293T细胞长至70％～80％；
2、弃去培养基，PBS清洗细胞两次，将假病毒按比例加入到24孔板中，然后加入抗体，37℃，2100rpm离心感染2h，转移至37℃培养箱中继续感染4h后，弃掉病毒液，用PBS清洗细胞两次，加入含10％血清的完全培养基DMEM继续培养48h；
3、弃去培养基，PBS清洗细胞两次，加入裂解液冰上放置10min至细胞裂解充分；取10μl细胞裂解物转移到白色的96孔反应板中加入荧光素酶底物为50μl检测荧光素酶活性值。
4、结果
结果如图3所示，HF22能够有效的中和马尔堡病毒和埃博拉病毒，抑制病毒的增殖，提示对于以Tim-1为共受体的病毒，Tim-1抗体能够有效的防治其感染。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种具有中和活性的抗人Tim-1抗体
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Ile Lys Arg Arg Thr Asp Gly Gly Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Thr Ser Val Asp Asn Asp Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Arg Arg Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ser Val Asp Asn Asp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtgcagc tggaacagag cggcggcggc gtggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc aacgcgtgga tgacctgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtgggccgc attaaacgcc gcaccgatgg cggcaccacc 180
gattatgcgg cgccggtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgatag caaaaacacc 240
ctgtatctgc agatgaacaa cctgaaaaac gaagataccg cggtgtatta ttgcaccagc 300
gtggataacg atgtggatta ttggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Asp
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ile Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatattgtgc tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccccgggcga accggcgagc 60
attagctgcc gcagcagcca gagcctgctg catagcaacg gctataacta tctggattgg 120
tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt atctgggcag caaccgcgcg 180
agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240
agccgcgtgg aagcggaaga tattggcctg tattattgca tgcaggcgct gcagaccccg 300
ctgacctttg gcggcggcac caaagtggat attaaa 336

Claims (10)

1.一种抗人Tim-1的抗体，其特征在于，包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区；其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、7、8所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的抗体的核苷酸序列，其中，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的核酸分子，或包含权利要求5所述的表达载体。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的抗体。
8.如下任一项所述的应用，其特征在于，包括：
1)权利要求1-3任一项所述的抗体在制备诊断与Tim-1相关的疾病的产品中的应用；
2)权利要求1-3任一项所述的抗体在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
3)权利要求1-3任一项所述的抗体在制备防治病毒感染的药物组合物中的应用；
4)权利要求4所述的核酸分子制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
5)权利要求5所述的表达载体在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
6)权利要求6所述的宿主细胞在制备治疗与Tim-1相关疾病的药物组合物中的应用；
7)权利要求7所述的药物组合物在制备治疗与Tim-1相关的疾病的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，3)中所述的病毒为以Tim-1作为共受体的病毒，优选的，所述病毒为埃博拉病毒、马尔堡病毒、zika病毒、甲型肝炎病毒、艾滋病毒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒为马尔堡病毒、埃博拉病毒。
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