CN102369216A

CN102369216A - 特异性结合vcam-1的人单克隆抗体以及用于治疗炎性疾病或癌症、包含该人单克隆抗体的组合物

Info

Publication number: CN102369216A
Application number: CN2010800147716A
Authority: CN
Inventors: 李廷泰; 文庆德; 尹志容; 成炳济; 李东宪; 李一仙; 李东垠; 柳修娟; 朴荣祐; 崔昭瑛; 朴芝贤; 张明熙
Original assignee: Hanwha Total Petrochemicals Co Ltd
Current assignee: Hanwha TotalEnergies Petrochemical Co Ltd
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2012-03-07
Also published as: US8715670B2; KR20100109394A; BRPI1013649A2; WO2010114312A2; EP2414392A4; EP2414392A2; US20120308574A1; KR101238061B1; JP5438819B2; WO2010114312A3; JP2012522046A

Abstract

本发明涉及特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体，以及用于治疗炎性疾病或癌症、包含该抗体的治疗组合物。根据本发明的人单克隆抗体对在人或小鼠内皮细胞上表达的VCAM-1表现出强亲和力，有效地抑制白细胞粘附到表达VCAM-1的活化内皮细胞上，并表现出低免疫原性，因此可用于治疗癌症或炎性疾病如哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。

Description

特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体以及用于治疗炎性疾病或癌症、包含该人单克隆抗体的组合物

技术领域

本发明涉及特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体，以及用于炎性疾病或癌症、包含该抗体的治疗组合物。更具体地，本发明涉及特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体，该抗体对人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)表现出强特异性和亲和力，有效地抑制白细胞和表达VCAM-1的活化内皮细胞之间的相互作用，并表现出低免疫原性，本发明还涉及用于炎性疾病或癌症、包含该抗体的治疗组合物。

背景技术

在从血流迁移到组织的过程中，包括白细胞在内的免疫细胞通过活化内皮细胞从而诱导免疫反应，许多细胞粘附分子(CAM)如整联蛋白(integrin)、选择蛋白(selectin)、ICAM(细胞内粘附分子)和VCAM(血管细胞粘附分子)参与白细胞粘附到内皮细胞和迁移到组织的过程。细胞粘附分子从功能上可以分为涉及白细胞和内皮细胞之间的相互作用的选择蛋白、参与白细胞粘附到内皮细胞的过程的整联蛋白、免疫球蛋白或类似物质。这些细胞粘附分子在许多生理反应如免疫反应、炎症和血栓形成中发挥着重要的作用。

VCAM-1是血管内皮细胞粘附分子，其与在除嗜中性粒细胞以外的大多数白细胞表面上被表达的整联蛋白(VLA-4)相互作用。VCAM-1在活化内皮细胞上被炎症信号高度诱导，并参与白细胞附着于血管内皮细胞以及随后白细胞经内皮迁移到损伤组织中。

尽管有许多出版物与VCAM-1在炎症和癌症以及VLA-4相互作用中的作用相关，但抗VCAM-1的中和抗体的开发还未积极研究。尽管最近开发出M/K-2.7——抗小鼠VCAM-1的单克隆抗体，且该抗体对胶原诱导的关节炎小鼠模型的关节炎症具有抑制作用，但它仅对小鼠模型有特异性，因而需要进一步测试该抗体在临床应用中的有用性。

进一步地，VCAM-1由7个IgG-样结构域组成，其结构域1和4主要参与和配体——整联蛋白(α4β1或α4β7)的结合(1995，PNAS，92：p5714；1995，The journal ofimmunology，155：p3135等)。所以，为了抑制VCAM-1抗原和其配体之间的相互作用，有效的中和抗体应当对结构域1或4具有强亲和力。在这方面，迫切需要开发出这种用于临床前研究和临床研究的全人单克隆抗体，其表现出小鼠和人VCAM-1之间特异的交叉反应性，有效地抑制VCAM-1抗原和整联蛋白之间的相互作用，并使免疫原性的风险减到最低。

发明内容

技术问题

因此，本发明人已经做了许多努力来开发人单克隆抗体，其对小鼠和人VCAM-1表现出特异的交叉反应性，有效地抑制VCAM-1抗原和整联蛋白之间的相互作用，并使免疫原性的风险减到最低。本发明人已由人抗体文库制备出对人和小鼠VCAM-1具有特异性、含有人源重链和轻链结构域的新型人单克隆抗体，他们发现该抗体结合VCAM-1抗原的结构域1-2或3-4，从而表现出抑制U397前单核白细胞(promonocyticleukocytes)和活化内皮细胞之间的相互作用的强活性，由此完成本发明。

解决问题的方案

本发明的目的在于提供特异性结合人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)从而抑制白细胞与活化内皮细胞之间相互作用的人单克隆抗体，该抗体包含人源重链(V_H)和轻链(V_L)结构域。

本发明的另一目的在于提供用于诊断炎性疾病或癌症的组合物，该组合物包含特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体。

本发明的又一目的在于提供提供有关炎性疾病或癌症的诊断信息的方法，该方法包含检测怀疑患有炎性疾病或癌症的对象生物样本中的VCAM-1和特异性结合VCAM-1的人单克隆抗体之间的抗原-抗体反应的步骤。

本发明的再一目的在于提供用于炎性疾病或癌症的治疗组合物，该组合物使用了抑制VCAM-1介导的白细胞粘附到内皮细胞上的人单克隆抗体。

本发明的再一目的在于提供通过给对象施用根据本发明的治疗组合物来治疗炎性疾病或癌症的方法。

本发明的再一目的在于提供利用根据本发明的单克隆抗体来抑制VCAM-1介导的白细胞粘附到内皮细胞上的方法。

本发明的有利效果

根据本发明的人单克隆抗体对在人或小鼠内皮细胞上被表达的VCAM-1表现出强亲和力，有效地抑制白细胞粘附到表达VCAM-1的活化内皮细胞上，并具有人源重链和轻链结构域从而表现出低免疫原性，因此可用于治疗癌症或炎性疾病如哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。

附图简述

图1示出利用人VCAM-1-D1-D4和小鼠VCAM-1抗原执行的淘选(panning)结果；

图2示出根据本发明的三类人单克隆抗体的可变区的氨基酸序列；

图3是ELISA(酶联免疫吸附测定)的结果，示出抗原特异性抗VCAM-1人单克隆抗体对根据它们的人VCAM-1结构域的抗原的亲和力，其中VD2表示重组人VCAM-1结构域D1-D2/Fc嵌合体，VD4表示重组人VCAM-1结构域D1-D4/Fc嵌合体，VD7表示重组人VCAM-1结构域D1-D7/Fc嵌合体；

图4是抗VCAM-1人单克隆抗体对纯化人重组VCAM-1抗原和人白细胞之间的粘附的抑制活性的分析结果，其中它们的抑制活性是通过与未经抗体处理组相比荧光强度的降低确定的；

图5是抗VCAM-1人单克隆抗体对人白细胞和经TNF-α(肿瘤坏死因子-α)活化的人内皮细胞之间的粘附的抑制活性的分析结果，其中它们的抑制活性是通过与未经抗体处理的组相比荧光强度的降低确定的；

图6是抗VCAM-1人单克隆抗体对RhoA(Ras同源基因家族，成员A)活性的抑制活性的分析结果；

图7是抗VCAM-1人单克隆抗体对ROS(活性氧物质)活性的抑制活性的分析结果；和

图8是在卵白蛋白诱导的哮喘小鼠模型中，抗VCAM-1抗体对炎性细胞浸润到支气管肺泡灌洗液中的抑制活性的分析结果(相比正常组##，p＜0.01；###，p＜0.001；相比哮喘诱导组^*，p＜0.05；^**，p＜0.01)。

实施本发明的最佳方式

为了实现上述目的，本发明的一个方面在于提供特异性结合到人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)从而抑制白细胞和活化内皮细胞之间的相互作用的人单克隆抗体。

如本文使用的“抗体”包括提到的与特定抗原免疫学反应的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和单克隆抗体。该术语也包括基因工程形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠科动物抗体)和异源结合抗体(heteroconjugate antibody)(例如，双特异性抗体)。

术语“抗体”也包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv和rIgG)。该术语也指重组单链Fv片段(scFv)。该术语抗体也包括二价分子或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。二价分子和双特异性分子描述在这些文献中，例如，Kostelny等人(1992，J.Immunol.148：15467)、Pack和Pluckthun(1992，Biochemistry 31：1579)、Hollinger等人(1993，supra)、Gruber等人(1994，J.Immunol.：5368)、Zhu等人(1997，Protein Sci.6：781)、Hu等人(1996，Cancer Res.56：3055)、Adams等人(1993，Cancer Res.53：4026)和McCartney等人(1995，Protein Eng.8：301)。

而且，如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体克隆获得的抗体分子，其对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每个重链和轻链均含有恒定区和可变区(该区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区含有被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区和四个“框架”区。该CDR主要负责结合到抗原的表位上。每个链的CDR通常指从N-末端开始按顺序编号的CDR1、CDR2和CDR3，通常也通过特定CDR位于其中的链鉴定。

如本文使用的术语“人源化抗体”是源于人免疫球蛋白的分子，指构成抗体的所有氨基酸序列，包括互补决定区和框架区，都由人免疫球蛋白组成。人源化抗体用于人治疗一般至少具有三个潜在的优点。首先，它可以与人免疫系统更好地相互作用，例如，从而通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞。其次，人免疫系统不会将该抗体识别为外来的(foreign)。第三，其在人体循环中的半衰期类似于天然存在的人抗体，从而允许较小的给药剂量和较不频繁的给药次数。因此，根据本发明的人单克隆抗体对在人内皮细胞上被表达的VCAM-1表现出强亲和力，并有效地抑制白细胞粘附到表达VCAM-1的活化内皮细胞上。另外，因为它们的重链和轻链结构域都来源于人从而表现出低免疫原性，所以根据本发明的人单克隆抗体可以用于治疗癌症或炎性疾病，如哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。

如本文使用的术语“抑制白细胞和活化内皮细胞之间的相互作用”是指所有这样的机制：本发明的人单克隆抗体特异性结合到在活化内皮细胞上表达的VCAM-1，从而抑制在白细胞上被表达的VLA-4(极迟抗原-4)和α4β1整联蛋白与在内皮细胞上被表达的VCAM-1之间的相互作用，或抑制内皮细胞之间形成间隙。该相互作用的抑制不局限于此，但例如，可以通过抑制白细胞粘附到活化内皮细胞上而进行，或通过降低ROS(活性氧物质)和RhoA(Ras同源基因家族，成员A)的活性抑制内皮细胞之间形成间隙来进行。当免疫细胞如白细胞结合到内皮细胞时，内皮细胞信号转导通路中的细胞内RhoA和ROS被活化从而触发使连结细胞的分子的牢固连接松散的信号转导。随后，内皮细胞之间的间隙扩大从而形成空穴(hole)。免疫细胞通过该空穴，并迁移到发炎部位。但是，本发明抗体降低了内皮细胞信号转导通路中的ROS和RhoA活性，使得内皮细胞之间的间隙形成得到抑制而不形成空穴。结果，阻止了免疫细胞迁移到发炎部位，从而抑制白细胞和活化内皮细胞之间的相互作用。

根据本发明的一个实施方式，发现，本发明的人单克隆抗体4B在0.1μg或更多量时对于白细胞粘附到人VCAM-1抗原表现出80％的抑制率，而本发明的人单克隆抗体7C和7H在10μg量时对于白细胞粘附到人VCAM-1抗原表现出90％或更高的抑制率(图4)。进一步地，发现，本发明的人单克隆抗体4B在0.1～10.0μg量时对于白细胞粘附到人内皮细胞表现出50～60％的抑制率，而本发明的人单克隆抗体7C和7H在10μg量时对于白细胞粘附到人内皮细胞表现出50～60％或更高的抑制率(图5)。该结果表明，本发明抗体有效地抑制了白细胞粘附到活化内皮细胞上。另外，发现，人单克隆抗体4B表现出约80％的RhoA抑制，而人单克隆抗体7H表现出约30％的RhoA抑制(图6)，并且人单克隆抗体4B表现出约65％的ROS抑制，而人单克隆抗体7H表现出约25％的ROS抑制(图7)，表明本发明抗体有效地降低了RhoA和ROS的活性，从而阻止内皮细胞之间的间隙形成。这些结果揭示，这些抗体对白细胞和活化内皮细胞之间相互作用的抑制作用将可用于诊断和治疗与VCAM-1相关的疾病如炎性疾病或癌症。

在优选的实施方式中，本发明的人单克隆抗体可以包括重链可变区，其含有由SEQ ID NO.2限定的重链CDR1、由SEQ ID NO.3限定的重链CDR2和由SEQ IDNO.4限定的重链CDR3；以及轻链可变区，其含有由SEQ ID NO.14限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.15限定的轻链CDR2和由SEQ ID NO.16限定的轻链CDR3。更优选地，本发明的人单克隆抗体可以包括由SEQ ID NO.1限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.13限定的轻链氨基酸序列。根据本发明的一个实施方式，包括由SEQ ID NO.1限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.13限定的轻链氨基酸序列的人单克隆抗体被命名为4B。

根据一个优选的实施方式，人单克隆抗体对人VCAM-1具有亲和力，并且人单克隆抗体与人VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)可以为1×10^-11M至9×10^-9M，该值可以通过利用BIACORE分析测定每个抗体对人VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)获得。根据本发明的一个实施方式，发现人单克隆抗体4B对人VCAM-1抗原具有约1nM的强亲和力(表1)，这揭示本发明抗体对VCAM-1具有强特异性亲和力，因此本发明抗体可以用在需要VCAM-1的抗原识别的任何应用中。

根据一个优选实施方式，本发明的人单克隆抗体可以是特异性结合到小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和人VCAM-1以便抑制白细胞和活化内皮细胞之间相互作用的人单克隆抗体。此种单克隆抗体是有利的，因为它结合到人和小鼠VCAM-1，即，具有交叉反应性，因此可以用在小鼠的临床前研究中。

特异性结合到人和小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的人单克隆抗体可以包括重链可变区，其含有由SEQ ID NO.6限定的重链CDR1、由SEQ ID NO.7限定的重链CDR2和由SEQ ID NO.8限定的重链CDR3；以及轻链可变区，其含有由SEQ IDNO.18限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.19限定的轻链CDR2和由SEQ ID NO.20限定的轻链CDR3。更优选的，本发明的人单克隆抗体可以包括由SEQ ID NO.5限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.17限定的轻链氨基酸序列。根据本发明的一个实施方式，包括由SEQ ID NO.5限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.17限定的轻链氨基酸序列的人单克隆抗体被命名为7C。

进一步地，特异性结合到人和小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)上的人单克隆单体可以包括重链可变区，其含有由SEQ ID NO.10限定的重链CDR1、由SEQID NO.11限定的重链CDR2和由SEQ ID NO.12限定的重链CDR3；以及轻链可变区，其含有由SEQ ID NO.22限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.23限定的轻链CDR2和由SEQ ID NO.24限定的轻链CDR3。更优选的，本发明的人单克隆抗体可以包括由SEQ ID NO.9限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.21限定的轻链氨基酸序列。根据本发明的一个实施方式，包括由SEQ ID NO.9限定的重链氨基酸序列和由SEQID NO.21限定的轻链氨基酸序列的人单克隆抗体被命名为7H。

根据一个优选实施方式，人单克隆抗体对人VCAM-1具有亲和力，并且人单克隆抗体与人和小鼠VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)可以为1×10^-10M至9×10^-8M，该值通过可以利用BIACORE分析测定每个抗体对人VCAM-1的缔合/解离常数(K_D值)获得。根据本发明的一个实施方式，发现人单克隆抗体7C和7H对人和小鼠VCAM-1抗原具有约5～100nM的高亲和力(表1)，这揭示本发明抗体对人和小鼠VCAM-1具有强特异性亲和力，因此本发明抗体可以用在需要VCAM-1的抗原识别的任何应用中。就是说，本发明的人单克隆抗体对人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-1具有强特异性亲和力，从而有效地抑制白细胞粘附到活化内皮细胞上，从而提供了对于VCAM-1相关的疾病如炎性病症或癌症有效的诊断和治疗方法。

在又一个方面，本发明涉及制备特异性结合到人，或者人和小鼠VCAM-1的人单克隆抗体的方法。

本发明的单克隆抗体容易由产生单克隆抗体的众所周知的方法产生。例如，制备单克隆抗体的方法可以通过利用从免疫动物中获取的B白细胞产生杂交瘤而进行(Koeher and Milstein，1976，Nature，256：495)，或利用噬菌体展示方法进行，但不局限于此。

利用噬菌体展示的抗体文库是这样的方法，其利用直接从B淋巴细胞获取的抗体基因在噬菌体表面上表达抗体，而不需要制备杂交瘤。噬菌体展示方法可以克服与通过B细胞永生化产生单克隆抗体关联的许多困难。常规噬菌体展示包含：1)将具有随机序列的寡核苷酸插入到与噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N-末端对应的区域中；2)表达天然外壳蛋白和所述具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白；3)处理可以结合到所述寡核苷酸编码的多肽的受体材料；4)利用低pH或具有结合竞争能力的分子洗脱结合在该受体上的肽-噬菌体颗粒；5)扩增通过淘选在宿主细胞中洗脱下来的噬菌体；6)重复所述步骤以便获得期望量的噬菌体；和7)通过对淘选选择的噬菌体克隆进行DNA测序来测定活性肽的序列。

在优选实施方式中，本发明单克隆抗体的制备方法可以通过噬菌体展示方法进行。本发明所属领域的技术人员参考，例如由Barbas等人(METHODS：ACompanionto Methods in Enzymology 2：119，1991 and J.Virol.2001 Jul；75(14)：6692-9)和Winter等人(Ann.Rev.Immunol.12：433，1994)公开的众所周知的噬菌体展示技术能够容易地进行上述步骤。可用于构建抗体文库的噬菌体可以是丝状噬菌体，例如，fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3，但不局限于此。而且，可用于表达丝状噬菌体表面上的外源基因的载体可以是噬菌体载体如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG，或噬菌粒载体如pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX，但不局限于此。

进一步地，可用于提供重组噬菌体成功再感染所需的天然外壳蛋白的辅助噬菌体可以由M13K07或VSCM13示例，但不局限于此。

根据本发明的一个实施方式，检验通过重组技术获得的VCAM-1的分子量和纯度，然后将其用于制备单克隆抗体。通过噬菌体展示技术获得的对人和小鼠VCAM-1具有特异性的人抗体是人源scFv(单链可变区片段)，并作为单噬菌体克隆被筛选，从而获得22类对人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-1都具有特异性的单克隆噬菌体。如下获得单克隆噬菌体。首先，使VCAM-1与来自具有多样性的人幼稚scFv文库细胞的文库噬菌体反应，接着淘选并筛选强有力地结合到VCAM-1抗原的单克隆(表1和图2)。通过指纹法确认所选的单克隆，接着进行测序从而确认该抗体的VH和VL的CDR区。通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)的Ig BLAST程序研究上述抗体和种系(germ line)抗体组之间的同源性。结果，获得对VCAM-1具有特异性的22类噬菌体抗体。

进一步地，根据本发明的一个实施方式，构建了含有多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码所选22类人抗体噬菌体的重链和轻链或其具有免疫活性的片段。在构建表达载体后，可以对表达调控元件，如启动子、终止子和增强子，以及用于靶向膜或分泌的序列加以适当地选择，并可为了某种目而将其结合使用，这取决于用于产生人抗体的轻链和重链或其片段的宿主细胞。

本发明的表达载体包括质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体、病毒载体或类似载体，但不局限于此。合适的表达载体包括用于靶向膜或分泌的信号序列或前导序列以及表达调控元件，如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子，并可以根据其目的被构建成多种形式。

进一步地，根据本发明的一个实施方式，本发明提供了识别与人抗体结合的人VCAM-1抗原结构域的位置的方法。已报道VCAM-1由7个IgG-样结构域组成，并且它的结构域1和4主要参与和其配体——整联蛋白(α4β1或α4β7)的结合。根据本发明的一个实施方式，表达和纯化人VCAM-1抗原的每个结构域(D1-D2、D1-D4、D1-D7)，然后进行ELISA分析22类抗体的抗原结合区。结果，该抗原结合区根据抗体的类型而变化，并且在它们当中，获得结合到结构域D1-D2的抗体4B和7H，以及结合到结构域D3-D4的抗体7C(图3)。

进一步地，本发明中的VCAM-1介导白细胞和活化内皮细胞之间的相互作用，从而分析了该抗体对人白细胞(U937细胞)和用重组人VCAM-1或人TNF-α刺激的人内皮细胞(HUVEC)之间相互作用的抑制活性。根据本发明的一个实施方式，用各种浓度的抗体处理人VCAM-1固定化固体支持板或HUVEC单层板。为了检验该抗体是否抑制荧光标记的U937细胞和抗原的结合，测量了荧光强度。结果，所有三类抗体都表现出抑制活性。特别地，发现对人VCAM-1抗原表现出最强亲和力的抗体4B即使在低的浓度下也表现出强抑制活性(图4和5)。

因为本发明的单克隆抗体对在多种细胞类型如人或小鼠细胞中表达的VCAM-1具有强亲和力，所以它可以用于使用对VCAM-1抗原识别的任何应用中。此外，该单克隆抗体强有力地抑制白细胞结合到活化内皮细胞。所以，本发明提供了诊断和治疗与VCAM-1相关的疾病如炎性疾病或类似疾病的有效方法。

因此，可以将特异性结合到人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-1的本发明人单克隆抗体单独使用，或者将其以药物组合物形式，与药学上可接受的载体一起用于诊断和治疗与VCAM-1相关的疾病。

而且，本发明单克隆抗体也可以与其它抗体、生物活性剂或材料组合用于各种目的。例如，本发明单克隆抗体可以与4B9或其它抗-VCAM-1抗体组合用于治疗以内皮中的VCAM-1表达为特征的病症。或者，本发明单克隆抗体可以与识别在炎症事件中鉴定的其它内皮细胞受体(例如，ELAM1、ICAM1等)的抗体，以及用于炎性疾病的已知治疗药物组合使用。

在再一方面，本发明提供了用于诊断炎性疾病或癌症的组合物，该组合物包含人单克隆抗体。

就是说，包含特异性结合到人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-1的单克隆抗体的诊断组合物可以用于诊断与VCAM-1表达相关的疾病或VCAM-1介导的疾病，例如，炎性疾病或癌症。

如本文使用的，术语“炎性疾病”可以包括，但不局限于与VCAM-1相关的炎性疾病，例如，哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞或移植排斥。

用于诊断炎性疾病或癌症的本发明组合物可以进一步包括药学上可接受的载体，并可以与该载体一起被配制。如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”是指不对活性成分的生物活性和特性造成损害的载体或稀释剂。对于液体制剂，应当对该药学上可接受的载体进行灭菌，使其适合于生物体。例如，该药学上可接受的载体可以包括盐水、无菌水、林格液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇，或以上成分中的一种或多种的混合物。必要时，可以添加其它常见的添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂或类似物。而且，可以进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂以便将该组合物配制成注射制剂，如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。

在再一方面，本发明提供了提供有关炎性疾病或癌症的诊断信息的方法，该方法包含检测怀疑患有炎性疾病或癌症的对象生物样本中的VCAM-1和人单克隆抗体之间的抗原-抗体反应的步骤。就是说，可以通过使本发明重组人单克隆抗体与生物样本反应并检测抗原-抗体复合物的形成来检测VCAM-1。结果，可以提供有关炎性疾病或癌症的诊断信息。

如本文使用的，术语“对象”包括，但不限于马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟类，并指任何动物(如人)。

如本文使用的，术语“生物样本”可以是组织、细胞、全血、血清、血浆液、组织(脑、皮肤、淋巴结、脊髓)的剖解样本、细胞培养上清液、破坏性真核细胞和细菌表达系统，但不局限于此。VCAM-1、炎性疾病或癌症的存在可以通过使经处理或未经处理的生物样本与本发明单克隆抗体反应进行检测。

如本文使用的，术语“抗原-抗体复合物”是指样本中的VCAM-1抗原和本发明单克隆抗体的组合物质。此种抗原-抗体复合物的形成可以通过选自比色法、电化学法、荧光法、发光测定法、颗粒计数法、视觉评估和闪烁计数法的方法检测。然而，该方法不局限于上述实例而且有多种应用。

可利用各种标记检测本发明中的抗原-抗体复合物。其具体实例可以选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒颗和放射性同位素，但不局限于此。

用作标记的材料的合适的实例包括作为酶的乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和β-内酰胺酶；作为荧光剂的荧光素、Eu³⁺、Eu³⁺螯合物和穴状化合物；作为配体的生物素衍生物；作为发光物质的吖啶酯(acridiniumester)、异鲁米诺衍生物；作为微颗粒的胶体金、彩色乳胶；和作为放射性同位素的⁵⁷Co、³H、¹²⁵I、¹²⁵I-Bonton Hunter试剂。

优选地，抗原-抗体复合物可以通过利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。ELISA技术包括直接ELISA，其利用识别粘附到支撑体的抗原的标记抗体；间接ELISA，其利用标记二抗，该二抗识别所捕获的其中抗原粘附到支撑体上的抗原-抗体复合物的抗体；直接夹心ELISA，其利用识别粘附到支撑体上的抗原-抗体复合物的抗原的另一标记抗体；间接夹心ELISA，其利用另一标记二抗，该二抗在与识别粘附到支撑体上的抗原-抗体复合物的抗原的抗体反应后识别抗体。该单克隆抗体可以具有可检测标记，另外该抗原-抗体复合物可以通过处理可捕获本发明单克隆抗体并具有可检测标记的另一抗体进行检测。

在再一个实施例中，本发明提供了用于炎性疾病或癌症、包含人单克隆抗体的治疗组合物，和治疗炎性疾病或癌症的方法，该方法包含给对象施用该治疗组合物的步骤。

用于炎性疾病或癌症的本发明治疗组合物可以进一步包括药学上可接受的载体，并可以与该载体一起被配制。有用的载体与以上描述的相同。

在这方面，炎性疾病可以选自哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥，但不局限于此。

根据本发明的一个实施方式，对小鼠哮喘进行了效力试验，以便证实根据本发明的人单克隆抗体是否具有体内抗炎作用。在用抗VCAM-1人抗体处理后，炎性细胞，特别是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的总数目显著减少。也就是说，发现该抗体对哮喘中炎性细胞流入的抑制作用与当前用于治疗哮喘的氨茶碱的抑制作用相似(图8)。

包含人单克隆抗体的本发明治疗组合物可以药学有效量的单剂量或多剂量形式施用。在这方面，该组合物可以以溶液、粉末、气雾剂、胶囊、肠溶片或胶囊或栓剂形式施用。考虑了各种施用方式，包括腹膜内施用、静脉内施用、肌肉施用、皮下施用、皮内施用、经口施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠内施用，但本发明不局限于这些示例的施用方式。然而，因为肽在口服施用后被消化，所以应当对用于经口施用的组合物活性成分进行包衣或配制以便阻止它们在胃中降解。另外，该药物组合物可以利用能够将该活性成分运送到靶细胞的某些器具施用。

包含单克隆抗体的本发明组合物可以药学有效量施用。该“药学有效量”是指足够以适用于医学治疗或预防的合理利益/风险比预防或治疗疾病的量。该有效剂量的水平可以根据以下因素确定：疾病的严重性，药物活性，患者的年龄、体重、健康和性别，患者的药物过敏性，施用时间、途径和释放率，治疗持续时间，或者包括与本发明组合物混合在一起或与本发明组合物同时使用的药物在内的元素，或者医学领域中众所周知的其它元素。另外，包含单克隆抗体的本发明组合物可以单独施用或与其它治疗剂组合施用，或者也可以与常规治疗剂相继施用或同时施用。

在施用药学有效量的本发明药物组合物的情况下，对VCAM-1具有强亲和力的本发明单克隆抗体特异性结合到在内皮细胞上表达的VCAM-1并使得VCAM-1中和。最终，本发明单克隆抗体抑制白细胞粘附到内皮细胞上，从而治疗VCAM-1介导的疾病。优选地，VCAM-1介导的疾病是炎性疾病或癌症，更优选地，该炎性疾病是关节炎、鼻炎、多发性硬化症、肠道疾病、哮喘、动脉硬化、心肌梗塞或移植排斥。

在再一方面，本发明提供了利用根据本发明的人单克隆抗体抑制VCAM-1介导的白细胞粘附到内皮细胞的方法。也就是说，VCAM-1结合到在炎症和免疫排斥反应中的活化白细胞上表达的VLA-4(极迟抗原-4)和α4β1整联蛋白，并在促进内皮细胞和包括单核细胞和T细胞在内的白细胞之间的相互作用方面发挥着关键的作用。根据本发明的单克隆抗体特异性结合VCAM-1，从而抑制白细胞粘附到内皮细胞上。

【实施本发明的方式】

下文，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，下列实施例仅为说明本发明的目的而提供，因此本发明不意欲局限于此。

实例1：人和小鼠VCAM-1抗原的制备

<1-1>人VCAM-1的克隆

含有人VCAM-1基因(hMU012650)(Kugi#IRAU-75-G02)的质粒购自韩国生命科学与生物技术研究所(KRIBB)，人类基因组功能分析中心提供的KUGI(Korean UniGene Information)。该质粒用作模板DNA，为了仅表达VCAM-1的D1-D2结构域和D1-D4结构域，对于VCAM-1的D1-D2结构域，利用正向引物(5′-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCCC-3′，SEQ ID NO.25)和反向引物(5′-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAGCCTG-3′，SEQ ID NO.26)对每个基因进行扩增，而对于VCAM-1的D1-D4结构域，利用正向引物(5′-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCCC-3′，SEQ ID NO.27)和反向引物(5′-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3′，SEQ ID NO.28)对每个基因进行扩增。在用sfiI处理后，利用连接酶分别将基因克隆到pYK602-Fc载体和pYK602-His唯一载体(由KRIBB构建的载体)中。在下面的PCR条件下获得PCR产物：对于50μl的总反应体积，使100ng模板在94℃下反应2分钟，然后在94℃下反应30秒，在55℃下反应30秒，并在72℃下反应1分钟30秒(D1-D4)和45秒(D1-D2)，持续30个循环，然后在72℃下反应10分钟。而且，检验了所克隆的pYK602-FC-VCAM-1-D1-D2、pYK602-His-VCAM-1-D1-D2、pYK602-FC-VCAM-1-D1-D4和pYK602-His-VCAM-1-D1-D4载体的碱基序列。

<1-2>VCAM-1蛋白质的表达和纯化

为了从对hVCAM-1具有强亲和力的抗体中选取对mVCAM-1具有交叉反应性的抗体，制备了若干种蛋白质。在它们当中，含有整个分子的hVCAM-Fc-嵌合体(R&D系统，cat#：862-VC)和mVCAM-1-Fc嵌合体(R&D系统，Cat#：643-VM)是商购获得的，含有每个VCAM-1结构域的片段的表达和纯化如下执行。

首先，将5×10⁶个293E细胞铺于10个直径为150mm的培养皿中，次日用PEI(23966：美国Polysciences公司)处理20μg克隆的pYK602-VCAM-1-D1-D2载体和20μg pYK602-VCAM-1-D1-D4载体的每一个以便进行转染。次日，用不含血清的DMEM替换该培养基，然后每隔一天收集上清液，接着在10％SDS-PAGE凝胶中电泳并进行蛋白质印迹以便分析表达水平。

收集其中hVCAM-1-D1-D2-Fc和hVCAM-1-D1-D4-Fc的表达被证实的上清液，并利用0.22μm Top过滤器(Millipore，Cat#：SCGP T05RE)过滤从而获得足够量的蛋白质。在使用之前如下纯化该蛋白质。首先，用PBS洗涤Econo柱(Bio-RadCat.No 737-1006，1×5cm)，然后装填500μl蛋白质A(Amersham Cat.No.17-1279-30)。在装填期间，将10ml PBS(pH 7.4)施加到该柱子从而洗涤小珠(bead)，并施加30ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)作为结合缓冲液。随后，利用蠕动泵(Bio-RadCat.No.731-8142)，以0.5ml/min的流速向其中施加所获得的上清液。在结合到该柱之后，用PBS以2ml/min的流速对它进行洗涤，持续1小时，然后进行洗脱。利用500μl 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.5)洗脱，并添加1/10体积的1M Tris-HCl(pH 9.0)用于中和。在6个洗脱馏分当中，该蛋白质主要洗脱在#1和#2馏分中。将这两个馏分放在10K透析膜中，接着在4L PBS中进行o/n透析。上面所有过程都是在4℃的冷藏室内进行的。在量化之后，将该产物等分并储存在-70℃下。纯化之后，在10％SDS-PAGE凝胶上证实该产物。分别获得2.8mg和800μg量的hVCAM-1-D1-D2-Fc和hVCAM-1-D1-D4-Fc。收集其中hVCAM-1-D1-D2-his和hVCAM-1-D1-D4-his的表达被证实的上清液，利用0.22μm Top过滤器(Millipore，Cat#：SCGP T05RE)过滤，并利用LabScale TFF系统(Millipore，Cat#：XX42LSS11)的pellicon XL膜(Millipore，8K，cat#：PXB0 08A 50)浓缩至1/10的体积。将10倍体积的IMAC缓冲溶液(300mMKCl、50mM KH₂PO₄、5mM咪唑、pH 8.0)添加到浓缩物中，并用IMAC缓冲溶液替换。利用Profinia^TM蛋白质纯化系统(Bio-Rad)的Bio-Scle Mini profinity IMACcartridge(cat#：732-4610)，根据制造商的说明书以1ml/min的速度纯化。在4℃下利用膜(10K，132574：SPECTRAPOR，USA)在4L PBS溶液中对洗脱液进行透析，持续4小时或更长时间，然后在4L预先冷却的PBS溶液中再次透析过夜。在o/n透析之后，将所得物转移到e-管中，并通过Bradford法测定蛋白质浓度。结果，获得400μghVCAM-1-D1-D4-his蛋白质，在10％SDS-PAGE凝胶中对其进行检验。

实例2：文库噬菌体的构建

在37℃下将具有多样性的2.7×10¹⁰个人scFv(单链可变区片段)文库细胞在含有17g 2×YTCM[Tryptone(CONDA，1612.00)、10g酵母提取物(CONDA，1702.00)、5gNaCl(sigma，S7653-5kg)、34μg/ml氯霉素(sigma，C0857))]、2％葡萄糖(sigma，G5400)和5mM MgCl₂(sigma，M2393)的培养基(3L)中培养2-3小时(OD₆₀₀＝0.5～0.7)。此后，用辅助噬菌体感染该细胞，接着在30℃下将该细胞在含有2×YTCMK[2×YT CM、卡那霉素(sigma，K1876)70μg/ml、1mM IPTG(ELPISBIO，IPTG025)]的培养基中培养16小时。然后将该细胞离心(4500rpm，15min，4℃)，得到上清液，将该上清液溶解在添加有4％PEG(Fluka 81253)6000和3％NaCl(SigmaS7653)的溶液中，接着在冰上反应1小时。再次离心该反应物(8000rpm，20min，4℃)。将沉淀物溶解在PBS中，然后再次离心(12000rpm，10min，4℃)。结果，获得含有文库噬菌体的上清液，将其转移到新管中并储存在4℃下。

实例3：通过噬菌体展示进行淘选

当由7个IgG-样结构域组成的VCAM-1与其配体——alpha4beta1整联蛋白(α4β1整联蛋白)结合时，已知它的结构域1和4充当结合基序(binding motif)。因而，利用人VCAM-1-D1-D4(hVCAM-1-D1-D4)以及整个VCAM-1分子进行淘选。在这个实施例中，将描述针对hVCAM-1-D1-D4的淘选方法和结果。

<3-1>在hVCAM-1-D1-D4上的淘选

在4℃下，利用旋转机，使用4ml包被缓冲液[包被缓冲液：1.59gNa₂CO₃(sigma，S7795)、2.93g NaHCO₃(sigma，S8875)、0.2g NaN₃(sigma，S2002)]，用30μghVACM1-D1-D-His抗原包被免疫吸收管(Nunc 470319)。然后，在室温下将该抗原溶解在PBS中2小时，接着在免疫管中用脱脂乳[(BD，232100)-4％，1×PBS中的]进行封闭(block)。将2ml制备的文库噬菌体添加到免疫管中，接着在室温下反应2小时。免疫管用PBST(0.05％)洗涤5次，用PBS洗涤2次。洗涤后，利用100mMTEA(Sigma T-0886)洗脱抗原特异性scFV-噬菌体。用洗脱的噬菌体转染大肠杆菌(XL1-Blue，stratagene，200249)，接着进行扩增。在第1轮淘选时扩增的噬菌体用PBST洗涤13次，用PBS洗涤23次，接着按照与以上描述的相同的方式——除了洗涤次数增加以外——进行第2-3轮淘选。为了利用第3轮多克隆噬菌体抗体的噬菌体抗体筛选对小鼠VCAM-1具有交叉反应性的抗体，利用mVCAM-1-His作为抗原进行第四轮淘选。结果，结合到mVCAM-1-His上的噬菌体抗体数目没有增加。然而，因为利用mVCAM-1-His抗原对对hVCAM-1-D1-4具有结合能力的噬菌体抗体进行了第4轮淘选，由此可知，所得噬菌体抗体具有交叉反应性。进一步地，对来自第4轮淘选的噬菌体抗体进行第5轮淘选。结果，对抗mVCAM-1-His抗原的噬菌体的菌落滴度增加至少10倍(表1和图1)。

【表1】

通过hVCAM-1-D1-4抗原和mVCAM-1-His抗原淘选的结果

<3-2>在hVCAM-1-D1-D4和mVCAM-1上淘选的结果

将从第1至5轮淘选获得并冰冻保存的细胞贮存液溶解在含有5ml 2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl₂的培养基中至OD₆₀₀＝0.1。此后，在37℃下将该细胞培养2-3小时(OD₆₀₀＝0.5～0.7)，用M1辅助噬菌体感染该细胞。然后，在30℃下将该细胞在含有2×YTCMK、5mM MgCl₂和1mM IPTG的培养基中培养16小时。将所培养的细胞离心(4500rpm，15min，4℃)，并将上清液转移到新管中(第1至3轮淘选多聚scFv-噬菌体)。在4℃下，利用包被缓冲液，用VCAM-1抗原(100ng/孔)包被96-孔免疫板(NUNC 439454)16小时，接着利用溶解在PBS(4％)中的脱脂乳进行封闭。每个孔用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤。将100μl第1至3轮淘选多scFV-噬菌体添加到每个孔中，接着在室温下反应2小时。每个孔用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤4次。以1∶2000稀释二抗——抗M13-HRP(Amersham 27-9421-01)，接着在室温下反应1小时。用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤后，将OPD片剂(Sigma8787-TAB)添加到PC缓冲液[C₆H₈O₇H₂O(sigma，C0706)5.1g、Na₂HPO₄(sigma，S7907)7.3g]中从而制备底物溶液，以100μl/孔将该底物溶液添加到每个孔中，接着显色10分钟。利用分光光度计(MolecularDevice，USA)测量OD₄₉₀。经由多聚噬菌体ELISA，发现来自第4轮淘选的噬菌体抗体中对hVCAM-1-D1-4的结合能力达到饱和，并发现来自第5轮淘选的噬菌体抗体中对mVCAM-1的结合能力达到饱和。相比对照组，它们还表现出交叉反应性，对hVCAM-1-D1-4和mVCAM-1-His具有强亲和力(图1)。

<3-3>单克隆抗体的筛选

在37℃下将从多克隆抗体(在利用整个hVCAM-1抗原的第3轮淘选和利用hVCAM-1-D1-D4抗原的第4-5轮淘选)获得的具有强结合能力的菌落，在含有添加有2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl₂的培养基的96深孔板(Bioneer，90030)——1ml/孔——中培养16小时。培养该细胞直至OD₆₀₀达到0.1。将100-200μl培养溶液接种在添加有2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl₂的培养基中，将其装在96深孔板中，接着在37℃下培养2-3小时直至OD₆₀₀达到0.5-0.7。用M1辅助噬菌体(MOI＝1∶20)感染该细胞，并在30℃下将受感染细胞在添加有2×YTCMK、5mM MgCl₂和1mMIPTG的培养基中培养16小时。将培养的细胞离心(4500rpm，15min，4℃)，获取上清液，向该上清液中加入4％PEG 6000和3％NaCl。溶解完成后，在冰上诱导反应1小时。将该反应物离心(8000rpm，20min，4℃)并将沉淀物溶解在PBS中。再次离心(12000rpm，10min，4℃)，获取上清液，从该上清液中获得淘选的单克隆scFv噬菌体。将该噬菌体转移到新管中并储存在4℃下。

随后，在4℃下用hVCAM-1-Fc嵌合体(R&D系统)(100ng/孔)包被96-孔免疫板16小时，接着利用溶解在PBS(4％)中的脱脂乳进行封闭。该96孔免疫板的每个孔均用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤。将100μl第3轮淘选的单克隆scFV-噬菌体(各100scFv-噬菌体)添加到每个孔中，接着在室温下反应2小时。每个孔用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤4次。以1∶2000稀释二抗——抗M13-HRP，接着在室温下反应1小时。随后，该板用0.2ml PBS-吐温20(0.05％)洗涤，接着进行显色。测量OD₄₉₀。

结果，将68个单克隆对各种VCAM-1抗原的结合能力进行比较，并通过指纹法和序列分析证实它们的类型。最终，选取22种不同类型的噬菌体抗体。

实例4：全IgG形式的克隆

为了将来自噬菌体、对抗hVCAM-1的单克隆噬菌体抗体转化成全IgG载体，利用1μl单克隆DNA和10pmole/μl重链正向引物和重链反向引物、5μl 10×缓冲液、1μl 10mM dNTP混合物、0.5μl pfu DNA聚合酶(Solgent，co.，2.5U/μl)和蒸馏水进行菌落PCR(iCycler iQ，BIO-RAD)从而获得重链，其中对于4B PCR，利用重链正向引物(TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGCAGTC，SEQ ID NO.29)和重链反向引物(GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA，SEQ IDNO.30)，对于7C PCR，利用重链正向引物(TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC，SEQ ID NO.31)和重链反向引物(SEQ ID NO.30)，对于7H PCR，利用重链正向引物(SEQ ID NO.29)和重链反向引物(SEQ ID NO.30)。还按照相同的方式，利用轻链正向引物和轻链反向引物进行菌落PCR从而获得轻链，其中对于4B PCR，利用轻链正向引物(TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCC，SEQ ID NO.32)和轻链反向引物(GAGGAGAGATCTTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC，SEQ ID NO.33)，对于7CPCR，利用轻链正向引物(TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCCTGTGCTGACTCAATC，SEQ ID NO.34)和轻链反向引物(GAGGAGAGATCTTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC，SEQ ID NO.35)，而对于7HPCR，利用轻链正向引物(TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCC，SEQ ID NO.36)和轻链反向引物(GAGGAGAGATCTTTTGATCTCCACTTTGGT，SEQ ID NO.37)。PCR在下面的条件下进行：在94℃下1分钟，在55℃下1分钟，并在72℃下1分钟，持续30个循环。

利用DNA-凝胶洗脱试剂盒(Qiagen，ND)洗脱从PCR获得的重链DNA，并将其与1μl pNATAB H载体(10ng)、15μl重链(100～200ng)、2μl 10×缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水混合，并将其放置在室温下1～2小时以便与载体连接。将感受态细胞(XL1-蓝色)添加到其中，并放在冰上30分钟，接着在42℃下热击90秒进行转化。再次将混合物放置在冰上5分钟，并将1ml LB培养基添加到其中。37℃下温育1小时后，将该细胞分散在LB Amp固体培养基上，接着在37℃下温育16小时。将所获得的单菌落接种在5ml LB Amp液体培养基中，接着在37℃下温育16小时。利用DNA-制备试剂盒(Nuclogen)从该培养基中提取DNA。也按照与以上相同的方式，利用pNATAB L载体提取轻链DNA。利用CMV-proF引物(AAA TGG GCGGTA GGC GTG，SEQ ID NO.38)(Solgent，Korea)对所获得的NDA进行测序分析。结果，证实由22个对抗VCAM-1的克隆转化的全IgG的重链和轻链序列与噬菌体抗体的序列相同。

实例5：抗体的瞬时基因表达

进行来自克隆的全IgG重链DNA和轻链DNA的抗体基因的瞬时基因表达。

CHO(中国仓鼠卵巢)-S用作用于瞬时基因表达的宿主细胞，从而在含有lipofectamine 2000(Cat no.11668-019，Invitrogen)和DNA(1∶1)的Opti-MEMI(GIBCO31985，Invitrogen)混合溶液中诱导转染。为了使瞬时表达最大化，使用1∶1比例的重链DNA和轻链DNA。RPMI 1640培养基(GIBCO 22400，Invitrogen)用于转染，所用细胞的浓度为2×10⁶个细胞/ml。该混合溶液反应20分钟后，将其与转染培养基以1∶9的比例混合，接着在5％CO₂37℃的震荡温育器中以110rpm温育4小时。随后，将含有8mM谷酰胺(GIBCO 25030，L-谷酰胺200mM，100×，Invitrogen)和HTS(GIBCO，HT补充物，Cat no.11067-030，Invitrogen)的CH-CHO培养基(GIBCO 10743，Invitrogen)添加到其中，所添加的体积与转染培养基的体积相等。将烧瓶在8％CO₂37℃震荡温育器中以100rpm温育4天。将培养的样品在8,000g下离心15分钟从而除去细胞碎片，并利用0.22μm过滤器(Corning)过滤上清液从而制备用于分离和纯化抗体的培养溶液。

实例6：抗体的分离和纯化

使实施例中5制备的上清液通过利用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，100mM NaCl)平衡的重组蛋白-A琼脂糖凝胶柱(Hitrap rProteinA FF，5mL，GEhealthcare)。将结合到柱上的抗体用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)、100mM NaCl溶液洗脱，并用1M Tris-HCl(pH 9.0)中和，接着在PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，Welgene)缓冲液中透析。在还原条件下，将所纯化抗体在Bis-Tris 4-12％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE凝胶，Invitrogen)上电泳。结果，检测到约55kDa的重链和约25kDa的轻链。

抗体对抗原的亲和力的分析

<7-1>对抗原结构域的亲和力

将实施例6中分离和纯化的抗体分别命名为4B、7C和7H。经证实它们分别含有SEQ ID NO.1限定的重链和SEQ ID NO.13限定的轻链(4B)、SEQ ID NO.5限定的重链和SEQ ID NO.17限定的轻链(7C)、以及SEQ ID NO.9限定的重链和SEQ ID NO.21限定的轻链(7H)。所分离的抗体对抗原的亲和力分析如下。

通过ELISA鉴定抗VCAM-1抗体结合区在由7个结构域组成的VCAM-1中的位置。微板的每个孔均用2g/ml浓度的重组人VCAM-1结构域1～2/Fc嵌合体(下文称为′VD2′，A&R疗法)、VCAM-1结构域1～4/Fc嵌合体(下文称为′VD4′，A&R疗法)，和VCAM-1结构域1～7/Fc嵌合体(下文称为′VD7′，R&D，862-VC)在4℃下包被过夜。该板用PBS洗涤一次，在37℃下利用添加有3％BSA(牛血清白蛋白)的PBS进行封闭2小时，接着在37℃下在含有抗体(1∶50)的细胞培养基中温育2小时。该板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤4次，通过抗-Fab单克隆抗体辣根过氧化物酶结合的抗-F(ab′)2抗体检测结合到重组人VCAM-1抗原上的抗VCAM-1抗体量。使该板与TMB底物溶液(3，3，5，5-四甲基联苯胺)在室温下反应约5分钟，并通过1N(当量)硫酸溶液终止反应从而测量在450nm处的光密度。

如图3所示，发现4B和7H对仅具有VCAM-1结构域中的1至2结构域的VD2有强的结合能力，而7C对VD2有很小的结合能力而对VD4和VD7有结合能力。也就是说，在VCAM-1的7个结构域当中，4B和7H结合到结构域1～2，而7C结合到结构域3～4中。

<7-2>通过BIACORE的亲和力分析

为了测定抗VCAM-1抗体4B、7C和7H对人和小鼠VCAM-1抗原的结合亲和力，将每个抗原作为配体固定到传感器芯片(传感器芯片CM5，BIACORE，BR-1003-99)上，然后利用BIACORE将人抗体的每种稀释液施加到固定的配体上从而诱导抗原和抗体之间的缔合和解离，从而测定缔合/解离常数KD值，该值指示相应抗原和抗体之间的结合相互作用。结果在图1中示出(参考文献：Thomas Hofer，WisitTangkeangsirisin，Michael G.Kennedy，Rose G.Mage，Stephen J.Raiker，KarthikVenkatesh，Hakjoo Lee，Roman J.Giger，Christoph Rader Chimeric rabbit/human Fab andIgG specific for members of the Nogo-66 receptor family selected for speciescross-reactivity with an improved phage display vector Journal of Immunological Methods318(2007)75.87；Paula Gomes a，David Andreu Direct kinetic assay of interactionsbetween small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonancebiosensor Journal of Immunological Methods 259，2002.217-230，和Kikuchi Y，Uno S，Nanami M，Yoshimura Y，Iida S，Fukushima N，Tsuchiya M.Determination ofconcentration and binding affinity of antibody fragments by use of surface plasmonresonance.Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.100，No.3，311-317，2005)。

BIACORE分析包含三个步骤：1)预浓缩(Pre-concentration)，其测定传感器芯片和配体之间的偶联条件；2)将配体固定到传感器芯片上；和3)将分析物结合到固定的配体上。

1)预浓缩

在这个实验中，使用常规BIACORE传感器芯片CM5(BIACORE，BR-1003-99)，在将配体固定在芯片上之前，通过用作偶联缓冲液的乙酸钠的pH 4.0～5.5的变化测定配体对传感器表面的静电引力。

2)配体固定

为了使配体固定到传感器芯片CM5上，首先应当用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-n′-(二甲基氨丙基)(EDC)(胺偶联试剂盒，BR-1000-50)的混合物活化该芯片从而制备对氨基有高度反应性的NHS-酯-活化的芯片表面。将1mg/ml待固化配体以3/100的稀释比稀释在97μl的每种醋酸钠溶液(在4.0到5.5的pH范围内变化)中，然后以10μl/min的流速施加该溶液约3分钟(作为阴性对照，利用运行缓冲液、HBS-EP缓冲液(BIACOREAB，Sweden)以相同的方式稀释该配体)。为了以预定值目标RU(共振单位)固定该配体，自动进行一系列注射直至达到目标RU。通过以10μl/min的流速注射1M乙醇胺(胺偶联试剂盒，BR-1000-50)约3分钟来使该配体固定的芯片灭活。最终的RU通过固定报告确定，该固定报告提供了在注射乙醇胺之前和之后RU值的差异。

3)将分析物结合到固定的配体上

在这个实验中采用由BIACORE仪器提供的流动池(flow cell)2-流动池1模式以便除去非特异性结合。在这时，将重组VCAM1/Fc抗原作为配体固定到流动池2上，并将BSA(牛血清白蛋白)固定到流动池1上。然后，同时将抗VCAM-1抗体4B、7C和7H中的每个作为分析物施加到流动池1和2中。流动池1的传感图(sensogram)RU自动从流动池2的传感器图RU中扣除。随后，以30μl/min的流速施加分析物约3分钟，然后诱导解离120秒。通过这个程序，获得相应抗原和抗体的缔合/解离曲线，并通过BIAevaluation程序(BIACORE AB，Sweden)计算出缔合/解离常数KD，如下表2所示。

【表2】

	人VCAM-1抗原	小鼠VCAM-1抗原
			抗体	K_D(nM)	K_D(nM)
4B	0.5	-
			7C	38.8	36.9
7H	5.44	10.7

上表2示出人和小鼠VCAM-1抗原特异性抗VCAM-1人单克隆抗体对抗原的结合能力或亲和力，并且利用蛋白质亲和力分析仪BIACORE(BIACORE AB，Sweden)分析了对于生物学上不同的物种、人和小鼠抗原的物种特异性抗原-抗体亲和力。以1∶1结合模式计算相应抗原-抗体的亲和常数K_D值。

结果，发现所有4B、7C和7H都对人抗原具有优异的结合能力，并且在它们当中，发现抗体4B具有优异的结合能力，约为1nM。另外，发现除了4B，抗体7C和7H对小鼠抗原具有约为10～100nM的结合能力。

实施例8：抗体对白细胞粘附的抑制作用

<8-1>对人VCAM-1抗原和白细胞之间粘附的抑制作用

将96孔板(Maxisorp，Nunc)的每个孔用100μl重组人VCAM-1(10μg/ml，Cat.No.：809-VR-200，R&D系统)包被1小时，然后将0.01、0.1、1.0和10.0μg量的人抗体4B、7C和7H添加到VCAM-1包被的孔中，进行抗原结合1小时。此时，1.0和10.0μg 4B2小鼠抗人VCAM-1单克隆抗体(Cat.No.：BBA5，R&D)用作阳性对照，和用作阴性对照，仅在无抗体的情况下处理该抗原。当抗体结合到抗原上时，利用5μM BCECF-AM(Cat.No.：216254，Calbiochem)对人白细胞U937(Cat.No.：CRL-1593.2，ATCC)进行荧光染色。接着，用100％人血清(Cat.No.：H4522，Sigma)处理U937细胞从而使细胞表面上的Fc受体灭活。将经荧光染色和Fc受体灭活处理的白细胞悬浮在添加有1％胎牛血清的RPMI 1640(Cat.No.：22400-089，Invitrogen)中至1.0×10⁶个细胞/ml。将100μl制备的U937细胞施加到经抗原和抗体处理的板的每个孔中，利用铝箔阻挡光。将该板在37℃5％CO₂温育器中温育15分钟，然后在每个孔中填充添加有1％胎牛血清的RPMI 1640，并用密封带紧密密封。将该板倒置放置，并在200×g力下离心5分钟。从该倒置的离心板中除去密封带。完全除去培养基和未结合的U937细胞，将150μl细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.5)，0.1％SDS)添加到每个孔中从而使结合的U937细胞裂解15分钟。随后，将该板放置在荧光计(GeminiX，Molecular Device)中，并在485nm的吸收波长/530nm的发射波长下测量荧光强度。计算三组测量值(每个实验条件)的平均值，计算荧光强度相比未经抗体处理组的荧光强度的减少量从而分析抑制率。结果，4B在0.1μg或更多量时表现出80％的抑制率。7C和7H在较低量(0.01～1.0μg)时表现出弱的抑制作用，但在10μg量时表现出90％的抑制率(图4)。

<8-2>对人内皮细胞和白细胞之间粘附的抑制作用

将2×10⁴个人内皮细胞HUVEC铺于96孔板(微量试验组织培养96-孔板，BD-Falcon)的每个孔上，根据制造商说明书在EGM-2培养基(Lonza)中培养约3天。当在显微镜下观察到细胞单层时，用20ng/ml人TNF-α刺激该细胞24小时。此后，为了除去TNF-α，用200μl EGM-2培养基洗涤每个孔两次，并将人抗体4B、7C和7H分别以0.01、0.1、1.0和10.0μg的量添加到铺于孔中的HUVEC单层上。将该板温育1小时从而诱导抗原-抗体结合。在这时，1.0和10.0μg 4B2小鼠抗人VCAM-1单克隆抗体(Cat.No.：BBA5，R&D)和小鼠抗-α4整联蛋白抗体用作阳性对照，和用作阴性对照，仅在无抗体的情况下处理该抗原。当抗体结合到抗原上时，利用5μMBCECF-AM(Cat.No.：216254，Calbiochem)对人白细胞U937(Cat.No.：CRL-1593.2，ATCC)进行荧光染色。接着，用100％人血清(Cat.No.：H4522，Sigma)处理U937细胞从而使该细胞表面上的Fc受体灭活。将经荧光染色和Fc受体灭活处理的U937细胞悬浮在添加有1％胎牛血清的RPMI 1640(Cat.No.：22400-089，Invitrogen)中至1.0×10⁶个细胞/ml。将100μl制备的U937细胞施加到经抗体处理的HUVEC的每个孔中，利用铝箔阻挡光。将该板在37℃5％CO₂温育器中温育10分钟，并倒置放置从而除去培养基和未结合的细胞。在每个孔中填充添加有1％胎牛血清的RPMI 1640，并用密封带紧密密封。将该倒置的板在400×g力下离心5分钟。从该倒置的离心板中除去密封带。完全除去培养基和未结合的U937细胞，并将150μl细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.5)，0.1％SDS)添加到每个孔中从而使结合的U937细胞裂解15分钟。随后，将该板放置在荧光计(GeminiX，Molecular Device)中，并在485nm的吸收波长/530nm的发射波长下测量荧光强度。计算三组测量值(每个实验条件)的平均值，计算荧光强度相比未经抗体处理组的荧光强度的减少量从而分析抑制率。结果，4B在0.1μg～10.0μg量时表现出约50～60％的抑制率。7C和7H在较低量(0.01～1.0μg)时表现出弱抑制作用，而在10μg量时表现出50～60％的抑制率(图5)。这些结果与实施例<8-1>中对VCAM-1抗原和白细胞之间粘附的抑制作用的分析结果相似。

实施例9：抗体对RhoA(Ras同源基因家族，成员A)和ROS(活性氧物质) 活性的抑制作用

<9-1>对RhoA(Ras同源基因家族，成员A)的抑制作用

将2×10⁴个HUVEC(人脐静脉内皮细胞)接种在6-孔板中，并培养至汇合，持续约3天。为了除去培养基中存在的血清，用EBM-2培养基(Cat.No.：CC-3156，Lonza)洗涤该板一次，并加入稀释在添加有0.25％胎牛血清的EBM-2培养基中的20ng/ml人TNF-α从而刺激该细胞过夜(约14～16小时)。除去该培养基后，添加10μg/ml浓度的抗VCAM-1抗体和对照抗体，接着在37℃下反应30分钟。添加用于与细胞表面上的VCAM-1交联的10μg/ml抗VCAM-1抗体(Cat.No.：BBA5，BD)，接着在37℃下反应30分钟。以1∶100比例添加HRP结合的抗小鼠抗体(Cat.No.：A9917，Sigma)，接着在37℃下反应15分钟。在该反应完成后，立即将该板放置在冰上从而除去培养基，并用冷PBS洗涤一次。在从该板完全除去残余的PBS后，将包括在RhoA活化试剂盒(Cat.No.：BK124，Cytoskeleton)中的100μl细胞裂解缓冲液添加到每个孔中，并回收裂解细胞。根据试剂盒中的手册进行随后的程序，并重复三次。

结果，发现抗体4B和7H对RhoA活性表现出约80％和30％的抑制率，这是由在细胞表面上表达的VCAM-1的交联引起的(图6)。

<9-2>对ROS(活性氧物质)活性的抑制作用

将2×10⁴个HUVEC(人脐静脉内皮细胞)接种在6-孔板中，并培养至汇合，持续约3天。为了除去培养基中存在的血清，用EBM-2培养基(Cat.No.：CC-3156，Lonza)洗涤该板一次，并加入稀释在添加有0.25％胎牛血清的EBM-2培养基中的20ng/ml人TNF-α从而刺激该细胞过夜(约14～16小时)。除去该培养基并用EBM-2培养基洗涤2次后，添加10μg/ml浓度的抗VCAM-1抗体和对照抗体，接着在37℃下反应30分钟。在每个孔均用EBM-2培养基洗涤2次后，添加用于与细胞表面上的VCAM-1交联的10μg/ml抗VCAM-1抗体(Cat.No.：BBA5，BD)，接着在37℃下反应30分钟。在每个孔均用EBM-2培养基洗涤2次后，以1∶100比例添加HRP结合的抗小鼠抗体(Cat.No.：A9917，Sigma)，接着在37℃下反应30分钟。每个孔均用EBM-2洗涤洗涤2次。在完全除去培养基后，利用稀释在EBM-2培养基中的150μl 10μM DCF(2′，7′-二氯荧光黄二乙酸酯)处理每个孔。然后，每10分钟检验一次荧光(波长495nm～527nm)，持续3小时，并通过在3小时测得的值评估该抗体的作用。重复该实验三次。

结果，发现抗体4B和7H对ROS活性表现出约65％和25％的抑制率，这是由在细胞表面上表达的VCAM-1的交联引起的(图7)。

上面的结果表明，根据本发明的抗体显著地抑制了RhoA和ROS活性；也就是说，当免疫细胞结合到内皮细胞时，内皮细胞之间的间隙扩大从而形成空穴，免疫细胞通过该空穴，并通过内皮细胞信号转导迁移到受感染部位。然而，根据本发明的抗体显著地抑制了以上内皮细胞信号转导通路中的RhoA和ROS活性，使得内皮细胞之间的间隙形成被抑制而不形成空穴。因此，阻止了免疫细胞迁移到受感染部位中。

实施例10：药物动力学分析

在这个实施例中，通过将本发明人申请的抗VCAM-1嵌合单克隆抗体(韩国专利申请No.10-2007-0053526，“VCAM-1 specific monoclonal antibody”)和本发明人单克隆抗体之间的体内半衰期相比较进行药物动力学分析。也就是说，分别给7周龄的BALB/c小鼠(雌性，东方)腹膜内施用500μg抗VCAM-1嵌合单克隆抗体和人抗体4B和7C。在施用之前以及在施用之后的30分钟、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72和96小时，从尾部静脉采集血液样品。进行ELISA从而测定血清IgG水平和半衰期(浓度降低最大血液浓度的1/2所需的时间)，结果在下表3中给出。

表3

参考表3，发现4B和7C的体内半衰期为约89小时，其比抗VCAM-1嵌合单克隆抗体的半衰期增加约3倍。

实施例11：对小鼠哮喘的效力试验

<11-1>哮喘动物模型的建立

为了证实对小鼠VCAM-1抗原具有特异性的人抗体7C和7H的体内效力，建立了哮喘动物模型。在第0、2和7天，给6周龄的雌性BALB/c小鼠(东方)腹膜内施用75μg卵白蛋白(Sigma，A5503)和作为辅助剂的2mg明矾(Pierce，77161)的混合物。在第14天至第20天的一周内，利用喷雾器(Omron)进行2％卵白蛋白的局部敏化，持续30分钟从而诱导哮喘(参考文献：S.J.Park，W.H.Shin，J.W.Seo等人，Anthocyanins inhibit airway inflammation and hyperresponsiveness in a murineasthma model.Food and Chemical Toxicology 45(2007)1459-1467)。在第14天，将抗体以0.2mg/小鼠(8mg/kg)和0.05mg/小鼠(2mg/kg)的剂量腹膜内施用一次。为了比较治疗效力，从第14天至20天每天以10mg/kg的剂量腹膜内施用氨茶碱(DaeWon Pharm)，作为对照。在第21天，检验炎症的解剖图式。

<11-2>抗体在哮喘动物模型中的效力

在最后一次卵白蛋白敏化之后24小时，用醚(Junsei)使该小鼠麻醉，并将其固定在解剖台上。切开胸部从而暴露气管，然后进行结扎并放置导管。注射1ml和0.8ml PBS从而进行支气管肺泡灌洗。将所获得的支气管肺泡灌洗液在4℃和2,000rpm下离心5分钟。将该细胞悬浮在PBS中从而对细胞数目进行计数。将20,000个细胞加入2,000rpm下的细胞离心涂片器(cytospin)(Thermo scientific)中3分钟，然后将其分散在载玻片上，接着进行Diff Quick染色。Diff Quick染色(Sysmex，38721)如下进行：将载玻片浸渍在溶液I中15秒，在溶液II中60秒，在溶液III中40秒，然后用自来水洗涤载玻片。将载玻片风干过夜，并利用固定液(Fluka，44581)固定。在光学显微镜(×100)下检查200个或更多的炎性细胞，并将细胞分为嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞以便进行比较(参考文献：D.Y.Kim，S.Y.Ryu，J.E.Lim等人，Anti-inflammatory mechanism of simvastatin in mouse allergic asthma model.European Journal of Pharmacology 557(2007)76-86)。

结果，当以0.2mg/小鼠的剂量施用抗VCAM-1人抗体时，炎性细胞的总数目显著减少。特别地，发现在以0.05mg/小鼠和0.2mg/小鼠剂量的7H处理的组中，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞数目减少。当以0.05mg/小鼠和0.2mg/小鼠的剂量施用一次7C时，炎性细胞总数目减少，特别地，巨噬细胞和嗜酸性粒细胞数目显著减少。也就是说，发现两种抗体对哮喘中的炎性细胞流入的抑制作用与当前用于治疗哮喘的氨茶碱的抑制作用相似(图8)。

Claims

1.人单克隆抗体，其特异性结合人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)从而抑制白细胞与活化内皮细胞之间的相互作用。

2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体进一步特异性结合小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)。

3.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有由SEQ ID NO.2限定的重链CDR1、由SEQ ID NO.3限定的重链CDR2，和由SEQ ID NO.4限定的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQID NO.14限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.15限定的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.16限定的轻链CDR3。

4.根据权利要求3所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体包含由SEQ IDNO.1限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.13限定的轻链氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体与人VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)为1×10^-11M至9×10^-9M。

6.根据权利要求2所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有由SEQ ID NO.6限定的重链CDR1、由SEQ ID NO.7限定的重链CDR2，和由SEQ ID NO.8限定的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQID NO.18限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.19限定的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.20限定的轻链CDR3。

7.根据权利要求6所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体包含由SEQ IDNO.5限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.17限定的轻链氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体与人和小鼠VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)为1×10^-10M至9×10^-8M。

9.根据权利要求2所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆单体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有由SEQ ID NO.10限定的重链CDR1、由SEQ ID NO.11限定的重链CDR2，和由SEQ ID NO.12限定的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQ ID NO.22限定的轻链CDR1、由SEQ ID NO.23限定的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.24限定的轻链CDR3。

10.根据权利要求9所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体包含由SEQ IDNO.9限定的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.21限定的轻链氨基酸序列。

11.根据权利要求9所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体与人和小鼠VCAM-1抗原的缔合/解离常数(K_D值)为1×10^-10M至9×10^-8M。

12.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述对白细胞和活化内皮细胞之间的相互作用的抑制是通过抑制白细胞粘附到活化内皮细胞上或通过降低ROS(活性氧物质)和RhoA(Ras同源基因家族，成员A)活性来阻止内皮细胞之间形成间隙进行的。

13.用于诊断癌症或一种或多种炎性疾病的组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的人单克隆抗体，所述一种或多种炎性疾病选自哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。

14.提供有关炎性疾病或癌症的诊断信息的方法，所述方法包含检测怀疑患有炎性疾病或癌症的对象生物样本中的VCAM-1和根据权利要求1至12中任一项所述的人单克隆抗体之间的抗原-抗体反应的步骤。

15.用于癌症或一种或多种炎性疾病的治疗组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的人单克隆抗体，所述一种或多种炎性疾病选自哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。

16.用于治疗癌症或一种或多种炎性疾病的方法，其包含给对象施用根据权利要求15所述的治疗组合物的步骤，所述一种或多种炎性疾病选自哮喘、鼻炎、关节炎、多发性硬化症、肠道疾病、动脉硬化、心肌梗塞和移植排斥。