CN101863980B

CN101863980B - 全人源抗血管内皮细胞生长因子受体2单链抗体

Info

Publication number: CN101863980B
Application number: CN 200910264180
Authority: CN
Inventors: 王旻; 张娟; 李海鑫; 陈卫; 周雅琼
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2029-12-31
Also published as: CN101863980A

Abstract

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及基因工程设计、表达的对人血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)具有特异性亲和力的全人源单链抗体。本发明还提供重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的核苷酸序列，以及包含重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的核苷酸序列，以及包含可变重链和可变轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列。本发明还提供产生和表达抗VEGFR-2单链抗体的方法，通过“富集-洗脱-富集”的循环操作，筛选出对人血管内皮生长因子具有特异亲和力的抗体，后通过原核细胞分泌表达系统、亲和纯化系统获得单链抗体。本发明抗体可以应用于偶联于可检测物质和治疗剂。

Description

全人源抗血管内皮细胞生长因子受体2单链抗体

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人血管内皮细胞生长因子受体2特异结合的单链抗体，能够阻断VEGF与其受体的结合，中和由于血管内皮细胞生长因子与受体2的结合所产生的生物学效应。

背景技术

血管生成是新生血管发育包括血管内皮细胞增殖，迁移和组织浸润，细胞构成血管骨架，现有循环系统中新生血管的生成以及新生微血管的成熟。血管生成在正常的生理过程包括干细胞发育，卵泡生长和伤口愈合，病理状态如肿瘤生长，非正常血管生成如青光眼。其他疾病状态包括但不限于动脉粥样硬化，类风湿关节炎和眼科病如糖尿病视网膜病和老年斑点病变。

控制这类疾病的方法包括通过封闭肿瘤部位组织或器官细胞的血供，这就要求对所要鉴别的肿瘤位点的明确。机械法阻断血供的另一个缺点是旁路微血管的发育常常很迅速而重新给肿瘤。另外一种方法是对参加血管生成过程中一些因子的调控，无论是静息期还是血管生成期都可以被控制。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是人们所发现参与血管生成中的一个重要的因子。

VEGF特异地作用于血管内皮细胞，增加血管通透性，促进内皮细胞迁移、分裂、增殖，有利于肿瘤的转移和扩散，并且部分造成肿瘤多药耐药^[1]。VEGF有多种剪接体，主要以游离形式分泌表达于胞外，是抗血管生成抗肿瘤治疗的主要靶标。肿瘤血管靶向药物与肿瘤靶向药物相比，产生耐药性的可能性较小，因为它们针对遗传稳定的血管内皮细胞，而不是易突变不稳定的肿瘤细胞，因此不易产生肿瘤耐药性^[2]。

2004年，美国FDA批准的抗VEGF抗体贝伐单抗(Avastin)在临床与化疗药物联合治疗结肠直肠癌有明显的延长病人生命的效果。然而，封闭VEGF治疗肿瘤的同时也抑制了VEGF的正常生理功能，病人使用后会引起高血压、出血和血栓形成。而通过对VEGF作用的信号途径研究显示，VEGF有三种主要的受体(VEGF receptor，VEGFR)：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF受体通常是III类受体型酪氨酸激酶，其特征在于他们氨基末端的胞外受体结合域中有若干，通常是5或7个免疫球蛋白样的环。另外两个区包括一个跨膜区和一个羧基末端胞内催化域，其可被不同长度的亲水性内激酶(interkinase)序列插入，也称作激酶插入域断开。其中介导VEGF在肿瘤新生血管形成中发挥功能的主要受体是VEGFR-2，又称激酶功能区受体(kinase domain receptor，KDR)，是一种受体型酪氨酸激酶，主要局限于增殖的内皮细胞表达^[3，4]。因此对VEGF/VEGFR-2自分泌或旁分泌途径引起肿瘤血管生成的抑制可以治疗VEGFR-2依赖性的相关疾病，特别是抗肿瘤治疗。可以预测，对于抗血管生成抗肿瘤治疗这种开发前景极其诱人的治疗途径而言，靶向VEGFR-2的抑制剂治疗肿瘤相对于直接拮抗VEGF而言其特异性及针对性更强，并能避免对VEGF的全面封闭所导致的副作用。

以VEGFR-2为靶点的药物研究有抗VEGFR-2抗体，可溶性VEGF受体，小分子酪氨酸激酶抑制剂和反义核酸等^[2]。与临床应用的其他小分子药物相比，抗体有着明显的优点与优势：半衰期长，毒副作用低等。抗体对靶标分子具有高特异性和高亲和力，大大减少了脱靶所造成的副作用，正在发展成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。尤其近年来开发的人源化或全人源单克隆抗体，避免了早期鼠源抗体的免疫原性，是一种理想的药物形式。美国Imclone system开发了针对小鼠VEGFR-2的抗体IMC1121^[5]，并以IMC1121为主要成分与紫杉醇(paclitaxel)和卡铂(carboplatin)联合研制了抗癌新药IMC1121B，该药目前在扩散期的乳腺癌III期临床试验阶段有上佳的表现，2009年开展了晚期非小细胞肺癌的II期临床研究。这极大的鼓舞了以VEGFR-2为靶的抗肿瘤药物研究，而靶向人VEGFR-2的抗体的研究对抗体工程科研人员无疑有着更大的吸引力。

抗体药物的研究趋势要求抗体实现靶点明确、人源化和小型化。对KDR的胞外结构域缺失突变的研究显示，在KDR7个胞外配基结合区中3区对于VEGF的结合贡献最突出，它的缺失突变可以引起受体-配体亲和力下降1000倍^[6]，因此，靶向VEGFR-2特定的关键结构域KDR3的拮抗剂将有更高的组织特异性和亲和力，而分子量只有全长抗体的1/6的抗VEGFR-2单链抗体可以通过E.coli发酵降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗VEGF受体2(KDR)的单链抗体。本发明单链抗体的特征为特异性结合人VEGF受体2的胞外3区即KDR3，在体外能够抑制VEGF所诱导的脐静脉内皮细胞细胞增殖。

全人源抗VEGF受体2单链抗体基因序列全长729个核苷酸，预期有243个氨基酸。具有115个氨基酸的重链可变区(见图1)和112个氨基酸的轻链可变区(见图2)，通过16个氨基酸的柔性肽连接(SSGGGGSGGGGSGGSA)。

含有本发明血管内皮生长因子受体2单链抗体基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述血管内皮生长因子受体2抗体的方法。

本发明通过噬菌体展示抗体库技术，以人VEGF受体胞外3区KDR3为靶抗原，筛选得到一个能特异性结合KDR的全人源单链抗体AK404R；用1mmol/L IPTG诱导表达；利用超声破碎细胞，低温离心去细胞碎片，将上清过镍亲和层析柱进行分离纯化；Western Blot鉴定分离纯化得到的AK404R；分析不同剂量下抗体和抗原的作用；检测单链抗体AK404R对VEGF所诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用。

附图说明

图1展示AK404R的重链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3下划线。

图2展示AK404R的轻链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3下划线。

图3是全人源的抗人VEGF受体2单链抗体AK404R的三维结构。

图4是一SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的AK404R通过镍柱进行分离纯化的结果。

图5是利用Western Blot方法鉴定分离纯化得到的AK404R。

图6是一曲线图，描述不同浓度AK404R与VEGF受体2(KDR)特异性结合的定量ELISA实验。

图7是一曲线图，描述全人源的抗人VEGF受体2(KDR)单链抗体AK404R对VEGF诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制作用。

本发明以下将结合具体实施例作进一步的详述：

实施例1.全人源的抗人VEGF受体2单链抗体的筛选

以包被缓冲液(50mM NaHCO₃，pH9.6)稀释KDR3，取4ml加入到免疫管中，室温包被过夜；次日，弃上清，PBS迅速洗管3次；2％MPBS(含有2％脱脂牛奶的PBS)，37℃封闭2h；弃封闭液，用PBS迅速洗管3次；将噬菌体抗体库(10¹²～10¹³p.f.u)悬浮于4ml 2％MPBS并加入到免疫管中，室温反复倒转30min后，于室温静置90min以上；以含有0.1％Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂；加入1ml 100mM三乙胺[700μl三乙胺(7.18mol/L)加入到50ml水中]，室温反复倒转孵育10min，进行特异性洗脱；0.5ml 1M Tris(pH7.4)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的大肠杆菌TG1，进行扩增和制备，用于下一轮筛选。

实施例3.抗KDR单链抗体的可溶性表达及分离纯化

挑选测序正确的TG1菌株，收集噬菌粒，按常规操作感染表达菌株大肠杆菌HB2151，培养至OD_600nm＝0.6，加入终浓度1mM的IPTG，25℃诱导过夜，12％SDS-PAGE检测诱导表达的结果。

6000rpm，4℃离心5min，收集菌体；PBS重悬菌体，超声破碎(超声3s，间隙3s，总共10min)；10000rpm，4℃离心20min，保留上清；将上清过镍柱(Novagen产品)，用不同浓度的咪唑洗脱；12％SDS-PAGE检测收集的样品，-20℃保存目的蛋白。

实施例4.抗KDR单链抗体的Western Blot鉴定

纯化得到的AK404R进行变性SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12％；4℃，100mA恒流转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％MTBS(含有5％脱脂牛奶的TBS)中室温封闭1h；用5％MTBS按1∶1000稀释anti-6×His抗体(Novagen产品)，室温孵育1h，TBS洗涤3遍，每次10min；用5％MTBS按1∶10000稀释HRP-anti-Mouse二抗(购自联科生物)，室温孵育1h，TBS洗涤3遍，每次10min；用DAB显色。

实施例5.可溶性单链抗体AK404R的定量ELISA

将实验室制备的KDR3室温包被酶标板过夜。用200μl 3％BSA(PBS配置)室温封闭2h，取获得的可溶性抗KDR3单链抗体2倍梯度稀释，室温孵育90min，以含有0.05％Tween20的PBS洗涤3次，每孔加入100μl用3％BSA 1∶1000稀释后的anti-c-myc tag抗体，室温孵育90min。以含有0.05％Tween20的PBS洗涤3次，加入100μl用3％BSA 1∶5000稀释后的HRP-偶联IgG多克隆抗体，室温孵育90min。以含有0.05％Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。TMB的底物液，室温孵育10min。每孔加入50μl 5％(v/v)稀硫酸终止反应。测定OD₆₅₀和OD₄₅₀，并以OD₄₅₀的值减去OD₆₅₀的值，作为最后检测结果。

实施例5.抗KDR单链抗体对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的抑制

消化6代内的HUVEC原代细胞，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后用5％胎牛血清培养基替换原培养基。将培养的HUVEC细胞分为4组，按照分组要求加入VEGF和不同浓度的AK404R，继续培养72h，观察细胞生长状况后每孔加入20μl的MTT，37℃继续培养4h，倾去上清，每孔加入150μl DMSO，在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(OD值)，计算细胞增殖活力。AK404R的生物活性由细胞生长的抑制率评价。抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。

抗人VEGF受体KDR单链抗体的可变区重链和轻链氨基酸推导序列如下：

序列表

<110>中国药科大学

<120>全人源抗血管内皮细胞生长因子受体2单链抗体

<130>20

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>115

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Phe Glu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val

115

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Leu Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Pro Ala Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Arg Phe Glu Pro Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn

1 5 10

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Ala Ser Val

1 5 10

Claims

1.一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的单链抗体，其特征在于：其重链CDR1域氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链CDR2域氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链CDR3域氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；轻链CDR1域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链CDR2域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链CDR3域氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的单链抗体在制备抑制VEGF所诱导的HUVEC细胞增殖的药物中的应用。