CN102906116B - 融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的核酸分子，其选自：i．包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其补体具有至少85%同一性的核苷酸序列的核酸分子；ii．包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其补体的至少1500个连续核苷酸的片段的核酸分子；iii．编码包含与SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子；vi．编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少500个连续的氨基酸；以及v．核酸分子编码多肽含有人源化的免疫球蛋白或对于CD133具有结合特异性的免疫球蛋白的部分；编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的变体的核酸分子，其中所述核酸分子在6.0×SSC中于45℃温育、之后是在0.2×SSC/0.1%SDS中于65℃洗涤的条件下与包含整个SEQ ID NO:1的核酸分子，或其补体杂交。

Description

融合蛋白

【技术领域】

本发明涉及核酸分子和能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合的多肽。本发明也涉及含有本发明的核酸分子的宿主细胞。而且，本发明涉及产生本发明的多肽的方法。多肽可用于预防，治疗或诊断心血管疾病。因此，本发明也涉及含有本发明的多肽，其是优选二聚体的药物组合物。

【背景技术】

内皮祖先细胞（EPC）居住在骨髓及释放到血流，在这里它们涉及止血和组织修复。CD133蛋白，长效五羟淀粉跨膜糖蛋白，在EPC表面表达，在这里EPC分化为内皮细胞后表达下调。CD133不在血的任何其他细胞类型上表达，这使其成为EPC募集的有吸引力的靶标。

从WO 2008/101700知道能将内皮祖先细胞（EPC）吸引到血管损伤位点的双特异性蛋白。由WO 2008/101700公开的蛋白含有能以高亲和性结合EPC上的CD133的部分。而且，由WO 2008/101700公开的蛋白含有部分能识别及结合血管的内皮衬中的损伤。根据WO2008/101700，通过连接能结合内皮前体细胞的第1蛋白和能结合胶原的第2蛋白来制备蛋白。

第1和第2蛋白通过使用SPDP（N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯），其是异双官能交联剂来连接。由于第1蛋白含有与SPDP具有反应性的约25个赖氨酸残基，及第2蛋白含有约18个赖氨酸残基，可能的二聚产物数是至少450（18×25）。此外，更高寡聚体的形成不可避免。因此，交联的产物含有产物的异源混合物。顺便而言，混合物不含有任何第1和第2蛋白的融合蛋白，由于产物未通过编码第1和第2蛋白的2个或更多基因的接合来制备。

因此，无由WO 2008/101700可利用的产物可被认为是融合基因的翻译产物或作为具有源于各原蛋白的功能性质的单多肽。

由WO 2008/101700公开的蛋白混合物不合适于用作药物，由于混合物不可以标准化的及定义的组成和对于治疗性应用适合的足够的纯度提供。而且，由于寡聚体不可避免，WO 2008/101700的混合物的产率和功效有问题。

另一方面，制备含有在WO 2008/101700的混合物中存在的多肽序列的融合蛋白的尝试不能结合能选择性地和同时结合内皮前体细胞和胶原的第2蛋白。

【发明概述】

因此，本发明的目的是提供能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合的小尺寸多肽，其中可以高产率和高纯度制备在药物组合物中有用的蛋白，用于由EPC分化为血管壁的内皮细胞直接或由阳性调节因子的分泌间接改善治愈过程。

本发明提供编码特定融合蛋白的核酸分子。融合蛋白可通过EPC归巢到暴露的胶原用于治疗或预防心血管疾病，或用于诊断目的。

根据第1方面，本发明提供分离的核酸分子，其选自：

i．包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其补体具有至少85%同一性的核苷酸序列的核酸分子；

ii．包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其补体的至少1500个连续核苷酸的片段的核酸分子；

iii．编码包含与SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

iv．编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少500个连续的氨基酸；以及

v．编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的变体的核酸分子，其中所述核酸分子在6.0×SSC中于45℃温育、之后是在0.2×SSC/0.1%SDS中于65℃洗涤的条件下与包含整个SEQ ID NO:1的核酸分子，或其补体杂交。

SEQ ID NO:1的核酸序列如下：

ATGGAAACCCCTGCTCAGCTGCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCTGACACCACCGGCGACATCCTGATGACCCAGTCCCCCAAGTCCATGTCCATGTCCCTGGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCAAGGCCTCCGAGAACGTGGACACCTACGTGTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGCAGTCCCCTAAGGTGCTGATCTACGGCGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCCGGCTCCGCCACCGACTTCTCCCTGACCATCTCCAACGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGATTACCACTGCGGCCAGTCCTACAGATACCCTCTGACCTTCGGCGCTGGCACAAAGCTGGAACTGAAGGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCTGACCTGATGAAGCCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCAACTACTACGTGCACTGGGTGAAACAGTCCCTGGACAAGTCCCTGGAATGGATCGGCTACGTGGACCCTTTCAACGGCGACTTCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTAGCTCCACCGCCTACATGCACCTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCCTGgATTGGTACGACACCTCCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGAACCGCTGTGACCGTGTCCTCCCAGTCTGGCCCTCTGCCTAAGCCTTCCCTGCAGGCCCTGCCTTCCTCCCTGGTGCCTCTGGAAAAGCCAGTGACCCTGCGGTGTCAGGGACCTCCTGGCGTGGACCTGTACCGGCTGGAAAAGCTGTCCTCCAGCAGATACCAGGACCAGGCCGTGCTGTTCATCCCTGCCATGAAGCGGTCCCTGGCCGGCAGGTACAGGTGCTCCTACCAGAACGGCTCCCTGTGGTCTCTGCCTTCCGACCAGCTGGAACTGGTCGCCACAGGCGTGTTCGCCAAGCCTTCTCTGTCTGCCCAGCCTGGCCCTGCTGTGTCCTCTGGCGGCGACGTGACCCTGCAGTGCCAGACCAGATACGGCTTCGACCAGTTCGCCCTGTACAAAGAGGGCGACCCAGCCCCTTACAAGAACCCTGAGCGGTGGTACAGGGCCTCCTTCCCTATCATCACCGTGACCGCCGCTCACTCCGGAACCTACCGGTGCTACAGCTTCTCCTCCCGGGACCCTTACCTGTGGTCCGCCCCTAGCGACCCTCTGGAACTGGTGGTCACCGGCACCTCCGTGACCCCTTCCAGGCTGCCTACCGAGCCTCCTAGCTCCGTGGCCGAGTTCTCTGAGGCCACCGCCGAGCTGACCGTGTCTTTCACCAACAAGGTGTTCACCACCGAGACATCCCGGTCCATCACCACCTCCCCCAAAGAGTCCGACTCTCCTGCCGGCCCTGCTCGGCAGTACTACACCAAGGGCAACGGCGGCAGAGTGGAGTGTCCTCCTTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGACAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACAGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG

根据第2方面，本发明提供含有本发明的第1方面的核酸分子的宿主细胞。

根据第3方面，本发明提供能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合的多肽，其选自：

（a）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:2的至少600个连续的氨基酸；

（b）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的变体，其中所述变体由与包含整个SEQ ID NO:1的核酸分子或其补体在6.0×SSC中于45℃温育、之后是在0.2×SSC/0.1%SDS中于65℃洗涤的条件下杂交的核酸分子编码；

（c）由以下核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含与由SEQ IDNO:1的核苷酸序列组成的核酸或其补体具有至少85%同一性的核苷酸序列；以及

（d）包含与SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列的多肽。

根据第3方面的多肽对于用于预防或治疗心血管疾病是有利的。

SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下：

METPAQLLFLLLLWLPDTTGDILMTQSPKSMSMSLGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPEQSPKVLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFSLTISNVQAEDLADYHCGQSYRYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPDLMKPGASVKISCKASGYSFTNYYVHWVKQSLDKSLEWIGYVDPFNGDFNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGGLDWYDTSYWYFDVWGAGTAVTVSSQSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGNGGRVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

根据第4方面，本发明提供产生包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的方法，所述方法包括在核酸分子表达的条件下培养根据第3方面的宿主细胞。

根据第5方面，本发明提供包含根据本发明的第3方面的多肽的药物组合物。

根据第6方面，本发明提供根据第3方面的多肽用于制备预防或治疗心血管疾病的药物的用途。

本发明展示，可以高效率在哺乳动物细胞培养物中表达的本发明的融合蛋白，能以高亲和性结合其靶CD133和胶原，及甚至在动态条件下能将表达CD133的HEK 293细胞固定到胶原包被的表面，如流室实验中显示。

与含有与GPVI-Fc化学连接的W6B3H10mAb的WO2008/101700的蛋白混合物可比较，本发明的融合蛋白能在小鼠模型中将自人脐带血分离的CD133阳性祖先细胞募集到诱导的血管损伤。而且，募集的EPC分化为内皮细胞，由此直接贡献于内皮壁的再生。因此，本发明的融合蛋白增加再内皮化，且在再生血管医学中有有益价值。本发明的多肽对于由分化为血管壁的内皮细胞直接或由阳性调节因子的分泌间接改善治愈过程是有用的。

优于以往的化学连接的构建体，新融合蛋白对胶原具有更高亲和性（见图9）。这表示用作对于局部结合血管损伤有更高功效的药物的优势。在融合蛋白的各种可能性中，仅scFv-lh显示对CD133可比较的高亲和性，然而其他来源的构建体未显示（见图5）。

除了本发明的多肽对于血管再生过程的应用之外，也可采用以在由化学治疗或放射治疗消除骨髓之后改善移植的干细胞归巢到骨髓。

本发明提供能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合的小尺寸的根据SEQ ID NO:2的多肽。本发明的蛋白可以高产率和高纯度制备，这使得其在药物组合物中高度有用。

本发明的多肽是融合蛋白，即，融合基因的翻译产物。融合蛋白含有单链抗-CD133抗体结构域，接头，Fc部分，及GPVI部分。本发明的蛋白可为二聚体形式。

本发明的多肽基于单链抗体（scFv），其仅由单克隆抗体的轻和重链的可变序列组成，其由连接的接头肽组合在一个多肽链上。此单链抗体以意外地高亲和性保留对于亲本mAb的抗原的特异性。根据本发明使用的亲本mAb可由小鼠杂交瘤细胞克隆W6B3H10，可商购的克隆W6B3C1（Miltenyi，Bergisch Gladbach）的亚克隆产生。

因为本发明的多肽的抗体部分源于小鼠单克隆抗体，含有此部分的融合蛋白是小鼠-人嵌合蛋白。由于有技术可利用，以在基于重组抗体的药学中取代小鼠来源的序列，其成为了开发人源化的或完全人的治疗性分子的本领域状态。此尤其当重复施用时，减少或防止针对治疗性蛋白的免疫应答。因此，可使本发明的多肽的单链部分由称之为CDR移植的方法经历人源化过程。在此，将包含抗体的抗原结合位点的小鼠来源的互补决定区（CDR）移植到人框架残基。

可将源于物种小鼠的融合蛋白的抗体部分通过小鼠CDR的CDR移植到人共有受体框架序列来成功地人源化。人源化的融合蛋白保留对其靶蛋白CD133和胶原I的结合性质，及以相比融合蛋白类似亲和性与小鼠单链序列结合。

第2融合偶体能识别及结合血管内皮衬中的损伤。在内皮细胞层由手术干预诸如支架移植损伤之后或动脉粥样硬化性噬斑破裂之后，胶原，内皮下基质的成分，暴露于血流。此导致血小板的快速附接和活化，其进而可导致血栓形成和血管的最终阻塞。

人源化的融合蛋白能抑制血小板与损伤的血管壁的结合，如由降低的血栓形成区显示（见图22）。相比具有小鼠抗体序列的前体分子，预期施用之后人源化的融合蛋白改善患者的免疫系统的耐受性。

血小板经在血小板表面上表达的糖蛋白VI（GPVI），膜糖蛋白受体粘附于胶原。人血小板糖蛋白VI的可溶性部分，其对应于蛋白的细胞外结构域，显示对胶原的高结合亲和力。

GPVI以高亲和性作为同源二聚体结合胶原。为了一方面辅助二聚化和另一方面辅助融合蛋白由亲和层析的纯化，将人IgG的Fc部分附接于可溶性GPVI部分。Fc-片段经铰链区的余下的部分中的共价二硫键形成二聚体，其促进很可能由二硫键形成支持的GPVI的二聚化。而且，Fc-标签增加血流中融合蛋白的半衰期。

【附图说明】

图1显示W6B3H10轻和重可变区cDNA的组装的序列。特别是，图1A显示κ轻链的序列。加下划线的序列属于轻链序列的恒定区。图1B显示γ重链的序列。

图2显示A中描绘的构建体scFv-lh和B中显示的scFv-hl的核苷酸序列。A中的加下划线的序列源于重链的恒定区，B中的加下划线的序列源于轻链的恒定区。Gly-Ser接头序列以斜体字书写。

图3显示使用Strep-Tactin基质自CHO细胞上清液纯化单链抗体scFv-lh的蛋白印迹，用StrepMAb-典型-HRP抗体检测。显示流通（FT），头2个洗涤级分（W1，W2），洗出液级分1～5（E1～E5）和洗脱后基质（M）。在泳道E2～E5中在约27kDa的预期的尺寸显示特异性条带。泳道M显示非特异性信号。

图4显示自细菌的scFv-hl的纯化的考马斯凝胶。B，细菌裂解物，E2/3，组合的洗出液2和3，E4，E5，洗出液级分4和5。

图5显示单链抗体与固定的AC133/293细胞上的CD133的结合。A，浓度依赖性结合性质B，2nmol/L W6B3H10mAb与固定的AC133/293细胞上的CD133的结合由单链抗体scFv-lh的竞争。

图6显示融合蛋白scFv-lh-GPVI-Fc的核苷酸序列（SEQ IDNO:1）和氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。图1A显示对于在CHO细胞中有效表达密码子-优化的核苷酸序列，其中编码单链部分的序列加下划线。图1B显示自核苷酸序列推导的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。显示的20个氨基酸前导序列肽在成熟蛋白中缺乏。单链部分的序列加下划线。GPVI和FcIgG2由以粗体显示的GGR-接头连接。

图7显示在非-还原和还原性条件下在4～20%聚丙烯酰胺凝胶上分离的融合蛋白，凝胶用考马斯亮蓝染色。

图8显示融合蛋白与固定的AC133/293细胞上的CD133结合的表征。图8A显示用于比较融合蛋白和亲本mAb W6B3H10的结合的滴定ELISA。图8B显示用2nM W6B3H10mAb和融合蛋白作为竞争物的竞争性ELISA。

图9显示由ELISA测量融合蛋白相比GPVI-FcIgG1与0.1μg牛胶原I的结合。图9A展示浓度依赖性结合。图9B展示融合蛋白与1μg/ml固定的胶原I结合的竞争，由增加量的可溶性胶原I竞争。

图10展示表达CD133的细胞及HEK 293对照细胞与胶原在2000/s剪力下融合蛋白介导的结合。

图11展示在体内连接诱导的损伤之后，qEPC与小鼠颈动脉的融合蛋白介导的结合，由活体荧光显微镜检测量。

图12显示融合蛋白对左心室功能（A）及对梗塞尺寸（B）的效应。N=5/6，*p<0.05，**p<0.005（t检验）。

图13显示由含有人源化的序列的噬菌体克隆相比带有小鼠单链序列的噬菌体m1h的FACS分析的亲和性测量。图13A显示噬菌体克隆26相比噬菌体m1h的亲和性。图13B显示噬菌体克隆27和噬菌体克隆29相比噬菌体m1h的亲和性。使用Graphpad Prism 4.0软件进行分析。当输入平均FI（荧光指标），Geo-平均FI或中位FI时测量pM中的相对亲和性。

图14显示以供体序列作为阴性对照，而受体序列作为阳性对照评定人源化的抗体序列的人性。A，供体VL；B，受体VL；C，克隆26VL；D，供体VH；E，受体VH；F，克隆26VH。

图15显示使用NCBI的BlastP程序比较蛋白序列。图15A显示亲本小鼠单链抗体（SEQ ID NO:22；小鼠）和人受体序列（SEQ IDNO:23；受试者）的序列比对。图15B显示人源化的单链抗体克隆26（SEQ ID NO:24；人源化的）和人受体序列（SEQ ID NO:23；受试者）的序列比对。框住及指示轻（CDR-L1（SEQ ID NO:25），CDR-L2（SEQ ID NO:26）和CDR-L3（SEQ ID NO:27））和重链（CDR-H1（SEQ ID NO:28），CDR-H2（SEQ ID NO:29）和CDR-H3（SEQ IDNO:30））的互补决定区。

图16显示人源化的融合蛋白（SEQ ID NO:15；上行）与含有小鼠来源的单链部分的融合蛋白（SEQ ID NO:2；下行）使用NCBI的Blastx程序的蛋白序列比对。序列显示蛋白水平上95%的同一性。

图17显示具有源于鉴定的噬菌体克隆26的单链部分的人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc的核苷酸（SEQ ID NO:14）和氨基酸序列（SEQ ID NO:15）。图17A显示对于在CHO细胞中有效表达密码子-优化的核苷酸序列（SEQ ID NO:14），其中编码人源化的单链部分的序列加下划线。图17B显示自核苷酸序列推导的氨基酸序列（SEQ ID NO:15）。显示的20个氨基酸前导序列肽在成熟蛋白中缺失。人源化的单链部分的序列加下划线。

图18显示分别在还原及非-还原性条件下，在4～20%聚丙烯酰胺凝胶上与scFv-lh-GPVI-Fc（m）一起分离的人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc（h）。凝胶用考马斯亮蓝染色。

图19显示融合蛋白与固定的AC133/293细胞上的CD133抗原的结合的表征。图19A显示用于比较人源化的和非-人源化的融合蛋白的结合的细胞ELISA。图19B显示2nM W6B3H10mAb与固定的AC133/293细胞的结合由人源化的和非-人源化的融合蛋白的竞争。包括Fc-蛋白作为阴性对照。

图20显示由ELISA测量的人源化的和非-人源化的融合蛋白与0.1μg固定的牛胶原I的剂量-依赖性结合。将Fc-蛋白用作阴性对照。

图21显示源于噬菌体克隆27的人源化的单链抗体的核苷酸序列（SEQ ID NO:16；在图21A中）和氨基酸序列（SEQ ID NO:17；在图21B中）。图21C显示编码包含克隆27的人源化的序列的融合蛋白的序列（SEQ ID NO:18；查询）和小鼠（SEQ ID NO:2；受试者）单链抗体序列的DNA序列比对，其中序列同一性是96%。

图22显示源于噬菌体克隆29的人源化的单链抗体的核苷酸序列（SEQ ID NO:19；在图22A中）和氨基酸序列（SEQ ID NO:20；在图22B中）。图22C显示编码包含克隆29的人源化的序列的融合蛋白的序列（SEQ ID NO:21；查询）和小鼠（SEQ ID NO:2；受试者）单链抗体序列的DNA序列比对，其中序列同一性是96%。

图23显示在结扎左颈总动脉之后血小板聚集物的尺寸分析。结果作为自5个体/组的平均值±SEM给出。

【发明详述】

当多肽可以其在CD133蛋白和胶原蛋白之间形成桥的状态存在时，尤其是在本实施例中描述的条件下，多肽能同时与胶原和CD133蛋白结合。分别与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有约85%同一性，优选90%，95%或98%同一性的氨基酸或核苷酸序列在本文被定义为足够同一。因此，术语"足够同一"指称第1氨基酸或核苷酸序列与第2氨基酸或核苷酸序列（SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2）含有足够的或最小数的同一或相当的（例如，具有类似侧链的氨基酸残基）氨基酸残基或核苷酸，使得第1和第2氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。如本文所用，“融合蛋白”是发挥融合蛋白活性的多肽。如本文所用，"融合蛋白活性"，"融合蛋白的生物学活性"或"融合蛋白的功能活性"指称同时和选择性与胶原和CD133蛋白结合。

【核酸分子】

本发明针对核酸分子，其与SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列，或其补体具有足够的同一性，即具有至少85%（90%，95%或98%）同一性。

本发明针对核酸分子，其包括SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列，或其补体的至少1500（1600，1800，2000，2200）个核苷酸的片段。在一实施方式中，本发明的核酸分子具有SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列。也在本发明之内的是编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子。

本发明也包括编码多肽的核酸分子，其中所述核酸与由SEQ IDNO:2组成的核酸分子在严格条件下杂交（例如，在6*氯化钠/柠檬酸钠（SSC）于约60℃杂交，之后是在0.2*SSC，0.1%SDS于65℃一次或更多洗涤），且其中所述核酸编码至少500个氨基酸，优选至少700个氨基酸长度，在翻译后修饰之前及以还原型具有大致65～85kD的分子量的多肽。

本发明的一方面属于编码融合蛋白或其有生物学活性的部分的分离的核酸分子，以及对于用作鉴定编码融合蛋白的核酸（例如，融合蛋白mRNA）的杂交探针足够的核酸分子和对于用作用于融合蛋白核酸分子的扩增或突变的PCR引物足够的片段。如本文所用，术语"核酸分子"旨在包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）和RNA分子（例如，mRNA）和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选是双链DNA。

"分离的"核酸分子是从核酸的天然的来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子。优选地，"分离的"核酸无（优选蛋白编码序列）天然地侧接核酸所来源的生物的基因组DNA中的核酸的序列。而且，"分离的"核酸分子，诸如cDNA分子，可为基本上无其他细胞物质，或当由重组技术产生时是培养基，或当化学合成时基本上无化学前体或其他化学品。

本发明的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或此核苷酸序列的任何补体的核酸分子，可使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离（Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989）。

在另一实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含是SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列的补体，或其部分的核酸分子。与给定核苷酸序列互补的核酸分子是与给定核苷酸序列足够互补的核酸分子，其可与核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双联体。

而且，本发明的核酸分子可仅包含编码融合蛋白的部分核酸序列，例如，可用作探针或引物的片段或编码融合蛋白的有生物学活性的部分的片段。

编码融合蛋白的"有生物学活性的部分"的核酸片段可通过分离编码具有融合蛋白生物学活性的多肽的SEQ ID NO:1的部分，表达融合蛋白的编码的部分（例如，由体外重组表达）及评定融合蛋白的编码的部分的活性来制备。

本发明还包括由于遗传密码简并性不同于SEQ ID NO:1的核苷酸序列，由此编码与由SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列编码的相同的融合蛋白的核酸分子。

因此，在另一实施方式中，本发明的分离的核酸分子是至少1500（1600，1800，2000，2200）个核苷酸长度及在严格条件下与包含SEQID NO:1的核苷酸序列，优选编码序列的核酸分子杂交。

如本文所用，术语"在严格条件下杂交"旨在描述杂交及洗涤条件，在该条件下，彼此具有至少85%（95%，98%）同一性的核苷酸序列一般保持彼此杂交。该严格条件为本领域技术人员已知和可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&S ons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。严格杂交条件的一例是在6*氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中于约4℃杂交，之后是在0.2*SSC，0.1%SDS中于50～65℃（例如，50℃或60℃或65℃）一次或更多洗涤。优选地，在严格条件下杂交的本发明的分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。

变化可由突变导入SEQ ID NO:1的核苷酸序列，由此不改变融合蛋白的功能能力而导致编码的蛋白的氨基酸序列的变化。例如，可进行导致在"非-必要的"氨基酸残基的氨基酸取代的核苷酸取代。"非-必要的"氨基酸残基是可不改变生物学活性而自SEQ ID NO:2的序列改变的残基，然而"必要的"氨基酸残基对于融合蛋白的生物学活性是需要的。

因此，本发明的另一方面属于编码含有对于活性不是必要的氨基酸残基中的变化的融合蛋白的核酸分子。该融合蛋白在氨基酸序列上与SEQ ID NO:2不同，且仍保留生物学活性。

在一实施方式中，核酸分子包括编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约85%，95%或98%同一性的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。编码具有不同于SEQ ID NO:1的序列的序列的融合蛋白的分离的核酸分子可通过将一个或更多核苷酸取代，添加或缺失导入融合蛋白的核苷酸序列（SEQ ID NO:1），使得一个或更多氨基酸取代，添加或缺失导入编码的蛋白来创建。突变可由标准技术，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变来导入。优选地，在一个或更多预测的非-必要的氨基酸残基制造保守性氨基酸取代。由此，例如，1%，2%，3%，5%或10%的氨基酸可被保守性取代取代。"保守性氨基酸取代"是氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基取代的取代。已在本领域定义具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），不带电的极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），非极性的侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸），β-分支的侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳族侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）的氨基酸。由此，融合蛋白中的预测的非必要氨基酸残基优选用来自相同的侧链家族的另一氨基酸残基取代。或者，突变可沿着全部或部分融合蛋白编码序列，诸如由饱和诱变随机导入，且可就融合蛋白生物学活性筛选得到的突变体，以鉴定保留活性的突变体。通过诱变，编码的蛋白可重组表达，且可测定蛋白活性。

可检定突变融合蛋白的同时和选择性地与CD133和胶原结合的能力。

本发明也涉及包含编码本发明的人源化的免疫球蛋白（例如，单链抗体）的核酸序列的分离的核酸分子，以及涉及包含编码人源化的免疫球蛋白轻链（例如，编码SEQ ID NO:12，13，14或15的氨基酸序列的序列和/或编码SEQ ID NO:111，116的氨基酸序列的序列或其部分）或重链（例如，编码SEQ ID NO:17，18，19或20的氨基酸序列的序列和/或编码SEQ ID NO:110，114的氨基酸序列的序列或其部分）的序列的分离的核酸分子。

而且，本发明涉及包含编码包含源于对CD133具有结合特异性的非人抗体（例如，单链抗体）的免疫球蛋白的互补决定区（CDR）的人源化的免疫球蛋白的核酸序列（例如，编码包含SEQ ID NO:25，26，27，28，29和/或30的氨基酸序列或其部分的序列）及源于人来源的免疫球蛋白的框架区（例如，编码SEQ ID NO:23的氨基酸序列的序列或其部分）的分离的核酸分子。

本发明还涉及编码含有人源化的对于CD133具有结合特异性的免疫球蛋白或该免疫球蛋白的链的部分的融合蛋白的核酸分子。提供例如，包含编码人源化的免疫球蛋白轻链的基因，包含编码源于对于CD133具有结合特异性的非人抗体的轻链的CDR（例如，编码包含SEQ ID NO:25，26和/或27的氨基酸序列或其部分的序列），及源于人来源的轻链框架区的核苷酸序列的表达载体。包含编码人源化的免疫球蛋白重链的基因，包含编码源于对于CD133具有结合特异性的非人抗体的重链的CDR（例如，编码包含SEQ ID NO:28，29和/或30的氨基酸序列或其部分的序列），及源于人来源的重链的框架区的核苷酸序列的表达载体是该构建体的另一例。在一实施方式中，表达载体可包括编码人源化的免疫球蛋白的核酸，其包括编码包含源于对于CD133具有结合特异性的非人抗体的轻链的CDR的轻链可变区和来自人来源的轻链的框架区的第1核酸序列，及编码包含源于对于CD133具有结合特异性的非人抗体的重链的CDR的重链可变区和来自人来源的重链的框架区的第2核酸序列（例如，编码包含SEQ IDNO:17，20或24的氨基酸序列的序列）。在一实施方式中，表达载体可包括编码轻链的核酸，其包括编码，例如，自SEQ ID NO:1的轻链可变区（nt 61～381）的第1核酸序列，及编码，例如自SEQ IDNO:1的重链可变区（nt 427～798）的第2核酸序列或其部分。在一些实施方式中，表达载体可包括编码本文所述的轻链的核酸及编码本文所述的重链的核酸。

【分离的融合蛋白和抗-融合蛋白抗体】

本发明也涉及具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85%，优选95%或98%同一性的氨基酸序列的多肽。

本发明的一方面属于分离的融合蛋白，及其有生物学活性的部分，以及对于用作免疫原以产生抗-融合蛋白抗体适合的多肽片段。在一实施方式中，融合蛋白由重组DNA技术产生。作为重组表达的替代，融合蛋白或多肽可使用标准肽合成技术化学合成。

"分离的"或"纯化的"蛋白或其有生物学活性的部分是基本上无细胞物质或来自融合蛋白所来源的细胞或组织来源的其他混杂蛋白，或当化学合成时基本上无化学前体或其他化学品。术语"基本上无细胞物质"包括融合蛋白的制备物，其中蛋白从其所分离的或重组产生的细胞的细胞组分分离。由此，基本上无细胞物质的融合蛋白包括具有少于约30%，20%，10%或5%（由干重）的非-融合蛋白（也在本文称之为"混杂蛋白"）的融合蛋白的制备物。当融合蛋白或其有生物学活性的部分重组产生时，其也优选基本上无培养基，即，培养基占蛋白制备物的少于约20%，10%或5%的体积。当融合蛋白由化学合成产生时，其是优选基本上无化学前体或其他化学品，即，其从涉及蛋白合成的化学前体或其他化学品分离。因此该融合蛋白的制备物具有少于约30%，20%，10%，5%（由干重）的化学前体或非-融合蛋白化学品。

融合蛋白的有生物学活性的部分包括包含足够同一于或源于融合蛋白的氨基酸序列（例如，SEQ ID NO:2显示的氨基酸序列）的氨基酸序列的肽，其相比全长融合蛋白包括更少氨基酸，且呈现至少融合蛋白活性。一般而言，有生物学活性的部分包含具有至少融合蛋白活性的结构域或基序。融合蛋白的有生物学活性的部分可为多肽，其为，例如，至少500，550，600，650或700个氨基酸长度。优选的有生物学活性的多肽包括一个或更多融合蛋白结构域，尤其是源于选择性地结合CD133的单链抗体的结构域，接头，Fc部分和GPVI部分。

有用的融合蛋白是包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约85%，优选95%或99%同一性的氨基酸序列及保留SEQ ID NO:2的融合蛋白的功能活性的蛋白。

因为融合蛋白的抗体部分源于小鼠单克隆抗体，融合蛋白是小鼠-人嵌合蛋白，其小鼠序列除了那些涉及抗原识别的之外，可针对人序列通过抗体人源化取代。一般而言，部分人抗体和完全人抗体相比其他抗体在人身体之内具有更长半衰期。因此，更低剂量和欠频繁的施用常常是可能的。修饰诸如脂质化可用于稳定化抗体及增强摄取和组织穿透（例如，进入脑）。用于抗体脂质化的方法被Cruikshank等人（(1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 14:193）描述。

2个序列之间的百分率同源性的确定可使用数学算法实现。优选的，2个序列的比较利用的数学算法的非限制性例是Karlin和Altschul的算法（1990）Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:2264-2268，在Karlin和Altschul（1993）Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 90:5873-5877中修饰。将该算法并入Altschul，等人（1990）J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，分值=100，字长=12进行而获得与本发明的核酸分子类似或同源的核苷酸序列。为了为比较目的获得空位的比对，可如描述于Altschul等人（1997）Nucleic Acids Res.25:3389-3402用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序（例如，XBLAST和NBLAST）的默认参数。见http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov。

2个序列之间的百分率同一性可使用类似于上述那些的技术，允许或不允许间隔测定。在计算百分率同一性中，一般计数完全匹配。

优选地，本发明的融合蛋白产生由标准物重组DNA技术。例如，DNA片段编码不同多肽序列，例如通过采用连接用钝端或交错端，限制酶消化框内连接在一起根据常规技术，以提供用于适当的末端，适当补平粘着端，碱性磷酸酶处理，以避免不期望的接合，及酶促连接。在另一实施方式中，融合基因可由常规技术包括自动化的DNA合成仪合成。可使用用于多克隆和单克隆抗体制备的标准技术将分离的融合蛋白，或其部分或片段，用作免疫原，以产生结合融合蛋白的抗体。

可使用全长融合蛋白或，替代性地，本发明提供用作免疫原的融合蛋白的抗原性肽片段。融合蛋白的抗原性肽包含SEQ ID NO:2显示的氨基酸序列的至少8（优选10，15，20或30）个氨基酸残基，及包括融合蛋白表位，使得针对肽产生的抗体与融合蛋白形成特定免疫复合物。

本发明也提供含有人源化的对于CD133具有结合特异性的免疫球蛋白的可变区的多肽。特别是，本发明也涉及含有人源化的对于CD133具有结合特异性的免疫球蛋白片段的本发明的融合蛋白的多肽，其中免疫球蛋白包含非人来源（例如，啮齿动物）和至少部分人来源的免疫球蛋白（例如，人框架区，γ类型的人恒定区）的抗原结合区。

在一些实施方式中，本发明的多肽可还包括全部或部分人来源的恒定区，例如，全部或部分人重链恒定区和/或人轻链恒定区。而且，本发明的多肽可包含包括具有一个或更多突变，例如，减少与Fc受体结合和/或固定补体的能力的一个或更多突变的全部或部分人恒定区的人源化的免疫球蛋白。

融合蛋白免疫原可用于通过用所述免疫原免疫适合的受试者，例如，兔，山羊，小鼠或其他哺乳动物来制备抗体。适合的受试者用免疫原性融合蛋白制备物的免疫诱导多克隆抗-融合蛋白抗体应答。因此，本发明的另一方面属于抗-融合蛋白抗体。

多克隆抗-融合蛋白抗体可通过用融合蛋白免疫原免疫适合的受试者来制备。针对融合蛋白的抗体分子可从哺乳动物（例如，自血）分离，并由良好知道的技术，诸如蛋白A层析进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫之后适当的时间时，可从受试者得到抗体-产生细胞及用于由标准技术，诸如杂交瘤技术描述的由Kohler和Milstein（1975）Nature 256:495-497，人B细胞杂交瘤技术（Kozbor等人（1983）Immunol Today 4:72），或EBV-杂交瘤技术（Cole等人（1985），Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）制备单克隆抗体。

【重组表达载体和宿主细胞】

本发明的另一方面属于载体，优选表达载体，其含有编码融合蛋白（或其部分）的核酸。

如本文所用，术语"载体"指称能运输已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是"质粒"，其指称可连接另外的DNA段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA段连接到病毒基因组。载体可能在导入它们的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制原点和附加型哺乳动物载体的细菌载体）。将其他载体（例如，非-附加型哺乳动物载体）在导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组，及由此随着宿主基因组复制。而且，特定载体能指导它们可操作地连接的基因的表达。一般而言，重组DNA技术中实用的表达载体优选是质粒（载体）形式。但是，本发明也包括该其他形式的表达载体，诸如病毒载体（例如，复制缺陷型反转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒）。

本发明的重组表达载体包含适合于核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明的核酸。因此，重组表达载体包括一个或更多调控序列，基于待对于表达使用的宿主细胞选择的，其可操作地连接到待表达的核酸序列。

在重组表达载体之内，"可操作地连接的"旨在表示目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接到调控序列（例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞时，在宿主细胞中）。

术语"调控序列"旨在包括启动子，增强子和其他表达控制元件（例如，多聚腺苷酸化信号）。该调控序列，例如，描述于Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成性表达的那些，和仅在特定宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些（例如，组织-特异性调控序列）。可将本发明的表达载体导入宿主细胞，由此产生由本发明的核酸编码的融合蛋白或肽。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核生物或真核生物细胞，例如，细菌细胞诸如大肠埃希氏菌（E.coli），昆虫细胞（使用杆状病毒表达载体），酵母细胞或哺乳动物细胞中融合蛋白的表达（Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990)）。或者，重组表达载体可，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶体外转录及翻译。

在原核生物中蛋白的表达可在大肠埃希氏菌（E.coli）中，用含有指导蛋白表达的组成性或诱导型启动子的载体进行。融合载体向其编码的蛋白添加许多氨基酸，通常添加到重组蛋白的氨基末端。该融合载体一般用于3个目的：（1）增加重组蛋白的表达；（2）增加重组蛋白的溶解度；及（3）通过作为亲和纯化中的配体而辅助重组蛋白的纯化。常常，在融合表达载体中，蛋白水解切割位点被导入融合部分和重组蛋白连接处，以致使在融合蛋白纯化后重组蛋白自融合部分的分离。该酶，及它们的同源识别序列，包括因子Xa，凝血酶和肠激酶。典型融合表达载体包括pGEX（Pharmacia Biotech Inc;Smith andJohnson(1988)Gene 67:31-40），pMAL（New England Biolabs,Beverly,Mass）和pRIT5（Pharmacia，Piscataway，N.J.），其分别将谷胱甘肽S-转移酶（GST），麦芽糖E结合蛋白，或蛋白A融合到靶重组融合蛋白。

适合的诱导性非-融合大肠埃希氏菌（E.coli）表达载体的例包括pTrc（Amann等人（1988）Gene 69:301-315）和pET 11d（Studier等人，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89）。自pTrc载体的靶基因表达依赖于自杂交体trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。自pET 11d载体的靶基因表达依赖于自T7gn10-lac融合启动子由共表达的病毒RNA聚合酶（T7gn1）介导的转录。此病毒聚合酶由自带有在lacUV5启动子转录控制下的T7gn1基因的居住性λ原噬菌体的宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)供给。

最大化在大肠埃希氏菌（E.coli）中重组蛋白表达的一个策略是在具有损伤的蛋白水解地切割重组蛋白的能力的细菌中表达蛋白（Gottesman,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)119-128）。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，从而用于各氨基酸的个体密码子是在大肠埃希氏菌（E.coli）中优先利用的那些（Wada et al.(1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118）。本发明的核酸序列的该改变可由标准DNA合成技术进行。

在另一实施方式中，本发明的融合蛋白表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母（S.cerevisiae）中表达的载体的例包括pYepSec1（Baldari et al.(1987)EMBO J.6:229-234），pMFa（Kurjan andHerskowitz,(1982)Cell 30:933-943），pJRY88（Schultz et al.(1987)Gene 54:113-123），pYES2（Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.），pGBT9（Clontech，Palo Alto，Calif.），pGAD10（Clontech，Palo Alto，Calif.），pYADE4和pYGAE2和pYPGE2（Brunelli andPall(1993)Yeast 9:1299-1308），pYPGE15（Brunelli and Pall(1993)Yeast 9:1309-1318），pACT11（Dr.S.E.Elledge,Baylor College ofMedicine），及picZ（InVitrogen Corp，San Diego，Calif.）。

或者，本发明的融合蛋白可在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体表达。在培养的昆虫细胞中表达蛋白可利用的杆状病毒载体包括pAc系列（Smith et al.(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165）和pVL系列（Lucklow and Summers(1989)Virology 170:31-39）。

在另一实施方式中，本发明的核酸在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体表达。哺乳动物表达载体的例包括pCDM8（Seed(1987)Nature 329:840），pCI（Promega）和pMT2PC（Kaufman et al.(1987)EMBO J.6:187-195）。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能常常由病毒调控元件提供。例如，通常使用的启动子源于多瘤病毒，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于用于原核生物和真核生物细胞的其他适合的表达系统，见Sambrook等人的第16和17章（见上）。

在另一实施方式中，重组哺乳动物表达载体能指导在特定细胞类型中核酸的优先表达。本领域知道组织-特异性调控元件。适合的组织-特异性启动子的非限制性例包括白蛋白启动子（肝-特异性；Pinkert etal.(1987)Genes Dev.1:268-277），淋巴样-特异性启动子（Calame和Eaton（1988）Adv.Immunol.43:235-275），尤其是T细胞受体（Winoto和Baltimore（1989）EMBO J.8:729-733）和免疫球蛋白（Banerji等人（1983）Cell 33:729-740;Queen and Baltimore(1983)Cell33:741-748）启动子。

本发明的另一方面属于已导入本发明的重组表达载体或本发明的分离的核酸分子的宿主细胞。术语不仅指称特定受试者细胞，但指称该细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响，特定修饰可在后代发生，该后代可不，实际上，与亲本细胞相同，但是仍包括在本文所用的术语的范围之内。

宿主细胞可为任何原核生物或真核生物细胞。例如，融合蛋白可在细菌细胞诸如大肠埃希氏菌（E.coli），昆虫细胞，酵母或哺乳动物细胞（诸如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）或COS细胞）中表达。

本发明的载体DNA或分离的核酸分子可经常规转化或转染技术导入原核生物或真核生物细胞。如本文所用，术语"转化"和"转染"旨在指称将外源核酸（例如，DNA）导入宿主细胞的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖-介导的转染，脂转染或电穿孔。对于转化或转染宿主细胞适合的方法可见于Sambrook，等人和其他实验室手册。

为了鉴定及选择这些整合体，通常将编码可选择的标记物（例如，对抗生素的抗性）的基因随着目标基因导入宿主细胞。优选的可选择的标记物包括赋予对药物，诸如G418，潮霉素和甲氨喋呤的抗性的那些。可将编码可选择的标记物的核酸在与编码融合蛋白的相同的载体上导入宿主细胞或可在分离的载体上导入。用导入的核酸稳定地转染的细胞可由药物选择鉴定。

本发明的宿主细胞，诸如培养中的原核生物或真核生物宿主细胞，可用于产生本发明的融合蛋白。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生融合蛋白的方法。在一实施方式中，所述方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞（已向其中导入编码融合蛋白的重组表达载体或分离的核酸分子），使得产生融合蛋白。在另一实施方式中，方法还包括从培养基或宿主细胞分离融合蛋白。

【药学组合物】

可将核酸分子和多肽（也在本文称之为"本发明的活性化合物"）合入适合于施用的药物组合物。该组合物一般包含核酸分子，融合蛋白，或抗体和药学可接受的载体。如本文所用语言"药学可接受的载体"包括溶剂，分散介质，包被，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，其是与药学施用相容。可将另外的活性化合物合入组合物。

本发明的药物组合物配制为与其旨在的施用途径相容。可优选的施用途径包括肠胃外，例如，静脉内或动脉内施用。用于肠胃外施用的溶液或悬浮液：无菌稀释剂诸如注射用水，盐溶液，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和张度调节剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调整。肠胃外制备物可包封进玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量瓶。

适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散剂和无菌可注射溶液或分散剂的临时制备用无菌粉。对静脉内施用，适合的载体包括生理学盐水，克列莫佛EL（BASF；Parsippany，N.J.）或磷酸盐缓冲液（PBS）。在全部情况中，组合物必需是无菌和应是流体至容易可注射性存在的程度。其必需制备和存储条件下是稳定的，和必需被保存免于微生物诸如细菌和真菌的混杂作用。

载体可为含有，例如，水，乙醇，多元醇（例如，甘油，丙二醇，及液体聚乙二醇），及其混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可，例如，通过使用包被诸如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持需要的粒径，及通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可由各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞，等达到。在许多情况中，在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇诸如甘露糖醇，山梨糖醇，氯化钠会是可优选的。

无菌可注射溶液可通过根据需要将活性化合物（例如，融合蛋白或抗-融合蛋白抗体）以需要的量在适当的溶剂中与以上列举的成分之一种或组合合并，之后是过滤的灭菌来制备。一般而言，分散剂通过将活性化合物合并到含有基本分散介质和自以上列举的那些的需要的其他成分的无菌媒质来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉的情况中，优选的制备方法是自其之前无菌过滤的溶液真空干燥及冷冻干燥，其产生活性成分加任何其他所需成分的粉。

配制剂量单元形式的口腔或肠胃外组合物对于容易施用和剂量均一性尤其有利。本文所用的剂量单元形式指称作为待处理受试者的单元剂型适合的物理学独立单元。各单元含有计算为产生与需要的药学载体关联的期望的治疗效果的预定量的活性化合物。

可将本发明的核酸分子插入载体及用作基因治疗载体。可将基因治疗载体由，例如，静脉内注射，局部施用（US-A 5,328,470）或由立体定向注射（见，例如，Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057）递送到受试者。

基因治疗载体的药学制备物可在可接受的稀释剂中包含基因治疗载体，或可包含嵌入基因递送媒质的慢释放基质。或者，其中可自重组体细胞完整产生的完全基因递送载体，例如反转录病毒载体，药学制备物可包括产生基因递送系统的一种或更多细胞。

药物组合物可与用于施用的使用说明一起包括在容器，包装或分注器中。

【发明的用途和方法】

本文所述的核酸分子，蛋白，蛋白同源物，及抗体可用于一种或更多以下方法：

（a）治疗方法（例如，治疗性和预防性）。

（b）筛选测定；

（c）预测性医学（例如，诊断测定，预后测定）。

融合蛋白与其他细胞蛋白相互作用，尤其是干细胞，且可由此由EPC分化为血管壁内皮细胞直接或由阳性调节因子的分泌间接用于改善治愈过程。

本发明的分离的核酸分子可用于表达融合蛋白（例如，在基因治疗应用中，在宿主细胞中，经重组表达载体）。此外，融合蛋白可用于筛选调节融合蛋白活性或表达的药物或化合物以及用于治疗病症。此外，本发明的抗-融合蛋白抗体可用于调节融合蛋白活性。

【治疗方法】

本发明提供治疗处于（或灵敏于）心血管病症的风险或具有与暴露的内皮下胶原关联的心血管病症的受试者的预防性和治疗性方法。

【预防性方法】

一方面，本发明提供受试者中预防与暴露的内皮下胶原关联的疾病或病情的方法。处于由暴露的内皮下胶原导致的或贡献的疾病的风险的受试者可由，例如，用鉴定处于心血管事件的风险的受试者的常规方法，诸如高LDL胆甾醇水平，动脉高血压，糖尿病，吸烟及由对于不稳定的动脉噬斑，诸如对比NMR成像中的噬斑增强的以往的及新生物标记，肌钙蛋白T和I或RGD肽来鉴定。

特别是，本发明的多肽对于治疗心血管疾病是有用的。特定心血管病症相关于使胶原暴露于血小板的内皮损伤。本发明的多肽可用于治疗该病症。这些病症包括动脉粥样硬化的全部并发症，诸如急性冠状综合征（诸如心肌梗塞）和急性或慢性脑血管病症，诸如瞬时缺血性发作（TIA）或中风，由经皮导管干预（PCI）和心脏手术的心脏和冠状干预。

而且，由造血干细胞与融合蛋白的预温育及骨髓胶原经融合蛋白的糖蛋白VI组分的结合，可改善由移植之后干细胞的骨髓再生。

【治疗性方法】

本发明的多肽可用于预防或治疗心血管疾病的治疗性方法。优选地，本发明的多肽以二聚体形式使用。尤其是，本发明的多肽可用于祖先细胞归巢而改善血管修复。

多肽施用的剂量方案依赖于待治疗的受试者的龄，重量，性别和病情。剂量可优选是0.01～2g的范围的本发明的多肽每患者/天。多肽可优选肠胃外施用。施用可为1～5次/天。

在一实施方式中，方法涉及施用与其他剂，或剂的组合组合的本发明的多肽。其他剂的例是GPVI-Fc，溶血栓剂诸如重组组织纤溶酶原活化物，抗-血小板剂，诸如ADP受体阻断剂（氯吡格雷，替格雷洛，坎格雷洛和其他），凝血酶拮抗剂（达比加群或其他），或因子X拮抗剂（诸如利伐沙班），或肝素。

【实施例】

【材料】

除了以下方法部分中提及的试剂盒和材料之外，使用以下物质。寡核苷酸购自Eurofins MWG Operon（Ebersberg，德国）。Herculase聚合酶（Stratagene，La Jolla，California）用于PCR扩增。细胞培养用培养基和PBS来自Biochrom（Berlin，德国）。化学品来自Roth（Karlsruhe，德国）和Sigma-Aldrich（Seelze，德国）。牛胶原I购自BD Biosciences（San Jose，California）。

【杂交瘤细胞系W6B3H10的轻和重链的可变序列的扩增和鉴定】

从4×10⁶和1.4×10⁷细胞的杂交瘤细胞系W6B3H10，使用OligotexDirect mRNA试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国），根据生产商的流程分离mRNA。取18μl分离的mRNA使用Superscript III试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，California）根据生产商的流程用于cDNA合成。为了扩增编码W6B3H10抗体的重和轻链的可变区的序列，测试不同引物组合：用于κ轻链可变序列扩增的Bi7/Bi5，Bi8/Bi5，用于γ重链可变序列的Bi3/Bi4，Bi3d/Bi4（引物描述于Dübel S et al，1994）。得到的条带自琼脂糖凝胶切下，使用GFX Gel条带纯化试剂盒（GE Healthcare,Piscataway,New Jersey）纯化，及用用于轻链测序的Bi5seq（5’GGGAAGATGGATCCAGTTG 3’；SEQ ID NO:7），Bi5fwd（5’CCATGTCCATGTCACTTG 3’；SEQ ID NO:8），及Bi5rev（5’GGTTTCTGTTGATACCAG 3’；SEQ ID NO:9）测序。重链序列用测序引物Bi4seq（5’CAGGGGCCAGTGGATAGA 3’；SEQ IDNO:10），Bi4fwd（5’CTGACCTGATGAAGCCTG 3’；SEQ IDNO:11），及Bi4rev（5’TTCACCCAGTGCACGTAG 3’；SEQ IDNO:12）获得。

【单链抗体及融合蛋白的表达和纯化】

编码单链抗体的DNA构建体由基因合成产生，并克隆（Geneart，Regensburg，德国）进哺乳动物表达载体pcDNA5-FRT（Invitrogen，Carlsbad，California）。使用Attractene（QIAGEN，Hilden，德国）或阳离子脂质体2000转染试剂（Invitrogen，Carlsbad，California）根据生产商的流程进行CHO细胞的瞬时转染。因为用构建体scFv-hl无表达可检测，且CHO细胞中scFv-lh的表达非常差，将两种构建体的DNA经NcoI/XhoI亚克隆进细菌表达载体pET22b(+)（Merck，Darmstadt，德国）。序列由测序控制，及使用这些DNA转化表达株BL21(DE3)的大肠埃希氏菌（E.coli）（Merck，Darmstadt，德国）。使用0.2mM IPTG诱导单链抗体的表达。蛋白的分离经Strep-Tactin亲和纯化（IBA BioTagnology，德国）根据生产商的流程进行。

编码pcDNA5-FRT中的scFv-lh-GPVI-FcIgG2的DNA构建体定购自Geneart（Regensburg，德国）。使用阳离子脂质体2000（Invitrogen，Carlsbad California）根据随附的流程产生稳定地表达的CHO细胞系。为产生更大尺度的融合蛋白，将CHO细胞在T500三重瓶（NUNC，Rochester，纽约）上培养。为了分离融合蛋白，收集细胞上清液，并使用1ml Hi Trap蛋白G HP柱（GE Healthcare,Piscataway,New Jersey）纯化。将分离的蛋白针对PBS透析o/n。

【由细胞ELISA测试单链抗体与在HEK 293细胞上表达的CD133抗原的结合】

将聚-L-赖氨酸96-孔板（BD Biosciences，San Jose，California）用CD133表达细胞系AC133/293如下包被。将0.2ml的培养基中的1×10⁵细胞加入各孔及o/n于37℃，5%CO₂温育，以允许细胞附接于板表面。次日将孔用0.2ml PBS洗涤一次及用0.1ml 2%多聚甲醛（在PBS中，pH7.4）于室温固定10～20min。将孔用PBS-T（PBS+0.1%吐温-20）洗涤及用1×RotiBlock或3%PBS-T中的乳于室温阻断1小时。用PBS-T洗涤之后，将相应抗体的系列稀释加入孔及于室温伴随振摇温育至少1小时。用PBS-T洗涤之后，添加0.1ml的StrepMAb-典型-HRP（在PBS-T中1:10000，Iba BioTagnology，德国）或辣根过氧化物酶连接的抗-小鼠IgG（在PBS-T中1:10000，Dianova，Hamburg，德国）及于室温伴随振摇温育1小时。用PBS-T洗涤之后，添加0.1ml的1-Step Ultra TMB-ELISA底物（ThermoScientific，Braunschweig，德国），及温育直到显影充足的蓝染色。为了停止反应，将0.1ml1M H₂SO₄加入各孔，和用无限F200平板读数仪（TECAN，Switzerland）在450nm和595nm处的吸光度作为参照测量。为了测试结合特异性，用300ng/ml（2nM）W6B3H10亲本mAb及增加量的竞争物蛋白进行竞争性ELISA。使用抗-小鼠IgG-HRP抗体（在PBS-T中的1:10000，Dianova，Hamburg，德国）检测信号。

【用固定的胶原I的结合ELISA】

将Immulon 2HB 96-孔板（NUNC，Rochester，纽约）用在15mMNa₂CO₃，35mM NaHCO₃，pH9.6中的0.1ml 1μg/ml牛胶原I o/n于4℃包被。将孔用PBS-T洗涤，用PBS-T中的0.1ml 1×RotiBlock(Roth，Karlsruhe，德国）阻断1小时，并在添加0.1ml的融合蛋白的3倍稀释之前再次洗涤。于室温伴随振摇温育1小时之后，将孔用PBS-T洗涤。孔将用在PBS-T中1:10000的0.1ml抗-人IgG-HRP（Dianova，Hamburg，德国）于室温伴随振摇温育1小时。将板用PBS-T洗涤及用0.1ml 1-步骤Ultra TMB-ELISA（PIERCE，Rockford，Illinois）温育。在足够显影蓝染色之后，通过添加0.1ml 1M H₂SO₄停止反应。在450nm和595nm处作为参照波长使用无限F200平板读数仪（TECAN，Switzerland）测量吸光度。用Sigma Plot 11使用Four Parameter Logistic计算EC₅₀值。

【在剪力下表达CD133的细胞粘接于胶原】

将玻璃载玻片用10μg/ml胶原I根据Langer et al（2005）包被及插入流室（Oligene，Berlin，德国）。将载玻片的胶原包被的表面用10μg/ml的融合蛋白预处理30min。为了显示结合的CD133依赖性，也将载玻片与W6B3H10mAb温育。添加AC133/293细胞，及在2000s^-1的剪力下温育。将实验磁带录像及离线评价。

【小鼠中的颈动脉结扎和由活体显微镜检的EPC粘接的评定】

从人脐带血分离CD133+细胞，如描述于（Bueltmann A et al，2003）。

为了评价融合蛋白对EPC体内募集的效应，我们使用活体荧光显微镜检如描述于（Massberg et al，2002）。在实验之前，将EPC用5-二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（DCF）染色及与融合蛋白（20μg/ml/100nM）或GPVI-Fc（15μg/ml/100nM）温育30min。将野生型C57BL/6J小鼠（Charles River Laboratories）通过咪达唑仑（5mg/kg体重；Ratiopharm），美托咪定（0.5mg/kg体重；Pfizer）和芬太尼（0.05mg/kg体重，CuraMed/Pharam GmbH）溶液的腹膜内注射来麻醉。将聚乙烯导管（Portex）移植进右颈静脉，并将荧光EPC（5×104/250μl）静脉内注射。游离解剖颈总动脉，及剧烈结扎5min，以诱导血管损伤。在血管损伤之前及之后，荧光EPC与损伤的血管壁的相互作用由颈总动脉的原位体内视频显微镜检，使用Zeiss Axiotech显微镜（20×水浸没物镜，W 20x/0.5；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.），用落射用100-W HBO汞灯可视化。通过计数在15s之内未动或自内皮表面分开的细胞来评定附着的EPC数。它们的数以细胞/mm²内皮表面给出。

【NOD/Scid小鼠中的心肌梗塞模型】

将NOD/Scid小鼠如上述麻醉。将管插入人工呼吸用气管。胸开口之后，将左降低冠状动脉用丝结扎45min。在由结扎开口辅助的再灌注之后，将胸部和气管缝合。立即然后和48小时后，将用融合蛋白（20μg/ml）或等摩尔量的Fc-对照蛋白预处理30min的分离的人CD34+祖先细胞通过尾静脉静脉内应用。另一对照组在手术之后未获得任何祖先细胞。干预之后7d和28d通过超声波心动图记术测定分区变化（FAC），以评定左心室功能。随后处死小鼠，及由伊文斯蓝和TTC染色分析梗塞区尺寸。

【由CDR移植的小鼠单链抗体的人源化】

使源于小鼠序列的融合蛋白的单链部分由CDR移植经历人源化。作为原材料，使用带有用于单链抗体的序列的细菌表达载体pET22b-scFv-lh以及表达CD 133的HEK 293细胞系AC 133/293与HEK 293对照细胞一起。以下详细列出人源化过程中使用的方法。

【包装噬菌体显示库的流程】

【1．制备辅助噬菌体】

通过用不同稀释的辅助噬菌体于37℃感染对数期TG1细菌细胞30min及平铺在2TY板上的顶部琼脂来制备辅助噬菌体。将小噬斑在3mL液体2TY培养基中与TG1的30μL过夜培养物一起温育，并于37℃生长2h。将此培养物稀释于1L 2TY培养基，并生长1h。在加入卡那霉素至50μg/mL之后，将培养物于37℃生长16h。将细胞由离心（10min，以5000g）移出，和通过添加0.25vol的噬菌体沉淀剂来自上清液沉淀噬菌体。在冰上温育30min之后，通过以5000g离心10min，之后是将沉淀重悬浮于5mL PBS和通过0.22-μm滤器灭菌来收集噬菌体粒子。通过测定2TY板上噬斑-形成单元（pfu）数来用含有100μLTG1（饱和的培养物）和噬菌体稀释的顶部-琼脂层滴定辅助噬菌体。将噬菌体浓储物溶液稀释到1×10¹³pfu/mL及以小等份于-20℃存储。

【2．制备原库噬菌体】

通过用库甘油浓储物接种500ml 2TY-G和于37℃以250rpm振摇温育至在600nm处0.8～0.9的光密度来制备库噬菌体。将VCSM13辅助噬菌体加入培养物至5×10⁹pfu/ml的终浓度，并将培养物于37℃伴随振摇温育30min，然后伴随200rpm轻轻振摇温育30min，以允许噬菌体感染。通过以2,200g离心15min，并将沉淀重悬浮于相同的体积的2TY-AK来回收细胞。将此培养物于30℃伴随快速振摇（300rpm）温育过夜。将细胞通过以7000g于4℃离心15min来沉淀，并将含有噬菌体的上清液回收到预冷却的1L瓶。将0.3vol的噬菌体沉淀剂加入上清液，混合及在冰上温育1h，以允许噬菌体沉淀。将噬菌体通过以7000g在相同的瓶中于4℃离心15min两次来沉淀。移出尽可能多的上清液，并将沉淀重悬浮于8mL PBS。将噬菌体在更小管中以12,000g再离心10min，并将噬菌体不搅乱可呈现的细菌沉淀地经上清液回收。最终，通过用噬菌体浓储物的稀释物感染TG1细胞，平铺到2TY-AG，温育和呈现的氨苄西林抗性集落数的枚举来滴定噬菌体浓储物。然后将噬菌体以等份于4℃存储。

【淘选噬菌体显示库的流程】

微量滴定淘选板的孔用源于CD133表达AC133/293细胞的CD133-合并的膜制备物通过于37℃温育2小时直接包被，并用阻断缓冲剂（PBS含有2%乳）于4℃过夜阻断。将阻断的孔用0.1%PBST（含0.1～0.3%吐温20(V/V)的PBS）洗涤6次，并将等同体积的噬菌体库和4%PBSM的总体积0.5mL的混合物加入对照孔［预阻断的］。在第1轮的筛选期间，噬菌体粒子数应是至少100×高于库尺寸（例如，对于10¹⁰克隆的库，10¹²cfu）。第1轮之后多样性下降至10⁶，由此无随后轮的筛选的该需求。将板于室温温育30min，以阻断结合的位点。将输入的噬菌体混合物加入淘选孔［用靶蛋白包被的］，于室温温育60min及用PBSMT（含有2%乳的PBS）洗涤10～20次。通过用200μL酸性洗脱缓冲剂于室温温育5min来洗脱噬菌体。将含有噬菌体的上清液转移到新管及用Tris-HCl缓冲剂中和。将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）TG1的新鲜指数地生长的培养物用洗脱的噬菌体感染，和将它们的一半扩增用于进一步轮的选择。将余下的洗出液存储于4℃。

【质量控制噬菌体FACS的流程】

将AC133/293细胞收集到1ml含有5microM EDTA的PBS中（10μl的0.5M浓储物），立即混合，以防止凝集及保持在冰上。将细胞用FACS缓冲剂（补充了1%BSA或5%FBS及含有0.05%NaN₃的PBS）洗涤2～3×，并将自最终洗涤的细胞沉淀悬浮于50μl FACS缓冲剂。将10μl的噬菌体溶液加入50μl的细胞悬浮液，轻轻混合及在冰上温育30分钟。将细胞用FACS缓冲剂洗涤2～3×，及悬浮于50μl FACS缓冲剂。将10μl的抗体［兔抗-M13pAb-FITC］溶液加入50μl的细胞悬浮液，轻轻混合及在冰上温育30分钟。将细胞用FACS缓冲剂洗涤2～3×及悬浮于200～300μl FACS缓冲剂用于分析。

【由噬菌体FACS方法和Graphpad Prism 4.0软件的亲和性测量流程】

将显示目标scFv的噬菌体在测定之前标准化到相同的滴度，稀释到不同滴度及如上述测定。使用噬菌体FACS的输出用于逐步计算目标scFv的亲和性，如Graphpad Prism 4.0软件的用户手册中例示。

【人源化的融合蛋白的表达和纯化】

接收人源化的单链抗体克隆26的序列信息之后，将人源化的融合蛋白的序列虚拟组装及合成及克隆（Geneart，Regensburg，德国）进哺乳动物表达载体pcDNA5-FRT（Invitrogen，Carlsbad，California）。根据早先描述的流程开发稳定的细胞系，其中融合蛋白表达及分泌为CHO细胞的上清液，及使用1ml HiTrap蛋白G HP柱（GE Healthcare,Piscataway,New Jersey）纯化。分离的蛋白针对PBS透析o/n。

【由细胞ELISA的人源化的融合蛋白与HEK 293细胞上表达的CD133抗原的结合的测试】

上述方法除了聚-L-赖氨酸96-孔板用仅6～7×10⁴AC133/293细胞/孔包被之外。

【左颈总动脉结扎之后测定血小板聚集的活体显微镜检】

对于活体显微镜检实验，使用雄性C57Bl/6J小鼠。通过以120×g离心10min自1ml供体小鼠的柠檬酸盐血制备富含血小板的血浆，其已用Tyrodes缓冲剂pH6.5调至2ml。分离含有血小板的上清液，并将血小板通过添加20μl 5-羧基-二乙酸荧光素乙酰氧基甲基酯（Invitrogen）和于室温避光温育5min来荧光标记。将体积用TyrodespH6.5填充达4ml，并将血小板通过以900×g离心12min来沉积。将血小板分别重悬浮于250μl的Tyrodes pH6.5和Tyrodes pH7.4，等份计数，并将血小板数调整到2.8×10¹⁰/ml。将实验小鼠（24±2g）通过美托咪定（0.5mg/kg体重，Pfizer），咪达唑仑（5mg/kg体重，Roche）和芬太尼（0.05mg/kg体重，Janssen-Cilag）溶液的腹膜内注射麻醉。手术期间体温用恒温毯系统（Harvard Apparatus）维持恒定于38.5℃。将聚乙烯导管（Portex）移植进左尾静脉，及在左颈总动脉解剖之后，将250μl（7×10⁹）标记的血小板静脉内注射进尾静脉。随后静脉内应用1mg/kg体重的人源化的融合蛋白或等摩尔量的FcIgG2对照蛋白。将左总动脉用丝（7-0Prolene，Ethicon）剧烈结扎5min，以诱导血管损伤。使用有落射用100W HBO汞灯和s/w-CCD照相机BC71（HornImaging）的荧光显微镜（Axioskop 2FS mot，Carl Zeiss）在结扎之后以不同时间间隔监控结扎区。通过用Photoshop CS5软件分析3个固定的-像的平均值来测定血小板聚集物，其中以像素测量由血小板聚集物产生的更高光强度的区的尺寸，然后使用定义的网格转化为μm²。

【结果和讨论】

【编码单克隆抗体W6B3H10的可变序列的鉴定和构建体设计】

PCR之后扩增，其用各引物组合产生产物，自凝胶切下条带，纯化及测序。组装源于用3种不同引物测序的序列各（图1）及使用NCBI（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）的IGBlast与IgG数据库比较。

为了建立用于2种可能的取向“轻-重”或“重-轻”的单链抗体（scFv）的序列，自数据库V-Base（见http:∥vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk）随机选择各前导序列，以辅助抗体分泌进哺乳动物细胞培养的培养基。

重和轻链的序列由编码Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser的Gly-Ser接头（SEQ ID NO:13）连接。为了允许通过亲和纯化分离单链抗体，在C-末端添加编码Strep Tag II的序列。建立的命名为scFv-lh和scFv-hl的构建体序列显示于图2。

【单链抗体的表达和结合CD133的测试】

CHO细胞用单链构建体瞬时转染之后，可用scFv-lh检测弱表达（见图3）。

大规模转染之后，可分离足够的蛋白用于对于细胞ELISA中结合CD133测试。于此并行，蛋白也在大肠埃希氏菌（E.coli）中表达，用于足够的浓储物产生。产生ScFv-hl，其可不在CHO细胞中表达，并自大肠埃希氏菌（E.coli）单独纯化。（见图4）。

为了测试是否单链抗体识别它们的抗原CD133，将单链抗体的3倍稀释系列在固定的AC133/293细胞上温育，使CD133抗原在它们的表面表达。然而在低nM范围有清楚的scFv-lh以高亲和性的结合，意外地，未检测到scFv-hl对CD133的亲和性（见图5A）。

此发现不是由于不同表达系统，因为自大肠埃希氏菌（E.coli）纯化的scFv-lh与自哺乳动物细胞培养分离的scFv-lh显示相同的结合特征。

为了测试scFv-lh与CD133相互作用的特异性，使2nM的W6B3H10mAb与固定的AC133/293细胞上的CD133的结合与增加量的单链抗体竞争。此明显展示，scFv-lh可以3.1nM的IC50值有效阻断单克隆抗体与抗原CD133的结合（图5B），此意外地高亲和性可为由于分子的更小得多的尺寸，这使得对于scFv-lh的固定的CD133相比对于更大mAb的更可接近。

【融合蛋白的设计，表达和表征】

作为用于融合蛋白的成分鉴定scFv-lh之后，选择GPVI-FcIgG2作为双功能蛋白的第2部分。而GPVI应介导与胶原结合，将IgG2的Fc部分选择为一方面辅助亲和纯化及另一方面避免与更通常使用的FcIgG1关联的不期望的效应子功能。因此，以单链抗体组分scFv-lh之后是可溶性糖蛋白VI和FcIgG2的方式设计融合蛋白，其由用于更柔性的3个氨基酸GGR-接头分离（图6）。

在T500三重瓶上在稳定地转染的CHO细胞的粘接培养物中表达融合蛋白。使用蛋白G亲和层析纯化上清液。融合蛋白的典型产率在2～2.7mg/l范围内。

蛋白的鉴定和纯度由使用连接到辣根过氧化物酶的抗-人IgG抗体的蛋白印迹（数据不显示的）及由考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶控制（图7）。

在还原性条件下融合蛋白的分离产生约90kD的条带尺寸。在非-还原性条件下的分子质量是大致180kD，其明显显示蛋白作为二聚体存在。

79.1kD的单体蛋白的理论分子质量显示，其必需翻译后修饰，最很可能由糖基化。

对于血小板糖蛋白VI，仅在氨基酸92描述一个N-联糖基化位点（Kunicki et al，2005）。单链抗体部分无用于N-联糖基化的共有序列，然而IgG2的Fc-部分也带有一个N-联糖基化位点。因为这2个糖基化位点不足以解释观察到的尺寸差异，融合蛋白可含有另外的O-联糖基化位点。

【融合蛋白与CD133和胶原的结合特征】

由ELISA用固定的AC133/293细胞比较融合蛋白及W6B3H10mAb与CD133的结合（图8A）。观察到的对于融合蛋白是0.21nM及对于W6B3H10mAb是0.12nM的EC50值在相同的数量级。由此融合蛋白与抗原CD133的结合性质相比单链抗体改善了，其可仅部分由融合蛋白的二聚化解释，其导致类似于见于全尺寸抗体的情况的2个同一抗原结合位点。

单链多肽随后的GPVI-FcIgG2多肽可对单链抗体部分的3维结构具有一些稳定化效应，这似乎是有益于抗原结合。为了确认结合的特异性，用2nM W6B3H10mAb及增加量的融合蛋白进行竞争性ELISA。mAb与固定的AC133/293细胞的结合的有效抑制确认结合由CD133介导（见图8B）。

也显示融合蛋白与其第2结合偶体胶原I的结合。在用固定的胶原I的ELISA中，将融合蛋白的结合与GPVI-FcIgG1的结合比较。对于二者，可观察到剂量依赖性结合，但意外地，结合亲和力不同（图9A）。融合蛋白与胶原的结合特异性由与可溶性胶原I的竞争性ELISA确认（图9B）。

【在动态条件下融合蛋白的双特异性结合】

在之前实验中，独立地展示融合蛋白与各其结合偶体的结合。为了通过同时结合两种靶蛋白确认分子的双官能性，将玻璃载玻片用10μg/ml胶原I包被，插入到流室，与10μg/ml的融合蛋白预温育及与表达CD133的AC133/293细胞在2000/s的剪力下温育，模拟人血流中存在的条件。此实验展示，融合蛋白非常有效介导CD133表达细胞与胶原的结合，甚至在剪力下。

结合可由添加亲本W6B3H10mAb逆转，这显示AC133/293细胞固定到胶原表面是CD133-依赖性的（图10）。

【EPC与损伤的血管的体内结合】

为了测试是否表达CD133的EPC可被有效募集及附接到损伤的血管壁，将EPC从人脐带血分离，荧光标记及与融合或对照蛋白GPVI-Fc预温育，然后静脉内应用到麻醉的小鼠的颈静脉。在颈动脉血管壁损伤之后，以增加的时间间隔对附接的EPC数计数。这明显显示，融合蛋白相比对照蛋白显著增加附接的EPC数，在损伤之后5min细胞达最高数，但在60min之后仍有显著细胞数（图11）。

EPC与对照蛋白的预温育也导致显著的量的附着的EPC的观察可被建立的EPC粘附于由血小板介导的血管损伤位点的发现所解释（Abou-Saleh et al，2009）。与融合蛋白的预温育可在具有对于冠状动脉疾病的危险因素的患者中尤其有益，其中循环EPC数是低且其可由同种异体EPC移植或由离体扩展的自体EPC移植物治疗。

【融合蛋白对NOD/Scid小鼠中心肌梗塞模型中左心室功能和梗塞区的影响】

在NOD/Scid小鼠中由左降低冠状动脉的结扎诱导梗塞。由超声波心动图记术及由处死之后心脏的染色来分析用20μg/ml的融合蛋白预处理的CD34+祖先细胞的应用对左心室功能和梗塞区尺寸的效应。然而在手术之后7d无可观察到对左心室功能的效应，在第28天，相比未用祖先细胞处理的动物和用与Fc对照温育的祖先细胞处理的动物，显著差异显而易见（见图12A）。融合蛋白处理也导致梗塞区尺寸的显著减小，如显示于图12B。成为观察的正面效应的基础的机理迄今未鉴定。许多动物研究显示，移入用于心肌修复的仅小部分的干细胞分化为心肌细胞或血管细胞，但其推定，观察的心脏改善可由营养支持或由祖先细胞分泌的旁分泌因子导致，且其可对相邻细胞具有有益效应或活化居住性心脏干细胞（Greco&Laughln，2010）。

【表达人源化的sc-抗体的噬菌体的表征】

由CDR移植的抗体人源化过程，由此CDR序列转移到人亚组共有（H-SubI-κ和H-SubI-VH）受体框架序列，导致具有对膜结合的CD133的显著亲和性的3个噬菌体克隆（26，27，29）的鉴定。噬菌体稀释系列的FACS测量显示，对于克隆26是32.19pM的KD（平均荧光指标），且对于克隆27和29分别是50.78pM和102.9pM的KD（图13A，13B）。与此相比，带有原小鼠单链抗体的噬菌体在2个独立实验中显示25.63和26.93pM的KD。使用在线工具（http:∥www.bioinf.org.uk/ab/shab/）评定克隆26的VL和VH序列相比小鼠供体和人受体序列的那些的人性显示向人受体序列的值的Z-分值移位（见图14），其确认人源化的序列的更人样特征。此也可展示，通过比较小鼠或人源化的单链抗体的蛋白序列与人受体序列（见图15）。人源化的抗体显示76%的序列同一性，差异主要由于不同互补决定区，然而小鼠单链抗体相比人受体序列是仅在氨基酸序列的59%同一性。在两个比对中，忽略连接的接头肽序列。具有亲本分子的氨基酸序列的人源化的融合蛋白与小鼠来源的单链部分的核苷酸序列的比对导致95%的序列同一性（见图16）。

【人源化的融合蛋白的产生和其表达和表征】

选择与膜结合的CD133显示最高亲和性的人源化的单链抗体（克隆26）的序列，其相比小鼠单链序列在相同的数量级，以建立人源化的融合蛋白hscFv-lh-GPVI-Fc（见图16）。由稳定地转染的CHO细胞系产生一批蛋白，并自细胞上清液由蛋白G亲和层析纯化。由用抗-人IgG抗体的蛋白印迹确认蛋白的鉴定，所述抗体与融合蛋白的Fc片段结合。在用考马斯亮蓝染料染色的聚丙烯酰胺凝胶中控制纯度。在还原及非-还原性条件下，人源化的融合蛋白与具有小鼠单链部分的融合蛋白呈现相同的迁移行为（见图18）。因此，其最可能是，人源化过程未关于翻译后修饰如糖基化模式或分子的二聚化改变融合蛋白。

【人源化的融合蛋白与CD133抗原和胶原的结合的测试】

将通过用固定的细胞的细胞ELISA的人源化的融合蛋白与稳定的细胞系AC133/293上的跨膜蛋白CD133的结合与亲本融合蛋白的结合比较（图19）。用Sigma Plot 11.0计算的两种分子的EC50在相同的0.25～0.3nM的范围。用2nM W6B3H10mAb和融合蛋白作为竞争物的竞争ELISA确认了结合特异性，及显示对于人源化的和小鼠融合蛋白分别2.7和3.1nM的IC50值。融合蛋白的人源化应不改变其GPVI部分与胶原I的结合性质。为了证明此推定，由ELISA用固定的牛胶原I测量结合。可用对于人源化的和亲本融合蛋白分别4.7和6.3nM的EC50值显示两种蛋白的剂量-依赖性结合（见图20）。

【在小鼠模型中颈总动脉损伤之后人源化的融合蛋白对血小板聚集的体内效应】

为了测试是否人源化的融合蛋白在颈总动脉损伤之后对血小板聚集具有任何影响，静脉内施用供体小鼠的荧光标记的血小板，之后是输注1mg/kg的人源化的融合蛋白或等摩尔量的Fc-对照蛋白和立即血管结扎。直到结扎之后60min形成的血小板聚集物尺寸的确定显示用人源化的融合蛋白处理的组和对照组之间高度显著差异（p<0.005，Student氏t检验）见图23)，确认人源化的融合蛋白与血小板结合的GPVI就体内胶原结合竞争的能力，其进而导致降低的血小板活化及聚集形成。

【参考文献】

Abou-Saleh H,Yacoub D,JF,Gillis MA,Neagoe PE,Labarthe B,Théroux P,Sirois MG,Tabrizian M,Thorin E,Merhi Y,Endothelial progenitor cells bind and inhibit platelet function andthrombus formation,Circulation 120(2009),2230-2239

Bueltmann A,Gawaz M,Münch G,Ungerer M,Massberg S,Immunoadhesin comprising a glycoprotein VI domain,WO03104282(2003)

Dübel S,Breitling F,Fuchs P,Zewe M,Gotter S,Welschof M,Moldenhauer G,Little MJ,Isolation of IgG antibody Fv-DNA fromvarious mouse and rat hybridoma cell lines using the polymerasechain reaction with a simple set of primers.Immunol Methods 175(1994),89-95.

Greco N&Laughln MJ,Umbilical cord blood stem cells formyocardial repair and regeneration.Methods Mol Biol.660(2010),29-52.

Kunicki TJ,Cheli Y,Moroi M,Furihata K,The influence ofN-linked glycosylation on the function of platelet glycoprotein VI,Blood 106(2005),2744-2749

Langer H,May AE,Bültmann A,Gawaz M,ADAM 15is anadhesion receptor for platelet GPIIb-IIIa and induces plateletactivation,Thromb Haemost.94,(2005),555-61

Massberg S,Brand K,Grüner S,Page S,Müller E,Müller I,Bergmeier W,Richter T,Lorenz M,Konrad I,Nieswandt B,Gawaz M,A criticalrole of platelet adhesion in the initiation of atheroscleroticlesion formation,J.Exp.Med.196(2002),887-896

Moroi M&Jung SM,Platelet glycoprotein VI:its structure andfunction,Thromb Res.114,(2004),221-33.

Claims (12)

1.分离的核酸分子，其选自：

i.由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其补体具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的核酸分子；以及

ii.编码由与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子；

其中所述核酸分子编码的多肽能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合，且

其中所述核酸分子编码的多肽包含：

SEQ ID NO：25所示的CDR-L1，

SEQ ID NO：26所示的CDR-L2，

SEQ ID NO：27所示的CDR-L3，

SEQ ID NO：28所示的CDR-H1，

SEQ ID NO：29所示的CDR-H2，

SEQ ID NO：30所示的CDR-H3。

2.权利要求1的核酸分子，其选自：

(a)由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的核酸；以及

(b)编码由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子。

3.核酸分子，其由权利要求1或2的核酸分子和载体核酸序列组成。

4.宿主细胞，其含有权利要求1～3之任一项的核酸分子。

5.能同时和选择性地与胶原和CD133蛋白结合的多肽，其选自：

(a)由以下核酸分子编码的多肽，所述核酸分子由与由SEQ IDNO:1的核苷酸序列组成的核酸或其补体具有至少99％同一性的核苷酸序列组成；以及

(b)由与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的多肽，

其中所述多肽包含：

SEQ ID NO：25所示的CDR-L1，

SEQ ID NO：26所示的CDR-L2，

SEQ ID NO：27所示的CDR-L3，

SEQ ID NO：28所示的CDR-H1，

SEQ ID NO：29所示的CDR-H2，

SEQ ID NO：30所示的CDR-H3。

6.权利要求5的多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

7.由权利要求5定义的多肽，其包含源于人来源的免疫球蛋白的免疫球蛋白框架区。

8.权利要求5～7之任一项的多肽，其是二聚体。

9.产生由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽的方法，所述方法包括在核酸分子表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞。

10.药物组合物，其包含权利要求5～8之任一项的多肽。

11.权利要求5～8之任一项的多肽用于制备诊断心血管疾病的制剂的用途。

12.权利要求5～8之任一项的多肽用于制备预防或治疗心血管疾病的药物的用途。