EA023016B1

EA023016B1 - Составной белок

Info

Publication number: EA023016B1
Application number: EA201201234A
Authority: EA
Inventors: Майнрад Гавац; Таня Шёнбергер; Хайдрун Деген; Гётц Мюнх; Ханс-Петер Хольтхофф; Андреас Бюльтманн; Ханс-Йёрг Бюринг; Кристоф Ледер
Original assignee: Эдванскор Гмбх
Priority date: 2010-04-07
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2016-04-29
Also published as: EP2556092A1; ZA201207425B; CN102906116A; AU2011238084B2; CN102906116B; WO2011124370A1; AU2011238084A1; CA2795142A1; EP2377888A1; US20130130315A1; JP2013532954A; EA201201234A1

Abstract

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, к которой относятся: vi. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; vii. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; viii. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную SEQ ID NO: 2; ix. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2; и х. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий гуманизированный иммуноглобулин или части иммуноглобулина, имеющие специфичность связывания с CD133; молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45°С в 6,0×SSC с последующим промыванием в 0,2×SSC/0,1% SDS при 65°С.

Description

Область изобретения

Изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты и полипептида, способных одновременно и избирательно связываться с коллагеном и СЭ133 белком. Настоящее изобретение также касается клеткихозяина, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение касается способа получения полипептида согласно изобретению. Полипептид может применяться для профилактики, лечения или диагностики сердечно-сосудистого заболевания. Соответственно, настоящее изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, который предпочтительно является димером.

Уровень техники

Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) находятся в костном мозге и высвобождаются в кровоток, где они принимают участие в гемостазе и восстановлении тканей. СГО133 белок, трансмембранный гликопротеин пентаспан, экспрессируется на поверхности ЕРС, и, таким образом, экспрессия подавляется после дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки. СГО133 не экспрессируется ни на каком другом типе клеток крови, что делает его привлекательным объектом для рекрутинга ЕРС.

Биспецифический белок, способный привлекать эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) к местам повреждений сосудов, известен из документа АО 2008/101700. Белок, описанный в документе АО 2008/101700, содержит компонент, способный связываться с СЭ133 на ЕРС с высокой аффинностью. Кроме того, белок, описанный в документе АО 2008/101700, содержит компонент, способный распознавать и связываться с местами повреждений в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов. Согласно документу АО 2008/101700, белок получают путем связывания первого белка, способного к связыванию с эндотелиальными клетками-предшественниками, и второго белка, способного к связыванию с коллагеном.

Первый и второй белки связывают с использованием 8ΡΌΡ (Ν-сукцинимидил 3-(2пиридилдитио)пропионата), который является гетеробифункциональным сшивающим агентом. Поскольку первый белок содержит около 25 лизиновых остатков, реагирующих с 8ΡΌΡ, а второй белок содержит около 18 лизиновых остатков, количество возможных димерных продуктов составляет как минимум 450 (18x25). Кроме того, нельзя избежать образования высших олигомеров. Соответственно, сшитый продукт содержит гетерогенную смесь продуктов. При этом смесь не содержит какого бы то ни было составного белка из первого и второго белков, поскольку продукты не образуются путем соединения двух или большего количества генов, кодирующих первый и второй белки.

Соответственно, ни один из продуктов, получаемых согласно документу АО 2008/101700, не может рассматриваться как продукт трансляции составного гена или как отдельный полипептид с функциональными качествами, унаследованными от каждого из исходных белков.

Смесь белков, описанная в документе АО 2008/101700, неприемлема для применения в качестве медикамента, поскольку эта смесь не может обеспечиваться со стандартизированным и определенным составом и достаточной степенью чистоты для терапевтического применения. Кроме того, поскольку олигомеров невозможно избежать, выход и эффективность смеси согласно документу АО 2008/101700 представляют проблему.

С другой стороны, при попытках получения составного белка, содержащего полипептидные последовательности, присутствующие в смеси согласно документу АО 2008/101700, не удалось связать второй белок, способный избирательно и одновременно связываться с эндотелиальными клеткамипредшественниками и коллагеном.

Краткое описание изобретения

Таким образом цель настоящего изобретения состоит в обеспечении полипептида малого размера, способного одновременно и избирательно связываться с коллагеном и СЭ133 белком, благодаря чему белок может быть получен с большим выходом и высокой степенью чистоты, позволяющей применять его в фармацевтической композиции для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки стенок сосудов или посредством секреции положительных модулирующих факторов.

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный составной белок. Составной белок может применяться для лечения или профилактики сердечнососудистого заболевания путем хоминга ЕРС к открытому коллагену или для диагностических целей.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, к которой относятся:

ΐ. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО ΝΟ: 1 или ее комплемента;

ΐΐ. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО ΝΟ: 1 или ее комплемента;

ίίί. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную 8ЕО ГО ΝΟ: 2;

ίν. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот 8ЕО ГО ΝΟ: 2; и

- 1 023016

ν. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45°С в 6,0х§§С с последующим промыванием в 0,2х§§С/0,1% 8Ό8 при 65°С.

Нуклеиново-кислотная последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 представлена ниже АТООАААССССТОСТСАОСТОСТОТТССТОСТОСТОСТОТООСТОССТОАСА ССАССООСОАСАТССТОАТОАСССАОТСССССААОТССАТОТССАТОТСССТ ОООСОАОАОАОТОАСССТОТССТОСААООССТССОАОААСОТООАСАССТА СОТОТССТООТАТСАОСАОААОССТСАОСАОТССССТААООТОСТОАТСТАС ООСОССТССААСАОАТАСАССООСОТОСССОАСАОАТТСАССООСТССООСТ ССОССАССОАСТТСТСССТОАССАТСТССААСОТОСАООССОАООАССТОСС СОАТТАССАСТОСООССАОТССТАСАОАТАСССТСТОАССТТСООСОСТООС АСАААОСТООААСТОААОООСООАООСООААОТООАООСООАООАТСТОО СООСООАООСТСТОААОТОСАОСТОСАОСАОТССООСССТОАССТОАТОАА ОССТООСОССТССОТОААОАТСТСТТОСААООССАОСООСТАСТССТТСАСС ААСТАСТАСОТОСАСТОООТОАААСАОТСССТООАСААОТСССТООААТОО АТСООСТАСОТООАСССТТТСААСООСОАСТТСААСТАСААССАОААОТТСА АООАСААООССАСССТОАССОТООАСААОТСТАОСТССАССОССТАСАТОС АССТОТССТСССТОАССТССОАСОАСТССОССОТОТАСТАСТОТОССАОАОО СООССТОбАТТООТАСОАСАССТССТАСТООТАСТТСОАСОТОТООООСОСТ ОСААССОСТОТСАСССТОТССТСССАОТСТОССССТСТОССТААОССТТСССТ ССАООСССТОССТТССТСССТООТОССТСТООААААОССАОТОАСССТОСОО ТОТСАОООАССТССТООСОТООАССТОТАССООСТООААААОСТОТССТССА ОСАОАТАССАООАССАООССОТОСТОТТСАТСССТОССАТОААОСООТСССТ ООССООСАООТАСАаОТОСТССТАССАОААСООСТСССТОТООТСТСТОССТ ТССОАССАОСТООААСТООТСОССАСАООСОТОТТСОССААОССТТСТСТОТ СТОСССАОССТОССССТОСТОТОТССТСТООСООСОАСОТОАСССТОСАОТО ССАОАССАОАТАСООСТТСОАССАОТТСОСССТСТАСАААОАОССССАССС АСССССТТАСААОААСССТОАОСООТООТАСАОООССТССТТСССТАТСАТС АССОТСАССОССОСТСАСТСССОААССТАССООТОСТАСАОСТТСТССТССС аООАСССТТАССТОТООТССОССССТАОСОАСССТСТООААСТООТООТСАС СООСАССТССОТОАССССТТССАООСТОССТАССОАОССТССТАОСТССОТО ОССОАОТТСТСТОАООССАССОССОАОСТОАССОТОТСТТТСАССААСААОО ТОТТСАССАССОАОАСАТСССООТССАТСАССАССТСССССАААСАОТССОА СТСТССТСССООСССТССТСОССАОТАСТАСАССААОООСААСООСООСАОА ОТООАОТОТССТССТТОСССТОССССТССТСТООСТООСССТТССОТОТТССТ ОТТСССТССАААОССТААООАСАСССТОАТОАТСТСССООАССССТОААОТО АССТОСОТОСТООТООАСОТОТСССАСОАООАСССТОАООТССАСТТСААТТ ООТАСОТООАСООСОТООАООТаСАСААСОССААОАССААОССТСОООАОО ААСАОТТСААСТССАССТТССОСОТООТСТСТОТОСТОАССОТООТОСАССА ООАСТООСТОААСООСАААОААТАСААОТОСААООТаТССААСААОООССТ ОССТОССССТАТСОААААОАССАТСАОСААОАССААОООАСАОССТСОСОА

ОССТСАССТСТАСАСССТСССАСССАСССОССАОСАААТОАССААОААССА

ОаТОТСССТОАССТОССТООТСААОООСТТСТАСССТТССОАТАТСОССОТО

ОАОТОООАОТСТААСООССАОССТОАОААСААСТАСААСАССАССССТССТ

АТОСТООАСТССОАСОССТССТТСТТССТОТАСТССАААСТОАСАОТООАТА

АСТСССООТООСАОСАОООСААСОТОТТСТССТОСТСТОТОАТОСАСОАООС

ССТОСАСААССАСТАТАСССАОААСТСССТОТСССТОТСТССССССААО

Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает полипептид, способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и СГО133 белком, выбранный из группы, к которой относятся:

a) фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 2, причем фрагмент включает как минимум 600 заменимых аминокислот §ЕЦ ГО N0: 2;

b) вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 2, причем вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 или ее комплемент, в условиях

- 2 023016 инкубации при 45°С в 6,0х§§С с последующим промыванием в 0,2х§§С/0,1% δΌδ при 65°С;

с) полипептид, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1 или ее комплемента; и

б) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична 8ЕЦ ГО N0: 2.

Полипептид согласно третьему аспекту предпочтителен для применения в профилактике или лечении сердечно-сосудистого заболевания.

Аминокислотная последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2 представлена ниже

МЕТРА0ЬЬРЬЬЬЬ\УЬРОТТОМЬМТ08РК5М5МЗЬОЕКУТЕ8СКАЗЕНУОТУУЗ νΥ00ΚΡΕ05ΡΚνΠΥΟΑ5ΝΕΥΤθνΡΟΕΡΤΟ3Ο3ΑΤΟΡ8ΕΤΙ3Νν0ΑΕΟΕΑΟΥΗ€

СОЗУКУРЕТРОАОТКЕЕЬКОООСЗООООЗОООСЗЕУОЕООЗОРОЕМКРОАЗУ

ΚΙ80ΚΑ8ΟΥ8ΡΤΝΥΥνΗ\ννΚ08ΕΟΚ8ΕΕ\νΐΟΥνθΡΡΝθηΡΝΥΝ<3ΚΡΚΟΚΑΤΕΤ

УОКЗЗЗТЛ ΥΜΗΕ38ΕΤ8ΕΟ3Λ V ΥΥΕ ΑΙΐΟΟΕΟ\νΥΓ}Τ3 ΥΨΥΡΟ У\У(ЗЛОТА УТУЗ

808ОРЕРКР8Е0АЬР88ЕУРЕЕКРУТЕКС0ОРРОУОЕУКЕЕКЬ888КУ0О0АУЕР1

Ι'ΛΜΚΚ3ΕΛΟΙ<ΥΓίί'3Υ()Ν(ί5Ε\ν3Ι,Ρ5Β0[.ΚΕνΑΊθνΡΛΚΡ8Ε3Α0Ρ(;ΡΑν83ΟΟ ϋνΤΙ.000ΤΚΥΟΡΟ0ΓΑΙ.ΥΚΕΟΟΡΑΡΥΚ.ΝΡΕΚλνΥΚΑ5ΡΡΙΙΤνΤΑΑΗ5ΟΤΥΚεΥ8

Γ33Κ.Ε>ΡΥΤ.’'Λ⁷3ΑΡ3ΟΡΙ_Ε[_ννΤΟΤ3νΤΡ8ΗΙ_ΡΤΓΡΡ83νΑΕΓ3ΕΑΤΑΕΕΤν3ΡΤΝΚΆ'

РТТЕТ8К51ТТЗРКЕ5О5РАСРАК<УУУТКО]ЧССКУЕСРРСРАРРУАОР8УРЕРРРК

ΡΚΌΤΕΜΙ8ΚΤΡΕνΤθνννπν8ΗΕΟΡΕν(3ΡΝ\νΥνθθνΕνΗΝΑΚΤΚΡί{ΕΕς>ΡΝ8Τ

ΡΚννδνΕΤννΗ(30νΕΝ0ΚΕΥΚ<;κν3ΝΚ0ΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΤΚ0ς>ΡΚΕΡ<3νΥΤΕΡΡ δΚΕΕΜΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδϋΙΑνΕΨΕδΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡΜΕΟδηΟδΡΡΕΥ

8ΚΕΤνυΚ8ΡΥΑ)<χ;Νν['8Ο8νΜ[ΙΕΑΐ,ΗΝΙΙΥΤ0Κ8Ι.8Ι.8ΡΟΚ

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2, причем способ включает культивирование клетки-хозяина согласно третьему аспекту в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую полипептид согласно третьему аспекту изобретения.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает применение полипептида согласно третьему аспекту для производства медикамента для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания.

Настоящее изобретение демонстрирует, что составной белок согласно настоящему изобретению, который может экспрессироваться в культуре клеток млекопитающих с высокой эффективностью, способен связываться с его мишенями СЭ133 и коллагеном с высокой аффинностью и иммобилизовать СГО133. экспрессирующий клетки НЕК 293 на покрытой коллагеном поверхности даже в динамических условиях, как показывает эксперимент с проточной камерой.

По сравнению со смесью белков согласно документу \У0 2008/101700, которая содержит Ю6В3Н10 шАЬ, химически связанное с СРУ1-Рс, составной белок согласно настоящему изобретению способен рекрутировать СЭ133-положительные клетки-предшественники, выделенные из пуповинной крови человека, к местам искусственного повреждения сосудов на мышиной модели. Кроме того, рекрутированные ЕРС дифференцируются в эндотелиальные клетки и, таким образом, прямо способствуют регенерации эндотелиальной стенки. Таким образом, составной белок согласно настоящему изобретению усиливает реэндотелиализацию и может быть выгодно использован в медицине для восстановления сосудов. Полипептид согласно изобретению может использоваться для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации в эндотелиальные клетки стенки сосуда или косвенно, путем секреции положительных модулирующих факторов.

Новый составной белок превосходит существующие химически связанные последовательности в том, что обладает более высокой аффинностью к коллагену (см. фиг. 9). В этом состоит преимущество при использовании в качестве медикамента с более высокой эффективностью для местного связывания с местами повреждения сосудов. Среди различных возможных составных белков лишь 8сРу-Ш демонстрирует сравнимую высокую аффинность к СГО133, в отличие от других производных последовательностей (см. фиг. 5).

Помимо применения полипептида согласно настоящему изобретению для процессов восстановления сосудов, он также может применяться для улучшения хоминга трансплантированных стволовых клеток к костному мозгу после абляции костного мозга путем химиотерапии или радиотерапии.

Настоящее изобретение обеспечивает полипептид малого размера в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2, способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и СГО133 белком. Белок согласно настоящему изобретению может быть получен в большом выходном количестве и с высокой степенью чистоты, что обусловливает его высокую пригодность в фармацевтической композиции.

Полипептид согласно изобретению представляет собой составной белок, т.е., продукт трансляции

- 3 023016 составного гена. Составной белок содержит домен одноцепочечного антитела против СО133, линкер, Рскомпонент и ΟΡνί-компонент. Белок согласно настоящему изобретению может быть в форме димера.

Полипептид согласно настоящему изобретению образуется на основе одноцепочечного антитела (зсРу), состоящего исключительно из вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, которые комбинируются на одной полипептидной цепи соединительным линкерным пептидом. Это одноцепочечное антитело сохраняет специфичность родительского тЛЬ к антигену с неожиданно высокой аффинностью. Родительское тАЬ, применяемое согласно настоящему изобретению, может вырабатываться клоном клеток гибридомы мыши ^6В3Н10, субклоном серийно выпускаемого клона \У6В3С1 (МШепуц ВсгдБсН С1абЬасй).

Так как компонент антитела полипептида согласно настоящему изобретению взят из моноклонального антитела мыши, составной белок, содержащий этот компонент, является химерным белком мышичеловека. Поскольку существуют технологии замены последовательностей мышиного происхождения в фармацевтических средствах на основе антител, в данной отрасли стали традиционно применять разработку терапевтических молекул, являющихся гуманизированными или полностью человеческими. Это снижает или предотвращает иммунную реакцию против терапевтического белка, особенно при периодическом введении. Таким образом, одноцепочечный компонент полипептида согласно настоящему изобретению может подвергаться процессу гуманизации с применением способов, называемых трансплантацией СБК. При этом гипервариабельные участки (СБК) мышиного происхождения, включающие антигенсвязывающий центр антитела, переносят на каркасные остатки человеческого происхождения.

Компонент антитела составного белка, взятого из организма мыши, может быть успешно гуманизирован путем трансплантации мышиных СЭР на консенсусную акцепторную каркасную последовательность человека. Гуманизированный составной белок сохраняет свойства связывания с белкамимишенями СО133 и коллагеном I и связывается с подобной аффинностью по сравнению с составным белком с одноцепочечной последовательностью мыши.

Второй партнер слияния способен распознавать и связываться с местами повреждения в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов. После повреждения слоя эндотелиальных клеток вследствие хирургического вмешательства, такого как имплантация стента, или после разрыва атеросклеротических бляшек коллаген, как составляющая субэндотелиального матрикса, открывается для воздействия кровотока. Это приводит к быстрому прикреплению и активизации тромбоцитов, что, в свою очередь, может вызывать образование тромба и окончательной закупорки кровеносного сосуда.

Гуманизированный составной белок способен ингибировать связывание тромбоцитов с поврежденными стенками сосудов, как видно из уменьшения площади образования тромба (см. фиг. 22). Ожидается, что по сравнению с молекулой-предшественником с последовательностью антитела мыши гуманизированный составной белок должен улучшить толерантность иммунной системы пациента после введения.

Тромбоциты прилипают к коллагену через гликопротеин VI (ОРУ1), мембранный гликопротеиновый рецептор, который экспрессируется на поверхности тромбоцитов. Растворимая часть гликопротеина VI человеческих тромбоцитов, соответствующая внеклеточному домену белка, демонстрирует высокую аффинность связывания с коллагеном.

ΟΡνί связывает коллаген с высокой аффинностью как гомодимер. Для облегчения димеризации с одной стороны и очищения составного белка путем аффинной хроматографии с другой стороны Рскомпонент человеческого 1дО присоединяется к растворимому ΟΡν-компоненту. Рс-фрагмент образует димеры через ковалентные дисульфидные связи в оставшейся части шарнирного участка, что способствует димеризации ΟΡνί, которая, возможно, поддерживается образованием дисульфидной связи. Кроме того, Рс-метка увеличивает время полужизни составного белка в кровотоке.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает собранные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепи кДНК \У6В3Н10. В частности, фиг. 1А показывает последовательность каппа-легкой цепи. Подчеркнутая последовательность относится к константной области последовательности легкой цепи. Фиг. 1В показывает последовательность для гамма-тяжелой цепи;

фиг. 2 - нуклеотидную последовательность конструктов зсРу-Ш, показанного в части А, и зсРу-Ы, показанного в части В. Подчеркнутая последовательность в части А взята из константной области тяжелой цепи, а в части В - из константной области легкой цепи. Линкерная последовательность 01у-8ег показана курсивом;

фиг. 3 - вестерн-блоттинг очищения одноцепочечного антитела зсРу-Ш из супернатанта клеток СНО с применением матрицы §1гер-Тас1ш, обнаруженного при помощи антитела 81герМАЬ-С1а881с-НКР. Показаны проточная фракция (РТ), первые две фракции промывания (^1, ^2), фракции элюата с 1 по 5 (Е1-Е5) и матрикс после элюирования (М). Специфическая полоса показана в ожидаемом размере приблизительно 27 кДа в рядах Е2-Е5. Ряд М показывает неспецифические сигналы;

фиг. 4 - результаты проводимого с применением окрашивания геля Кумасси анализа очищения 5сРу-Ы от бактерий. В - бактериальный лизат, Е2/3 - комбинированные элюаты 2 и 3, Е4, Е5 - фракция элюата 4 и 5;

фиг. 5 - связывание одноцепочечных антител с 00133 на фиксированных клетках АС 133/293. А - 4 023016 зависимые от концентрации свойства связывания, В - конкурентное связывание 2 нмоль/л ^6В3Н10 тАЪ с СЭ133 на фиксированных клетках АС 133/293 с применением 8сРу-1Ь одноцепочечного антитела;

фиг. 6 - нуклеотидную последовательность (ЗЕО ГО N0: 1) и аминокислотную последовательность (ЗЕО ГО N0: 2) составного белка 5сРу-1Ъ-СРУ1-Рс. Фиг. 1А показывает нуклеотидную последовательность, являющуюся кодон-оптимизированной для эффективной экспрессии в клетках СНО, причем последовательность, кодирующая одноцепочечный компонент, выделяется подчеркиванием. Фиг. 1В показывает аминокислотную последовательность (ЗЕО ГО N0: 2), выведенную из нуклеотидной последовательности. Показанный лидерный пептид из 20 аминокислот в зрелом белке отсутствует. Последовательность одноцепочечного компонента выделяется подчеркиванием. 0РУ1 и Рс1дО2 соединяются ООКлинкером, показанным жирным шрифтом;

фиг. 7 - составной белок, который отделяли на 4-20% полиакриламидном геле в невосстановительных и восстановительных условиях, с окрашиванием геля бриллиантовым синим Кумасси;

фиг. 8 - характеризацию связывания составного белка с СГО133 на фиксированных клетках АС133/293. Фиг. 8А показывает ЕиЗА-титрование для сравнения связывания составного белка и родительского тАЪ \У6В3Н10. Фиг. 8В показывает конкурентный ЕЬ18А-анализ с 2 нМ \У6В3Н10 тАЪ и составным белком в качестве конкурента;

фиг. 9 - измерение связывания составного белка в сравнении с ОРУ1-Рс1дО1 с 0,1 мкг коллагена I крупного рогатого скота с применением ЕЬ18А. Фиг. 9А демонстрирует зависимое от концентрации связывание. Фиг. 9В демонстрирует конкурентное связывание составного белка с 1 мкг/мл иммобилизированного коллагена I, конкурирующего с увеличиваемым количеством растворимого коллагена I;

фиг. 10 демонстрирует опосредованное составным белком связывание экспрессирующих СГО133 клеток и контрольных клеток НЕК 293 с коллагеном при сдвиговом усилии 2000/с;

фиг. 11 - опосредованное составным белком связывание цЕРС с сонной артерией мыши после вызванного лигированием повреждения ίη νίνο, измеряемое путем интравитальной флуоресцентной микроскопии;

фиг. 12 показывает влияние составного белка на функцию левого желудочка (А) и на размер инфаркта (В). N=5/6, * р<0,05, ** р<0,005 (ΐ-тест);

фиг. 13 - измерение аффинности путем РАСЗ-анализа клонов фагов, содержащих гуманизированные последовательности в сравнении с фаговым т1Ъ, включающим одноцепочечную последовательность мыши. Фиг. 13А показывает аффинность клона фага 26 в сравнении с фаговым т1Ъ. Фиг. 13В показывает аффинность клона фага 27 и клона фага 29 в сравнении с фаговым т1Ъ. Анализ осуществляли с применением программы ОтарЪраб Рпмн 4.0. Показатели относительной аффинности в рМ измеряют на основе введенных среднего Р1 (показатель флуоресценции), среднего геометрического Р1 или медианного Р1;

фиг. 14 - оценку гуманизации последовательности гуманизированного антитела с донорной последовательностью в качестве отрицательного контроля и акцепторной последовательности в качестве положительного контроля. А - донорный УЪ; В - акцепторный УЪ; С - клон 26 УЪ; Ό - донорный УН; Е акцепторный УН; Р - клон 26 УН;

фиг. 15 - сравнение белковых последовательностей с применением программы В1аЧР NСВI. Фиг. 15А показывает выравнивание последовательности родительского одноцепочечного антитела мыши (ЗЕО ГО N0: 22; мышь) и акцепторной последовательности человека (ЗЕО ГО N0: 23; ЗЬ|с1). Фиг. 15В показывает выравнивание последовательности клона 26 гуманизированного одноцепочечного антитела (ЗЕО ГО N0: 24; гуманизированное) и акцепторной последовательности человека (ЗЕО ГО N0: 23; ЗЬ|с(). Гипервариабельные участки легких (СЭК-Ы (ЗЕО ГО N0: 25), СЭР-Е2 (ЗЕО ГО N0: 26) и СПК-Ь3 (ЗЕО ГО N0: 27)) и тяжелых цепей (С1Ж-111 (ЗЕО ГО N0: 28), СПК-112 (ЗЕО ГО N0: 29) и СОК-Н3 (ЗЕО ГО N0: 30)) указываются заключением в рамку;

фиг. 16 - выравнивание белковой последовательности гуманизированного составного белка (ЗЕО ГО N0: 15; верхняя строка) с составным белком, содержащим одноцепочечный компонент мышиного происхождения (ЗЕО ГО N0: 2; нижняя строка) с применением программы В1а8(х NСВI. Последовательности демонстрируют идентичность 95% на уровне белка;

фиг. 17 - нуклеотидную (ЗЕО ГО N0: 14) и аминокислотную последовательность (ЗЕО ГО N0: 15) гуманизированного составного белка Й5сРу-1Н-СРУ1-Рс с одноцепочечным компонентом, производным от распознанного клона фага 26. Фиг. 17А показывает нуклеотидную последовательность (ЗЕО ГО N0: 14), которая является кодон-оптимизированной для эффективной экспрессии в клетках СНО, причем последовательность, кодирующая гуманизированный одноцепочечный компонент, выделяется подчеркиванием. Фиг. 17В показывает аминокислотную последовательность (ЗЕО ГО N0: 15), выведенную из нуклеотидной последовательности. Показанный лидерный пептид из 20 аминокислот в зрелом белке отсутствует. Последовательность гуманизированного одноцепочечного компонента выделяется подчеркиванием;

фиг. 18 - гуманизированный составной белок 115сРу-1Н-СРУ1-Рс (Ъ), который отделяли вместе с 8сΡν1Ъ-0РУ1-Рс (т) на 4-20% полиакриламидном геле в восстановительных и невосстановительных условиях соответственно. Гель окрашивали бриллиантовым синим Кумасси;

фиг. 19 - характеризацию связывания составного белка с антигеном СГО133 на фиксированных клетках АС133/293. Фиг. 19А показывает ЕЫЗА-анализ клеток для сравнения связывания гуманизированно- 5 023016 го и негуманизированного составного белка. Фиг. 19В показывает конкурентное связывание 2 нМ ^6В3Н10 тЛЬ с фиксированными клетками АС 133/293 с использованием гуманизированного и негуманизированного составных белков. Рс-белок использовали в качестве отрицательного контроля;

фиг. 20 показывает зависимое от дозы связывание гуманизированного и негуманизированного составных белков с 0,1 мкг иммобилизированного коллагена крупного рогатого скота I, измеряемое с применением ЕЬ18Л. Рс-белок использовали в качестве отрицательного контроля;

фиг. 21 - нуклеотидную последовательность (8ЕЦ ГО N0: 16; на фиг. 21А) и аминокислотную последовательность (8ЕЦ ГО N0: 17; на фиг. 21В) гуманизированного одноцепочечного антитела, производного от клона фага 27. Фиг. 21С показывает выравнивание последовательностей ДНК, кодирующих составные белки, включающие гуманизированную последовательность клона 27 (8ЕЦ ГО N0: 18; Снегу) и последовательность одноцепочечного антитела мыши (8ЕЦ ГО N0: 2; 8Ь]с1), причем идентичность последовательностей составляет 96%;

фиг. 22 - нуклеотидную последовательность (8ЕС ГО N0: 19; на фиг. 22А) и аминокислотную последовательность (8ЕС ГО N0: 20; на фиг. 22В) гуманизированного одноцепочечного антитела, производного от клона фага 29. Фиг. 22С показывает выравнивание последовательностей ДНК, кодирующих составные белки, включающие гуманизированную последовательность клона 29 (8ЕС ГО N0: 21; Сиегу) и последовательность одноцепочечного антитела мыши (8ЕС ГО N0: 2; 8Ь|с1). причем идентичность последовательностей составляет 96%;

фиг. 23 - анализ размера агрегатов тромбоцитов после лигирования левой общей сонной артерии. Результаты показаны как средний показатель ± 8ЕМ для 5 субъектов на группу.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Полипептид способен одновременно связываться с коллагеном и СО133 белком, когда полипептид может существовать в состоянии, в котором он образует мостик между 00133 белком и коллагеновым белком, в частности в условиях, описанных в представленных примерах. Аминокислотные или нуклеотидные последовательности, имеющие приблизительно 85% идентичности, предпочтительно 90, 95 или 98% идентичности с 8ЕС ГО N0: 1 или 8ЕС ГО N0: 2 соответственно, определяются авторами как достаточно идентичные. Соответственно, термин достаточно идентичный касается первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или равноценных (например, аминокислотный остаток, имеющий подобную боковую цепь) аминокислотных остатков или нуклеотидов со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью (8ЕС ГО N0: 1 или 8ЕС ГО N0: 2), таким образом, что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или общую функциональную активность. В контексте данного описания составной белок означает полипептид, обеспечивающий активность составного белка. В контексте данного описания активность составного белка, биологическая активность составного белка или функциональная активность составного белка означают одновременное и выборочное связывание с коллагеном и СО133 белком.

Молекулы нуклеиновых кислот.

Изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты, которая является достаточно идентичной, т.е. как минимум на 85% (90, 95 или 98%) идентичной нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕС ГО N0: 1, или ее комплементу.

Настоящее изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты, включающей фрагмент из как минимум 1500 (1600, 1800, 2000, 2200) нуклеотидов нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕС ГО N0: 1, или ее комплемента. В варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению имеет нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕС ГО N0: 1. Также изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 2.

Изобретение также включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, причем нуклеиновая кислота гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, которая состоит из 8ЕС ГО N0: 2, в жестких условиях (например, гибридизации в 6*хлориде натрия/цитрате натрия (88С) при приблизительно 60°С, с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2*88С, 0,1% 808 при 65°С), и нуклеиновая кислота кодирует полипептид длиной как минимум 500 аминокислот, предпочтительно как минимум 700 аминокислот, имеющий молекулярную массу приблизительно от 65 до 85 кДа, перед посттрансляционными модификациями и в восстановленной форме.

Один аспект изобретения касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют составные белки или их биологически активные части, а также молекулы нуклеиновых кислот, достаточные для использования в качестве зондов гибридизации для распознавания кодирующих составной белок нуклеиновых кислот (например, мРНК составного белка) и фрагменты для использования в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот составных белков. В контексте данного описания термин молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, образованные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, однако предпочтение отдается двухцепочечным ДНК.

- 6 023016

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты является молекулой, отделенной от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике нуклеиновой кислоты. Предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе примыкает к нуклеиновой кислоте в геномной ДНК организма, из которого взята нуклеиновая кислота. Кроме того, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, такая, как молекула кДНК, может практически не содержать другого клеточного материала или культуральной среды, если ее получают при помощи рекомбинантных технологий, или практически не содержать химических предшественников или других химических веществ в случае ее химического синтеза.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, например молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0: 1, или комплемент любой из этих нуклеотидных последовательностей, может быть выделена с применением стандартных способов молекулярной биологии и представленной в данном описании информации о последовательности (ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаЮту Мапиа1. 2пб, еб., Со1б Зртшд НагЬог ЬаЬотаЮту, Со1б Зртшд НагЬог ЬаЬотаЮту Ргезз, Со1б Зртшд НагЬог, Ν.Υ., 1989).

В другом варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной в ЗЕО ГО N0: 1, или ее часть. Молекула нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной данной нуклеотидной последовательности, достаточно комплементарна данной нуклеотидной последовательности, которую она может гибридизировать с нуклеотидной последовательностью, с образованием, таким образом, устойчивого дуплекса.

Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может включать лишь часть нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей составной белок, например фрагмент, который может использоваться в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий биологически активную часть составного белка.

Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий биологически активную часть составного белка, может быть получен путем выделения части ЗЕО ГО N0: 1, которая кодирует полипептид, имеющий биологическую активность составного белка, который экспрессирует кодированную часть составного белка (например, путем рекомбинантной экспрессии ш νίΙΐΌ) и оценки активности кодированной части составного белка.

Изобретение также охватывает молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от нуклеотидной последовательности ЗЕО ГО N0: 1 вследствие дегенерации генетического кода, и, таким образом, кодируют такой же составной белок, как тот, который кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в ЗЕО ГО N0: 1.

Соответственно, в другом варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеет длину как минимум 1500 (1600, 1800, 2000, 2200) нуклеотидов и гибридизируется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, предпочтительно кодирующую последовательность ЗЕО ГО N0: 1.

В контексте данного описания термин гибридизируется в жестких условиях означает условия гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, как минимум на 85% (95, 98%) идентичные между собой, обычно остаются гибридизированными одна с другой. Такие жесткие условия известны специалистам в данной области и описываются в публикации Сштеп! РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 1оЬп ^йеу & Зопз, ΚΥ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Примером жестких условий гибридизации может быть гибридизация в 6*хлориде натрия/цитрате натрия (ЗЗС) при приблизительно 4°С с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2*ЗЗС, 0,1% ЗИЗ при 50-65°С (например, 50 или 60 или 65°С). Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая гибридизируется в жестких условиях, соответствует природной молекуле нуклеиновой кислоты.

Изменения, вносимые путем мутации в нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0: 1, таким образом, ведут к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого белка без изменения функциональной способности составного белка. Например, могут осуществляться нуклеотидные замещения, которые ведут к аминокислотным замещениям в заменимых аминокислотных остатках. Заменимый аминокислотный остаток является остатком, который может быть изменен по сравнению с последовательностью ЗЕО ГО N0: 2 без изменения биологической активности, в то время, как незаменимый аминокислотный остаток является необходимым для биологической активности составного белка.

Соответственно, другой аспект изобретения касается молекул нуклеиновых кислот, кодирующих составные белки, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются существенными для активности. Такие составные белки отличаются по аминокислотной последовательности от ЗЕО ГО N0: 2, сохраняя при этом биологическую активность.

В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85, 95 или 98% идентична аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая составной белок, имеющий последователь- 7 023016 ность, отличающуюся от последовательности ЗЕЦ ГО N0: 1, может быть создана путем включения одного или нескольких нуклеотидных замещений, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность составного белка (ЗЕЦ ГО N0: 1), таким образом, чтобы одно или несколько нуклеотидных замещений, добавлений или делеций были включены в кодированный белок. Мутации могут включаться стандартными способами, такими как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно консервативные аминокислотные замещения осуществляют в одном или нескольких заданных заменимых аминокислотных остатках. Таким образом, например, 1, 2, 3, 5 или 10% аминокислот могут быть заменены путем консервативного замещения. Консервативное аминокислотное замещение представляет собой замещение, при котором аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Группы аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, известны специалистам в данной области. Эти группы включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизином, аргинином, гистидином), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой), неизменными полярными боковыми цепями (например, глицином, аспарагином, глутамином, серином, треонином, тирозином, цистеином), неполярными боковыми цепями (например, аланином, валином, лейцином, изолейцином, пролином, фенилаланином, метионином, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонином, валином, изолейцином) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозином, фенилаланином, триптофаном, гистидином). Таким образом, прогнозируемый заменимый аминокислотный остаток в составном белке предпочтительно заменяется другим аминокислотным остатком из той же группы боковых цепей. В альтернативном варианте мутации могут быть включены случайно по всей кодирующей последовательности составного белка или ее части, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут подвергаться отбору на биологическую активность составного белка для распознавания мутантов, сохраняющих активность. После мутагенеза кодированный белок может рекомбинантно экспрессироваться, и может определяться активность белка.

Мутантный составной белок подвергают анализу на способность к одновременному и выборочному связыванию с СГО133 и коллагеном.

Изобретение также касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует гуманизированный иммуноглобулин согласно настоящему изобретению (например, одноцепочечное антитело), а также выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих последовательность, которая кодирует легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 12, 13, 14 или 15 и/или последовательность, кодирующую аминокислоту ЗЕЦ ГО N0: 111, 116 или ее части) или тяжелую цепь (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 17, 18, 19 или 20 и/или последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 110, 114 или ее части.

Кроме того, изобретение касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую гуманизированный иммуноглобулин, который включает гипервариабельные участки (СИК) иммуноглобулина взятого из не принадлежащего человеку антитела (например, одноцепочечного антитела), имеющие специфичность связывания с СИ133 (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая включает ЗЕЦ ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 и/или 30 или ее части) и каркасный участок, взятый из иммуноглобулина человеческого происхождения (например, последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 23 или ее части).

Настоящее изобретение также касается молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей составной белок, который содержит гуманизированный иммуноглобулин, имеющий специфичность связывания с СИ133, или части цепи такого иммуноглобулина. Например, обеспечивается вектор экспрессии, включающий ген, кодирующий легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую СИК, взятую из легкой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания с СИ133 (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая включает ЗЕЦ ГО N0: 25, 26 и/или 27 или ее части), и каркасный участок, взятый из легкой цепи человеческого происхождения. Вектор экспрессии, включающий ген, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую СИК, взятый из тяжелой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания с СИ133 (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую ЗЕЦ ГО N0: 28, 29 и/или 30 или ее части), и каркасный участок, взятый из тяжелой цепи человеческого происхождения, является еще одним примером такой последовательности. В одном варианте осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую гуманизированный иммуноглобулин, который включает первую нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, включающий СИК, взятый из легкой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания с СИ133, и каркасный участок из легкой цепи человеческого происхождения, и вторую нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, включающий СИК,

- 8 023016 взятый из тяжелой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания с СЭ133. и каркасный участок из тяжелой цепи человеческого происхождения (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую 8ЕО ГО N0: 17, 20 или 24). В одном варианте осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, которая включает первую нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, например, из 8ЕЦ ГО N0: 1 (нуклеотиды с 61 по 381) и вторую нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, например, из 8Е0 ГО N0: 1 (нуклеотиды с 427 по 798) или ее часть. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, описанную авторами, и нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, описанную авторами.

Выделенный составной белок и антитела против составного белка.

Настоящее изобретение также касается полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85, предпочтительно на 95 или 98% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 2.

Один аспект изобретения касается выделенных составных белков и их биологически активных частей, а также фрагментов полипептидов, приемлемых для применения в качестве иммуногенов для выработки антител против составного белка. В одном варианте осуществления составные белки образуют при помощи технологий рекомбинантных ДНК. В варианте, альтернативном рекомбинантной экспрессии, составной белок ил полипептид может быть синтезирован химически с применением стандартных технологий синтеза пептидов.

Выделенный или очищенный белок или его биологически активная часть практически не содержат клеточного материала или других примесных белков клеточного или тканевого происхождения, от которых происходит составной белок, или практически не содержит химических предшественников или других химических веществ в химически синтезированной форме. Термин практически не содержит клеточного материала включает композиции составного белка, в которых белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или получают рекомбинантным путем. Таким образом, составной белок, практически не содержащий клеточного материала, включает композиции составного белка, имеющие менее чем приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухой массе) несоставного белка (в контексте данного описания также называемого примесным белком). При рекомбинантном получении составного белка или его биологически активной части он также предпочтительно практически не должен содержать культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее чем приблизительно 20, 10 или 5% от объема белковой композиции. Если составной белок получают путем химического синтеза, он предпочтительно практически не должен содержать химических предшественников или других химических веществ, т.е. он должен быть отделен от химических предшественников или других химических веществ, задействованных в синтезе белка. Соответственно, такие композиции составного белка составляют менее чем приблизительно 30, 20, 10, 5% (по сухой массе) химических предшественников или отличных от составного белка химических веществ.

Биологически активные части составного белка включают пептиды, включающие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные аминокислотной последовательности составного белка или производные от нее (например, аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 2), которые включают меньшее количество аминокислот по сравнению с составным белком полной длины, и демонстрируют как минимум активность составного белка. Как правило, биологически активные части включают домен или мотив как минимум с активностью составного белка. Биологически активной частью составного белка может быть полипептид, имеющий длину, например, как минимум 500, 550, 600, 650 или 700 аминокислот. Предпочтительные биологически активные полипептиды включают один или несколько структурных доменов составного белка, в частности домен, взятый из одноцепочечного антитела, выборочно связывающегося с СЭ133, линкер, Ре-компонент и ОРУ1-компонент.

Приемлемым для применения составным белком является белок, который включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85, предпочтительно на 95 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 2 и сохраняет функциональную активность составного белка 8Е0 ГО N0: 2.

Поскольку компонент антитела составного белка происходит из моноклонального антитела мыши, составной белок является мышино-человеческим химерным белком, мышиные последовательности которого, кроме тех, которые принимают участие в распознавании антигена, могут быть заменены последовательностями человека путем гуманизации антитела. Как правило, частично человеческие антитела и полностью человеческие антитела имеют более длительное время полужизни в человеческом организме по сравнению с другими антителами. Соответственно, часто существует возможность введения меньших доз с меньшей частотой. Модификации, такие как липидизация, могут применяться для стабилизации антител и для усиления поглощения и проникновения в ткани (например, в головной мозг). Способ липидизации антител описывается в публикации Стшкзйапк с1 а1. ((1997) 1. Лссцигеб 1ттипе Нейс1епсу 8упбготсз апб Нитап Ке1гоу1го1оду 14:193).

Определение процентной гомологии между двумя последовательностями может осуществляться с

- 9 023016 применением математического алгоритма. Предпочтительным неограничивающим примером математического алгоритма, применяемым для сравнения двух последовательностей, может быть алгоритм Карлина и Альтшуля (1990) Ргос. ΝαΙ'Ι Асаб. δοί. υδΑ 87:2264-2268, модифицированный согласно публикации Каг1ш апб АИзсШ (1993) Ргос. ΝαΙ'Ι Асаб. δα. υδΑ 90:5873-5877. Такой алгоритм включается в программы ΝΒΕΑδΤ и ΧΒΕΑδΤ согласно публикации ЛИзсШ е! а1. (1990) 1. Мо1. ΒίοΙ. 215:403-410. Поиски нуклеотидов ΒΕΑδΤ могут выполняться при помощи программы ΝΒΕΑδΤ, сумма баллов = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, подобных или гомологичных молекулам нуклеиновых кислот согласно изобретению. Для получения выровненных последовательностей с учетом разрывов с целью сравнения применяют Сарреб ΒΕΑδΤ согласно описанию в публикации Л115с1ш1 е! а1. (1997) ШсГОс Аабз Кек. 25:3389-3402. При применении программ ΒΕΑδΤ и Сарреб ΒΕΑδΤ используют параметры соответствующих программ по умолчанию (например, ΧΒΕΑδΤ и ΝΒΕΑδΤ). См. 1Шр://\у\у\у.псЫ.п1т.шк8оу.

Процент идентичности между двумя последовательностями определяют с применением способов, подобных описанным выше, с учетом или без учета разрывов. При вычислении процента идентичности обычно учитывают точные соответствия.

Предпочтительно составной белок согласно изобретению получают при помощи стандартных технологий рекомбинантных ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, сшивают внутри рамки в соответствии с традиционными технологиями, например, путем применения тупых концов или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестрикционным ферментом для обеспечения соответствующих концов, заполнение липких концов в соответствующих случаях, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного соединения и ферментного лигирования. В другом варианте осуществления составной ген может быть синтезирован традиционными способами, включая применение автоматических синтезаторов ДНК.

Выделенный составной белок, или его часть, или фрагмент может применяться в качестве иммуногена для выработки антител, связывающихся с составным белком, с применением стандартных способов для получения композиции поликлонального и моноклонального антитела.

Может применяться составной белок полной длины, или, в альтернативном варианте, изобретение обеспечивает антигенные пептидные фрагменты составного белка для применения в качестве иммуногенов. Антигенный пептид составного белка включает как минимум 8 (предпочтительно 10, 15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, показанной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, и включает эпитоп составного белка таким образом, что антитело, выработанное против пептида, образует специфичный иммунный комплекс с составным белком.

Настоящее изобретение также обеспечивает полипептид, содержащий вариабельный участок гуманизированного иммуноглобулина, который обладает специфичностью связывания с СИ133. В частности, настоящее изобретение также касается полипептида составного белка согласно настоящему изобретению, содержащего фрагмент гуманизированного иммуноглобулина, который обладает специфичностью связывания с СЭ133, причем иммуноглобулин включает антиген-связывающий участок отличного от человеческого происхождения (например, из организма грызуна) и как минимум часть иммуноглобулина человеческого происхождения (например, человеческий каркасный участок, человеческую константную область гамма-типа).

В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению также может включать полную константную область человеческого происхождения или ее часть, например, полную константную область тяжелой цепи человека или ее часть и/или константную область легкой цепи человека. Кроме того, полипептид согласно настоящему изобретению может включать гуманизированный иммуноглобулин, включающий полную человеческую константную область или ее часть, имеющую одну или несколько мутаций, например, одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание с Рс рецепторами и/или способность к фиксации комплемента.

Составной белок в качестве иммуногена может использоваться для получения антител путем иммунизации соответствующего субъекта, например кроля, козы, мыши или другого млекопитающего, иммуногеном. Иммунизация соответствующего субъекта композицией иммуногенного составного белка вызывает реакцию поликлонального антитела против составного белка. Соответственно, другой аспект изобретения касается антител против составного белка.

Поликлональные антитела против составного белка могут быть получены путем иммунизации соответствующего субъекта составным белком в качестве иммуногена. Молекулы антител, направленных против составного белка, могут быть выделены из организма млекопитающего (например, из крови) и подвергнуты дальнейшему очищению общеизвестными способами, такими, как хроматография белка А, для получения фракции 1дС. В соответствующий момент времени после иммунизации вырабатывающие антитело клетки могут быть получены от субъекта и использованы для получения моноклональных антител стандартными способами, такими как гибридомная технология, описанная в публикации КоЫег апб Μί1δίηίη (1975) ШШге 256:495-497, гибридомная технология на В клетках человека (Ко/Ъог е! а1. (1983) 1ттипо1 ГОбау 4:72), или ΕΒν-гибридомная технология (Со1е е! а1. (1985), Мопос1опа1 АпйЪоб1е8 апб Сапсег ^ег^ру, А1ап К. Ь188, 1пс., рр. 77-96).

- 10 023016

Рекомбинантные векторы экспрессии и клетки-хозяева.

Другой аспект изобретения касается векторов, предпочтительно векторов экспрессии, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует составной белок (или ее часть).

В контексте данного описания термин вектор касается молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединяется. Одним типом вектора является плазмида, которая означает циклическую петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы могут быть способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую она введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) включаются в геном клетки-хозяина после включения в клетку-хозяин и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В целом векторы экспрессии, применяемые согласно технологиям рекомбинантных ДНК, предпочтительно имеют форму плазмид (векторов). Однако изобретение также включает другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефицитом репликации, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы).

Рекомбинантные векторы экспрессии согласно изобретению включают нуклеиновую кислоту согласно изобретению в форме, приемлемой для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Соответственно, рекомбинантные векторы экспрессии включают одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, применяемых для экспрессии, и функционально связанных с нуклеиново-кислотной последовательностью, подлежащей экспрессии.

В контексте рекомбинантного вектора экспрессии функционально связанный означает, что соответствующая нуклеотидная последовательность связывается с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким образом, чтобы обеспечивалась возможность экспрессии нуклеотидной последовательности (например, в ίη νίίτο системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, если вектор вводится в клетку-хозяин).

Термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описываются, например, в публикации Ооеббе1; Оепе Ехргеззюп ТесЬпо1оду: Мебюбз ίη Ешуто1оду 185, Асабешю Ргезз, §ап О|едо. СайГ. (1990). К регуляторным последовательностям относятся те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Векторы экспрессии согласно изобретению могут включаться в клетки-хозяева для образования таким образом составных белков или пептидов, которые кодируются нуклеиновыми кислотами согласно изобретению.

Рекомбинантные векторы экспрессии согласно изобретению могут предназначаться для экспрессии составного белка в прокариотных или эукариотных клетках, например бактериальных клетках, таких как Е.сой, клетках насекомых (с применением бакуловирусных векторов экспрессии), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (Ооеббе1, Оепе Ехргеззюп Тесйпо1оду: Мебюбз ίη Еηζушο1οду 185, Асабешю Ргезз, 8ап Н1едо, СайГ. (1990)). В альтернативном варианте рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован ш νίίτο, например, с применением регуляторных последовательностей Т7 промотора и Т7 полимеразы.

Экспрессию белков в прокариотах осуществляют в Е.сой с использованием векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию белков. Слитые векторы добавляют определенное количество аминокислот к кодируемому в них белку, как правило к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат для трех целей: 1) увеличения экспрессии рекомбинантного белка; 2) увеличения растворимости рекомбинантного белка; и 3) способствования очищению рекомбинантного белка путем воздействия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в слитых векторах экспрессии сайт протеолитического расщепления включают в месте соединения слитого компонента и рекомбинантного белка для обеспечения возможности отделения рекомбинантного белка от слитого компонента после очищения составного белка. Такие ферменты и их последовательности когнатного распознавания включают Фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. К типичным слитым векторам экспрессии относятся рОЕХ (Рйатшаша Вю1есй 1пс; 8шйй апб Мйпзоп (1988) Оепе 67:31-40), рМАЬ (№те Епд1апб Вю1аЪз, ВесеНу, Мазз.) и рЫТ5 (Рйатшаша, Р1зса1атау, N.6.), которые сливают глутатион δ-трансферазу (О8Т), мальтоза Е-связывающий белок или белок А соответственно, с заданным рекомбинантным составным белком.

Примерами подходящих индуцируемых неслитых векторов экспрессии Е.сой могут быть рТгс (Ашапп е1 а1. (1988) Оепе 69:301-315) и рЕТ 11б (81иб1ет е1 а1., Оепе Ехргеззюп Тесйпо1оду: Мебюбз ш Еηζушο1οду 185, Асабешю Ргезз, 8ап Н1едо, СайГ. (1990) 60-89). Экспрессия гена-мишени из вектора рТгс основывается на транскрипции РНК-полимеразы хозяина из промотора слияния гибрида 1тр-1ас. Экспрессия гена-мишени из вектора рЕТ 11б основывается на транскрипции из промотора слияния Т7 дп10-1ас,

- 11 023016 опосредованной коэкспрессированной вирусной полимеразой РНК (Т7 дп1). Эта вирусная полимераза обеспечивается штаммами-хозяевами ВЬ21(НЕ3) или ΗΜδ174(ΌΕ3) из резидентного лямбда-профага, включающего ген Т7 дп1 при транскрипционном контроле промотора 1асИУ5.

Одна методология максимизации экспрессии рекомбинантного белка в Е.соП состоит в экспрессии белка в бактериях, имеющих ослабленную способность к протеолитическому расщеплению рекомбинантного белка (Оо!!езтап, Оепе Ехргеззюп ТесПпо1оду: МеПюйз ίη Еп/уто1оду 185, Асайетю Ртезз, 8ап Эюдо. СаПГ. (1990) 119-128). Другая методология состоит в изменении нуклеиново-кислотной последовательности нуклеиновой кислоты, вставляемой в вектор экспрессии таким образом, чтобы отдельными кодонами для каждой аминокислоты были предпочтительно используемые в Е.соП (^айа е! а1. (1992) Нис1ею Ас1йз Кез. 20:2111-2118). Такое изменение нуклеиново-кислотных последовательностей согласно изобретению может осуществляться с применением стандартных способов синтеза ДНК.

В другом варианте осуществления вектором экспрессии составного белка согласно настоящему изобретению является вектор экспрессии дрожжей. Примерами векторов для экспрессии в дрожжах 8. сетМзае могут быть рУер8ес1 (Ва1йап е! а1. (1987) ЕМВО 1. 6:229-234), рМРа (Кицап апй Негзко\уП/, (1982) Се11 30:933-943), р1КУ88 (ЗсЬиИг е! а1. (1987) Оепе 54:113-123), рУЕ82 (1пуШодеп Сотротайоп, 8ап Этедо, СаПГ.), рОВТ9 (Сшп!есП, Ра1о А1!о, СаПГ.), рОАЭ10 (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СаПГ.), рУАОЕ4 и рУОАЕ2 и рУРОЕ2 (ВтипеШ апй Ра11 (1993) Уеаз! 9:1299-1308), рУРОЕ15 (ВтипеШ апй Ра11 (1993) Уеаз! 9:1309-1318), рАСТ11 (Ότ. 8.Е. Е11ейде, Вау1ог Со11еде оГ Мейюше) и рю2 (ГпУйтодеп Согр, 8ап Н1едо, СаПГ.).

В альтернативном варианте составные белки согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться в клетках насекомых с применением бакуловирусных векторов экспрессии. К бакуловирусным векторам, подходящим для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых, относятся группа рАс (διηίΐΠ е! а1. (1983) Мо1. Се11 Вю1. 3:2156-2165) и группа рУЪ (ЬисЫоте апй 8иттегз (1989) Уио1оду 170:31-39).

В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота согласно изобретению экспрессируется в клетках млекопитающих с применением вектора экспрессии млекопитающего. Примерами векторов экспрессии млекопитающих могут быть рСЭМ8 (8еей (1987) ЫаШге 329:840), рС1 (Рготеда) и рМТ2РС (КаиГтап е! а1. (1987) ЕМВО 1. 6:187-195). При использовании в клетках млекопитающих контрольные функции вектора экспрессии часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например, традиционно применяемые промоторы берут из вируса полиомы, Аденовируса 2, цитомегаловируса и §1т1ап У1тиз 40. Другие подходящие экспрессионные системы как для прокариотных, так и для эукариотных клеток представлены в разделах 16 и 17 публикации 8атЬтоок е! а1. (см. выше).

В другом варианте осуществления рекомбинантный вектор экспрессии млекопитающего способен предпочтительно направлять экспрессию нуклеиновой кислоты в конкретном типе клеток. Тканеспецифические регуляторные элементы известны специалистам в данной области. Неограничивающими примерами подходящих тканеспецифических промоторов могут быть альбуминовый промотор (печеночноспецифический; Ршкей е! а1. (1987) Оепез Эеу. 1:268-277), лимфоидноспецифические промоторы (Са1ате апй Еа!оп (1988) Айу. 1ттипо1. 43:235-275), в частности, промоторы Т-клеточных рецепторов (\УПю1о апй ВаШтоте (1989) ЕМВО 1. 8:729-733) и иммуноглобулины (Вапетр е! а1. (1983) Се11 33:729-740; Оиееп апй ВаШтоте (1983) Се11 33:741-748).

Еще один аспект изобретения касается клеток-хозяев, в которые включен рекомбинантный вектор экспрессии согласно изобретению или выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Термин касается не только конкретной клетки, являющейся предметом изобретения, но потомства или потенциального потомства такой клетки. Поскольку могут происходить определенные модификации в последующих поколениях вследствие мутации или воздействия окружающей среды, такое потомство фактически может быть не идентичным родительским клеткам, но все же охватывается объемом данного термина в контексте данного описания.

Клетка-хозяин может быть любой прокариотной или эукариотной клеткой. Например, составной белок может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких, как Е.соП, клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих (таких, как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или СО8-клетки).

Вектор ДНК или выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут включаться в прокариотные или эукариотные клетки при помощи традиционных способов трансформации или трансфекции. В контексте данного описания термины трансформация и трансфекция относятся к разным технологиям включения инородной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяин, включая соосаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованную ЭЕЛЕ-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Приемлемые способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев описываются в публикации 8атЬтоок е! а1. и других лабораторных пособиях.

Для распознавания и отбора этих компонентов ген, который кодирует селектируемый маркер (например, резистентность к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с нужным геном. Предпочтительными селектируемыми маркерами являются те, которые обеспечивают резистентность к медикаментам, таким, как О418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть включена в клетку-хозяин на том же векторе, что и тот, который кодирует

- 12 023016 составной белок, или может быть включена на отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфицированные включенной нуклеиновой кислотой, могут распознаваться путем отбора медикаментов.

Клетку-хозяин согласно изобретению, такую как прокариотная или эукариотная клетка-хозяин в культуре, используют для получения составного белка согласно настоящему изобретению. Соответственно, изобретение также обеспечивает способы получения составного белка с применением клетокхозяев согласно изобретению. В одном варианте осуществления способ включает культивирование клеток-хозяев согласно изобретению (в которую включен рекомбинантный вектор экспрессии или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая составной белок) в приемлемой для образования составного белка среде. В другом варианте осуществления способ также включает выделение составного белка из среды или клетки-хозяина.

Фармацевтические композиции.

Молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды (также называемые активными соединениями) согласно изобретению могут включаться в фармацевтические композиции, приемлемые для введения. Такие композиции обычно включают молекулу нуклеиновой кислоты, составной белок или антитело и фармацевтически приемлемый носитель. В контексте данного описания определение фармацевтически приемлемый носитель включает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, совместимые с вводимым фармацевтическим средством. В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.

Фармацевтическую композицию согласно изобретению рецептируют таким образом, чтобы она была совместимой с предусмотренным способом введения. К предпочтительным способам введения относятся парентеральное, например внутривенное или внутриартериальное введение. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального введения: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Уровень рН может регулироваться кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Композиция для парентерального введения может быть помещена в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.

К фармацевтическим композициям, приемлемым для введения инъекционным путем, относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов и дисперсий, предназначенных для немедленного инъекционного введения. К подходящим для внутривенного введения носителей относятся физиологический раствор, СтеторЬот ЕЬ (ΒΑδΡ; Рагаррапу, N.1.) или фосфатно-буферный раствор (ΡΒδ). В любом случае композиция должна быть стерильной и достаточно жидкой для того, чтобы ее можно было без труда ввести через шприц. Она должна быть устойчивой в условиях производства и хранения и защищенной от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки.

Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль) и их смеси. Надлежащую текучесть поддерживают, например, путем использования покрытия, например лецитинового, путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностноактивных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может достигаться при помощи различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлоробутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтение отдают включению в композицию изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорида натрия.

Стерильные растворы для инъекций получают путем включения активного соединения (например, составного белка или антитела против составного белка) в нужном количестве в соответствующий растворитель с одним из вышеперечисленных ингредиентов или их комбинацией в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая обеспечивает на выходе порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из его предварительно стерильно фильтрованного раствора.

Особое предпочтение отдают рецептированию композиций для перорального или парентерального введения в форме дозированной единицы для облегчения введения и единообразия доз. Форма дозированной единицы в контексте данного описания означает физически дискретные единицы, приемлемые в качестве единичных доз для субъекта, подвергающегося лечению. Каждая единица содержит заданное

- 13 023016 количество активного соединения, рассчитанное для обеспечения необходимого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут включаться в векторы и использоваться в качестве векторов для генной терапии. Векторы для генной терапии могут доставляться в организм субъекта, например, путем внутривенной инъекции, местного введения (И8-А 5328470) или стереотаксической инъекции (см., например, СЬеи е( а1. (1994) Ργοο. Ναΐΐ. Асаб. δα. И8А 91:3054-3057).

Фармацевтическая композиция вектора для генной терапии может включать вектор для генной терапии в приемлемом разбавителе или может включать медленно высвобождающийся матрикс, в который включен наполнитель для доставки гена. В альтернативном варианте, в котором полный вектор для доставки гена может быть образован в целом виде из рекомбинантных клеток, например ретровирусных векторов, фармацевтическая композиция может включать одну или несколько клеток, образующих систему доставки гена.

Фармацевтические композиции могут содержаться в таре, упаковке или дозаторе вместе с инструкциями по применению.

Применение и способы согласно изобретению.

Описанные авторами молекулы нуклеиновых кислот, белки, гомологи белков и антитела могут применяться с использованием одного или нескольких из следующих способов:

a) способов лечения (например, терапевтического и профилактического);

b) скрининговых исследований;

c) предиктивной медицины (например, диагностических анализов, прогностических анализов).

Составной белок взаимодействует с другими клеточными белками, в частности стволовыми клетками, и, таким образом, может применяться для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки стенок сосудов или посредством секреции положительных модулирующих факторов.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут применяться для экспрессии составного белка (например, через рекомбинантный вектор экспрессии в клетке-хозяине при применении генной терапии). Кроме того, составной белок может применяться для отбора медикаментов или соединений, модулирующих активность или экспрессию составного белка, а также для лечения заболеваний. Кроме того, могут применяться антитела против составного белка согласно изобретению для модулирования активности составного белка.

Способы лечения.

Настоящее изобретение обеспечивает как профилактические, так и терапевтические способы лечения субъекта, подверженного риску (или восприимчивого) сердечно-сосудистого заболевания или страдающего от сердечно-сосудистого заболевания, связанного с открытым субэндотелиальным коллагеном.

Профилактические способы.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ профилактики у субъекта заболевания или состояния, связанного с открытым субэндотелиальным коллагеном. Субъекты, подверженные риску заболевания, вызываемого или возникающего при участии открытого субэндотелиального коллагена, могут распознаваться, например, традиционными способами идентификации субъекта, подверженного риску сердечно-сосудистых явлений, таких как высокий уровень ЬПЬ холестерина, артериальная гипертензия, сахарный диабет, курение, и при помощи существующих и новых биомаркеров для неустойчивых артериальных бляшек, таких как увеличение бляшек при контрастной ЯМР-визуализации, тропонин Т и I или ΚΟΌ пептиды.

В частности, полипептид согласно изобретению применяют для лечения сердечно-сосудистого заболевания. Некоторые сердечно-сосудистые заболевания связаны с эндотелиальными повреждениями, открывающими коллаген для воздействия тромбоцитов. Для лечения таких нарушений может применяться полипептид согласно изобретению. К таким нарушениям относятся все осложнения атеросклероза, такие как острые коронарные синдромы (такие как инфаркты миокарда) и острые или хронические цереброваскулярные нарушения, такие как преходящие ишемические нарушения мозгового кровообращения (Т1А) или инсульт, кардиологического или коронарного вмешательства путем чрескожного введения катетера ^С1) и операция на сердце.

Кроме того, путем предварительной инкубации кроветворных стволовых клеток с составным белком и связывания коллагена костного мозга через гликопротеин VI составного белка может быть улучшена репопуляция костного мозга стволовыми клетками после трансплантации.

Терапевтические способы.

Полипептид согласно настоящему изобретению может применяться согласно терапевтическим способам профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания. Предпочтительно полипептид согласно настоящему изобретению применяют в форме димера. В частности, полипептид согласно настоящему изобретению может применяться для хоминга клеток-предшественников для улучшения восстановления сосудов.

Режим дозирования при введении полипептида зависит от возраста, массы, пола и состояния субъекта, подвергаемого лечению. Доза предпочтительно может пребывать в диапазоне от 0,01 до 2 г поли- 14 023016 пептида согласно настоящему изобретению на пациента в день. Полипептид предпочтительно вводят парентерально. Введение может осуществляться от 1 до 5 раз в день.

В одном варианте осуществления способ включает введение полипептида согласно настоящему изобретению в комбинации с другим агентом или комбинацией агентов. Примерами других агентов могут быть ОРУ1-Рс, тромболитические агенты, такие как рекомбинантный тканевой активатор плазминогена, антитромбоцитарные агенты, такие как блокаторы АЭР-рецептора (клопидогрель, тикагрелор, кангрелор и другие), антагонисты тромбина (дабигатран или другие) или антагонисты фактора X (такие как ривароксабан) или гепарин.

Примеры

Материал.

Помимо комплектов и материалов, упомянутых в представленном ниже разделе о способах, применяли указанные ниже вещества. Олигонуклеотиды приобретали у Еитойпв ΜΨ0 Орегоп (ЕЬег5Ьегд, Германия). Полимеразу геркулазу (8йа1адепе, Ьа боНа, СаПГогша) использовали для ПЦР-амплификации. Среды для клеточных культур и РВ8 приобретали у ВюсПтот (ВетПп, Германия). Химикаты приобретали у ΚοΐΠ (КагПгиПе, Германия) и 5адта-А1бпсП (8ее1/е, Германия). Коллаген I крупного рогатого скота приобретали у ΒΌ Вю5шепсе5 (8ап 1озе, СаПГогша).

Амплификация и распознавание вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепей линии клеток гибридомы ^6В3Н10.

МРНК выделяли из клеток 4х10⁶ и 1,4х10⁷ линии клеток гибридомы \У6В3Н10 с применением комплекта 0Ндо1ех ЭПес! тРЯЛ (ΟΙΛΟΕΝ, Нббеп, Германия) в соответствии с протоколом производителя. 18 мкл выделенной мРНК брали для синтеза кДНК с применением комплекта 5>ирег5спр1 III (1пуйтодеп, СаткЬаб, СаПГогша) в соответствии с протоколом производителя. Для амплификации последовательностей, кодирующих вариабельные участки тяжелых и легких цепей антитела \У6В3Н10, испытывали различные комбинации праймеров: В17/В15, В18/В15 для амплификации вариабельной последовательности легкой каппа-цепи, В1З/В14, В|3б/В|4 для вариабельной последовательности тяжелой гамма-цепи (праймеры описываются в публикации ОйЬе1 8. е! а1., 1994). Полученные в результате полосы вырезали из агарозного геля, очищали с применением комплекта ОРХ Ое1 Вапб РштйсаПоп (ОЕ НеаЛПсате, Ркса1ауау, Яе\у 1ет5еу) и секвенировали при помощи В155ец (5' ОООААОАТООАТССАОТТО 3'; 8ЕО ГО N0: 7), В15Г»б (5' ССАТОТССАТОТСАСТТО 3'; 8ЕО II) N0: 8) и В15теу (5' ООТТТСТОТТОАТАССАО 3'; 8ЕО ГО N0: 9) для секвенирования легкой цепи. Последовательности тяжелой цепи получали с использованием праймеров секвенирования В145ец (5' САООООССАОТООАТАОА 3'; 8Е0 ГО N0: 10), В14Губ (5' СТОАССТОАТОААОССТО 3'; 8ЕО ГО N0: 11) и В14теу (5' ТТСАСССАОТОСАСОТАО 3'; 8ЕО ГО N0: 12).

Экспрессия и очищение одноцепочечных антител и составных белков.

Последовательности ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, получали путем синтеза генов и клонировали (Оепеаг!, КедешЬитд, Германия) в вектор экспрессии млекопитающего рс^NА5-РРТ (4πνίйодеп, Саг15Ьаб, СаПГогша). Временную трансфекцию клеток СНО осуществляли с применением реагентов для трансфекции Айтас1епе ОАОЕК НПбеп, Германия) или МроГесЕшипе 2000 ДпуЛтодеп, СаткЬаб, СаПГогша) в соответствии с протоколами производителей. Поскольку экспрессия при использовании конструкта 5сРу-П1 не обнаруживалась, и экспрессия 5сРу-1П в клетках СНО была очень слабой, ДНК обоих конструктов субклонировали в бактериальный вектор экспрессии рЕТ22Ь(+) (Мегск, ЭагпЮабЕ Германия) через №окХПок Последовательности контролировали путем секвенирования, и Е.соП экспрессионного штамма ВЬ21(ОЕ3) (Мегск, ЭагпЮабЕ Германия) трансформировали с применением этих ДНК. Экспрессию одноцепочечных антител вызывали с использованием 0,2 мМ ГРТО. Выделение белков осуществляли путем аффинной очистки §1тер-ТасПп (ГОА ВюТадпо1оду, ОоШпдеп, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

Последовательность ДНК, кодирующую 5сРν-1П-ОΡVI-РбдО2 в рс^NА5-РРТ получали от Оепеаг! (Редеп5Ьигд, Германия). Устойчиво экспрессирующую линию клеток СНО генерировали с применением ЫроГесктше 2000 ДпуПтодеп, СаткЬаб СаПГогша) согласно прилагаемому протоколу. Для получения составного белка в большем масштабе клетки СНО культивировали в тройных флаконах Т500 (NυNС, РосПе51ег, Уогк). Для выделения составного белка клеточный супернатант собирали и очищали с применением 1 мл НР-колонок Н1 Тгар на белке О (ОЕ НеаЛПсате, Р|5са1ауау, №у 1ет5еу). Выделенный белок диализировали в течение суток на РВ8.

Испытание связывания одноцепочечных антител с СГО133 антигеном, экспрессируемым на клетках НЕК 293 путем ЕЫ§А-анализа клеток.

На 96-луночный планшет с поли-Ь-лизином (ВО Вю5аепсе5, 8ап 1о5е, СаПГогша) наносили линию экспрессирующих СГО133 клеток АС 133/293 следующим образом. 1x105 клеток в 0,2 мл среды добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение суток при 37°С, 5% СО₂, чтобы клетки могли присоединиться к поверхности планшета. На следующий день лунки один раз промывали 0,2 мл РВ8 и фиксировали с использованием 0,1 мл 2% параформальдегида (в РВ8, рН 7,4) в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Лунки промывали РВ8-Т (РВ8 + 0,1% Туееп-20) и блокировали при помощи 1х КоПВ1оск

- 15 023016 или 3% молока в ΡΒδ-Т в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания ΡΒδ-Т в лунки добавляли последовательные разведения соответствующего антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение как минимум одного часа при взбалтывании. После промывания ΡΒδ-Т добавляли 0,1 мл δΙΐΌρΜΛΗ-0;·ΐ55ίο-ΗΒΡ (1:10000 в ΡΒδ-Т, 1Ьа ВюТадпо1оду. ОбШпдеп, Германия) или связанный с пероксидазой хрена 1дС против мыши (1:10000 в ΡΒδ-Т, Ωίαηονα. НатЬигд, Германия) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа при взбалтывании. После промывания ΡΒδ-Т добавляли 0,1 мл субстрата 1-δΙορ ИНта ТМΒ-Ε^IδА (ТЬегто δοίοηίίίίο, Βταυη8θΗ№θί§, Германия) и инкубировали до надлежащей проявки синего красителя. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли 0,1 мл 1М Η₂δΟ₄ и измеряли оптическую плотность при 450 и 595 нм в качестве эталона при помощи планшетридера Р200 (ТЕСАЛ, МаппейогТ, Швейцария). Для определения специфичности связывания а конкурентный ΕΕΙδΆ-анализ осуществляли с использованием 300 нг/мл (2 нМ) родительского тАЬ 06Β3410 и возрастающего количества конкурентного белка. Сигналы обнаруживали при помощи антитела 1дОΗΚΡ против мыши (1:10000 в ΡΒδ-Т, Илапоуа, НатЬигд, Германия).

ΕΕΙδΆ-анализ связывания с иммобилизированным коллагеном I.

На 96-луночный планшет 1тти1оп 2 НВ (ЛИЛС, РосЬе81ег, Лете Уогк) наносили 0,1 мл 1 мкг/мл коллагена I крупного рогатого скота в 15 мМ Ла₂СО₃, 35 мМ ЛаНСО₃, рН 9,6 в течение суток при 4°С. Лунки промывали ΡΒδ-Т, блокировали 0,1 мл 1х РтЮЮск (ПоХП, КатктиЬе, Германия) в ΡΒδ-Т в течение одного часа и снова промывали перед добавлением 0,1 мл составного белка в трехкратном разбавлении. После одного часа инкубации при комнатной температуре со взбалтыванием лунки промывали ΡΒδ-Т. Лунки инкубировали с 0,1 мл [дС-ΗΡΡ против человека (Олапоуа, НатЬигд, Германия), 1:10000 в ΡΒδ-Т в течение одного часа при комнатной температуре со взбалтыванием. Планшет промывали ΡΒδ-Т и инкубировали с 0,1 мл 1-δ1^ρ ИНта ТМΒ-Ε^IδА ПЕРСЕ, РоскГогй, Шшолк). После достаточного проявления окрашивания синим реакции останавливали путем добавления 0,1 мл 1М НЕО₄. Оптическую плотность измеряли при 450 и 595 нм в качестве эталона длины волны с применением планшет-ридера Р200 (ТЕСАЛ, МаппейогТ, Швейцария). Значения ЕС₅₀ вычисляли при помощи δ^дта Ρ^Ι 11 с применением Роит кагатеЮ!· Ьодлкйс.

Адгезия экспрессирующих СЭ133 клеток с коллагеном при сдвиговом усилии.

На предметное стекло наносили 10 мкг/мл коллагена I согласно публикации Ьапдет е( а1. (2005) и вставляли в проточную камеру (ОЬдепе, ЕегЬи, Германия). Покрытую коллагеном поверхность стекла предварительно обрабатывали 10 мкг/мл составного белка в течение 30 мин. Для демонстрации зависимости связывания от С.П133 стекло также инкубировали с 06Β3410 тАЬ. Клетки АС 133/293 добавляли и инкубировали при сдвиговом усилии 2000 с-1. Эксперименты записывали на видео и оценивали в автономном режиме.

Лигирование сонной артерии у мышей и оценка адгезии ЕРС путем прижизненной микроскопии.

Клетки С.П133+ выделяли из пуповинной крови человека согласно описанию (Βие1ΐтаηη А. е( а1., 2003).

Для оценки влияния составного белка на рекрутинг ЕРС ш У1уо, авторами применялась интравитальная флуоресцентная микроскопия согласно описанию (МаккЬетд е( а1, 2002). Перед экспериментами ЕРС окрашивали сукцинимидиловым эфиром 5-карбоксифлуоресцеин диацетата (ИСР) и инкубировали с составным белком (20 мкг/мл/100 нМ) или ΟΡνΐ-Рс (15 мкг/мл/100 нМ) в течение 30 мин. Мышей Ο’57ΒΕ/61 дикого типа (СЬат1е8 РКег ЬаЬогаЮпек) подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции раствора мидазолама (5 мг/кг массы тела; РаЬорЬагт), медетомидина (0,5 мг/кг массы тела; ΡΓί/ег) и фентанила (0,05 мг/кг массы тела, Си^аМей/ΡЬа^ат ОтЬН). Полиэтиленовые катетеры (ПогХех) вводили в правую яремную вену и путем внутривенной инъекции вводили флуоресцентные ЕРС (5x104/250 мкл). Общую сонную артерию высвобождали путем надреза и сильно лигировали в течение 5 мин, чтобы вызвать повреждение сосуда. До и после повреждения сосуда взаимодействие флуоресцентных ЕРС с поврежденными стенками сосуда визуализировали при помощи щ 5йи ш У1уо видеомикроскопии общей сонной артерии с применением микроскопа 2е188 А\ю1есЬ (20х водно-иммерсионный объектив, 20х/0,5; Саг1 2е188 Мюго1тадшд, 1пс.) с ртутной лампой НБО на 100 Вт для эпи-иллюминации. Количество прилипших ЕРС определяли путем подсчета клеток, которые не перемещались или не отделялись от поверхности эндотелия в течение 15 с. Их количество указывается как клетки/мм² поверхности эндотелия.

Модель инфаркта миокарда на мышах ЛОИ^сМ.

Мышей ЛОЭ/8с1Й подвергали анестезии согласно представленному выше описанию. В трахею вставляли трубку для искусственного дыхания. После раскрытия грудной клетки левую нисходящую коронарную артерию лигировали на 45 мин, перевязав нитью. После реперфузии, которая обеспечивалась снятием лигатуры грудную клетку и трахею зашивали. Сразу после этого и через 48 ч выделенные человеческие клетки-предшественники СЭ34+, предварительно обработанные в течение 30 мин составным белком (20 мкг/мл) или эквимолярным количеством Рс-контрольного белка, вводили внутривенно через хвостовую вену. Другая контрольная группа не получала клеток-предшественников после операции. Фракционное изменение площади (РАС) определяли при помощи эхокардиографии через 7 и через

- 16 023016 дней после хирургического вмешательства для оценки функции левого желудочка. Затем мышей умерщвляли и размер площади инфаркта анализировали путем окрашивания Еуапз В1ие и ТТС.

Гуманизация одноцепочечного антитела мыши путем трансплантации СОК.

Одноцепочечный компонент составного белка, взятого из мышиных последовательностей, подвергали гуманизации путем трансплантации СОК. В качестве исходного материала использовали бактериальный вектор экспрессии рЕТ22Ь-8сРу-1Ь, включающий последовательность для одноцепочечного антитела, а также экспрессирующую С.Н133 линию клеток НЕК 293 АС 133/293 вместе с контрольными клетками НЕК 293. Способы, применяемые в процедуре гуманизации, детально перечисляются ниже.

Протокол создания фаг-дисплейной библиотеки.

1. Получение хелперного фага.

Хелперный фаг получали путем инфицирования бактериальных клеток ТО1 лог-фазы хелперным фагом в различных степенях разбавления в течение 30 мин при 37°С и помещения на планшеты 2ΤΥ с агаром. Небольшую бляшку инкубировали в 3 мл жидкой среды 2ΤΥ вместе с 30 мкл суточной культуры ТО1 и выращивали в течение 2 ч при 37°С. Эту культуру разбавляли в 1 л среды 2ΤΥ и выращивали в течение 1 ч. После добавления канамицина до 50 мкг/мл культуру выращивали в течение 16 ч при 37°С. Клетки удаляли путем центрифугирования (10 мин при 5000 д) и фаг осаждали из супернатанта путем добавления 0,25 объема осадителя фагов. После 30 мин инкубации на льду частицы фага собирали путем центрифугирования в течение 10 мин при 5000 д с последующим ресуспендированием бляшки в 5 мл РВЗ и стерилизацией через фильтр 0,22 мкм. Хелперный фаг титровали путем определения количества бляшкообразующих единиц (р£и) на планшетах 2ΤΥ с верхними агаровыми слоями, которые содержали 100 мкл ТО1 (насыщенная культура) и фаг в разных степенях разбавления. Исходный раствор фага разбавляли до 1х 10¹³ р£и/мл и хранили в небольших аликвотных количествах при -20°С.

2. Приготовление исходных библиотечных фагов.

Библиотечные фаги получали путем инокуляции 500 мл 2ΤΥ-0 исходной библиотекой в глицерине и инкубации при 37°С со взбалтыванием при 250 об/мин до оптической плотности при 600 нм 0,8-0,9. К культуре добавляли хелперные фаги УСЗМ13 до окончательной концентрации 5х10 р£и/мл и культуру инкубировали в течение 30 мин при 37°С без взбалтывания, затем в течение 30 мин с легким взбалтыванием при 200 об/мин для инфицирования фагом. Клетки извлекали путем центрифугирования при 2200 д в течение 15 мин и их пеллет ресуспендировали в том же объеме 2ΤΥ-ΑК. Эту культуру инкубировали в течение суток при 30°С с быстрым взбалтыванием (300 об/мин). Клетки гранулировали путем центрифугирования при 7000 д в течение 15 мин при 4°С и супернатант, содержащий фаги, извлекали в предварительно охлажденные 1 л бутылки. 0,3 объема осадителя фагов добавляли к супернатанту, смешивали и инкубировали в течение 1 ч на льду для осаждения фага. Фаг гранулировали путем центрифугирования дважды при 7000 д в течение 15 мин в той же бутылке при 4°С. Как можно большее количество супернатанта удаляли и пеллет ресуспендировали в 8 мл РВЗ. Фаг повторно центрифугировали в меньших пробирках при 12000 д в течение 10 мин и фаг извлекали через супернатант, не повреждая бактериальный пеллет, который может образоваться. И наконец, исходные фаги титровали путем инфицирования клеток ТО1 исходным фагом в разных степенях разбавления, помещения в 2ΤΥ-ΑΟ, инкубации и подсчета количества образовавшихся резистентных к ампициллину колоний. Затем фаги хранили в аликвотных количествах при 4°С.

Протокол пэннинга фаг-дисплейной библиотеки.

На лунки планшета для пэннинга с микротитрованием наносили СО133-комбинированные препараты мембран из экспрессирующих С.Н133 клеток АС 133/293 непосредственно путем инкубации в течение 2 ч при 37°С и блокировали при помощи блокирующего буфера (РВЗ, содержащего 2% молока) при 4°С в течение суток. Блокированные лунки промывали 6 раз 0,1% РВЗТ (РВЗ с 0,1-0,3% Т\\ееп 20 (об./об.)) и смесь одинаковых объемов библиотеки фагов и 4% РВЗМ в общем объеме 0,5 мл добавляли в контрольные лунки [предварительно блокированные]. В течение первого цикла отбора количество частиц фага должно быть как минимум в 100 раз большим, чем размер библиотеки (например, 10¹² с£и для библиотеки из 10¹⁰ клонов). Разнообразие снижается до 10⁶ после первого цикла, и, таким образом, на последующих циклах отбора такой необходимости нет. Планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре для блокирования мест связывания. Входную смесь фагов добавляли в лунки для пэннинга [покрытые белками-мишенями], инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин и промывали 10-20 раз РВЗМТ (РВЗ с содержанием 2% молока). Фаг элюировали путем инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре с 200 мкл кислого элюирующего буфера. Супернатант, содержащий фаги переносили в новую пробирку и нейтрализовали ТТ18-НС1 буфером. Свежую экспонентно выращиваемую культуру ЕксЬепсЫа сой ТО1 инфицировали элюированными фагами и половину их амплифицировали для дальнейших циклов отбора. Оставшийся элюат хранили при 4°С.

Протокол РАСЗ фагового контроля качества.

Клетки АС133/293 собирали в 1 мл РВЗ с содержанием 5 микроМ ЕЭТЛ (10 мкл 0,5М исходного раствора), сразу же смешивали для предотвращения свертывания и держали на льду. Клетки промывали 2-3х РАСЗ буфером (РВЗ с добавлением 1% ВЗА или 5% РВЗ и с содержанием 0,05% №N3) и пеллет

- 17 023016 клеток после окончательного промывания суспендировали в 50 микролитрах РАС8 буфера. 10 мкл растворов фагов добавляли к 50 мкл суспензии клеток, осторожно смешивали и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2-3х РАС8 буфером и суспендировали в 50 мкл РАС8 буфера. 10 мкл раствора антитела [кроля против М13рАЬ-Р1ТС] добавляли к 50 мкл суспензии клеток, осторожно смешивали и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2-3 х РАС8 буфером и суспендировали в 200-300 мкл РАС8 буфера для анализа.

Протокол измерения аффинности с применением фагового РАС8 и программы СгарНРаб Рпзт 4.0.

Нужный фаг-дисплейный зсРу нормализовали до одинаковых титров перед анализом, разбавляли до разных титров и анализировали согласно представленному выше описанию. Выход фагового РАС8 использовали для вычисления постепенного аффинности нужного зсРу согласно примеру в руководстве для пользователей программы СгарНРаб Рпзт 4.0.

Экспрессия и очищение гуманизированного составного белка.

После получения информации о последовательности для клона 26 гуманизированного одноцепочечного антитела последовательность для гуманизированного составного белка собирали ίη зШсо, синтезировали и клонировали (СепеагХ, КедепзЬигд, Германия) в вектор экспрессии млекопитающего рсЭКА5РКТ Опуйгодеп, Саг1зЬаб, СаНТогта). Устойчивую линию клеток получали в соответствии с описанным выше протоколом, согласно которому составной белок экспрессировали и секретировали в супернатант клеток СНО и очищали с применением 1 мл НР-колонки Ηί Тгар на белке С (СЕ НеаИНсаге, Р1зсаХауау, №у бегзеу). Выделенный белок диализировали в течение суток на РВ8.

Испытание связывания гуманизированного составного белка с антигеном СО133, экспрессированным на клетках НЕК 293, путем ЕЫ8А-анализа клеток.

Способ согласно представленному выше описанию, за исключением того, что на 96-луночный планшет с поли-Ь-лизином наносили только 6-7х 10⁴ клеток АС 133/293 на лунку.

Прижизненная микроскопия для определения агрегации тромбоцитов после лигирования левой общей сонной артерии.

Для экспериментов с прижизненной микроскопией использовали самцов мышей С57В1/61. Богатую тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования при 120 хд в течение 10 мин из 1 мл цитратной крови мыши-донора, которую доводили до 2 мл буфером Тугобез, рН 6,5. Супернатант, содержащий тромбоциты, отделяли и тромбоциты флуоресцентно метили путем добавления 20 мкл ацетоксиметилового эфира 5-карбоксифлуоресцеин диацетата (1пуйгодеп) и инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте. Объем дополняли до 4 мл при помощи Тугобез, рН 6,5 и тромбоциты осаждали путем центрифугирования при 900хд в течение 12 мин. Тромбоциты ресуспендировали в 250 мкл Тугобез, рН 6,5, и Тугобез, рН 7,4, соответственно, подсчитывали аликвотное количество и число тромбоцитов доводили до 2,8х10¹⁰/мл. Экспериментальных мышей (24 ± 2 г) подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции раствора медетомидина (0,5 мг/кг массы тела, РП/ег), мидазолама (5 мг/кг массы тела, Росйе) и фентанила (0,05 мг/кг массы тела, 1апззеп-Сбад). Температуру тела в течение операции поддерживали на неизменном уровне 38,5°С при помощи системы гомеотермического покрывала (Нагуагб АррагаХиз). Полиэтиленовый катетер (РогХех) вводили в левую хвостовую вену и после вырезания левой общей сонной артерии 250 мкл (7х10⁹) меченых тромбоцитов вводили путем внутривенной инъекции в хвостовую вену. Затем внутривенно вводили 1 мг/кг массы тела гуманизированного составного белка или эквимолярное количество контрольного белка Рс1дС2. Левую общую артерию сильно лигировали в течение 5 мин, перевязав нитью (7-0 Рго1епе, ЕХЫсоп), чтобы вызвать повреждение сосуда. Участок лигирования контролировали при помощи флуоресцентного микроскопа (Ахюзкор 2 Р8 тоХ, Саг1 2е1зз) с ртутной лампой НВ0 на 100 Вт для эпи-иллюминации и з/у-ССЭ камерой ВС71 (Нот 1тадшд) с разными интервалами времени после лигирования. Агрегаты тромбоцитов определяли путем анализа среднего из трех неподвижных изображений при помощи программы РйоХозЬор С85, причем размер участков с более высокой интенсивностью света, образуемых агрегатами тромбоцитов, измеряли в пикселах, а затем переводили в мкм с применением определенной сетки.

Результаты и обсуждения

Распознавание вариабельных последовательностей, кодирующих моноклональное антитело \У6В3Н10, и построение конструкта.

После ПЦР-амплификации, которая обеспечивала продукты с каждой комбинацией праймера, полосы вырезали из геля, очищали и секвенировали. Собирали последовательности, полученные в результате секвенирования с тремя различными праймерами каждая (фиг. 1) и сравнивали с базой данных 1дС с использованием 1СВ1азХ КС’В1 (НЦр://ууу.псЫ.п1т.п1Й.доу/|дЬ1аз1/).

Для определения последовательностей для одноцепочечных антител (зсРу) в двух возможных ориентациях легкая-тяжелая или тяжелая-легкая лидерную последовательность каждой выбирали из базы данных ν-Вазе (см. йХХр://уЬазе.тгс-сре.сат.ас.ик) для обеспечения секреции антитела в среду клеточных культур млекопитающих.

Последовательности тяжелых и легких цепей соединяли С1у-8ег линкером, кодирующим С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег (8ЕЦ ГО N0: 13). Для возможности выделения одно- 18 023016 цепочечных антител путем аффинной очистки последовательность, кодирующую 81гер Тад II, добавляли на С-конце. Установленные последовательности конструктов под названием зсРу-ΙΗ и зсРу-Ίίί показаны на фиг. 2.

Экспрессия одноцепочечных антител и испытание связывания с СЭ133.

После временной трансфекции клеток СНО одноцепочечными конструктами слабая экспрессия может быть обнаружена при помощи зсРу-ΙΗ (см. фиг. 3).

После крупномасштабной трансфекции может быть выделено достаточное количество белка, который подлежит испытанию на связывание с СЭ133 в ходе ЕЫ8Л-анализа клеток. Параллельно белок также экспрессировался в Е.соН для достаточного образования исходного материала. 8сРу-Ь1, который не может экспрессироваться в клетках СНО, получали и очищали только из Е.соН. (см. фиг. 4).

Для того чтобы определить, распознают ли одноцепочечные антитела их антиген СИ133, трехкратные серийные разбавления одноцепочечных антител инкубировали на фиксированных клетках АС 133/293, экспрессирующих антиген СЭ133 на их поверхности. При явном связывании зсРу-ΙΗ с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне неожиданно было обнаружено отсутствие аффинности зсРу-Ы к СИ133 (см. фиг. 5А).

Этот факт был обусловлен не разными системами экспрессии, поскольку зсРу-Пк очищенный от Е.соН, демонстрирует такие же характеристики связывания, что и у выделенного из культуры клеток млекопитающего.

Для испытания на специфичность взаимодействия зсРу-Ш с СИ133, связывание 2 нМ А6В3Н10 тАЬ с СЭ133 на фиксированных клетках АС133/293 конкурировало с возрастающим количеством одноцепочечного антитела. Это четко продемонстрировало, что зсРу-ΙΗ может эффективно блокировать связывание моноклонального антитела с антигеном СЭ133 (фиг. 5В) с показателем 1С₅₀ 3,1 нМ. Эта неожиданно высокая аффинность может быть обусловлена значительно меньшим размером молекулы, которая делает иммобилизованный СЭ133 для зсРу-ΙΗ более доступным по сравнению с большим тАЬ.

Построение, экспрессия и характеризация составного белка.

После распознавания зсРу-Ш в качестве составляющей составного белка ОРУ1-Рс1дО2 выбирали в качестве второго компонента для бифункционального белка. Если ОРУ1 должен посредничать в связывании с коллагеном, то человеческий Рс-компонент 1дО2 был выбран для обеспечения аффинной очистки с одной стороны и для избежания нежелательных эффекторных функций, связанных с более часто применяемым Рс1дО1, с другой стороны. Таким образом, составной белок был построен таким образом, чтобы за компонентом одноцепочечного антитела зсРу-ΙΗ следовали растворимый гликопротеин VI и Рс1дО2, разделенные тремя аминокислотными ООК-линкерами для большей гибкости (фиг. 6).

Составной белок экспрессировался в адгезионной культуре устойчиво трансфицированных клеток СНО в тройных флаконах Т500. Супернатанты очищали при помощи аффинной хроматографии на белке О. Типичный выход составного белка составлял в пределах 2-2,7 мг/л.

Идентичность и степень чистоты белка контролировали путем вестерн-блоттинга с применением антитела 1дО против человека, связанного с пероксидазой хрена (данные не показаны), и при помощи окрашенного бриллиантовым синим Кумасси полиакриламидного геля (фиг. 7).

Отделение составного белка в восстановительных условиях в результате давало размер полосы приблизительно 90 кДа. Молекулярная масса в невосстановительных условиях составляла приблизительно 180 кДа, что явно демонстрировало, что белок существует в форме димера.

Теоретическая молекулярная масса мономерного белка 79,1 кДа показывает, что он должен подвергаться посттрансляционной модификации, наиболее вероятно - путем гликозилирования.

Для гликопротеина VI тромбоцитов описывается лишь один ^связанный центр гликозилирования на аминокислоте 92 (КитсИ е( а1., 2005). Компонент одноцепочечного антитела не имеет консенсусной последовательности для ^связанного гликозилирования, в то время, как Рс-часть ЦО2 также включает один ^связанный центр гликозилирования. Поскольку эти два центра гликозилирования недостаточны для того, чтобы обусловливать наблюдаемую разницу в размерах, составной белок может содержать дополнительные О-связанные центры гликозилирования.

Характеристики связывания составного белка с СЭ133 и коллагеном.

Связывание составного белка и А6В3Н10 тАЬ с СЭ133 сравнивали с применением ЕЫ8А с фиксированными клетками АС 133/293 (фиг. 8А). Наблюдаемые значения ЕС₅₀ 0,21 нМ для составного белка и 0,12 нМ для А6В3Н10 тАЬ относились к одному порядку величин. Таким образом, свойства связывания составного белка с антигеном СЭ133 были улучшены в сравнении с одноцепочечным антителом, что может лишь частично объясняться димеризацией составного белка, которая приводит к двум идентичным антигенсвязывающим центрам, подобно ситуации, имеющей место в случае антитела полного размера.

Полипептид ОРУРРШдОЗ, следующий за одноцепочечным полипептидом, может иметь определенное стабилизирующее влияние на трехмерную структуру одноцепочечного антитела, что, по-видимому, способствует связыванию антигена. Для подтверждения специфичности связывания осуществляли конкурентный ЕЫ8А-анализ с 2 нМ А6В3Н10 тАЬ и возрастающим количеством составного белка. Эффективное ингибирование связывания тАЬ с фиксированными клетками АС 133/293 подтвердило, что свя- 19 023016 зывание опосредовано СБ133 (см. фиг. 8В).

Также было продемонстрировано связывание составного белка со вторым партнером по связыванию коллагеном I. В ΕΟδΑ-анализе с иммобилизированным коллагеном I связывание составного белка сравнивали со связыванием ОРУ1-Рс1дО1. Для обоих наблюдалось зависящее от дозы связывание, однако показатели аффинности связывания неожиданно оказались разными (фиг. 9А). Специфичность связывания составного белка с коллагеном подтверждалась конкурентным ЕЫ§А-анализом с растворимым коллагеном I (фиг. 9В).

Биспецифическое связывание составного белка в динамических условиях.

В предыдущих экспериментах связывание составного белка с каждым из партнеров по связыванию демонстрировалось отдельно. Для подтверждения бифункциональности молекулы путем одновременного связывания с обоими белками-мишенями на предметное стекло наносили 10 мкг/мл коллагена I, вставляли в проточную камеру, предварительно инкубировали с 10 мкг/мл составного белка и инкубировали с экспрессирующими СБ133 клетками АС133/293 при сдвиговом усилии 2000/с, моделируя условия кровотока человека. Этот эксперимент демонстрирует, что составной белок очень эффективно посредничает в связывании экспрессирующих СБ133 клеток с коллагеном даже при сдвиговом усилии.

Связывание может быть ревертировано путем добавления родительского У6В3Н10 тАЬ, что показывает, что иммобилизация клеток АС133/293 на поверхности коллагена зависит от СБ133 (фиг. 10).

Ш νίνο связывание ЕРС с поврежденными кровеносными сосудами.

Для того чтобы испытать, могут ли экспрессирующие СБ133 ЕРС эффективно рекрутироваться и присоединяться к стенкам поврежденного кровеносного сосуда, ЕРС выделяли из пуповинной крови человека, флуоресцентно метили и предварительно инкубировали с СРУЕЕс составного или контрольного белка, а затем внутривенно вводили в яремную вену подвергнутой анестезии мыши. После повреждения стенки сонной артерии количество присоединенных ЕРС подсчитывали с увеличивающимися интервалами времени. Было четко продемонстрировано, что составной белок значительно увеличивает количество присоединенных ЕРС в сравнении с контрольным белком, с наибольшим количеством клеток через 5 мин после повреждения и с сохранением значительного количества клеток через 60 мин (фиг. 11).

То, что предварительная инкубация ЕРС с контрольным белком также приводит к значительному количеству прилипающих ЕРС, может объясняться установленным фактом, что ЕРС прилипают к местам повреждения сосудов посредством тромбоцитов (АЬои-8а1еБ е1 а1, 2009). Предварительная инкубация с составным белком может быть особенно благоприятной для пациентов с факторами риска заболевания коронарной артерии, у которых число циркулирующих ЕРС является низким и которые могут подвергаться лечению либо путем трансплантации аллогенных ЕРС, либо при помощи выращиваемых ех νίνο аутологичных трансплантатов ЕРС.

Влияние составного белка на функцию левого желудочка и площадь инфаркта в модели инфаркта миокарда на мышах ΝΘΌ/δαά.

Инфаркт у мышей ΝΘΌ/δαά вызывали путем лигирования левой нисходящей коронарной артерии. Влияние применения клеток-предшественников СБ34+. предварительно обработанных 20 мкг/мл составного белка, на функцию левого желудочка и размер площади инфаркта анализировали путем эхокардиографии и окрашивания сердца после умерщвления животного. Поскольку влияние на функцию левого желудочка могло наблюдаться через 7 дней после операции, на 28-й день были очевидными значительные расхождения по сравнению с животными, не получавшими клеток-предшественников, и животными, получавшими клетки-предшественники, инкубированные с Рс контролем (см. фиг. 12А). Лечение с применением составного белка также приводило к значительному уменьшению размера площади инфаркта, как показано на фиг. 12В. Механизмы, лежащие в основе наблюдаемого положительного влияния, до сих пор не выяснены. Многие исследования на животных показали, что лишь малая часть стволовых клеток, прививаемых для восстановления миокарда, дифференцирует в кардиомиоциты или сосудистые клетки, однако предполагается, что наблюдаемое улучшение сердечной функции может быть вызвано трофической поддержкой или паракринными факторами, секретируемыми клеткамипредшественниками, которые могут благоприятно влиять на соседние клетки или активизировать резидентные стволовые клетки сердца (Сгесо & ЬаидЫп, 2010).

Характеризация фагов, экспрессирующих гуманизированное кс-антитело.

Процедура гуманизации антитела путем трансплантации СИЛ, при которой последовательности СИЛ переносили на консенсусную (Н-§иЫ-к и Н-§иЫ-УН) акцепторную каркасную последовательность человеческой подгруппы, приводила к распознаванию трех клонов фага (26, 27, 29) со значительной аффинностью к мембранно-связанному СБ133. РАС8-измерения серийных разбавлений фага показали ΚΌ 32,19 пМ для клона 26 (средний показатель флуоресценции) и 50,78 и 102,9 пМ для клона 27 и 29 соответственно (фиг. 13А, 13В). Для сравнения, фаг, включающий исходное одноцепочечное антитело мыши, демонстрировал ΚΌ 25,63 и 26,93 пМ в двух независимых экспериментах. Оценка гуманизации последовательностей УЪ и УН клона 26 в интерактивном режиме (1и1р://\у\у\у.ЫотГ.ог8.ик/аЬ5/511аЬ/) в сравнении с показателями мышиной донорной и человеческой акцепторной последовательности показала сдвиг в Ζпоказателе в сторону значения человеческой акцепторной последовательности (см. фиг. 14), что подтверждает более свойственную для человеческой последовательности характеристику гуманизированной

- 20 023016 последовательности. Это также может быть продемонстрировано путем сравнения белковых последовательностей мышиного или гуманизированного одноцепочечного антитела с человеческой акцепторной последовательностью (см. фиг. 15). Гуманизированное антитело демонстрирует идентичность последовательности 76% с расхождениями, обусловленными главным образом, различными гипервариабельными участками, в то время как мышиное одноцепочечное антитело является лишь на 59% идентичным по аминокислотной последовательности в сравнении с человеческой акцепторной последовательностью. В обоих выравниваниях связующая линкерная пептидная последовательность была пропущена. Сопоставление выровненной нуклеотидной последовательности гуманизированного составного белка с аминокислотной последовательностью родительской молекулы с одноцепочечным компонентом мышиного происхождения в результате продемонстрировало идентичность последовательности 95% (см. фиг. 16).

Образование гуманизированного составного белка и его экспрессия и характеризация.

Последовательность гуманизированного одноцепочечного антитела, демонстрирующая наивысшую аффинность к мембранно-связанным С.О133 (клон 26), которая относилась к одному порядку величин с одноцепочечной последовательностью мыши, выбирали для образования гуманизированного составного белка ШсРу-Ш-ОР^-Рс (см. фиг. 16). Партию белка образовывали из линии устойчиво трансфицированных клеток СНО и очищали от клеточного супернатанта путем аффинной хроматографии на белке Ο. Идентичность белка подтверждалась вестерн-блоттингом с антителом 1дО против человека, которое связывается с Рс фрагментом составного белка. Степень чистоты контролировали в полиакриламидном геле, окрашенном бриллиантовым синим Кумасси. Как в восстановительных, так и в невосстановительных условиях гуманизированный составной белок демонстрировал одинаковый характер миграции с составным белком с мышиным одноцепочечным компонентом (см. фиг. 18). Таким образом, процесс гуманизации, очевидно, не вносил изменений в составной белок в плане посттрансляционных модификаций, таких, как характер гликозилирования или димеризация молекулы.

Испытание связывания гуманизированного составного белка с антигеном СЭ133 и коллагеном.

Связывание гуманизированного составного белка с трансмембранным белком СЭ133 на устойчивой линии клеток АС 133/293 путем ЕЫ§А-анализа клеток с фиксированными клетками сравнивали со связыванием родительского составного белка (фиг. 19). Показатель ЕС₅₀ обеих молекул, рассчитанный при помощи §1§та Р1о1 11.0, пребывал в том же диапазоне 0,25-0,3 нМ. Конкурентный ЕЫ8А с 2 нМ \У6В3Н10 тАЬ и составными белками в качестве конкурентов подтвердил специфичность связывания и продемонстрировал значения 1С₅₀ 2,7 и 31 нМ для гуманизированного и мышиного составного белка соответственно. Гуманизация составного белка не должна изменять свойства связывания его компонента ΟΓνΐ с коллагеном I. Для подтверждения этого предположения связывание измеряли с применением ЕЫ8А с иммобилизированным коллагеном крупного рогатого скота I. Зависимое от дозы связывание обоих белков может быть продемонстрировано с показателями ЕС₅₀ 4,7 и 6,3 нМ для гуманизированного и родительского составного белка соответственно (см. фиг. 20).

Πι-νίνο влияние гуманизированного составного белка на агрегацию тромбоцитов после повреждения общей сонной артерии на мышиной модели.

Для того чтобы определить, имеет ли гуманизированный составной белок какое-либо влияние на агрегацию тромбоцитов после повреждения общей сонной артерии, флуоресцентно меченные тромбоциты мыши-донора вводили внутривенно с последующим вливанием 1 мг/кг гуманизированного составного белка или эквимолярного количества Рс-контрольного белка и выполняемым сразу после этого лигированием кровеносного сосуда. Определение размера агрегатов тромбоцитов, образовавшихся до 60 мин после лигирования, продемонстрировало очень значительные расхождения между группой, получавшей гуманизированный составной белок, и контрольной группой (р<0,005, 1-тест Стьюдента) см. фиг. 23), подтверждая способность гуманизированного составного белка к конкуренции со связанным с тромбоцитами ОР^ за связывание с коллагеном ίη-νίνο, что, в свою очередь, приводило к снижению активизации тромбоцитов и образованию агрегатов.

- 21 023016

Литература

АЬои-8а1ек Н, УасоиЬ О, Ткеогё! 6Р, ОПйз МА, Иеацое РЕ, ЬаЬаПке В, Ткёгоих Ρ, 5ϊγοϊ5 МО, ТаЬпг1ап М, Ткопп Е, МегН Υ, ЕпбоЙюНа! рго^епког сеПз Ьюб апб ΐηΒΐΡ>ίΙ р1а(е1е( Гипсйоп апб (кготЬиз Готтайоп, Скси1айоп 120 (2009), 2230-2239

Виектапп Α, Оала/ М, Мипск О, ип^егег М, МаззЬег^ 8, Гттипоабкезт сотрП81П§ а §1усорго1е1п VI ботат, Χνθ03104282 (2003)

ОйЬе1 8, Вгек1ш§ Р, Риск® Ρ, Ζο\νο М, Оойег 8, ХУе1зскоГ М, Мо1бепкаиег О, ЬкЙе Мб, 1$о1айоп оГ 1§О апйЬобу Ρν-ΟΝΑ Ггот уапоиз тоизе апб га! куЬпбота сеП Нпез из1п§ 1ке ро1утегазе скат геасйоп ν/кк а з1тр1е зе1 оГ рптегз. 1ттипо1 Ме(кобз 175 (1994), 89-95.

Огесо N & Баи^Ып Мб, итЫНса1 согб Ыооб з(ет сеПз Гог туосагб1а1 герай апб ге^епегайоп. Ме1кобз Μοί ΒίοΙ. 660 (2010), 29-52.

Кип1ск1 Тб, Скей Υ, Μοτοΐ М, Рипка(а К, Тке тйиепсе оГ Ν-Ипкеб §1усозу1айоп оп 1ке Гипсйоп оГ р1а1е!е1 |»1усорго1е1П VI, В1ооб 106 (2005), 27442749 капает Н, Мау АЕ, Виктапп А, 0а\уа7. Μ, ΑΌΑΜ 15 1з ап абкезюп гесергог Гог р!а(е1е1 ОРНЬ-Ша апб тбисез р1а1е1ег асйуайоп, ТкготЬ Наетозй 94, (2005),

555-61

МаззЬег£ 8, Вгапб К, Огбпег 8, Ра§е 8, МиНег Е, МйПег I, Вег§те1ег XV,

Кбск1ег Т, Ьогепг М, Копгаб I, РНезчуапб! В, Оам/аг М, А спйса! го1е οί р1а1е1е! абкезюп ΐη 1ке Ыйайоп оГ а1кегозс!егойс 1езюп Готтайоп, б. Ехр. Меб, 196 (2002),

887-896

Мого! М & бип§ ЗМ, Р1а1е1е1 §1усорго1е1п VI: кз зйисШге апб Гипсйоп,

ТкготЬ Еез. 114, (2004), 221-33.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, к которой относятся:

ΐ. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 или ее комплемента;

и. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 или ее комплемента;

ίίί. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2;

ίν. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2; и

ν. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45°С в 6,0/δδС с последующим промыванием в 0.2/δδί'.'/0.1%ι δΌδ при 65°С.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что выбирается из группы, к которой относятся:

a) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1; и

b) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2;

c) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по п.1, включающий гуманизированный иммуноглобулин, имеющий специфичность связывания с СО133, или части иммуноглобулина, име- 22 023016 ющего специфичность связывания с СГО133.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, отличающаяся тем, что включает векторные нуклеиново-кислотные последовательности.
4. Клетка-хозяин, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3.
5. Полипептид, способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и СГО133 белком, который выбран из группы, к которой относятся:

a) фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2, причем фрагмент включает как минимум 600 заменимых аминокислот ЗЕО ГО N0: 2;

b) вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2, причем вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность ЗЕО ГО N0: 1 или ее комплемент в условиях инкубации при 45°С в 6,0хЗЗС с последующим промыванием в 0,2хЗЗС/0,1% ЗЭЗ при 65°С;

c) полипептид, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности ЗЕО ГО N0: 1 или ее комплемента; и

б) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична ЗЕО ГО N0: 2.
6. Полипептид по п.5, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2.
7. Полипептид по п.5 или 6, отличающийся тем, что включает гипервариабельные участки иммуноглобулина, имеющие специфичность связывания с СО 133.
8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что включает в качестве гипервариабельных участков аминокислотные последовательности ЗЕО ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 и/или 30 или их части.
9. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что включает каркасный участок иммуноглобулина, взятый из иммуноглобулина человеческого происхождения.
10. Полипептид по любому из пп.5-9, отличающийся тем, что является димером.
11. Способ получения полипептида, включающего аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2, причем способ включает культивирование клетки-хозяина по п.4 в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты.
12. Фармацевтическая композиция, включающая полипептид по любому из пп.5-9.
13. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для профилактики, лечения или диагностики сердечно-сосудистого заболевания.
14. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для производства медикамента для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания.
15. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для получения диагностического маркера для неустойчивых бляшек.