JP2002332300A - 抗semp1抗体、その製法及び使用 - Google Patents
抗semp1抗体、その製法及び使用Info
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Abstract
は腫瘍の治療行為において、密着結合タンパク質の欠失
又は発現を検査する抗体が必要とされている。 【解決手段】 本発明では、ガンの診断及び治療に有用
である、密着結合タンパク質SEMP1に結合する抗体を提
供する。本発明の抗体は、抗体DSM ACC2458、DSMACC245
9、DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から選択さ
れる抗体と同様な様式でSEMP1に結合するものである。
Description
ンパク質SEMP1に対する抗体、その製法、並びに診断及
び治療におけるその使用に関する。
が、細胞接着及び細胞増殖の制御を介して、腫瘍発生性
でない正常な細胞活動を規定している。これらの主要な
制御要因の損失が、腫瘍発生の顕著な特徴である。
ーディン(claudin)ファミリータンパク質が、細胞接着
複合体である密着結合の主要な構成成分として同定され
た。マウスのclaudin-1は、明らかに、上皮細胞におけ
る主要な密着結合タンパク質を構成する(Furuse, M., e
t al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550; Furuse,
M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-401)。最
近、ヒト相同体であるSEMP1 (老化関連上皮膜タンパク
質, Swiss Prot. Acc. No. 095832, ヒトCLD1)が、分子
遺伝学的解析により同定された(Swisshelm, K.A., et a
l., Gene 226 (1999) 285-295)。
着性タンパク質が、腫瘍発生に関与するらしいことを示
す多くの証拠が報告されている(Porvaznik, M., et a
l., J.Supramol. Struct. 10 (1979) 13-30; Swift, J.
G., et al., J. Submicrosc.Cytol. 15 (1983) 799-81
0; Chochand-Prillet, B., et al., Ultrastruct. Path
ol. 22 (1998) 413-420; Solar, A.P. et al., Carcino
genesis 20 (1999) 1425-1431; Woo, P.L., et al., J.
Biol. Chem. 274 (1999) 32818-32828)。更に最近、SE
MP1の発現が上皮性の細胞及び組織に独占的であるこ
と、しかしその発現はヒト乳ガン腫瘍細胞においてイン
ビトロでは減少調節されているか、又は完全に失われて
いることも報告されている(Swisshelm, K.A., et al.,
Gene 226 (1999) 285-295)。
あるいはインビボ又はエキソビボでの治療行為におい
て、密着結合タンパク質又はその関連タンパク質の欠失
又は発現を検査するために、ポリクローナル抗体又はモ
ノクローナル抗体が必要である。occludinを認識する抗
体の作製及び適用が、インビトロで成功している(Furus
e, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550;
Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-
401)。しかし、ヒトSEMP1又はそのマウス相同体claudin
-1に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の作
製は、非常に困難であった。マウスclaudin-1に対する
モノクローナル又はポリクローナル抗体を作製できなっ
かったことも報告されている(Furuse, M., et al., J.
Cell Biol.141 (1998) 1539-1550)。
末端細胞内ドメインに対するポリクローナル抗体がウサ
ギで作成された。これは、その他の関連する内在性タン
パク質とは交差しないものである(clone MH25, Zymed L
oboratories Inc., 458 Carlton Court, South San Fra
ncisco, CA94080, Catalog No.71-7800, http://www.zy
med.com/products/71-7800.html)。またマウスclaudin-
1のC末端ドメインに対するモノクローナル抗体がラッ
トで作製された(Furuse, M., et al., J. CellBiol. 14
7 (1999) 891-903)。
ACC2459, DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から
選択される抗体と同様の様式でSEMP1(ヒトCLD-1)ポリペ
プチドに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗
体を提供する。本発明の抗体は、マウスclaudin-1のC
末端細胞内ドメインに対して、無視できないほどに結合
することはない。
用いて抗SEMP1抗体を作製することはできなかったが、
驚くことに、DNA免疫接種により、好ましくはSEMP1ポリ
ペプチドの増強免疫接種(ブースト)の追加により、SE
MP1特異的抗体を作製することが可能であることが分か
った。本発明の方法によれば、SEMP1の全ての部分に対
する抗体、特に細胞外ドメインに対する抗体を容易に提
供することが可能である。後者の抗体は、SEMP1を介し
たシグナル伝達の調節に有用である。
である。DNAの免疫接種というアイデアは、裸のプラス
ミドDNAをマウス筋肉に注射することにより、筋繊維へ
のトランスフェクションを介してトランス遺伝子の発現
が起こり、その結果細胞毒性T細胞(CTL)と抗体応答の
両方が誘導されたという事実に由来する(Barry, M.A.,
et al., Biotechniques 16 (1994) 616-618 and 620; D
avis, H.L., et al., Hum. Mol. Genet. 2 (1993) 1847
-1851; Davis, H.L., et al., Vaccine 12 (1994)1503-
1509; Davis, H.L., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (199
7) 635-646; Lowrie, D.B., Nat. Med. 4 (1998) 147-1
48; Ulivieri, C., et al., J. Biotechnol. 51 (1996)
191-194)。
ター遺伝子又は治療用遺伝子の供給に用いるものと同じ
である。基本的に、確立されている真核細胞用発現ベク
ターのいずれかを用い得る。ほとんどのDNA免疫接種用
ベクターは、多様な宿主細胞内でトランス遺伝子を高レ
ベルで発現させるために、強力なウイルス性プロモータ
ー/エンハンサー配列を含んで成る。また、発現したRN
Aを停止させるために、ポリアデニル化配列も必要であ
る。
ない」とは、従来技術として周知である慣習的な結合検
出方法によって抗体結合を検出できないことを意味す
る。慣習的には、免疫沈降法を用いて抗体結合を調べ
る。免疫沈降における誤差の通常の限界(すなわち「無
視できないほどに結合することはない」という意味にお
ける限界)は約5%以下である。
そのC末端の細胞内ドメイン又はその一部分を意味す
る。このドメインは、配列番号4のアミノ酸185から211
までである。
にコードされる1又は複数のポリペプチドから成るタン
パク質を指す。認知されている抗体遺伝子には、種々の
定常領域遺伝子及び無数の可変領域遺伝子がある。種々
の形態で抗体が存在し、それらには、例えばFv、Fab及
びF(ab)2、更に単一鎖が含くまれる(Houston et al.,PN
AS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Sc
ience 242 (1988) 423-426; Hood et al., Immunology,
Benjamin N.Y., 2nd ed. (1984); Hunkapiller, T., a
nd Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。
ンスジェニック動物により生産された抗体が、特に有用
である(WO 99/00010)。なぜならその様な抗体は、ヒト
抗体と非常に似ているからである。本発明の好ましい抗
体は、SEMP1抗原との相互作用に関して、抗体DSM ACC24
58, DSM ACC2459, DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成
る群から選択される抗体と同じ特性を有するモノクロー
ナル抗体及びその断片である。別のグループの抗体(DSM
2460及びDSM2462)は、SEMP1の細胞内ドメイン(エピトー
プ2(IC2)、図4参照)に対するものである。
の軽鎖ポリペプチドと2つの重鎖ポリペプチドを含んで
成る。その各々の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、抗原と
相互作用する結合ドメインを有する可変領域(一般的に
は当該ポリペプチド鎖のアミノ末端部分)を包含する。
また、その各々の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、当該ポ
リペプチド鎖の定常領域(一般的にはカルボキシ末端)
をも包含する。この領域は、抗体と、宿主の組織又は因
子、例えば免疫系の種々の細胞、貪食細胞、及び古典的
な補体系の第一成分(C1q)との結合を仲介し得る部分で
ある。
完全な鎖であり、その各々は、可変領域と完全な定常領
域とから本質的に成る。本発明の抗体の可変領域を、別
のイソタイプの定常領域に移植することができる。例え
ば、イソタイプγ1の重鎖の可変領域をコードするポリ
ヌクレオチドを、別の重鎖のクラス(又はサブクラス)
の定常領域をコードするポリヌクレオチドに移植するこ
とができる。
することなく、場合により、人間に注射した場合に抗体
の抗原性を実質的に増加させることなく、本発明の抗体
の重鎖及び/又は軽鎖のアミノ酸配列に対して1乃至数
個のアミノ酸置換、特に保存的なアミノ酸置換を行うこ
とができる。場合により、1乃至数個のアミノ酸の欠失
又は付加を行うことができる。典型的には、定常領域又
は可変領域、枠組み構造配列、及び相補性決定領域(CD
R)に対してアミノ酸の置換、付加又は欠失を行う。
るアミノ酸によるアミノ酸置換である(例えば酸性特性
を有するアミノ酸:Asp又はGlu)。保存的アミノ酸置換
により、親配列による構造特性が実質的に変化しないこ
とが必要である。その様なポリペプチド構造の例が、Pr
otein, Structure and Molecular Principles, Creight
on(editor), W.H. Freeman and Company, New York (19
84); Introduction toProtein Structure, C. Brandon
and J. Tooze, Garland Publishing, New York (1981);
Thornton, J.M., et al., Nature 354 (1991) 105-106
に記載されている。
しくは保存的アミノ酸置換)が、天然配列(好ましく
は、抗原に直接に接触しないポリペプチドの一部分)に
おいて行われ得る。本発明の抗体及び方法の範囲内で、
同様な様式でSEMP1に相互作用する多数の別の抗体を見
出すことが可能である。その様な抗体は、寄託した抗体
と同様な様式でSEMP1抗原に結合し得る。
注目する抗体によりエピトープの重複が検出される抗体
を意味する。このエピトープの重複を、競合検査系を利
用して検出することができる。この目的のために、例え
ば酵素免疫検査を利用して、固定化したSEMP1抗原との
結合に関して、ある抗体が既知の抗体と競合する程度を
検査する。
原(例えば、その表面にSEMP1を発現している細胞)
を、前記の1つの寄託抗体に由来する標識抗体と、過剰
量の注目する抗体と共にインキュベーションする。結合
した標識を検出することにより、注目する抗体の結合が
前記の標識抗体の結合を置換する程度を容易に確認する
ことができる。その標識抗体に比べて、注目する抗体の
濃度が同一である場合、又はより高い場合、好ましくは
105倍過剰である場合に、前記の置換が少なくとも20
%、好ましくは少なくとも50%であるならば、エピトー
プの重複が存在する。
結合する限り、完全なポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体、それらの断片(例えばFv, (Fv)2, Fab, Fa
b', F(ab)2)、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体で
あってよい。CDR領域のみ又は、CD30への特異的結合能
を付与するその一部分のみを有する短鎖の抗体断片もま
た、特にその抗体が標識される場合には、適する。イソ
タイプIgG1の抗体が好ましい。
arlow and D. Lane, Antibodies: ALoboratoryManual,
Cold Spring Harbor Press (1988); Bessler, W.G., et
al., Immunobiol. 170 (1985) 239-244; Jung, G., et
al., Angewandte Chemie 97 (1985) 883-885; Cianfri
glia, M., et al., Hybridoma 2 (1993) 451-457を参照
すること。
4に示すペプチド1〜37、より好ましくはペプチド5、
21、29、30及び37に結合する抗体を生産する方法を提供
する。この方法では、ある哺乳動物種に、SEMP1の読み
枠をコードするプラスミドDNA(SEMP1の核酸)を免疫接種
し、次にSEMP1ポリペプチドを免疫接種し、その後抗SEM
P1抗体生産B細胞を単離し、それをミエローマ細胞株と
融合させ、その融合細胞株を単離し、SEMP1に対する抗
体活性を検査し、SEMP1に結合する抗体を生産する細胞
株を単離し、その細胞株からモノクローナル抗体(Mab)
を生産させ、それを、好ましくは実質的に純粋になるま
で、単離する。
ヶ月間にわたって一月毎にDNA接種を繰り返し、そして
B細胞の単離前約3日間毎日SEMP1ポリペプチドを、増
強のために接種する。本発明の方法により、SEMP1ポリ
ペプチド内の全ての免疫原性の領域又はドメインに対す
るモノクローナル抗体及び/又はポリクローナル抗体を
生産することが可能である。
に周知の通りに、好ましくはHarlowE. and Lane D., "A
ntibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harb
or Laboratory (1988)に記載の方法に従ってポリクロー
ナル抗体(Pab)が回収される。
を保持し、その抗原結合にとって重要でない領域内が修
飾されている、本発明の抗体の誘導体を提供する。当該
抗体誘導体を、本発明の抗体から、1又は複数の定常ド
メインの交換及び/又は他の分子との連結により得るこ
とができる。
ドメインの交換を行うことができ、例えば、IgMクラス
の抗体を、その抗原特異性を維持しつつ、IgGクラスの
抗体に転換することができる。このイソタイプの転換
を、周知の細胞生物学的又は分子生物学的手法により行
い得る(Rothman, P., et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1
990) 1672-1679)。
クローナル抗体を生産する方法が好ましく、その場合、
SEMP1抗体の可変領域を、ヒト抗体の定常領域に連結す
る。
治療、血管形成の制御、天然若しくは合成化合物又は細
胞を適用するための脳血液関門の制御、炎症反応の制
御、眼圧の制御などのための本発明の抗体の使用に関す
る。この場合、細胞株DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM
ACC2461及びDSM ACC2463により分泌される抗体から成る
群から選択される抗体を用いることが好ましい。
は、表面に結合しているSEMP1分子、好ましくはSEMP1の
細胞外ドメインと結合するので、それらは、生理学的又
は病態生理学的な密着結合の発現を定性的又は定量的に
検出するために非常に適する。この検出は、周知の通
り、免疫学的な測定方法、好ましくはELISA法により行
われる。この種の方法は周知である。その場合、本発明
の抗体を、標識化及び/又は固定化して、用いることが
できる。
検出可能な標識を結合した少なくとも1つの本発明の抗
体の結合の後にシグナル変化を評価する。診断上のSEMP
1の重要性は、好ましくは、内皮/上皮細胞層の損傷及
び透過性の検出、腫瘍細胞の転移の開始及び/又は進
行、並びに腫瘍発生の進行の同定にある。
過性を促進し、そしてガン、急性/慢性炎症疾患、心筋
虚血、アテローム性硬化症、糖尿病性網膜症、リウマチ
様関節炎、腸管感染の治療又は予防処置のための薬物に
対する内皮/上皮組織の透過性を増加する方法を提供す
る。この場合、好ましくはSEMP1の細胞外ドメインに結
合する本発明の1又は数個の抗体を、場合により通常の
医薬用担体、アジュバント、充填剤又は添加剤と共に投
与する。
ヒト由来の抗体にできるだけ類似する抗体を用いること
が好ましい(Glassy, M.C., and Dillman, R.O., Mol. B
iother. 1 (1988) 7-13)。好ましくは、本発明の抗体の
SEMP1結合配列の一部分又は全部が、ヒトの可変領域内
の対応する配列により置換される様に、本発明の抗体の
可変領域が更に修飾された抗体を用いる。その様な抗体
は、例えば、キメラ抗体又はヒト化(CDR移植化)抗体で
ある。
ーナル抗体から製造する(Morrison,S.L., Annu. Rev. I
mmunol. 10 (1992) 239-265; Winter, G., and Milstei
n,C., Nature 349 (1991) 293-299)。特に好ましい本発
明の態様では、腫瘍特異的なヒト抗体(Borrebaeck, C.
A.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988)
3995-3999; Borrebaeck, C.A.K., Immunol. Today 9
(1988) 355-359)を治療のために用いる。更に、Griffit
hs, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734などの
記載通りに、ファージディスプレーライブラリーを介し
てヒトモノクローナル抗体を調製することが特に好まし
い。
Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring
Harbor, New York及びBerger and Kimmel, Methods in
Enzymology, Vol.152, Guide to Molecular Cloning T
echniques (1987), AcademicPress Inc., San Diego, C
Aの記載通りに、当業界に既知の方法により配列データ
に基づいて、本発明のSEMP1抗体を、組換え技術により
調製することができる。本発明のポリヌクレオチドを、
好ましくは、合成オリゴヌクレオチドから作製する。
既知の標準的な方法により、真核又は原核宿主細胞にお
いて発現させることができる。好ましくは哺乳動物細
胞、例えばリンパ細胞株を宿主細胞として用いる。典型
的には、そのためのポリヌクレオチド構成体は、本発明
の抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域を含んで成る完
全なヒト抗体の重鎖及び/又は完全なヒト抗体の軽鎖を
コードする。
又は軽鎖)が、種々の参考資料から、例えば、限定でな
く、E.A. Kabat et al. (1987) (37)に列挙したものか
ら当業者により選択され得る。本発明の一つの態様で
は、ヒト軽鎖の定常領域のアミノ末端に、本発明の抗体
の軽鎖の可変領域がペプチド連結されている(すなわち
読み枠を一致させた融合)抗体軽鎖と、それに対応する
重鎖とをコードするポリヌクレオチド配列を発現させ、
そして重鎖/軽鎖の二量体及び別の抗体タイプを形成さ
せる。
ル抗体は、細胞接着に関与する細胞表面上に結合してい
るSEMP1抗原に結合するので、それらを、人間のインビ
ボ治療のために用いることができる。従ってまた本発明
は、1又は複数の本発明の抗体を、場合により通常の医
薬用担体、アジュバント、充填剤又は添加剤と共に含有
する医薬組成物を提供する。本発明の当該組成物は、好
ましくはワクチンのアジュバント透過性を改善する。
の薬理学的有効量を含有する滅菌した当該組成物を、前
記疾患の治療のために人間患者に投与する。典型的には
当該組成物は、免疫原性を減弱させるために、本発明の
抗体のCDR領域を含有するキメラ抗体又はヒト化抗体を
含んで成る。
容認される担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発
明の抗体の溶液を含有する。種々の水性担体、例えば
水、緩衝水溶液、0.4%塩水、0.3%グリシン水などを用
い得る。この溶液は滅菌され、一般的には粒状物質を含
まない。当該組成物を通常の周知の方法により滅菌し得
る。
を含んでよく、それらは、ほぼ生理学的条件にするため
に必要なものであり、例えばpH調整剤と緩衝剤、毒性調
整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどであ
る。当該組成物中の本発明の抗体の濃度は広く変動し、
例えば、重量で約0.01%未満から、通常は少なくとも約
0.1%で、多くて5%程度までで変動し、主にその液体
の容量、粘度などに基づいて、又は選択した特定の投与
様式に従って選択される。
は、滅菌緩衝水1mlと、約0.1〜250mg、好ましくは1〜
10mgの本発明の抗体とを含有する。
ましくは非経口投与に適する医薬組成物中に組み込むこ
とができる。好ましくは、0.1〜500mg/ml、好ましくは
0.1〜250mg/mlの抗体を、好ましくは1〜500mmol/lの緩
衝剤と共に含有する注射可能な緩衝溶液として当該抗体
を製剤化する。この注射可能溶液は、液体の剤形でも又
は凍結乾燥品の剤形でもよい。
しくは1〜50mM、最適には5〜10mM)でよく、そのpHは
5.0〜7.0(最適にはpH 6.0)でよい。その他の適当な緩衝
剤には、限定でなく、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムなどが
ある。当該溶液の毒性を改良するために、塩化ナトリウ
ムを0〜300mM(液体剤形の場合最適には150mM)で用い得
る。
〜10%のスクロース(最適には0.5〜1%)を含有し得
る。その他の適当な凍結保護剤にはトレハロース及びラ
クトースなどがある。凍結乾燥品の場合、増量剤、主に
は1〜10%のマンニトールを含有し得る。液体及び凍結
乾燥品の両剤形の場合で、安定化剤、主には1〜50mMの
L-メチオニン(最適には5〜10mM)を用い得る。その他
の適当な増量剤には、グリシン、アルギニンなどがあ
る。界面活性剤、主には0〜0.05%のポリソルベート80
(最適には0.005〜0.01%)を含有し得る。別の界面活
性剤には、限定でなく、ポリソルベート20及びポリオキ
シエチレンエーテル系界面活性剤、例えばBRIJ(登録商
標)などがある。
約0.01〜50 mg/kg体重であり、この用量を繰り返し投与
することができる。好ましい態様では、当該医薬組成物
は、一投与あたり約0.01〜10mg/kgの用量の抗体を含有
する。より好ましくは1mg/kgの用量の抗体を含有す
る。
脈内、皮下、腹腔内、筋肉内投与)である。好ましい態
様では、当該抗体を静脈内点滴又は注射により投与す
る。別の好ましい態様では、当該抗体を筋肉内又は皮下
注射により投与する。
て製造及び保存中に安定である必要がある。当該組成物
は、溶液、微小乳状液、分散液、リポソーム、又はその
他の高濃度薬物に適する整った構造体として製剤化され
得る。滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要な
場合には1又は複数の前記列挙した成分と共に適当な溶
媒に加え、そして濾過滅菌を行うことにより調製され得
る。
礎分散媒体及び前記列挙したその他必要な成分を含有す
る滅菌担体中に加えることにより調製される。滅菌注射
溶液のために滅菌凍結乾燥粉末を調製する場合、その好
ましい方法では、濾過滅菌した当該溶液を真空乾燥又は
噴霧乾燥して、活性成分と任意の希望成分とから成る粉
末を調製する。
グ剤、例えばレシチンの使用により、分散液の場合には
必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活
性剤の使用により維持することができる。注射用組成物
の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステ
アリン酸塩及びオエラチン(oelatin)を組成物中に含有
させることにより達成し得る。
知の種々の方法により、多数の治療適用のために投与す
ることができる。好ましい投与経路/様式は、皮下注
射、静脈注射又は点滴である。投与経路/様式は、希望
する結果に応じて変化する。
物の急速な放出を抑制する担体と共に調製することがで
き、それは、例えば放出制御型製剤、例えば移植体、経
皮パッチ、及び微小カプセル式供給系である。生物分解
性の生体適合ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポ
リ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルト
エステル、及びポリ乳酸を用いることができる。その様
な製剤の調製方法が多数特許されており、又は当業者に
周知である(Sustained and Controlled Release Drug D
elivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekke
r, Inc., New York, 1978)。
品の形で用いられ、そして適当な希釈剤又は担体、例え
ば水、塩水、デキストロース水溶液、緩衝水溶液などと
共に混合され得る。
し、そして使用前に適当な担体中で再構成することがで
きる。通常の凍結乾燥及び再構成の方法が用いられる。
この凍結乾燥と再構成により、生物活性が様々な程度で
損失することがあり、それを補償するために使用量を調
整する必要があろう。
抗体を、当業者に周知の通常の方法により医薬上容認さ
れる投与剤形に製剤化する。医薬上容認される酸又は塩
基付加塩を用いて、抗体を製剤化してもよい。更に、当
該化合物又はその塩を、適当な水和型で用いてもよい。
数の本発明の抗体を、無毒性で且つ治療上有効な量で治
療に用いる。種々の要因、例えば患者のタイプ、年齢、
体重、性別及び症状、腫瘍の種類、投与経路、並びに治
療に用いる抗体の種類に応じて、治療投与様式が選択さ
れる。医師が、既知の抗体治療法に照らして当該薬剤の
有効量を決定し、処方する。その場合、医師は最初に比
較的低用量を用い、それから最大の効果が得られるま
で、その用量を増していくだろう。
ために有用な精製SEMP1ポリペプチドを、真核細胞中で
組換え的に生産することができる。SEMP1は、細胞間の
接触領域に局在する接着性の強い密着結合タンパク質で
あるので(Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 147 (19
99) 891-903)、完全長のポリペプチドを単離及び精製す
ることは非常に難しい。更に、SEMP1は膜結合型タンパ
ク質であるので、膜からタンパク質を解離させることが
必要である。
プロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネー
ト;オクチルグルコシド,デオキシコール酸,Igepal
(登録商標)CA630, (オクチルフェノキシ)ポリエトキシ
エタノール;Triton(登録商標)X-100 (オクチルフェノ
キシ); Thesit, ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテ
ル;ジギトニン)による細胞膜からのSEMP1の遊離は失敗
した。しかし驚くことに、Zwittergent(登録商標)(N-ド
デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホ
ネート, Roche Diagnostics GmbH, DE)によりSEMP1を単
離及び精製することができた。
チドをクロマトグラフィーにより精製する方法である。
この方法では、SEMP1ポリペプチドを含有する水性組成
物をクロマトグラフィーカラムにかけ、そしてN-ドデシ
ル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネー
トの存在下でSEMP1ポリペプチドを溶出し、それをその
溶出液から回収する。
SEMP1ポリペプチドを遊離させる方法であり、その方法
では、水溶液中の膜結合状態のSEMP1ポリペプチドを、
そのポリペプチドが溶解する様にN-ドデシル-N,N-ジメ
チル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにより処理
する。
Hoffmann-La Roche AGにより2000年5月18日にDeutsch
e Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm
bH(DSM) (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig,
Germany)に寄託された。 ────────────────────────────────── 細胞株 抗体 ────────────────────────────────── DSM ACC2458 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン3 DSM ACC2459 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン4 DSM ACC2460 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン5 DSM ACC2461 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン7 DSM ACC2462 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン38 DSM ACC2463 モノクローナル抗体(MAB) 抗ヒトSEMP1;クローン64 ──────────────────────────────────
び37(aa160-171, EC2)により競合阻害される; クローン4:ペプチド21(aa97-108, IC1)により競合阻
害される; クローン7:ペプチド5(aa31-42, EC1)により競合阻害
される; クローン64:ペプチド29(aa136-147, EC2), 30(aa139-1
50, EC2)及び31(aa142-153, EC2)により競合阻害され
る; クローン5:ペプチド41(aa191-202, IC2)により競合阻
害される; クローン38:ペプチド44(aa200-211, IC2)により競合阻
害される。
アミノ酸配列上のアミノ酸番号として括弧内に示す。こ
れを、3Dコンピュータ構造予測モデルのシグナルPに
より確認した(http://genome.cbs.dtu.uk/services/Sig
nalP/)。
フラスコ内で、10%血清(Gibco)、Yeastolate (Gibc
o)、Pluronic F-68、ゲンタマイシン(Gibco)を補充した
IPL41培地(Gibco)中で増殖させた。SEMP1バキュロウイ
ルスを感染させたSf9細胞を大量に単離するために、こ
の細胞を7Lのバッチ発酵槽で培養し、そして接種の3日
後に細胞を収集した。
S, 2mM l-グルタミン(Roche Molecular Biochemicals),
1x 非必須アミノ酸(Biochrom AG), 1mMピルビン酸ナト
リウム(Biochrom AG)及びNutridoma (Roche Molecular
Biochemicals)を補充したRPMI1640培地中で培養した。
抗SEMP1抗体を多量に含む培養上清を得るために、SEMP1
ハイブリドーマ株を、Heraeus miniPerm classic(MWCO
12.5k)培養装置中で増殖させ、細胞濃度が1x107/mlに達
した後1週間に数回その培地を収集した。
2 SEMP1及びl-NGFR(低親和性神経成長因子受容体)(WO 95/
06723)を形質導入したレトロウイルス生産性の両種指向
性細胞株HSR BM01 (DSM ACC2235, WO99/60143)(MoMuLV
系)を、10% FCS, 2mM l-グルタミン(Roche Molecular B
iochemicals), 1x 非必須アミノ酸(Biochrom AG), 1mM
ピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG)を補充したDMEM培
地中で培養した。高力価の上清を得るために、全面密集
に近い培養細胞に新鮮な培地を加え、24時間後にその上
清を収集し(Machl, A.W., Cytometry 29 (1997) 371-37
4)、即座にそれを細胞の形質導入のために用いた。
質導入した前記細胞とを、10% FCS, 2mM l-グルタミン
(Roche Molecular Biochemicals), 1x 非必須アミノ酸
(Biochrom AG), 1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom A
G)を補充したRPMI培地中で培養した。レトロウイルスに
よりSEMP1を形質導入するために、全面密集に近い培養
細胞を、実施例1cの記載通りに調製したレトロウイルス
を含有する上清と共にインキュベーションした。その培
養細胞からFACS(FACS Vantage, Becton Dickinson)によ
り、l-NGFRに対するFITC標識抗体と結合した単一細胞を
選別することにより、SEMP1を発現するMDA-MB435細胞株
を得た。
従ってpBlueBacHis2Bベクターによりクローン化した。
このHis-SEMP1プラスミドと線状化バキュロウイルスDNA
とをSf9細胞にトランスフェクトし、その3日後に上清
を集めた(Invitrogen, Bac'NBlue System)。この高力価
ウイルス保存液をSf9細胞に27℃で再度感染させた。感
染3日後にその細胞を集め、超音波処理により総タンパ
ク質を抽出した(抽出緩衝液:50mM NaP, 150mM NaCl,
pH7.2)。そのタンパク質抽出液を30000gで20分間遠心
し、そのペレットを50mM NaP, 150mM NaCl, 2% Zwitter
gent(N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパ
ンスルホネート, 両性イオン性, Roche Molecular Bioc
hemicals)中に溶解した。
iキレートセファロースカラム(Pharmingen)の親和性ク
ロマトグラフィーにより抽出した。このカラムに300mM
NiCl2を負荷し、平衡化緩衝液(50mM Tris, 500mM NaCl,
pH8, 0.5% Zwittergent)で洗浄し、粗タンパク質分画
を負荷し、そして平衡化緩衝液/10mMイミダゾールで洗
浄した。平衡化緩衝液/200mMイミダゾールで溶出を行
った。N末端のHis6タグとエンテロキナーゼタグのため
に、修飾したSEMP1タンパク質の分子量は23kDから27kD
に増加した。
接種する前に、100μlのカルジオトキシン(10μM/PBS)
(LATOXAN, L-8012; Rosans, France)を両足の脛骨筋内
に注射して、筋の変性/再生を誘発した(0日目)。シ
リカゲル膜カラム(Qiagen, DE)により精製した、SEMP1
の読み枠を有するプラスミドDNA 50μg/50μl滅菌0.9%N
aCl水を、各後脚の前脛骨筋内に注射した。このDNA用量
を4週間毎に5回注射した。
に、眼球穿刺により少量の血清を採取した。血清力価の
最も高いマウスを、前記のSf9細胞から精製したSEMP1タ
ンパク質30μgの静脈投与により免疫増強した。129日目
にこのマウスから脾臓を取り出し、下記の標準的方法に
よりハイブリドーマの作製に用いた。SEMP1陽性のハイ
ブリドーマの大量培養からFACSによる細胞選別クローニ
ング(FACS Vantage, Becton Dickinson)により、高生産
性のハイブリドーマ株を得た。
な方法に従って、ウエスタンブロット分析を行った。種
々の量の精製SEMP1タンパク質、又はSEMP1陽性細胞若し
くはSEMP1陰性対照細胞からの抽出タンパク質を分離し
たゲルを転写したニトロセルロース膜を、SEMP1抗体を
生産するハイブリドーマ株由来の上清(1:10及び1:100希
釈)とインキュベーションした。抗SEMP1のシグナルを、
標準的な化学発光法(Roche Molecular Biochemicals)に
より検出した。
鏡用スライド上で、標準的な培地中で、種々の密度で培
養した。細胞をPBSで洗浄した後、1%パラホルムアル
デヒド/PBSにより室温で1時間固定した。0.05% Tween2
0/10%アルブミン/PBS中で1時間インキュベーションす
ることにより、透過性の亢進及びブロッキングを行っ
た。その後、抗SEMP1抗体と、次にAlexa488で標識され
た抗マウスF(ab)2(Molecular Probes)とにより処理し
て、間接免疫蛍光染色を行った。
るベクターを用いて、SEMP1レトロウイルスを作製した
(Machl, A.W., Cytometry 29 (1997) 371-374)。要約す
ると、5'-LTRプロモーターが、マーカータンパク質l-NG
FRの発現を誘導する。3'下流に位置するSV40プロモータ
ーをCMVプロモーターにより置換し、それによりSEMP1の
発現を誘導する。SEMP1遺伝子を、理想的なKozak配列(K
ozak, M., Nucleic Acids Res. 15(1987) 8125-8148)を
導入したORFとしてクローン化した。
に、SEMP1/l-NGFRレトロウイルスプラスミドを、リポフ
ェクタミン(Gibco)により取扱説明書に従って、レトロ
ウイルス生産性の両種指向性のHSR BM01細胞株にトラン
スフェクトした。FACSにより細胞選別を行い、そしてそ
のHSR BM01細胞株の培養上清による有効な形質導入率を
検査することにより、高力価なレトロウイルスを生産す
るHSR BM01細胞株を得た。この細胞株が生産したレトロ
ウイルスを用いて、例えば腫瘍学的に適当な乳房カルシ
ノーマ細胞に形質導入を行うことにより、抗体特異性及
びSEMP1タンパク質の適正な局在化を証明することがで
きる。
ンブロット分析により確認した。代表的な結果を図2に
示す(矢印参照;SEMP1ハイブリドーマ株38による)。S
EMP1陽性細胞のみ、例えばSAEC(小気管上皮細胞)及びCA
CO-2が、予想分子量の約23kDの位置にシグナルを有す
る。予想通り、造血細胞株K562はSEMP1陰性である。更
にSEMP1陰性乳房カルシノーマ細胞株MDAMB435では、SEM
P1タンパク質バンドは認められず、一方レトロウイルス
により形質導入した前記細胞株MDAMB435xSemp1では、強
いSEMP1のバンドが認められた。
の種々の細胞内及び細胞外エピトープに対するモノクロ
ーナル抗体を生産する種々のSEMP1ハイブリドーマ株が
得られた。図3は、細胞におけるSEMP1抗体の結合特異
性を示す。4回膜貫通型タンパク質であるSEMP1は、細
胞間の接触部位にのみ局在する(矢印参照;SEMP1ハイ
ブリドーマ株38による)。
を選別した。Hisタグ付加SEMP1による96ウエルプレート
のコーティング;1%ウシアルブミンによるプレートの
ブロッキング;洗浄(PBS/0.05%Tween20により2回);
抗SEMP1活性を有するハイブリドーマ血清とのインキュ
ベーション、ポジティブコントロールとして抗His抗体
とのインキュベーション;洗浄;ペルオキシダーゼ結合
二次抗体とのインキュベーション;洗浄;ペルオキシダ
ーゼ基質(ABTS溶液)とのインキュベーション。
ために、補完的なペプチドを用いてELISAを行った。そ
のために、SEMP1の親水性領域に由来する44個のペプチ
ドを合成し、そして各反応毎に抗SEMP1抗体を含む上清
とインキュベーションした。多量のペプチドを用いるこ
とにより、そのペプチドがエピトープに相当した場合、
抗SEMP1抗体とHisタグ付加SEMP1との結合が低下する。
その発色シグナルの低下を、ペプチドとインキュベーシ
ョンしていない上清の場合と比較して測定した。
の試み 融合ペプチド(QWRIYSAGD)-KLH (テンガイヘモシアニン
に結合した配列番号1のペプチド)及びKLH-(MKCMKCLEDD
EMQKM) (テンガイヘモシアニンに結合した配列番号2の
ペプチド)を、フロイントアジュバントと共に、2匹の
ウサギに注射した。免疫接種1回につき合計0.1mgのペ
プチドを3カ所の皮下に注射した。0,2,6及び8週
目に注射を行った。ドットブロット上では前記ペプチド
に対して、血清は高い抗体力価を示したが、細胞抽出物
に対して又はFACS分析において、この血清は機能しなか
った。
ローン3(Peters, J.H., et al.,"Monoklonale Antikor
per", Springer Verlag, Berlin, 1985, pp.209-212に
基づいて調製した);10mmol/lクエン酸緩衝剤;47mmol/
lリン酸緩衝剤、pH6.3;50mU/mlのペルオキシダーゼ連
結モノクローナル抗体クローン5(Wilson, M.B.,and Na
kane, P.K., 1978, in Immunofluorescence and Relate
d Staining Techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wi
ck eds., pp.215-224, Elservier/North Holland, Amst
erdamに基づいて調製した;この活性はペルオキシダー
ゼによる)。
剤、pH4.4;3.2mmol/l過ホウ酸ナトリウム;1.9mmol/l
ABTS(2,2-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-ス
ルホン酸塩))。各々3, 5, 10及び25ng/mlの組換えSEMP1
を加えたヒト血清を試料として用いる。ストレプトアビ
ジンで被覆されたポリスチレン製小チューブ(EP-A02690
92に基づいて調製した)を用いて反応を行う。
料と1mlの試薬1とを20〜25℃で60分間インキュベーシ
ョンした後、その溶液を吸引し、そして水道水で2回洗
浄する。次に試薬2を加え、20〜25℃で30分間インキュ
ベーションし、そして420nmの吸光度を光度計で測定す
る。この様にして標準曲線を得て、それにより検査試料
中のSEMP1濃度を決定する。
正常組織及び乳ガン組織のパラフィン切片を調べた。図
5は、抗SEMP1抗体(図5A, B)により、そして対照として
非結合性抗体(C, D)により染色した切片を示す。本発明
の抗SEMP1抗体は、種々の腺構造の上皮細胞のみに特異
的に結合しているが、周囲の間葉性支質組織は染色され
ていない。
てその膜が染色されていることが示される。この図で
は、乳腺の切片において、小葉構造(上皮細胞)とは別
に、管構造(内皮細胞)も本発明の抗体により染色され
得ることは示されていない。
1の発現は、正常組織に比べて有意に低い。このことが
図6及び7に示されている。乳房又は結腸の正常組織で
は、SEMP1はその上皮細胞の膜部分に特に認められ、一
方腫瘍組織では、その膜及び細胞質にいくらかの染色が
認められた。しかし腫瘍組織の染色は、正常組織に比べ
てかなり低かった。
房腫瘍組織の8つの切片との比較を示す。図7では、特
に小葉構造が染色されている。いずれの場合も、それら
の膜に染色が認められる。乳房腫瘍組織の切片のいずれ
でも、膜の染色を検出することはできなかったが、正常
乳房組織ではそれが認められた。乳房腫瘍組織では、常
に細胞質が薄く均一に染色されている。
は、細胞間の密着結合状態を診断するために有効に用い
られること、従ってこれは腫瘍発生及び/又は腫瘍進行
のための貴重なマーカーとなることが証明される。
ロウイルスを感染させたSf9昆虫細胞(Research Diagnos
tic Inc., NJ, USA)で、Hisタグ付加SEMP1を発現させ
た。Sf9細胞の溶解液の粗上清から、Niキレートカラム
によりHisタグ付加SEMP1を精製した。200mMイミダゾー
ルで溶出することにより、最高の収量及び純度が得られ
た。矢印は、Hisタグ付加SEMP1タンパク質の位置を示
す。
発現。ウエスタンブロット法による抗SEMP1モノクロー
ナル抗体の特異性の分析。SEMP1陰性細胞(造血細胞株K5
62、乳ガン細胞株MDA-MB435)、及び陽性細胞(SAEC(小気
管上皮細胞)、アデノカルシノーマCACO-2、SEMP1レトロ
ウイルスにより形質導入した乳ガン細胞MDA-MB435)を全
面密集に成るまで増殖させ、溶解し、そしてウエスタン
ブロット分析した。矢印は、天然のSEMP1タンパク質の
位置を示す。
ク培養した、SEMP1を形質導入したMDA-MB435細胞におけ
るSEMP1の発現を、蛍光顕微鏡により分析した。S字状
のSEMP1染色パターンから、その発現の特異性及び細胞
間接触部位への局在化が示される。
クローナル抗体5のエピトープマッピング。配列番号4
のアミノ酸(aa)22-81は第一細胞外ドメイン(EC1)であ
り、aa 103-117は第一細胞内ドメイン(IC1)であり、aa
141-163は第二細胞外ドメイン(EC2)であり、aa 185-211
はC末端の細胞内ドメイン(IC2)である。aa 1-21(N末
端), 82-102, 118-140及び164-184は膜ドメインであ
る。
パク質の発現。SEMP1タンパク質を抗SEMP1/抗マウスPO
Dにより染色し、そしてカウンター染色をヘマトキシリ
ンにより行った(パネルA及びB)。二次抗体の抗マウ
スPODによるコントロール染色をパネルC及びDに示
す。パネルA及びC内の四角の枠は、パネルB及びDに
おいて拡大した領域を示す。
び結腸の腫瘍組織とのSEMP1発現の比較。図5の記載通
りに染色した。
正常乳房組織とのSEMP1染色の比較。図5の記載通りに
染色した。
Claims (6)
- 【請求項1】 SEMP1抗原に結合する抗体であって、抗
体DSM ACC2458、DSMACC2459、DSM ACC2461及びDSM ACC2
463から成る群から選択される抗体と同様な様式でSEMP1
に結合する前記抗体。 - 【請求項2】 細胞株DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM
ACC2460、DSM ACC2461、DSM ACC2462及びDSM ACC2463か
ら成る群から選択される細胞株から得られる抗体。 - 【請求項3】 細胞株DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM
ACC2460、DSM ACC2461、DSM ACC2462及びDSM ACC2463。 - 【請求項4】 抗体DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM AC
C2461及びDSM ACC2463から成る群から選択される抗体と
同様な様式でSEMP1に結合する抗体を生産する方法であ
って、ある哺乳動物種にSEMP1の核酸を免疫接種し、そ
して次にSEMP1ポリペプチドを免疫接種すること、及び
その動物の細胞又は体液から前記抗体を単離することを
特徴とする、前記方法。 - 【請求項5】 請求項1又は2に記載の抗体を0.1〜500
mg/mlの量でpH5.0〜7.0で含有する組成物。 - 【請求項6】 請求項1又は2に記載の抗体を含有する
組成物の調製方法であって、その組成物中の抗体の濃度
が0.1〜500 mg/mlであり、その組成物のpHが5.0〜7.0で
ある様に、前記抗体の水溶液を緩衝水溶液と混合する、
前記方法。
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