PT1167389E - Anticorpos contra smp1, processos para a sua produção e as suas utilizações - Google Patents

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ANTICORPOS CONTRA SEMPl, PROCESSOS PARA A SUA PRODUÇÃO E AS

SUAS UTILIZAÇÕES A presente invenção tem por objecto anticorpos contra a proteína humana das juntas herméticas ("tight junction") SEMPl, processos para a sua produção e as suas utilizações em diagnóstico e terapia. 0 ambiente extra-celular das células de mamíferos determina, por via da regulação da adesão das células e da proliferação das células, um comportamento normal, não tumorigénico das células in vivo. As perdas destes elementos principais de controlo são as marcas da tumorigénese.

Recentemente identificaram-se a ocludina e os elementos da família das caludinas como os constituintes principais da junta hermética do complexo de adesão das células. A claudina-1 de murino constitui obviamente a principal proteína da junta hermética nas células epiteliais (Furuse, M., et al., J. Cell Biot 141 (1998) 1539-1550; Furuse, M., et al., J Cell Biol. 143 (1998) 391-401) e a homóloga humana de SEMPl (proteína da membrana epitelial associada a senescência, Swiss Prot. Ace. No. 095832, CLD1 humana) foi identificada recentemente por análise genética molecular (Swisshelm, K. A., et al, Gene 226 (1999) 285-295). Há uma grande evidência de que a junta hermética como o contacto de célula-célula e a proteína de selagem possam estar envolvidas na tumorigénese (Pcrvaznik, . et al., J. Supramol. Struct. 10 (1979) 13-30; Swift, J. G., et al., J. Submicrosc. Cytol. 15 (1983) 799-810; Chochand-Prillet, E., et al., Ultrastruct. Pathol. 22 (1998) 413-420; Soler, A. P., et al., Carcinogenesis 20 (1999) 1425-1431; Woo, P. L., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 32818-32828). Alem disso, foi recentemente demonstraao que a expressão de SEMP1 pode ser encontrada exclusivamente em células e tecidos com origem no epitélio mas que é desregulada ou se perde completamente em células de tumor cancerígeno da mama humana, in vitro (Swisshelm, . A., et al, Gene 226 (1999) 285-295) . A perda ou a expressão das proteínas da junção hermética ou das moléculas associadas na avaliação de diagnóstico de tumorigénese e/ou da progressão do tumor ou na intervenção terapêutica in vivo ou ex vivo requer anticorpos monoclonais ou policlonais. A geração e a aplicação de anticorpos para identificar a ocludina têm sido demonstradas sucessivamente in vitro (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-401). Contudo, encontraram-se dificuldades significativas para gerar anticorpos monoclonais ou policlonais contra a SEME-1 humana ou a sua homóloga de rato claudina-1. Resultados que desapontaram foram também relatados quanto a geração de anticorpos monoclonais ou policlonais coontra claudina-1 de murino (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539— 1550) .

Mais recentemente, gerou-se um anticorpo policlonal em coelhos contra o domínio intracelular do terminal 0 da proteína claudina-1 de murino, que não reage de forma cruzada com outras proteínas endógenas relacionadas íclone MH25, Zymed Laboratories Inc., 458 Carlton Court, South San Francisco, CA 94080, No. de catálogo 71-7800, dato; //hõu , lamadO .hlarl-i e gerou-se um anticorpo monoclonal contra o domínio do terminal C da claudina-1 de murino em ratos (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 147 (1999) 891-903) . A presente invenção nem por Isso por objecto anticorpos monoclonais e policlonais que se ligam ao polipeptido SEMPl (CLD-1 humana) de uma maneira equivalente a um anticorpo seleccionado no grupo que consiste nos anticorpos DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 e DSM ACC2463.

Esse anticorpo, de acordo com a presente invenção, não se liga a um considerável número de domínios intracelulares do terminal C de claudina-1 de murino.

Surpreendentemente, verificou-se que, apesar das tentativas falhadas para gerar anticorpos anti-SEMPl utilizando fragmentos do polipéptido de SEMPl para imunização, é possível gerar anticorpos específicos de SEMPl utilizando a vacinação com ADN, preferencialmente com um reforço adicional com polipéptido de SEMPl. De acordo com o processo da presente invenção é agora possível providenciar facilmente anticorpos contra todas as partes de SEMPl, especialmente contra os domínios extracelulares, que são úteis para a modulação da transdução do sinal por via de SEMPl. A vacinação com ADN é possível de acordo com o estado da técnica. O conceito de imunização com ADN originado na observação de que o ADN simples de plasmido injectadc nos músculos de rates resulta na transfecção de fibras musculares, na expressão do transgene e na indução tanto de uma CTC (célula T como ae ma resposta ao anticorpo (Barry, Μ. A., et al., Biotechniques 16 (1994; 616-618 e 620; Davis, H. L., et a . Hum. Mol. Ghausio 2 (1993) 1847-1851; Davis, H. L., et al., Vaccine 12 (1994) 1503-1509; Davis, H. L., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1197) 635-646; Lowrie, D. B., Nat. Med. 4 (1998; 147-148; Ulivieri, C., et sl,, J. Biotechnol. 51 (1996) 191-194). As estruturas utilizadas para a imunização com ADN são idênticas as utilizadas para a libertação aos ge&es repórteres ou dos genes terapêuticos. Basicamente, pode-se utilizar qualquer um dos vectores de expressão eucariótica estabelecidos. A maior parte dos vectores de imunização de ADN compreende uma sequência de um forte promotor viral/de sequência melhoradora para conduzir a níveis elevados de expressão de transgenes numa ampla variedade de células hospedeiras. Também e necessária uma sequência de poliadenilação para terminar o ARN expresso.

Tal como se utiliza aqui, a expressão "não se liga num grau considerável" significa que a ligação do anticorpo não pode ser detectada por processos convencionais de detecção dessas ligações que são conhecidas da técnica anterior. Habitualmente, aplica-se a imuno-precipitação para determinar a ligação. 0 limite convencional do erro na imuno-precipitação (e assim no significado de "não se liga num grau considerável") é de cerca de 5 %.

Tal como se utiliza aqui, a expressão "terminação C da claudina-1 de murino" significa o domínio intracelular do terminal C ou uma parte dele. Este domínio consiste nos arninoácidos 185-211 da SEQ ID NO: 4.

Tal como se utiliza aqui, g termo "anticorpo" refere-se a uma proteína que consiste em um ou mais polipéptidos praticamente codificados pelos genes do anticorpo. Os genes do anticcrpo reconhecidos incluem os genes diferentes da região constante assim como a miríade de genes da variável do anticorpo. Os anticorpos podem existir numa variedade de formas, incluindo, por exemplo, Fv, Fab e Fl-sfcUg assim como as cadeias simples (por exemplo, Houston >:·r. al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R. E., et al., Science 242 (1988) 423-426; e, em geral, Hood et al., Immunology, Benjamin N. Y., 2" edição (1984) e Hunkapiller, T., e Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16). Os anticorpos especialmente produzidos em animais transgénicos não humanos que expressam os receptores humanos de Fc são úteis (ver a patente de invenção WO 99/00010) dado que esses anticorpos são bastante semelhantes aos anticorpos humanos. Os anticorpos preferidos, de acordo com a presente invenção, são anticorpos monoclonais e os seus fragmentos com as mesmas características em relação a interacção do antigénio de SEMPl como um anticorpo seleccionado no grupo que consiste nos anticorpos DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 e DSM ACC2463.

Um outro grupo de anticorpos (DSM 2460 e DSM 2462) é dirigido ao domínio intracelular (epítopo 2 (IC2), ver Fig. 4) de SEMPl. O anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos duas cadeias leves de polipéptidos e duas cadeias pesadas de polipéptidos. Cada uma das cadeias leves e pesadas de polipéptidos contém uma região variável (geralmente a porção do terminal amino da cadeia de polipéptido) que contém um domínio de ligação que interage com o antigénio. Cada uma das cadeias leves e pesadas de polipéptidos também compreende uma região constante das cadeias de polipéptidos (geralmente, a porção do terminal carboxi) que pode mediar a ligação do anticorpo aos tecidos hospedeiros ou aos factores incluindo várias células dos sistema imunitário, algumas células fagocíticas e um primeiro componente (Clq) dos sistema clássico do complemento. Normalmente, as cadeias leves e pesadas de polipéptidos são cadeias completas, cada uma delas consistindo essencialmente numa região variável e numa região constante completa. As regiões variáveis do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser enxertadas em regiões constantes de outros isotipos. Por exemple, um polinucleótido gue codifica a região variável de uma cadeia pesada do isotipo γΐ pode ser enxertado no polinucleótido gue codifica a região constante de outra classe de cadeias pesadas (ou sub-classe) .

Alem disso, de uma maneira geral pode-se fazer uma ou várias substituições de aminoácidos, especialmente substituições conservadoras na seguência de aminoácidos das sequências de cadeia pesada e/ou de cadeia leve dos anticorpos da presente invenção, sem interferir de forma substancial na ligação do antigénio e, em alguns enquadramentos, sem praticamente aumentar a antigenicidade do anticorpo quando injectado num paciente humano. Nalgumas variações, podem fazer-se eliminações ou adições de um ou mais aminoácidos. Normalmente, as substituições, adições ou eliminações de aminoácidos são feitas em regiões constantes ou em regiões variáveis, sequências estruturais e nas sequências de determinação de complementaridade (SDC) .

Structures A substituição conservadora de aminoácido é uma substituição de um aminoácido por uma substituição de uss aminoácido que tem caracteristicas similares (por exemplo, as que têm propriedades ácidas: Asp ou Glu) . Uma substituição de aminoácido conservadora não deve alterar significativamente as características estruturais da sequência parental. Exemplos dessas estruturas de polipéptidos estào descritas em Proreins, Structures and

Molecular Principies, Creighton (editor), W. H. Freeman and Company, New York (1984), Introduction to Protein Structure, C. Brandon e J. Tooze, Garland Publishing, New York (1981) e em Thornton, J. M., et al., Nature 354 (1991) 105-106.

For exemplo, as substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (preferencialmente substituições de aminoácido conservadoras) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural (preferencialmente na porção do polipéptido que não contacta directamente com o antigénio).

Com os anticorpos e os processos de acordo com a presente invenção é possivel encontrar um grande número de outros anticorpos que interagem com SEMPl de uma forma análoga. Esses anticorpos podem ligar-se ao antigénio de SEMPl de uma forma equivalente aos anticorpos depositados.

Pela expressão "anticorpos que se ligam de uma forma equivalente" deve entender-se anticorpos no caso em que uma sobreposição do epítopo é detectável com os anticorpos em questão. A sobreposição do epítopo pode ser detectada com a ajuda de um sistema de análise comparativa. Com este fim, por exemplo com a ajuda de um imuno-ensaio de enzima, ensaia-se a extensão em que o anticorpo concorre com o anticorpo conhecido no que respeita a ligação a um antigénio imobilizado de SEMPl. Com este fim, faz-se a incubação de um antigénio apropriadamente imobilizado (por exemplo um SEMPl que expressa células na sua superfície) com um dos anticorpos depositados numa forma marcada e com um excesso do anticorpo em questão. For meio da detecção da marcação da ligação pode-se facilmente confirmar a extensão em que o anticorpo em questão pode deslocar o anticorpo definitivo da ligação. Se houver uma deslocação de pelo na mesma menos 20 %, preferencialmente de pelo menos 50 %, concentração ou em concentrações mais elevadas, preferencialmente no caso de um excesso de 105 do anticorpo em questão, em referência a um dos anticorpos depositados, então a sobreposição do epitopo está presente.

Os anticorpos podem ser utilizados como anticorpos completos monoclonais ou policlonais, os seus fragmentos (por exemplo, Fv, (Fv)2, Fab, Fab', F(ab)2), anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos, desde que eles se liguem a SEMP1 de uma forma apropriada. Os fragmentos do anticorpo de cadeia curta que contêm apenas as regiões SDC ou as suas partes que conferem a ligação especifica a CD30 são também apropriados, especialmente se o anticorpo é um anticorpo marcado. Preferem-se os anticorpos do isotipo de IgGl.

Quanto à produção de anticorpos monoclonais, ver, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Bessler, W. G., et al., Immunobiol. 170 (1985) 239-244; Jung, G., et al., Angewandte Chemie 97 (1985) 883-885; ou Cianfriglia, M., et al., Hybridoma 2 (1993) 451-457. A presente invenção também tem por objecto um processo para a produção de anticorpos que se ligam ao antigénio de SEMPl, preferencialmente aos péptidos 1-37, mais preferencialmente aos péptidos 5, 21, 29, 30 e 37 (Fig. 43 que se mencionam a seguir, em que se imunizam espécies de mamíferos com um plasmido de ADN de SEMPl que codifica para um quadro de leitura aberto (sequência longa de ADN que não tem codão de paragem) ae SEMPl e em seguida com um polipéptldo de SEMPl, isolam-se as células B que produzem os anricorpos anti-SEMPl e fundem-se com linhas ae células de mieloma, isolam-se as linhas de células fundidas e ensaiam-se quanto a actividade do anticorpo contra SEMP1, isolam-se as linhas de células que produzem os anticorpos que se ligam a SEMP1, produzem-se os anticorpos monoclocais (Acms) a partir das referidas linhas de células e isolam-se, preferencialmente até a uma pureza substancial. Preferencialmente realiza-se a imunização durante um período de cerca de 3 a 5 meses com imunizações repetidas de ADN a intervalos de um mês e com um reforço diário com polipéptido de SEMP1 durante cerca de 3 dias antes do isolamento das células B. Com o processo de acordo com a presente invenção é possível produzir anticorpos monoclonais e/ou policlonais contra todas as regiões ou domínios imunogénicos do polipéptido de SEMPl.

Recuperam-se os anticorpos policlonais (Paks), depois de uma imunização com ADN, de acordo com o estado da técnica, preferencialmente de acordo com os protocolos descritos em Harlow E. e Lane D., "Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988). A presente invenção também tem por objecto derivados de anticorpos de acordo com a presente invenção, que possuem a sua especificidade de ligação, mas com modificações na região que não é importante para a ligação do antigénio. Estes derivados de anticorpos podem possivelmente ser obtidos a partir de anticorpos de acordo com a presente invenção por meio de da permuta de um ou mais domínios constantes e/ou ligações com outras moléculas. Assim, por exemplo, uma permuta de domínios constantes para um isotípo pode ser realizada em que, por exemplo, se pode côsuesriêf um anticorpo da classe IgM num anticorpo da classe IgG, com manutenção da sua especificidade antigéníca. Esta trcca de isotipos poae ter lugar por meio tís; processos biológicos das células ou processos biológicos moleculares que são bem conhecidos (ver, por exemplo, Rothman, P., et al., Mol. Coll. Biot. 10 (1990) 1672-1679) . Há um processo preferido para a proauçãc de Acms com uma imunogeneicidade reduzida em seres humanos, em que as regiões variáveis dos anticorpos de SEMP1 estão ligaaas a regiões constantes de um anticorpo humano. A presente invenção tem também por objecto a utilização de um anticorpo de acordo com a presente invenção para o diagnóstico ou a terapia de, por exemplo, terapia de tumores, controlo da angiogénese, controlo da barreira do cérebro ao sangue aplicando compostos químicos ou naturais ou células, controlo de resposta inflamatória, controlo da pressão dos olhos, etc. É por isso preferível utilizar um anticorpo seleccionado no grupo de anticorpos segregados pelas linhas de células DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 e DSM ACC2463.

Dado que os anticorpos preferidos que se podem obter pelo processo de acordo com a presente invenção se podem ligar as moléculas de SEMPl ligadas a superfície e sendo especialmente preferido com o domínio extracelular de SEMPl, são extraordinariamente bem apropriados para a detecção qualitativa ou quantitativa da expressão fisiclógica ou patofisiológica das juntas herméticas. A detecção tem por isso lugar de uma forma conhecida por meio de :am processo ímunclógico de determinação, preferencialmente por meio de uma análise por S . Os processos deste tipo são bem conhecidos e necessitam de mais explicações aqui. Os anticorpos obtidos de acordo com a presente invenção podem assim ser utilizados numa forma marcada e/ou imobilizada.

Em cada caso desses processos imunológicos de diagnóstico, avaliou-se uma alteração de sinal no seguimento da ligação de pelo menos um anticorpo ae acordo com a presente invenção, ao qual está ligado a um marcador detectável. A importância do diagnóstico de SEMP1 é preferencialmente a detecção de danos na camada das células endoteliais/epiteliais e a permeabilidade, identificação de metástases de células tumorais no inicio e /ou no progresso da tumorigénese. A presente invenção também tem por objecto um processo para aumentar a permeabilidade de adjuvantes de vacinas, aumentar a permeabilidade de tecidos endoteliais/epiteliais com medicamentos para o tratamento terapêutico ou profiláctico do cancro, doenças inflamatórias agudas ou crónicas, isquemia do miocárdio, ateroesclerose, retinopatia diabética, artrite reumatóide, injecção intestinal, em que se administra um uma mistura de vários anticorpos de acordo com a presente invenção, preferencialmente a ligação a um domínio extracelular de SEMPl, eventualmente em conjunto com um veículo, adjuvante, carga ou materiais aditivos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Para a prevenção de uma resposta imunitária durante a aplicação farmacêutica, e preferível utilizar anticorpos que se pareçam tanto quanto possível com os anticorpos de origem humana (Glassy, M. G., e Dillman, R. 0., Mol. Biother. 1 (1988) 7-13). Preferencialmente, utilizam-se anticorpos em que a região variável de um anticorpo de accrdo com a presente invenção é ainda modificado nessa parte ou em toda a sequência de ligação de SEMP1 do referido anticorpo que são substituídas pelas sequências correspondentes de uma região variável humana. Esses anticorpos são, por exemplo, anticorpos quiméricos ou humanizados (enxertados em SDC). Esses anticorpos sáo normalmente fabricados a partir de um anticorpo monoclonal de roedor (ver, por exemplo, para revisão Morrison, S. L., Annu. Rev. Immunol. 10 (1992) 239-265; Winter, G., e Milstein, C., Nature 349 (1991) 293-299). Num enquadramento especificamente preferido da presente invenção, utilizam-se anticorpos específicos dos tumores (Borrebaeck, C. A. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 3995-3999; Borrebaeck, C. A. K., Immunet. Today 9 (1988) 355-359) para fins terapêuticos. Alem disso, prefere-se especificamente preparar ACms humanos por via de bibliotecas que contém fagos, tal como se descreve, por exemplo, em Griffiths, A. D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734).

Os anticorpos de SEMP1 produzidos por via recombinante da presente invenção podem ser preparados com base nos dados da sequência de acordo com processos conhecidos na técnica e descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edção (1989), Cold Spring Harbor, New York; e Berger e Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press Inc., San Diego, CA. Os polinucleótidos da presente invenção são formados, preferencialmente, a partir de oligonucleótidos sintéticos.

Esses polipéptídos recombinantes podem ser expressos em células hospedeiras eucarióticas ou procariótícas de acordo com processos padrão conhecidos na técnica, preferencialmente células de mamíferos, tais como Linhas de células de linfócltos que se podem utilizar como células hospedeiras. Normalmente, essas estruturas de polinucleótidos codificam uma cadeia pesada completa de anticorpo humano e/ou uma cadeia leve completa de anticorpo humano, de acordo com a presente invenção, regiões variáveis de cadeia pesada e/cu de cadela leve, respectivamente. As sequências alternativas da região humana constante (cadeia pesada e/ou cadeia leve) podem ser seleccionadas pelos especialistas na matéria a partir de varias fontes de referência, incluindo, mas não se limitando às listadas em E. A. Kabat et al. (1987) (37 ). Num enquadramento da presente invenção, uma sequência de polinucleótido que codifica uma região constante humana, de cadeia leve, que compreende uma cadeia leve de anticorpo, com uma ligação do péptido do terminal amino (isto é, uma fusão na estrutura) a uma região variável da cadeia leve de um anticorpo de acordo com a presente invenção e uma cadeia pesada correspondente são expressas e formam dimeros de cadeia pesada/leve e outros tipos de anticorpos.

Dado que os anticorpos monoclonais obtidos pelo processo de acordo com a presente invenção se ligam ao antigenio SEMPl ligados a superfície das células, que está envolvido na adesão das células, eles podem ser utilizados para o tratamento in vivo em seres humanos. Assim, a presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção, eventualmente em conjunto com veículos, adjuvantes, cargas ou materiais aditivos farmacêuticos convencionais. Essas composições, de acordo com a presente invenção, aumentam, preferencialmente, a permeabilidade das vacinas adjuvantes.

Para as utilizações terapêuticas, administra-se, a um paciente humano, uma composição esterilizada contendo uma dose efectiva, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção, para o tratamento das doenças descritas antes. Normalmente, ar composições compreenderão um anticorpo quimérico ou humanizado que contém a região SDC de um anticorpo, de acordo com a presente invenção, para a imunogeneicidade reduzida.

As composições para administração parentérica conterão, normalmente, uma solução de um anticorpo de acordo com a presente invenção dissolvida num veiculo aceitável, preferencialmente num veiculo aquoso. Pode-se utilizar uma variedade de veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4 %, glicina a 0,3 % e similares. As soluções são esterilizadas e geralmente de uma matéria particular. As composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, conforme necessário para se aproximarem de condições fisiológicas, tais como ajuste do pH e agentes de tamponamento, agentes de ajustamento da toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. as concentrações dos anticorpos de acordo com a presente invenção nestas formulações podem variar amplamente, por exemplo, desde menos do que cerca de 0 01 %, normalmente pelo menos cerca de 0,1 %, até tanto quanto 5 % em peso e serão seleccionadas principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidade, etc. ou de acordo com o modo de administração particular que foi seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica típica para injecção intramuscular pode ser feita para conter 1 mL de água esterilizada tamponada e cerca de 0,1 a 250 mg, preferencialmente 1 a 10 mg do anticorpo de acordo com a presente invenção.

Tal como se mencionou, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados numa composição, preferencialmente numa composição farmacêutica apropriada para administração parentérica. Preferencialmente, o anticorpo pode ser preparado como uma solução tamponada injectável contendo 0,1 a 500 mg/mL de anticorpo e, preferencialmente, 0,1 a 250 mg/mL de anticorpo, preferencialmente em conjunto com 1 a 500 mmole/L de tampão. A solução injectável pode ser composta quer por um liquido, quer por uma forma de dosagem liofilizada. O tampão pode ser, por exemplo, L-histidina (preferencialmente 1 a 50 mM, optimamente 5 a 10 mM) , a pH 5,0 a 7,0 (optimamente pH Λ . \ 0 ’ como nas

Outros tampões apropriados incluem, mas não se limitam a succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. O cloreto de sódio pode ser utilizado para modificar a toxicidade da solução a uma concentração de 0-300 mM (optimamente 150 mM para uma forma de dosagem liquida) Podem incluir-se crio-protectores para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 0 a 10 % de sacarose (optimamente 0,5 a 1,0 %). Outros crio-protectores apropriados incluem tre-halose e lactose. Podem incluir-se agentes para o aumento de volume para uma forma de dcsagem liofilizada, principalmente 1 a 10 i: db manitol. Podem utilizar-se estabílízantes tanto nas formas de dosagem líquidas como nas firmas de dosagem liofilizadas, principalmente L-metionina 1 a 50 mM (de uma forma optimizada 5 a 10 mM).

Ourros agentes para o aumento de volume apropriados, incluindo a glícina, arginina podem ser incluídos como polisorbato-S0 a 0-0,05 % (de uma forma optimizada 0,005-0,01 %), Tensioactivos adicionais incluem, mas não se limitam a polisorbato 20 e tensioactivos de eter de polioxietileno tais como detergentes BRIJ©

Uma dosagem apropriada do anticorpo de acordo com a presente invenção para tratamentos médicos é de cerca de 0,01 a 50 mg/kg de peso do corpo, embora esta dosagem possivelmente seja administrada repetidamente.

Num enquadramento preferido, a composição farmacêutica inclui o anticorpo numa dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg por aplicação. As doses do anticorpo mais preferidas incluem 1 mg/kg. O modo de administração preferido é o parentérico (por exemplo, por via intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Num enquadramento preferido, o anticorpo é administrado por infusão ou injecção intravenosa. Num outro enquadramento preferido, o anticorpo é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea.

As composições farmacêuticas normalmente devem ser esterilizadas e estáveis nas condições de fabrico e de armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão, dispersão, lipossoma ou outras estruturas ordenadas apropriadas para uma concentração elevada de fármaco. A# soluções injectáveis esterilizadas podem ser preparadas por incorporação do composto activo na quantidade necessária no seio de um dissolvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados antes, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veiculo esterilizado que contém um meio básico de dispersão e os outros ingredientes necessários dos enumerados antes. No caso de pós esterilizados, liofilizados para a preparação de soluções injectáveis esterilizadas, os processos preferidos da preparayão são a secagem em vácuo e a secagem por pulverização que origina um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua soluyão previamente filtrada em meio estéril. Pode-se mater a fluidez apropriada de uma solução, por exemplo, por meio da utilização de um revestimento tal como lecitina, por meio da manutenção da dimensão de partícula necessária no caso da dispersão e por meio da utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser conseguida por meio da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de mono-estearato e oleatina.

Os anticorpos e as porções de anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de processos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferidos de administração sejam a injecção subcutânea, a injecção intravenosa ou a infusão. Como será evidente para um especialista na matéria, a via e/cu o modo de administração irão variar consoante os resultados desejados. Em certos enquadramentos, o composto activo pode ser preparado com um veiculo que irá proteger o composto CfiHítx» a rápida libertação, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de libertação micro-encapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompativeis podem ser utilizados, assim como o acetato de etileno e vinilo, os poiianidridos, o ácido poliglicólico, o colagenic, os poií-orto-ésteres e o ácido polilactico. Muitos dos processos para a preparação dessas formulações estão patenteados ou são de uma forma geral conhecidos dos especialistas na matéria, ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

Os anticorpos da presente invenção são utilizados na forma líquida, em pó ou liofilizada e podem ser combinados com um diluente ou um veículo apropriado, tal como água, uma solução salina, uma dextrose aquosa, um tampão aquoso e similares. Também de podem utilizar conservantes.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser liofilizados para serem armazenados e reconstituídos num veiculo apropriado antes de serem utilizados. Podem utilizar-se as técnicas convencionais de liofilização e de reconstituição. Será entendido pelos especialistas na matéria que a liofilização e a reconstituição podem levar a vários graus de perda de actividade biológica que utilizam níveis podem ter se der ajustados para compensar. independentemente da via de administração selecciona-da, os anticorpos de acordo com a presente invenção são formulados em formas de dosagem aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico por processos convencionais conhecidos pelos especialistas na matéria. Os anticorpos podem ser formulados utilizando sais de adição de ácidos ou de bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Além disso, os compostos ou os seus sais podem ser utilizados sob uma forma hidratada apropriada.

Independentemente da via de administraçáo seleccicna-da, utiliza-se, em qualquer tratamento, uma quantidade não tóxica mas efectiva sob o ponto de vista terapêutico de um ou mais anticorpos da presente invenção. 0 regime de dosagem para o tratamento é seleccionado de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo, a idade, o peso, o sexo e as condições médicas do paciente, o tipo de tumor, a via de administração e o anticorpo particular utilizado no tratamento. Um médico de clinica geral pode facilmente determinar e prescrever a quantidade efectiva do fármaco necessária tendo em conta as abordagens terapêuticos com anticorpos. Procedendo assim, o médico pode utilizar primeiro doses relativamente baixas e, em seguida, doses crescentes até se obter uma resposta máxima. 0 polipéptido de SEMP1 purificado útil para o reforço durante a imunização pode ser produzido de forma recombinante em células eucarióticas. Como SEMP1 é uma proteína da junta hermética localizada nas áreas do contacto de célula - célula das células e com uma forte tendência de adesão (Furuse, M., et al., J. Cell. Eiol. 147 (1999) 891-903) é muito difícil isolar e purificar o polipéptido de comprimento complete. Além disso, devido ao facto de SEMPl ser uma proteína associada a membrana, é necessário libertar a proteína da membrana. Contudo, várias tentativas para isolar SEMPl a partir de membranas de células utilizando diferentes detergentes (CHAPS, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamónio]-l-propano; octil-glícósido, ácido desoxicólico, Igepal© CA630, (octilfenoxi) polietoxietanol; Triton® K-.IÔ0 (octilfenooxi) ; Thesit, étsr de policxietileno-9-laurilo; Digitonina) falharam. Contudo, surpreendentemente, foi possível isolar e purificar SEMP1 utilizando Zwittergent® (N-dodecíl-N,N-dimetil-3-amónio-l-propano-sulfonato, Roche Ciagnostics GmbH, DE). isso, um octro aspecto da presente invángílc é um processo para a purificação cromatografica do polipéptido de SEMP1 segundo o gual se aplica uma composição aquosa contendo um polipéptido de SEMPl na coluna cromatográfica. 0 polipéptido de SEMPl é eluído na presença de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amónio-l-propano-sulfonato e recuperado do eluato.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo para a libertação do polipéptido de SEMPl de uma matriz semelhante a uma membrana de célula por meio do tratamento do referido polipéptido de SEMPl ligado numa solução aquosa com N-dodecilo de tal maneira que o polipéptido de SEMPl é solubilizado.

As linhas de células que se seguem, mencionadas na presente invenção, que segregam anticorpos, foram depositadas por F. Hoffmann-La Roche AG com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder 50Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 18 de Maio de, 2000:

Linha de células Anticorpo DSM ACC2458 ACM anti-humano SEMPl; clone 3 DSM ACC2459 ACM anti-humano SEMPl; clone 4 DSM ACC2460 ACM anti-humano SEMPl; clone 5 DSM ACC2461 ACM anti-humano SEMPl; clone 7 DSM ACC2462 ACM antí-humanc SEMPl; clone 38 kCC2463 ACM antí-humanc SEMPl; clone 64

As suas características de ligação são as seguintes: clone 3, concorrente com o péptido 21 (arninoácido (aa) 97-108, IC1) e 37 (160-171, EC2) clone 4, concorrente com o péptido 21 (aa 97-108, ICl) clone 7, concorrente com o péptido 5 (aa 31-42, ECl) clone 64, concorrente com o péptido 29 (aa 136-147, EC2), 30 (aa 139-150, EC2) e 31 (aa 142-153, EC2). clone 5, concorrente com o péptido 41 (aa 191-202, IC2) clone 38, concorrente com o péptido 44 (aa 200-211, IC2) ECl: epitopo 1 extracelular (aa 22-81) ICl: epitopo 1 intracelular (aa 103-117) EC2: epitopo 2 extracelular (aa 141-163) IC2: epitopo 2 intracelular (aa 185-211) (Entre parênteses estão as áreas de SEMP1 às quais se ligam os anticorpos, confirmadas pelo modelo de previsão de estruturas em computador em 3D Signal P (http://genomecbs.dtu.uklservices/SignalPI), a numeração de aminoácidos de acordo com a posição dos aminoácidos do produto dos genes de SEMP1.

Os exemplos que se seguem, a listagem de sequências e as figuras são providenciados para ajudar a compreensão da presente invenção, cujo verdadeiro âmbito está estabelecido nas reivindicações em anexo. SEQ ID NO: 1 Péptido de fusão. SEQ ID NO: 2 Péptido de fusão. SEÇ IC NO: 3 Sequência de ADN de SEMP1. SEÇ ID NO: 4 Sequência do polipéptido de SEMP1.

Descrição das figuras

Figura 1 Purificação da proteína de SEMPí, SEMP1 marcada com His foi expressa em células ae insectos Sf9 infectadas com baculcvírus de SEMPÍ(Research Diagnostic Inc., 1 USA, www.researchd.com). SEMPÍ marcada com His foi purificada a partir do sobrenadante impuro das células Sf9 lisadas por meio de purificações em coluna e obteve-se o mais elevado rendimento e a mais elevada pureza por eluição com imidazole 200 mM a partir de uma coluna de quelato de Ni. A seta indica a localização da proteína de SEMPÍ marcada com His.

Figura 2 Especificidade e expressão de SEMPÍ dependente de células. A análise da especificidade dos anticorpos monoclonais de SEMPÍ por análise de transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western blot) . As células negativas de SEMPÍ (K562 hematopoiéticas, MDA-MB435 de cancro da mama) e as positivas (células pequenas epiteliais das vias aéreas CEEV, Caco-2 de adenocarcinoma, MDA-MB435 do cancro da mama trânsduzida com retrovírus de SEMPÍ) cresceram até a confluência, sofreram lise e foram submetidas a uma análise de transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western blot). A seta indica a posição da proteína de SEMPÍ natural.

Figura 3 Expressão de SEMPÍ em células de cancro da mama. A expressão de SEMPÍ em células de cultura a granel de MoSi-dls-OS transauzida em SEMPÍ foi analisada com um microscópio de fluorescência. A especificidade da expressão e a permanência no sítio dos contactos de células-células está indicado pelo modelo de coloração sigmóide de SEMP1.

Figura 4 Estrutura do domínio de SEMP1 e mapeamento do epítopo do ACm5 de SEMP1. Os amínoácidcs (aa) 22-81 da SEQ ID NO: 4 representa o primeiro domínio extracelular (EC1) aa 103-117 representa o primeiro domínio intracelular (IC1), aa 141-163 representa o segundo domínio extracelular (EC2), aa 185-211 representa o domínio intracelular do terminal C (IC2), aa 1-21 (N-term.), 82-102, 118-140 e 164-184 representam domínios da membrana.

Figura 5 Expressão da proteína de SEMP1 em tecido normal de mama humana. A coloração da proteína de SEMPl foi feita com anti-SEMPl/anti-rato-POD e foi contra-corada com hematoxilina (painel A e B) . A coloração de controlo com anticorpo secundário anti-rato-POD está indicada nos painéis C e D. Os rectângulos nos painéis A e C indicam as áreas que estão aumentadas nos painéis B e D.

Figura 6 Comparação da expressão de SEMPl em tecido normal da mama e do cólon com tecido de tumor da mama e do cólon. A coloração fez-se como está descrito na fig. 5.

Peito indica mama; Intestino indica cólon; transformado indica tecido de tumor.

Figura 7 Coicrâção da proteína de !X em diferentes tecidos de tumor da mama a partir de diferentes dadores comparada com tecido normal da mama. A coloração fez-se como está descrito na fig. 5.

Exemplo 1

Cultura de células a) Células de insectos Sf9 Células Sf9 (ATCC CRL 1711) de quatro passagens de rotina cresceram em frascos T25 em meio IPL 41 (Gibco) complementado com soro a 10% (Gibco /Yeastclate (Gibco)/ Pluronic F-68, Gentamicina (Gibco). Para o isolamento em larga escala das células Sf9 infectadas com baculovirus de SEMPl, fez-se a cultura das células num fermentador de 7 L de um processo em lotes e colheram-se 3 dias depois da inoculação. b) Hibridoma de SEMPl

As células de hibridoma que segregam anti- SEMPl foram postas em cultura em meio RPMI 1640 complementado com SBF a 10 % / 1-glutamina 2 mM (Roche Molecular Biochemicals)/ 1 x aminoácidos não essenciais (Biochrom AG)/ piruvato de sódio 1 mM (Biochrom Mí; e Nutridoma (Roche Molecular

Biochemicals). Para a geração de do sobrenadante de hibridoma enriquecido com anti- SEMPl, inocularam-se clones de hibridoma de SEMPl em miniPerm clássico da Heraeus, dispcsitivo de cultura MWCO 12,5 k e recolheu-se o meio várias vezes por semana depois da concentração das células ter atingido 1 xlGE7 células por mL. c) Linha de células AM12, produtora do retrovírus d-t SEMPl

Fez-se uma cultura de uma linha de células anfotrópica HSR BM01 (DSM ACC2235, patente de invenção WO ΐν;13ϊ·<,). · (estrutura em V MoMuL) transduzida com SEMPl e i -NGFR (receptor do factor de crescimento do nervo de baixa afinidade), patente de invenção WO 95/06723, produzindo retrovirus, em meio OMhM/PBP a 10 % / 1 -giuPÃPU.hg 2 mM (Roche Molecular Biochemicals) / 1 x aminoácidos t-Aq essenciais (Biochrom AG)/ piruvato de sódio 1 mM (Biochrom AG) . Para se obter um titulo superior do sobrenadante, adicionou-se meio fresco até as culturas sub-confluentes do sobrenadante condicionado serem colhidas 24 h mais tarde (Machl, A. W., Cytometry 29 (1997) 371-374) e foi imediatamente utilizado para a transdução das linhas de células. d) MDA-MB 435 A linha de células de cancro da mama humano MDA-MB 435 negativa para SEMPl assim como a sua contra-parte transduzida de SEMPl forma postas em cultura em RPMI/ SBF a 10 % /1-Glutamina 12 mM (Roche Molecular Biochemicals)/ 1 x aminoácidos não essenciais (Biochrom AG)/ piruvato de sódio 1 mM (Biochrom AG). A transdução retroviral de SEMPl foi realizada por incubação de uma cultura sub-confluente durante 24 h num sobrenadante contendo retrovirus produzidos de acordo com o exemplo lc. Os clones de células MDA-MB 435 expressando SEMPl foram produzidos escolhendo células simples, ligando-as a anticorpos marcados com FITC em função de RFCN-1 (receptores dos factor de crescimento de nervos 1) a partir de culturas a granel por meio de SCAF (saída de células activada por fluorescência) (FACS Vantage, Becton Dickínson).

Exemplo 2

Construção do vector e expressão de SEMPl

Clonou-se SEMPl hexa marcada com his no terminal N por processos padrão no vector pSitêBseHisipB, As células Sf9 foram transfectadas com o plasmido de Hls-SEMPl e os sobrenadantes do ADN de baculovirus linearizados de SEMPl foram colhidos 3 dias após a infecção (Invitrogen, Bac'NBlue System). esta concentração do vírus com um título elevado para a re-infecção das células Sf9. Colheram-se as células depois de uma infecção de 3 dias a 27 i?C e extraiu-se a proteína total por tratamento com ultra-sons das células Sf9 (tampão de extracção: NaP 50 mM, NaCl 150 mM, a pH 7,2). Centrifugou-se o extracto de proteína a 30.000 g durante 20 min e dissolveu-se o aglomerado em NaP 50 mM, NaCl 150 mM, Zwíttergent© a 2 % í; p - dod di 1 ~ o, d ~ dlms; t £ 1 - i~ am-inio-1 -propttv'· iml f o:o «t f anfotérico, Roche Molecular Biochemicals).

Extraiu-se SEMPl marcado com hexa-his a partir do lisado impuro por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de sefarose quelada com Ni (Pharmingen). Carregou-se a coluna com NÍCI2 300 mM, lavou-se com tampão de equilíbrio (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, a pH 8, Zwíttergent® a 0.5 %), carregou-se com a fracção da proteína impura e lavou-se com tampão de equilíbrio/imidazole 10 mM. Realizou-se a eluíção com tampão de equilíbrio/imidazole 200 mM. Devido ao marcador de his do terminal N e ao marcador enterocinase, a dimensão do peso molecular da proteína SEMPl modificada aumenta de 23 para 27 kD.

Exemplo 3

Processo de imunização

Imunizaram-se ratos fêmeas BALB/c com 6-8 semanas de idade. Mies da imunização, induziu-se a degenera- çãc/regeneração do músculo por meio de uma injecção intramuscular bilateral de 100 pL de cardiotoxina (10 μΜ no seio de SBF) (LATOXAN, L-8102; Rosans, França) no M. tibialis (- dia O) . Injectou-se, intramuscularmente, 50pg de NaCl a 0,9 % na cartilagem do tarso anterior de cada pata traseira. Injectou-se cinco doses de ADN de 4 em 4 semanas. Retiraram-se aliquotas de soro por punção retrobulbar no 97° dia, 3 dias antes da dissecção do baço. Ao animal que apresentou o titulo mais elevado de soro deu-se um reforço intravenosamente com 30 pg da proteína de SEMP1 puriifcada a partir das células de Sf9 (ver antes) . Sacrificaram-se os ratos no 129 'dia e utilizaram-se os baços para gerar hibridomas no seguimento de processos normalizados. Geraram-se clones de hibridoma altamente produtores por clonagem separadora de células por SCAF (FACS Vantage, Becton Dickinson) de culturas em larga escala de hibridoma positivo para SEMP1.

Análise por transferência de antícorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western blot) anti-SEMPl A análise por transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western blot) foi realizada por processos padrão utilizando o sistema Novex NuPage Bis-Tris (Invitrogen). As membranas de nitrocelulose manchadas a partir dos géis de proteína carregados com diferentes quantidades de SEMP1 purificada ou extractos de células de células de controlos positivos ae SEMP1 ou controlos negativos de SEMPl foram incubados com sobrenadantes de clones de hibridoma que produzem anticorpos de SEMPl (diluição a 1:10 e i:100). Detectou-se o sinal anti-SEMPi utilizando protocolos padrão de quimio-luminescência (Roche Moleclar Bicchemicals).

Exemplo 4

Microscopia de irnunofluorescência

As células MDA-MB 435 cresceram em lâminas de microscópio revestidas com poli-L-lisina (Sigma) em meio padrão a diferentes densidades. Lavaram-se as células com SBF e fixaram-se em seguida com paraformaldeido a 1 %/SBF durante 1 h, a temperatura ambiente. Fez-se a permeabili-zaçaõe e o bloqueio com uma incubação de 1 h no seio de Tween20 a 0,05 %/ Albumina a 10 % (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha)/ SBF. Depois realizou-se uma coloração por irnunofluorescência directa com anti-SEMPl seguido de PÍ&Dh anti-rato marcado com Alexa488 (Molecular Probes). Registou-se a imagem de fluorescência.

Exemplo 5

Estrutura retroviral e transdução virai O retrovírus de SEMPl foi gerado utilizando um vector contendo um marcador da superfície das células do R FCN-1 como uma molécula relatora (Machl, A.W., et al, Cytometry 29 (1997) 371-374). Em resumo, o promotor de 5’LTR conduz a expressão da proteína marcadora de R FCN-1. O promotor de SV40 localizado a jusante de 3' foi substituído por um promotor de CMV, que conduz a expressão de SEMPl. SEMPl foi clonado como QLA (quadro de leitura aberto) com a introdução de uma sequência ideal de Kozak (Kozak, M., Nucloic Acids Res. 15 (1987) 8125-8148). Para gerar retrovirus infecciosos, transfectou-se o plasmido 3EMP1/ R FCN-1 com lipofectamina (Gibco) na linha de células HÇR BM01 anfotrópica, produzindo retrovirus, de acordo com o manual do fabricante. Cs s&trAvlms com elevado titulo de HSR BM01 que produzem clones de células foram gerados pela separâção de células SCAF e subsequente ensaio das taxas de transdução efectivas dos sobrenadantes de clones de células HSR BM01 condicionados.

Esta linha de células pode ser utilizada para providenciar especificidade e uma permanência correcta da proteína de SEMP1, por exemplo, em células de carcinoma mamário relevantes sob o ponto de vista oncológico.

Especificidade do anticorpo A especificidade dos diferentes anticorpos monoclonais para SEMP1 tem sido confirmada por análise de transferência de anticorpo/proteina para uma matriz imobilizada (Western blot) . Um resultado típico está indicado na fig. 2 (seta, clone c38 de SEMPl) , Apenas as células positivas de SEMPl como CPEV (células pequenas epiteliais das vias aéreas) e CACO-2 mostram um sinal a um PM esperado de cerca de 23 kD. Como era esperado, a linha de células hematopoiéticas K562 é nagetiva para SEMPl. Além disso, as linhas de células de cancro da mama negativas para SEMPl MDAMB435 não exibem uma banda de proteínas de SEMPl, em que a sua contra-parte MDAMB435xSempl transduzida sob o ponto de vista dos retrovirus, exibe uma forte banda de SEMPl. Para além do clone c38 do hibridoma de SEMPl, obteve-se uma variedade de hibridomas diferentes de SEMPl que produzem anticorpos monoclonais contra diferentes epitopos intra- e extracelu-lares de SEMPl. A fig. 3 mostra a especificidade biológica da ligação dos anticorpos de SEMPl. SEMPl, como proteína da tfansmêmbrana 4 está localizada apenas nos sitias de contacto de célula-célula (seta, clone c38 de SEMPl).

Exemplo 6

Mapeamento do epítopo utilizando anticorpos complementares de SEMPl

Para a subsequente avaliação dos epitopos dos anticorpos de SEMPl realizou-se uma análise por ELISA: - revestimento de câmaras com 96 micro-tubos com SEMPl marcado com his - bloqueio das câmaras com albumina bovina a 1 % - lavagem (duas vezes com SBF/Tween 20 a 0,05 %) incubação com sobrenadantes do hibridoma contendo actividade anti- SEMPl, controlo positivo do anticorpo anti-his - lavagem incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase - lavagem - incubação com substrato de peroxidase (solução de ABTS®)

Para identificar os epitopos de 66 anticorpos diferentes, estabeleceu-se uma ELISA complementar de péptidcs. Com este fim, sintetizou-se 44 péptidos das áreas hidrofílicas de SEMPl e incubaram-se em reacções simples durante a incubação dos sobrenadantes contendo ancicorpos anti- SEMP1. Utilizando quantidades elevadas do péptido reauz-se a ligação dos anticorpos anti- SEMP1 com os epitopos emparelhados com SEMP1 marcada com his. A redução do sinal cromogénico foi medida em comparação com os sobrenadantes não concorrentes.

Exemplo 7

Tentativas para gerar anticorpos de SEMP1 utilizando péptidos de SEMP1 para imunização

Injectou-se, em dois coelhos, péptidos de fusão (QWRIYSAGD)-KLH (Péptido da SEQ ID NO: 1 acoplado a hemocianina de lapa de orifício) e KLH-(MKCMKCLEDDEMQKM) (Péptido of SEQ ID NO: 2 acoplado a hemocianina de lapa de orifício) em adjuvante de Freund. Administrou-se um total de 0,1 mg por imunização em três sítios dorsais subcutâneos. As injecções foram dadas nas semanas 0, 2, 6 e 8. O soro exibiu um título elevado de anticorpo utilizando os péptidos numa análise de mancha, mas não funcionou nos extractos de células ou numa análise por SCAF. Por isso, não se geram anticorpos de ligação a SEMP1.

Exemplo 8

Imuno-ensaio de enzimas para a determinação de SEMPl de acordo com o princípio de ELISA

Reagente 1: - 1,25 its/t;!: do clone 3 do Acm biotinilado (preparação de acordo com Peterç, J. H., et al., "Monoklonale AntíkÔrper", Springer Verlag, Berlim, 1985, pp. 209-212) - 10 mmole/L de tampão de citrate - 47 mmole/L de tampão de fosfato, pH 6,3 - 5 0 mU,/fflL de conjugado de peroxidase e cione 5 de anticorpo (preparado de acordo com Wilson, M. B., e Nakane, P. K., 1978, em Immunofluorescence and

Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wick eds., pp. 215-224, Elsevier/North Holland, Amsterdam; a actividade expressa refere-se a peroxidase)

Reagente 2: - 100 mmole/L de tampão de citrato de fosfato, a pH 4,4 _3,2 mmole/L de perborato de sódio -1,9 mmole/L de ABTS® (2,2'-azino-di-[sulfonato de 3-etil- benztiazolina (6)1

Como amostras utilizaram-se soros humanos aos quais se adicionou 3, 5, 10 e 25 ng/mL, respectivamente, de SEMP1 produzida de forma recombinante. A reacção realiza-se utilizando pequenos tubos de poliestireno revestidos com estreptavidina (preparação de acordo com a patente de invenção europeia EP-A 0 269 092) .

Realização da determinação:

Fez-se a incubação de uma amostra de 0,2 mL num pequeno tubo com 1 mL de reagente 1 durante 6 0 minutos a 20-25 "1, seguida da sucção e lavagem por duas vezes com água da torneira. Em seguida, adiciona-se o reagente 2, faz-se -à sua incubação durante 30 minutos a 20-25 "C e determina-se a extracçâo no fotómetro a 420 nm. Cesta maneira, obtém-se uma curva padrãc, permitindo a determinação das concentrações de SEMPl das amostras a serem examinadas.

Detecção de SEMPl em tecido normal e tecido de tumor

Para detectar a proteína de SEMPl em secções hidtológicas, examinaram-se secções de parafina de tecido normal e tecido de cancro da mama. A fig. 5 mostra uma secção com uma coloração do anticorpo anti-SEMPl (Figs. 5 A e B) e com um anticorpo que não se liga (C, D) para fins de controlo. 0 anticorpo anti-SEMPl, de acordo com a presente invenção liga-se especificamente apenas as células epiteliais das diferentes estruturas glandulares, enquanto o tecido do estroma do mesênquima circundante não é corado. A figura mostra claramente que isto é uma coloração localizada na membrana em que todas as células epiteliais estão coradas. Não se mostra nesta figura que, nas secções da glândula mamária, excepto nas estruturas lobulares (células epiteliais), também as estruturas tubulares (células endoteliais) podem ser coradas com os anticorpos de acordo com a presente invenção.

Ao contrário disto, a expressão de SEMPl em tecido de tumor é significativamente inferior do que no tecido normal. Isto está ilustrado nas Figs. 6 e 7. Enquanto no tecido normal da mama ou do cólon SEMPl encontra-se especialmente na parte da membrana das células epiteliais, no tecido do tumor encontrou-se alguma coloração na membrana e no citoplasma. Contudo, a coloração em tecido do tumor foi consideravelmente mais baixa do que no tecido ncrmal. A fig. 7 mostra uma comparação de uma secção de tecido normal da mama com oito secções de tecido de tumor da mama. A fig. 7 mostra que especialmente as estruturas tubulares estão coradas. Em todos os casos, verifica-se a coloração na membrana. Em nenhuma das secções do tecido de tumor da mama se podia iocaiizar a colcração localizada na membrana tal como se encontrou em tecido normal da mama. Para o tecido do tumor da mama, a coloração e sempre uma coloração citosólica uniforme e fraca.

Estas experiências demonstram que os anticorpos anti-SEMPl, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas efectivamente para o diagnóstico do estado da junta hermética das células e por isso são um marcador valioso para a tumorigénese e/ou a progressão do tumor.

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Woo, P.L., et al., J. Biol, Chem. 274 (1999) 32818-32828 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> F. Hoffmann-La Roche <12 0> Anticorpos contra SEMPl, processos para a sua produção e as suas utilizações <130> Caso 20692 < 17Ο> Patent In Ver. 2.1

<210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: péptido

Gin Trp Arg Ile Tir Ser Ala Gli Asp 1 5

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: péptido

Met Lis Cis Met Lis Cis Leu Glu Asp Asp Glu Met Gin Lis Met ε 10 15

<210> 3 <211> 3443 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (221) .. {853) <400> 3 gagcaacctc agcttctagt atccagactc cagcgccgcc ccgggcgcgg accccaaccc 60 cgacccagag cttctccagc ggcggcgcag cgagcagggc tccccgcctt aacttcctcc 120 gcggggccca gccaccttcg ggagtccggg ttgcccacct gcaaactctc cgccttctgc 180 acctgccacc cctgagccag cgcgggcgcc cgagcgagtc atg gcc aac gcg ggg 235

Met Ala Asn Ala Gli 1 5 ctg cag ctg ttg ggc ttc att ctc gcc ttc ctg gga tgg ate ggc gcc 283 Leu Gin Leu Leu Gli Fen Ile Leu Ala Fen Leu Gli Trp Ile Gli Ala 10 15 20 ate gtc age act gcc ctg ccc cag tgg agg att tac tcc tat gcc ggc 331 Ile Val Ser Tre Ala Leu Pro Gin Trp Arg Ile Tir Ser Tir Ala Gli 25 30 35 gac aac ate gtg acc gcc cag gcc atg tac gag ggg ctg tgg atg tcc 359 Asp Asn Ile Val Tre Ala Gin Ala Met Tir Glu Gli Leu Trp Met Ser 40 45 50 rgc gtg teg cag age ggg cag ate cag tgc aaa gtc ttt gac tcc 427 Cis Val Ser Gin Ser Tre G1 i Gin Ile Gin C í s Lis Val Fen Asp Ser 55 60 65 ttg ctg 3at ctg CCC age aga ttg caa gea acc cgt gcc ttg atg gcg 475 Leu Leu Asn Leu Ser Ser Tre Leu Gin Ala Tre Arg ílL:S Leu Met V 3.1 70 75 80 85 gzt ggc ctc ctg ocra gtg ata gea ate ttt gtg gcc acc gtt ggc 523 lia Laá laa '£:& Ϊ Ile j .... Ile Fen V,.:> Tre 95 100 atg aag tgt atg aag tgc ttg gaa gac gat gag ylg cag ãcLCJ atg agg 571 Met Lis C i s Met Lis Ci s Leu Glu Asp Asp Glu Vai Gin Lis Met Arq 105 110 115 atg gct gtc a 11 ggg ggt gcg dlc ttt c 11 c 11 gca ggt ctg gct a 11 619 Net Ale Vai II e G.l i Gli AI a Ile Fen Leu Leu Ala Gli Leu Ala Ile 120 125 130 11 a gtt gcc aca gca tgg ta t ggc aat aga ate gtt caa yaa 11 c t a t 661 Leu Vai Ala Tre Ala Trp Tir Gli Asn Arg 11 e Vai Gin Glu Fen Tir 135 140 145 gac cet atg acc cca gtc aat gcc agg tac gaa ttt ggt cag gct c tc 715 Asp Pro Met Tre Pro Vai Asn Ala Arg Tir Glu Fen Gli Gin Ala Leu 150 155 160 165 11 c a c t ggc tgg gct gct gct t c t c tc tgc c 11 ctg gga ggt gcc c ta 763 Fen Tre G li Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cis Leu Leu Gli Gli Ala Leu 170 175 180 ctt tgc tgt tcc tgt ccc cga aaa aca acc tet tac cca aca cca agg 811 Leu Cis Cis Ser Cis Pro Arg Lis Tre Tre Ser Tir Pro Tre Pro Arg 185 190 195 ccc tat cca aaa cct gca cct tcc acc ggg aaa gac tac gtg 853 Pro Tir Pro Lis Pro Ala Pro Sei Ser Gli Lis Asp T i r Vai 200 205 210 tgacacagag gcaaaâggag aaaatcatgt tgaaacaaac cgaaaatgga cattgagata 913 ctatcattaa cattaggacc ttagaatttt gggtattgta atctgaagta tggtattaca 973 aaacaaacaa acaaacaaaa aacccatgtg ttaaaatact cagtgctaaa catggctaaa 1033 tcttatttta tcttctttcc tcaatatagg agggaagatt ttaccatttg tattac tgc t 1093 tcccattgag taatcatact caaatggggg aaggggtgct ccttaaatat atatagatat 1153 gtatatatac atgtttttct attaaaaata gacagtaaaa t a c ta t tc tc attatgttga 1213 tactagcata cttaaaataL ctctaaaata ggtaaatgta tttaattcca tattgatgaa 127 3 gatgtttatt ggtatatttt cttatataca tatgtaacag tcaaatatca 1333 tttactcttc ttcattagct ttgggtgcct ttgccácâag acctagccta arttaccaag 1393 çatgaattct ttcaattctt catgcgtgcc cctttcatat acttatttta ttttttacca i453 ccacttgcat cgttattaag ttttgtgttt catcggtctc 1513 tatctcctga atctaucuca tttcatagcc tacattttag tttctaaaqc caagaagaat 1573 l tal l.acaaa t ca gaa l l ut gqagçcaaat ctttctgcat gaccaaagtg a t a a a 11 c c t 1633 gttgaccttc ccacacaatc cetçtactct gacccatagc actcttgttt gctttgaaaa 1693 3# tatttgtcca attgagtagc tgeatgctgt tcccccaggt gtrgtaacac aactttattg 17 53 attgaatttt taagctactt attcatagtt ttatatcccc ctaaactacc tcrrttttcc 1813 ccattcctta a LlclatLgt tttcccaagt gtaattatca tgcgttttat ate ttcctaa 1873 taaggtgtgg tctgtttgtc tgaacaaagt gctagacttt ctggagtgat aatctggtga 1933 caaatattc t ctctgtagct ataagcaagt cacttaatct ttctacctct tttttctatc ; 33:: tgccaâattg agataatgaL acttaaccag ttagaagagg tagtgtgaat attaattagt 2053 ttatattac t c t c a 11 c 111 gaacatgaac tatgcctatg tagtgtcttt atttgetcag 2113 ctggctgaga cactgaagta gtcactgaac aaaacctaca cacgtacctt catttgattc 2173 actgccttcc tc tc tc tac c agtctatttc cactgaacaa aacctacaca cataccttca 2233 tgtggttcag tgccttcctc zctctaccag tctatttcca ctgaacaaaa cctacgcaca 2293 taccttcatg tggctcagtg ccttcc~ctc tctaccagtc tatttccàtr ctntcagctg 2353 gtctgacat gtttgtgctc tgttccattt taacaactgc tcttactttt ccagtctgta 2413 cagaatgcta tttcacttga gcaagatgat gtatggaaag ggtgttggca ctggtgtctg 2473 gagacctgga tttgagtctt ggtgctatca . atcaccgtct gtgtttgagc aaggcatttg 2533 gctgctgtaa gcttattgct tcatctgtaa gcggtggttt gtaattcctg atcttcccac 2593 ctcacagtga tgttgtgggg atccagtgag acagaataca tgtaagtgtg gttttgtaat 2653 tgggacagtg ctatactaag ggaaagaatt gaggaattaa ctgcatacgt tttggtgttg 2713 cttttcaaat gtttgaaaat aaaaaaatgt taagaaatgg g tttc ttg c c ttaaccagtc 2773 tctcaagtga tgagocagtg aagtaaaatt gagtgcacta aacgaataag attctgagga 2833 agtcttatct tctgcagtga gtatggccca atgctttctg tggctaaaca gatgtaatgg 2893 gaagaaataa aagcctacgt gttggtaaat ccaacagcaa gggagatttt tgaatcataa 2953 taactcataa ggtgctatct gttcagtgat gccctcagag ctcttgctgt tagctggcag 3013 ctgacgctgc taggatagtt agtttggaaa tggtacttca taataaac ta cacaaggaaa 3073 gtcagccacc gtgtcttatg aggaattgga c ctaataaat tttagtgtgc cttccaaacc 3133 tgagaatata tgcttttgga agttaaaatt taaatggctt ttgccacata catagatctt 3193 catgatgtgt gagtgtaatt ccatgtggat atcagttacc aaacattaca aaaaaatttt 3253 atggcccaaa atgaccaacg aaattgttac aatagaattt atccaatttt gatcttttta 3313 tattcttcta ccacacctgg aaacagacca atagac attt tggggtttta taatgggaat 3373 ttgtataaag cattactctt tttcaataaa ttgtttttta atttaaaaaa aggaaaaaaa 3433 aaaaaaaaaa 3443 <210 > 4 <211> 211

<212 > PRT <213> Homo sapiens :fc'; A ia Asn Ala Gli Leu Gin Leu Lai; 1 5 15

Gli Trp ile Gli Ala Ile Vai Ser Tre Ala Leu Pro Gin Srp Arg lie 20 25 30

Tir Ser Tir Ala Gli Asp Asn Ile Vai Tre Ais Gin Ala Met Tir Glu 35 40 45

Gli Leu Srp Met Ser Cis Vai Ser Gin Ser Tre Gli Gin Ile Gin Cis 50 55 60

Lis Vai Fen Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Tre Leu Gin Ala Tre 65 70 75 80

Arg Ala Leu Met Vai Vai Gli Ile Leu Leu Gli Vai Ile Ala Ile Fen 85 90 95

Vai Ala Tre Vai Gli Met Lis Cis Met Lis Cis Leu Glu Asp Asp Glu 100 105 110

Vai Gin Lis Met Arg Met Ala Vai Ile Gli Gli Ala Ile Fen Leu Leu 115 120 125

Ala Gli Leu Ala Ile Leu Vai Ala Tre Ala Trp Tir Gli Asn Arg Ile 130 135 140

Vai Gin Glu Fen Tir Asp Pro Met Tre Pro Vai Asn Ala Arg Tir Glu 145 150 155 160

Fen Gli Gin Ala Leu Fen Tre Gli Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cis Leu 165 170 175

Leu Gli Gli Ala Leu Leu Cis Cis Ser Cis Pro Arg Lis Tre Tre Ser 180 18.5 190

Tir Pro Tre Pro Arg Pro Tir Pro Lis Pro Ala Pro Ser Ser Gli Lis i95 200 205

Asp Tir Vai 210

Lisboa, 17 de Setembro de 2007 41

Claims (10)

1. iixrasíímçõii 1. Anticorpo de ligação ao antigénio de SEMP1, caracteri-zado pelo facto de o referido anticorpo se ligar a SEMPl com um epitopo detectável que se sobrepõe a um anticorpo seleccionado no grupo que consiste nos anticorpos DSM ACC2458, DSM ACC2459, CSM ACC2461 e DSM ACC2463.
2. 2. Anticorpo caracterizado pelo facto de se obter a partir do grupo que consiste nas linhas de células DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 e DSM ACC2463.
3. 3. Anticorpo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser um fragmento de Fab, Fab', F(ab) :
4. 4. Linhas de células DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 e DSM ACC2463.
5. 5. Processo para a produção de um anticorpo que se liga a SEMP1 com um epitopo detectável que se sobrepõe a um anticorpo seleccionado no grupo que consiste em anticorpos de DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 e DSM ACC2463, caracterizado pelo facto de se imunizar uma espécie de mamífero cão humano com um ácido nucleico de SEMP1 e em seguida com um polipeptido de SEMP1 e de o referido anticorpo ser isolado das células ou de um fluido do corpo das referidas espécies.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em. que o referido anticorpo é um anticorpo mcnoclonal e o referido processo ser ainda caracterizado pelo facto de as células B que produzem o anticorpo de SEMP1 serem isoladas e fundidas com linhas de células de mieloma, isolando-se as células fundidas e ensaiando-se quanto a actividade do anticorpo contra SEMP1, células essas que produzem anticorpos que se ligam a SEMPl e que são isoladas e o referido anticorpo monoclonal ser produzido a partir das referidas linhas de células e de ser isolado.
7. 7. Utilização de um anticorpo, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar a produção de um agente terapêutico.
8. 8. Composição farmacêutica contendo um anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 3 numa quantidade de 0,1 a 500 mg/mL, a pH 5,0 a 7,0.
9. 9. Composição farmacêutica contendo um anticorpo de acordo com a reivindicação 8, numa quantidade de 0,1 a 250 mg/mL, a pH 5,0 a 7,0.
10. 10. Processo para a produção de uma composição farmacêutica contendo um anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se combinar uma solução aquosa do referido anticorpo com uma solução tampão aquosa de modo a que a concentração do anticorpo na composição farmacêutica seja de 0,1 a 530 mg/mL, a um valor de pH entre 5,0 e 7,0. Lisboa, i7 de Setembro de 2007