JP3415171B2 - 成長因子リセプターに特異的な組換抗体 - Google Patents

成長因子リセプターに特異的な組換抗体

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】成長因子及びそれらのリセプター（受容
体）は細胞増殖の調節に含まれ、そしてそれらは腫瘍の
成長にも働くものと思われる。膜リセプタータンパク質
チロシンキナーゼ種のタンパク質、ｃ−ｅｒｂＢ−２成
長因子リセプタータンパク質（Ａ．Ｕｌｌｒｉｃｈ及び
Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ ６１：２０
３−２１２，１９９０）がヒト胸部腫瘍及びヒト卵巣癌
において見い出されている。ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の
増幅及びこのタンパク質の過剰発現は腫瘍患者について
の悪い予後に関連する。従ってこのｃ−ｅｒｂＢ−２タ
ンパク質は、診断マーカーとしてそして癌治療のための
標的としての両方の潜在能力を有する。配列分析が示す
には、ＨＥＲ２とも称される１８５キロ−ダルトンの糖
タンパク質（ｇｐ１８５）であるｃ−ｅｒｂＢ−２はｎ
ｅｕ腫瘍遺伝子のヒト類似体（Ａ．Ｌ．Ｓｃｈｅｃｈｔ
ｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９７６−９７８，１
９８５）と同一又は非常に類似し、そしてヒト表皮成長
因子（ＥＧＦ）リセプターとかなりの配列同一性を有す
る。
【０００２】腫瘍の診断及び治療において特に注目すべ
きものは腫瘍マーカーに特異的な抗体である。ポリクロ
ーナル抗体は、抗原、即ち腫瘍マーカーにより免疫化さ
れた哺乳類の血清から得られる。ハイブリドーマ工学の
開発は連続細胞系、特に所望する特定のモノクローナル
抗体を生産するネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）ハイブリドーマ
を作り出すことを可能とした。ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異
的なマウスモノクローナル抗体は周知であり、そして例
えばＳ．Ｊ．ＭｃＫｅｒｚｉｅらのＯｎｃｏｇｅｎｅ
４：５４３−５４８，１９８９；Ｒ．Ｍ．Ｈｕｄｚｉａ
ｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：１１６５−１１７２，１９８
９；国際特許出願ＷＯ８９／０６６９２（Ｇｅｎｅｔｅ
ｃｈ）；及び日本国出願公開第０２−１５０−２９３号
（味の素（株））に記載されている。
【０００３】生体内中における診断及び治療薬としての
マウス由来モノクローナル抗体の利用における主なる制
限は、異種タンパク質としてのそれらの免疫原性、それ
らの循環系におけるやや長めの持続性及び損傷を与える
免疫複合体の形成にある。一方、ヒトモノクローナル抗
体による治療も限定されており、その理由はヒトハイブ
リドーマ細胞系は調製することが困難であり、一般に不
安定であり、従って適切な特異性のモノクローナル抗体
を十分な量且つ安価において製造できないからである。
主として、マウスモノクローナル抗体の生体外における
利用は限定を有さない。しかしながら、モノクローナル
抗体の製造費及び利用するイムノアッセイのタイプに依
存する抗体への検出可能なマーカーの結合の必要性は、
通常のマウスモノクローナル抗体のためのより経済的な
他の方法を見い出すことを所望せしめる。
【０００４】有望な他の方法は、特定の診断及び治療作
業のためのテーラー抗体（ｔａｉｌｏｒ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ）のためにイムノグロブリン遺伝子を改質せしめる
ことである。イムノグロブリン分子の可変領域及び各定
常領域のドメインが別々のエキソン（それら自身のスプ
ライス部にて）においてコード化されている事実に基づ
き、組換ＤＮＡ技術が、種々のクローン化イムノグロブ
リン遺伝子の部分を単離し、そしてそれらを他のイムノ
グロブリン又はエフェクター分子にリゲートせしめるた
めに利用できる。再構成した遺伝子は適切な形質転換連
続細胞系により発現される。マウス抗体は、例えばマウ
ス定常ドメインエキソンをヒトイムノグロブリン定常ド
メインエキソンと交換することにより「ヒト化」（ｈｕ
ｍａｎｉｚｅｄ）抗体へと変換せしめることができ、従
ってマウスの抗体−結合部位及びヒト定常ドメインを有
するキメラ抗体が作られうる。このキメラ抗体は、マウ
スの可変ドメインにより決定される抗体特異性を保持し
続けるが、しかしながら重鎖ポリペプチドのカルボキシ
−末端定常ドメインセグメントにより決定されるヒトエ
フェクター機能（例えば補体結合、食細胞の刺激、マス
ト細胞による顆粒の放出の誘発）も示す。ヨーロッパ特
許出願第０２３９４００号に記載の抗体を作り変えるこ
とにおけるより巧妙な技術は、フレームワーク領域（Ｆ
Ｒｓ）と称されるマウス可変ドメイン内の他の完全に保
存されているドメインをも、ヒト抗体由来の関連するフ
レームワーク領域又はその他のヒトタンパク質配列と交
換せしめている。このような抗体は人間において免疫原
性がより少ないであろう。その理由は、マウス抗体に由
来する部分は相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する抗原に
対する特異性を決定する高変異性領域のそれのみである
からである。
【０００５】更に、イムノグロブリンと相違する融合タ
ンパク質、例えば一本鎖抗体であって、出発マウスモノ
クローナル抗体の特異性及び結合特性を保持するが、こ
の融合タンパク質の非イムノグロブリン部由来のその他
の新規な特性を有する抗体を形成せしめることもでき
る。抗原と結合できるモノクローナル抗体の最も小さい
ドメインは、重鎖及び軽鎖の可変ドメインより成るＦｖ
フラグメントと称される部分である。タンパク質分解技
術によってＦｖフラグメントを作ることは困難であり、
その理由は関連する可変ドメインは希釈によって解離す
る傾向にあるからである。短いペプチドリンカーを介し
て重鎖及び軽鎖の可変ドメインを結合せしめることによ
って構成されるＦｖ分子（一本鎖抗原結合性タンパク質
とも呼ばれる）は、オリジナルのモノクローナル抗体と
類似の特性により抗原と結合する（Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８
９；Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，
１９８８；及び国際特許出願ＷＯ８９／０９８２５（Ｃ
ｅｌｌｔｅｃｈ））。Ｆｖコード化遺伝子は主として、
組換遺伝子工学によりエフェクター分子をコード化する
遺伝子と結合せしめることができる。例えばＦｖをコー
ド化する遺伝子配列を、シュード−モナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ遺伝子の一部をコード化する遺
伝子と結合せしめることができることが周知である
（Ｖ．Ｋ．Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３
９：３９４−３９７；及び国際特許出願ＷＯ８９／１１
５３３（Ｉ．Ｐａｓｔａｎら））。
【０００６】本発明の目的は、モノクローナル抗体の軽
鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んで成る、ヒ
ト成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイ
ンに特異的な組換抗体；ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異的なモ
ノクローナル抗体それ自体；該組換抗体及び該モノクロ
ーナル抗体の製造方法；該モノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞；該ハイブリドーマ細胞の製造方
法；該重鎖可変ドメイン、該軽鎖可変ドメイン及び該組
換抗体についてコード化するＤＮＡ；該ＤＮＡの製造方
法；該ＤＮＡの発現のために適切なハイブリドベクタ
ー；該ＤＮＡにより形質転換されている宿主細胞；並び
に腫瘍の診断及び治療における該組換抗体及び該モノク
ローナル抗体の利用、の提供にある。
【０００７】本発明は、モノクローナル抗体の重鎖可変
ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含んで成る、成長因子
リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン、即ち、
１８５キロダルトンの糖タンパク質（ｇｐ１８５）に特
異的な組換抗体に関する。
【０００８】このような組換抗体は、例えば、ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２に特異性を有するマウス重鎖可変ドメイン、及
びヒト重鎖定常ドメインα，γ，δ，ε又はμ、好まし
くはγ、例えばγ１もしくはγ４、並びにｃ−ｅｒｂＢ
−２に特異性を有するマウス軽鎖可変ドメイン、及びヒ
ト軽鎖定常ドメインκ又はλ、好ましくはκ、より成
る、機能性抗体を提供するように全てを組み合わせたキ
メラ抗体でありうる。
【０００９】本発明の好ましい組換抗体は一本鎖抗体で
あり、ここでこの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン
はスペーサーグループ、好ましくはペプチドにより結合
されている。最も好ましいのは該重鎖可変ドメインが該
組抗体のＮ末端に位置する一本鎖抗体である。この一本
鎖組換抗体は、エフェクター分子及び／又はそれらが生
産される宿主細胞中による抗体のプロセッシングを促進
せしめるシグナル配列を更に含んで成りうる。考えられ
るエフェクター分子は、診断又は治療目的のために有用
なもの、例えば検出可能な反応を生じめる酵素、例えば
ホスファターゼ、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来
のアルカリホスファターゼ、又は哺乳類アルカリホスフ
ァターゼ例えば牛アルカリホスファターゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水素酵
素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ；特異的な結合特性を有するペプ
チド、例えばビオチンと強く結合するストレプトマイシ
ス アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄ
ｉｎｉｉ）由来のストレプトアビジン；酵素、毒素ある
いはその他の薬剤であって、この抗体が結合している細
胞を攻撃するもの、例えばプロテアーゼ、細胞溶解素又
は外毒素、例えばリシンＡ、ジフテリア毒素Ａもしくは
シュード−モナス外毒素である。以降、エフェクター分
子を更に含んで成る一本鎖組換抗体は融合タンパク質と
称するか、又は適切ならば「一本鎖（組換）抗体」もし
くは「組換抗体」なる語の意味の範囲内に含まれる。
【００１０】エフェクター分子なる語は上記のタンパク
質の生物活性変異体、例えば生体外突然変異誘発にかけ
られたＤＮＡから生産された変異体（ここで、該ＤＮＡ
によりコード化されるタンパク質が天然タンパク質の生
物活性を保持するよう対策がなされている）も含む。こ
のような改良は、アミノ酸の付加、交換もしくは欠失よ
り成ることがあり、後者は短くなった変異体をもたら
す。例えば、酵素例えばホスファターゼはコード化遺伝
子のクローニングを促進せしめるために改良されている
ＤＮＡから調製されることができ、又は外毒素例えばシ
ュードモナス外毒素は細胞結合性ドメインを欠損せしめ
るように変異せしめたＤＮＡから調製されることができ
る。
【００１１】本発明の組換抗体を、そのｃ−ｅｒｂＢ−
２細胞外ドメインに対する特異性について、例えば高レ
ベルのｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞の免疫蛍光染色
により、免疫複合体の直接的又は免疫沈殿のいづれかに
よるイムノブロッティング及びタンパク質ブロッティン
グにより、あるいはその他のイムノアッセイ、例えば結
合、交差阻害又は競合放射性もしくは酵素、イムノアッ
セイにより試験される。
【００１２】抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインは、種
々の特性を有する抗体に適切に保持されているフレーム
ワーク領域（ＦＲ）と称されるもの、及び特異性のため
の固有な相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される高可変
性領域より成る。
【００１３】本発明の好ましい組換抗体は、重鎖可変ド
メインが以下の式のポリペプチド：
【化５】 （ここで、ＦＲ1 は少なくとも２５〜２９個、好ましく
は２５〜３３個の天然のアミノ酸を含んで成るポリペプ
チド残基であり、ＦＲ2 は１２〜１６個の天然アミノ酸
を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ3 は３０〜
３４個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基で
あり、ＦＲ4 は少なくとも６〜１０個、好ましくは６〜
１３個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基で
あり、ＣＤＲ1Hは配列番号４の３２〜３６番目のアミノ
酸配列のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ2Hは配列番号
４の５１〜６７番目のアミノ酸配列のポリペプチド残基
であり、そしてＣＤＲ3Hは配列番号４の１００〜１０９
番目のアミノ酸配列のポリペプチド残基であるか、又は
ＣＤＲ1Hは配列番号８の３２〜３６番目のアミノ酸配列
のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ2Hは配列番号８の５
１〜６７番目のアミノ酸配列のポリペプチド残基であ
り、そしてＣＤＲ3Hは配列番号８の１００〜１１０番目
のアミノ酸配列のポリペプチド残基であり、そしてアミ
ノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態にありう
る）を含んで成るものである。これらの特定の相補性決
定領域は配列番号４に従う
【化６】
【化７】 及び
【化８】 であるか、又は配列番号８に従う
【化９】
【化１０】 及び
【化１１】 である。
【００１４】特に好ましいのは、式Ｉの重鎖可変ドメイ
ンを含んで成る組換抗体であって、そのフレームワーク
領域ＦＲ1 ，ＦＲ2 ，ＦＲ3 及びＦＲ4 のポリペプチド
残基が哺乳類、特にネズミ又はヒトの抗体において見い
出せるものである。
【００１５】本発明の第１の態様において最も好ましい
のは、配列番号４の２〜１２０番目のアミノ酸配列のポ
リペプチドを含んで成る重鎖可変ドメインを有し、任意
的にアミノ酸配列２〜３１（ＦＲ1 ）、３７〜５０（Ｆ
Ｒ2 ）、６８〜９９（ＦＲ3 ）及び／又は１１０〜１２
０（ＦＲ4 ）内の１又は複数（例えば１，２，３もしく
は４個）の単独アミノ酸がその他のアミノ酸により置き
代っているかあるいは欠失しており、そしてアミノ酸Ｃ
ｙｓがＳ−Ｓ−架橋を形成する酸化状態にありうる組換
抗体であり、特に、配列番号４の２〜１２０番目のアミ
ノ酸配列のポリペプチドを含んで成る重鎖可変ドメイン
を有し、アミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状
態にありうる組換抗体である。
【００１６】本発明の第２の態様において最も好ましい
のは、重鎖可変ドメインが配列番号８の２〜１２１番目
のアミノ酸配列のポリペプチドを含んで成り、任意的に
アミノ酸配列２〜３１（ＦＲ1 ）、３７〜５０（Ｆ
Ｒ2 ）、６８〜９９（ＦＲ3 ）及び／又は１１１〜１２
１（ＦＲ4 ）内の１又は複数（例えば１，２，３もしく
は４個）の単独アミノ酸がその他のアミノ酸により置き
代っているかあるいは欠失しており、そしてアミノ酸Ｃ
ｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態にありうる組換抗
体であり、特に、配列番号８の２〜１２１番目のアミノ
酸配列のポリペプチドを含んで成る重鎖可変ドメインを
有し、アミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態
にありうる組換抗体である。
【００１７】例えば、このフレームワーク領域内の疎水
性アミノ酸は、その他のアミノ酸、好ましくはこれも疎
水性のアミノ酸、例えば同類のアミノ酸により置き代わ
られること、二個のアミノ酸により置き代われること、
又は欠失されることがある。同様に、このフレームワー
ク領域内の親水性アミノ酸はその他のアミノ酸により置
き代わられること、二個のアミノ酸により置き代わられ
ること、又は欠失されることがあり、ここでこのアミノ
酸の交換は関連するフレームワーク領域の水素結合構造
を好ましくは保持せしめる。
【００１８】同様に、本発明の好ましい組換抗体は、こ
の軽鎖可変ドメインが次式のポリペプチド
【化１２】 （ここで、ＦＲ6 は天然アミノ酸を好ましくは１９〜２
５個、特に１９〜２３個の天然アミノ酸を含んで成るポ
リペプチド残基であり、ＦＲ7 は１３〜１７個の天然ア
ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ8 は
３０〜３４個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド
残基であり、ＦＲ9 は天然アミノ酸、特に７〜１１個の
天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、そ
してＣＤＲ1Lは配列番号４の１５９〜１６９番目のアミ
ノ酸配列のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ2Lは配列番
号４の１８５〜１９１番目のアミノ酸配列のポリペプチ
ド残基であり、そしてＣＤＲ3Lは配列番号４の２２４〜
２３２番目のアミノ酸配列のポリペプチド残基である
か、又はＣＤＲ1Lは配列番号８の１６０〜１７０番目の
アミノ酸配列のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ2Lは配
列番号８の１８６〜１９２番目のアミノ酸配列のポリペ
プチド残基であり、そしてＣＤＲ3Lは配列番号８の２２
５〜２３２番目のアミノ酸配列のポリペプチド残基であ
り、そしてアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ架橋を形成する酸化
状態にありうる）を含んで成るものである。これらの固
有の相補性決定領域は、配列番号４に従う
【化１３】
【化１４】 及び
【化１５】 であるか、又は配列番号８に従う
【化１６】
【化１７】 及び
【化１８】 である。
【００１９】特に好ましいのは、式IIの軽鎖可変ドメイ
ンを含んで成る組換抗体であって、そのフレームワーク
領域ＦＲ5 ，ＦＲ6 ，ＦＲ7 及びＦＲ8 のポリペプチド
残基が好ましくは哺乳類、特にネズミ又はヒトの抗体に
おいて見い出せるものである。
【００２０】本発明の第１の態様において最も好ましい
のは、配列番号４の１３６〜２４１番目のアミノ酸配列
のポリペプチドを含んで成る軽鎖可変ドメインを有し、
任意的にアミノ酸配列１３６〜１５８（ＦＲ6 ）、１７
０〜１８４（ＦＲ7 ）、１９２〜２２３（ＦＲ8 ）及び
／又は２３３〜２４１（ＦＲ9 ）内の１又は複数（例え
ば１，２，３もしくは４個）の単独アミノ酸がその他の
アミノ酸により置き代っているかあるいは欠失してお
り、そしてアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ−架橋を形成する酸
化状態にありうる組換抗体であり、特に、配列番号４の
１３６〜２４１番目のアミノ酸配列のポリペプチドを含
んで成る軽鎖可変ドメインを有し、アミノ酸ＣｙｓがＳ
−Ｓ架橋を形成する酸化状態にありうる組換抗体であ
る。
【００２１】本発明の第２の態様において最も好ましい
のは、軽鎖可変ドメインが配列番号８の１３７〜２４１
番目のアミノ酸配列のポリペプチドを含んで成り、任意
的にアミノ酸配列１３７〜１５９（ＦＲ6 ）、１７１〜
１８５（ＦＲ7 ）、１９３〜２２４（ＦＲ8 ）及び／又
は２３３〜２４１（ＦＲ9 ）内の１又は複数（例えば
１，２，３もしくは４個）の単独アミノ酸がその他のア
ミノ酸により置き代っているかあるいは欠失しており、
そしてアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態
にありうる組換抗体であり、特に、配列番号８の１３７
〜２４１番目のアミノ酸配列のポリペプチドを含んで成
る軽鎖可変ドメインを有し、アミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架
橋を形成する酸化状態にありうる組換抗体である。
【００２２】例えば、このフレームワーク領域内のアミ
ノ酸は重鎖について前記した通りその他のアミノ酸によ
り置き代わられるか又は欠失されうる。
【００２３】特に好ましいのは、一本鎖組換抗体であっ
て、その重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが、スペ
ーサーグループであって１０〜３０個、例えば約１５個
のアミノ酸より成るものにより連結されている組換抗体
であり、特に次式のポリペプチド
【化１９】 （ここでＦＲ1 ，ＣＤＲ1H，ＦＲ2 ，ＣＤＲ2H，Ｆ
Ｒ3 ，ＣＤＲ3H，ＦＲ4 ，ＦＲ6 ，ＣＤＲ1L，ＦＲ7 ，
ＣＤＲ2L，ＦＲ8 ，ＣＤＲ3L及びＦＲ9 は前記の通りで
あり、そしてＳｐはおよそ１０〜３０個、例えば約１５
個のアミノ酸より成るペプチドスペーサーである）を含
んで成る一本鎖組換抗体である。ここで該重鎖又は軽鎖
可変ドメインはエフェクター分子、例えば酵素、例えば
ホスファターゼ、特にアルカリホスファターゼ、もしく
は毒素、例えばシュードモナス外毒素、又はそれらの変
異体に更に連結されている。好ましくは、該エフェクタ
ー分子は該軽鎖可変ドメインに、任意的に１個以上（例
えば１〜１０個）のアミノ酸より成るペプチドスペーサ
ーを介して連結されている。
【００２４】一本鎖組換抗体及びエフェクター分子を含
んで成るこれらの融合タンパク質は、任意的にその他の
ペプチド、例えば精製を促進せしめるペプチド、特に抗
体に対するエピトープとして有用なペプチド、例えばＦ
ＬＡＧペプチドを含んで成る。例えばアフィニティーク
ロマトグラフによるこのようなペプチドを含んで成る融
合タンパク質の精製は、それらが例えばより速く、より
特異性及び／又は緩やかでありうることにおいて好都合
である。このペプチドはこの融合タンパク質のＮ−末端
にて、組換抗体とエフェクター分子の間において、又は
この融合タンパク質のＣ−末端に位置せしめることがで
きる。好ましくは、これはＮ−末端又はＣ−末端に、特
にＮ−末端に位置される。好ましくは、これらの構造物
は分解部位も含み、これによって融合タンパク質が例え
ばエンテロキナーゼもしくは因子Ｘａによる酵素分解、
又は当業界において周知の化学的方法のいづれかによ
り、そこから離脱できる。更に、これらの構造物は、１
個以上の、例えば１〜１０個の、特に約２個のアミノ酸
より成るペプチドスペーサー、（該スペーサーは前記の
ペプチドの結合を促進せしめる）及び／又はこの組換抗
体に対する分解部位を含んで成りうる。この分解部位
は、該組換抗体とエフェクター分子を含んで成る融合タ
ンパク質が、所望されるならば好ましくは試験管内にお
いて容易に遊離できるように位置する。例えば、Ｆｖ
（ＦＲＰ５）−ＥＴＡと表示する融合タンパク質（配列
番号１０を参照）を含んで成るタンパク質構造物におい
て、ＦＬＡＧペプチド及びエンテロキナーゼ切断部位が
スペーサーに連結され、そしてＦｖ重鎖／軽鎖可変ドメ
インと外毒素Ａとの融合タンパク質の前方に置かれてい
る。所望するならば、このＦＬＡＧペプチドを好ましく
はタンパク質のアフィニィティー精製後にエンテロキナ
ーゼにより分離せしめることができ、これによって一本
鎖抗体Ｆｖ（ＦＲＰ５）及び外毒素Ａを含んで成る融合
タンパク質が得られる。
【００２５】最も好ましいのは、一本鎖組換抗体であっ
て、その重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが成長
因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特
異的なマウスモノクローナル抗体、例えばマウスモノク
ローナル抗体ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＷＰ５１又はＦ
ＳＰ７７に由来し、特にマウスモノクローナル抗体ＦＲ
Ｐ５又はＦＷＰ５１に由来するものである。同様に好ま
しいのは、一本鎖組換抗体であって、その軽鎖と重鎖の
可変ドメインを連結するスペーサーグループがグリシン
及びセリンより選ばれる約１５個のアミノ酸を含んで成
るポリペプチド、特に該スペーサーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが３回反復するサブユニットよ
り成る１５個のアミノ酸のポリペプチドであるものであ
る。
【００２６】特に好ましいのは、一本鎖抗体であって、
ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７より
成るグループから選ばれるマウスモノクローナル抗体の
重鎖可変ドメイン；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒが３回反復するサブユニットより成る１５個のア
ミノ酸のスペーサーグループ；ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，
ＦＷＰ５１又はＦＳＰ７７より成るグループから選ばれ
るマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン；並び
に酵素、例えばホスファターゼ、例えばアルカリホスフ
ァターゼｐｈｏＡ、もしくは外毒素、例えばシュードモ
ナス外毒素又はそれらの変異体、を含んで成るものであ
る。
【００２７】特に好ましいのは、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐ
ｈｏＡで表示する特別な一本鎖組換抗体であって、配列
番号５の２〜６９０のアミノ酸配列のポリペプチドを含
んで成るものである。
【００２８】同様に好ましいのは、一本鎖組換抗体であ
って、精製を促進せしめるペプチド、切断部位並びにＦ
ｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ及びＦｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴ
Ａより成るグループから選ばれる特定の一本鎖組換抗体
を含んで成るもの、特に一本鎖組換抗体であって、配列
番号１０の−１０〜６０６のアミノ酸配列のポリペプチ
ド及び配列番号１１の−１０〜６０６のアミノ酸配列の
ポリペプチドより成るグループから選ばれるポリペプチ
ドを含んで成るものであり、該タンパク質は、必要なら
ばエンテロキナーゼによる試験管内分離にかける。
【００２９】特に好ましいのは、一本鎖組換抗体であっ
て、配列番号１０のアミノ酸配列２−６０６のポリペプ
チド及び配列番号１１のアミノ酸配列２−６０６のポリ
ペプチドより成るグループから選ばれるタンパク質を含
んで成るものである。
【００３０】本発明は更に、成長因子リセプターｃ−ｅ
ｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特異的であり、ＦＲＰ
５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７７及びＦＷＰ５１と表示され
るマウスモノクローナル抗体であって、それぞれがハイ
ブリドーマ細胞系ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７７及
びＦＷＰ５１により分泌されるものに関する。最も好ま
しいのは、ＦＲＰ５及びＦＷＰ５１と表示するマウスモ
ノクローナル抗体である。
【００３１】本発明は更に、本発明の組換抗体及びマウ
スモノクローナル抗体の製造方法に関する。該抗体は周
知の方法により製造され、このような抗体を生産する以
下に定義する宿主細胞又はハイブリドーマ細胞を試験管
内又は生体内において増殖せしめ、そして必要ならば得
られる抗体を単離せしめることを特徴とする。例えば本
発明の組換抗体は、形質転換せしめた宿主をその発現を
可能とする条件のもとで培養し、そして該抗体を単離せ
しめることを含んで成る組換ＤＮＡ技術によって調製さ
れうる。
【００３２】より詳しくは、本発明は、重鎖マウス可変
ドメイン、軽鎖マウス可変ドメイン、重鎖マウス可変ド
メインと軽鎖マウス可変ドメイン、一本鎖組換抗体、融
合タンパク質並びに融合タンパク質であって任意的に精
製を促進せしめるペプチド、切断部位及びペプチドスペ
ーサーを含んで成るもの、より成るグループから選ばれ
る本発明のタンパク質の製造のための方法にも関し、該
方法は、プロモーター及び該タンパク質についてコード
化せしめるＤＮＡを含んで成る発現カセットを含んで成
るハイブリドベクターによって形質転換された宿主細胞
例えばＥ．コリを培養し（該ＤＮＡは該プロモーターに
よって調節されている）、そして該タンパク質を単離せ
しめることを含んで成る。
【００３３】特に、本発明は重鎖マウス可変ドメイン、
軽鎖マウス可変ドメイン、重鎖マウス可変ドメインと軽
鎖マウス可変ドメイン、一本鎖組換抗体、融合タンパク
質並びに融合タンパク質であって任意的に精製を促進せ
しめるペプチド、切断部位及びペプチドスペーサーを含
んで成るもの、より成るグループから選ばれる本発明の
タンパク質の製造のための方法に関し、該方法は該タン
パク質をコード化する第２ＤＮＡ配列と適切な解読フレ
ーム内において連結している、シグナルペプチドをコー
ド化する第１ＤＮＡ配列と作動連結しているプロモータ
ーを含んで成る発現カセットを含んで成るハイブリドベ
クターにより形質転換された宿主細胞、例えばＥ．コリ
を培養し、そして該タンパク質を単離せしめることを含
んで成る。
【００３４】試験管内におけるハイブリドーマ細胞又は
哺乳類宿主細胞の増殖は、適切な培養培地であって常用
の標準培養培地、例えばダルベッコ改良イーグル培地
（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌ
ｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）又は：ＲＰＭＩ１６４０
培地、任意的に哺乳類血清、例えば仔牛血清、又は微量
元素及び成長維持供給物、例えば、支持細胞例えば正常
マウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）、脾臓細胞、骨髄マクロ
ファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トラン
スフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等の供
給された培地において行なわれる。細菌細胞又は酵母細
胞の宿主細胞の増殖は同様に当業界における周知の適切
な培養培地において行なわれ、例えば細菌については、
培地ＬＢ，ＮＺＣＹＭ，ＮＺＹＭ，ＮＺＭ、テリフィッ
クブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）、ＳＯＢ，
ＳＯＣ，２ｘＹＴ又はＭ９最少培地中で行なわれ、そし
て酵母についてはＹＰＤ，ＹＥＰＤ、最少培地又は完全
最少ドロップアウト培地中で行なわれる。
【００３５】試験管内製造は比較的純粋な抗体の製造を
提供し、そして大量の所望する抗体を提供するためのス
ケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母又は哺乳類
細胞の培養についての技術は当業界において周知であ
り、そして均質な懸濁培養、例えばエアーリフト（空中
補給）反応槽もしくは連続攪拌反応槽内における培養、
又は固定化もしくは包埋化細胞培養、例えば中空ファイ
バー、マイクロカプセル、アガロースマイクロビース上
もしくはセラミックカートリッジ上における培養を含
む。
【００３６】大量の所望する抗体は、哺乳類細胞を生体
内において増殖せしめることによっても得ることができ
る。この目的のためには、所望の抗体を生産するハイブ
リドーマ細胞を組織適合性哺乳類に注射して抗体産性腫
瘍の成長を引き起こさせる。任意的に、この動物を炭化
水素、特に鉱物油、例えばプリスタン（テトラメチル−
ペンタデカン）によって、注射前に感作せしめる。１〜
３週間後、この抗体をそれら哺乳類の体液から単離す
る。例えば、適切なミエローマ細胞とＢａｌｂ／ｃマウ
ス由来の抗体産性脾臓細胞との融合によって得られるハ
イブリドーマ細胞、又は所望の抗体を生産するハイブリ
ドーマ細胞系Ｓｐ２／０由来の感染細胞を、任意的にプ
リスタンによって前処理されているＢａｌｂ／ｃマウス
に腹膜腔内注射し、そして１〜２週間後に、この動物の
腹水液を採取する。
【００３７】この細胞培養上清液を所望の抗体のため
に、優先的にはｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞の免疫
蛍光染色により、イムノブロッティングにより、酵素イ
ムノアッセイ例えばサンドイッチアッセイもしくはドッ
トアッセイにより、又はラジオイムノアッセイによって
検索する。
【００３８】該抗体の単離のため、該培養上清液又は腹
水液中のイムノグロブリンを濃縮してもよく、それは例
えば硫酸アンモニウムによる沈殿、吸湿性物質、例えば
ポリエチレングリコールに対する透析、選択膜への濾過
等による。必要及び／又は所望するならば、該抗体を常
用のクロマトグラフィー方法、例えばゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースによる
クロマトグラフィー及び／又は（イムノ−）アフィニテ
ィークロマトグラフィー、例えばｃ−ｅｒｂＢ−２タン
パク質又はプロテインＡによるアフィニティークロマト
グラフィーにより精製する。
【００３９】本発明は更に、本発明のモノクローナル抗
体を産出するハイブリドーマ細胞、特にハイブリドーマ
細胞系ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７７及びＦＷＰ５
１に関する。これらは１９９０年１１月２１日に、ブタ
ペスト条約のもと、取得番号がそれぞれ第９０１１２１
１５号、第９０１１２１１６号、第９０１１２１１７号
及び第９０１１２１１８号のもとでＰｏｒｔｏｎ Ｄｏ
ｗｎ，Ｓａｌｉｂｕｒｙ，ＵＫにおけるＥｕｒｏｐｅａ
ｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されてい
る。最も好ましいのは、ＦＲＰ５と表示したハイブリド
ーマ細胞系（ＥＣＡＣＣ番号９０１１２１１５）又はＦ
ＷＰ５１と表示したハイブリドーマ細胞系（ＥＣＡＣＣ
番号９０１１２１１８）である。本発明の好ましいハイ
ブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異的な
本発明のモノクローナル抗体を分泌し、そして深冷凍結
した培養物から融解及び再クローン化によって活性化せ
しめることができる。
【００４０】本発明は成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ
−２の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体を
産出するハイブリドーマ細胞系の調製のための方法にも
関し、該方法は、適切な哺乳類、例えばＢａｌｂ／ｃマ
ウスを精製されたｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、精製さ
れたｃ−ｅｒｂＢ−２を含む抗原性担体又は成長因子リ
セプターｃ−ｅｒｂＢ−２を有する細胞によって免疫化
せしめること、この免疫化哺乳類の抗体産性細胞を適切
なミエローマ細胞系と融合せしめること、この融合にお
いて得られるハイブリド細胞をクローン化せしめるこ
と、及び所望の抗体を分泌する細胞クローンを選別する
ことにより特徴付けられる。例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２
を有する細胞によって免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウス
の脾臓細胞をミエローマ細胞系ＰＡＩ又はミエローマ細
胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させ、得られる
ハイブリド細胞を所望の抗体の生産について検索し、そ
して陽性のハイブリドーマ細胞をクローン化せしめる。
【００４１】好ましいのは、ハイブリドーマ細胞系の製
造のための方法であって、適当なアジュバントを含む１
０7 〜１０8 個のヒト胸部腫瘍細胞系ＳＫＢＲ３細胞を
数回（例えば４〜６回）、数ケ月（例えば２〜４ケ月）
にわたって皮下及び／又は腹膜腔内注射によってＢａｌ
ｂ／ｃマウスを免疫化せしめ、そして最後の注射から２
〜４日後にこの免疫化マウスの脾臓細胞を採取し、そし
てこれを融合促進剤、好ましくはポリエチレングリコー
ルの存在下においてミエローマ細胞系ＰＡＩの細胞と融
合せしめることにより特徴付けられる方法である。好ま
しくは、このミエローマ細胞を、分子量約４，０００の
ポリエチレングリコール約３０％〜約５０％を含む溶液
中で、３〜２０倍過剰量のこの免疫化マウス由来の脾臓
細胞と融合せしめる。融合させた後、正常なミエローマ
細胞が所望のハイブリドーマ細胞よりもよく成長するこ
とを防ぐために、通常の間隔でこの細胞を前記の通りの
適切な培養培地であって選択培地、例えばＨＡＴ培地の
供給されている培地中に植え代えた。
【００４２】本発明は前記の通り、成長因子リセプター
ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特異的な抗体の重
鎖マウス可変ドメイン及び／又は軽鎖マウス可変ドメイ
ンについてコード化するインサート（挿入体）を含んで
成る組換ＤＮＡにも関する。定義により、このようなＤ
ＮＡは、コード化一本鎖ＤＮＡ、前記のコード化ＤＮＡ
とそれに相補性のＤＮＡより成る二本鎖ＤＮＡ、又はこ
れら相補性（一本鎖）ＤＮＡそれ自身を含んで成る。
【００４３】更に、成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−
２の細胞外ドメインに特異的な抗体の重鎖マウス可変ド
メイン及び／又は軽鎖マウス可変ドメインをコード化す
るＤＮＡは、重鎖マウス可変ドメイン及び／もしくは軽
鎖マウス可変ドメイン、又はその突然変異体をコード化
するオーセンティック（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＤＮＡを
有する酵素的又は化学的合成ＤＮＡであってよい。オー
センティックＤＮＡの突然変異体は、上記の抗体の重鎖
マウス可変ドメイン及び／又は軽鎖マウス可変ドメイン
であって、その１もしくは複数のアミノ酸が欠失してい
る又は１もしくは複数の他のアミノ酸により置換されて
いるものである。好ましくは、この改質は該抗体の重鎖
マウス可変ドメイン及び／又は軽鎖マウス可変ドメイン
のＣＤＲの外に存在する。このような突然変異ＤＮＡは
サイレント突然変異、即ち１又は複数のヌクレオチドが
その他のヌクレオチドにより置換されるがこの新しいコ
ドンが同一のアミノ酸をコード化する突然変異であって
もよい。このような突然変異の配列は、縮重（ｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔｅｄ）配列でもある。縮重配列は、本来コー
ド化されるアミノ酸配列の変化をもたらすことなく無制
限の数のヌクレオチドがその他のヌクレオチドにより置
換される遺伝子コードの範囲内において縮重されてい
る。このような縮重配列は、該重鎖マウス可変ドメイン
及び／又は軽鎖マウス可変ドメインの最大の発現を得る
ため、特定の宿主（特にＥ．コリ）により好適であるそ
れらの異なる制限部位及び／又は特定のコドンの頻度に
起因して有用となりうる。
【００４４】突然変異体なる語は、当業界に周知方法に
従うオーセンティックＤＮＡの試験管内突然変異誘発に
より得られるＤＮＡ突然変異体を含む。
【００４５】本発明は組換ＤＮＡであって、抗体、ＦＲ
Ｐ５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７７及びＦＷＰ５１より成る
グループから選ばれるモノクローナル抗体の重鎖マウス
可変ドメインをコード化するインサート、又は該重鎖可
変ドメインと相同性のアミノ酸配列をコード化するイン
サートを含んで成るものに関する。
【００４６】特に、本発明は組換ＤＮＡであって、ハイ
ブリドーマ細胞系ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７７も
しくはＦＷＰ５１のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡに由来す
る重鎖マウス可変ドメインをコード化するインサート、
あるいは該細胞系のゲノムＤＮＡと相同性であり、そし
てモノクローナル抗体ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＳＰ７
７もしくはＦＷＰ５１の重鎖可変ドメインと相同性のア
ミノ酸配列をコード化するインサートを含んで成るもの
に関する。特に好ましいのは、組換ＤＮＡであって、ハ
イブリドーマ細胞系ＦＲＰ５のゲノムＤＮＡもしくはｍ
ＲＮＡに由来する重鎖マウス可変ドメインをコード化す
るインサート、又は該細胞系のゲノムＤＮＡと相同性で
あり、そしてモノクローナル抗体ＦＲＰ５の重鎖可変ド
メインに相同性のアミノ酸配列をコード化するインサー
トを含んで成るもの；あるいは、ハイブリドーマ細胞系
ＦＷＰ５１のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡに由来する
重鎖マウス可変ドメインをコード化するインサート、又
は該細胞系のゲノムＤＮＡと相同性であり、そしてモノ
クローナル抗体ＦＷＰ５１の重鎖可変ドメインに相同性
のアミノ酸配列をコード化するインサートを含んで成る
ものである。
【００４７】好ましいのは、組換ＤＮＡであって、式Ｉ
のポリペプチドをコード化するインサートを含んで成り
（ここでＦＲ1 ，ＦＲ2 ，ＦＲ3 ，ＦＲ4 ，ＣＤＲ1H，
ＣＤＲ2H及びＣＤＲ3Hは前記の通り）、任意的に更にイ
ントロンを含んでいるポリペプチドである。特に好まし
いのは、式Ｉのポリペプチドをコード化する組換ＤＮＡ
であって、ネズミもしくはヒトフレームワーク領域ＦＲ
1 ，ＦＲ2 ，ＦＲ3 及びＦＲ4 をコード化するインサー
ト、並びに配列番号４のＤＮＡ配列９９〜１１３（ＣＤ
Ｒ1H）、ＤＮＡ配列１５６〜２０６（ＣＤＲ2H）及びＤ
ＮＡ配列３０３〜３３２（ＣＤＲ3H）の相補性決定領域
をコード化するインサート、又は配列番号８のＤＮＡ配
列９９〜１１３（ＣＤＲ1H）、ＤＮＡ配列１５６〜２０
６（ＣＤＲ2H）及びＤＮＡ配列３０３〜３３５（ＣＤＲ
3H）の相補性決定領域をコード化するインサートを含ん
で成るものである。最も好ましいのは、配列番号４のＤ
ＮＡ配列９〜３６５のインサートを含んで成るＤＮＡで
あって、ここで任意的に１又は複数（例えば１〜１０
個）のヌクレオチドがその他のヌクレオチドにより置換
されているものであり、特に配列番号４のＤＮＡ配列９
〜３６５のインサートを含んで成るＤＮＡである。同様
に好ましいのは、配列番号８のＤＮＡ配列９〜３６８の
インサートを含んで成るＤＮＡであって、ここで任意的
に１又は複数（例えば１〜１０個）のヌクレオチドがそ
の他のヌクレオチドにより置換されているものであり、
特に配列番号８のＤＮＡ配列９〜３６８のインサートを
含んで成るＤＮＡである。
【００４８】配列番号４に示すヌクレオチドの配列のＤ
ＮＡ、又は配列番号８に示すヌクレオチドの配列のＤＮ
Ａにおいて、これらはその他のヌクレオチドによって置
換でき、このような置換は、これらがコード化する相補
性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を変えない場合が
好ましい。このことは、このようなヌクレオチドの置換
が、フレームワーク領域（ＦＲ）についてコード化する
インサート又はトリプレットコドンの縮重に基づいて、
コード化されるアミノ酸を変えない位置において見い出
されることを意味する。
【００４９】同様に、本発明は抗体ＦＲＰ５，ＦＳＰ１
６，ＦＳＰ７７及びＦＷＰ５１より成るグループから選
ばれるモノクローナル抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインを
コード化するインサート、又は該軽鎖可変ドメインと相
同性のアミノ酸をコード化するインサート組換ＤＮＡに
関する。
【００５０】より詳しくは、本発明は組換ＤＮＡであっ
て、ハイブリドーマ細胞系ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＳ
Ｐ７７もしくはＦＷＰ５１のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ
に由来する軽鎖マウス可変ドメインをコード化するイン
サート、あるいは該細胞系のゲノムＤＮＡと相同性であ
り、そしてモノクローナル抗体ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，
ＦＳＰ７７もしくはＦＷＰ５１の軽鎖可変ドメインと相
同性のアミノ酸配列をコード化するインサートを含んで
成るものに関する。特に好ましいのは、組換ＤＮＡであ
って、ハイブリドーマ細胞系ＦＲＰ５のゲノムＤＮＡも
しくはｍＲＮＡに由来する軽鎖マウス可変ドメインをコ
ード化するインサート、又は該細胞系のゲノムＤＮＡと
相同性であり、そしてモノクローナル抗体ＦＲＰ５の軽
鎖可変ドメインに相同性のアミノ酸配列をコード化する
インサートを含んで成るもの；あるいは、ハイブリドー
マ細胞系ＦＷＰ５１のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡに
由来する軽鎖マウス可変ドメインをコード化するインサ
ート、又は該細胞系のゲノムＤＮＡと相同性であり、そ
してモノクローナル抗体ＦＷＰ５１の軽鎖可変ドメイン
に相同性のアミノ酸配列をコード化するインサートを含
んで成るものである。
【００５１】好ましいのは、組換ＤＮＡであって、式II
のポリペプチドをコード化するインサートを含んで成り
（ここでＦＲ5 ，ＦＲ6 ，ＦＲ7 ，ＦＲ8 ，ＣＤＲ1L，
ＣＤＲ2L及びＣＤＲ3Lは前記の通り）、任意的に更にイ
ントロンを含んでいるポリペプチドである。特に好まし
いのは、式IIのポリペプチドをコード化する組換ＤＮＡ
であって、ネズミもしくはヒトフレームワーク領域ＦＲ
5 ，ＦＲ6 ，ＦＲ7 及びＦＲ8 をコード化するインサー
ト、並びに配列番号４のＤＮＡ配列４８０〜５１２（Ｃ
ＤＲ1L）、ＤＮＡ配列５５８〜５７８（ＣＤＲ2L）及び
ＤＮＡ配列６７５〜７０１（ＣＤＲ3L）の相補性決定領
域をコード化するインサート、又は配列番号８のＤＮＡ
配列４８３〜５１５（ＣＤＲ1L）、ＤＮＡ配列５６１〜
５８１（ＣＤＲ2L）及びＤＮＡ配列６７８〜７０１（Ｃ
ＤＲ3L）の相補性決定領域をコード化するインサートを
含んで成るものである。
【００５２】最も好ましいのは、配列番号４のＤＮＡ配
列４１１〜７２８のインサートを含んで成るＤＮＡであ
って、ここで任意的に１又は複数（例えば１〜１０個）
のヌクレオチドがその他のヌクレオチドにより置換され
ているものであり、特に配列番号４のＤＮＡ配列４１１
〜７２８のインサートを含んで成るＤＮＡである。同様
に好ましいのは、配列番号８のＤＮＡ配列４１４〜７２
８のインサートを含んで成るＤＮＡであって、ここで任
意的に１又は複数（例えば１〜１０個）のヌクレオチド
がその他のヌクレオチドにより置換されているものであ
り、特に配列番号８のＤＮＡ配列４１４〜７２８のイン
サートを含んで成るＤＮＡである。配列番号４に示すヌ
クレオチドの配列のＤＮＡ、又は配列番号８に示すヌク
レオチドの配列のＤＮＡにおいて、これらはその他のヌ
クレオチドによって置換でき、このような置換は、これ
がコード化する相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配
列を変えない場合が好ましい。このことは前記した重鎖
可変ドメインについてコード化するＤＮＡと同じであ
る。
【００５３】完全な四量体イムノグロブリン分子の組立
て及びこのキメラ抗体の発現のため、重鎖及び軽鎖可変
ドメインをコード化する該組換ＤＮＡインサートを、関
連する重鎖及び軽鎖定常ドメインをコード化するＤＮＡ
と融合せしめ、次いで適切な宿主細胞に、例えばハイブ
リドベクターに組み入れた後に移し入れる。
【００５４】従って本発明は、ヒト定常ドメイン、例え
ばγ１，γ２，γ３又はγ４、好ましくはγ１又はγ４
に融合している、ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに
特異的な抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコード化する
インサートを含んで成る組換ＤＮＡにも関する。同様に
本発明は、ヒト定常ドメインκ又はλ、好ましくはκに
融合している、ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特
異的な抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコード化するイ
ンサートを含んで成る組換ＤＮＡに関する。
【００５５】本発明は特に、前記の一本鎖組換抗体をコ
ード化する組換ＤＮＡ、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖
可変ドメインとがスペーサーグループをコード化するＤ
ＮＡインサートにより連結されている組換ＤＮＡに関
し、特に式III のタンパク質をコード化し（ここでＦＲ
1 ，ＦＲ2 ，ＦＲ3 ，ＦＲ4 ，ＦＲ6 ，ＦＲ7 ，Ｆ
Ｒ8 ，ＦＲ9 ，ＳＰ，ＣＤＲ1H，ＣＤＲ2H，ＣＤＲ3H，
ＣＤＲ1L，ＣＤＲ2L及びＣＤＲ3Lは前記の通り）、任意
的にエフェクター分子及び／又は宿主細胞における抗体
のプロセッシングを促進せしめるシグナル配列を更に含
んで成る組換ＤＮＡに関する。特に本発明は、任意的に
１又は複数（例えば１〜１０個）のヌクレオチドが他の
ヌクレオチドにより置換されている、配列番号４のＤＮ
Ａ配列９〜７２８のインサートを含んで成るＤＮＡ、特
に配列番号４のＤＮＡ配列９〜７２８のインサートを含
んで成るＤＮＡに関する。更に本発明は、任意的に１又
は複数（例えば１〜１０個）のヌクレオチドが他のヌク
レオチドによって置換されている、配列番号８のＤＮＡ
配列９〜７２８のインサートを含んで成るＤＮＡ、特に
配列番号８のＤＮＡ配列９〜７２８のインサートを含ん
で成るＤＮＡに関する。
【００５６】他の態様において、本発明は組換ＤＮＡで
あって、その重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがス
ペーサーグループをコード化するＤＮＡインサートによ
り連結されている組換ＤＮＡをコード化し、任意的に宿
主細胞において抗体のプロセッシングを促進せしめるシ
グナル配列及び／又は抗体の精製を促進せしめるペプチ
ドをコード化するＤＮＡ及び／又は切断部位をコード化
するＤＮＡ及び／又はペプチドスペーサーをコード化す
るＤＮＡ及び／又はエフェクター分子をコード化するＤ
ＮＡを含んで成るものに関する。
【００５７】エフェクター分子をコード化するＤＮＡ
は、前記のエフェクター分子、特にアルカリホスファタ
ーゼ又はシュードモナス外毒素Ａをコード化するＤＮＡ
を意図とする。このようなエフェクター分子をコード化
するＤＮＡは、天然の酵素もしくは毒素をコード化する
ＤＮＡの配列、又はそれらの突然変異体を有し、そして
当業界において周知の方法により製造されうる。例えば
アルカリホスファターゼもしくはシュードモナス外毒素
Ａをコード化する天然のＤＮＡ又はその突然変異体は、
前述と類似の方法により得ることができる。
【００５８】最も好ましいのは、配列番号５のＤＮＡ配
列２３〜８１４、配列番号５のＤＮＡ配列８６〜２１５
５又は配列番号５のＤＮＡ配列２３〜２１５５のインサ
ートであって、任意的に１又は複数（例えば１〜１０
個）のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換さ
れているものを含んで成るＤＮＡであり、特に配列番号
５のＤＮＡ配列２３〜２１５５のインサートを含んで成
るＤＮＡである。
【００５９】同様に好ましいのは、配列番号１０のＤＮ
Ａ配列１〜１９１１、配列番号１０のＤＮＡ配列６４〜
１９１１もしくは配列番号１０のＤＮＡ配列９７〜１９
１１のインサートであって任意的に１もしくは複数（例
えば１〜１０個）のヌクレオチドが他のヌクレオチドに
よって置換されているものを含んで成るＤＮＡ、又は配
列番号１１のＤＮＡ配列１〜１９１１、配列番号１１の
ＤＮＡ配列６４〜１９１１もしくは配列番号１１のＤＮ
Ａ配列９７〜１９１１のインサートであって任意的に１
もしくは複数（例えば１〜１０個）のヌクレオチドが他
のヌクレオチドによって置換されているものを含んで成
るＤＮＡであり、特に配列番号１１のＤＮＡ配列１〜１
９１１のインサートを含んで成るＤＮＡである。
【００６０】更に、本発明はハイブリドベクターである
組換ＤＮＡであって、前記の通りのネズミ重鎖の可変ド
メインをコード化するインサート及び／又は前記の通り
のネズミ軽鎖の可変ドメインをコード化するインサー
ト、複製もしくは自律性複製配列の起源、１もしくは複
数のドミナント（優性）マーカー配列、並びに任意的に
発現コントロール配列、シグナル配列及び更なる制限部
位を含んで成る組換ＤＮＡに関する。
【００６１】第１の態様において、本発明に関するハイ
ブリドベクターは、プロモーター、更には本発明のタン
パク質であって重鎖ネズミ可変ドメイン、軽鎖ネズミ可
変ドメイン、重鎖ネズミ可変ドメインと軽鎖ネズミ可変
ドメイン、一本鎖組換抗体、融合タンパク質、並びに融
合タンパク質であって任意的に精製を促進せしめるペプ
チド、切断部位及びペプチドスペーサーを含んで成るも
の、より成るグループから選ばれるものを含んで成る発
現カセットを含んで成り（ここでこのＤＮＡは該プロモ
ーターによってコントロールされている）、そして該タ
ンパク質を単離せしめる。
【００６２】第２の態様において、本発明に関するハイ
ブリドベクターは、重鎖ネズミ可変ドメイン、軽鎖ネズ
ミ可変ドメイン、重鎖ネズミ可変ドメインと軽鎖ネズミ
可変ドメイン、一本鎖組換抗体、並びに精製を促進せし
めるペプチド、分解部位及びペプチドスペーサーを任意
的に含んで成る融合タンパク質より成るグループから選
ばれる本発明のタンパク質をコード化する第２ＤＮＡ配
列に、適切な解読フレームにおいて連結しているシグナ
ルペプチドをコード化する第１ＤＮＡ配列と作動連結し
ているプロモーターを含んで成る発現カセットを含んで
成る。
【００６３】ベクターは一般に適合性宿主細胞との共同
作業において、二つ機能を示す。１つの機能はイムノグ
ロブリン可変ドメインをコード化する核酸のクローン化
を促進せしめること、即ち、有用な量の核酸（クローニ
ングベクター）を製造することである。他の機能は、染
色体外因子として保持されること又は宿主染色体（発現
ベクター）に一体化されることのいづれかにより、適切
な宿主において組換遺伝子構造体の複製及び発現を提供
することにある。クローニングベクターは前記の通りの
組換遺伝子構造体、複製又は自律性複製配列の起源、ド
ミナントマーカー配列並びに任意的にシグナル配列及び
更なる制限部位を含んで成る。発現ベクターは組換遺伝
子の転写及び翻訳に重要な発現コントロール配列を更に
含んで成る。
【００６４】複製又は自律性複製配列の起源は、例えば
シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）も
しくはその他のウイルス源由来の外因性起源を含ませる
ようにベクターを組立てること、又は宿主細胞の染色体
機構のいづれかによって提供される。
【００６５】マーカーは該ベクターを含む宿主細胞の選
別を可能にする。選択マーカーには、重金属例えば銅、
又は抗生物質例えばジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉ
ｎ）（Ｇ−４１８）もしくはヒグロマイシンに対する耐
性を授ける遺伝子、あるいは宿主細胞の遺伝的損傷、例
えばチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリルトラ
ンスフェラーゼ、ジヒドロホレートリダクターゼ等の欠
損を補完する遺伝子が含まれる。
【００６６】シグナル配列は、例えば予備配列（ｐｒｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は組換抗体の分泌を誘発する分泌
誘導体（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ）、スプラ
イスシグナル等でありうる。組換抗体の分泌を誘発する
シグナル配列は例えばｏｍｐＡ遺伝子、ｐｅｌＢ（ペク
チン酸リアーゼ）遺伝子又はｐｈｏＡ遺伝子由来の配列
である。
【００６７】発現コントロール配列として、該ベクター
ＤＮＡはプロモーター、即ち、転写の開始と停止及びこ
のｍＲＮＡの安定化のために必要な配列、並びに任意的
にエンハンサー及び更なる調節的配列を含んで成る。
【００６８】広範囲にわたるプロモーター配列が、宿主
細胞の種類に応じて利用できうる。強力であり、そして
同時によく調節されうるプロモーターが最も有用であ
る。翻訳の開始のための配列は例えばシャイン−ダルガ
ーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｒｇａｒｎｏ）配列である。転
写の開始及び停止、並びにｍＲＮＡの安定化のために必
要な配列は、通常例えば発現宿主由来のウイルス又は真
核細胞のｃＤＮＡの非コード化５′領域及び３′領域の
それぞれから得られる。エンハンサーはウイルス起源、
例えばシミアンウイルス、ポリオーマウイルス、牛パピ
ロマウイルスもしくはモロニーサルコマウイルス由来、
又はゲノム、特にマウス起源の転写刺激ＤＮＡ配列であ
る。
【００６９】本ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメン
トは作動的に連結している。即ち、それらはつながって
おり、そして互いに機能的な関係において位置してい
る。Ｅ．コリ株における複製及び発現のために適切なベ
クターの例はバクテリオファージ、例えばλバクテリオ
ファージの誘導体、又はプラスミド、例えば、特にプラ
スミドＣｏｌＥ１及びその誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐ
ＳＦ２１２４，ｐＢＲ３１７もしくはｐＢＲ３２２、並
びにｐＢＲ３３２由来のプラスミド例えばｐＵＣ９，ｐ
ＵＣＫ０，ｐＨＲｉ１４８及びｐＬｃ２４が挙げられ
る。適切なベクターは、完全なレプリコン、マーカー遺
伝子、制限エンドヌクレアーゼのための認識配列（これ
により、異種ＤＮＡ及び適切ならば発現コントロール配
列をこの部位に挿入することができる）、並びに任意的
にシグナル配列及びエンハンサーを含む。
【００７０】微生物プロモーターは、例えば温度感受性
リプレッサーによりコントロールされる、バクテリオフ
ァージλの強力な左手方向（ｌｅｆｔｗａｒｄ）プロモ
ーターＰL である。更に適切なのは、Ｅ．コリプロモー
ター、例えばｌａｃ（ラクトース）プロモーターであっ
て、ｌａｃリプレッサーによって調節されそしてイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘発されるも
の、ｔｒｐ（トリプトファン）プロモーターであってｔ
ｒｐリプレッサーにより調節されそして例えばトリプト
ファンの不足により誘発されるもの、及びｔａｃ（ハイ
ブリドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）であってｌａｃリ
プレッサーにより調節されているものである。
【００７１】酵母における複製及び発現のために適切な
ベクターは、酵母複製起点（ｓｔａｒｔ）及び酵母のた
めの選択遺伝子マーカーを含む。このようなベクターの
１つのグループは、ａｒｓ配列（自律性複製配列：ａｕ
ｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）と称される複製の起点を含む。このようなベ
クターは形質転換後に酵母細胞において染色体外的に保
持され、そして自律的に複製される。更に、サッカロマ
イシス セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の２μ（２ミクロン）のプラ
スミドＤＮＡの全て又は一部を含むベクターが利用でき
る。このようなベクターは該細胞内に既に存在している
２μのプラスミドの中に組換により一体化せしめるか、
又は自律的に複製される。高い形質転換率及び高いコピ
ー数が達成される場合、２μの配列が特に適切である。
【００７２】酵母における発現のために適切な発現コン
トロール配列は例えば高発現性酵母遺伝子のそれであ
る。従って、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨ
II遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ3 もしくはＰＨ
Ｏ5 ）遺伝子、イソチトクローム遺伝子のためのプロモ
ーター、又は解糖系に包含されるプロモーター、例え
ば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸キナ
ーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフェートイソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナ
ーゼの遺伝子のプロモーターが利用できる。
【００７３】哺乳類細胞における複製及び発現のために
適切なベクターは、ウイルス由来のＤＮＡ、例えばシミ
アンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウスサルコマウイル
ス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、牛パピロマウイルス
（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ突然変異体（ＢＫ
Ｍ）、又はマウスもしくはヒトのサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列が付与されている。
他方、該ベクターは哺乳類発現生成物、例えばアクチ
ン、コラーゲン、ミオシン他由来のプロモーターであっ
て、通常所望の遺伝子配列、即ち、イムノグロブリンＨ
鎖又はＬ鎖のプロモーターと関連するプロモーターを含
んで成りうる。
【００７４】好ましいベクターは、原核細胞及び真核細
胞宿主の両方のために適切なものであり、そしてそれは
ウイルスの複製系に基づく。特に好ましいのは、シミア
ンウイルスプロモーター例えばｐＳＶｇｐｔ又はｐＳＶ
ｎｅｏを含んで成るベクターであって、エンハンサー、
例えばイムノグロブリン遺伝子配列に通常一体化されて
いるエンハンサー、特にマウスＩｇのＨ−又はＬ−鎖エ
ンハンサーを更に含んで成るものである。
【００７５】本発明の組換抗体をコード化する組換ＤＮ
Ａは、例えば形質転換せしめた宿主細胞を培養すること
により製造でき、そして任意的にこの製造したＤＮＡを
単離せしめる。
【００７６】特に、このようなＤＮＡは以下の段階： ａ）所望の特異性を有する抗体の可変重鎖及び／又は軽
鎖のドメインをコード化するネズミＤＮＡを、例えば適
切なハイブリドーマ細胞系のゲノムから該ＤＮＡを単離
し、そしてＤＮＡプローブを用いて所望のＤＮＡを選別
すること、又は適切なハイブリドーマ細胞系からｍＲＮ
Ａを単離し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて所望の特異性を有する抗体の可変重鎖及び／又は軽
鎖のドメインをコード化するｃＤＮＡを調製すること、
により調製し、 ｂ）所望のシグナル配列をコード化するＤＮＡ及び／又
はエフェクター分子をコード化するＤＮＡを、例えば、
適切な起源、例えばゲノムライブラリー又はｃＤＮＡラ
イブラリーから、ＤＮＡプローブを用いて所望のＤＮＡ
を単離せしめることにより準備し、 ｃ）化学的方法により所望のスペーサーグループをコー
ド化するＤＮＡを合成し、 ｄ）段階ａ）並びに任意的にｂ）及びｃ）のＤＮＡを適
切なハイブリドベクターに組入れることにより、該組換
抗体をコード化する組換遺伝子を組立て、 ｅ）得られるハイブリドベクターを感受性宿主細胞に移
し入れるか、又は該組換遺伝子をコード化するＤＮＡを
回収し、そしてこの結合していないＤＮＡを感受性宿主
細胞に移し入れ、 ｆ）形質転換された宿主細胞を選別及び培養し、そして ｇ）任意的に所望のＤＮＡを単離せしめること、 を含んで成る方法により調製できる。
【００７７】上記の方法の段階ａ）に関するＤＮＡはゲ
ノムＤＮＡの単離、又はｍＲＮＡから単離したｃＤＮＡ
の調製により得ることができる。ハイブリドーマ細胞由
来のゲノムＤＮＡは当業界において周知の方法により単
離でき、これは、細胞の破裂（例えば、トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ：商標）のような清浄剤の存在下における溶
解）、ＤＮＡの抽出（例えばフェノール及びＣＨＣｌ3
／イソアミルアルコールにより処理し、そしてＤＮＡを
沈殿化させることによる）段階を含む。該ＤＮＡを、通
常１又は複数の制限エンドヌクレアーゼによりフラグメ
ント化せしめ、得られるフラグメントを適切な担体、例
えばニトロセルロース膜上で複製し、そして目的のポリ
ペプチド配列をコード化するＤＮＡ配列、特に配列変え
せしめたＨ−及びＬ−鎖Ｉｇ遺伝子配座の存在につい
て、ＤＮＡプローブによって検索する。この工程によ
り、ＤＮＡフラグメントは、重鎖のＶ，Ｄ及びＪ領域並
びに軽鎖のＶ及びＪ領域のそれぞれを、誘導配列及びわ
ずかのイントロンを伴って有するインサートを含むこと
が見い出せた。同様にハイブリドーマ細胞からのｃＤＮ
Ａを当業界において周知の方法、例えば細胞のＲＮＡ全
てを抽出し、適切なクロマトグラフィー方法、例えばオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースにおけるクロマトグラフィー
によりｍＲＮＡを単離し、ネズミイムノグロブリンの重
鎖及び軽鎖の定常ドメイン遺伝子内の適切な領域に相補
性のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下においてデ
オキシヌクレオチド３リン酸と逆転写酵素の混合物によ
りｃＤＮＡを合成し、そしてこのｃＤＮＡを単離せしめ
ることにより調製する。ＤＮＡ単離を容易にする手段と
して、所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡをポリペメラー
ゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）技術を用いて増幅することがで
きる。ＰＣＲは遺伝子の各末端のＤＮＡ領域に特異的な
二種のプライマーからの伸長の繰り返しを包含する。好
ましくは、適切なハイブリドーマ細胞系由来の全ｍＲＮ
ＡのｃＤＮＡ転写物を、ＩｇのＨ−及びＬ−鎖の可変ド
メインそれぞれにハイブリダイズさせるために仕立てた
プライマーの存在下において、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼを伴って加熱／冷却のサイクルにおいて処理する。
【００７８】上記の方法の段階ｂ）に関するゲノムＤＮ
Ａ又はｃＤＮＡを当業界において周知の方法に従って適
切な細菌もしくは哺乳類細胞から単離せしめる。好まし
くは、ａ）に記載した方法を利用し、ネズミハイブリド
ーマ細胞の代りに関連する起源細胞を代用し、そして所
望のシグナル配列又は所望のエフェクター分子をコード
化する遺伝子とハイブリダイズせしめるためにデザイン
したＤＮＡプローブを用いる。ＲＮＡ全体からのｍＲＮ
Ａの選別がオリゴ（ｄＴ）−セルロースにより可能でな
い場合、ｃＤＮＡを関連するオリゴヌクレオチドプライ
マーを利用して全ＲＮＡから調製する。ＤＮＡの単離は
ＰＣＲ技術によりかなり簡潔化される。
【００７９】段階ｃ）に関するＤＮＡは、常用の化学的
及び酵素的方法、例えば重複相補性配列による３０〜６
０の塩基のオリゴヌクレオチドの化学的合成、このよう
なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及び酵
素的リゲーション、任意的にその後、関連するデオキシ
ヌクレオチド３リン酸の存在下において適切な酵素によ
って欠損している塩基を補完せしめることにより調製す
る。
【００８０】マウスの可変鎖ドメインに対するＤＮＡプ
ローブは合成ＤＮＡ、所望のイムノグロブリンをコード
化するｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡもし
くは既知のヌクレオチド配列のＤＮＡフラグメントであ
りうる。Ｌ−／Ｈ−鎖の可変ドメインの配列変えしたＩ
ｇ遺伝子配座の検出及び／又は増幅のためのプローブと
して、該ＤＮＡが由来する哺乳類、例えばＢａｌｂ／ｃ
マウスにおけるＬ−／Ｈ−鎖のＩｇ配座を構成する、隣
り合って保存される可変又は定常ドメインの既知のヌク
レオチド配列のＤＮＡフラグメントを選んだ。このＤＮ
Ａプローブは、化学的方法により合成するか、又は適切
な哺乳類の適切な組織、例えばＢａｌｂ／ｃマウスの肝
臓から単離し、そして標準的な方法により単離せしめ
た。必要ならば、該プローブＤＮＡを、例えばよく知ら
れたニック−トランスレーション技術により放射性標識
し、次いで添加物例えばカルシウムキレート剤、粘性調
節化合物、タンパク質、非特異的ＤＮＡ等を含む緩衝剤
と塩の溶液中において、選択的なハイブリダイゼーショ
ンに好適な温度でＤＮＡライブラリーとハイブリダイズ
せしめる。
【００８１】所望のＤＮＡ配列を含むフラグメントが同
定されたら、非本質的なＤＮＡを除去するため、１方又
は両方の末端を改質せしめるため、そして介在する配列
の全部又は一部を除去するために処理すること等のため
に、このフラグメントを更なる操作にかける。
【００８２】該組換抗体をコード化する組換遺伝子を提
供するための種々のＤＮＡフラグメントの連結は、常用
の技術、例えばブラント−又は付着末端リゲーション、
適切な付着末端を提供するための制限酵素分解、適切な
らば付着末端を補完せしめること、不必要な連結を回避
するためのアルカリホスファターゼ処理、及び適切なリ
ガーゼによるリゲーションにより行われる。
【００８３】該組換ＤＮＡの移し入れ、例えばハイブリ
ドベクターの移し入れ及び形質転換細胞の選別は以下に
記載する。
【００８４】更に、本発明は前記の組換ＤＮＡにより形
質転換せしめた宿主細胞に関し、一般には所望の組換抗
体の重鎖をコード化するＤＮＡ及び／又は軽鎖をコード
化するＤＮＡにより形質転換せしめた宿主細胞に関し、
特に好ましい一本鎖組換抗体をコード化するＤＮＡによ
り形質転換せしめた宿主細胞に関する。
【００８５】更に詳しくは本発明は、プロモーター、並
びに重鎖ネズミ可変ドメイン、軽鎖ネズミ可変ドメイ
ン、重鎖ネズミ可変ドメインと軽鎖ネズミ可変ドメイ
ン、一本鎖組換抗体、融合タンパク質、及び融合タンパ
ク質であって精製を促進せしめるペプチド、切断部位と
ペプチドスペーサーを更に含んで成るもの、より成るも
のから選ばれる本発明のタンパク質をコード化するＤＮ
Ａを含んで成る発現カセットを含んで成るハイブリドベ
クターにより形質転換された宿主細胞に関し、ここで該
ＤＮＡは該プロモーターによりコントロールされる。
【００８６】更に本発明は、重鎖ネズミ可変ドメイン、
軽鎖ネズミ可変ドメイン、重鎖ネズミ可変ドメインと軽
鎖ネズミ可変ドメイン、一本鎖組換抗体、融合タンパク
質及び融合タンパク質であって精製を促進せしめるペプ
チド、切断部位とペプチドスペーサーを更に含んで成る
ものより成るグループから選ばれる本発明のタンパク質
をコード化する第２ＤＮＡ配列に、適当な解読フレーム
において連結しているシグナルペプチドをコード化する
第１ＤＮＡ配列と、作動的に連結しているプロモーター
を含んで成る発現カセットを含んで成るハイブリドベク
ターにより形質転換された宿主細胞に関する。
【００８７】特に、本発明は重鎖ネズミ可変ドメイン、
軽鎖ネズミ可変ドメイン、重鎖ネズミ可変ドメインと軽
鎖ネズミ可変ドメイン、一本鎖組換抗体、融合タンパク
質及び融合タンパク質であって精製を促進せしめるペプ
チド、切断部位とペプチドスペーサーを更に含んで成る
ものより成るグループから選ばれる本発明のタンパク質
の製造のための方法であって、該タンパク質をコード化
する第２のＤＮＡ配列に適当な解読フレームにおいて連
結しているシグナルペプチドをコード化する第１のＤＮ
Ａ配列と、作動的に連結しているプロモーターを含んで
成る発現カセットを含んで成るベクターにより形質転換
せしめた宿主、例えばＥ．コリを培養し、そして該タン
パク質を単離することを含んで成る方法に関する。
【００８８】本発明の宿主細胞は試験管内での培養が可
能でなければならない。適切な細胞は、原核細胞又は真
核細胞由来のものであり、それは例えば細菌細胞例えば
Ｅ．コリ、酵母例えばサッカロマイシス セレビジア又
は哺乳類細胞である。機能的なヒト／マウスキメラ抗体
の調製のためには、活性抗体の製造に適切な環境を提供
するために該宿主細胞は高等真核細胞由来でなくてはな
らない。その理由は、機能的な三量体抗体分子の生合成
は適切な初期ペプチド鎖の折りたたみ、グリコシル化及
び組立てを必要とするからである。
【００８９】適切な宿主の例は、制限酵素又は改質酵素
の欠損する、又は不足する微生物、例えば細菌、特にエ
スシェリヒア コリの株、例えばＥ．コリＸ１７７６、
Ｅ．コリＹ１０９０、Ｅ．コリＨＢ１０１、Ｅ．コリＷ
３１１０、Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３５、Ｅ．コ
リＪＡ２２１、Ｅ．コリＤＨ５α、Ｅ．コリＫ１２又は
Ｅ．コリＣＣ１１８株、バチルス スブチルス（Ｂｕｔ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス ステアロ
サーモフィルス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス、ヘモフィル
ス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びその他、並びに酵
母例えばサッカロマイシス セレビジア、例えばＳ．セ
レビジアＧＲＦ１８である。更に適切な宿主細胞は、よ
り高等な生物の細胞、特に樹立連続（ｅｓｔａｂｌｉｓ
ｈｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）ヒトもしくは動物細胞
系、例えばヒト胎芽肺繊維芽細胞Ｌ１３２、ヒト悪性黒
色腫ボウス（Ｂｏｗｅｓ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＶ４
０ウイルス感染化アフリカ産グリーンモンキーＣＯＳ−
７の腎臓細胞もしくは中国産ハムスターの卵巣細胞、又
はリンパ性由来の細胞例えばリンパ腫、ミエローマ、ハ
イブリドーマ、トリオーマもしくはクアドローマ細胞、
例えばＰＡＩ，Ｓｐ２／０もしくはＸ６３−Ａｇ８．６
５３細胞である。
【００９０】上記のＥ．コリの株、特にＥ．コリＣＣ１
１８が宿主として好ましい。
【００９１】本発明は形質転換宿主細胞の調製のための
方法にも関し、ここでは適切な前記の感受性宿主細胞を
本発明に関するハイブリドベクターにより形質転換せし
め、そしてこの形質転換細胞を選別している。
【００９２】微生物の形質転換は論文、例えばＳ．セレ
ビジア（Ａ．Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７
８）、Ｂ．スブチリス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏ
ｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１，１９６
１）、及びＥ．コリ（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９，１９７０）について論文
において記載の通りに実施した。
【００９３】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換工程は、
例えば、ＤＮＡの取込みを可能にするための該細胞のＣ
ａ2+処備処理、及びハイブリドベクターとのインキュベ
ーションを含む。形質転換細胞のその後選別は、例え
ば、該ベクターＤＮＡのマーカー配列の種類に依存して
親細胞から形質転換細胞の選別を可能にする選択培地に
該細胞を移し換えることにより達成されうる。好ましく
は、該ベクターを含まない細胞が成育できない成育培地
を用いる。酵母の形質転換は、例えば、グリコシダーゼ
による細胞壁の酵素的除去、得られるスフェロプラスト
をポリエチレングリコール及びＣａ2+イオンの存在下に
おいて該ベクターと処理せしめること、及び該スフェロ
プラストを寒天の中に埋め込むことにより細胞壁を再生
せしめる段階を含んで成る。好ましくは、この再生用寒
天は再生及び前記の形質転換細胞の選別を同時に可能と
するように調製する。
【００９４】高等な真核細胞、例えば哺乳類細胞系由来
の細胞の形質転換は、好ましくは感染により達成せしめ
る。感染は常用の技術、例えばリン酸カルシウム沈殿、
マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレ
クトロポレーション（即ち、細胞膜の透過性を一時的に
高める短い電気パルスによるＤＮＡの導入）により、又
は補助化合物例えばジエチルアミノエチルデキストラ
ン、ジメチルスルホキシド、グリセロールもしくはポリ
エチレングリコール等の存在下において実施する。この
感染工程の後、感染細胞を例えば、選択マーカーの種類
に依存して選択培地、例えば標準培養培地例えばダルベ
ッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地等であって例えば関連する抗生物質
を含むもの中での培養により、同定且つ選別する。
【００９５】該宿主細胞を、該組換Ｌ−鎖遺伝子構造体
単独により該組換Ｈ−鎖遺伝子構造体単独により、この
両方により、順次もしくは同時のいづれかで形質転換せ
しめるか、又はこのＬ−鎖とＨ−鎖の遺伝子両方を含ん
で成るベクター構造体、例えば前述した組換一本鎖抗体
遺伝子構造体を用いることにより形質転換せしめる。
【００９６】好ましいのは、抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体
の重鎖可変ドメインをコード化するＤＮＡ、スペーサー
グループをコード化するＤＮＡ、抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２
抗体の軽鎖可変ドメインをコード化するＤＮＡ及びエフ
ェクター分子をコード化するＤＮＡを含んで成る組換一
本鎖抗体遺伝子構造体により形質転換された宿主細胞、
特に前記の好ましい組換一本鎖抗体遺伝子により感染さ
れた宿主細胞である。本発明の宿主細胞の更なる例は、
類似の組換プラスミドであって、択一的な配向性のＨ−
及びＬ−鎖遺伝子構造体を含み、この組換抗体の高レベ
ルな発現性を促進せしめる更なるＤＮＡ因子の組入れた
ものにより感染された細胞である。
【００９７】本発明の宿主細胞は遺伝子的に安定であ
り、一定の特異性の本発明の組換抗体を分泌し、そして
深冷凍結生物から融解及び再クローン化によって活性化
される。
【００９８】この形質転換された宿主細胞は、当業界に
おいて周知の方法により、炭素の同化性原料、例えば炭
水化物例えばグルコース又はラクトース、窒素の同化性
原料、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はそ
れらの分解生成物例えばペプトン、アンモニウム塩等、
並びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸塩及び／又は炭酸
塩を含む液体培地中で培養される。この培地は更に、例
えば成長促進剤、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マ
ンガン等を含む。
【００９９】該培地は、好ましくは選択圧力（ｓｅｌｅ
ｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を及ぼすため、そして
形質転換されていない又は該ハイブリドベクターを失っ
た細胞の生育を阻止するように選ぶ。従って、例えばも
しこのハイブリドベクターがマーカーとして抗生物質耐
性遺伝子を含むなら、この培地に抗生物質を加える。も
し、例えば利用する宿主細胞が必須アミノ酸において栄
養要求性であり、そしてこのハイブリドベクターがこの
宿主の欠損を補完する酵素をコード化する遺伝子を含む
場合、このアミノ酸の欠いた最少培地をこの形質転換細
胞の培養のために用いる。
【０１００】高等の真核細胞、例えば哺乳類細胞由来の
細胞を、市販されている培地、例えばダルベッコ改良イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、ＲＰＭＩ培地
及び前記した培地、任意的に成長促進剤及び／又は哺乳
類血清の添加した培地を用い、組織培養条件下で生育せ
しめる。組織培養条件下での細胞培養は当業界において
よく知られ、そして均質懸濁培養、例えばエアーリフト
反応槽もしくは連続攪拌槽内における培養、又は固定化
もしくは包埋細胞培養、例えば中空ファイバー、マイク
ロカプセル、アガロースマイクロビース上、多孔質ガラ
ス製ビーズ、セラミックカートリッジもしくはその他の
マイクロ担体における培養を含む。
【０１０１】培養は当業界に周知の方法により行われ
る。この培養条件、例えば温度、培地のpHの値及び発酵
（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）時間は、本発明のポリペ
プチド又は誘導体の最大の力価が得られるように選ぶ。
従って、Ｅ．コリ又は酵母株を浸水培養による好気的条
件のもとで、約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃そし
てpH値４〜８、好ましくは約pH７にて振騰又は攪拌しな
がら、好ましくは本発明のポリペプチド又は誘導体の最
大収率が達成される迄培養する。
【０１０２】細胞密度が満足しうる値に到達したら、こ
の培養を中止し、そして該ポリペプチド又は誘導体を単
離する。もし該ハイブリドベクターが適切な分泌シグナ
ル配列を含むなら、このポリペプチド又は誘導体は該形
質転換細胞により、直接的にこの培地の中に分泌され
る。そうでなければ、この細胞を例えば清浄剤例えばＳ
ＤＳ，ＮＰ−４０（商標）、トリトン（商標）もしくは
デオキシコール酸との処理、リゾチームもしくは類似作
用の酵素による溶解、又は浸透圧ショックもしくは超音
波による破裂によって破壊させなければならない。前記
のシグナル配列が所望のタンパク質の分泌を細胞ペリプ
ラズムへ誘導する場合も、細胞の解体が必要となる。酵
母を宿主微生物として用いる場合、この細胞壁はグルコ
シダーゼによる酵素的分解により除去してよい。他方又
は更に、機械的な力、例えば粉砕力（例えばフレンチプ
レス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）、ダイノミル（Ｄｙ
ｎｏｍｉｌｌ）等）又はガラスビーズもしくは酸化アル
ミニウムとの振騰、又は凍結（例えば液体窒素中）と融
解（例えば３０℃〜４０℃）の繰り返し、並びに超音波
が、細胞の破壊に利用できる。
【０１０３】本質的に周知の方法において、タンパク
質、核酸及びその他の細胞構成成分を含む、該細胞を破
壊した後に得られる混合物の遠心後に得られる細胞上清
液又は溶液は、タンパク質に富み、本発明のポリペプチ
ドを含む。従って、例えば、ほとんどの非タンパク質成
分をポリエチレンイミン処理により除去し、そして本発
明のポリペプチド及び誘導体を含むタンパク質を例えば
硫酸アンモニウム又はその他の塩類の飽和溶液により沈
殿せしめる。そうでなければ、この細胞上清液又はリゼ
ートを、適切な膜により濾過すること及び／又はクロマ
トグラフィー方法例えばアフィニティークロマトグラフ
ィーにより直接予備精製する。
【０１０４】本発明に関する組換抗体及びモノクローナ
ル抗体は、成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞
外ドメインの定性及び定量検査のために利用できる。こ
れは、腫瘍の進行性のモニターのため、腫瘍が本発明の
組換又はモノクローナル抗体による治療を受け入れられ
るかどうかの決定、及び化学治療による腫瘍の治療をモ
ニターするために特に有用である。考えられる腫瘍はｃ
−ｅｒｂＢ−２を過剰発現するもの、例えば胸部及び卵
巣腫瘍である。
【０１０５】一般に、本発明に関するモノクローナル及
び組換抗体は、抗体と抗原（即ち、ｃ−ｅｒｂＢ−２タ
ンパク質の細胞外ドメイン）との間の結合相互作用に基
づく任意の周知のイムノアッセイにおいて利用されう
る。このようなアッセイの例には、放射性−、酵素、蛍
光、化学ルミネッセンス、免疫沈殿、ラテックス凝集及
び赤血球凝集イムノアッセイが挙げられ、そして特に免
疫染色方法が挙げられる。
【０１０６】本発明に関する抗体は、上記の通り又は酵
素イムノアッセイにおける酵素複合化誘導体の形におい
て利用されうる。任意の酵素イムノアッセイの周知の改
良方法、例えば可溶性相（均質）酵素イムノアッセイ、
固相（不均質）酵素イムノアッセイ、単一酵素イムノア
ッセイ又は二重（サンドイッチ）酵素イムノアッセイで
あってｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の直接又は間接（競
合的）検出による方法が利用されうる。
【０１０７】このような酵素イムノアッセイの例はサン
ドイッチ酵素イムノアッセイ、即ち、適切な担体、例え
ばポリスチレン、ポリプロピレンもしくはポリビニルク
ロリドのマイクロタイタープレート又は試験管のプラス
チック表層、ガラスもしくはプラスチック製ビース、フ
ィルター紙、デキストラン他、セルロースアセテートも
しくはニトロセルロースシート、磁性粒子等が単なる吸
着により又は任意的に例えばグルタルアルデヒドもしく
はシアノゲンブロミドによる該担体の活性化後により、
モノクローナル担体によって被覆されているイムノアッ
セイが挙げられる。次に、可溶性ｃ−ｅｒｂＢ−２タン
パク質及び検出可能な酵素（例えばアルカリホスファタ
ーゼ）を含んで成る本発明の最終的な一本鎖組換抗体を
含む試験溶液を加える。この試験溶液中の可溶性ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２タンパク質の量は、結合した組換抗体の量に
正比例し、そしてこれは酵素基質溶液の添加により測定
される。この酵素基質反応は、例えば目視又は光学測定
装置により観察されうる色の変化をもたらす。
【０１０８】本発明に関する抗体は上記の通り、又は放
射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）における放射性標識誘導
体の形において利用できる。酵素イムノアッセイについ
て前記したと同様に、任意の放射性イムノアッセイの周
知の改良方法が利用されうる。
【０１０９】この試験は酵素ラベルの代りに放射性ラベ
ル例えば 125Ｉを用いる、前記した酵素イムノアッセイ
と類似の方法において実施される。この試験溶液に存在
するｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の量に相当する免疫複
合体の量を、この免疫複合体の放射性活性を測定するこ
とにより決定する。
【０１１０】免疫染色のため、凍結保存生検材料の凍結
切片又はパラフィン包埋組織切片を、検出可能な酵素を
含んで成る本発明の組換抗体を含む溶液により処理せし
める。結合している組換抗体は適切な酵素基質、好まし
くは本発明の組換抗体の部位にて固形堆積物（染色）を
もたらす酵素基質との処理により検出される。酵素を含
んで成る組換抗体の代りに、ストレプトアビジンを含ん
で成る組換抗体及び抗体の部位にてより高い酵素濃度を
もたらすビオチン−酵素−コンジュゲートの溶液が利用
でき、これにより免疫染色方法の感度は高まる。この酵
素基質の固形堆積物は顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡による
検査、又は染色の波長での吸光度をスキャンすることに
より検定される。
【０１１１】ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質について前述
した本発明に関連する組換抗体及び／又はモノクローナ
ル抗体の利用は、その他の本質的に周知のイムノアッセ
イ、例えば免疫蛍光アッセイ、抗体被覆又は抗原被覆ラ
テックス粒子によるラテックス凝集、抗体被覆又は抗原
被覆赤血球による赤血球凝集、抗体被覆光学ファイバー
及びその他の直接反応型免疫センサーであって結合状態
を電気的もしくは光学的信号に変換せしめるものを用い
たエバネッセント（かすかな）光アッセイ等も含む。
【０１１２】本発明はｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の定
性及び定量検査のための、本発明の組換抗体及び／又は
本発明のモノクローナル抗体、並びに任意的に添加物を
含んで成る検査キットにも関する。
【０１１３】酵素イムノアッセイのための本発明に関す
る検査キットは、例えば、適切な担体、モノクローナル
抗体の任意的に凍結乾燥された溶液、酵素もしくはスト
レプトアビジンを含んで成る組換抗体の任意的に凍結乾
燥又は濃縮された溶液、もしストレプトアビジンを含ん
で成る組換抗体を用いるならば酵素−ビオチンコンジュ
ゲート溶液、固形もしくは溶解形態における酵素基質、
ｃ−ｅｒｂＢ−２の標準溶液、緩衝溶液、並びに任意的
に、非特異的な吸着及び凝集形成を阻止するためのポリ
ペプチドもしくは清浄剤、ピペット、反応容器、検量
線、仕様書等を含む。
【０１１４】免疫染色のための本発明に関する検査キッ
トは、例えは、酵素もしくはストレプトアビジンを含ん
で成る組換抗体の任意的に凍結乾燥又は濃縮された溶
液、もしストレプトアビジンを含んで成る組換抗体を用
いるならば酵素−ビオチンコンジュゲートの溶液、固形
もしくは溶解形態における酵素基質、緩衝溶液、並びに
任意的に、ピペット、反応容器、検量線、仕様書等を含
む。
【０１１５】本発明の組換及びモノクローナル抗体はｃ
−ｅｒｂＢ−２タンパク質の定性及び定量検査のために
利用できる。この成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２
が一定の腫瘍タイプ、例えは胸部及び卵巣腫瘍において
過剰発現される事実に基づき、該抗体はこれらの腫瘍の
検出及びモニターに特によく適する。加えて、本発明の
抗体の放射性標識誘導体は、放射性スキャニング技術を
用いて患者における腫瘍の生体内における位置決めのた
めに利用されうる。このためには、本発明の抗体の放射
性標識誘導体を患者に注射し、そしてこの患者を通常の
間隔でガンマーイメージャーによりスキャンする。成長
因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する細胞は
他の組織よりもより多くの放射活性抗体を取り込み、従
ってこれはガンマーイメージングカメラにより明確に認
識されるであろう。好ましくは、体重１kg当り、１５〜
３０μCiを示す３〜８μｇの量において、 131Ｉもしく
は 99mＴｃにより標識されている組換又はモノクローナ
ル抗体を放射性スキャニングのために用いる。
【０１１６】本発明の抗体は、免疫アフィニティークロ
マトグラフィーによる天然材料又は形質転換宿主細胞か
らのｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の単離及び精製のため
に更に利用できる。
【０１１７】更に、本発明のモノクローナル抗体及び組
換抗体、特に、エフェクター分子特に毒素、特にシュー
ドモナス外毒素を含んで成る組換抗体は、成長因子リセ
プターｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍、例えば胸
部又は卵巣腫瘍を有する患者の治療に有用である。もし
所望するならば、腫瘍の治療は複数の、例えば２種の本
発明の抗体を適用すること、例えばＦＲＰ５及びＦＷＰ
５１の両方を適用することを含んで成りうる。ホスファ
ターゼを含んで成る組換体をリン酸化プロドラッグ、例
えばミトマイシンホスフェート又はエトポシドホスフェ
ートと一緒に利用することができ、これによって腫瘍の
部位での活性薬剤のプロドラッグへの転換を可能にす
る。
【０１１８】従って、本発明は成長因子リセプターｃ−
ｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍を処理するための医薬
製剤であって、治療に有効な量の本発明に関する組換抗
体又はモノクローナル抗体及び医薬として受け入れられ
る担体を含んで成る製剤にも関する。好ましいのは、非
経口的な用途のための医薬製剤である。筋肉内、皮下又
は静脈内適用のための製剤は、例えば等張水溶液又は懸
濁物であり、任意的に利用する直前に凍結乾燥又は濃縮
調製品から準備するものである。油中の懸濁物は油成分
として、注射の目的のために常用される植物、合成油又
は半合成油を含む。この医薬製剤は除菌してよく、そし
て添加物、例えば配合物を保存、安定化、湿潤化、乳化
もしくは可溶化せしめるもの、浸透圧の調節のための塩
類、緩衝液及び／又は粘性を調節する化合物、例えばナ
トリウムカルボキシセルロース、カルボキシメチルセル
ロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、デキ
ストラン、ポリビニルピロリドンもしくはゼラチンを含
んでよい。
【０１１９】本発明の医薬製剤は約０．０１％〜約５０
％の活性成分を含む。これらは投与単位形態、例えば直
ちに利用できるアンプルもしくはバイアル、又は凍結乾
燥固形形態であってもよい。
【０１２０】一般に、哺乳類のための治療的有効投与量
は、抗体の種類、患者の状態及び適用方法に依存して、
体重１kg当り、約５〜２５μｇの本発明の組換抗体又は
本発明のモノクローナル抗体である。投与の特定の方法
及び適切な投与量は、患者の特徴、疾病の状態、処置す
べき腫瘍のタイプ等を考慮しながら医師によって決定さ
れる。本発明の医薬製剤は当業界において周知の方法、
例えば常用の攪拌、溶解、糖依化、又は凍結乾燥工程に
より製造される。注射のための医薬製剤は当業界におい
て周知の方法に従って加工し、アンプル又はバイアルに
充填し、そして無菌の条件下でシールする。
【０１２１】本発明は特にモノクローナル抗体、ハイブ
リドーマ細胞系、組換一本鎖抗体、組換ＤＮＡ、形質転
換宿主細胞及び実施例において詳細のそれらの製造のた
めの方法に関する。以下の実施例は本発明の例示であっ
ていかなる範囲を限定するものではない。
【０１２２】略語 ＡＴＰ アデノシン３リン酸 ＢＳＳ アール（Ｅａｒｌｅ）の平衡塩類溶液 ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチル ＤＭＥＭ ダルベッコの改良イーグル培地 ｄＮＴＰ デオキシヌクレオチド３リン酸 ＤＴＴ ジチオスレイトール ＥＤＴＡ 二ナトリウムエチレンジアミンテトラアセテート ＥＧＦ 内皮成長因子 ＥＧＴＡ エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） −Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸 ＦＣＳ 仔牛血清 ＨＡＴ培地 ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン培地 ＨＥＰＥＳ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス ルホン酸 ＨＴ培地 ヒポキサンチン及びチミンジン培地 Ｉｇ イムノグロブリン ＩＰＴＧ イソプロピル−β−チオガラクトシド ＭＡｂ モノクローナル抗体 ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水 ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＭＳＦ フェニルメチルスルホニルフルオリド ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動 トリス トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン Ｕ 単位（ユニット） ＶL 軽鎖可変ドメイン ＶH 重鎖可変ドメイン ＸＰ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ− トルイジン塩
【０１２３】
【実施例】
例１．ハイブリドーマ細胞系ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，Ｆ
ＷＰ５１及びＦＳＰ７７の調製 １．１ 抗原の起源及びＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化 乳癌患者の肋膜滲出物から１９７０年において単離し
た、ＳＫＢＲ３ヒト胸部腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ
３０）は細胞１個当り約１×１０6 個のｃ−ｅｒｂＢ−
２リセプタータンパク質分子を発現する。ＰＢＳ中の２
０×１０6 個のＳＫＢＲ３細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに
皮下及び／又は腹膜腔内注射した。この細胞を完全フロ
インド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント１：１（ｖ／ｖ）
で混合した。完全アジュバントの代わりにフロインドの
不完全アジュバントを代用して約３ケ月にわたり、合計
５回この注射を繰り返した。最後の細胞の注射は融合の
３日前に付与せしめた。
【０１２４】１．２ 細胞融合 免疫化マウスを殺し、そしてそれらの脾臓細胞を常用の
方法（ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６：４９５，１９７６）に従って融合せしめ
た。脾臓細胞を融合パートナー、即ち、マウスミエロー
マ細胞系ＰＡＩ（Ｓｔｏｋｅｒら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ＃２１７１３，１９８２）と
５：１〜１０：１の比で、４１％のポリエチレングリコ
ール４０００（Ｍｅｒｃｋ）の存在下において混合せし
めた。融合細胞を腹腔マクロファージのもとで、２４穴
マイクロタイターウエルにおいて１ウエル当り１×１０
6 個の細胞の密度にてまき、２週間にわたり週３回標準
ＨＡＴ選択培地、その後ＨＴ培地を２週間にわたり供給
した。ハイブリドーマ細胞の成育が目に見えるようにな
ったら、この上清液を例１．３に記載の通りに検索し
た。陽性ハイブリドーマをクローン化せしめ、そして保
存した。
【０１２５】１．３ ハイブリドーマの上清液中の抗体
の検定 成育したハイブリドーマの培養液を、二つの段階、免疫
蛍光法及び免疫沈殿法を包含する方法を利用して抗−ｃ
−ｅｒｂＢ−２抗体の存在について試験した。
【０１２６】１．４ 免疫蛍光法 第１の段階において、ハイブリドーマの上清液を、それ
らの高レベルのヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を発現
するマウス細胞の免疫蛍光染色のために試験した。これ
らの細胞を単離するため、このＨＣ１１マウス乳腺内皮
細胞系（Ｂａｌｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２０８９，１
９８８）を、常用の方法（Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７
３）に従い、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を発現す
るプラスミド（Ｍａｓｕｋｏら、Ｊｐｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．８０：１０，１９８９）及び薬剤Ｇ４１８に
耐性な遺伝子をコード化するプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ
（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７，１９８２）により感染せ
しめた。感染細胞は２００μｇ／mlのＧ４１８（ジェネ
チシン、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む培地中で２週間で
選別された。個々のクローンを、常用のタンパク質プロ
ッティング技術（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０，１９
７９）を利用してヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の発
現について選別及び分析した。高レベルのヒトｃ−ｅｒ
ｂＢ−２タンパク質を発現するクローン（クローンＲ１
＃１１）を選別し、そして免疫蛍光アッセイに利用し
た。非感染ＨＣ１１細胞をコントロール細胞として用い
た。
【０１２７】このアッセイは以下の方法において行っ
た。これらの細胞（Ｒ１＃１１又はＨＣ１１）を、熱不
活性化ＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）８％、ＥＧＦ（Ｉｎｏｔ
ｅｃｈ）１０ng／ml及びインスリン（Ｓｉｇｍａ）５μ
ｇ／mlを含むＲＰＭＩ培地中で、１〜２日間フィブロネ
クチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）被
覆カバーガラス上で増殖せしめた。フィブロネクチン被
覆カバーガラスは室温にて製造及び保存され、そしてこ
れらはスクリーニングのために日常的に利用される。こ
のカバーガラスをカルシウム及びマグネシウムを含むＰ
ＢＳ中ですすぎ、そして３．７％（ＰＢＳ中においてｖ
／ｖ）のホルムアルデヒドによって１０分間処理するこ
とにより固定せしめる。非特異的な結合を下げるため、
このカバーガラスを３％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む
ＰＢＳ中で２０分間インキュベートせしめた。このカバ
ーガラスをＰＢＳ及び水の中で洗い、次いで室温で乾燥
させた。２０〜３０μｌのハイブリドーマ上清液をカバ
ーガラス上の円形の領域に加え、これを湿った雰囲気中
で室温にて１〜２時間インキュベートせしめた。次にこ
のカバーガラスを０．０５％のトリトン−Ｘ１００（Ｆ
ｌｕｋａ：商標）を含むＰＢＳにより３回洗浄し、そし
て蛍光体の結合したヒツジ由来の完全抗体（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）（抗−マウスＩｇ）と更に１時間インキュベー
トせしめた。ＰＢＳによる３回の洗浄及び水による１回
の洗浄後、蛍光顕微鏡及び浸水（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅ
ｒｓｉｏｎ）レンズを利用して蛍光について検索した。
陽性であるハイブリドーマ上清液を、例１．３．２に記
載の第２段階において検索した。
【０１２８】１．３．２ 免疫沈殿及びタンパク質ブロ
ッティング分析 ＳＫＢＲ３ヒト胸部腫瘍細胞は１細胞当り約１×１０6
個のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質分子を発現する。細胞
リゼート品を、１％のトリトン−Ｘ１００、５０mMのト
リス−ＨＣｌ pH７．５、５mMのＥＧＴＡ、０．１５Ｍ
のＮａＣｌ、１mMのＰＭＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、８０μｇ／mlのアプロチニン（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５０μｇ／
mlのロイプペプチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）及び４μｇ／mlのペプスタチン（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む緩衝液１ml中で
約４×１０6 個の細胞を抽出せしめることにより調製し
た。例１．３．１に記載の免疫蛍光アッセイにおいて陽
性であるハイブリドーマの上清液２００〜５００μｌを
このＳＫＢＲ３抽出物（２．５〜４．０mg／ml）１００
μｌとインキュベートした。この量の抽出物は約５０〜
１００ngのｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を含む。このハ
イブリドーマ上清液及びＳＫＢＲ３抽出物を氷の上で一
夜インキュベートし、次いでヒツジ抗−マウスＩｇのＩ
ｇＧ画分（ＩＣＮ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ）１μｌを加えた。この複合物を、プロテインＡセフ
ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 商標）の添加により回
収し、ＴＮＥＴ（１４０mMのＮａＣｌ、５０mMのトリス
−ＨＣｌ、pH７．５、５mMのＥＤＴＡ、１％のトリトン
Ｘ−１００）及び水により洗浄し、サンプル緩衝液（８
０mMのトリス−ＨＣｌ、pH６．８、０．２％のＳＤＳ、
１０％のグリセロール）中で煮沸し、そしてこの上清液
を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに載せた。このタンパク質を
電気泳動させ、そしてＴｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０，１
９７９）に記載のオリジナルの技術を幾分改良した方法
を利用し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロ
ットせしめた。このタンパク質はセミ−ドライブロッタ
ー（Ｇ．Ｆｒｏｂｅｌ、１００４．０１型）を利用し、
その製造者の仕様書に従って移した。この膜を０．５％
のゼラチン（Ｍｅｒｃｋ）を含むＰＢＳ中で３７℃で１
時間にわたりブロックした。この膜をＰＴＧ（０．０２
％のゼラチン（Ｍｅｒｃｋ）及び０．２５％のトリトン
−Ｘ１００（Ｆｌｕｋａ）を含むＰＢＳ）中で３７℃で
５分間にわたり、２回洗浄した。この膜を、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２タンパク質のカルボキシ末端の１３個のアミノ酸
に対して刺激せしめた抗血清（Ｇｕｌｌｉｃｋら、Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４０：２４６，１９８７、抗血
清２１Ｎ）を含むＰＴＧ中で３７℃で４５分間インキュ
ベートせしめることにより、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク
質を検出した。この膜をＰＴＧ中で３７℃で５分間にわ
たり、３回洗浄した。この膜結合２１Ｎ抗血清を、この
膜を０．１μＣ／mlの 125Ｉ−標識プロテイン−Ａ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）を含むＰＴＧ中でインキュベートする
ことにより検出した。ハイブリドーマであってその上清
液が特異的にｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を免疫沈殿せ
しめるものを以下に記載の単一細胞クローニング及び更
なる特徴付けのために増殖させた。
【０１２９】例２．ｃ−ｅｒｂＢ−２特異的ＭＡｂの特
徴付け ２．１ ハイブリドーマの保存及び処理 抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ＭＡｂ ＦＲＰ５，ＦＳＰ１
６，ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７をそれぞれ分泌するハイ
ブリドーマＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＷＰ５１及びＦＳ
Ｐ７７は培地中で増殖させ、−８０℃又は液体窒素中で
凍結させ、そして再培養することができる。この細胞は
限界希釈法によりクローン化され、そして英国における
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎ
ｉｍａｌＣｅｌｌ Ｌｉｎｅｓに寄託されている。この
ハイブリドーマ細胞系は以下の取得番号を有する：ＦＲ
Ｐ５：９０１１２１１５，ＦＳＰ１６：９０１１２１１
６，ＦＳＰ７７：９０１１２１１７，ＦＷＰ５１：９０
１１２１１８。これらの細胞を、プリスタンによりプラ
イム化せしめたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて腹水を生成
せしめることにより増殖せしめた。この抗体を硫酸アン
モニウム沈殿及びＤＥ５２ＤＥＡＥ−セルロースカラム
（Ｗｈａｔｍａｎ）上でのイオン交換クロマトグラフィ
ーにより、腹水から精製した。精製ＭＡｂをＰＢＳ中で
−８０℃にて保存した。
【０１３０】２．２ ＭＡｂのアイソタイプの検定 ＭＡｂ ＦＲＰ５，ＦＳＰ１６，ＦＷＰ５１及びＦＳＰ
７７のアイソタイプを、マウスＩｇクラス及びサブクラ
スに対するウサギ抗血清によるＥＬＩＳＡ分析（Ｂｉｏ
ｒａｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ ＴＭ Ｓｕｂ Ｉｓ
ｏｔｙｐｉｎｇ：商標）により検定した（このキットの
製造者の提案する方法に従って）。ＭＡｂ ＦＲＰ５，
ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７はＩｇＧ１アイソタイプであ
り、ＦＳＰ１６はＩｇＧ２ｂのアイソタイプであった。
全てのＭＡｂの軽鎖はカッパー型であった。
【０１３１】２．３ フローサイトメリー ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異性のＭＡｂを利用するＦＡＣＳ
分析を以下の通りに実施した。ＳＫＢＲ３ヒト胸部腫瘍
細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ培地（１０μＭのア
ジ化ナトリウム、４％のＦＣＳ及び２５mMのＥＤＴＡを
含むＢＳＳ）中で洗浄し、そして１×１０6 個の細胞を
１００μｌのＦＡＣＳ培地に再懸濁せしめた。非特異的
部位を、この細胞を室温で１０分間５μｌのヤギ血清と
インキュベートすることによりブロックした。このＳＫ
ＢＲ３細胞を遠心により集め、ＦＡＣＳ培地において作
られた１：２希釈の上清液５０μｌ中に再懸濁せしめ、
そして氷上にて４５分間インキュベートした。この細胞
を４mlのＦＡＣＳ培地により洗浄し、遠心により集め、
１：２０に希釈したヒツジ由来の抗マウスＩｇ蛍光体結
合完全抗体を含むＦＡＣＳ培地５０μｌに再懸濁せし
め、そして氷上にて３０分間インキュベートした。４ml
のＦＡＣＳ培地を加え、この細胞を遠心により集め、１
００mlのＦＡＣＳ培地に再懸濁し、そして固定化するこ
となくそれらの蛍光についてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ
ｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）において分析した。コ
ントロールとして、ＳＫＢＲ３細胞を非反応性ＩｇＧ１
ＭＡｂ（１２３６Ｓ３１−３）とインキュベートし
た。このＦＡＣＳ分析は、ＭＡｂＦＲＰ５，ＦＳＰ１
６，ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７により処理せしめたＳＫ
ＢＲ３細胞はコントロールＭＡｂにより処理せしめた細
胞よりも高い蛍光を有することを示した。この結果、こ
れらのＭＡｂはｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の細胞外ド
メインと結合することが示された。
【０１３２】２．４ ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異性のＭＡ
ｂの結合性ドメイン ＭＡｂ ＦＲＰ５及びＦＳＰ７７を、ヨードゲン（Ｉｏ
ｄｏｇｅｎ）（１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ，
６ａ−ジフェニルグリコウリル、Ｓｉｇｍａ）を用い、
標準的な方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，ｐ．
３３０）に従い、１μＣ／μｇの比活性迄 125Ｉ（無担
体ナトリウム 125ヨージド（Ｓｏｄｉｕｍ 125ｉｏｄ
ｉｄｅ）Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共有結合せしめた。競争
的な実験を、ＳＫＢＲ３細胞（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）
の４穴マルチディシュにおいて、１５mmのウエル当り
０．５〜１．０×１０5 個の細胞）を、標識ＦＲＰ５又
はＦＳＰ７７並びに種々の量の非標識ＭＡｂ ＦＲＰ
５，ＦＳＰ１６，ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７を含むＲＩ
Ａ緩衝液（１２０mMのＮａＣｌ、５０mMのＨＥＰＥＳ、
pH７．８、１mMのＥＤＴＡ、２％のＢＳＡ）２５０μｌ
と、４℃で２時間インキュベートせしめることにより実
施した。この細胞をＲＩＡ緩衝液により５回洗浄し、
０．５mlの１％のトリトンＸ−１００、１０％のグリセ
ロール、２０mMのＨＥＰＥＳ、pH７．４に室温にて３０
分間にわたり溶解し、そして結合した放射性活性をガン
マーカウンターにより測定した。この結果、ＭＡｂ Ｆ
ＲＰ５及びＦＳＰ１６はＳＫＢＲ３細胞と結合するのに
互いに競争し合うことが示され、このことはこれらの２
種のＭＡｂがｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の同一のドメ
インに結合することを示唆する。ｃ−ｅｒｂＢ−２タン
パク質に結合するためにＭＡｂ ＦＷＰ５１とＦＳＰ７
７は互いに競争することはなく、又ＦＲＰ５又はＦＳＰ
１６とも競争し合うことはなかった。結局、この４種の
ＭＡｂのパネルはｃ−ｅｒｂＢ−２膜リセプターチロシ
ンキナーゼの細胞外部位の３種のドメインに結合する。
【０１３３】例３．ハイブリドーマ細胞系ＦＲＰ５から
のＲＮＡの単離 ３．１ ＦＲＰ５細胞の増殖 ＦＲＰ５ハイブリドーマ細胞（１×１０8 個）を、１０
％のＦＣＳ（Ａｍｉｎｅｄ）、１mMのピルジン酸ナトリ
ウム（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、２mMのグルタミン（Ｓｅｒｏ
ｍｅｄ）、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び１
００μｇ／mlのゲンタマイシン（Ｓｅｒｏｍｅｄ）を含
んで成るＤＭＥＭ（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中、３７℃にて、
１７５cm組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ３０２８）内
において、大気及び７．５％のＣＯ2 の湿った雰囲気中
で懸濁培養において増殖せしめた。この細胞を遠心によ
り集め、ＰＢＳで１回洗浄し、液体窒素中で瞬間凍結さ
せ、そしてペレットとして清浄な無菌プラスチック製キ
ャップ付チューブ中で−８０℃で保存した。
【０１３４】３．２ ＦＲＰ５細胞からの全細胞ＲＮＡ
の抽出 全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ（Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６，１９８７）
により詳細の酸性グアニジニウムチオシアネート−フェ
ノール−クロロホルム法を利用して抽出した。ＦＲＰ５
細胞の細胞ペレット（１×１０8 個）を、１０mlの変性
溶液（４Ｍのグアニジニウムチオシアネート（Ｆｌｕｋ
ａ）、２５mMのクエン酸ナトリウム、pH７．０、０．５
％のＮ−ラウロイルサルコシン（Ｓｉｇｍａ）、０．１
Ｍの２−メルカプトエタノール）の存在下において、こ
のチューブ内で直接融解せしめた。この溶液を室温でホ
モジナイズせしめた。次に、２Ｍの酢酸ナトリウム１ml
（pH４）、フェノール１０ml（水に飽和）及びクロロホ
ルム−イソアミルアルコール混合物（４９：１）２mlを
このホモジネート品に加えた。この最終懸濁物を１０秒
間強く攪拌し、そして氷の上で１５分間冷やした。この
サンプルを１０，０００ｘｇで２０分間、４℃で遠心し
た。遠心の後、この水性相に存在するＲＮＡを１０mlの
イソプロパノールと混合し、そして−２０℃で１時間放
置した。このＲＮＡ沈殿物を遠心により集め、このペレ
ットを３mlの水に溶解し、そしてＲＮＡを−２０℃にて
１容量のイソプロパノールの添加により再沈殿させた。
遠心及びペレットをエタノールにて洗浄した後、このＲ
ＮＡの最終ペレットを水に溶解せしめた。この方法によ
り約３００μｇの全細胞ＲＮＡを得た。この最終精製材
料を−２０℃で保存した。
【０１３５】３．３ ポリ（Ａ）含有ＲＮＡの単離 ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを全ＲＮＡから、Ｅｄｍｏｎｄｓ
ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
６８：１３３６，１９７１）により詳細され、そしてＭ
ａｎｉａｔｉｓらにより改良された方法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２，ｐ．１９７）による
オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）におけるクロマトグラフィーにより
選別した。このポリ（Ａ）−含有ＲＮＡを公開された方
法に記載の通りに調製したが、但しＲＮＡを、ＳＤＳ含
有緩衝液ではなく水により、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
スから溶離させた。このポリ（Ａ）−含有ＲＮＡをエタ
ノールにより沈殿させ、そして遠心により集めた。３０
０μｇの全細胞ＲＮＡからのこのポリ（Ａ）−含有ＲＮ
Ａの収量は約３０μｇであった。この最終精製材料を−
２０℃で保存した。
【０１３６】例４．ＦＲＰ５ハイブリドーマ細胞系から
機能的な重鎖及び軽鎖再配列のクローニング 例３．３に記載の通りにＦＲＰ５ハイブリドーマ細胞か
ら単離したポリ（Ａ）−含有ＲＮＡは、ｃＤＮＡの合成
及びその後のＶ−領域ミニ遺伝子の増幅の起源として働
く。予測したサイズの増幅生成物をアガロースゲルから
精製し、そして適当なベクターにクローン化せしめる。
機能的な再配列はシーケンシングにより同定される。
【０１３７】４．１ オリゴヌクレオチド ＭＣＫ２はマウスイムノグロブリンκ（カッパー）定常
ドメインにおける領域に相補するようデザインしてい
る。
【０１３８】 ５′−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ−３′
【０１３９】ＭＣＨＣ２はマウスイムノグロブリンγ１
定常ミニ遺伝子における領域と相補するようにデザイン
している。
【０１４０】 ５′−ＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡ−３′
【０１４１】オリゴヌクレオチドＶＨ１ＦＯＲ，ＶＨ１
ＢＡＣＫ，ＶＫ１ＦＯＲ及びＶＫ１ＢＡＣＫはＯｒｌａ
ｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８６：３８３３，１９８９）により、共通配列が一
致するようデザインされている。
【０１４２】 ＶＨ１ＦＯＲ：５′−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３′ ＶＨ１ＢＡＣＫ：５′−ＡＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ａ）Ａ（Ｇ／Ａ）ＣＴＧＣ ＡＧ（Ｇ／Ｃ）ＡＧＴＣ（Ｔ／Ａ）ＧＧ−３′ ＶＫ１ＦＯＲ：５′−ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）Ｃ （Ｃ／Ｇ）−３′ ＶＫ１ＢＡＣＫ：５′−ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ −３′
【０１４３】４．２ ｃＤＮＡ合成 ポリ（Ａ）−含有ＲＮＡ ５５ngを、５０mMのトリス−
ＨＣｌ、pH８．３、３mMの塩化マグネシウム、１０mMの
ＤＴＴ、７５mMのＫＣｌ、４００μＭのｄＮＴＰ（Ｎ＝
Ｇ，Ａ，Ｔ及びＣ）、１００μｇのＢＳＡ（分子生物学
級、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１０
０ＵのＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）、２５ｐモルのＭＣＫ２及び２５ｐモ
ルのＭＣＨＣ２を含む緩衝液に溶解させた。このＲＮＡ
を７０℃で５分間変性させ、次いで氷の上で２分間冷や
した。２００ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ，Ｂ
ＲＬ）を加えた後、ｃＤＮＡ合成を３７℃で１時間にわ
たるインキュベーションにより行った。
【０１４４】４．３ ポリメラーゼ連鎖反応 このｃＤＮＡ反応物の１／１０を、１０mMのトリス−Ｈ
Ｃｌ、pH８．３、１．５mMのＭｇＣｌ2 、５０mMのＫＣ
ｌ、１０mMのβ−メルカプトエタノール、２００μＭの
ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ及びＣ）、０．０５％のツイ
ーン−２０（商標）（Ｍｅｒｃｋ）、０．０５％のＮＰ
−４０（商標）（Ｍｅｒｃｋ）、１０％のＤＭＳＯ、２
５ｐモルのオリゴヌクレオチド１（以下参照のこと）、
２５ｐモルのオリゴヌクレオチド２（以下参照のこと）
及び２．５Ｕのアンプリタク（（Ａｍｐｌｉｔａｑ）商
標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ）を含む緩衝液中におけるＤＮＡ増幅のため
に用いた。９３℃で１分間にわたる最初の変性、及びそ
の後３７℃でアニール化せしめた後、Ｔａｑポリメラー
ゼを加えた。最初の４回のサイクルにおいては、プライ
マー伸長は７１℃にて０．２分間、変性は９３℃にて
０．０１分間、そしてアニール化は３７℃にて０．２分
間で行った。最後の２５回のサイクルについてはアニー
ル化温度を６２℃迄高めた。最後に、増幅は７１℃での
３分間のプライマー伸長により終了した。
【０１４５】 ＰＣＲ生成物 オリゴヌクレオチド１ オリゴヌクレオチド２ ＨＣ ＭＣＨＣ２ ＶＨ１ＢＡＣＫ Ｈ ＶＨ１ＦＯＲ ＶＨ１ＢＡＣＫ ＬＣ ＭＣＫ２ ＶＫ１ＢＡＣＫ Ｌ ＶＫ１ＦＯＲ ＶＫ１ＢＡＣＫ
【０１４６】４．４ 改質及び精製 増幅物質をＣＨＣｌ3 によって抽出し、そして２００mM
のＬｉＣｌの存在下においてエタノールにより沈殿させ
た。クローニングを促進せしめるため、６６mMのトリス
−酢酸、pH７．９、１３２mMの酢酸カリウム、２０mMの
酢酸マグネシウム、１mMのＤＴＴ、２００μｇ／mlのＢ
ＳＡ（分子生物学級、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）及び４００μＭのｄＮＴＰ（Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ
及びＣ）中において、１ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）による３
分間の処理によってブラント末端を作り上げた。このポ
リメラーゼを、３７℃にて１時間にわたる１０ＵのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によ
るＤＮＡのリン酸化の前に、６５℃で１５分間の加熱に
よって不活性化せしめた。この目的のため、この緩衝液
は５０mMのＥＤＴＡ及び１mMのＡＴＰに調整されてい
る。この改質増幅生成物を１．２％（ｗ／ｖ）のアガロ
ースゲル（超高純度ＤＮＡ級アガロース、Ｂｉｏｒａ
ｄ）上で分離せしめ、そして予測サイズのＤＮＡをＤＥ
ＡＥ ＮＡ ４５膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒとＳｃｈｕ
ｅｌｌ）によって溶出させた。
【０１４７】４．５ リゲーション ブルースクリプト（（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）商標）Ｋ
Ｓ＋（７０μｇ）をＸｂａＩにより直鎖状にし、ブラン
ト末端を付与せしめるためにクレノウＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により
処理し、そして牛の腸のホスファターゼにより脱リン酸
化せしめ、そして３０ngの純粋な増幅生成物を５０mMの
トリス−ＨＣｌ、pH７．８、１０mMの塩化マグネシウ
ム、１０mMのＤＴＴ及び０．８mMのＡＴＰ中において
０．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、１６℃にて一夜リゲー
トせしめた。アンピシリン耐性コロニーを得るため、こ
のリゲーション混合物の半分を用いてＥ．コリＫ８０３
に形質転換せしめた。ＮａＯＨを基礎とするプラスミド
「ミニプレプ」法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）を利用して、所望
のリゲーション生成物についてこれらを検索せしめた。
以下のプラスミドが得られた。
【０１４８】
【０１４９】４．６ シーケンシング シーケンシングはＴ3 及びＴ7 オリゴヌクレオチドプラ
イマーを伴って、シーケナーゼ（（Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅ）商標）キット（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い、この製造者の提供する方
法に従って行った。
【０１５０】プラスミドｐＭＺ１７／１は非機能的な再
配列を含む。プラスミドｐＭＺ１７／２はＩｇと無関係
な配列を含む。プラスミドｐＭＺ１８／１（配列番号
２）及びｐＭＺ１８／２は同じ機能的なＦＲＰ５カッパ
ー軽鎖可変ドメインインサートを含む。プラスミドｐＭ
Ｚ１６／１（配列番号１）及びｐＭＺ１６／２は同じ機
能的なＦＲＰ５重鎖可変ドメインインサートを含む。プ
ラスミドｐＭＺ１５／１及びｐＭＺ１５／２はある定常
領域ＤＮＡを伴ってＦＲＰ５重鎖可変ドメインインサー
トも含む。プラスミドｐＭＺ１６／１及びｐＭＺ１８／
１は更なるサブクローニング段階のための起源として用
いられる。
【０１５１】例５．ＭＡｂ ＦＲＰ５一本鎖Ｆｖ遺伝子
の組立て ５．１ 重鎖及び軽鎖可変ドメインのｃＤＮＡのための
クローニングリンカーの組立及び配列 オリゴヌクレオチドを用い、ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥIIフラ
グメントとしてのＰＣＲ増幅マウス重鎖可変ドメインｃ
ＤＮＡ及びＰｖｕII／ＢａｌIIフラグメントとしてのＰ
ＣＲ増幅マウスカッパー軽鎖可変ドメインｃＤＮＡのク
ローニングを可能にするリンカー配列を組立てた。これ
は解放解読フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を作り上げ、ここにおいて重鎖と軽鎖可変ドメ
インは１５個のアミノ酸鎖、
【化２０】 をコード化する配列により連結されている。このアミノ
酸リンカーは一本鎖Ｆｖにおける重鎖及び軽鎖可変ドメ
インにおいて存在する抗原結合性ドメインの適切な折り
たたみを可能にすることが示されている（Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：５８７９，１９８８）。
【０１５２】このクローニングリンカーの組立てのた
め、６種の相補性オリゴヌクレオチド１Ａ，１Ｂ，２
Ａ，２Ｂ，３Ａ，３Ｂを用いた。
【０１５３】 １Ａ：５′−ＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴ ＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧ−３′ １Ｂ：５′−ＧＡＡＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＴＧ ＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧ−３′ ２Ａ：５′−ＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧ ＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣ−３′ ２Ｂ：５′−ＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣ ＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ−３′ ３Ａ：５′−ＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＣ Ｔ−３′ ３Ｂ：５′−ＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣ ＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣ−３′
【０１５４】４０pMのオリゴヌクレオチド１Ｂ，２Ａ，
２Ｂ，３Ａを、４種の別々の反応において、全容量２０
μｌにおいて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を利用し、５′末
端にて、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２）の詳細する方法に従ってリン
酸化せしめた。オリゴヌクレオチド１Ａ及び３Ｂは、最
終リゲーション反応におけるこのリンカーの自己リゲー
ションを避けるためにリン酸化せしめなかった。キナー
ゼ反応の後、この酵素を７０℃で３０分間にわたるイン
キュベーションにより不活性化せしめた。３種の別々の
反応において、全容量４０μｌにおいて４０pMの２種の
オリゴヌクレオチド、即ち、非リン酸化１Ａとリン酸化
１Ｂ、リン酸化２Ａとリン酸化２Ｂ、及びリン酸化３Ａ
と非リン酸化３Ｂをそれぞれ含むものを混合した。この
３種の反応におけるオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションを、５分間にわたり９５℃迄加熱し、５分間
にわたり６５℃にてインキュベーションし、そして室温
迄ゆっくり冷却することにより実施した。３種の各反応
物１０μｌを混ぜ、４μｌの１０Ｘリゲーション緩衝液
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及び４ユニットのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を加え、そして無
菌水により全容量を４０μｌに調整した。これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニール化ペアーを１種のリンカー配
列に、１４℃にて１６時間にわたりリゲートせしめた。
この反応混合物を等容量のフェノール／クロロホルム
（１：１）により抽出せしめ、次に等容量のクロロホル
ム／イソアミルアルコール（２４：１）によるこの水性
相の再抽出により抽出せしめた。この水性相を集め、
０．１容量の３Ｍの酢酸ナトリウムpH４．８及び２容量
のエタノールを加え、そしてＤＮＡを−７０℃で４時間
にわたり沈殿させ、そして遠心により集めた。得られる
リンカー配列はＳｐｈＩ及びＸｂａＩアダプター末端を
有する。これをＳｐｈＩ及びＸｂａＩ消化ｐＵＣ１９
に、１００ngのリゲートリンカー及び２００ngのＳｐｈ
Ｉ／ＸｂａＩ消化ｐＵＣ１９を含む反応においてリゲー
トせしめた。Ｅ．コリＸＬ１ブルー（（Ｂｌｕｅ）商
標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換せしめた後、
４種の独立コロニー由来のプラスミドＤＮＡをアルカリ
性溶解ミニ−プレパレーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）
により単離せしめた。ｐＵＣ１９にクローン化したこの
リンカーＤＮＡ配列を両方の方向において、この二本鎖
ＤＮＡをシーケナーゼII（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）並びにｐＵＣユーバーサ
ル及びリバースプライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に
より、その製造者のプロトコールに従ってシーケンシン
グした。シーケンス化した４種の組換ｐＵＣ１９単離物
のうちの３種が正しいリンカー配列を含んでいた。その
内の１つをｐＷＷ１９と表示し、そして更なる実験にお
いて用いた。この配列を配列番号３において示す。
【０１５５】５．２ 可変ドメインのサブクローニング
のためのプラスミドの調製 ｐＷＷ１９から１４４bpのＨｉｎｄIII ／ＳａｃＩフラ
グメントとしてのＦｖクローン化リンカー配列を誘導
し、そしてＰｖｕII制限部位を含まないＨｉｎｄIII ／
ＳａｃＩ消化ブルースクリプトＫＳ＋（ｅｘ ＰｖｕI
I）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入せしめた。得られ
るプラスミドｐＷＷ１５はＰｓｔＩ／ＢｓｔＥII及びＰ
ｖｕII／ＢｇｌIIフラグメントとして、それぞれ重鎖及
び軽鎖可変ドメインのクローニングを可能にする。
【０１５６】５．２．１ ＦＲＰ５重鎖可変ドメインの
サブクローニング プラスミドｐＭＺ１６／１をＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIに
より消化し、そしてＦＲＰ５のこの３３８bpの重鎖可変
ドメインフラグメントを単離した。これをＰｓｔＩ／Ｂ
ｓｔＥII消化ｐＷＷ１９にクローン化せしめ、プラスミ
ドｐＷＷ３１が得られた。
【０１５７】５．２．２ ＦＲＰ５軽鎖可変ドメインの
突然変異及びＦｖ融合遺伝子の組立て ＦＲＰ５軽鎖可変ドメインのＦｖクローニングリンカー
へのサブクローニングを促進せしめるため、ＰｖｕII制
限部位及びＢｇｌII制限部位をこのコード化領域の５′
及び３′末端にそれぞれ導入した。このＦＲＰ５軽鎖可
変ドメインコード化領域を、ｐＭＺ１８／１からＳａｃ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。ＳａｃＩ
及びＢａｍＨＩはｐＭＺ１８／１に存在するブルースク
リプトポリリンカーの制限部位である。このフラグメン
トはオリゴヌクレオチドＭＣＫ２を用いるＰＣＲにより
増幅せしめた（上記参照のこと）３９２bpの完全な軽鎖
可変ドメインフラグメントを含んでいる。カッパー軽鎖
可変ドメインＤＮＡの５′末端（ＶL ５′）へのＰｖｕ
II制限部位及び３′末端（ＶL ３′）へのＢｇｌII制限
部位の導入のため、このフラグメントを突然変異せし
め、そしてオリゴヌクレオチド、 ＶL ５′：５′−ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ−３′及び ＶL ３′：５′−ＧＣＣＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＣＣＣ ＧＡＧ−３′ を用いてＰＣＲにより増幅せしめた。２０ngのこのＦＲ
Ｐ５可変軽鎖ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを１０
０μｌの反応物中にて鋳型として、例４．３に記載のＰ
ＣＲ条件に従って用いた。この増幅且つ突然変異せしめ
たフラグメントをＰｖｕII／ＢｇｌII消化せしめた後、
１．５％のアガロースゲルから３０９bpのフラグメント
として単離し、そしてＰｖｕII／ＢｇｌII消化ｐＷＷ１
５にクローン化せしめてプラスミドｐＷＷ４１を作り上
げた。ＦＲＰ５カッパー軽鎖可変ドメインを、ｐＷＷ４
１からＢｓｔＥII／ＸｂａＩフラグメントとして単離
し、そしてＢｓｔＥII／ＸｂａＩ消化ｐＷＷ３１に挿入
せしめた。これにより、ｐＷＷ３１におけるＦＲＰ５重
鎖可変ドメイン及びＦＲＰ５カッパー軽鎖可変ドメイン
は１つの解放解読フレームに融合された。３種の独立ク
ローンの二本鎖ＤＮＡをＰＵＣユニバーサルとリバース
プライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、両方の方
向においてシーケナーゼIIキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により、その製造者のプロトコ
ールに従ってシーケンス化せしめた。突然変異せしめた
ＦＲＰ５軽鎖可変ドメインと融合しているＦＲＰ５重鎖
可変ドメインを有するプラスミドの１種を選別し、そし
てｐＷＷ５２と表示した。プラスミドｐＷＷ５２におけ
るＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩインサートの配列を配列番号
４に示す。
【０１５８】例６．一本鎖Ｆｖ−ホスファターゼ融合遺
伝子発現性プラスミドの組立て ＭＡｂ ＦＲＰ５一本鎖Ｆｖ遺伝子を細菌アルカリホス
ファターゼと融合させる。このキメラ遺伝子は、ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２タンパク質の結合活性及び酵素活性を保持す
る二価分子をコード化する。
【０１５９】６．１ 一本鎖Ｆｖ（ＦＲＰ５）遺伝子の
突然変異 ｐＷＷ５２からの一本鎖Ｆｖ（ＦＲＰ５）をコード化す
る遺伝子とアルカリ性ホスファターゼ遺伝子ｐｈｏＡと
の遺伝子融合を可能にするため、ｐＷＷ５２の配列位置
７２９〜７３１の停止コドン（例５．２．３を参照のこ
と）を以下の通りに削除せしめた。ｐＷＷ５２のプラス
ミドＤＮＡをＢｓｔＥII及びＢｇｌIIにより消化し、そ
してこのリンカー配列及びＦＲＰ５軽鎖可変ドメインコ
ード化配列を単離した。他の消化において、ｐＷＷ５２
をＢｓｔＥII及びＢｃｌＩにより切断せしめた。これに
よってベクター配列及びＦＲＰ５重鎖可変ドメインコー
ド化配列を含む大きなフラグメントが単離された。この
ＢｓｔＥII／ＢｇｌII Ｖ L フラグメントを次にＶH を
含むＢｓｔＥII／ＢｃｌＩ切断ｐＷＷ５２に挿入した。
得られるプラスミドｐＷＷ５３において、ＢｇｌII／Ｂ
ｃｌＩの結合は前記の通りに二本鎖ＤＮＡをシーケンス
化することにより検定される。
【０１６０】ｐＷＷ５３におけるＢｇｌII／ＢｃｌＩ結
合の配列（位置番号は配列番号４のプラスミドｐＷＷ５
２におけるＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩインサートの位置番
号に相当する）：ＢｇｌII／ＢｃｌII ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＡ ７１４−７２８｜７３８−７４８
【０１６１】６．２ Ｅ．コリアルカリホスファターゼ
遺伝子ｐｈｏＡの突然変異 Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ融合遺伝子を組立てるた
め、Ｅ．コリアルカリホスファターゼ遺伝子ｐｈｏＡを
突然変異させ、この成熟タンパク質のＮ末端付近のｐｈ
ｏＡのコード化領域におけるＸｂａＩ切断部位及びｐｈ
ｏＡの３′非翻訳領域におけるＳａｃＩ切断部位を作り
上げた。この工程は突然変異フラグメントのクローニン
グを促進せしめる。組換トランスポゾンＴｎＰｈｏＡを
有するｐＢＲ３２２誘導体（ＭａｎｏｉｌとＢｅｃｋｗ
ｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：８１２９，１９８５）をＢｇｌII切断により
直鎖状にした。この直鎖鋳型ＤＮＡ ２０ngを、オリゴ
ヌクレオチドＰｈｏＡ５′及びＰｈｏＡ３′をプライマ
１及び２として利用する前述の通りに実施した１００μ
ｌのＰＣＲ反応のために用いた。
【０１６２】 ＰｈｏＡ５′：５′−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣ −３′ ＰｈｏＡ３′：５′−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＧ−３′
【０１６３】このＰＣＲ生成物のＸｂａＩ／ＳａｃＩ消
化に続き、１４１９bpのフラグメントを１．５％のアガ
ロースゲルから単離し、そしてＸｂａＩ／ＳａｃＩ消化
プラスミドｐＵＣ１９に挿入せしめた。リゲーションは
前記の通りに行った。リゲートせしめたＤＮＡをＥ．コ
リＸＬ１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換せ
しめた。これにより、突然変異せしめたｐｈｏＡ遺伝子
の解放解読フレームはｐＵＣ１９のｌａｃＺ解放解読フ
レームとフレーム内において融合する。突然変異せしめ
たｐｈｏＡ遺伝子が機能的なアルカリホスファターゼを
発現せしめることを示すために、組換クローンを１００
μｇ／mlのアンピシリン、０．５mMのＩＰＴＧ（Ｓｉｇ
ｍａ）及び４０μｇ／mlのＸＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）を含むＬＢ寒天プレート上にまいた。ｐＵＣ１９の
ｌａｃプロモーターを誘導した後、ｌａｃＺ−ｐｈｏＡ
融合タンパク質が発現された。この融合タンパク質のホ
スファターゼ活性は指示薬ＸＰを青い色素へ変換せしめ
る。青いコロニーの１つを単離し、そして導入せしめた
制限部位の存在を、ＸｂａＩ及びＳａｃＩによるミリプ
レプＤＮＡの消化により確認した。突然変異ｐｈｏＡの
部分的な５′及び３′ＤＮＡ配列が前記の通りに二本鎖
ＤＮＡをシーケンシングすることにより得た。このＤＮ
Ａ配列は配列番号５において示す最終的なＦｖ（ＦＲＰ
５）−ｐｈｏＡ融合遺伝子配列の集成体に含まれてい
る。この単離したプラスミドをｐＷＷ６１と表示し、そ
して更なるサブクローニング段階のために用いた。
【０１６４】６．３ ＦＲＰ５ Ｆｖ−ｐｈｏＡ発現性
プラスミドの組立て プラスミドｐＷＷ１９から（例５．１．２参照）、クロ
ーニングリンカー配列をＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩフラ
グメントとして単離し、そしてＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲ
Ｉ消化プラスミドｐＩＮIII −ｏｍｐＡ−Ｈｉｎｄ（Ｒ
ｅｎｔｉｅｒ−Ｄｅｌｒｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：８７２６，１９８８）に挿入し、プラ
スミドｐＷＷ１６を導いた。
【０１６５】ｐＷＷ６１から（例６．２参照）、突然変
異ｐｈｏＡ遺伝子をＸｂａＩ／ＳａｃＩフラグメントと
して単離し、そしてＸｂａＩ／ＳａｃＩ消化ｐＷＷ５３
に挿入せしめた。得られるプラスミドｐＷＷ６１５は、
突然変異アルカリホスファターゼ遺伝子とフレーム内に
おいて融合しているＦｖ（ＦＲＰ５）遺伝子を有するＦ
ｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ遺伝子をｐＷＷ６１５からＨ
ｉｎｄIII ／ＳａｃＩフラグメントとして単離し、そし
てＨｉｎｄIII ／ＳａｃＩ消化プラスミドｐＷＷに挿入
せしめた。このことはＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ発現
性プラスミドｐＷＷ６１６（以下参照）をもたらす。す
べてのリゲーションは前記の通りに行った。組換プラス
ミドをＥ．コリＸＬ１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
に形質転換せしめた。この構造体はアルカリ性ミニプレ
パレーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）により単離したプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認した。
【０１６６】この構造体において、アルカリホスファタ
ーゼｐｈｏＡに遺伝子的に融合したＦＲＰ５のＦｖ一本
鎖抗体がＩＰＴＧの誘導の後にＥ．コリにおいて発現さ
れうる。この組換タンパク質はＥ．コリの外膜のプロテ
インＡ（ｏｍｐＡ）シグナル配列をＮ′末端にて、Ｅ．
コリ発現性細胞のペリプラズマ空間にこのタンパク質を
分泌せしめることを促進するために有する。
【０１６７】発現性プラスミドｐＷＷ６１６におけるＦ
ｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ融合遺伝子の配列を配列番号
５に示す。このｐｈｏＡ配列の一部は、Ｃｈａｎｇら
（Ｇｅｎｅ ４４：１２１，１９８６）から集めた。
【０１６８】例７．Ｅ．コリにおけるＦｖ（ＦＲＰ５）
−ｐｈｏＡの発現 プラスミドｐＷＷ６１６をｐｈｏＡ陰性Ｅ．コリ株ＣＣ
１１８（ＭａｎｏｉｌとＢｅｃｋｗｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８１２
９，１９８５）に形質転換せしめた。組換単一コロニー
を７０μｇ／mlのアンピシリンを含む５０mlのＬＢ培地
中において一夜増殖せしめた。この一夜培養物を、７０
μｇ／mlのアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地５００ml
に１：１０で希釈し、そして０．１のＯＤ550 となる迄
３７℃で増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度２mMとなる迄
加え、そして発現を３７℃で１時間にわたり引き起こさ
せた。この細胞をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ遠心機内に
おいて２５分間にわたる４，０００rpm で４℃での遠心
により集めた。ＣＣ１１８／ｐＷＷ６１６の上清液を、
Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの調製のため氷の上に放置
した。
【０１６９】７．１ ＣＣ１１８／ｐＷＷ６１６のペリ
プラズマタンパク質からのＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ
の単離 細菌ペレットを１０mlのＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍのトリ
ス−ＨＣｌ、pH８．０、０．５mMのＥＤＴＡ、０．５Ｍ
のスクロース）中に懸濁せしめ、そして氷の上に１０分
間放置した。Ｈｅｒａｅｕｓ小型遠心機において５，０
００rpm 、１０分間、４℃での遠心の後、この上清液を
除去し、そして洗浄せしめたペレットを１５mlの氷冷Ｔ
ＥＳ（水で１：４に希釈）中に懸濁させた。この細胞を
３０分間氷の上に放置し、そして前記の通りに再遠心せ
しめた。ペリプラズマタンパク質を含むこの上清液をＢ
ｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００超遠心機により、４５，００
０ｇで１５分間再遠心せしめた。このペリプラズマ抽出
物をＡｍｅｒｓｈａｍ限外濾過ユニットにおいて、ＹＭ
１０膜を通して最終容量２ml迄濃縮せしめた。ＰＢＳに
よる５倍希釈及びＹＭ１０膜での５回の再濃縮により、
このペリプラズマ抽出物の１：４希釈ＴＥＳ緩衝液はＰ
ＢＳにより交換された。ＮａＮ3 及びプロテアーゼ阻害
剤をこのペリプラズマタンパク質（ＰＢＳ中で２ml）に
加え、０．０２％のＮａＮ3 、０．１mMのＰＭＳＦ、２
μｇ／mlのアプロチニン、１μｇ／mlのロイペプチン及
び１μｇ／mlのペプスタチンの最終濃度にした。このペ
リプラズマ抽出物を４℃にて保存した。
【０１７０】７．２ Ｅ．コリＣＣ１１８／ｐＷＷ６１
６培養物の濃縮上清液からのＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏ
Ａの単離 誘導Ｅ．コリ培養物ＣＣ１１８／ｐＷＷ６１６の上清液
（５００ml）を０．４５μｍの膜で濾過せしめた。この
濾過物をＡｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットにおいて、ＹＭ
１０膜に通して、前記の通りＰＢＳ中において最終容量
１０ml迄濃縮させた。ＮａＮ3 及びプロテアーゼ阻害剤
をこの濃縮上清液に、前記の通りの最終濃度になる迄加
えた。この抽出物中のＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの濃
縮をクマジー染色した９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＢ
ＳＡ標品との比較においてデンシトメトリーにより測定
した。
【０１７１】例８．Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの活性 ８．１ Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡを用いた免疫染色
によるＳＫＢＲ３胸部腫瘍細胞におけるｃ−ｅｒｂＢ−
２の検査 Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡのＦｖドメインはこの分子
がｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質の細胞外ドメインに結合
することを可能にする。結合したＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐ
ｈｏＡはアルカリホスファターゼ活性の検出のための色
素物質を利用する染色方法により視覚化されうる。
【０１７２】８．１．１ 細胞の固定 １細胞当り、約１×１０6 個のｃ−ｅｒｂＢ−２リセプ
ターを有するＳＫＢＲ３ヒト胸部腫瘍細胞をフィブロネ
クチン被覆ガラスカバースリップ上にて増殖せしめた。
この細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、その後ＰＢＳ／
３．７％のホルムアルデヒドにより、室温にて３０分間
にわたり固定せしめた。この固定細胞を室温でＰＢＳに
より３回洗浄した。非特異的な結合部位を、この細胞を
高湿インキュベーター内にて、３７℃でＰＢＳ／３％の
ＢＳＡと１時間インキュベートせしめることによりブロ
ックせしめた。次にこの細胞をＰＢＳにより２回洗浄せ
しめた。
【０１７３】８．１．２ Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ
の予備処理 Ｅ ．コリ由来のアルカリホスファターゼは酵素的に活性
となるために二量化されなければならない。Ｅ．コリの
ペリプラズム内において、天然のｐｈｏＡは二量化され
る。即ち、ｐｈｏＡの２分子が２つのＺｎ2+イオンによ
り一緒になる。このＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡもＥ．
コリにおいて二量体として生産される。Ｆｖ（ＦＲＰ
５）−ｐｈｏＡの抗原への結合性を高めるためには、こ
の二量体はこの溶液にＥＧＴＡを加えることによって単
量化せしめる。この段階はこの溶液からＺｎ2+イオンを
除去せしめる。単量化ホスファターゼはＺｎ2+の添加に
より再び二量化されうる。ＥＧＴＡをＣＣ１１８／ｐＷ
Ｗ６１６（前記参照）由来の４０倍濃縮上清液又はペリ
プラズマタンパク質２００μｌに、最終濃度５mMとなる
よう加えた。この溶液をイムノアッセイにおいて利用す
る直前に３７℃で１時間インキュベートする。
【０１７４】８．１．３ 細胞の染色 ＰＢＳ／３％のＢＳＡ（前記）によりブロックせしめた
後、固定化細胞を１μｇ／mlの濃度の予備処理せしめた
Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡと１時間、３７℃で高湿イ
ンキュベーター内にてインキュベートせしめた。この細
胞を室温にてＰＢＳにより３回洗浄した。この染色溶液
は、１００mMのトリス−ＨＣｌ、pH８．２、１mM Ｚｎ
Ｃｌ2 、９．７mlに加えられた、３００μｌのナフトー
ルＡＳ−ＭＸ（商標）リン酸塩（Ｓｉｇｍａ、ジメチル
ホルムアミド中において１３mg／ml）、８mgのレバミソ
ール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）（Ｓｉｇｍａ）及び１０
mgのファストレッドＴＲ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ：商
標）塩（Ｓｉｇｍａ）より成る。この混合物を調製し、
そして使用直前に０．４５μｍのフィルターで濾過し
た。結合したＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡを再び二量化
せしめるためにこの染色溶液にＺｎＣｌ2 を加え、これ
によってアルカリホスファターゼを活性化せしめた。細
胞をファストレッド染色溶液に室温にて１５分間インキ
ュベートせしめた。このホスファターゼ活性を染色後、
この細胞をＰＢＳで２回そして１ＭのＫＨ2 ＰＯ4 で１
回洗浄することによりブロックせしめた。ガラスカバー
スリップはゲルマウント（Ｂｉｏｍｅｄａ）が載せてあ
る。この細胞を蛍光顕微鏡のもとで、励起のために緑色
光を用いて検査した。染色されたＳＫＢＲ３細胞は強い
赤色の表面蛍光を示した。
【０１７５】８．２ Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡを用
いたイムノブロットにおけるｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク
質過剰発現の検定 ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を過剰発現するＳＫＢＲ３
細胞の全細胞リゼート由来のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分離せしめ、そしてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ）上にブロットした。抽出物の調製及びイムノ
ブロッティング技術については例１．３．２を参照のこ
と。この膜の遊離（フリー）な結合部位を、１０mMのト
リス−ＨＣｌ、pH７．５、０．９％のＮａＣｌ、０．０
５％のツイーン２０（Ｂｉｏｒａｄ）及び３％のＢＳＡ
を含む溶液中にて室温での１時間のインキュベーション
によりブロックした。予備処理したＦｖ（ＦＲＰ５）−
ｐｈｏＡ（例７．２参照）を最終濃度０．１μｇ／mlと
なるようブロッキング溶液に希釈した。この膜をＦｖ
（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ溶液中で室温にて１時間インキ
ュベートし、その後室温にて１０mMのトリス−ＨＣｌ、
pH７．５、０．９％のＮａＣｌ、０．０５％のツイーン
２０で３回、そして１０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．
５、０．９％のＮａＣｌで１回洗浄した。結合したＦｖ
（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの検出のため、この膜を例７．
３に記載のファストレッド基質溶液であってレバミソー
ルを含まない溶液中にて３７℃で２０分間インキュベー
トせしめた。この膜を水で２日洗浄することにより反応
を停止させた。Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡは１８５KD
のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を特異的に検出せしめ
る。
【０１７６】例９．Ｅ．コリ由来のＦｖ（ＦＲＰ５）−
ｐｈｏＡの発現及び単離 ９．１ ペリプラズマ抽出物の調製 プラスミドｐＷＷ６１６をｐｈｏＡ陰性Ｅ．コリ株ＣＣ
１１８に、標準的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に従って形
質転換せしめた。単一のコロニーを採取し、そして７０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地において一夜増
殖せしめた。この一夜培養物をアンピシリンを含む新鮮
ＬＢ培地において１：１０に希釈し、そして０．１のＯ
Ｄ550 となる迄３７℃にて増殖させた。この時点で、Ｆ
ｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ遺伝子の発現を最終濃度２mM
迄のＩＰＴＧの添加により引き起こし、そしてこれらの
細胞を更に１．５〜２時間増殖せしめた。この細胞を遠
心により集め、そして温和な浸透圧ショックにより処理
してこのペリプラズマタンパク質を上清液に放出させ
た。このタンパク質をＡｍｅｒｓｈａｍ限外濾過ユニッ
トにおいて、ＹＭ１０膜を通して濃縮した。
【０１７７】９．２ 抗原アフィニティーカラムの調製 標準的な方法により、ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメイン
を発現するバクロウイルスベクターにより感染された昆
虫細胞からｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を単離した
（Ｖ．Ａ．ＬｕｃｋｏｗとＭ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７：５５，１９８
８）。ＭＡｂ ＦＳＰ７７をＣＮＢＲ活性化セファロー
ス４Ｂ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、その製造者
の仕様書に従って結合せしめた。この昆虫細胞リゼート
を、５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、５mMのＥＧＴ
Ａ、０．５％のトリトンＸ−１００、１５０mMのＮａＣ
ｌを含む緩衝液中にて、結合せしめたＭＡｂ ＦＳＰ７
７と２時間、４℃、振騰台の上でインキュベートせしめ
た。このビーズをカラムに充填し、そして非特異的に結
合しているタンパク質を除去するために１０mMのリン酸
塩、pH６．８、及び１００mMのＮａＣｌより成る予備溶
出緩衝液により洗浄した。ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質
は、１００mMのグリシン、pH３．０、及び１００mMのＮ
ａＣｌを含む低pH溶出緩衝液による処理によって回収し
た。このカラムからの画分を、そのpHを上げるためにリ
ン酸緩衝液pH８．０に集めた。ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外
ドメインは各画分の一部を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
上に泳動させ、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に
ブロットせしめ、そしてこのフィルターをＭＡｂ ＦＳ
Ｐ７７、その後ヒツジ抗マウスＩｇＧにより処理せしめ
ることにより検出される。結合したＩｇＧは 125Ｉ−プ
ロテイン−Ａ処理により検出される。細胞外ドメインを
含む画分をプールし、そしてそのタンパク質をＣＮＢＲ
活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、そ
の製造者の仕様書に従って結合せしめた。
【０１７８】９．３ アフィニティークロマトグラフィ
ーによるＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの単離 ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質に結合したセファロース
（例９．２）を例９．１に記載の通り単離したペリプラ
ズマ抽出物と、２〜４時間、４℃にて、ロッキング台上
でインキュベートした。このビーズをカラムに充填しそ
して例９．２の通りに予備溶出緩衝液により洗浄した。
Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡタンパク質を例９．２の低
pH溶出緩衝液による溶出によって回収した。この画分
を、標準的なプロトコールを用い、ｐｈｏＡ酵素活性に
ついての試験により、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの存
在についてモニターした。
【０１７９】例１０．腫瘍におけるｃ−ｅｒｂＢ−２タ
ンパク質のイムノアッセイ １０．１ 腫瘍切片の調製 腫瘍中のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質のレベルを検出す
るため、凍結腫瘍切片又はパラフィン包埋腫瘍切片のい
づれかを得るように腫瘍組織を処理した。腫瘍断片を瞬
間凍結し、次いでクライオスタット（低温槽）にて切断
し、１％のゼラチン被覆ガラススライド上に集め、そし
て４％のパラホルムアルデヒドで固定せしめた。ＰＢＳ
による数回の洗浄を経て、この腫瘍組織は染色の用意が
された。他方、腫瘍断片を固定のために４％のパラホル
ムアルデヒドの中に入れ、パラフィン中に包埋せしめ、
次いで切片を切断し、そしてポリリシン被覆ガラスカバ
ースリップ上に集めた。染色のための切片を調製するた
め、これらを５６℃にて一夜加熱せしめ、キシレン中で
脱蝋し、９５％、７５％及び３５％のエタノール並びに
水の中で段階的に再水和せしめ、そしてＰＢＳで洗浄し
た。
【０１８０】１０．２ Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの
予備処理 Ｅ ．コリペリプラズマ由来のものとしてのＦｖ（ＦＲＰ
５）−ｐｈｏＡの二量体がｃ−ｅｒｂＢ−２抗原とよく
結合しないため、まずこれを単量化せしめた。これはＦ
ｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡの溶液を３７℃にて１時間、
最終濃度５mMのＥＧＴＡにより処理せしめることにより
達成される。この処理は、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ
の二量体構造を維持するために重要なＺｎ2+をキレート
する。
【０１８１】１０．３ 腫瘍切片の染色 例１０．１に従って調製した腫瘍切片の非特異的な染色
は、この切片を３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中にてインキ
ュベートすることにより防いだ。このブロックされた切
片を１μｇ／mlの濃度のＦｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡ
と、高湿チャンバー内にて室温で予備処理せしめた。こ
の切片を室温でＰＢＳにより３回洗浄した。結合したＦ
ｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡタンパク質をアルカリホスフ
ァターゼのための基質としてのファストレッドを用い検
出した。この染色溶液は、１００mMのトリス−ＨＣｌ、
pH８．２及び１mMのＺｎＣｌ2 ９．７mlに加えられ
た、３００μｌのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩（Ｓｉ
ｇｍａ、ジメチルホルムアミド中１３mg／ml）、８mgの
レバミソール（内因性アルカリホスファターゼの阻害
剤、Ｓｉｇｍａ）及びファストレッドＴＲ塩（Ｓｉｇｍ
ａ）より成る。この混合物を調製し、そして使用直前に
０．４５μｍのフィルターに濾過した。ＺｎＣｌ2 をこ
の染色溶液に加え、結合Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡタ
ンパク質を再び二量体化、そしてアルカリホスファター
ゼを活性化せしめた。Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡによ
り処理せしめたこの腫瘍切片をファストレッド染色溶液
中において室温で１５分間インキュベートせしめた。染
色せしめた後、アルカリホスファターゼ活性を、ＰＢＳ
による２回そして１ＭのＫＨ2 ＰＯ4 による１回のこの
細胞の洗浄によってブロックせしめた。このガラスカバ
ースリップはゲルマウントが載せてある。この細胞を励
起のための緑色光を用いて蛍光顕微鏡のもとで検査し
た。陽性に染色された細胞は強い赤色の細胞表層蛍光を
示す。
【０１８２】一方、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈｏＡタンパ
ク質により処理された腫瘍切片はナフトールＡＳ−ＢＩ
リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）及びニューフシン（（Ｎｅｗ
Ｆｕｃｈｓｉｎ）商標）（Ｓｉｇｍａ）により、又は５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣ
ＩＰ，Ｓｉｇｍａ）及びニトロブルーテトラゾリウム
（商標）（Ｓｉｇｍａ）により染色されうる。これらの
染色切片は通常の可視光顕微鏡により観察できる。
【０１８３】例１１．ＦＷＰ５１ハイブリドーマ細胞系
由来の機能的な重鎖及び軽鎖再配列のクローニング 例３．３に記載の通りにＦＷＰ５１ハイブリドーマ細胞
から単離したポリ（Ａ）−含有ＲＮＡはｃＤＮＡ合成及
びＶ−領域のその後の増幅の原料として働く。ポリメラ
ーゼ連鎖反応によるＦＷＰ５１重鎖及び軽鎖可変ドメイ
ンｃＤＮＡのｃＤＮＡ合成並びに増幅は例４に記載の通
りに実施した。予測サイズの増幅生成物をアガロースゲ
ルから単離し、そして適当なベクターの中にクローン化
せしめた。機能性再配列をシーケンシングにより同定し
た。
【０１８４】１１．１ ＦＷＰ５１重鎖及び軽鎖可変ド
メインｃＤＮＡのサブクローニング 例４．３に従って増幅せしめた材料をＣＨＣｌ3 により
抽出せしめ、そして２００mMのＬｉＣｌの存在下におい
て沈殿させた。クローニングを促進するため、このＦＷ
Ｐ５１重鎖可変ドメインｃＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及
びＢｓｔＥIIにより切断せしめ、このフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＰｓｔＩ及
びＢｓｔＥII消化ｐＷＷ１５ＤＮＡにリゲートせしめ
た。ＦＷＰ５１軽鎖可変ドメインｃＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｖｕII及びＢｇｌIIにより切断せしめ、このフラグメン
トをアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＰｖ
ｕII及びＢｇｌII消化ｐＷＷ１５ＤＮＡ（例５参照）に
リゲートせしめた。リゲーション、形質転換、及び所望
のリゲーション生成物についてのスクリーニングは例
４．５に記載の通りに行った。以下のプラスミドが得ら
れた。
【０１８５】
【０１８６】１１．２ シーケンシング シーケンシングは例４．６に記載の通りに行った。
【０１８７】プラスミドｐＷＷ１５−ＶＨ５１−１（配
列番号６），ｐＷＷ１５−ＶＨ５１−２，ｐＷＷ１５−
ＶＨ５１−３は同一の機能性ＦＷＰ５１重鎖可変ドメイ
ンインサートを含む。プラスミドｐＷＷ１５−ＶＬ５１
−１（配列番号７），ｐＷＷ１５−ＶＬ５１−２，ｐＷ
Ｗ１５−ＶＬ５１−３は同一のＦＷＰ５１カッパー軽鎖
可変ドメインインサートを含む。プラスミドｐＷＷ１５
−ＶＨ５１−１及びｐＷＷ１５−ＶＬ５１−１を更なる
サブクローニング工程のための起源として用いる。
【０１８８】例１２．ＭＡｂ ＦＷＰ５１一本鎖遺伝子
の組立て １２．１ Ｆｖ融合遺伝子の組立て プラスミドｐＷＷ１５−ＶＨ５１−１をＰｓｔＩ及びＢ
ｓｔＥIIにより消化し、そしてＦＷＰ５１の３４２bpの
重鎖可変ドメインフラグメントが単離された。これをＰ
ｓｔＩ／ＢｓｔＥII消化ｐＷＷ１５−ＶＬ−５１−１に
クローン化せしめ、プラスミドｐＷＷ１５−Ｆｖ５１
（配列番号８）が得られた。
【０１８９】１２．２ 一本鎖Ｆｖ（ＦＷＰ５１）遺伝
子の突然変異 ｐＷＷ１５−Ｆｖ５１由来の一本鎖Ｆｖ（ＦＷＰ５１）
コード化遺伝子とエフェクター遺伝子間の遺伝子融合を
可能にするため、ｐＷＷ Ｆｖ１５−５１における配列
位置７２９〜７３１（配列番号８）のコドンを以下の通
りに除去せしめた（例６も参照のこと）。ｐＷＷ１５−
Ｆｖ５１のプラスミドＤＮＡをＢｓｔＥII及びＢｇｌII
により消化し、そしてリンカー配列及びＦＷＰ５１軽鎖
可変ドメインコード化フラグメントを単離した。他の消
化において、ｐＷＷ１５−Ｆｖ５１をＢｓｔＥII及びＢ
ｃｌＩにより切断せしめた。従って、ベクター配列及び
ＦＷＰ５１重鎖可変ドメインコード化配列を含むフラグ
メントが単離された。このＢｓｔＥII／ＢｇｌII ＶL
フラグメントを、次にＶH を含むＢｓｔＥII／ＢｃｌＩ
切断ｐＷＷ１５−Ｆｖ５１に挿入せしめた。得られるプ
ラスミドｐＷＷ１５−Ｆｖ５１−ＯＲＦをＦｖ（ＦＷＰ
５１）−エフェクター融合遺伝子の組立てのための起源
として用いた。
【０１９０】例１３．一本鎖Ｆｖ−外毒素Ａ融合遺伝子
発現性プラスミドの組立て ＭＡｂ ＦＲＰ５及びＭＡｂ ＦＷＰ５１一本鎖Ｆｖ遺
伝子を短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）細菌毒素、即ち、シ
ュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ（ＥＴＡ）
と融合せしめる。これらキメラ遺伝子は、ｃ−ｅｒｂＢ
−２発現性細胞におけるタンパク質合成を選択的に阻害
する組換免疫毒素をコード化する。
【０１９１】１３．１ シュードモナス アエルギノー
ザＰＡＫの外毒素Ａ遺伝子の突然変異 Ｆｖ−外毒素Ａ（Ｆｖ−ＥＴＡ）融合遺伝子の組立ての
ため、シュードモナスアエルギノーザＰＡＫ由来のＥＴ
Ａ遺伝子を突然変異せしめ、この毒素のＮ−末端のオリ
ジナルな細胞結合性ドメインＩを欠失させ、そしてこの
ＥＴＡコード化領域の前方のドメインＩ／ドメインIIの
境界にてＸｂａＩ切断部位を生じさせた。プラスミドｐ
ＭＳ１５０Ａ（Ｌｏｒｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７０：７１４，１９８８）をＥｃｏＲＩ切断により
直鎖状にした。２０ngのこの直鎖鋳型を前述した通りに
実施する１００μｌのＰＣＲ反応のために用いた。以下
のオリゴヌクレオチドをプライマー１及び２として利用
した。
【０１９２】 １：５′−ＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＣ ＴＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＴＧ−３′ ２：５′−ＧＣＧＧＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴ−３′
【０１９３】このＰＣＲ生成物のＨｉｎｄIII ／Ｓａｌ
Ｉ消化に続き、２０１bpのフラグメントを１．５％のア
ガロースゲルから単離し、そしてＨｉｎｄIII ／Ｓａｌ
Ｉ消化プラスミドｐＵＣ１８に挿入せしめた。リゲーシ
ョンは前記の通りに行った。リゲートＤＮＡをＥ．コリ
ＸＬ１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換せし
めた。２種の組換プラスミドが単離され、そのインサー
トＤＮＡを前記の通りｐＵＣユニバーサル及びリバース
プライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてシーケン
ス化した。予測の生成物を含む１方のプラスミドをｐＷ
Ｗ２２と表示し（配列番号９）、そして更なるサブクロ
ーニング工程のための起源として用いた。プラスミドｐ
ＷＷ２２をＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩにより切断せし
め、突然変異ＥＴＡ遺伝子フラグメントを単離し、そし
てｐＵＣ９ベクター配列及び該毒素のＣ−末端部分をコ
ード化するＥＴＡ遺伝子の部分を含むＨｉｎｄIII ／Ｓ
ａｌＩ消化プラスミドｐＭＳ１５０Ａの大きなフラグメ
ントの中に挿入せしめた。これにより、得られるプラス
ミドｐＷＷ２０において、該毒素のドメインII及びIII
をコード化する短縮ＥＴＡ遺伝子が作られる。
【０１９４】１３．２ 一本鎖Ｆｖ−ＥＴＡ融合遺伝子
の集成 Ｆｖ−ＥＴＡ融合遺伝子の組立てに適切なＨｉｎｄIII
／ＸｂａＩ一本鎖Ｆｖ遺伝子フラグメントをプラスミド
ｐＷＷ５３（一本鎖Ｆｖ ＦＲＰ５）及びプラスミドｐ
ＷＷ１５−Ｆｖ５１−ＯＲＦ（一本鎖Ｆｖ ＦＷＰ５
１）から単離し、そしてＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩ消化ｐ
ＷＷ２０に挿入せしめた。リゲーション及びＥ．コリＸ
Ｌ１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）への形質転換は前
記の通りに行った。得られるプラスミドｐＷＷ２０−Ｆ
ｖ５（Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ）及びｐＷＷ２０−Ｆ
ｖ５１（Ｆｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴＡ）を更なるサブク
ローニング工程のために用いる。
【０１９５】１３．３ 一本鎖Ｆｖ−外毒素Ａ融合遺伝
子発現性プラスミドの組立て Ｅ ．コリにおける一本鎖Ｆｖ−外毒素Ａ融合遺伝子の発
現のため、発現性プラスミドｐＦＬＡＧ（ＩＢＩ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いた。この融合遺伝子を、ｐ
ＦＬＡＧ−１によりコード化される外膜プロテインＡ
（ｏｍｐＡ）シグナル配列とフレーム内において融合せ
しめた。ｐＷＷ２０−Ｆｖ５及びｐＷＷ２０−Ｆｖ５１
由来のプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII により消化し、
そしてブラント末端を例４．５に記載の通りにクレノウ
フィル−イン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）によって作った。ブラ
ント末端化ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化せしめ、そし
て一本鎖Ｆｖ−ＥＴＡ遺伝子フラグメントが単離された
（Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ：１９１６bp，Ｆｖ（ＦＷ
Ｐ５１）−ＥＴＡ：１９１６bp）。ｐＦＬＡＧ−１プラ
スミドＤＮＡをＨｉｎｄIII により消化し、前記の通り
にブラント末端を作り、得られるＤＮＡフラグメントを
単離し、そしてＥｃｏＲＩにより消化せしめた。ブラン
ト末端／ＥｃｏＲＩ Ｆｖ−ＥＴＡ融合遺伝子フラグメ
ントを改質ｐＦＬＡＧプラスミドＤＮＡに挿入した。こ
れによりＦｖ−ＥＴＡフラグメントはｐＦＬＡＧ−１の
ｏｍｐＡシグナル配列とフレーム内において融合され、
Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（配列番号１０）の発現のた
めのプラスミドｐＷＷ２１５−５及びＦｖ（ＦＷＰ５
１）−ＥＴＡ（配列番号１１）の発現のためのプラスミ
ドｐＷＷ２１５−５１が得られた。
【０１９６】例１４．Ｅ．コリ由来のＦｖ（ＦＲＰ５）
−ＥＴＡ及びＦｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴＡの発現並びに
単離 １４．１ 全リゼートの調製 プラスミドｐＷＷ２１５−５及びｐＷＷ２１５−５１を
標準的な方法（例９．１参照）に従ってＥ．コリ株ＣＣ
１１８に形質転換せしめた。単一のコロニーを採取し、
そして１００μｇ／mlのアンピシリン及び０．４％のグ
ルコースを含むＬＢ培地中において一夜増殖せしめた。
この一夜培養物を、アンピシリン及びグルコースを含む
新鮮なＬＢ培地中において１：３０に希釈し、そして
０．５のＯＤ550 となる迄３７℃で増殖せしめた。この
時点で、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ及びＦｖ（ＦＷＰ５
１）−ＥＴＡ遺伝子の発現をＩＰＴＧの最終濃度０．５
mM迄の添加により誘発せしめ、そしてこの細胞を更に３
０分間増殖させた。遠心によりこの細胞を集め、そして
ＰＢＳ／１mMのＣａＣｌ2 中において超音波処理により
溶解せしめた。このリゼートを２５，０００ｇ、４℃、
４５分間の超遠心により清浄化せしめた。この上清液を
集めた。
【０１９７】１４．２ アフィニティークロマトグラフ
ィーによるＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ及びＦｖ（ＦＷＰ
５１）−ＥＴＡの単離 ６６．４KDa のＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ又は６６．３
KDa のＦｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴＡタンパク質を含む透
明なＥ．コリリゼートをＭ１モノクローナル抗体アフィ
ニティーカラム（ＩＢＩ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
に通過させた。このカラムをＰＢＳ／１mMのＣａＣｌ2
により３回洗浄した。結合したＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴ
Ａ又はＦｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴＡタンパク質をＰＢＳ
／２mMのＥＤＴＡにより溶出させた。これらの画分をＦ
ｖ−ＥＴＡタンパク質の存在について、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びウサギにおいて作られた抗−外毒素Ａ抗血清を用
いるイムノブロッティング（例１．３．２参照）により
モニターした。
【０１９８】例１５．Ｆｖ（ＦＲＰ５）ＥＴＡ及びＦｖ
（ＦＷＰ５１）ＥＴＡによる、ｃ−ｅｒｂＢ−２発現性
細胞におけるタンパク質合成の選択的な阻害 試験管内においては、組換免疫毒素Ｆｖ（ＦＲＰ５）−
ＥＴＡ及びＦｖ（ＦＷＰ５１）−ＥＴＡは、ヒトｃ−ｅ
ｒｂＢ−２タンパク質を高レベルで発現する細胞のタン
パク質合成及び増殖を選択的に阻害する。この免疫毒素
は、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を全く又はわずか
にしか発現しない細胞には影響を及ばさない。
【０１９９】１５．１ 細胞系の免疫毒素処理 ヒトの胸部及び卵巣腫瘍細胞系、ＳＫ−ＢＲ３，ＭＤＡ
ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４５３，ＨＴＢ７７；マ
ウス乳腺内皮細胞系ＨＣ１１及びヒトｃ−ｅｒｂＢ−２
ｃＤＮＡを感染せしめたＨＣ１１細胞を４８穴組織培
養プレート（ｃｏｓｔａｒ）上に、１０５5 個の細胞／
ウエルの密度にてまいた。４時間後、この培地を除去
し、そしてＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ又はＦｖ（ＦＷＰ
５１）−ＥＴＡを１〜１０００ng／mlの種々の濃度で含
む正常成育培地と交換した。この細胞を毒素融合タンパ
ク質と１６時間インキュベートした。
【０２００】１５．２ 細胞の 3Ｈ−ロイシン標識 免疫毒素処理細胞を２回洗浄し、そして４μCiの 3Ｈ−
ロイシン／ml含有正常成育培地中で４時間にわたり増殖
せしめた。この標識細胞を２回洗浄し、そして 3Ｈ−ロ
イシン標識全タンパク質をワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）ＧＦＣフィルター上に、ＴＣＡ沈殿により集めた。
免疫毒素処理細胞中のタンパク質合成速度を未処理コン
トロール細胞との比較において測定した。
【０２０１】例１６．Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ並びに
ＭＡｂ ＦＷＰ５１及びＦＳＰ７７のヌードマウスにお
けるｃ−ｅｒｂＢ−２発現性細胞の増殖の阻害 ｃ−ｅｒｂＢ−２発現性細胞の注射された動物へのＦｖ
（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ並びにＭＡｂ ＦＷＰ５１及びＦ
ＳＰ７７の投与は、これらの細胞の腫瘍増殖を阻害す
る。
【０２０２】１６．１ ヌードマウス腫瘍標品 ＮＩＨ／３Ｔ３マウス繊維芽細胞系を、点突然変異せし
めた活性化ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を発現する
プラスミド（Ｍａｓｕｋｏら、Ｊｐｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ． ８０：１０，１９８９）及び薬剤Ｇ４１８へ
の耐性のための遺伝子をコード化するプラスミドｐＳＶ
２ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． １：３２７，１９８２）によ
り、常用の先に詳細された方法（Ｇｒａｈａｍとｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１
９７３）に従って感染せしめた。感染細胞を５００μｇ
／mlのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｅｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ）を含む培地中で２週間選別せしめた。常用のタン
パク質ブロッティング技術（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３
５０，１９７９）を利用して、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２タ
ンパク質の発現性について個々のクローンを選別及び分
析した。中間レベルの点突然変異ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２
タンパク質を発現するクローン（クローン３．７）を選
択し、そしてヌードマウスにおける増殖について試験し
た。０．２mlのＰＢＳに懸濁せしめた２〜５×１０６個
のクローン３．７細胞（１動物当り）を雌Ｂａｌｂ／ｃ
ヌードマウスのわき腹に皮下注射した。２×１０６個の
細胞の投与量で注射した３．７細胞はヌードマウスにお
いて迅速に腫瘍を形成せしめた（コントロール動物、例
１６．２参照）。
【０２０３】１６．２ 動物の免疫毒素処理 ２×１０６個のクローン３．７細胞をヌードマウスに皮
下注射せしめた。この動物をＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ
により全体で７日間にわたり連続的に処理せしめた。２
００μｌのＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（ＰＢＳ中にて濃
度３５μｇ／ml）をこの動物に皮下的に内植された浸透
圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ小型浸透圧ポンプ、２００１型、
Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，＃９４３０３−
０８０２）に、クローン３．７細胞を注射すると同時に
入れた。このポンプは連続的にＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴ
Ａを放出し、そして各動物に７日間にわたり１μｇ／日
導入する。コントロール動物（例１６．１参照）と比較
して、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは腫瘍の形成の開始を
遅らせる。
【０２０４】１６．３ 動物のＭＡｂ処置 ５×１０６個のクローン３．７細胞をヌードマウスに皮
下注射した。このクローン３．７細胞の注射と同日に、
この動物を毎日、１０日間にわたり、ＭＡｂＦＷＰ５１
又はＭＡｂ ＦＳＰ７７のいづれかにより処置した（Ｍ
Ａｂの投与量は５０μｇ／２００μｌのＢＳＳ／日であ
る）。このＭＡｂはマウスの尾の血管に静脈内注射し
た。両方の抗体共、腫瘍の増殖の開始を遅らせた。これ
らに比べ、腫瘍増殖の阻害における相剰的な作用が両抗
体ＭＡｂ ＦＷＰ５１及びＭＡｂＦＳＰ７７の同時投与
において観察された。
【０２０５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：361 配列の型：核酸 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ（Escherichia Coli） クローン名：pMZ 16/1 配列の特徴 特徴：VH1 BACKプライマー領域 存在位置：６..27 特徴：CDR1H 存在位置：95..109 特徴：CDR2H 存在位置：152..202 特徴：CDR3H 存在位置：299..328 特徴：VH1 FOR プライマー領域 存在位置：329..361 他の情報：モノクローナル抗体FPR5の重鎖可変ドメイン
遺伝子 配列： TCTAGAGGTG AAACTGCAGC AGTCTGGACC TGAACTGAAG AAGCCTGGAG 50 AGACAGTCAA GATCTCCTGC AAGGCCTCTG GGTATCCTTT CACAAACTAT 100 GGAATGAACT GGGTGAAGCA GGCTCCAGGA CAGGGTTTAA AGTGGATGGG 150 CTGGATTAAC ACCTCCACTG GAGAGTCAAC ATTTGCTGAT GACTTCAAGG 200 GACGGTTTGA CTTCTCTTTG GAAACCTCTG CCAACACTGC CTATTTGCAG 250 ATCAACAACC TCAAAAGTGA AGACATGGCT ACATATTTCT GTGCAAGATG 300 ATCAACAACC TCAAAAGTGA AGACATGGCT ACATATTTCT GTGCAAGATG 300 GGAGGTTTAC CACGGCTACG TTCCTTACTG GGGCCAAGGG ACCACGGTCA 350 CCGTCTCCTC A 361
【０２０６】配列番号：２ 配列の長さ：407 配列の型：核酸 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pMZ 18/1 配列の特徴 特徴：MCK2プライマー領域 存在位置：６..28 特徴：CDR1L 存在位置：98..130 特徴：CDR2L 存在位置：176..196 特徴：CDR3L 存在位置：293..319 特徴：MCK2プライマー領域 存在位置：374..404 他の情報：モノクローナル抗体のカッパー軽鎖可変ドメ
イン遺伝子 配列： TCTAGTCACT GGATGGTGGG AAGATGGAGA CATTGTGATG ACCCAGTCTC 50 ACAAATTCCT GTCCACTTCA GTAGGAGACA GGGTCAGCAT CACCTGCAAG 100 GCCAGTCAGG ATGTGTATAA TGCTGTTGCC TGGTATCAAC AGAAACCAGG 150 ACAATCTCCT AAACTTCTGA TTTACTCGGC ATCCTCCCGG TACACTGGAG 200 TCCCTTCTCG CTTCACTGGC AGTGGCTCTG GGCCGGATTT CACTTTCACC 250 ATCAGCAGTG TGCAGGCTGA AGACCTGGCA GTTTATTTCT GTCAGCAACA 300 TTTTCGTACT CCATTCACGT TCGGCTCGGG GACAAAATTG GAAATAAAAC 350 GGGCTGATGC TGCACCAACT GTATCCATCT TCCCACCATC CAGTGACTAG 400 AACTAGA 407
【０２０７】配列番号：３ 配列の長さ：175 配列の型：核酸 配列の種類：プラスミドDNA 起源 生物名：完全合成 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 19 配列の特徴 特徴：Pst 部位 存在位置：30..35 特徴：Bst EII 部位（重鎖可変ドメインのサブクローン
化のため） 存在位置：38..44 特徴：(Gly Gly Gly Gly Ser)3リンカー遺伝子配列 存在位置：54..98 特徴：Pvu II部位 存在位置：105..110 特徴：Bgl II部位 存在位置：112..117 特徴：Bcl I 部位（軽鎖可変ドメインのサブクローン化
のため） 存在位置：120..125 配列： AAGCTTGCAT GCAAGCTTCT CAGGTACAAC TGCAGGAGGT CACCGTTTCC 50 TCTGGCGGTG GCGGTTCTGG TGGCGGTGGC TCCGGCGGTG GCGGTTCTGA 100 CATCCAGCTG GAGATCTAGC TGATCAAAGC TCTAGAGGAT CCCCGGGTAC 150 CGAGCTCGAA TTCACTGGCC GTCGT 175
【０２０８】配列番号：４ 配列の長さ：748 配列の型：核酸及び相補タンパク質 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 52 配列の特徴 特徴：合成スペーサー 存在位置：１..８ 特徴：FRP5重鎖可変ドメイン 存在位置：９..365 特徴：CDR1H 存在位置：99..113 特徴：CDR2H 存在位置：156..206 特徴：CDR3H 存在位置：303..332 特徴：リンカー配列（15個のアミノ酸） 存在位置：366..410 特徴：FRP5軽鎖可変ドメイン 存在位置：411..728 特徴：CDR1L 存在位置：480..512 特徴：CDR2L 存在位置：558..578 特徴：CDR3L 存在位置：675..701 他の情報：成長因子リセプターc-erbB-2の細胞外ドメイ
ンに結合性の、Fv重鎖／軽鎖可変ドメイン融合タンパク
質 配列： AAGCT TCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG AAG 44 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys 5 10 AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCC TCT GGG TAT 89 Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 15 20 25 CCT TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA 134 Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly 30 35 40 CAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATT AAC ACT TCC ACT GGA GAG 179 Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu 45 50 55 TCA ACA TTT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GAC TTC TCT TTG 224 Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu 60 65 70 GAA ACC TCT GCC AAC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA 269 Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys 75 80 85 AGT GAA GAC ATG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AGA TGG GAG GTT TAC 314 Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr 90 95 100 CAC GGC TAC GTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT 359 His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 105 110 115 TCC TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC 404 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 120 125 130 GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CAC AAA TTC CTG TCC ACT 449 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr 135 140 145 TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT 494 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 150 155 160 GTG TAT AAT GCT GTT GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT 539 Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 165 170 175 CCT AAA CTT CTG ATT TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT GGA GTC 584 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val 180 185 190 CCT TCT CGC TTC ACT GGC AGT GGC TCT GGG CCG GAT TTC ACT TTC 629 Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe 195 200 205 ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT 674 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 210 215 220 CAG CAA CAT TTT CGT ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAA 719 Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 225 230 235 TTG GAG ATC TAGCTGATCA AAGCTCTAGA 748 Leu Glu Ile 240
【０２０９】配列番号：５ 配列の長さ：2233 配列の型：核酸及び相補タンパク質 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス及びエッシェリヒア コリ 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 616 配列の特徴 特徴：ompA 5′非コード化領域 存在位置：１..22 特徴：ompAシグナルペプチド 存在位置：23..85 特徴：FRP5重鎖可変ドメイン 存在位置：89..445 特徴：リンカー配列（15個のアミノ酸） 存在位置：446..490 特徴：FRP5軽鎖可変ドメイン 存在位置：491..814 特徴：phoAコード化領域 存在位置：815..2155 特徴：phoA 3′非コード化領域 存在位置：2156..2233 他の情報：成長因子リセプターc-erbB-2に結合性の、Fv
重鎖／軽鎖可変ドメイン及びアルカリホスファターゼ融
合タンパク質、Fv(FRP5)-phoA 配列： TCTAGATAAC GAGGCGCAAA AA ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA 49 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala -20 -15 GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAA GCT TCT CAG GTA 94 Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ser Gln Val -10 -5 1 CAA CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA 139 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 5 10 15 GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCC TCT GGG TAT CCT TTC ACA AAC TAT 184 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA CAG GGT TTA AAG TGG 229 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp 35 40 45 ATG GGC TGG ATT AAC ACC TCC ACT GGA GAG TCA ACA TTT GCT GAT 274 Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp 50 55 60 GAC TTC AAG GGA CGG TTT GAC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AAC 319 Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn 65 70 75 ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AGT GAA GAC ATG GCT 364 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala 80 85 90 ACA TAT TTC TGT GCA AGA TGG GAG GTT TAC CAC GGC TAC GTT CCT 409 Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro 95 100 105 TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT TCC TCT GGC GGT GGC 454 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 110 115 120 GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATC CAG 499 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 125 130 135 CTG ACC CAG TCT CAC AAA TTC CTG TCC ACT TCA GTA GGA GAC AGG 544 Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 140 145 150 GTC AGC ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG TAT AAT GCT GTT 589 Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val 155 160 165 GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT AAA CTT CTG ATT 634 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 170 175 180 TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT GGA GTC CCT TCT CGC TTC ACT 679 Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr 185 190 195 GGC AGT GGC TCT GGG CCG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC AGT GTG 724 Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val 200 205 210 CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG CAA CAT TTT CGT 769 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe Arg 215 220 225 ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAA TTG GAG ATC AAA GCT 814 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala 230 235 240 CTA GAG CCT GTT CTG GAA AAC CGG GCT GCT CAG GGC GAT ATT ACT 859 Leu Glu Pro Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr 245 250 255 GCA CCC GGC GGT GCT CGC CGT TTA ACG GGT GAT CAG ACT GCC GCT 904 Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala 260 265 270 CTG CGT GAT TCT CTT AGC GAT AAA CCT GCA AAA AAT ATT ATT TTG 949 Leu Arg Asp Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu 275 280 285 CTG ATT GGC GAT GGG ATG GGG GAC TCG GAA ATT ACT GCC GCA CGT 994 Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg 290 295 300 AAT TAT GCC GAA GGT GCG GGC GGC TTT TTT AAA GGT ATA GAT GCC 1039 Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp Ala 305 310 315 TTA CCG CTT ACC GGG CAA TAC ACT CAC TAT GCG CTG AAT AAA AAA 1084 Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys 320 325 330 ACC GGC AAA CCG GAC TAC GTC ACC GAC TCG GCT GCA TCA GCA ACC 1129 Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr 335 340 345 GCC TGG TCA ACC GGT GTC AAA ACC TAT AAC GGC GCG CTG GGC GTC 1174 Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val 350 355 360 GAT ATT CAC GAA AAA GAT CAC CCA ACG ATT CTG GAA ATG GCA AAA 1219 Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala Lys 365 370 375 GCC GCA GGT CTG GCG ACC GGT AAC GTT TCT ACC GCA GAG TTG CAG 1264 Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln 380 385 390 GAT GCC ACG CCC GCT GCG CTG GTG GCA CAT GTG ACC TCG CGC AAA 1309 Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys 395 400 405 TGC TAC GGT CCG AGC GCG ACC AGT GAA AAA TGT CCG GGT AAC GCT 1354 Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro Gly Asn Ala 410 415 420 CTG GAA AAA GGC GGA AAA GGA TCG ATT ACC GAA CAG CTG CTT AAC 1399 Leu Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn 425 430 435 GCT CGT GCC GAC GTT ACG CTT GGC GGC GGC GCA AAA ACC TTT GCT 1444 Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala 440 445 450 GAA ACG GCA ACC GCT GGT GAA TGG CAG GGA AAA ACG CTG CGT GAA 1489 Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu 455 460 465 CAG GCA CAG GCG CGT GGT TAT CAG TTG GTG AGC GAT GCT GCC TCA 1534 Gln Ala Gln Ala Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser 470 475 480 CTG AAT TCG GTG ACG GAA GCG AAT CAG CAA AAA CCC CTG CTT GGC 1579 Leu Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly 485 490 495 CTG TTT GCT GAC GGC AAT ATG CCA GTG CGC TGG CTA GGA CCG AAA 1624 Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys 500 505 510 GCA ACG TAC CAT GGC AAT ATC GAT AAG CCC GCA GTC ACC TGT ACG 1669 Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr 515 520 525 CCA AAT CCG CAA CGT AAT GAC AGT GTA CCA ACC CTG GCG CAG ATG 1714 Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala Gln Met 530 535 540 ACC GAC AAA GCC ATT GAA TTG TTG AGT AAA AAT GAG AAA GGC TTT 1759 Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly Phe 545 550 555 TTC CTG CAA GTT GAA GGT GCG TCA ATC GAT AAA CAG GAT CAT GCT 1804 Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asp His Ala 560 565 570 GCG AAT CCT TGT GGG CAA ATT GGC GAG ACG GTC GAT CTC GAT GAA 1849 Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu 575 580 585 GCC GTA CAA CGG GCG CTG GAA TTC GCT AAA AAG GAG GGT AAC ACG 1894 Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr 590 595 600 CTG GTC ATA GTC ACC GCT GAT CAC GCC CAC GCC AGC CAG ATT GTT 1939 Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile Val 605 610 615 GCG CCG GAT ACC AAA GCT CCG GGC CTC ACC CAG GCG CTA AAT ACC 1984 Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr 620 625 630 AAA GAT GGC GCA GTG ATG GTG ATG AGT TAC GGG AAC TCC GAA GAG 2029 Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu 635 640 645 GAT TCA CAA GAA CAT ACC GGC AGT CAG TTG CGT ATT GCG GCG TAT 2074 Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr 650 655 660 GGC CCG CAT GCC GCC AAT GTT GTT GGA CTG ACC GAC CAG ACC GAT 2119 Gly Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp 665 670 675 CTC TTC TAC ACC ATG AAA GCC GCT CTG GGG CTG AAA TAAAACCGCG 2165 Leu Phe Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys 680 685 690 CCCGGCAGTG AATTTTCGCT GCCGGGTGGT TTTTTTGCTG TTAGCAACCA 2215 GACTTAATGG CAGAGCTC 2233
【０２１０】配列番号：６ 配列の長さ：342 配列の型：核酸 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW15-VH51-1 配列の特徴 特徴：VH1 BACKプライマー領域の部分配列 存在位置：１..14 特徴：CDR1H 存在位置：82..96 特徴：CDR2H 存在位置：139..189 特徴：CDR3H 存在位置：286..318 特徴：VH1 FOR プライマー領域の部分配列 存在位置：317..342 他の情報：モノクローナル抗体FWP51 の重鎖可変ドメイ
ン遺伝子 配列： CTGCAGCAGT CTGGGGCTGA GCTGGTGAGG CCTGGGACTT CAGTGAAGCT 50 GTCCTGCAAG GCTTCTGATT ACACCTTCAC CAGCTACTGG ATGAACTGGG 100 TGAAGCAGAG GCCTGGACAA GGCCTTGAAT GGATTGGTAT GATTGATCCT 150 TCAGACAGTG AAACTCAATA CAATCAAATG TTCAAGGACA AGGCCGCATT 200 GACTGTAGAC AAGTCCTCCA ATACAGCCTA CATGCAACTC AGCAGCCTGA 250 CATCTGAGGA CTCTGCGGTC TATTACTGTG CAAAAGGGGG GGCCTCTGGG 300 GACTGGTACT TCGATGTCTG GGGCCAAGGG ACCACGGTCA CC 342
【０２１１】配列番号：７ 配列の長さ：310 配列の型：核酸 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW15-VL51-1 配列の特徴 特徴：VK1 BACKプライマー領域の部分配列 存在位置：１..18 特徴：CDR1L 存在位置：64..96 特徴：CDR2L 存在位置：142..162 特徴：CDR3L 存在位置：259..282 特徴：VK1 FOR プライマー領域の部分配列 存在位置：292..310 他の情報：モノクローナル抗体FWP51 の軽鎖可変ドメイ
ン遺伝子 配列： CAGCTGACCC AGTCTCCATC CTCACTGTCT GCATCTCTGG GAGGCGAAGT 50 CACCATCACT TGCAAGGCAA GCCAAGACAT TAAGAAGTAT ATAGCTTGGT 100 ACCAACACAA GCCTGGAAAA AGTCCTCGGC TACTCATACA CTACACATCT 150 GTATTACAGC CAGGCATCCC ATCCAGGTTC AGTGGAAGTG GGTCTGGGAG 200 AGATTATTCC TTCAGCATCC ACAACCTGGA GCCTGAAGAT ATTGCAACTT 250 ATTATTGTCT ACATTATGAT TATCTGTACA CGTTCGGAGG GGGCACCAAG 300 CTGGAGATCT 310
【０２１２】配列番号：８ 配列の長さ：748 配列の型：核酸及び相補タンパク質 配列の種類：plasmid DNA ORIGINAL 起源 生物名：マウス 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW15-Fv51 配列の特徴 特徴：合成スペーサー 存在位置：１..８ 特徴：FWP51 重鎖可変ドメイン 存在位置：９..368 特徴：CDR1H 存在位置：99..113 特徴：CDR2H 存在位置：156..206 特徴：CDR3H 存在位置：303..335 特徴：合成スペーサー 存在位置：369..413 特徴：FWP51 軽鎖可変ドメイン 存在位置：414..728 特徴：CDR1L 存在位置：483..515 特徴：CDR2L 存在位置：561..581 特徴：CDR3L 存在位置：678..701 特徴：合成スペーサー 存在位置：729..748 他の情報：モノクローナル抗体FWP51 重鎖及びカッパー
軽鎖可変ドメインcDNAを含んで成る一本鎖Fv融合遺伝子 配列： AAGCT TCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GTG 44 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val 1 5 10 AGG CCT GGG ACT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GAT TAC 89 Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr 15 20 25 ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA 134 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 30 35 40 CAA GGC CTT GAA TGG ATT GGT ATG ATT GAT CCT TCA GAC AGT GAA 179 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu 45 50 55 ACT CAA TAC AAT CAA ATG TTC AAG GAC AAG GCC GCA TTG ACT GTA 224 Thr Gln Tyr Asn Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Ala Leu Thr Val 60 65 70 GAC AAG TCC TCC AAT ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA 269 Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 75 80 85 TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AAA GGG GGG GCC TCT 314 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Ala Ser 90 95 100 GGG GAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC 359 Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 105 110 115 GTT TCC TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT 404 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 120 125 130 GGC GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT 449 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 135 140 145 GCA TCT CTG GGA GGC GAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG GCA AGC CAA 494 Ala Ser Leu Gly Gly Glu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 150 155 160 GAC ATT AAG AAG TAT ATA GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT GGA AAA 539 Asp Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys 165 170 175 AGT CCT CGG CTA CTC ATA CAC TAC ACA TCT GTA TTA CAG CCA GGC 584 Ser Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Val Leu Gln Pro Gly 180 185 190 ATC CCA TCC AGG TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC 629 Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser 195 200 205 TTC AGC ATC CAC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT 674 Phe Ser Ile His Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 TGT CTA CAT TAT GAT TAT CTG TAC ACG TTC GGA GGG GGC ACC AAG 719 Cys Leu His Tyr Asp Tyr Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 CTG GAG ATC TAGCTGATCA AAGCTCTAGA 748 Leu Glu Ile 240
【０２１３】配列番号：９ 配列の長さ：201 配列の型：核酸 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ PAK (Pseudomonas aeruginosa PAK) 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 22 配列の特徴 特徴：合成スペーサー 存在位置：１..27 特徴：外毒素Ａ配列の核酸位置1574〜1747に相補性の部
分外毒素Ａ配列 (Gray ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2645, 198
4) 存在位置：29..201 他の情報：シュードモナス アエルギノーザ PAK由来の
突然変異外毒素Ａ遺伝子 AAGCTTAAGG AGATCTGCAT GCTTCTAGAG GGCGGCAGCC TGGCCGCGCT 50 GACCGCGCAC CAGGCCTGCC ACCTGCCGCT GGAGACTTTC ACCCGTCATC 100 GCCAGCCGCG CGGCTGGGAA CAACTGGAGC AGTGCGGCTA TCCGGTGCAG 150 CGGCTGGTCG CCCTCTACCT GGCGGCGCGA CTGTCATGGA ACCAGGTCGA 200 C 201
【０２１４】配列番号：10 配列の長さ：2012 配列の型：核酸及び相補タンパク質 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス／Ｐ．アエルギノーザ 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 215-5 配列の特徴 特徴：ompAシグナルペプチド 存在位置：１..63 特徴：FLAGペプチド及びエンテロキナーゼ切断部位 存在位置：64..87 特徴：FRP5重鎖可変ドメイン 存在位置：97..453 特徴：リンカー配列（15個のアミノ酸） 存在位置：454..498 特徴：FRP5軽鎖可変ドメイン 存在位置：499..822 特徴：外毒素Ａコード化領域（成熟外毒素Ａのアミノ酸
252〜613 をコード化） 存在位置：826..1911 特徴：外毒素Ａの３′非コード化領域 存在位置：1912..2012 他の情報：c-erbB-2タンパク質結合性の、Fv重鎖／軽鎖
可変ドメイン及び外毒素Ａ融合タンパク質、Fv(FRP5)-E
TA 配列： ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC 45 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe -30 -25 -20 GCT ACC GTT GCG CAA GCT GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CTA 90 Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu -15 -10 -5 GCT TCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG AAG AAG 135 Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 1 5 10 CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCC TCT GGG TAT CCT 180 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro 15 20 25 TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA CAG 225 Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln 30 35 40 GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATT AAC ACC TCC ACT GGA GAG TCA 270 Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser 45 50 55 ACA TTT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GAC TTC TCT TTG GAA 315 Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu 60 65 70 ACC TCT GCC AAC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AGT 360 Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser 75 80 85 GAA GAC ATG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AGA TGG GAG GTT TAC CAC 405 Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His 90 95 100 GGC TAC GTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT TCC 450 Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 105 110 115 TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC GGT 495 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 120 125 130 TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CAC AAA TTC CTG TCC ACT TCA 540 Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser 135 140 145 GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG 585 Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 150 155 160 TAT AAT GCT GTT GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT 630 Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 165 170 175 AAA CTT CTG ATT TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT GGA GTC CCT 675 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro 180 185 190 TCT CGC TTC ACT GGC AGT GGC TCT GGG CCG GAT TTC ACT TTC ACC 720 Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG 765 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln 210 215 220 CAA CAT TTT CGT ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAA TTG 810 Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 GAG ATC AAA GCT CTA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG 855 Glu Ile Lys Ala Leu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala 240 245 250 CAC CAG GCC TGC CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC 900 His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg 255 260 265 CAG CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG 945 Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val 270 275 280 CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCG GCG CGA CTG TCA TGG AAC 990 Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn 285 290 295 CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC 1035 Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser 300 305 310 GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC 1080 Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala 315 320 325 CGT CTG GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAG CGC TTC GTC 1125 Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val 330 335 340 CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG GCC AAC GCC GAC 1170 Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp 345 350 355 GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC GCG GGC 1215 Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly 360 365 370 CCG GCG GAC AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACT 1260 Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr 375 380 385 GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC 1305 Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr 390 395 400 CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC 1350 Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 405 410 415 CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC 1395 Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly 420 425 430 ACC TTC CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC 1440 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg 435 440 445 GCG CGC AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC 1485 Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile 450 455 460 GCC GGC GAT CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA 1530 Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu 465 470 475 CCC GAC GCA CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC 1575 Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val 480 485 490 TAT GTG CCG CGC TCG AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG 1620 Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu 495 500 505 ACC CTG GCC GCG CCG GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC 1665 Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 510 515 520 GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG 1710 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu 525 530 535 GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC 1755 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala 540 545 550 GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC 1800 Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg 555 560 565 AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCC GAC AAG GAA 1845 Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu 570 575 580 CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCC GGC AAA 1890 Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys 585 590 595 CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA CTGCCGCGAC CGGCCGGCTC 1934 Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 600 605 CCTTCGCAGG AGCCGGCCTT CTCGGGGCCT GGCCATACAT CAGGTTTTCC 1984 TGATGCCAGC CCAATCGAAT ATGAATTC 2012
【０２１５】配列番号：11 配列の長さ：2012 配列の型：核酸及び相補タンパク質 配列の種類：plasmid DNA 起源 生物名：マウス／Ｐ．アエルギノーザ 直接の起源 生物名：エッシェリヒア コリ クローン名：pWW 215-51 配列の特徴 特徴：ompAシグナルペプチド 存在位置：１..63 特徴：FLAGペプチド及びエンテロキナーゼ切断部位 存在位置：64..87 特徴：FWP51 重鎖可変ドメイン 存在位置：97..456 特徴：FWP51 軽鎖可変ドメイン 存在位置：502..822 特徴：外毒素Ａ遺伝子コード化領域（成熟外毒素Ａのア
ミノ酸 252〜613 をコード化） 存在位置：826..1911 特徴：外毒素Ａ遺伝子の３′非コード化領域 存在位置：1912..2012 他の情報：c-erbB-2タンパク質に結合性のFw重鎖／軽鎖
可変ドメイン及び外毒素Ａ融合タンパク質、Fv(FWP51)-
ETA 配列： ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC 45 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe -30 -25 -20 GCT ACC GTT GCG CAA GCT GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CTA 90 Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu -15 -10 -5 GCT TCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GTG AGG 135 Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 1 5 10 CCT GGG ACT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GAT TAC ACC 180 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr 15 20 25 TTC ACC AGC TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA 225 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 30 35 40 GGC CTT GAA TGG ATT GGT ATG ATT GAT CCT TCA GAC AGT GAA ACT 270 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr 45 50 55 CAA TAC AAT CAA ATG TTC AAG GAC AAG GCC GCA TTG ACT GTA GAC 315 Gln Tyr Asn Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Ala Leu Thr Val Asp 60 65 70 AAG TCC TCC AAT ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT 360 Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 75 80 85 GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AAA GGG GGG GCC TCT GGG 405 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Ala Ser Gly 90 95 100 GAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT 450 Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 105 110 115 TCC TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC 495 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 120 125 130 GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA 540 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 135 140 145 TCT CTG GGA GGC GAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG GCA AGC CAA GAC 585 Ser Leu Gly Gly Glu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 150 155 160 ATT AAG AAG TAT ATA GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT GGA AAA AGT 630 Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ser 165 170 175 CCT CGG CTA CTC ATA CAC TAC ACA TCT GTA TTA CAG CCA GGC ATC 675 Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Val Leu Gln Pro Gly Ile 180 185 190 CCA TCC AGG TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC TTC 720 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe 195 200 205 AGC ATC CAC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT TGT 765 Ser Ile His Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 CTA CAT TAT GAT TAT CTG TAC ACG TTC GGA GGG GGC ACC AAG CTG 810 Leu His Tyr Asp Tyr Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 GAG ATC AAA GCT CTA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG 855 Glu Ile Lys Ala Leu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala 240 245 250 CAC CAG GCC TGC CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC 900 His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg 255 260 265 CAG CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG 945 Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val 270 275 280 CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCG GCG CGA CTG TCA TGG AAC 990 Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn 285 290 295 CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC 1035 Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser 300 305 310 GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC 1080 Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala 315 320 325 CGT CTG GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAG CGC TTC GTC 1125 Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val 330 335 340 CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG GCC AAC GCC GAC 1170 Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp 345 350 355 GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC GCG GGC 1215 Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly 360 365 370 CCG GCG GAC AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACT 1260 Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr 375 380 385 GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC 1305 Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr 390 395 400 CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC 1350 Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 405 410 415 CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC 1395 Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly 420 425 430 ACC TTC CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC 1440 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg 435 440 445 GCG CGC AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC 1485 Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile 450 455 460 GCC GGC GAT CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA 1530 Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu 465 470 475 CCC GAC GCA CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC 1575 Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val 480 485 490 TAT GTG CCG CGC TCG AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG 1620 Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu 495 500 505 ACC CTG GCC GCG CCG GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC 1665 Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 510 515 520 GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG 1710 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu 525 530 535 GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC 1755 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala 540 545 550 GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC 1800 Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg 555 560 565 AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCC GAC AAG GAA 1845 Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu 570 575 580 CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCC GGC AAA 1890 Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys 585 590 595 CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA CTGCCGCGAC CGGCCGGCTC 1934 Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 600 605 CCTTCGCAGG AGCCGGCCTT CTCGGGGCCT GGCCATACAT CAGGTTTTCC 1984 TGATGCCAGC CCAATCGAAT ATGAATTC 2012
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｐ 35/00 // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ Ａ６１Ｋ 39/395 33/577 Ｂ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｇ０１Ｎ 33/574 1:91 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 イナ−マリア ハルベルト ドイツ連邦共和国，7889 グレンツァッ ハ−ビーレン，イム ホルンライン 21 (72)発明者 ベルント グロナー スイス国，4059 バーゼル，レルヘンシ ュトラーセ ２ (72)発明者 ノルマン ハルドマン スイス国，4125 リーヘン，グシュタル テンラインベク 67／３ (72)発明者 マルクス ツビクル スイス国，4057 バーゼル，ドラーツグ シュトラーセ 62 (56)参考文献 特表 平２−500329（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−500005（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／006692（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/28 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 15/02 C12N 15/09 C12P 21/08 G01N 33/53 A61B 10/00 A61K 39/395 A61P 35/00 G01N 33/574 G01N 33/577 C12R 1:19 C12R 1:91 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン
    及び軽鎖可変ドメインを含んで成る成長因子リセプター
    ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特異的な一本鎖組
    換抗体を含んでなる融合タンパク質であって、ここで当
    該重鎖可変ドメインは配列番号４のアミノ酸配列２〜１
    ２０のポリペプチドを含んで成り、ここで任意的に該ア
    ミノ酸配列２〜３１（ＦＲ1 ）、３７〜５０（ＦＲ
    2 ）、６８〜９９（ＦＲ3 ）、及び／又は１１０〜１２
    ０（ＦＲ4 ）内の１、２、３もしくは４個の単独アミノ
    酸がその他のアミノ酸により置換されているか、あるい
    は欠失しており、そしてここでアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ
    架橋を形成する酸化状態にあり得、前記重鎖可変ドメイ
    ン及び軽鎖可変ドメインはポリペプチドスペーサーグル
    ープ及びエフェクター分子により連結されており、任意
    的に精製を促進せしめるペプチド、切断部位及びペプチ
    ドスペーサーを含んで成る、融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 前記重鎖可変ドメインが配列番号４のア
    ミノ酸配列２〜１２０のポリペプチドを含んで成り、そ
    してアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態に
    ありうる、請求項１記載の融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 前記軽鎖可変ドメインが配列番号４のア
    ミノ酸配列１３６〜２４１のポリペプチドを含んで成
    り、ここで任意的に該アミノ酸配列１３６〜１５８（Ｆ
    Ｒ6 ）、１７０〜１８４（ＦＲ7 ）、１９２〜２２３
    （ＦＲ8 ）及び／又は２３３〜２４１（ＦＲ9 ）内の
    １、２、３もしくは４個の単独アミノ酸がその他のアミ
    ノ酸により置換されているか、又は欠失しており、そし
    てここでアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状
    態にありうる、請求項１記載の融合タンパク質。
  4. 【請求項４】 前記軽鎖可変ドメインが配列番号４のア
    ミノ酸配列１３６〜２４１のポリペプチドを含んで成
    り、そしてここでアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成す
    る酸化状態にありうる、請求項１記載の融合タンパク
    質。
  5. 【請求項５】 モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン
    及び軽鎖可変ドメインを含んで成る成長因子リセプター
    ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特異的な一本鎖組
    換抗体を含んでなる融合タンパク質であって、ここで当
    該重鎖可変ドメインが配列番号８のアミノ酸配列２〜１
    ２１のポリペプチドを含んで成り、こ こで任意的に該ア
    ミノ酸配列２〜３１（ＦＲ 1 ）、３７〜５０（ＦＲ
    2 ）、６８〜９９（ＦＲ 3 ）、及び／又は１１１〜１２
    １（ＦＲ 4 ）内の１、２、３もしくは４個の単独アミノ
    酸がその他のアミノ酸により置換されているか、あるい
    は欠失しており、そしてここでアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ
    架橋を形成する酸化状態にあり得、前記重鎖可変ドメイ
    ン及び軽鎖可変ドメインはポリペプチドスペーサーグル
    ープ及びエフェクター分子により連結されており、任意
    的に精製を促進せしめるペプチド、切断部位及びペプチ
    ドスペーサーを含んで成る、融合タンパク質。
  6. 【請求項６】 前記重鎖可変ドメインが配列番号８のア
    ミノ酸配列２〜１２１のポリペプチドを含んで成り、こ
    こでアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ架橋を形成する酸化状態に
    ありうる、請求項５記載の融合タンパク質。
  7. 【請求項７】 前記軽鎖可変ドメインが配列番号８のア
    ミノ酸配列１３７〜２４１のポリペプチドを含んで成
    り、ここで任意的に該アミノ酸配列１３７〜１５９（Ｆ
    Ｒ6 ）、１７１〜１８５（ＦＲ7 ）、１９３〜２２４
    （ＦＲ8 ）及び／又は２３３〜２４１（ＦＲ9 ）内の
    １、２、３もしくは４個の単独アミノ酸がその他のアミ
    ノ酸により置換されているか、あるいは欠失しており、
    そしてここでアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸
    化状態にありうる、請求項５記載の融合タンパク質。
  8. 【請求項８】 前記軽鎖可変ドメインが配列番号８のア
    ミノ酸配列１３７〜２４１のポリペプチドを含んで成
    り、ここでアミノ酸ＣｙｓがＳ−Ｓ架橋を形成する酸化
    状態にありうる、請求項５記載の融合タンパク質。
  9. 【請求項９】 前記エフェクター分子が酵素又はその生
    物学的に活性な変異体である、請求項１〜８のいずれか
    １項記載の融合タンパク質。
  10. 【請求項１０】 前記酵素がアルカリホスファターゼ又
    はその生物学的に活性な変異体である、請求項９記載の
    融合タンパク質。
  11. 【請求項１１】 前記エフェクター分子が毒素又はその
    生物学的に活性な変異体である、請求項１〜８のいずれ
    か１項記載の融合タンパク質。
  12. 【請求項１２】 前記エフェクター分子がシュードモナ
    ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素又はその生物学的
    に活性な変異体である、請求項１１記載の融合タンパク
    質。
  13. 【請求項１３】 前記重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ド
    メインがマウスモノクローナル抗体ＦＲＰ５（ＥＣＡＣ
    Ｃ受託番号９０１１２１１５号）に由来する、請求項１
    記載の融合タンパク質。
  14. 【請求項１４】 前記重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ド
    メインがマウスモノクローナル抗体ＦＷＰ５１（ＥＣＡ
    ＣＣ受託番号９０１１２１１８）に由来する、請求項５
    記載の融合タンパク質。
  15. 【請求項１５】 配列番号５のアミノ酸配列２〜６９０
    のポリペプチドを含んで成る、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−ｐｈ
    ｏＡと命名された、請求項１記載の融合タンパク質。
  16. 【請求項１６】 配列番号１０のアミノ酸配列２〜６０
    ６のポリペプチドを含んで成る、Ｆｖ（ＦＲＰ５）−Ｅ
    ＴＡと命名された、請求項１記載の融合タンパク質。
  17. 【請求項１７】 配列番号１１のアミノ酸配列２〜６０
    ６のポリペプチドを含んで成る、Ｆｖ（ＦＷＰ５１）−
    ＥＴＡと命名された、請求項５記載の融合タンパク質。
  18. 【請求項１８】 モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイ
    ン及び軽鎖可変ドメインを含んで成る成長因子リセプタ
    ーｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに特異的な組換抗
    体を含んでなる融合タンパク質であって、ここで当該重
    鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインはＦＳＰ１６（Ｅ
    ＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１６号）及びＦＳＰ７７
    （ＥＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１７号）から成る群
    から選ばれるマウスモノクローナル抗体に由来し、ここ
    で当該ドメインはポリペプチドスペーサーグループ及び
    エフェクター分子により連結されており、任意的に精製
    を促進せしめるペプチド、切断部位及びペプチドスペー
    サーを含んで成る、融合タンパク質。
  19. 【請求項１９】 配列番号４において示すモノクローナ
    ル抗体ＦＲＰ５（ＥＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１５
    号）又は配列番号８において示すモノクローナル抗体Ｆ
    ＷＰ５１（ＥＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１８号）の
    重鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサート、又は
    該重鎖可変ドメインと相同性のアミノ酸配列をコードす
    るインサートを含んで成る、請求項１〜１７のいずれか
    １項記載の融合タンパク質をコードするインサートを含
    んで成る、組換ＤＮＡ。
  20. 【請求項２０】 配列番号４において示すモノクローナ
    ル抗体ＦＲＰ５（ＥＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１５
    号）又は配列番号８において示すモノクローナル抗体Ｆ
    ＷＰ５１（ＥＣＡＣＣ受託番号９０１１２１１８号）の
    軽鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサート、又は
    該軽鎖可変ドメインと相同性のアミノ酸配列をコードす
    るインサートを含んで成る、請求項１〜１７のいずれか
    １項記載の融合タンパク質をコードするインサートを含
    んで成る、組換ＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 複製起点又は自律複製配列、１もしく
    は複数のドミナント（優性）マーカー配列、並びに任意
    的に発現コントロール配列、シグナル配列及び更なる制
    限部位を更に含んで成るハイブリドベクターである、請
    求項１９又は２０記載の組換ＤＮＡ。
  22. 【請求項２２】 シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖ
    ｉｒｕｓ）プロモーター及びマウスＩｇのＨ又はＬ鎖エ
    ンハンサーを含んで成るハイブリドベクターである、請
    求項２１記載の組換ＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 請求項１９又は２０記載の組換ＤＮＡ
    の製造のための方法であって、以下の段階、 （ａ）適切なハイブリドーマ細胞系のゲノムからネズミ
    ＤＮＡを調製し、そして目的の特異性を有する抗体の重
    鎖及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする目的のＤＮ
    Ａを選別し、 （ｂ）目的のシグナル配列をコードするＤＮＡを調製
    し、及びエフェクター分子をコードするＤＮＡを調製
    し、 （ｃ）化学的方法により、目的のスペーサーグループを
    コードするＤＮＡを合成し、 （ｄ）段階（ａ）及び（ｂ）、並びに任意的に（ｃ）の
    ＤＮＡを適切なハイブリドベクターに組入れることによ
    り、該癒合タンパク質をコードする組換遺伝子を構築
    し、 （ｅ）得られるハイブリドベクターを感受性宿主細胞に
    移し入れるか、又は該組換遺伝子をコードするＤＮＡを
    回収し、そして結合していないＤＮＡを感受性宿主細胞
    に移し入れ、 （ｆ）形質転換せしめた宿主細胞を選別及び培養し、そ
    して （ｇ）任意的に目的のＤＮＡを単離すること、 を含んで成る方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１９又は２０記載の組換ＤＮＡ
    により形質転換されている宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 前記宿主細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌ
    ｉ）の株の細胞である、請求項２４記載の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 適切な感受性細胞を請求項１９又は２
    ０記載のＤＮＡインサート、複製起点又は自律複製配
    列、１もしくは複数のドミナントマーカー配列、並びに
    任意的に、発現コントロール配列、シグナル配列及び更
    なる制限部位を含んで成るハイブリドベクターにより形
    質転換せしめ、そして該形質転換細胞を選別せしめる、
    請求項２４記載の形質転換細胞の製造のための方法。
  27. 【請求項２７】 成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２
    の定性及び定量測定のための方法であって、請求項１〜
    １８のいずれか1項記載の融合タンパク質を利用するこ
    とを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 検出可能な酵素を含んで成る前記融合
    タンパク質を含む溶液による組織切片の免疫染色を含ん
    で成る、請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜１８のいずれか1項記載の
    融合タンパク質を含んで成る、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパ
    ク質の定性及び定量測定のための検査キット。
  30. 【請求項３０】 成長因子リセプターｃ−ｅｒｂＢ−２
    を過剰発現する腫瘍を処置するための薬理組成物であっ
    て、治療的に有効な量の請求項１〜１８のいずれか1項
    記載の融合タンパク質及び薬理学的に許容される担体を
    含んで成る薬理組成物。
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