JP2001517437A - リガンドホモログ - Google Patents
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Abstract
Description
のような核酸分子によってコードされるTIEリガンドホモログタンパク質、な
らびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法お
よび手段、ならびに開示されたTIEリガンドホモログを結合する抗体に関する
。
ーゼ含有IgおよびEGF相同性ドメイン」を表し、そして血管内皮細胞および
初期造血細胞でほぼ排他的に発現され、そしてEGF様ドメイン、および「免疫
グロブリン(IG)様」折り畳みと一般にいわれる鎖内ジスルフィド結合によっ
て安定化される細胞外折り畳みユニットの存在によって特徴づけられる、レセプ
ターチロシンキナーゼの新しいファミリーを示すために新しく作り出された。ヒ
ト白血病細胞からのチロシンキナーゼホモログcDNAフラグメント(tie)
は、Partanenら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 8
7,8913−8917(1990)に記載された。このヒト「tie」レセプ
ターのmRNAは、すべてのヒト胎児およびマウス胚組織で検出されており、そ
して心臓および血管内皮細胞に局在することが報告されている。Korhone
nら,Blood 80,2548−2555(1992);PCT出願公開公
報第WO 93/14124号(1993年7月22日公開)。「tie−1」
といわれるヒトtieのラットホモログは、Maisonpierreら,On
cogene 8,1631−1637(1993)によって同定された。「t
ie−2」と命名されたもう1つのtieレセプターは、もともとラットで同定
されたが(Dumontら,Oncogene 8,1293−1301(19
93))、「ork」といわれる、tie−2のヒトホモログは、米国特許第5
,447,860号(Ziegler)に記載された。tie−2のマウスホモ
ログは、もともと「tek」と称された。脳毛細管cDNAライブラリーからの
マウスtie−2レセプターのクローニングは、PCT出願公開公報第WO 9
5/13387号(1995年5月18日公開)に開示される。TIEレセプタ
ーは、新脈管形成に積極的に関与すると考えられ、そして造血においても役割を
果たし得る。
96/11269号(1996年4月18日公開)および米国特許第5,521
,073号(1996年5月28日公開)に記載されている。「htie−2リ
ガンド1」または「hTL1」と命名されたTIE−2リガンドをコードするλ
gt10と命名されたベクターは、ATCC受託番号75928で寄託されてい
る。「htie−2 2」または「hTL2」と命名されたもう1つのTIE−
2リガンドをコードするプラスミドは、ATCC受託番号75928で入手可能
である。この第2のリガンドは、TAI−2レセプターのアンタゴニストとして
記載されている。TIE−2レセプターについての分泌されたヒトおよびマウス
リガンドの同定は、Davisら,Cell 87,1161−1169(19
96)によって報告されている。新脈管形成および造血中の可能性のある作用に
おけるその役割を反映するために、「アンジポエチン−1」と命名したヒトリガ
ンドは、WO 96/11269において「htie−2 1」または「hTL
−1」と種々に命名されたリガンドと同じリガンドである。アンジオポエチン−
1は、後で脈管形成役割を果たし、そしてVEGFの役割とは異なることが記載
されている(Suriら,Cell 87,1171−1180(1996))
。TIE−2は、腫瘍増殖に必要な病理的な脈管形成中に明らかにアップレギュ
レートされるので(Kaipainenら,Cancer Res.54,65
71−6577(1994))、アンジオポエチン−1は、腫瘍脈管構造を特異
的に標的するためにさらに有用であることが示唆されている(Davisら,前
出)。
する。本発明はまた、このようなリガンドホモログまたはその機能的誘導体をコ
ードする単離された核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを提供
する。本発明はさらに、新規TIEリガンドホモログまたはその機能的誘導体を
産生するためにこのような核酸で形質転換された宿主細胞に関する。新規TIE
リガンドホモログは、公知または以後に発見された、TIEレセプターのアゴニ
ストまたはアンタゴニストであり得る。他の治療剤または診断剤のそれぞれのT
IEレセプターを発現する細胞への送達を含む、その治療または診断用途もまた
、本発明の範囲内である。
ストまたはアンタゴニスト抗体、およびこのような抗体の診断または治療用途を
提供する。
なTIEリガンドホモログを特異的に結合する抗体を含む組成物に関する。
療剤または細胞傷害性薬剤との結合体、およびこのような結合体を含む組成物に
関する。TIE−2レセプターは、腫瘍増殖に必要である病理的な脈管形成中に
アップレギュレートされることが報告されるので、本発明のTIEリガンドホモ
ログの細胞傷害性または他の抗腫瘍薬剤への結合体は、腫瘍血管系を特異的に標
的することにおける有用性を見いだし得る。
ドする遺伝子がある腫瘍細胞で増幅されることが見いだされている。したがって
、腫瘍の診断および処置のための組成物および方法もまた、本発明の範囲内であ
る。
定するための方法に関し、これは、このようなTIEリガンドホモログのTIE
レセプターへの結合を可能にする条件下で、本発明の検出可能に標識したTIE
リガンドホモログと細胞とを接触させる工程、およびこのような結合が実際に生
じたかどうかを決定する工程を包含する。
くとも1つの抗体と生物学的試料を接触させる工程、および形成したTIEリガ
ンドホモログ−抗体複合体の量を測定する工程によって、生物学的試料中の本発
明のTIEリガンドホモログの量を測定するための方法に関する。
の有効量で内皮細胞を処理する工程を包含する、内皮細胞増殖の阻害のための方
法に関する。
効量で内皮細胞を処理する工程を包含する、内皮細胞アポトーシスの誘導のため
の方法に関する。
胞を抗TIEリガンドホモログ抗体に曝露する工程、および抗体の細胞への結合
を決定する工程による、TIEリガンドホモログの存在を決定するための方法に
関する。
物から得られた組織細胞のテスト試料において、および(b)同じ細胞タイプの
公知の正常組織細胞のコントロール試料において、本発明のTIEリガンドホモ
ログをコードする遺伝子の発現のレベルを検出する工程を包含し、ここで、テス
ト試料におけるより高い発現レベルは、テスト組織細胞が得られた哺乳動物にお
ける腫瘍の存在を示す。特定の実施態様では、本発明は、(a)抗TIEリガン
ドホモログ抗体を哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料と接触させる工程
、および(b)テスト試料における抗TIEリガンドホモログ抗体とTIEリガ
ンドホモログとの間の複合体の形成を検出する工程によって、哺乳動物における
腫瘍を診断する方法に関する。
プチドを過剰発現する細胞を、NL8ポリペプチドの発現および/または活性を
阻害する有効量の薬剤に曝露する工程を包含する。
器上のラベル;および(c)容器内に含まれている活性薬剤を含む組成物を含み
、ここで、組成物は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効であり、容器上のラ
ベルは、この組成物が、NL8ポリペプチドの過剰発現によって特徴づけられる
症状を処置するために使用され得、そして組成物中の活性薬剤は、NL8ポリペ
プチドの発現および/または活性を阻害する薬剤であることを示す。
ィブなまたは変異体TIEリガンドホモログと競合する能力に基づいて、TIE
レセプターのポリペプチドまたは低分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定
するためのスクリーニング方法に関する。
存在を画像化するための方法に関し、これは、本発明の検出可能に標識されたT
IEリガンドホモログまたはアゴニスト抗体を投与する工程、および新脈管形成
を検出する工程を包含する。
IEリガンドホモログの有効量を投与する工程による、患者において新生血管形
成を促進または阻害する方法に関する。好ましい実施態様では、本発明は、創傷
治癒の促進のための方法に関する。もう1つの実施態様では、本発明は、虚血性
心臓または肢において側副血管新生を誘導するためのような、脈管形成プロセス
を促進するための方法に関する。さらに好ましい実施態様では、本発明は、腫瘍
増殖を阻害するための方法に関する。
熟および/または増殖を促進する方法に関し、薬学的に受容可能なベヒクル中の
本発明のTIEリガンドホモログの有効量を患者に投与する工程を包含する。
れは、薬学的に受容可能なベヒクル中の本発明のTIEリガンドホモログの有効
を必要な患者に投与する工程を包含する。
VEGFファミリーのメンバーを含む他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて
、投与され得る。組み合わせ治療は、新生血管形成、ならびに筋肉増殖および発
達を促進または阻害するための新しいアプローチに導き得る。
号4)、NL8(配列番号6)、およびNL4(配列番号19)と命名したネイ
ティブなヒトタンパク質、ならびに、サルのような高等哺乳動物;マウス、ラッ
トハムスターのような齧歯類;ブタ;ウマ;ウシを含む(しかしこれらに限定さ
れない)、他の非ヒト哺乳動物種におけるそのホモログ、天然に存在する対立遺
伝子およびスプライス改変体、ならびに、ネイティブなTL−1またはTL−2
リガンドとは異なる限り、このようなネイティブな分子のアミノ酸配列改変体の
ような、生物学的に活性な(機能的)誘導体を含む。例えば、NL4のアミノ酸
配列は、hTL2と約34%同一およびhTL1と約32%同一である。本発明
のネイティブなTIEリガンドホモログは、そのネイティブな環境に関連する他
のタンパク質を実質的に含まない。この定義は、本発明のTIEリガンドホモロ
グが得られる方法によっていかなるようにも限定されず、そしてその他の点で定
義内のすべてのTIEリガンドホモログを含み、天然供給源から精製されるか、
組換えDNA技術から得られるか、合成されるか、またはこれらおよび/もしく
は他の技術の任意の組み合わせによって調製されるいずれかである。本発明のネ
イティブなTIEリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、本発明の全長のネ
イティブなヒトTIEリガンドホモログと、または本発明のネイティブなヒトT
IEリガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインと、少なくとも約90%、
好ましくは少なくとも約95%、より好ましくは少なくとも約98%、最も好ま
しくは少なくとも約99%配列同一性を有する。このようなアミノ酸配列改変体
は、好ましくは、ネイティブなTIEリガンドホモログの定性的生物学的活性を
提示または阻害する。
、公知のhTL−1アミノ酸配列における約278位〜約498位のアミノ酸;
公知のhTL−2アミノ酸配列における約276位〜約496位のアミノ酸;N
L1のアミノ酸配列における約270位〜約493位のアミノ酸;NL5のアミ
ノ酸配列における約272位〜約491位のアミノ酸;NL8のアミノ酸配列に
おける約252位〜約470位のアミノ酸;NL4のアミノ酸配列における約1
30位〜約346位のアミノ酸;および他のTIEリガンドホモログにおけるホ
モログをいうために使用される。NL4のフィブリノーゲンドメインとhTL−
1およびhTL−2のフィブリノーゲンドメインとの間のアミノ酸配列同一性は
、約44%である。
ドの縮重の結果として、所定のTIEリガンドホモログをコードする多数のヌク
レオチド配列が産生され得ることが理解される。本発明は、すべての可能なコド
ン選択に基づいて、本発明のTIEリガンドホモログをコードする、ヌクレオチ
ド配列のあらゆる可能な改変体を特に意図する。本発明のTIEリガンドホモロ
グをコードする核酸分子は、好ましくは、ストリンジェント条件下で天然に存在
するTIEリガンドホモログ遺伝子にハイブリダイズし得るが、実質的に異なる
コドン利用を有する、TIEリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列を
産生するために有利であり得る。例えば、コドンは、特定のコドンが宿主によっ
て利用される頻度に従って、ポリペプチドの発現が特定の原核生物または真核生
物宿主で起こる割合を増加させるように選択され得る。さらに、改良された特性
(例えば、半減期)を有するRNA転写物は、所定のTIEリガンドホモログを
コードするヌクレオチド配列の適切な選択によって産生され得る。
エア(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)のバ
ージョン1.6、またはこのソフトウエアの任意のアップデート版もしくは等価
物に組み込まれる、多配列アラインメントのClustal方法(Higgin
sらComput.Appl.Biosci.5,151−153(1989)
およびHigginsら,Gene 73,237−244(1988))に従
って比較されるべき2つの配列をアラインすることによって決定される。
易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依
存的な経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングの
ためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要と
する。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が融解温度以下の環境に存在
する場合に変性したDNAが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブ
リダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対
温度が高い。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェン
トにする傾向があるが、より低い温度ではそうではないことになる。ハイブリダ
イゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、
Ausubelら,Current Protocols in Molecu
lar Biology,Wiley Interscience Publi
shers,(1995)を参照のこと。
ー条件」は、(1)洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、50℃で0
.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデ
シル硫酸ナトリウムを用いる;(2)ホルムアルドのような変性剤、例えば、4
2℃にて、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1%ポ
リビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム
を含むpH 6.5での50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)を含
む50%(v/v)ホルムアミド、をハイブリダイゼーション中に用いる;また
は(3)42℃にて50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、
0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 6.8
)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理したサケ
精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキスト
ランを用い、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および5
5℃で50%ホルムアミド中で42℃にて洗浄し、次いで55℃にてEDTAを
含む0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄する、条件によって同定
され得る。
ar Cloning:A Laboratory Manual,New Y
ork:Cold Spring Harbor Press,1989に記載
のように同定され得、そして上記よりもストリンジェントでない洗浄溶液および
ハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度、および%SDS)の
使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、20%ホルムアミド、5×
SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリ
ン酸ナトリウム(pH 7.6)、5×デンハート溶液、10%硫酸デキストラ
ン、および20mg/mL変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で37℃にての
一晩インキュベート、次いで約37〜50℃にて1×SSC中でフィルターを洗
浄することである。当業者は、プローブ長などのような適切な因子に必要なよう
に、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識する。
ペプチド」に融合したTIEリガンドホモログポリペプチドを含むキメラポリペ
プチドをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供する
ために十分な残基を有するが、融合されるポリペプチドの活性を妨害しないよう
に十分に短い。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと
実質的に交差反応しないかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に
、少なくとも6アミノ酸残基、および通常は約8〜50アミノ酸残基(好ましく
は、約10〜20アミノ酸残基)を有する。
物学的に活性な」とは、分子が公知または本明細書中以降に発見されるTIEリ
ガンドのネイティブなレセプター(以降「TIEレセプター」という)、例えば
、ネイティブなTIE−2レセプターに特異的に結合しそしてそれによってシグ
ナルを出す能力、あるいはシグナル伝達に関与するネイティブなTIEレセプタ
ー(例えば、TIE−2)の能力をブロックする能力をいう。したがって、本発
明の(ネイティブなおよび改変体)TIEリガンドは、ネイティブなTIE(例
えば、TIE−2)レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発
明のTIEリガンドの好ましい生物学的活性は、新生血管形成を誘導または阻害
する能力を含む。新生血管形成を誘導する能力は、生物学的症状および疾患(例
えば、創傷治癒、虚血、および糖尿病)の処置に有用であり、ここでは、新生血
管形成が望ましい。他方で、新生血管形成を阻害またはブロックする能力は、例
えば、腫瘍増殖を予防または減弱することに有用であり得る。他の好ましい生物
学的活性は、筋肉増殖または発達に影響を及ぼす能力である。さらに好ましい生
物学的活性は、骨発生、成熟、または増殖に影響を与える能力である。さらにも
う1つの好ましい生物学的活性は、乳ガンのようなガンの病理における関与であ
る。なおさらに好ましい生物学的活性は、内皮細胞増殖を阻害および/またはア
ポトーシスを誘導する能力である。
サル)、ならびに齧歯類(例えば、ラットおよびマウス)を含むが、これらに限
定されない任意の動物種のTIEレセプターをいうために本明細書で使用される
。この定義は、詳細には、例えば、PCT出願第WO 95/13387号(1
995年5月18日公開)に開示されるTIE−2レセプター、およびPCT出
願公開公報第WO 93/14124号(1993年7月22日公開)で「TI
E」という内皮細胞レセプターチロシンキナーゼを含むが、これらに限定されず
、そして好ましくはTIE−2である。
物学的に活性なアミノ酸配列改変体、ならびに、誘起誘導体化薬剤との反応によ
って得られた誘導体、翻訳後修飾、非タンパク質性ポリマーを有する誘導体、お
よびイムノアドヘシンを含む共有改変を定義するために使用される。
によって刺激されそして腫瘍脈管形成に必要とされることが最近示された、内皮
細胞特異的マイトジェンである(Sengerら,Cancer 46:562
9−5632(1986);Kimら,Nature 362:841−844
(1993);Schweikiら,Nature 359:843−845(
1992);Plateら,Nature 359:845−848(1992
))。これは、合成されそして種々の腫瘍および正常細胞によって分泌される3
4〜43kDa(約45kDaにて優勢な種を有する)ダイマーのジスルフィド
結合した糖タンパク質である。さらに、色素上皮細胞および周皮細胞のような培
養したヒト網膜細胞は、低酸素症に応答してVEGFを分泌しそしてVEGF遺
伝子発現を増加させることが証明された(Adamisら,Biochem.B
iophys.Res.Commun.193:631−638(1993);
Plouetら,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.34
:900(1992);Adamisら,Invest.Ophthalmol
.Vis.Sci.34:1440(1993);Aielloら,Inves
t.Ophthalmol.Vis.Sci.35:1868(1994);S
imorre−pinatelら,Invest.Ophthalmol.Vi
s.Sci.35:3393−3400(1994))。逆に、正常組織におけ
るVEGFは比較的低い。したがって、VEGFは、新生血管形成に関連する多
くの病理学的状態およびプロセスにおいて主要な役割を果たすようである。した
がって、上記の種々の症状によって影響を受ける組織におけるVEGF発現の調
節は、低酸素症に関連する処置または予防的治療に重要であり得る。
用語「単離された」とは、その天然環境の成分から同定および分離および/また
は回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、代表
的には、ポリペプチドについての診断または治療用途を妨害し、そして酵素、ホ
ルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る物質であ
る。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエ
ネーターの使用によるN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得
るために十分な程度まで、または(2)クーマシーブルーまたは好ましくは銀染
色を使用して非還元または還元条件下でSDS−PAGEによる均一性まで、精
製される。単離されたポリペプチドは、インサイチュで、組換え細胞内にポリペ
プチドを含む。なぜなら、TIEリガンドホモログの天然環境の少なくとも1つ
の成分が存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少
なくとも1つの精製工程によって調製される。
)によってシグナルを出す能力を有するならば、本発明のネイティブなTIEリ
ガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログ、ならびにこのようなネイ
ティブなTIEリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用され
る。言い換えると、用語「アゴニスト」は、TIEレセプターの生物学的役割の
状況において定義され、およびネイティブなTIEリガンドホモログの生物学的
役割に関して定義されず、これは、上述のように、TIEレセプター生物学的機
能のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましいアゴニストは、血管
形成のプロモーターであるか、または骨形成成熟または増殖に役割を果たす。他
の好ましいアゴニストは、筋肉増殖または発達を促進する。
−2)の生物学的機能を阻害する能力を有するならば、本発明のネイティブなT
IEリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログを、ならびにこのよ
うなネイティブなTIEリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために
使用される。また、用語「アンタゴニスト」は、TIEレセプターの生物学的役
割に関して定義され、およびネイティブなTIEリガンドホモログの生物学的役
割に関して定義されず、これは、TIEレセプター生物学的機能のアゴニストま
たはアンタゴニストのいずれかであり得る。好ましいアンタゴニストは、血管形
成、あるいは病理学的骨格または筋肉の発達または増殖のインヒビターである。
子または遺伝子フラグメントの複数のコピーが、特定の細胞または細胞株で形成
されるプロセスをいう。重複した領域(増幅したDNAのストレッチ)は、しば
しば「アンプリコン」といわれる。通常、産生されたメッセンジャーRNA(m
RNA)の量、すなわち、遺伝子発現のレベルはまた、発現した特定の遺伝子か
ら作成されるコピー数の割合で増加する。
ての前ガン性およびガン性の細胞および組織のいずれかの、全ての新形成細胞成
長および増殖をいう。
て特徴づけられる、哺乳動物における生物学的症状をいうかまたは記載する。ガ
ンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが
、これらに限定されない。このようなガンのより特定な例には、乳ガン、前立腺
ガン、結腸ガン、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵
臓ガン、神経膠芽腫、子宮頚ガン、卵巣ガン、悪性肝ガン(hepatoma)
、膀胱ガン、肝腫瘍、結直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓
ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝ガン腫、ならびに種々のタイプの頭部および
頚部ガンが挙げられる。
行われる介入である。したがって、「処置」とは、治療処置および予防または防
止尺度の両方をいう。処置を必要とするものには、既に障害を有するものならび
に障害が予防されるべきものが挙げられる。腫瘍(例えば、ガン)処置では、治
療薬剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少し得るか、または腫瘍細胞が他の治療薬剤
による処置、例えば、放射線照射および/または化学療法をより受けやすくし得
る。
には、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の妨害、サイ
トカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症または免疫学的応答の
抑制または悪化などが挙げられが、これらに限定されない。
イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園、競技、またはペット動物を含む、
哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトであ
る。
する(concurrent))および任意の順での連続投与を含む。
または抑制するおよび/または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は
、放射性同位元素(例えば、I131、I125、Y90、およびRe186)、化学療法 剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその
フラグメントのようなトキシンを含むことを意図する。
は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル
、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、
ブスルファン、シトキシン、タキソイド類、例えば、パクリタキセル(Taxo
l,Bristol−Myers Squibb Oncology,Prin
ceton,NJ)、およびドキセタキセル(Taxotere,Rhone−
Poulenc Rorer,Antony,Rnace)、トキソテレ、メト
トレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン
、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビン
クリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カ
ルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エス
ペラミシン類(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、メルファラン
、および他の関連のナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義には、タ
モキシフェンおよびオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調節ま
たは阻害するように作用するホルモン性薬剤もまた含まれる。
ボのいずれかで、細胞、特に本明細書で同定された遺伝子のいずれかを過剰発現
するガン細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。したがって、増殖阻
害薬剤は、S期においてこのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を顕著に減
少させるものである。増殖阻害薬剤の例には、G1期阻止およびM期阻止を誘導
する薬剤のような、細胞周期進行(S期以外の期間で)をブロックする薬剤が挙
げられる。古典的M期ブロッカーには、ビンカス(ビンクリスチンおよびビンブ
ラスチン)、タキソール、ならびに、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノル
ビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポIIインヒビターが挙
げられる。G1期を阻止する薬剤はまた、S期阻止にも及び、例えば、タモキシ
フェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクトレタミン、シスプラチン、メトト
レキセート、5−フルオロウラシル、およびara−CのようなDNAアルキル
化剤である。さらなる情報が、Murakamiらによる「Cell cucl
e regulation, oncogenes, and antineo
plastic drugs」という題の、The Molecular Ba
sis of Cancer, MendelsohnおよびIsrael編,
Chapter 1、特に13頁で見られ得る。
ンの完全な化学物質名は、(8S−シス)−10−[(3−アミノ−2,3,6
−トリデオキシ−α−L−リソキシ−ヘキサピラノシル)オキシ]−7,8,9
,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−8−(ヒドロキシアセ
チル)−1−メトキシ−5,12−ナフタセネジオンである。
する1つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般的な用語であ
る。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的
ポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、N−
メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン;
副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;レラキシン;プ
ロレラキシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、
および黄体形成ホルモン(LH)のような糖タンパク質ホルモン;肝臓増殖因子
;繊維芽細胞増殖因子;胎盤性ラクトゲン;腫瘍壊死因子−αおよび−β;ミュ
ラー管阻害因子;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビ
ン;血管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NFG−
βのような神経増殖因子;血小板増殖因子;TGF−αおよびTGF−βのよう
なトランスフォーミング増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子−Iおよび
−II;エリスロポエチン(EPO);骨誘導性因子;インターフェロン−α、
−β、および−γのようなインターフェロン;マクロファージ−CSF(M−C
SF)のようなコロニー刺激因子(CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF
(GM−CSF);および顆粒球−CSF(G−CSF);IL−1、IL−1
α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8
、IL−9、IL−11、IL−12のようなインターロイキン(IL);TN
F−αまたはTNF−βのような腫瘍壊死因子;およびLIFおよびキットリガ
ンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で使用される
場合。用語サイトカインには、天然供給源からまたは組換え細胞培養物からのタ
ンパク質およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が挙
げられる。
1つの夾雑核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸
分子は、天然で見いだされる形態または配置以外である。単離された核酸分子は
、したがって、天然細胞に存在するので、核酸分子とは区別される。しかし、単
離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞とは異なる染色体位置にあ
る場合、本発明のTIEリガンドホモログを普通に発現する細胞に含まれる核酸
分子が含まれる。
アミノ酸配列にいくつかの差を有する分子をいう。
および同じ位置で代わりに挿入される異なるアミノ酸を有するものである。置換
は、分子中の1つのみのアミノ酸が置換される場合、単一であり得、あるいは、
2つ以上のアミノ酸が同じ分子で置換される場合は、複数であり得る。
て挿入される1つ以上のアミノ酸を有する改変体である。アミノ酸に直接隣接す
るとは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに
接続されることを意味する。
有する改変体である。通常、欠失改変体は、分子の特定の領域で欠失した1また
は2アミノ酸を有する。欠失改変体には、C−および/またはN−末端欠失(短
縮)を有するもの、ならびに1つ以上のアミノ酸の内部欠失を有する改変体が挙
げられる。本発明の好ましい欠失改変体は、本発明のネイティブなTIEリガン
ドホモログのフィブリノーゲン様ドメインの外側の欠失を含む。
アミノ酸置換、挿入、および/または欠失の種々の組み合わせを含み得る。
、2つの群、荷電的および非荷電的に広く分類される。これらの群のそれぞれは
、アミノ酸をより正確に分類するために下位集団に分割される。 I.荷電アミノ酸 酸性残基:アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基:リジン、アルギニン、ヒスチジン II.非荷電アミノ酸 親水性残基:セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン 脂肪族残基:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 非極性残基:システイン、メチオニン、プロリン 芳香族残基:フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 保存的置換は、1つの群内のメンバーを同じ群内のもう1つのメンバーと交換
することを含むが、非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーをもう1
つに交換することを伴う。非保存的置換によって得られる改変体は、得られた改
変体の生物学的特性/機能の顕著な変化を生じることが予測される。
基の範囲であり、そして代表的には隣接する。欠失は、ネイティブなTIEレセ
プターとの相互作用に直接関連しない領域に導入され得る。欠失は、好ましくは
、本発明のTIEリガンドホモログのC末端のフィブリノーゲン様領域の外側で
行われる。
さの範囲のアミノおよび/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複
数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入(すなわち、TIEリガ
ンドホモログアミノ酸配列内の挿入)は、一般に、約1〜10残基、より好まし
くは1〜5残基、より好ましくは1〜3残基の範囲であり得る。末端挿入の例に
は、N末端メチオニル残基を有するTIEリガンドホモログ、細菌組換え細胞培
養物中のその直接発現の人工産物、および組換え宿主細胞からの成熟TIEリガ
ンドホモログの分泌を容易にするための異種N末端シグナル配列のTIEリガン
ドホモログのN末端への融合物が挙げられる。このようなシグナル配列は、一般
に、目的の宿主細胞種から得られ、したがって相同である。適切な配列には、例
えば、E.coliについてはSTIIまたはIpp、酵母についてはα因子、
および哺乳動物細胞についてはヘルペスgDのようなウイルスシグナルが挙げら
れる。ネイティブなTIEリガンドホモログ分子の他の挿入改変体には、免疫原
性ポリペプチド、例えば、β−ラクタマーゼまたはE.coliによってコード
される酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母タンパク質への、TIEリガ
ンドホモログ分子のN末端またはC末端の融合物、ならびに、1989年4月6
日に公開されたWO 89/02922に記載のように、免疫グロブリン領域(
好ましくは、免疫グロブリン定常領域)、アルブミン、またはフェリチンのよう
な長い半減期を有するタンパク質とのC末端融合物が挙げられる。
るので、いくつかのスクリーニングが最適な改変体を選択するために必要とされ
ることが理解される。
ティブなTIEリガンドホモログのDNAに適切なヌクレオチド変化を導入する
ことによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって、当該技術
分野で公知の方法によって調製される。アミノ酸配列改変体の構築における2つ
の主な変数がある:変異部位の位置および変異の性質。TIEリガンドホモログ
をコードするDNA配列の操作を必要としない、天然に存在する対立遺伝子を除
いて、TIEリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、好ましくは、対立遺伝
子または天然に存在しないアミノ酸配列改変体のいずれかを実現するために、DN
Aを変異することによって構築される。
との相互作用に関連すると同定された、本発明のTIEリガンドホモログのドメ
イン内で生成される。
種々の種からのTIEリガンドホモログが異なる部位、または高度に保存された
領域に作成され得る。
、次いで実現した結果に依存してより根本的選択で置換すること、(2)標的残
基を欠失すること、または(3)位置した部位に隣接する同じまたは異なるクラ
スの残基を挿入すること、または選択肢1〜3の組み合わせによって連続して改
変される。
ghamおよびWells,Science 244,1081−1085[1
989])。ここで、残基または標的残基の群は、アラニンまたはポリアラニン
によって同定されそして置換される。次いで、アラニン置換に対する機能的感受
性を証明するドメインは、アラニン置換の部位でまたは部位に対してさらにまた
は他の置換基を導入することによって精錬される。
遺伝子は、例えば、上記のように化学合成によって得られ得る。
DNAは、より初期に調製されたリガンドの改変体または非改変型をコードする
DNAの部位特異的変異誘発によって調製される。部位特異的変異誘発は、所望
の変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに横切
った欠失連結部の両側で安定な二重鎖を形成するために十分なサイズおよび配列
複雑性のプライマー配列を提供するために、隣接オリゴヌクレオチドの十分な数
の使用によってリガンド改変体の産生を可能にする。代表的には、約20〜25
ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の連結部の両側での約5〜10残
基が変更される。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり
、Edelmanら,DNA 2,183(1983)のような刊行物に例示さ
れる。理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、代表的には、一本鎖形態
および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異
誘発に有用な代表的なベクターには、例えば、Messingら,Third
Cleveland Symposium on Macromolecule
s and Recombinant DNA,A.Walton編,Else
vier,Amsterdam(1981)に開示されるように、M13ファー
ジのようなベクターが挙げられる。これおよび他のファージベクターは市販され
ており、そしてその使用は、当業者に周知である。M13由来ベクターを使用す
るDNAフラグメントにおける部位特異的変異を指示するオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの構築のための多才なおよび有効な手順は、Zoller,M.J.
およびSmith,M.,Nucleic Acids Res.10,648
7−6500[1982]によって公開された。また、一本鎖ファージ複製起点
を含むプラスミドベクター(Veiraら,Meth.Enzymol.153
,3[1987])は、一本鎖DNAを得るために用いられ得る。あるいは、ヌ
クレオチド置換は、インビトロで適切なDNAフラグメントを合成することによ
って、および当該技術分野で公知のPCR手順によって増幅することによって導
入される。
列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得ることによって行われる。所望
に変異された配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Crea
ら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 75,5765(197
8)によって、一般に合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖
タンパク質配列含有ベクターとアニールし、そしてE.coliポリメラーゼI
クレノウフラグメントのようなDNA重合化酵素を受けさせて、変異含有鎖の合
成を完了させる。したがって、ヘテロ二重鎖は、1つの鎖が元の非変異配列をコ
ードし、そして第2鎖が所望の変異を有する場合に形成される。次いで、このヘ
テロ二重鎖ベクターは、JP101細胞のような適切な宿主細胞を形質転換する
ために使用され、そして変異した配列アライメントを有する組換えベクターを含
むクローンが選択される。その後、変異した領域は除去され、そしてタンパク質
産生に適切な発現ベクター中に配置され得る。
ことに使用され得る。少量のテンプレートDNAがPCRにおける開始物質とし
て使用される場合、テンプレートDNAにおいて対応する領域とは配列がわずか
に異なるプライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみでテンプレ
ート配列とは異なる比較的大量の特異的DNAフラグメントを生成するために使
用され得る。プラスミドDNAへの変異の導入のために、プライマーの1つは、
変異の位置を重複しそして変異を含むように設計され;他のプライマーの配列は
、プラスミドの反対鎖の配列のストレッチと同一でなければならないが、この配
列は、プラスミドDNAに沿ってどこにでも位置し得る。しかし、第2プライマ
ーの配列が、第1の配列から200ヌクレオチド内に位置しそのため末端でプラ
イマーに結合したDNAの全体の増幅した領域が容易に配列決定され得ることが
好ましい。まさに記載したもののようなプライマー対を使用するPCR増幅は、
プライマーによって特定される変異の位置で異なるDNAフラグメントの集団を
生じ、そしておそらく他の位置では、テンプレートとしてコピーすることは、幾
分誤る傾向がある。
NAフラグメントは、所望の変異を組み込む。この産物物質は、標準的DNA技
術を使用してPCRテンプレートとして用いたプラスミド中の対応する領域を置
換するために使用される。別々の位置での変異は、変異体第2プライマーを使用
するかまたは異なる変異体プライマーでの第2PCRを行うことのいずれか、お
よび3つ(またはそれ以上)の部分的ライゲーションにおいてベクターフラグメ
ントに2つの得られるPCRフラグメントを同時にライゲートすることによって
、同時に導入され得る。
、増幅されるべき領域の外側でプラスミドDNA中に独特の認識部位を有する制
限エンドヌクレアーゼによる切断によって直線化される。この物質のうち、10
0ngを、4つのデオキシヌクレオチド酸リン酸を含みそしてGeneAmp(
商標)キット(Perkin−Elmer Cetus,Norwalk,CT
およびEmeryville,CAより入手)、および25pmolの各オリゴ
ヌクレオチドプライマーに含まれるPCR緩衝液を含むPCR混合物に、50μ
lの最終容量まで添加する。反応混合物を、35μl鉱油で重層する。反応物を
、100℃にて5分間変性し、氷上に簡単に置き、次いでPerkin−Elm
er Cetus,Norwalk,CTおよびEmeryville,CAか
ら購入した1μl Thermus aquaticus(Taq)DNAポリ
メラーゼ(5単位/l)を、鉱油層の下に添加する。次いで、反応混合物を、以
下のようにプログラムされたDNAサーマルサイクラー(Perkin−Elm
er Cetusから購入した)に差し込む: 2分、55℃、 30秒、72℃、次いで以下の19サイクル: 30秒、94℃、 30秒、55℃、および 30秒、72℃。
て水相を新しいバイアルに移し、フェノール/クロロホルム(50:50vol
)で抽出し、そしてエタノール沈殿し、そしてDNAを標準的手順によって回収
する。この物質は、その後、ベクターへの挿入のために適切な処置にかける。
lsら,[Gene 34,315(1985)]に記載の技術に基づく。開始
物質は、変異されるべきTIEリガンドホモログDNAを含むプラスミド(また
はベクター)である。変異されるべきTIEリガンドホモログ内のコドンが同定
される。同定された変異部位の各側における独特の制限エンドヌクレアーゼがな
ければならない。このような制限部位が存在しないならば、これらは、TIEリ
ガンドホモログをコードするDNAにおいて適切な位置に導入するための上記の
オリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。制限部位がプラ
スミドに導入された後、プラスミドを、直線にするためにこれらの部位で切断す
る。制限部位間のDNAの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌ
クレオチドを、標準的手順を使用して合成する。2つの鎖を別々に合成し、次い
で標準的技術を使用してともにハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオ
チドは、カセットという。このカセットを、プラスミドに直接連結され得るよう
に、直線にしたプラスミドの末端と適合可能である3’および5’末端を有する
ように設計する。このプラスミドは、現在、変異したTIEリガンドホモログD
NA配列を含む。
Eリガンドホモログのアミノ酸配列改変体を作成することに有用であり得る。こ
の方法は、(a)変異させるべきレセプターをコードする第1の遺伝子、第1お
よび第2の遺伝子が異種である天然または野生型ファージコートタンパク質の少
なくとも一部をコードする第2の遺伝子、および融合タンパク質をコードする遺
伝子融合物を形成する第1および第2の遺伝子に作動可能に連結される転写調節
エレメントを含む、複製可能な発現ベクターを構築する工程;(b)関連のプラ
スミドのファミリーを形成する第1の遺伝子内の1つ以上の選択された位置でベ
クターを変異する工程;(c)プラスミドで適切な宿主細胞を形質転換する工程
;(d)ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファー
ジで、形質転換された宿主細胞を感染させる工程;(e)プラスミドの少なくと
も一部を含む組換えファージミド粒子を形成するために適切でありそして宿湯を
形質転換し得る条件下で、形質転換し感染した宿主細胞を培養する工程であって
、この条件が、ほんの少量のファージミド粒子が粒子の表面上に融合タンパク質
の1つより多くのコピーを提示するように調節される、工程;(f)ファージミ
ド粒子の少なくとも一部が抗原に結合するように、適切な抗原とファージミド粒
子とを接触させる工程;および(g)結合するファージミド粒子を結合しないも
のと分離する工程、を包含する。工程(d)〜(g)は、1回以上繰り返され得
る。好ましくは、この方法において、プラスミドは、転写調節エレメントの堅い
制御下にあり、そして培養条件は、粒子の表面上に融合タンパク質の1つより多
くのコピーを提示するファージミド粒子の量または数が、約1%以下であるよう
に調節される。また、好ましくは、融合タンパク質の1つより多くのコピーを提
示するファージミド粒子の量は、融合タンパク質の単一コピーを提示するファー
ジミド粒子の量の10%以下である。最も好ましくは、この量は20%以下であ
る。代表的には、この方法では、発現ベクターは、ポリペプチドの各サブユニッ
トをコードするDNAに融合した分泌シグナル配列をさらに含み、そして転写調
節エレメントは、プロモーター系である。好ましいプロモーター系は、lac
Z、λPL、tac、T7ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスフ
ァターゼプロモーター、ならびにその組み合わせから選択される。また、通常は
、この方法は、M13K07、M13R408、M13−VCS、およびPhi
X 174から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファ
ージは、M13K07であり、そして好ましいコートタンパク質は、M13ファ
ージ遺伝子IIIコートタンパク質である。好ましい宿主は、E.coli、お
よびE.coliのプロテアーゼ欠失株である。
らMolecular Cloning:A laboratory Manu
al(New York:Cold Spring Harbor Labor
atory Press,1989)、およびCurrent Protoco
ls in Molecular Biology,Ausubelら編,Wi
ley−Interscience,1991のような、一般的教科書で見いだ
される。
レセプター配列から伝統的に構築されるキメラである(イムノアドヘシン)。こ
のような構造は、当該技術分野で周知である。文献で報告されたイムノアドヘシ
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1991)];IgGレセプターα鎖*[RidgwayおよびGorman, J.Cell.Biol.115,abstr.1448(1991)];HG
Fレセプター[Mark,M.R.ら,1992,J.Biol.Chem.,
投稿中]の融合物が挙げられ、ここでアステリスク(*)は、レセプターが免疫 グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
第5,304,640号(L−セレクチンリガンドについて);同第5,316
,921号および同第5,328,837号(HGF改変体について)に開示さ
れる。これらのキメラは、レセプター−免疫グロブリンキメラの構築と類似の方
法で作成され得る。
このような改変は、TIEリガンドホモログの標的されたアミノ酸残基を、選択
された側面または末端残基と反応し得る誘起誘導体化薬剤と反応させることによ
って、あるいは選択された宿主細胞で機能する翻訳後改変のメカニズムを利用す
ることによって伝統的に導入される。得られる共有誘導体は、生物学的活性に、
イムノアッセイに、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗TI
Eリガンドホモログ抗体の調製に、重要な残基を同定することに関するプログラ
ムで有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性
の完全不活化は、少なくとも1つのアルギニル残基またはリジル残基がその活性
に重要であり、その後選択された条件下で改変された個々の残基が、改変したア
ミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離によって同定されることを示唆す
る。このような改変は、当業者の範囲内であり、そして過度の実験を行うことな
く行われる。
なα−ハロ酢酸塩(および対応するアミン)と反応して、カルボキシメチルまた
はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システニル残基はまた、ブロモトリフ
ルオロアセトン、α−ブロモ−β−(5−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロ
アセチルリン酸、N−アルキルマレイミド,3−ニトロ−2−ピリジルジスルフ
ィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロロ水銀安息香酸、2−クロロ
水銀−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−
1,3−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
H 5.5〜7.0でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化さ
れる。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である;反応は、好ましくは、p
H 6.0にて0.1Mカコジル酸ナトリウム中で行われる。
応する。これらの薬剤の誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有す
る。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコ
リンイミデートのようなイミドエステル;ピリドキサルリン酸;ピリドキサール
;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;
2,4−ペンタンジオン;およびグリコキシレートとのトランスアミナーゼ触媒
した反応物が挙げられる。
リオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、および
ニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グア
ニジン官能基の高いpKaのために、反応がアルカリ条件で行われることが必要 とされる。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−ア
ミノ基と反応し得る。
メタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することにおいて
、特定の目的で行われ得る。最も普通には、N−アセチルイミジゾールおよびテ
トラニトロメタンは、それぞれO−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体
を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイでの使用
のために標識されたタンパク質を調製するために125Iまたは131Iを使用してヨ
ード化される。
−3−(2−モルホリニル−4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3
−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドのようなカルボ
ジイミド(R’−N=C=N−R’)との反応によって選択的に改変される。さ
らに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応
によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
およびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏や
かな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明
の範囲内にはいる。
、またはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およ
びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,P
roteins:Structure and Molecular Prop
erties,W.H.Freeman & Co.,San Francis
co,pp.79−86[1983])、N−末端アミンのアセチル化、ならび
に任意のC−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。分子は、さらに、米
国特許出願07/275,296または米国特許4,640,835;4,49
6,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;
または4,179,337に記載の方法で、非タンパク質性ポリマー、例えば、
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキ
レンに共有結合され得る。
を調製するために、ならびにアッセイまたはアフィニティー精製での使用のため
に水不溶性支持体マトリクスまたは表面にTIEリガンドポリペプチドを架橋す
るために、有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造にお
ける直接情報を提供する。普通に使用される架橋剤には、1,1−ビス(ジアゾ
アセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、および二官能性マレイミドが
挙げられる。メチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデー
トのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化可能中間体を
得る。あるいは、臭化シアン活性化した炭化水素のような反応性水不溶性マトリ
クスならびに米国特許第3,959,642号;第3,969,287号;第3
,691,016号;第4,195,128号;第4,247,642号;第4
,229,537号;第4,055,635号;および第4,330,440号
に記載の系反応性基質が、タンパク質固定化および架橋に用いられる。
果である。グルタミンおよびアスパラギン残基は、頻繁に、対応するグルタミン
酸およびアスパルギン酸残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残
基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態
は、本発明の範囲内にはいる。
オニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン
、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E.Creighto
n,Proteins:Structure and Molecular P
roperties,W.H.Freeman & Co.,San Fran
cisco,pp.79−86(1983)]が挙げられる。
を含む。非タンパク質性ポリマーは、通常は、親水性合成ポリマー、すなわち、
天然で他には見いだされないポリマーである。しかし、天然に存在し、そして組
換えまたはインビトロ方法によって産生されるポリマーは、天然から単離される
ポリマーと同様に、有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニ
ルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲にはいる。ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエー
テルは、特に有用である。
,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791
,192号;または第4,179,337号に記載の様式で、ポリエチレングリ
コール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの
ような種々の非タンパク質性ポリマーに連結され得る。まさに本発明のイムノア
ドヘシンのような、これらの改変体は、対応するネイティブなTIEリガンドよ
りも長い半減期を有することが予測される。
界面重合化によって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例
えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパ
ーティクル、およびナノカプセル)に、あるいはマクロエマルジョンに捕らえら
れ得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceuti
cal Sciences,16版,Osol,A.編(1980)に開示され
る。
ンタゴニスト抗体をカバーする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクロー
ナルであり得、そして限定することなく、成熟抗体、抗体フラグメント(例えば
、Fab、F(ab’)2、FVなど)、単鎖抗体、および種々の鎖の組み合わせ
を含む。
リガンドホモログを特異的に結合する単一モノクローナル抗体(アゴニスト、ア
ンタゴニスト、および中和抗体を含む)、ならびに多エピトープ特異性を有する
抗体組成物をカバーする。
の抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少
ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いては、同一である。モノ
クローナル抗体は、非常に特異的であり、単一抗原性部位に対して指向される。
さらに、代表的には種々の決定基(エピトープ)に対して指向される種々の抗体
を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは逆に、各モノクローナル抗体は
、抗原上の単一の決定基に対して指向される。
ラスもしくはサブクラスの指定にかかわりなく、定常ドメインを伴う、抗TIE
リガンドホモログ抗体の可変(超可変を含む)ドメインをスプライシングするこ
とによって産生されるハイブリッドおよび組換え抗体(例えば、「ヒト化」抗体
)、または重鎖を伴う軽鎖、またはもう1つの種からの鎖を伴う1つの種からの
鎖、または異種タンパク質を伴う融合物、ならびに所望の生物学的活性を示す限
り抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)2、およびFv)が挙げら れる。例えば、米国特許第4,816,567号およびMageら,Monoc
lonal Antibody Production Techniques
and Applications,pp.79−97(Marcel De
kker,Inc.:New York,1987)を参照のこと。
られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必
要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナ
ル抗体は、KohlerおよびMilstein,Nature,256:49
5(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、ま
たは米国特許第4,816,567号に記載のような組換えDNA方法によって
作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、McCafferty
ら,Nature,348:552−554(1990)に記載の技術を使用し
て生成されるファージライブラリーから単離され得る。
リン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(例えば、Fv、Fab
、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合サブ配列)であり、こ れは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ほとんどの部分につい
て、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、ここで、
このレシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基は、所望の特異性、親
和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナ
ー抗体)のCDRからの残基によって置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グ
ロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によっ
て置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入されたCDR
もしくはフレームワーク配列でも見られない残基を含み得る。これらの改変は、
抗体性能をさらに精錬および最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は
、少なくとも1つ、および代表的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含
み、このドメインにおいてCDR領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト
免疫グロブリンのCDR領域に対応し、そしてFR領域のすべてまたは実質的に
すべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体
はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくと
も一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。
IEリガンドホモログおよびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内
(ip)注射によって動物で惹起される。TIEリガンドホモログまたは標的ア
ミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫投与される種において免疫原性であるタ
ンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ
チログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに対して、二官能性また
は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(
システイン残基を介した結合体)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基
を介する)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、SOCl2、またはR1N=
C=NR(ここでRおよびR1は異なるアルキル基である)を用いて、結合体化 するために有用であり得る。
て)を3容量のフロイント(Frend)完全アジュバントと合わせること、お
よび複数の部位で皮内に溶液を注射することによって、免疫原性結合体または誘
導体に対して免疫される。1カ月後、その動物に、複数の部位での皮下注射によ
ってフロイント完全アジュバントの元の量の1/5〜1/10をブーストする。
7〜14日後、動物から採血し、そしてその血清を抗TIEリガンドホモログ抗
体力価についてアッセイする。動物に、その力価がプラトーになるまでブースト
する。好ましくは、動物は、同じTIEリガンドホモログであるが異なるタンパ
ク質におよび/または異なる架橋試薬によって結合体化された結合体でブースト
する。結合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作製され得
る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために使用される
。
の集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異
を除いては、同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、異なる抗
体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。例えば、本発明の抗TIEリガン
ドホモログモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein,Na
ture 256:495(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ方法
を使用して作製され得るか、または組換えDNA方法[Cabillyら,米国
特許第4,816,567号]によって作製され得る。
動物は、本明細書中上記のように免疫投与されて、免疫投与のために使用される
タンパク質に特異的に結合する抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘起する
。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫投与され得る。次いで、リンパ球は
、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用してミエローマ細胞と融
合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding,Monoclona
l Antibodies:Principles and Practice
,pp.59−103(Academic Press,1986)]。
胞の増殖または生存を阻害する好ましくは1つ以上の物質を含む、適切な培養培
地中に播種し、そして増殖する。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を
欠くならば、ハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、およびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はH
GPRT欠失細胞の増殖を抑制する。
て抗体の安定な高いレベルの発現を支持し、そしてHAT培地のような培地に感
受性である細胞である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、the
Salk Institute Cell Distribution Cen
ter,San Diego, California USAから入手可能な
MOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍に由来するようなマウスミエロー
マ株、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション,Rockville
,Maryland USAから入手可能なSP−2細胞である。ヒトミエロー
マおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産
生について記載されている[Kozbor,J.Immunol.133:30
01(1984);Brodeurら,Monoclonal Antibod
y Production Techniques and Applicat
ions,pp.51−63(Marcel Dekker,Inc.,New
York,1987)]。
して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは
、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、
ラジオイムノアッセイ(RIA)または固相酵素免疫吸着アッセイ(ELISA
)のようなインビトロ結合アッセイにより免疫沈降剤によって決定される。
lard,Anal.Biochem.107:220(1980)のスキャッ
チャード分析によって決定され得る。
細胞を同定した後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングさ
れ、そして標準的方法によって増殖され得る。Goding,Monoclon
al Antibodies:Principles and Practic
e,pp.59−104(Academic Press,1986)。この目
的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地またはRPM
I−1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における
腹水腫瘍のようにインビボで増殖され得る。
インA−Sepharose、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲ
ル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免
疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離
される。
例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得る
オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離され、そして
配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい
供給源として用いる。一旦単離すると、DNAは、発現ベクター中に配置され得
、このベクターは、次いでサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CH
O)細胞、または他に免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞のような宿主
細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合
成を得る。DNAはまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽
鎖定常ドメインでコード配列を置換することによって(Morrisonら,P
roc.Natl.Acad.Sci.81,6851(1984))、または
非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を免疫
グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。このように
、本明細書における抗TIEリガンドモノクローナル抗体の結合特異性を有する
「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
常ドメインについて置換されるか、または本発明の抗体の1つの抗原結合部位の
可変ドメインについて置換されて、本発明のTIEリガンドホモログに対する特
異性を有する1つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有するもう
1つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を生成する。
ンパク質化学で公知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、イム
ノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエステル結合を形
成することによって、構築され得る。この目的に適切な試薬の例には、イミノチ
オレートおよびメチル−4−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
される。この検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能シグ
ナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、この検出可能部分は、3H、1 4 C、32P、35S、または125Iのような放射性同位元素、フルオレセンイソチオ
シアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合
物;ビオチン;例えば、125I、32P、14C、または3Hのような放射性同位元素
標識、あるいは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋
ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。
が用いられ得、これには、Hunterら,Nature 144:945(1
962);Davidら,Biochemistry 13:1014(197
4);Painら,J.Immunol.Meth.40:219(1981)
;およびNygren,J.Histochem.and Cytochem.
30:407(1982)に記載の方法が挙げられる。
ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ方法で用いられ得る
。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual
of Techniques,pp.147−158(CRC Press,
Inc.,1987)。
疫学的反応性部分であり得る)が、限定された量の抗体との結合についてテスト
試料分析物(TIEリガンドホモログ)と競合する能力に依存する。テスト試料
中のTIEリガンドホモログの量は、抗体に結合する標準の量に逆比例する。結
合する標準の量を決定することを容易にするために、抗体は、一般に、競合前ま
たは後に不溶化され、そのため抗体に結合される標準および分析は、結合しない
ままの標準および分析から簡便に分離され得る。
タンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る。サンドイッ
チアッセイでは、テスト試料分析物は、固体支持体上に固定されている第一の抗
体によって結合され、その後第二の抗体が分析物に結合し、したがって不溶性3
部分複合体を形成する。DavidおよびGreene,米国特許第4,376
,110号。この第二の抗体は、それ自体が検出可能部分で標識され得るか(直
接的サンドイッチアッセイ)、または検出可能部分で標識される抗免疫グロブリ
ン抗体を使用して測定され得る(間接的サンドイッチアッセイ)。例えば、サン
ドイッチアッセイの1つのタイプは、ELISAアッセイであり、この場合、検
出可能部分は酵素である。
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される1つ以上のアミノ酸残基を有
する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入(import)」残
基といわれ、これは代表的には、「移入」可変ドメインから採用される。ヒト化
は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列で齧歯類CDRまたはCDR配列を置換
することによって、Winterおよび共同研究者[Jonesら,Natur
e 321,522−525(1986);Riechmannら,Natur
e 332,323−327(1988);Verhoeyenら,Scine
ce 239,1534−1536(1988)]の方法に従って行われ得る。
したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(Cabilly
,前出)、ここで、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、
非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、
代表的には、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基が、齧歯
類抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ながらヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方
法にしたがって、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して
、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される
。三次元免疫グロブリンモデルは、普通に利用可能であり、そして当業者は熟知
している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーション
構造を例示および提示するコンピュータプログラムは、利用可能である。これら
の提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の有望な役割の
分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を及ぼす
残基の分析を可能にする。この方法で、FR残基が、標的抗原に対する増加した
親和性のような所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスおよび移入配
列から選択および組み合わせられ得る。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響
を及ぼすことに、直接的およびほとんど実質的に関与する。さらに詳細には、1
992年8月21日に出願された米国特許出願第07/934,373号を参照
のこと、これは、1991年6月14日に出願された出願番号第07/715,
272号の一部継続である。
完全レパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物(例えば、マウス)を
産生することが、今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウ
スにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合欠損が、内因性抗体産生 の完全阻害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系変異体マウス
へのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際
のヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovitsら,Proc.Na
tl.Acad.Sci USA 90,2551−255(1993);Ja
kobivitsら,Nature 362,255−258(1993)を参
照のこと。
モノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化、抗体である。本発明の場合では
、結合特異性の1つは、特定のTIEリガンドホモログに対してであり、他方は
、任意の他の抗原に対して、および好ましくはもう1つのリガンドに対してであ
る。例えば、2つの異なるTIEリガンドホモログを特異的に結合する二特異的
抗体は、本発明の範囲内である。
対の同時発現に基づき、ここでこの2つの重鎖は異なる特異性を有する(Mil
lsteinおよびCuello,Nature 305,537−539(1
983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム類別のため、これらのハ
イブリドーマ(クアドローマ)は、1つのみが正しい二特異的構造を有する、1
0の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生する。アフィニティークロマトグラフ
ィー工程によって通常行われる、正しい分子の精製は、むしろ煩わしく、そして
産物収量は低い。類似の手順が、PCT出願公開公報第WO 93/08829
号(1993年5月13日に公開)およびTrauneckerら,EMBO
10,3655−3659(1991)に開示される。
可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融
合される。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し
、ヒンジの少なくとも一部、および免疫グロブリン重鎮の第2および第3の定常
領域(CH2およびCH3)を含む。この融合物の少なくとも1つに存在する軽
鎖結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)を有することが好まし
い。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコ
ードするDNAは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同
時トランスフェクトされる。これは、構築に使用される3つのポリペプチド鎖の
不同の比が最適収量を提供する場合の実施態様では、3つのポリペプチドフラグ
メントの相互の割合を調節することに、非常に柔軟性を提供する。しかし、少な
くとも2つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が、高い収量を得る場合または
比が特に重要ではない場合、1つの発現ベクターにおける2つまたは3つすべて
のポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入することが可能である。このアプ
ローチの好ましい実施態様では、二特異性抗体は、1つのアームにおける第1の
結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおけ
る(第2の結合特性を提供する)ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から
構成される。二特異性分子の半分のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容
易な方法を提供するので、この非対称構造が、望ましくない免疫グロブリン鎖組
み合わせからの所望の二特異性化合物の分離を容易にすることを見いだした。こ
のアプローチは、1992年8月17日に出願された同時係属出願第07/93
1,811号に開示される。
ら,Methods in Enzymology 121,210(1986
)を参照のこと。
をいい、このフラグメントは同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン(VL) に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH−VL)。短すぎて同じ鎖に おける2つのドメイン間の対形成ができないリンカーを使用することによって、
このドメインは、もう1つの鎖の相補ドメインと対形成させ、そして2つの抗原
結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097;WO
93/11161;およびHollingerら,Proc.Natl.Aca
d.Sci USA,90:6444−6448(1993)に、より十分に記
載される。
供される定義と同様に定義される。詳細には、「単離された」抗体は、その天然
環境の成分から同定および分離および/または回収されたものである。その天然
環境の夾雑成分は、抗体のための診断または治療使用を妨害する物質であり、そ
して酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げ
られ得る。好ましい実施態様では、抗体は、(1)Lowry方法によって決定
される場合95%重量を越える抗体、および最も好ましくは99%重量を越える
まで、(2)スピニングカップシークエネーターの使用によってN末端または内
部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、または(3
)クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元または非還元条件下
でSDS−PAGEによる均一性まで、精製される。抗体の天然環境の少なくと
も1つの成分が存在しないので、単離された抗体には、組換え細胞内でのインサ
イチュでの抗体が挙げられる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1
つの精製工程によって調製される。
るように抗体に直接または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成
物をいう。この標識は、それ自体によって検出可能であるか(例えば、放射性同
位元素標識または蛍光標識)、または酵素的標識の場合には、検出可能である基
質化合物または組成物の化学変更を触媒し得る。
細書において含まれる固相の例は、ガラス(例えば、制御された孔ガラス)、多
糖類(例えば、アガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニル
アルコール、およびシリコーンから部分的または全体が形成されるものを含む。
ある実施態様では、状況に依存して、その固相は、アッセイプレートのウェルを
含み得;他では、固相は精製カラム(例えば、アフィニティークロマトグラフィ
ーカラム)である。この用語はまた、米国特許第4,275,149号に記載の
ような別々の粒子の不連続固相を含む。
bB2抗体、および必要に応じて、化学療法剤)の送達に有用である、種々のタ
イプの脂質、リン脂質、および/または界面活性剤から構成される小胞である。
リポソームの成分は、生物学的膜の脂質整列に類似の、二層形成で普通に整列さ
れる。
る。
の共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない
細胞に免疫系細胞を標的するため(米国特許第4,676,980号)、および
HIV感染の処置のために(PCT出願公開公報第WO 91/00360号お
よび第WO 92/200373号;EP 03089)提案されている。ヘテ
ロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤
は当該技術分野で周知であり、そして多くの架橋技術とともに米国特許第4,6
76,980号に開示される。
インを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。好
ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合に所望の構造を形成すること
を可能にするVHおよびVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含む。s
Fvの総説については、Pluckthun The Pharmacolog
y of Monoclonal Antibodies,113巻,Rose
nburgおよびMoore編,Springer−Verlag,New Y
ork,pp.269−315(1994)を参照のこと。
換可能に使用され、そしてすべてのこのような名称は子孫を含む。すべての子孫
が、故意のまたは偶然の変異のため、DNA含量が正確に同一であり得ないこと
も理解される。最初の形質転換された細胞についてスクリーニングした場合に、
同じ機能または生物学的特性を有する変異体子孫が、含まれる。
NAを挿入されている、通常二本鎖の、一片のDNAをいう。外来DNAは、異
種DNAと定義され、これは、宿主細胞中に天然に見いだされないDNAである
。このベクターは、適切な宿主細胞に外来または異種DNAを輸送するために使
用される。一旦宿主細胞にはいると、ベクターは、宿主染色体DNAから独立し
て複製し得、そしてベクターおよびその挿入された(外来)DNAのいくつかの
コピーが生成され得る。さらに、このベクターは、外来DNAをポリペプチドに
翻訳することを可能にする必要なエレメントを含む。したがって、外来DNAに
よってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。
以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を
含む。適切なベクターの選択は、1)DNA増幅またはDNA発現に使用される
べきかどうか、2)ベクターに挿入されるべきDNAのサイズ、および3)ベク
ターで形質転換されるべき宿主細胞、に依存する。各ベクターは、その機能(D
NAの発現のDNAの増幅)および適合可能である宿主細胞に依存して、種々の
成分を含む。ベクター成分は、一般に、1つ以上の以下のものを含むが、これら
に限定されない:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハ
ンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
入されるTIEリガンドホモログ分子の一部であり得る。シグナル配列が異種で
あるならば、宿主細胞によって認識およびプロセシング(すなわち、シグナルペ
プチダーゼによって切断)されるように選択されるべきである。
、ompA、ompC、ompE、ompF、アルカリホスファターゼ、ペニシ
リナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIのリーダーのような、
原核生物シグナル配列である。酵母分泌については、例えば、酵母インベルター
ゼ、アミラーゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーが使用され得る
。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列が最も適切である。リストした
シグナル配列は、例示のためのみであり、そしていかなるようにも本発明の範囲
を限定しない。
宿主細胞においてベクターが複製することを可能にした核酸配列を含む。一般に
、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体から独立して
複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製する配列
を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに周知である。
周知のプラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適
切であり、酵母についての2μプラスミド起点および種々のウイルス起点(SV
40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV)は、哺乳動物細胞
におけるクローニングベクターに有用である。複製起点は、哺乳動物発現ベクタ
ーに必要ではない(SV40起点は、代表的には、初期プロモーターを含むので
、単に使用され得る)。ほとんどの発現ベクターは、「シャトル」ベクターであ
り、すなわち、これらは、少なくとも1つのクラスの生物で複製し得るが、発現
のために他の生物にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクターはE.col
iにクローニングされ、次いで同じベクターが、たとえ宿主細胞染色体から独立
して複製し得ないとしても、発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフ
ェクトされる。
えば、BacillusゲノムDNAで見いだされる配列に相補的であるDNA
配列をベクターに含むことによって、宿主としてBacillus種を使用して
、容易に達成される。このベクターでのBacillusのトランスフェクショ
ンは、ゲノムとの相同組換えおよび所望の異種ポリペプチドをコードするDNA
の挿入を生じる。しかし、ゲノムDNAの回収は、制限酵素切断が、コードされ
たポリペプチド分子を切り出すために必要とされるので、外因性の複製されたベ
クターの回収よりも複雑である。
子を含むべきである。これは、このベクターで形質転換した宿主細胞の生存また
は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在は、そ
のベクターを欠失する任意の宿主細胞が、形質転換した宿主での増殖または再生
で有利点を得ないことを確実にする。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質ま
たは他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、
またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、(b)相補的自己栄養欠損、ま
たは(c)複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給する(例えば、バチル
ス属についてのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)、タンパク質をコ
ードする。
。異種遺伝子でうまく形質転換される細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発
現し、したがって選択レジメを生存する。このような優勢選択の例は、薬物ネオ
マイシン[Southernら,J.Molec.Appl.Genet.1,
327(1982)]、ミコフェノール酸[Mulliganら,Scienc
e 209,1422(1980)]、またはハイグロマイシン[Sudgen
ら,Mol.Cel.Biol.5,410−413(1985)]を使用する
。上記の3つの例は、それぞれ、適切な薬物G418またはネオマイシン(ゲネ
チシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、あるいはハイグロマイシンに対する
耐性を与えるために真核生物制御下で細菌遺伝子を用いる。哺乳動物細胞に適切
な選択可能マーカーの他の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)または
チミジンキナーゼである。このようなマーカーは、所望の核酸を取り込むために
コンピテントであった細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体は、形
質転換体のみが、そのマーカーを取り込むことによって生存するために独特に適
合される選択圧下に、配置される。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度がうまく
変化する条件下で形質転換体を培養することによって課され、それによって、選
択遺伝子および所望のポリペプチドをコードするDNAの両方の増幅を導く。増
幅は、増殖に重要なタンパク質の産生に非常に需要がある遺伝子が、組換え細胞
のうまくいった生成の染色体内で直列に繰り返されるプロセスである。所望のポ
リペプチドの増加した量は、増幅したDNAから合成される。
ン、およびチミジンを含まない培養培地中ですべての形質転換体を培養すること
によって、最初に同定される。この場合に適切な宿主細胞は、DHFR活性を欠
失するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株であり、Urlaubおよ
びChasin,Proc.Nat’l.Acad.Sci USA 77、4
216(1980)に記載のように調製および増殖される。特に有用なDHFR
は、MTX(EP 117,060)に非常に耐性である、変異体DHFRであ
る。この選択薬剤は、内因性DHFRの存在にもかかわらず、さもなければ適切
な任意の宿主、例えば、ATCC No.CCL61 CHO−K1とともに使
用され得る。次いで、DHFRおよび所望のポリペプチドをコードするDNAは
、それぞれ、DHFRを不活化する薬剤(メトトレキサート、またはMTX)へ
の曝露によって増幅される。細胞が、常に大きいMTX濃度のうまくいったラウ
ンドで増殖し得る細胞についてのみ選択することによって、より多くのDHFR
を必要とする(そして結果としてすべての外因性DNAを増幅する)ことを確実
にする。あるいは、所望のポリペプチド、野生型DHFR、およびneo遺伝子
のようなもう1つの選択可能マーカーをコードする遺伝子で同時形質転換した宿
主は、G418のような選択可能マーカーについての選択薬剤を使用して同定さ
れ得、次いで内因性DHFRを含む野生型宿主中でメトトレキサートを使用して
選択および増幅される(米国特許第4,965,199号も参照のこと)。
trp1遺伝子である(Stinchcombら,1979,Nature 2
82:39;Kingsmanら,1979,Gene 7:141;またはT
schemperら,1980,Gene 10:157)。trp1遺伝子は
、トリプトファン中で増殖する能力のない酵母の変異体株、例えば、ATCC
No.44076またはPEP4−1(Jones,1977,Genetic
s 85:12)についての選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞ゲ
ノム中のtrp1障害の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による形質転
換を検出するために効果的な環境を提供する。同様に、Leu2欠失酵母株(A
TCC 20,622または38,626)は、Leu2遺伝子を有する公知の
プラスミドによって補充される。
されそして所望のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモ
ーターを含むべきである。プロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳
を制御する、構造遺伝子(一般に約100〜1000bp以内)の開始コドンか
ら上流に位置する非翻訳配列である。これらは、代表的には、2つのクラス、誘
導性および構成性に分かれる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変
化、例えば、栄養の存在または不在あるいは温度変化に応じて、その制御下でD
NAからの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。この時、種々の
可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。こ
れらのプロモーターは、制限酵素切断によって起源の遺伝子から取り出され、次
いで発現されるべきポリペプチドについての開始コドンの5’への挿入によって
、所望のポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結される。これは、T
IEリガンドホモログについてのゲノムプロモーターが使用可能ではないことを
いうのではない。しかし、異種プロモーターは、一般に、ネイティブなTIEリ
ガンドホモログプロモーターと比較した場合、発現したTIEリガンドホモログ
のより大きい転写および高い収量を生じる。
クトースプロモーター系(Changら,Nature 275:615(19
78);およびGoeddelら,Nature 281:544(1979)
)、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Go
eddel,Nucleic Acids Res.8:4057(1980)
および欧州特許出願公開公報第36,776号)、およびtacプロモーターの
ようなハイブリッドプロモーター(H.de Boerら,Proc.Nat’
l.Acad.Sci USA 80:21−25(1983))が挙げられる
。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。それらのヌクレオチド配
列は公開されており、それによって、当業者は、任意の必要とされる制限部位を
供給するためにリンカーまたはアダプターを使用してTIEリガンドホモログを
コードするDNAに作動可能に連結することを可能にする(Siebenlis
tら,Cell 20:269(1980))。細菌系での使用のためのプロモ
ーターはまた、TIEリガンドホモログをコードするDNAに作動可能に連結さ
れるシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を含む。
ナーゼ(Hitzemanら J.Biol.Chem.255:2073(1
980))または他の解糖系酵素(例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−
3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、
ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ)(Hessら,J.A
dv.Enzyme Reg.7:149(1978);およびHolland
,Biochemistory 17:4900(1978))のプロモーター
が挙げられる。
ーである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシト
クロームC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース
およびガラクトース利用に応答する酵素についてのプロモーター領域である。酵
母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、R.Hi
tzemanら,EP 73,657Aに記載される。酵母エンハンサーはまた
、酵母プロモーターと有利に使用される。
生物遺伝子は、転写が開始される部位から約25〜30塩基上流に位置するAT
リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から70〜80塩基上流に見い
だされるもう1つの配列は、CXCAAT領域であり、ここでXは任意のヌクレ
オチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の3’末端にはコード配列の3’
末端へのポリAテイルの付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列が存
在する。これらの配列のすべては、哺乳動物発現ベクターに適切に挿入される。
リオーマウイルス、トリポックスウイルス(1989年7月5日に公開された英
国特許2,211,504)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、
ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウ
イルス、B型肝炎ウイルス、のようなウイルス、および最も好ましくはシミアン
ウイルス40(SV40)のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、
アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロ
モーターから、ならびにこのようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能である
ならば、TIEリガンド配列に通常付随するプロモーターから、得られるプロモ
ーターによって制御され得る。
点をも含むSV40制限フラグメントとして便利に得られる[Fiersら、N
ature 273:113(1978)、MulliganおよびBerg,
Science 209,1422−1427(1980);Pavlaski
ら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 78,7398−740
2(1981)]。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、Hin
dIII E制限フラグメントとして便利に得られる[Greenawayら,
Gene 18,355−360(1982)]。ベクターとしてウシパピロー
マウイルスを使用して哺乳動物宿主中でDNAを発現するための系は、US 4
,419,446に開示される。この系の改変は、US 4,601,978に
記載される。サル細胞中でヒト免疫インターフェロンをコードするcDNAを発
現することにおいてはGrayら,Nature 295,503−508(1
982);単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下
で、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンcDNAを発現することにお
いてはReyesら,Nature 297,598−601(1982);培
養したマウスおよびウサギ細胞におけるヒトインターフェロンβ1遺伝子の発現
においてはCanaaniおよびBerg,Proc.Natl.Acad.S
ci USA 79,5166−5170(1982);ならびにプロモーター
としてラウス肉腫ウイルス長末端反復を使用するCV−1サル腎臓細胞、ニワト
リ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、およびマウ
スNIH−3T3細胞における細菌CAT配列の発現においてはGormanら
,Proc.Natl.Acad.Sci USA 79,6777−6781
(1982)も参照のこと。
写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する
。エンハンサーは、その転写を増加させるためにプロモーターで作用する、通常
約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、
転写ユニットに対して5’[Laiminsら,Proc.Natl.Acad
.Sci USA 78,993(1981)]および3’[Laskyら,M
ol.Cel.Biol.3,1108(1983)]、イントロン内[Ban
erjiら,Cell 33,729(1983)]ならびにコード配列自体内
[Osborneら,Mol.Cel.Biol.4,1293(1984)]
に見いだされており、比較的配向および位置非依存的である。多くのエンハンサ
ー配列は、現在は、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α
−フェトプロテイン、およびインスリン)由来で公知である。しかし、代表的に
は、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例には、複製起点の
後ろ側におけるSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウ
イルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側におけるポリオーマエ
ンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモ
ーターの活性化のためのエレメントを増強することにおいてはYaniv,Na
ture 297,17−18(1982)も参照のこと。エンハンサーは、T
IEリガンドDNAの5’または3’の位置でベクターに組み込まれ得るが、好
ましくは、プロモーターから5’の部位に位置する。
胞生物からの核を形成した細胞)で使用される発現ベクターはまた、転写の終結
およびmRNAを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は、真核
生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および時には3’非翻訳領域か
ら一般に利用可能である。これらの領域は、TIEリガンドホモログをコードす
るmRNAの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写された
ヌクレオチドセグメントを含む。3’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。
構築は、標準的ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはDNA
フラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生
成することが所望される形態に再ライゲートされる。
ゲーション混合物は、E.coli K12株294(ATCC 31,446
)を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるア
ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からの
プラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ切断によって分析され、およ
び/またはMessingら,Nucleic Acids Res.9,30
9(1981)の方法によってか、またはMaxamら,Methods in
Enzymology 65,499(1980)の方法によって配列決定さ
れる。
現を提供する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性
発現は、宿主細胞に効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、
宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによっ
てコードされる高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。適切な発現ベクタ
ーおよび宿主細胞を含む一過性の系は、クローンDNAによってコードされるポ
リペプチドの便利な陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性につ
いてのこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがっ
て、一過性発現系は、TIEリガンドホモログのアナログおよび改変体を同定す
る目的のために、本発明で特に有用である。
な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Gettingら,Nature
293,620−625(1981);Mantelら,Nature 281
,40−46(1979);Levinsonら;EP 117,060および
EP 117,058に記載される。TIEリガンドポリペプチドの哺乳動物細
胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、pRK5(EP 307,247)、
その他に、sp6転写開始部位、次いでXho/NotII cDNAクローニ
ング部位の前のSfiI制限酵素部位を有するpRK5D、およびSfiI部位
を含まないpRK5Dの前駆体のpRK5Bのような、pRK5の誘導体である
;Holmesら,Science 253,1278−1280(1991)
を参照のこと。
ン技術を用いる。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントは、切断され
、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形
態に再ライゲートされる。
ゲーション混合物は、E.coli K12株294(ATCC 31,446
)を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるア
ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からの
プラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ切断によって分析され、およ
び/またはMessingら,Nucleic Acids Res.9,30
9(1981)の方法によってか、またはMaxamら,Methods in
Enzymology 65,499(1980)の方法によって配列決定さ
れる。
する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、
宿主細胞で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞
は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコード
される高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。Sambrookら,前出
,pp.16.17−16.22。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一
過性発現系は、所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなポリペ
プチドの便利なポジティブスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発
現系は、必要な生物学的活性を有する天然のTIEリガンドホモログのアナログ
および改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。
質の機能的誘導体を含む)の合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および
宿主細胞は、Gethingら,Nature 293,620−625(19
81);Manteiら,Nature 281,40−46(1979);L
evinsonら;EP 117,060およびEP 117,058に記載さ
れる。TIEリガンドホモログの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミ
ドは、pRK5(EP 307,247)またはpSV16B(PCT公開公報
第WO 91/08291号)である。
記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、グ
ラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、E.coliまたはバチルス属が挙げ
られる。好ましいクローニング宿主は、E.coli 294(ATCC 31
,446)であるが、E.coli B、E.coli X1776(ATCC
31,537)、E.coli W3110(ATCC 27,325)、P
seudomonas種のような他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、ま
たはSerratia Marcesansが適切である。
クターに適切な宿主である。Saccharomyces cerevisia
eまたは一般のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般に使用さ
れる。しかし、多くの他の属、種、および株は一般に利用可能であり、そして本
発明で有用であり、例えば、S.pombe[BeachおよびNurse,N
ature 290,140(1981)]、Kluyveromyces l
actis[Louvencourtら,J.Bacteriol.737(1
983)];yarrowia(EP 402,226);Pichia pa
storis(EP 183,070)、Trichoderma reesi
a(EP 244,234)、Neurospora crassa[Case
ら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 76,5259−526
3(1979)];およびA.nidulans[Ballanceら,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.112,284−289(
1983);Tilburnら,Gene 26,205−221(1983)
;Yeltonら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 81,1
470−1474(1984)]およびA.niger[KelleyおよびH
ynes,EMBO J.4,475−479(1985)]のようなAspe
rgillus宿主である。
雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を行い得る。原則として、脊椎動物ま
たは無脊椎動物のいずれかからの、任意の高等真核生物培養物は作動可能である
が、ヒトのような哺乳動物からの細胞が好ましい。無脊椎動物の例には、植物お
よび昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体およびSp
odoptera frugiperda(イモムシ)、Aedes aegy
pti(蚊)、Aedes albopictus(蚊)、Drosophil
a melangaster(ショウジョウバエ)、およびBombyx mo
ri宿主細胞のような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。
例えば、LuckowらBio/Technology 6,47−55(19
88);Millerら,Genetic Enginnering,Setl
ow,J.K.ら編 Vol.8(Plenum Publishing,19
86),pp.277−279;およびMaedaら,Nature 315,
592−594(1985)を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は、例
えば、Autographa californica NPVのL−1改変体
は、公衆に入手可能であり、そしてこのようなウイルスは、本発明による本発明
のウイルスとして、特にSpodoptera frugiperda細胞のト
ランスフェクションのために使用され得る。
nsの特定の株(TIEリガンドDNAを含むように既に操作されている)との
インキュベーションによってトランスフェクトされる。A.tumefacie
nsとの植物細胞培養物のインキュベーション中、TIEリガンドをコードする
DNAは、トランスフェクトされるように植物細胞宿主に移入され、そして適切
な条件下で、TIEリガンドDNAを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプ
ロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と適合可能な調
節およびシグナル配列は、利用可能である。Depickerら,J.Mol.
Appl.Gen.1,561(1982)。さらに、T−DNA 780遺伝
子の上流領域から単離されたDNAセグメントは、組換えDNA含有植物組織に
おいて植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増加し得る。1989年
6月21日に公開されたEP 321,196を参照のこと。
椎動物細胞の増殖はそれ自体周知である。Tissue Culture,Ac
ademic Press,KruseおよびPatterson編(1973
)を参照のこと。有用な哺乳宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換され
たサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓
細胞株[293細胞または、懸濁培養物中の増殖のためにサブクローニングした
293細胞、Grahamら,J.Gen.Virol.36,59(1977
)];ベビーハムスター腎臓細胞9BHK(ATCC CCL 10);チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR[CHO、UrlaubおよびChas
in,Proc.Natl.Acad.Sci USA 77,4216(19
80)];マウスセルトリ細胞[TM4、Mather,Biol.Repro
d.23,243−251(1980)];サル腎臓細胞(CV1 ATCC
CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC C
RL−1587);ヒト子宮頚部ガン腫細胞(HeLa、ATCC CCL 2
);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット
肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W13
8、ATCC CCL75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065)
;マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細
胞[Matherら,Annals N.Y.Acad.Sci.383,44
068(1982)];MRC 5細胞;FS4細胞;およびヒト肝ガン細胞株
(Hep G2)である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓293およびチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞である。
産生する脊椎動物細胞である。
ーニングベクターで形質転換され、そしてプロモーターを誘導するかまたは増幅
した遺伝子を含む形質転換体を選択するために適切であるように改変された従来
の栄養培地中で培養される。
、一般にSambrookら,前出に記載のように適切な培地中で培養される。
ma)、最少必須培地(MEM,Sigma)RPMI−1640(Sigma
)、およびダルベッコの改変イーグル培地(DMEM,Sigma)のような市
販の培地は、宿主細胞を培養するために適切である。さらに、HamおよびWa
llace,Meth.Enzymol.58,44(1979);Barne
sおよびSato、Anal.Biochem.102,255(1980)、
US 4,767,704;4,657,866;4,927,762;または
4,560,655;WO 90/03430;WO 87/00195、また
は米国再特許30,985に記載の培地のいずれかが、宿主細胞のための培養培
地として使用され得る。これらの培地のいずれかは、ホルモンおよび/または他
の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子)、
塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸)、緩
衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシンおよびチミジ
ン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬物)、微量元素(μモル範囲での
最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される)、およびグルコースまた
は等価のエネルギー源が必要な場合に補充され得る。任意の他の必要な補充物は
また、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどのような培
養条件は、適切には、場合によっては、クローニングまたは発現のために選択さ
れる宿主とともにこれまで使用された条件であり、そして当業者には明らかであ
る。
物または植物内にある細胞を含む。
EリガンドホモログをコードするDNAを既に含む細胞に導入された制御エレメ
ントを利用する組換え産生方法で、産生され得ることが、さらに想像される。
適切に標識されたプローブを使用する便利なサザンブロッティング、mRNAの
転写を定量するためのノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Na
tl.Acad.Sci USA 77,5201−5205(1980)]、
ドットブロッティング(DNA分析)、またはインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンによって、試料中で直接的に測定され得る。種々の標識が用いられ得、最も
一般には、放射性同位体、特に32Pである。しかし、ポリヌクレオチドへの導入
のためにビオチン改変化ヌクレオチドを使用するような、他の技術も用いられ得
る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用
し、これは放射性同位元素、蛍光体、酵素などのような広範な標識で標識され得
る。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、およびDNA−RNAハイブリッ
ド二重鎖またはDNA−タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識し得る抗
体が用いられ得る。抗体は、次に、標識され得、そしてアッセイは、二重鎖が表
面に結合される場合に行われ得、そのため表面上での二重鎖の形成の際に、その
二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイのような、免
疫学的方法によって測定され得る。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料は、
代表的には、脱水および固定、次いで遺伝子産物に特異的な標識された抗体との
結合反応によって調製され、ここで、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識などの
ような標識は、通常、可視で検出可能である。本発明での使用に適切な特に感度
の高い染色技術は、Hseら,Am.J.Clin.Pharm.75,734
−738(1980)に記載される。
クローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の動物で調製
され得る。都合よく、その抗体は、本発明の天然のTIEリガンドホモログポリ
ペプチドに対して、または以下にさらに記載されるような本発明で提供されるD
NA配列に基づく合成ペプチドに対して、調製され得る。
るいはペリプラズム空間または培養培地中に分泌され得、そして、代表的には、
宿主細胞ライセートから回収される。組換えリガンドは、安定なタンパク質のそ
の後の形成を考慮して、任意の技術によって精製され得る。
、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、リガン
ドについて実質的に均質である調製物を得るために組換え細胞タンパク質または
ポリペプチドからTIEリガンドホモログを精製することが必要である。第1の
工程としては、培養培地またはライセートを遠心分離して、粒子状の細胞デブリ
を除去する。次いで、膜および可溶性タンパク質画分を分離する。次いで、TI
Eリガンドホモログは、可溶性タンパク質画分から精製され得る。以下の手順は
、適切な精製手順の例である:イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムで
の分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカでまたはDEAEのような陽イ
オン交換樹脂でのクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PA
GE;硫酸アンモニウム沈殿;例えば、Sephadex G−75を使用する
ゲル濾過;およびIgGのような夾雑物を除去するためのプロテインA Sep
haroseカラム。
機能的誘導体は、変更によって生じた特性の任意の実質的変化を考慮して、天然
のリガンドと同じ様式で回収される。例えば、TIEリガンドホモログと、もう
1つのタンパク質またはポリペプチド、例えば、細菌またはウイルス抗原との融
合物は、精製を容易にし;抗原に対する抗体を含むイムノアフィニティーカラム
は、融合物を吸着するために使用され得る。ウサギポリクローナル抗TIEリガ
ンドホモログカラムのようなイムノアフィニティーカラムは、少なくとも1つの
残っている免疫エピトープに結合することによってTIEリガンドホモログ改変
体を吸着するために用いられ得る。フェニルメチルスルホニルフルオライド(P
MSF)のようなプロテアーゼインヒビターはまた、精製中のタンパク質分解を
阻害するために有用であり得、そして抗生物質は、偶然の夾雑物の増殖を防ぐた
めに含まれ得る。本発明のTIEリガンドホモログは、公知または本発明以降に
発見される、TIEレセプター、例えば、TIE−2に結合する能力に基づいて
、アフィニティークロマトグラフィーによって便利に精製される。
し得ること、そしてこのことが組換え細胞培養物中での発現の際に天然のTIE
リガンドホモログまたはその改変体の特徴の変化を説明することを理解する。
発現する細胞の生存および/または増殖および/または分化を促進することに有
用である。
るためにさらに使用され得る。この目的ために、検出可能に標識されたリガンド
を、TIEレセプターへの結合を可能にする条件下で標的細胞と接触させ、そし
て結合はモニターされる。
モログを発現する細胞をテスト分子に曝露すること、そして直接的検出によって
または二次的生物学的効果に基づいてのいずれかで、テスト分子のTIEレセプ
ターへの特異的結合を検出することによって、TIEリガンドホモログの生物学
的活性を提示する分子を同定するために使用され得る。このアプローチは、TI
Eリガンドファミリーの新しいメンバーを同定するために、あるいはペプチドま
たは非ペプチド小分子ライブラリーをスクリーニングするために、特に適切であ
る。
成長に、または筋肉増殖または発育に重要な役割を果たし、および/あるいは血
管新生を促進または阻害する、天然のTIEレセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストを同定するように設計されたスクリーニングアッセイで有用である。
例えば、TIEレセプターのアンタゴニストは、例えば、BIAcoreバイオ
センサー技術(BIAcore;Pharmacia Biosensor,M
idscataway,N.J.)を使用することによって;または本発明の生
物学的に活性なTIEリガンドホモログによって引き起こされる生物学的応答を
ブロックする能力をモニターすることによって、測定されるように、天然のTI
Eレセプターへの本発明のTIEリガンドホモログの結合をブロックする能力に
基づいて同定され得る。モニターされ得る生物学的応答には、例えば、TIEレ
セプターまたはTIEシグナル伝達経路の下流の成分のリン酸化、あるいは、T
IEレセプターを発現する細胞の生存、増殖、または分化が挙げられる。TIE
レセプターを発現するようにか、またはTIEレセプターおよび本発明のTIE
リガンドホモログを同時発現するように操作された、TIEレセプターを正常に
発現しない細胞を利用する細胞ベースのアッセイは、使用に特に便利である。
タゴニストは、TIEリガンド/TIEレセプター相互作用を妨害する能力に基
づいて、同定され得る。TIEレセプターへのテスト分子の特異的結合を測定す
るために多くの方法があり、これには、TIEレセプターを発現するインタクト
な細胞の表面に結合したか、細胞ライセート中のTIEレセプターに架橋したテ
スト分子の量か、またはインビトロでTIEレセプターに結合した、テスト分子
の量を検出または測定することが含まれ、これに限定されない。
例えば、125I、蛍光物質、酵素活性を有する物質(好ましくは、比色検出に適 切な)、酵素のための基質(好ましくは、比色検出に適切な)、または(検出可
能に標識された)抗体分子によって認識され得る物質に共有または非共有結合し
たTIEリガンドホモログが挙げられる。
O 96/11269に記載されるものと類似の方法で行われ得る。
dhesin)の形態で必要に応じて使用されるTIEレセプターを精製するた
めに有用であり、TIEリガンドホモログまたはそのTIEレセプター結合部分
は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域に融合される。
能的誘導体はまた、内皮細胞増殖を阻害することおよび/または内皮細胞アポト
ーシスを誘導することに有用である。
出することに有用である。細胞または組織切片は、ハイブリダイズ条件下で本発
明のTIEリガンドホモログをコードする検出可能に標識された核酸分子と接触
され得、そして核酸分子にハイブリダイズしたmRNAの存在を決定し、それに
よってTIEリガンドホモログの発現を検出する。さらに、腫瘍(ガン)細胞で
増幅される本発明のTIEリガンドホモログをコードする核酸は、腫瘍(ガン)
の診断に有用である。
を測定するためにイムノアッセイで使用され得る。生物学的試料は、本発明のT
IEリガンドホモログを特異的に結合する抗体または抗体混合物と接触され、そ
してテスト試料に存在するリガンドと形成された複合体の量が測定される。
セプターを発現する細胞に対する、細胞傷害性分子、例えば、放射性同位元素ま
たはトキシン、あるいは治療薬剤の送達に有用であり得る。治療薬剤は、例えば
、TIE−2リガンドを含む他のTIEリガンド、血管内皮増殖因子(VEGF
)ファミリーのメンバー、公知の抗腫瘍薬剤、および筋肉増殖または発育、ある
いは骨発生、成熟、または増殖に関連することが公知の薬剤であり得る。
患状態を検出するために、診断薬剤として適切である。したがって、検出可能に
標識されたTIEリガンドホモログおよびTIEレセプターの抗体アゴニストは
、血管新生の存在をイメージングするために使用され得る。
ために使用され得、そして腫瘍増殖を阻害するために有用であり得る。
ドホモログ抗体は、それぞれのTIEリガンドホモログをコードする遺伝子の増
幅に関連する腫瘍(ガン)の診断および処置にさらに有用である。
調節が挙げられる。
ドホモログ抗体は、全身または局所適用に適切な、薬理学的に受容可能なベヒク
ルとの混合物中に活性成分を含む治療組成物として処方される。本発明の薬学的
組成物は、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有す
る活性成分を、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安
定化剤と混合することによって、貯蔵のために調製される(Remington
’s Pharmaceutical Sciences 16版,Osol,
A.編(1980))。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、用い
られる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン
酸、および他の有機酸のような緩衝剤;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子
量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グ
ロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;
グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミ
ノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、お
よび他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤;マンニトールまたはソルビ
トールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成カウンターイオン;お
よび/またはTween、Pluronics、またはPEGのような非イオン
性界面活性剤を含む。
化、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロ
カプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート(methylmethacyl
ate))マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に、コロイ
ド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエ
マルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル)に、またはマクロエマル
ジョンに捕らえられ得る。このような技術は、Remington’s Pha
rmaceutical Sceinces,前出に開示される。
凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過メンブランを通す濾過によって
容易に行われる。
皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイ
アル中に配置される。
たは病巣内経路による注射または注入、局所投与、または持続放出システムによ
る、公知の方法に従う。
クロカプセルでの、半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリク
スには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許3,773,91
9、EP 58,481)、L−グルタミン酸とガンマエチル−L−グルタミン
酸とのコポリマー(U.Sidmanら,1983,「Biopolymers
」22(1):547−556)、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート
)(R.Langerら,1981,「J.Biomed.Mater.Res
.」15:167−277およびR.Langer,1982,Chem.Te
ch.12:98−105)、エチレンビニル酢酸(R.Langerら,同上
)、またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP 133,988A)
が挙げられる。持続放出組成物はまた、リポソームを含む。本発明の範囲内の分
子を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される:DE 3,2
18,121A;Epsteinら,1985,「Proc.Natl.Aca
d.Sci USA」82:3688−3692;Hwangら,1980,「
Proc.Natl.Acad.Sci USA」77:4030−4034;
EP 52322A;EP 36676A;EP 88046A;EP 143
949A;EP 142641A;日本国特許出願83−118008;米国特
許4,485,045および4,544,545;およびEP 102,324
A。もともと、リポソームは、脂質含量が約30mol.%を越えるコレステロ
ールである小さい(約200〜800オングストローム)単層タイプであり、選
択された割合は、最適なNT−4治療に対して調節される。
路、および患者の症状に依存する。したがって、投与量を滴定し、そして最適な
治療効果を得るために必要とされる投与経路を改変することが、治療医師には必
要である。代表的な1日の用量は、上記の要素に依存して、約1μg/kg〜1
00mg/kg以上の範囲であり得る。代表的には、臨床医は、必要とされる生
物学的効果を提供する投与量に達するまで、本発明の分子を投与する。この治療
の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
遺伝子の増幅) 原核生物および真核生物のゲノムは、2つの一見相反することが求められる。
1つは、複数世代を通じて安定な遺伝を保証するための、そのオリジナルな形態
での遺伝情報としてのDNAの保存および増殖である。他方、細胞または生物は
、無限に続く環境変化に適応し得なければならない。適応機構は、遺伝物質の質
的改変または量的改変を含み得る。質的改変はDNA変異を含み、このDNA変
異によりコード配列が変えられ、構造的および/または機能的に異なるタンパク
質をもたらす。遺伝子増幅は量的改変であり、これにより完全なコード配列(す
なわち、遺伝子)の実数が増加し、これは、利用可能な転写鋳型数の増加、翻訳
可能な転写物数の増加、そして最後に、増幅遺伝子によりコードされるタンパク
質量の増加を導く。
核生物の培養系においてインビトロで調べられてきた。遺伝子増幅の最もよく特
徴付けられた例は、種々の濃度の細胞傷害薬物メトトレキサート(MTX)を含
む培地での真核生物細胞培養を含む。MTXは葉酸アナログであり、そして酵素
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をブロックすることによりDNA合成を
妨げる。低濃度のMTXへの初期暴露間に、たいていの細胞(>99.9%)は
死滅する。少数の細胞は生き残り、そして多量のDHFR−RNAおよびタンパ
ク質を生成することにより漸増濃度のMTXにおいて増殖し得る。この過剰生成
の基礎は、単一のDHFR遺伝子の増幅である。この遺伝子のさらなるコピーは
、小さく余分な染色体形態の染色体外コピー(二重微小(double min
ute))として、または組込まれた染色体コピーとして見出される。
する化学療法剤)耐性の発生、および悪性形質転換において最も一般的に遭遇す
る。自発的事象としての、またはウイルスもしくは化学的/環境的傷害による真
核生物細胞の形質転換は、代表的に、その細胞の遺伝物質の変化と関連する。ヒ
ト悪性腫瘍において観察される最も一般的な遺伝子変化の1つは、p53タンパ
ク質の変異である。p53は、定常(G1)期から複製(S)期への細胞の移行
を制御し、そしてDNA損傷の存在下でのこの移行を妨げる。言い換えれば、無
力化p53変異の主な結果の1つは、DNA損傷(すなわち遺伝子変化)の蓄積
および増殖である。点変異に加えて、新生物細胞における遺伝子変化の一般的な
型は、増幅および著しい構造的変化(例えば、転座)である。
的要求を示し得る。従って、あるガン遺伝子の悪性腫瘍における増幅は、これら
の遺伝子の、悪性形質転換プロセスおよび形質転換表現型維持における原因とな
る役割を示す。この仮説は、最近の研究において支持された。例えば、bcl−
2タンパク質は、ある型の非ホジキンリンパ腫において増幅されることが見出さ
れた。このタンパク質はアポトーシスを阻害し、そして新生物細胞の累進的な蓄
積を導く。増殖因子レセプター遺伝子ファミリーのメンバーは、種々の型のガン
において増幅されることが見出され、これは、これらのレセプターの過剰発現に
より新生物細胞が、限定量の利用可能な増殖因子により非感受性になり得ること
を示唆する。例は、アンドロゲン欠乏(deprivation)治療間での再
発前立腺ガンにおけるアンドロゲンレセプター増幅、および乳ガンにおける増殖
因子レセプターホモログERB2増幅を含む。最後に、細胞内シグナリングおよ
び細胞周期進行の制御に関与する遺伝子は、悪性形質転換間に増幅を受け得る。
これは、種々の上皮新生物およびリンパ新生物におけるbcl−1およびras
遺伝子の増幅により例示される。
し得るので、新生物における増幅DNA配列を同定する実現可能性を例示する。
ERB2の場合もまた、トランスフォーミングタンパク質が腫瘍治療に対する新
規かつ特異的な標的を示し得るので、治療上の見地から実現可能性を証明する。
胞から調製した染色体スプレッドの古典的な細胞遺伝学的解析は、全体の構造変
化(例えば、転座、欠失、および逆位)を同定するのに適する。増幅されたゲノ
ム領域は、それらが高コピー数の大きな領域を含むか、または染色体外物質とし
て存在する場合、視覚化することしかできない。細胞遺伝学は、特異的な染色体
変化と特定の新生物との一致した関連を証明する最初の技術であったが、一方、
処理可能なDNA配列の同定および単離には不適切である。より最近開発された
比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)技術により、新生物におけるゲノ
ム増幅の広範な現象が例証された。腫瘍DNAおよび正常DNAは、中期の正常
細胞に同時にハイブリダイズされ、そして全ゲノムは、増大した頻度で腫瘍に存
在するDNA配列の画像解析によりスクリーニングされ得る。(WO 93/1
8,186;Grayら、Radiation Res,137,275−28
9(1994))。スクリーニング法として、この型の解析により、種々のヒト
新生物において多数の繰返し発生するアンプリコン(増幅DNAの範囲)が明ら
かにされた。CGHは、DNAの増幅範囲の同定に関して古典的な細胞遺伝学的
解析より感度が高いが、標準的な分子遺伝学的技術によるアンプリコン内のコー
ド配列の迅速な同定および単離を可能にしない。
CR)に基づくアッセイである。これらのアッセイは、出発物質として非常に少
量の腫瘍DNAを利用し、極めて感度が高く、さらなる分析(例えば、配列決定
)を受け得るDNAを提供し、そして高容量(high−volume)スルー
プット分析に適する。
同定するために組み合せて使用される。細胞遺伝学的解析およびCGHは、増幅
領域の全ゲノムを詳しく調べるためのスクリーニング法を表すが、一方、PCR
に基づくアッセイは、コード配列(すなわち、増幅領域における遺伝子)の最終
的な同定に最も適する。
脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍を含む)また
は腫瘍細胞株に由来するDNAを、健康なドナーに由来するプールDNAと比較
することによる、定量的PCR(S.Gelminiら、Clin.Chem,
43,752(1997))により同定された。定量的PCRは、TaqMan
器具(ABI)を用いて行われた。遺伝子特異的プライマーおよび蛍光原(fl
uorogenic)プローブは、DNAのコード配列に基づいて設計された。
C769)、Calu−6(SRCC770)、H157(SRCC771)、
H441(SRCC772)、H460(SRCC773)、SKMES−1(
SRCC774)、およびSW900(SRCC775)を含み、全てATCC
から入手可能である。一次ヒト肺腫瘍細胞は、通常、腺ガン、扁平上皮ガン、大
細胞ガン、非小細胞ガン、小細胞ガン、および気管支肺胞ガンに由来し、そして
例えば、SRCC724(扁平上皮ガン、「SqCCa」と省略)、SRCC7
25(非小細胞ガン、「NSCCa」と省略)、SRCC726(腺ガン、「A
denoCa」と省略)、SRCC727(腺ガン)、SRCC728(扁平上
皮ガン)、SRCC729(腺ガン)、SRCC730(腺ガン/扁平上皮ガン
)、SRCC731(腺ガン)、SRCC732(扁平上皮ガン)、SRCC7
33(腺ガン)、SRCC734(腺ガン)、SRCC735(気管支肺胞ガン
、「BAC」と省略)、SRCC736(扁平上皮ガン)、SRCC738(扁
平上皮ガン)、SRCC739(扁平上皮ガン)、SRCC740(扁平上皮ガ
ン)、SRCC740(肺細胞ガン、「LCCa」と省略)を含む。
76)、SW620(結腸腺ガンのリンパ節転移、SRCC777)、COLO
320(腺ガン、SRCC778)、HT29(腺ガン、SRCC779)、H
M7(ガン腫、SRCC780)、CaWiDr(腺ガン、srcc781)、
HCT116(ガン腫、SRCC782)、SKCO1(腺ガン、SRCC78
3)、SW403(腺ガン、SRCC784)、LS174T(ガン腫、SRC
C785)、およびHM7(ATCC結腸腺ガン細胞株LS 174Tの高ムチ
ン産生改変体、Robert Warren博士、UCSFから得た)を含む。
一次結腸腫瘍は、CT2(SRCC742)、CT3(SRCC743)、CT
8(SRCC744)、CT10(SRCC745)、CT12(SRCC74
6)、CT14(SRCC747)、CT15(SRCC748)、CT17(
SRCC750)、CT1(SRCC751)、CT4(SRCC752)、C
T5(SRCC753)、CT6(SRCC754)、CT7(SRCC755
)、CT9(SRCC756)、CT11(SRCC757)、CT18(SR
CC758)、ならびにDcR3、BACrev、BACfwd、T160、お
よびT159と呼ばれる結腸腺ガンを含む。
35s(SRCC760)、T47D(SRCC761)、MB468(SRC
C762)、MB175(SRCC763)、MB361(SRCC764)、
BT20(SRCC765)、MCF7(SRCC766)、SKBR3(SR
CC767)を含む。
種々のヒト組織におけるmRNA発現を決定することにより)確かめられ得る。
現は、本明細書中に提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを用いた
、従来のサザンブロッティング、mRNA転写を定量するためのノーザンブロッ
ティング(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
7:5201−5205(1980))、ドットブロッティング(DNA分析)
、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより測定され得る。あるいは、
特定の二重鎖(DNA二重鎖、RNA二重鎖、およびDNA−RNAハイブリッ
ド二重鎖もしくはDNA−タンパク質二重鎖を含む)を認識し得る抗体が使用さ
れ得る。
片の免疫組織化学的染色、および遺伝子産物発現を直接定量するための細胞培養
物または体液のアッセイ)により測定され得る。免疫組織化学的染色および/ま
たはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナ
ルのいずれかであり得、そして任意の哺乳動物において調製され得る。好都合な
ことに、抗体は、ネイティブな配列のTIEリガンドホモログポリペプチドに対
して、または本明細書中に提供されるDNA配列に基づく合成ペプチドに対して
、またはTIEリガンドホモログDNAに融合し、かつ特定の抗体エピトープを
コードする外因性配列に対して調製され得る。抗体産生のための一般的な技術、
ならびにノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーションの
特別なプロトコルは、本明細書中以下に提供される。
要でない隣接ゲノム領域より多く増幅されているはずである。これを試験するた
めに、遺伝子は、例えば、放射線ハイブリッド分析(radiation−hy
brid analysis)により、特定の染色体にマップされ得る。次いで
、増幅レベルが、同定された位置および隣接ゲノム領域で決定される。遺伝子が
マップされたゲノム領域での選択的または優先的な増幅は、観察された遺伝子増
幅が腫瘍増殖または生存を促進する可能性と一致する。
TIEリガンドホモログ抗体の、腫瘍(ガン)細胞におけるTIEリガンドホモ
ログポリペプチドの効果を阻害する能力が試験される。例示的な抗体は、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびヘテ
ロ結合体(heteroconjugate)抗体を含み、これらの調製は本明
細書中以下に記載される。
および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ)で行われ得る。
Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual
of Techniques,147−158頁(CRC Press,Inc
.,1987)。
サンプル分析物と競合する能力に依存する。試験サンプル中の(腫瘍細胞におい
て増幅される遺伝子によりコードされる)標的タンパク質の量は、抗体に結合す
る標準の量と反比例する。結合する標準の量の決定を容易にするために、好まし
くは、抗体は、抗体に結合した標準および分析物が、結合していない標準および
分析物から都合良く分離され得るように、競合の前または後に不溶化される。
れるタンパク質の異なる免疫原部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッ
チアッセイにおいて、試験サンプル分析物は、固体支持体上に固定化された第1
の抗体に結合し、その後、第2の抗体が分析物に結合し、従って、不溶性3部分
複合体を形成する。例えば、米国特許第4,376,110号を参照のこと。第
2の抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識され得るか(直接サンドイッチア
ッセイ)、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測
定され得る(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアッセイの1
つの型はELISAアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
か、または例えば、パラフィンに包埋され、そして防腐剤(例えば、ホルマリン
)で固定され得る。
用して、遺伝子増幅アッセイの知見を確かめ、そして本明細書中で同定された遺
伝子と新生物細胞増殖の発生および病原性との間の関係をさらに理解し得る。腫
瘍またはガンの発生および病原性における本明細書中で同定された遺伝子産物の
役割は、本明細書中の遺伝子を増幅することが同定された一次腫瘍細胞または細
胞株を用いることにより試験され得る。このような細胞は、例えば、上記で列挙
された乳ガン、結腸ガン、および肺ガンの細胞および細胞株を含む。
の細胞を、本明細書中のcDNAでトランスフェクトし、そしてこれらのcDN
Aが過剰な増殖を誘導する能力を分析する。適切な細胞は、例えば、安定腫瘍細
胞株(例えば、B104−1−1細胞株(neu原ガン遺伝子でトランスフェク
トされた安定NIH−3T3細胞株)およびrasトランスフェクトNIH−3
T3細胞株)を含み、これは、所望の遺伝子でトランスフェクトし得、そして腫
瘍形成増殖についてモニターし得る。次いで、このようなトランスフェクト細胞
株を使用して、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または抗体組成
物が、形質転換細胞の増殖に対して細胞増殖抑制(cytostic)活性もし
くは細胞傷害活性を発揮することによるか、または抗体依存性細胞傷害(ADC
C)を媒介することにより、腫瘍形成細胞増殖を阻害する能力を試験し得る。本
明細書中で同定された遺伝子のコード配列でトランスフェクトされた細胞をさら
に使用して、ガン処置のための薬物候補を同定し得る。
は、本明細書中の細胞に基づくアッセイにおいて使用され得るが、安定細胞株が
好ましい。連続細胞株をトランスジェニック動物から得るための技術は、当該分
野で周知である(例えば、Smallら、Mol.Cell.Biol.5,6
42−648(1985)を参照のこと)。
る本明細書中で同定された遺伝子の役割を理解し、そして候補治療薬剤(抗体、
およびネイティブなポリペプチドの他のアンタゴニスト(小分子アンタゴニスト
を含む)を含む)の効力を試験し得る。このようなモデルのインビボ性質により
、これらはヒト患者における応答を詳しく予測する。腫瘍およびガン(例えば、
乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、肺ガンなど)の動物モデルは、非組換え動物お
よび組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、
例えば、齧歯動物(例えば、マウスモデル)を含む。このようなモデルは、標準
的な方法(例えば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎臓被膜下
の移植、またはオルトピン(orthopin)移植(例えば、結腸ガン細胞を
結腸組織に移植する))を用いて、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより
産生され得る。(例えば、1997年9月18に公開されたPCT公開番号WO 97/33551を参照のこと)。
特に、ヌードマウス)である。低形成/形成不全を伴うヌードマウスが、ヒト腫
瘍異種移植片の宿主として首尾良く機能し得るという観察により、この目的のた
めのその広範な使用が導かれた。常染色体劣性nu遺伝子は、非常に多数の別個
のヌードマウスコンジェニック系統(例えば、ASW、A/He、AKR、BA
LB/c、B10.LP、C17、C3H、C57BL、C57、CBA、DB
A、DDD、I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、
NZW、P、RIII、およびSJL)に導入された。さらに、ヌードマウス以
外の広範な種々の他の遺伝性免疫欠損を有する動物が繁殖され、そして腫瘍異種
移植片のレシピエントとして使用されてきた。さらなる詳細については、例えば
、The Nude Mouse in Oncology Research
,E.BovenおよびB.Winograd編、CRC Press,Inc
.,1991を参照のこと。
で列挙された腫瘍細胞株のいずれか、例えば、B104−1−1細胞株(neu
原ガン遺伝子でトランスフェクトされた安定NIH−3T3細胞株));ras
トランスフェクトNIH−3T3細胞;Caco−2(ATCC HTB−37
);中程度に十分分化したグレードII(grade II)ヒト結腸腺ガンの
細胞株であるHT−29(ATCC HTB−38))に由来するか、または腫
瘍およびガンに由来し得る。腫瘍細胞またはガン細胞サンプルは、標準的な条件
(液体窒素中での凍結および貯蔵を含む)を用いて、手術を受けている患者から
得られ得る(Karmaliら、Br.J.Cancer 48,689−69
6(1983))。
る。マウスの皮下(s.c.)空間は、腫瘍移植に非常に適する。腫瘍は、固形
ブロックとして、トロカール使用による針生検材料として、または細胞懸濁物と
して皮下移植され得る。固形ブロックまたはトロカール移植については、適切な
サイズの腫瘍組織断片が皮下空間に導入される。細胞懸濁物は、一次腫瘍または
安定腫瘍細胞株から新たに調製され、そして皮下注射される。腫瘍細胞はまた、
皮膚下(subdermal)移植片として注射され得る。この位置で、接種物
は、皮膚結合組織の下部と皮下組織との間に沈着される。BovenおよびWi
nograd、前出。
9129−9133(1986)により本質的に記載されるように、ラット神経
芽細胞腫細胞(これからneuガン遺伝子が最初に単離された)またはneu形
質転換NIH−3T3細胞をヌードマウスに移植することにより産生され得る。
腸ガン細胞を継代し、これらの動物において腫瘍出現を導くことにより産生され
得る。ヌードマウスにおけるヒト結腸ガンの正常位(orthotopic)移
植モデルは、例えば、Wangら、Cancer Research 54,4
726−4728(1994)およびTooら、Cancer Researc
h 55,681−684(1995)により記載されている。このモデルは、
AntiCancer,Inc.(San Diego,California
)により販売される、いわゆる「METAMOUSE」に基づく。
いで、インビトロ培養物に由来する細胞は、動物へ継代され得る。このような腫
瘍は、さらなる試験または薬物スクリーニングのための標的として役立ち得る。
あるいは、継代から得られた腫瘍は単離され、そして前継代細胞および1回以上
の継代の後に単離された細胞に由来するRNAは、目的の遺伝子のディファレン
シャルな発現について分析され得る。このような継代技術は、任意の公知の腫瘍
またはガン細胞株を用いて行われ得る。
64は、BALB/c雌マウスの化学的に誘導された線維肉腫であり(DeLe
oら、J.Exp.Med.146,720(1977))、これらは、種々の
薬剤の抗腫瘍活性を研究するための高度に制御可能なモデル系を提供する(Pa
lladinoら、J.Immunol.138,4023−4032(198
7))。簡単には、腫瘍細胞は、細胞培養においてインビトロで増殖される。動
物への注射前に、細胞株は洗浄され、そして緩衝液に、約10×106〜10× 107個細胞/mlの細胞密度で懸濁される。次いで、動物に、100〜100 μlの細胞懸濁物を皮下感染させ、腫瘍が出現するために1〜3週間放置する。
L)ガン腫は、研究用腫瘍モデルとして使用され得る。この腫瘍モデルにおける
効力は、肺小細胞ガン(SCCL)と診断されたヒト患者の処置における有益な
効果と相関してきた。この腫瘍は、罹患マウス由来腫瘍断片または培養維持細胞
の注射により正常マウスにおいて導入され得(Zupiら、Br.J.Canc
er 41,補遺4,309(1980))、そして証拠は、腫瘍が単一細胞の
注射からでさえも生じ得、そして非常に高い割合の感染腫瘍細胞が生存すること
を示す。この腫瘍モデルについてのさらなる情報については、Zacharsk
i,Haemostasis 16,300−320(1986)を参照のこと
。
は、処置前後の腫瘍サイズを測定することである。伝統的に、移植腫瘍のサイズ
は、二次元または三次元に関してノギスを用いて測定されてきた。二次元に限定
される測定は、正確に腫瘍サイズを反映せず、従って、通常、数式を用いること
により対応する体積に変換される。しかし、腫瘍サイズの測定値は、非常に不正
確である。薬物候補の治療効果は、処置誘導増殖遅延および特異的増殖遅延とし
てよりよく記載され得る。腫瘍増殖の記載における別の重要な変数は、腫瘍体積
倍加時間である。腫瘍増殖の計算および記載のためのコンピュータープログラム
もまた利用可能である(例えば、RygaardおよびSpang−Thoms
en,Proc.6th Int.Workshop on Immune−D
eficient Animals,WuおよびSheng編、Basel,1
989,301により報告されたプログラム)。しかし、処置後の壊死および炎
症応答が、実際に、少なくとも初期に腫瘍サイズの増加をもたらし得ることに留
意のこと。従って、これらの変化は、形態計測法およびフローサイトメトリー分
析の組み合わせにより、注意深くモニターされる必要がある。
するための標準的な技術を用いて、本明細書中で同定された遺伝子のコード部分
を、目的の動物のゲノムに導入することにより操作され得る。トランスジェニッ
ク操作の標的として役立ち得る動物は、制限なく、マウス、ラット、ウサギ、モ
ルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、チンパン
ジー、およびサル)を含む。トランスジーンをこのような動物に導入するための
当該分野で公知の技術は、前核マイクロインジェクション(HoppeおよびW
anger,米国特許第4,873,191号);生殖系列へのレトロウイルス
媒介遺伝子導入(例えば、Van der Puttenら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82,6148−615(1985));胚性
幹細胞における遺伝子ターゲッティング(Thompsonら、Cell 56
,313−321(1989));胚のエレクトロポレーション(Lo,Mol
.Cel.Biol.3,1803−1814(1983));精子媒介遺伝子
導入(Lavitranoら、Cell 57,717−73(1989))を
含む。概説については、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと
。
みトランスジーンを有する動物(「モザイク動物」)を含む。トランスジーンは
、単一のトランスジーンとして、またはコンカテマー(concatamer)
(例えば、頭部対頭部もしくは頭部対尾部タンデム)でのいずれかで組込まれ得
る。トランスジーンの特定の細胞型への選択的導入はまた、例えば、Lasko
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,6232−636
(1992)の技術に従うことにより可能である。
りモニターされ得る。例えば、サザンブロット分析またはPCR増幅を使用して
、トランスジーンの組込みを確かめ得る。次いで、mRNA発現レベルは、イン
サイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、PCR、または免疫
細胞化学のような技術を用いて分析され得る。動物は、さらに、腫瘍またはガン
発生の徴候について調べられる。
、動物の胚細胞に導入された、変えられた、同じポリペプチドをコードするゲノ
ムDNAとの間の相同組換えの結果として、欠損または変えられた、このポリペ
プチドをコードする遺伝子を有する「ノックアウト」動物が構築され得る。例え
ば、特定のポリペプチドをコードするcDNAを使用して、確立した技術に従っ
て、そのポリペプチドをコードするゲノムDNAをクローニングし得る。特定の
ポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部は、欠失されるか、または別の遺
伝子(例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコード
する遺伝子)で置換され得る。代表的に、数キロ塩基の変えられていない(5’
末端および3’末端両方の)隣接DNAがベクターに含まれる(相同組換えベク
ターの記載については、例えば、ThomasおよびCapecchi,Cel
l,51:503(1987)を参照のこと)。ベクターは、胚性幹細胞株に(
例えば、エレクトロポレーションにより)導入され、そして導入DNAが内因性
DNAと相同組換えした細胞は選択される(例えば、Liら、Cell,69:
915(1992)を参照のこと)。次いで、選択された細胞は、動物(例えば
、マウスまたはラット)の胚盤胞に注射されて、凝集キメラを形成する(例えば
、Bradley,Teratocarcinomas and Embryo
nic Stem Cells:A Practical Approach,
E.J.Robertson編(IRL,Oxford,1987),113−
152頁を参照のこと)。次いで、キメラ胚は適切な偽妊娠雌里親動物(pse
udopregnantfemale foster animal)に移植さ
れ、そして胚は、「ノックアウト」動物を作り出すために出産予定日まで育てら
れ得る。それらの生殖細胞に相同組換えDNAを有する子孫は標準的な技術によ
り同定され、そしてこの子孫を使用して、その動物の全細胞が相同組換えDNA
を含む動物を繁殖させ得る。ノックアウト動物は、例えば、ある病理学的状態か
ら防御するそれらの能力について、およびFIZZポリペプチドの非存在による
それらの病理学的状態の発生について特徴付けられ得る。
候補の抗力はまた、自然発生動物腫瘍の処置において試験され得る。このような
研究に適した標的は、ネコ口扁平上皮ガン(SCC)である。ネコ口SCCは、
この種で報告された口腫瘍の60%以上を占める最も一般的なネコの口悪性腫瘍
である、高度に侵襲性の悪性腫瘍である。これは、まれに離れた部位に転移する
が、この少ない転移発生数は、単に、この腫瘍を有するネコの短い生存期間の反
映であり得る。これらの腫瘍は、主にネコ口腔の解剖学的構造のために、通常、
手術できない。目下、この腫瘍に対する効果的な処置はない。研究に入る前に、
各々のネコは、完全な臨床検査、生検を受け、そしてコンピューター連動断層撮
影(CT)によりスキャンされる。舌下口扁平上皮細胞ガンと診断されたネコは
、研究から排除される。舌は、このような腫瘍の結果として麻痺するするように
なり得、そして処置により腫瘍が殺傷されてさえも、動物は、自分自身で餌を食
べることができないかもしれない。各々のネコは、長期間にわたって繰返し処置
される。腫瘍の写真は、処置期間の間毎日および各々の後の再チェックで撮影さ
れる。処置後、各々のネコは別のCTスキャンを受ける。CTスキャンおよび胸
部X線写真は、その後8週間毎に評価される。データは、コントロール群と比較
した、生存、応答、および毒性の差について評価される。陽性応答は、好ましく
は、生活の質の改善および/または寿命の増加と共に、腫瘍の緩解の証拠を必要
とし得る。
、腺ガン、リンパ腫、軟骨腫(chrondroma)、平滑筋肉腫)もまた試
験され得る。これらのうち、イヌおよびネコにおける哺乳動物腺ガンは、その出
現および性質がヒトのものと非常に類似するので好ましいモデルである。しかし
、このモデルの使用は、動物におけるこの型の腫瘍の稀な発生により制限される
。
た増幅遺伝子の過剰発現および/または活性化により特徴付けられる状態を含む
)を処置するために使用され得ることが意図される。このような抗体および他の
化合物(小有機分子および無機分子、ペプチド、アンチセンス分子などを含むが
、それらに限定されない)を用いて処置される例示的な状態または障害は、良性
腫瘍または悪性腫瘍(例えば、腎臓、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸
直腸、前立腺、膵臓、肺(ling)、外陰部、甲状腺、肝臓のガン腫;肉腫;
神経膠芽細胞腫;ならびに種々の頭部および頚部腫瘍);白血病およびリンパ悪
性腫瘍;他の障害(例えば、ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部および他
の腺、マクロファージ、上皮、支質、および分割腔の障害);ならびに炎症障害
、脈管形成障害、および免疫障害を含む。
ラスとしての静脈内投与により、または一定期間にわたる連続注入により、筋肉
内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節
内、滑液内、クモ膜下腔内、経口、局所、もしくは吸入の経路により)、哺乳動
物(好ましくは、ヒト)に投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
る。例えば、このような抗ガン剤で処置される患者はまた、放射線治療を受け得
る。あるいは、またはさらに、化学療法剤が患者に投与され得る。このような化
学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造者の説明書に従って、または当
業者により経験的に決定されるように使用され得る。このような化学療法の調製
および投薬スケジュールはまた、Chemotherapy Service,
M.C.Perry編、Williams&Wilkins,Baltimor
e,MD(1992)において記載される。化学療法剤は、抗腫瘍薬剤(例えば
、抗体)投与の前もしくは後で投与され得るか、またはそれと同時に与えられ得
る。抗体は、抗エストロゲン化合物(例えば、タモキシフェン)または抗プロゲ
ステロン(例えば、オナプリストン(onapristone))(EP 61
6812を参照のこと)と、このような分子について知られている投薬量で組み
合わされ得る。
、ErbB4、または血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体)を投与するこ
ともまた望ましくあり得る。あるいは、またはさらに、本明細書中で開示された
同じまたは2つ以上の異なる抗原を結合する2つ以上の抗体は、患者に同時投与
され得る。時々、1つ以上のサイトカインを患者に投与することもまた有益であ
り得る。好ましい実施態様において、本明細書中の抗体は、増殖阻害剤と同時投
与される。例えば、最初に増殖阻害剤が投与され、それに続いて本発明の抗体が
投与され得る。しかし、同時投与または本発明の抗体の最初の投与もまた意図さ
れる。増殖阻害剤の適切な投薬量は、現在使用される投薬量であり、そして増殖
阻害剤および本明細書中の抗体の組み合わせ作用(相乗作用)のために減らされ
得る。
適切な投薬量は、上記で定義された処置される疾患の型、疾患の重篤度および経
過、この薬剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、
患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。この薬
剤は、一度にまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与される。
よってもまたは連続注入によっても、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば
、0.1〜20mg/kg)の抗体が、患者への投与のための最初の候補投薬量
である。代表的な1日の投薬量は、上記の要因に依存して、約1μg/kg〜1
00mg/kg以上の範囲に及ぶ。数日以上にわたる反復投与については、状態
に依存して、処置は、疾患徴候の所望の抑制が現れるまで続けられる。しかし、
他の投薬量レジメが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッ
セイにより容易にモニターされる。
含む製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適切な容器は、
例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、種々の材料(例
えば、ガラスまたはプラスチック)から形成され得る。容器は、状態の診断また
は処置に効果的である組成物を保持し、そして滅菌した入口(access p
ort)を有し得る(例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴
を開けることができる栓が付いたバイアルであり得る)。組成物中の活性薬剤は
、通常、本明細書中で同定された遺伝子産物の活性を妨げ得る抗腫瘍薬剤(例え
ば、抗体)である。容器上のまたは容器に付随するラベルは、組成物が、選択し
た状態を診断または処置するために使用されることを示す。製造品は、さらに、
薬学的に受容可能な緩衝液(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー液、お
よびデキストロース溶液)を含む第2の容器を含み得る。これは、さらに、商業
的または使用者の観点から望ましい他の材料(他の緩衝液、希釈剤、フィルター
、針、注射器、および使用のための説明書が付いたパッケージ挿入物を含む)を
含み得る。
によりコードされるポリペプチドを結合するか、またはそれと複合体化するか、
さもなければコードポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨げる、
化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、そ
れらを小分子薬物候補物を同定するために特に適切にする、化学薬品ライブラリ
ーの高スループットスクリーニングを行い得るアッセイを含む。意図される小分
子は、合成有機化合物または合成無機化合物(ペプチド、好ましくは可溶性ペプ
チドを含む)、(ポリ)ペプチド−免疫グロブリン融合物、および特に、抗体(
制限なく、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグ
メント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにこのような抗体またはフラ
グメントのキメラまたはヒト化バージョン、ならびにヒト抗体および抗体フラグ
メントを含む)を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生
化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイ
を含む、種々の形式で行われ得、これらは当該分野で十分に特徴付けられている
。
りコードされるポリペプチドと、これらの2つの成分が相互作用し得るのに十分
な条件下および時間で接触させることを必要とする点で共通する。
単離されるか、または反応混合物中で検出され得る。特定の実施態様において、
本明細書中で同定された遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは薬物候補
は、共有結合接着または非共有結合接着により、固相(例えば、マイクロタイタ
ープレート)上に固定化される。非共有結合接着は、一般的に、固形表面をポリ
ペプチド溶液でコートし、そして乾燥することにより達成される。あるいは、固
定化されるポリペプチドに特異的な固定化抗体(例えば、モノクローナル抗体)
を用いて、ポリペプチドを固形表面にアンカーし得る。このアッセイは、非固定
化成分(これは検出可能な標識により標識され得る)を、固定化成分(例えば、
アンカーされた成分を含むコート表面)に添加することにより行われ得る。反応
が完了したら、反応しなかった成分は、例えば洗浄により除去され、そして固形
表面上に固定化された複合体は検出される。もともと固定化されていなかった成
分が検出可能な標識を有する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体
化が生じたことを示す。もともと固定化されていなかった成分が標識を有さない
場合、複合体化は、例えば、固定化複合体を特異的に結合する標識抗体を使用す
ることにより検出され得る。
パク質と相互作用するが、それに結合しない場合、そのタンパク質とのその相互
作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によりア
ッセイされ得る。このようなアッセイは、伝統的なアプローチ(例えば、架橋、
同時免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製)を
含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、ChevrayおよびNa
thans(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5789
−5793(1991))により開示されるような、Fieldsおよび共同研
究者(FieldsおよびSong,Nature(London)340,2
45−246(1989);Chienら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 88,9578−9582(1991))により記載される、酵
母に基づく遺伝的システムを用いることによりモニターされ得る。多くの転写ア
クチベーター(例えば、酵母GAL4)は、2つの物理的に分離したモジュラー
ドメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして機能するが、他方は転写活
性化ドメインとして機能する。前述の刊行物に記載された酵母発現系(一般的に
、「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれる)はこの特性を利用し、そして2つ
のハイブリッドタンパク質を使用し、一方において標的タンパク質がGAL4の
DNA結合ドメインに融合され、そしてもう一方において候補活性化タンパク質
が活性化ドメインに融合される。GAL4活性化プロモーター制御下でのGAL
1−lacZリポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介
したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用ポリペプチドを含むコロニーは
、β−ガラクトシダーゼの発色基質を用いて検出される。ツーハイブリッド技術
を用いて、2つの特異的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定
するための完全なキット(MATCHMAKERTM)は、Clontechから
市販されている。このシステムはまた、特異的なタンパク質相互作用に関与する
タンパク質ドメインをマップするために、ならびにこれらの相互作用に重要なア
ミノ酸残基の位置を正確に示すために拡大され得る。
成分との相互作用を妨げる化合物を見出すために、通常、増幅遺伝子産物および
細胞内成分または細胞外成分を含む反応混合物は、2つの産物の相互作用および
結合を可能にする条件下および時間で調製される。試験化合物が結合を阻害する
能力を試験するために、反応は、試験化合物の非存在下および存在下で行われる
。さらに、偽薬が、陽性コントロールとして働くために、第3の反応混合物に添
加され得る。混合物に存在する試験化合物と細胞内成分または細胞外成分との間
の結合(複合体形成)は、本明細書中上記に記載したようにモニターされる。コ
ントロール反応での複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パート
ナーとの相互作用を妨げることを示すが、試験化合物を含む反応混合物での形成
は、その相互作用を妨げることを示さない。
DNA合成およびλクローニングのためのSuperscript(登録商標)
Lambda System」、カタログ番号19643−014、Life
Technologies,Gaithersburg,MD,USAに記載の
プロトコルに従って、Clontech Laboratories,Inc.
Palo Alto,CA USAから得たヒト胎児肝臓mRNA、カタログ番
号64018−1から調製したcDNAライブラリーにおいて同定した。他に言
及されない限り、全試薬もまた、Life Technologiesから得た
。全手順は、以下の工程に要約され得る:(1)第1鎖合成;(2)第2鎖合成
;(3)アダプター添加;(4)酵素消化;(5)cDNAのゲル単離;(6)
ベクターへの連結;および(7)形質転換。
g/μl)を滅菌1.5ml微量遠心管に添加し、これにポリA+mRNA(7
μl、5μg)を添加した。反応管を、70℃まで、5分間、またはmRNAの
2次構造を変成するのに十分な時間で加熱した。次いで、反応物を氷上で冷却し
、そして5×第1鎖緩衝液(Life Tech.,4μl)、0.1M DT
T(2μl)、および10mM dNTP Mix(Life Tech.,1
μl)を添加し、次いで、37℃まで2分間加熱して、温度を平衡化させた。次
いで、Superscript(登録商標)逆転写酵素(Life Tech.
,5μl)を添加し、反応管を十分に混合し、そして37℃で1時間インキュベ
ートし、そして氷上に置くことにより終結させた。反応物の最終組成は、以下の
通りであった:50mM Tris−HCl(pH8.3);75mM KCl
;3mM MgCl2;10mM DTT;500μM 各dATP、dCTP 、dGTP、およびdTTP;50μg/ml NotIプライマー−アダプタ
ー;5μg(250μg/ml)mRNA;50,000U/ml Super
script(登録商標)逆転写酵素。
に混合し、そして温度を16℃より上にさせないように注意して、16℃で2時
間反応させた:蒸留水(93μl);5×第2鎖緩衝液(30μl);dNTP
混合物(3μl);10U/μl E.Coli DNAリガーゼ(1μl);
10U/μl E.Coli DNAポリメラーゼI(4μl);2U/μl
E.Coli RNaseH(1μl)。10U T4 DNAポリメラーゼ(
2μl)を添加し、そして反応物を、もう5分間16℃でインキュベートし続け
た。反応物の最終組成は、以下の通りであった:25mM Tris−HCl(
pH7.5);100mM KCl;5mM MgCl2;10mM (NH4) 2 SO4;0.15mM β−NAD+;250μM 各dATP、dCTP、d
GTP、およびdTTP;1.2mM DTT;65U/ml DNAリガーゼ
;250U/ml DNAポリメラーゼI;13U/ml RNaseH。反応
を、氷上に置くことおよび0.5M EDTA(10μl)の添加により止め、
次いで、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、
150μl)により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして5M NaCl
(15μl)および無水エタノール(−20℃、400μl)に希釈し、そして
14,000×gで2分間遠心分離した。上清を、得られたDNAペレットから
注意深く除去し、ペレットを、70%エタノール(0.5ml)に再懸濁し、そ
して14,000×gで2分間、再度遠心分離した。上清を再度除去し、そして
ペレットをスピードバックで乾燥した。
応物を穏やかに混合し、そして16℃で16時間インキュベートした:蒸留水(
25μl);5×T4 DNAリガーゼ緩衝液(10μl);SalIアダプタ
ー(10μl);T4 DNAリガーゼ(5μl)。反応物の最終組成は、以下
であった:50mM Tris−HCl(pH7.6);10mM MgCl2 ;1mM ATP;5%(w/v)PEG8000;1mM DTT;200μ
g/ml SalIアダプター;100U/ml T4 DNAリガーゼ。反応
物を、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、5
0μl)により抽出し、水相を取り出し、収集し、そして5M NaCl(8μ
l)および無水エタノール(−20℃、250μl)に希釈した。次いで、これ
を14,000×gで20分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを0
.5mlの70%エタノールに再懸濁し、そして14,000×gで2分間、再
度遠心分離した。続いて、上清を除去し、そして得られたペレットをスピードバ
ックにおいて乾燥し、そして次の手順へ続けた。
添加し、そして混合物を37℃で2時間インキュベートした:DEPC処理水(
41μl);NotI制限緩衝液(REACT,Life Tech.,5μl
)、NotI(4μl)。この反応物の最終組成は、以下であった:50mM
Tris−HCl(pH8.0);10mM MgCl2;100mM NaC l;1,200U/ml NotI。
サイズ分画し、そして分子量マーカーとの比較により決定される、1kbより長
いいずれのフラグメントもゲルから切り出した。次いで、cDNAを、ゲルから
0.1×TBE緩衝液(200μl)に電気溶出させ、そしてフェノール:クロ
ロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、200μl)により抽出し
た。水相を取り出し、収集し、そして14,000×gで20分間遠心分離した
。上清をDNAペレットから除去し、これを70%エタノール(0.5ml)に
再懸濁し、そして14,000×gで2分間、再度遠心分離した。上清を再度捨
て、ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして蒸留水(15μl)に再
懸濁した。
T4リガーゼ緩衝液(3μl);pRK5、XhoI、NotIで消化したベク
ター、0.5μg、1μl);前段落から調製したcDNA(5μl)、および
蒸留水(6μl)。続いて、さらなる蒸留水(70μl)および10mg/ml tRNA(0.1μl)を添加し、そして全反応物を、フェノール:クロロホ
ルム:イソアミルアルコール(25:24:1)により抽出した。水相を取り出
し、収集し、そして5M NaCl(10μl)および無水エタノール(−20
℃、250μl)に希釈した。次いで、これを、14,000×gで20分間遠
心分離し、デカントし、そしてペレットを70%エタノール(0.5ml)に再
懸濁し、そして14,000×gで2分間、再度遠心分離した。次いで、DNA
ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして後の手順における使用のため
に蒸留水(3μl)に溶出した。
エレクトロコンピテント(electrocompetent)DH10B細菌
(Life Tech.,20μl)を添加した。次いで、細菌ベクター混合物
を、製造者の推奨どおりにエレクトロポレーションした。続いて、SOC培地(
1ml)を添加し、そして混合物を、37℃で30分間インキュベートした。次
いで、形質転換体を、20個の標準的な、150mm アンピシリン含有LBプ
レートに配置し、そして16時間(37℃)インキュベートして、コロニーを増
殖させた。次いで、陽性コロニーをこそぎ落とし、そしてDNAを、標準的なC
sCl勾配プロトコルを用いて細菌ペレットから単離した。例えば、Ausub
elら、2.3.1。
.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93,7108−7
113、およびJacobs(1996年7月16日に発行された米国特許第5
,563,637号)により報告された方法を含む)により、ヒト胎児肝臓ライ
ブラリーにおいて同定され得る。Kleinら、およびJacobsによれば、
新規の分泌および膜結合哺乳動物タンパク質をコードするcDNAは、それらの
分泌リーダー配列を、リポーター系として酵母インベルターゼ遺伝子を用いて検
出することにより同定される。この酵素インベルターゼは、スクロースからグル
コースおよびフルクトースへの分解、ならびにラフィノースからスクロースおよ
びメリビオースへの分解を触媒する。分泌形態のインベルターゼは、酵母(Sa
ccharomyces cerevisiae)によるスクロース利用に必要
とされ、その結果、分泌型インベルターゼを生成し得ない酵母細胞は、唯一の炭
素源およびエネルギー源としてスクロースを含む培地上で十分に増殖しない。K
lein R.D.、前出、およびJacobs、前出の両方は、哺乳動物シグ
ナル配列が、機能的に、酵母インベルターゼのネイティブシグナル配列の代わり
になるという既知の能力を利用する。哺乳動物cDNAライブラリーを、非分泌
型酵母インベルターゼをコードするDNAに連結し、連結されたDNAを単離し
、そしてインベルターゼ遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換する。哺乳動物シ
グナル配列に連結した非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子を含む組換え体を、炭
素源としてスクロースのみまたはラフィノースのみを含む培地上で増殖するそれ
らの能力に基づいて同定する。次いで、同定された哺乳動物シグナル配列を使用
して、第2の完全長cDNAライブラリーをスクリーニングし、対応する分泌型
タンパク質をコードする完全長クローンを単離する。
、そのアミノ酸配列を図1−B(配列番号17)に示す。FLS139は、2つ
の既知のヒトTIE−2レセプターリガンド(h−TIE2L1およびh−TI
E2L2)と高度の配列相同性を示す、フィブリノーゲン様ドメインを含む。従
って、FLS139は、TIEリガンドファミリーの新規メンバーとして同定さ
れた。
American Type Culture Collection(ATC
C),12301 Parklawn Drive,Rockville,Ma
ryland 20852に寄託され、そして寄託番号ATCC 209281
を与えられている。
hods in Enzymology 266:460−480(1996)
)を用いて、GenBankデータベースをスクリーニングすることにより同定
した。NL1配列は、既知の発現配列タグ(expressed sequen
ce tag)(EST)T35448、T11442、およびW77823と
の相同性を示す。既知のEST配列のいずれも、完全長配列として同定されてお
らず、TIEレセプターと結合するリガンドとして記載されてもいない。
,CA,USA)から購入したmRNA、カタログ番号6528−1より調製し
たヒト胎児肺ライブラリーから、製造者の説明書に従ってクローニングした。
部位を含まない、pRK5Dの前駆体である;Holmesら、Science
,253:1278−1280(1991)を参照のこと。pRK5Dはまた、
ポリリンカー配列内でわずかな違いがある、pRK5(EP307,247、1
989年3月15日公開)の誘導体である。このライブラリーを、GenBan
kデータベースにおいて見出されたESTに基づいて、以下の合成オリゴヌクレ
オチドプローブ:
に配列決定した。
1)および図3(配列番号2)に示す。
性を示す。
rican Type Culture Collection(ATCC),
12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryl
and 20852に寄託され、そして寄託番号ATCC 209280を与え
られている。
ップされた。
) 発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQTM,Incyt
e Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を検索し、
そして参照実施例1のFLS139タンパク質と相同性を示すESTを同定した
。NL5およびNL8をクローニングするために、Clontech,Inc.
(Palo Alto,CA,USA)から購入したmRNA、カタログ番号6
528−1により調製したヒト胎児肺ライブラリーを、製造者の説明書に従って
使用した。このライブラリーを、データベースにおいて見出されたESTに基づ
いて、以下の合成オリゴヌクレオチドプローブ:
全に配列決定した。NL5の全ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、図
4および5(配列番号3および4)に示す。NL8の全ヌクレオチド配列および
推定アミノ酸配列を、図6および7(配列番号5および6)に示す。
Nプログラムを用いる)に基づいて、NL5は、TIE2レセプターのリガンド
1およびリガンド2両方と24%の配列同一性を示す。NL8は、TIEレセプ
ターのリガンド1およびリガンド2両方と23%の配列同一性を示す。
は、64〜74%同一である。より詳細には、NL1のフィブリノーゲンドメイ
ンは、NL5のフィブリノーゲンドメインと74%同一であり、そしてNL8の
フィブリノーゲンドメインと63%同一であるが、一方、NL5のフィブリノー
ゲンドメインは、NL8のフィブリノーゲンドメインと57%同一である。TI
E−2レセプターのリガンド1およびリガンド2は64%同一であり、そしてN
L1、NL5、およびNL8と40〜43%同一である。
3−p12.14、p13.3−p12.15に局在した。
e Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を検索し、
そしてヒトTIE−2 L1およびTIE−2 L2と相同性を示すEST(#
2939340)を同定した。
ブを合成した:
echnologies,Gaithersburg,MDからの試薬およびプ
ロトコル(Super Script Plasmid System)を用い
て、ベクターpRK5D中に、Clontech,Inc.(Palo Alt
o,CA,USA,カタログ番号6537−1)より購入した子宮mRNAから
調製した。pRK5Dは、sp6転写開始部位、それに続いてSfiI制限酵素
部位、次いでXhoI/NotI cDNAクローニング部位を有する、クロー
ニングベクターである。cDNAを、NotI部位を含むオリゴdTでプライム
し、SalIヘミキナーゼ処理(hemikinased)アダプターと平滑で
連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動により1000bpより大きなサイズ
まで適切に分類し、そしてXhoI/NotI切断pRK5Dに規定の方向でク
ローニングした。
めに、このライブラリーに由来するDNAを、上記で同定されたPCRプライマ
ー対を用いてPCR増幅によりスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリー
を使用して、プローブオリゴヌクレオチドおよびPCRプライマーの1つを用い
て、NL4遺伝子をコードするクローンを単離した。
NA配列および由来するタンパク質配列が得られた。
NA47470は、ヌクレオチド位置215〜217に明らかな翻訳開始部位を
有する単一オープンリーディングフレームを含む(図13、ここでATG開始コ
ドンに下線を付す)。図13において、ヌクレオチド位置1039〜1041の
TAA停止コドンを四角で囲んだ。推定ポリペプチドは、346アミノ酸長であ
る。クローンDNA47470はATCCに寄託され、そしてATCC寄託番号
209422を与えられた。
、NL4は、TIE2L1(32%)およびTIE2L2(34%)とアミノ酸
同一性を示す。
ョン分析) ヒト組織におけるNL1およびNL5 mRNAの発現を、ノザンブロット分
析により調べた。ヒトmRNAブロットを、完全長cDNAに基づく32P標識D
NAプローブにハイブリダイズした;このプローブを、cDNA挿入物を消化お
よび精製することにより作製した。ヒト胎児RNAブロットMTN(Clont
ech)およびヒト成人RNAブロットMTN−II(Clontech)を、
DNAプローブとインキュベートした。ブロットを、ハイブリダイゼーション緩
衝液(5×SSPE;2デンハルト液;100mg/mL変性剪断サケ精子DN
A;50%ホルムアミド;2%SDS)中でプローブと、42℃で60時間イン
キュベートした。ブロットを、2×SSC;0.05%SDSで室温1時間、数
回洗浄し、それに続いて0.1×SSC;0.1%SDSで、50℃で30分間
洗浄した。ブロットを、ホスホルイメージャー解析(phosphorimag
er analysis)(Fuji)による一晩曝露の後に現像した。
した。強いNL1 mRNA発現を、心臓および骨格筋組織において、ならびに
膵臓において検出した。NL5 mRNAは、骨格筋において強く発現し、そし
てより少ない程度で、心臓、胎盤、および膵臓において発現した。
により作製した33P標識リボプローブを使用する最適化プロトコルを用いて、イ
ンサイチュハイブリダイゼーションにより決定した(細胞性RNAへのハイブリ
ダイゼーションを観察する)。(LuおよびGillett,Cell Vis
ion 1:169−176(1994))。ホルマリンで固定され、パラフィ
ンに包埋されたヒト胎児および成人組織を切片にし、脱パラフィンし、そしてプ
ロテイナーゼK(20g/ml)中で、37℃で15分間タンパク質除去し、そ
してLuおよびGillett(1994)により記載されたようにインサイチ
ュハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。[33P]UTP標識アンチ
センスリボプローブをPCR産物から作製し、そして55℃で一晩ハイブリダイ
ズした。スライドを、Kodak NTB2核追跡(nuclear trac
k)エマルジョンに浸し、そして4週間暴露した。
02,SA<2000Ci/mmol)をスピードバック乾燥した。乾燥33P−
UTPを含む各々のチューブに、以下の成分を添加した: 2.0μl 5×転写緩衝液 1.0μl DTT(100mM) 2.0μl NTP混合物(2.5mM:10μ:各10mM GTP、CT
P、およびATP+10μl H2O) 1.0μl UTP(50μM) 1.0μl Rnasin 1.0μl DNA鋳型(1μg) 1.0μl H2O 1.0μl RNAポリメラーゼ(PCR産物についてはT3=AS、通常、
T7=S)。
seを添加し、それに続いて37℃で15分間インキュベートを行った。90μ
lのTE(10mM Tris(pH7.6)/1mM EDTA(pH8.0
))を添加し、そして混合物をDE81紙の上にピペットで移した。残っている
溶液を、Microcon−50限外濾過ユニットにロードし、そしてプログラ
ム10(6分)を用いてスピンをかけた。濾過ユニットを、2番目の上に逆さま
にし、そしてプログラム2(3分)を用いてスピンをかけた。最後の回収スピン
の後、100μlのTEを添加した。1μlの最終産物をDE81紙の上にピペ
ットで移し、そして6mlのBiofluor IIでカウントした。
μlのRNA Mrk IIIを、3μlのローディング緩衝液に添加した。9
5℃ヒートブロック上で3分間の加熱後、ゲルを直ぐに氷上に置いた。ゲルのウ
ェルをフラッシュし、サンプルをロードし、そして180〜250ボルトで45
分間流した。ゲルをサランラップでくるみ、そして−70℃フリーザー内で、1
時間〜一晩、増強スクリーンと共にXARフィルムに曝露した。
トレー上に置き、そして室温で5分間解凍した。トレーを55℃のインキュベー
ターに5分間入れて、曇りを減少させた。スライドを、換気装置(fume h
ood)内で、氷上で、4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、そして
0.5×SSCで、室温で5分間洗浄した(25ml 20×SSC+975m
l SQ H2O)。0.5μg/mlプロテイナーゼK中で37℃10分のタ ンパク質除去(予め温めたRNaseを含まないRNAse緩衝液250ml中
、12.5μlの10mg/mlストック)の後、切片を、0.5×SSCで、
室温で10分間洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中で各
々2分間脱水した。
を、ヒト胚−20μg/mlプロテイナーゼK(RNaseを含まないRNas
e緩衝液250ml中、500μlの10mg/ml;37℃、15分)、また
はホルマリン組織−8×プロテイナーゼK(RNase緩衝液250ml中、1
00μl;37℃、30分)中でタンパク質除去した。その後の0.5×SSC
でのリンスおよび脱水を、上記のように行った。
、50%ホルムアミド)に浸した濾紙が並んだプラスチックの箱の中に置いた。
組織を、50μlのハイブリダイゼーション緩衝液(3.75g デキストラン
硫酸+6ml SQ H2O)で覆い、ボルテックスし、そして蓋を緩めてマイ クロ波で2分間加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、
3.75mlの20×SSC、および9mlのSQ H2Oを添加し、組織を十 分にボルテックスし、そして42℃で1〜4時間インキュベートした。
3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、そしてスライドあたり48μlのハ
イブリダイゼーション緩衝液を添加した。ボルテックスした後、50μlの33P
混合物を、50μlのプレハイブリダイゼーションスライドに添加した。スライ
ドを、55℃で一晩インキュベートした。
い(400ml 20×SSC+16ml 0.25M EDTA、Vf=4L )、それに続いてRNaseA処理を37℃で30分間行った(RNase緩衝
液250ml中、500μlの10mg/ml=20μg/ml)。スライドを
、2×SSC、EDTAを用いて室温、2×10分で洗浄した。ストリンジェン
シーな洗浄条件は以下の通りであった:55℃で2時間、0.1×SSC、ED
TA(20mlの20×SSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
において、および分化している骨芽細胞に隣接する骨膜において発現することが
示される。発現はまた、腱において、関節部位での結合組織において、結合組織
の中隔において、および胎児体腔(body wall)の骨膜において観察さ
れた(図8−Aおよび8−B)。
ン細胞、アポクリン化生領域、および硬化性腺疾患におけるNL5 mRNA発
現が示された。発現は、浸潤性乳腺管ガン腫細胞上でさらに観察された。胎児下
肢組織において、軟骨内骨形成部位で、骨細胞において、および発生中の骨の骨
膜/軟骨膜において高い発現が見出された。NL5 mRNAはまた、および胎
児の体腔組織である発生中の骨の骨膜/軟骨膜の骨細胞において高度に発現した
。この分布は、骨形成および分化における役割を示唆する(図9−Aおよび9−
B)。
、腸、および体腔において高度に組織化された発現パターンが示され、これは、
この部位での特有で機能的な役割、ならびに脈管形成およびパターン形成(pa
tterning)における潜在的な関与を示唆する(図10−Aおよび10−
B)。この発現パターンは、NL1およびNL5のものとは異なる。
の深部白質内の小血管上での明らかな発現が示された。
の発現) 本実施例は、E.coliにおける本発明のTIEリガンドの非グリコシル化
形態の調製を例示する。NL1、NL5、NL8、またはNL4リガンドをコー
ドするDNA配列(それぞれ、配列番号1、3、5および18)を、選択したP
CRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベク
ター上の制限酵素部位と一致する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベ
クターが使用され得る。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、複製起
点、プロモーター、およびリボザイム結合部位をコードする。適切なベクターの
例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む、pBR
322(E.coli由来;Bolivarら、Gene 2:95(1977
)を参照のこと)である。ベクターを制限酵素で消化し、そして脱リン酸化する
。次いで、PCR増幅配列をベクターに連結する。
いて、選択したE.coli株を形質転換する。形質転換体を、LBプレート上
で増殖するそれらの能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択す
る。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析により確認し得る。
)中で一晩増殖し得る。続いて、一晩培養物を使用して、大規模(later
scale)培養物に接種し得る。次いで、細胞を、所望の光学密度まで増殖さ
せる。誘導物質(例えば、IPTG)を添加し得る。
により得た細胞ペレットを、当該分野で公知の種々の薬剤を用いて可溶化し得、
次いで、可溶化タンパク質を、タンパク質のしっかりとした結合を可能にする条
件下で、金属キレート化カラムを用いて精製し得る。
の発現) 本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、NL1、NL5、NL
8、およびNL4 TIEリガンドホモログのグリコシル化形態の調製を例示す
る。
7を参照のこと)を、発現ベクターとして使用する。必要に応じて、NL1、N
L5、NL8、またはNL4 DNAを、連結方法(例えば、Sambrook
ら、前出に記載)を用いて、NL1、NL5、NL8、およびNL4 DNAの
挿入を可能にする、選択した制限酵素でpRK5に連結する。得られたベクター
を、それぞれ、pRK5−NL1、NL5、NL8、およびNL4と呼ぶ。
93細胞(ATCC CCL 1573)を、培地(例えば、ウシ胎仔血清、必
要に応じて栄養成分および/または抗生物質を補充したDMEM)中で組織培養
プレートにおいてコンフルエンスまで増殖させる。約10μgのpRK5−NL
1、NL5、NL4、またはNL8 DNAを、約1μgのVA RNA遺伝子
をコードするDNA(Thimmappayaら、Cell,31:543(1
982))と混合し、そして500μlの1mM Tris−HCl、0.1m
M EDTA、0.227M CaCl2に溶解する。この混合物に、500μ lの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5m
M NaPO4を滴下し、そして沈殿物を、25℃で10分間形成させる。沈殿 物を再懸濁し、そして293細胞に添加し、そして37℃で約4時間放置する。
培養培地を吸引し、そしてPBS中20%のグリセロール2mlを30秒間添加
する。次いで、293細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、そして
細胞を約5日間インキュベートする。
単独)、または200μCi/ml、35S−システインおよび200μCi/m
l、35S−メチオニンを含む培養培地で置換する。12時間のインキュベーショ
ン後、馴化培地を収集し、スピンフィルター上で濃縮し、そして15%SDSゲ
ル上にロードする。処理したゲルを乾燥し、そして選択した期間、フィルムに暴
露して、NL1、NL5、およびNL8ポリペプチドの存在を明らかにし得る。
トランスフェクト細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーション(無血清培
地中で)を受け得、そして培地を、選択されたバイオアッセイで試験する。
d.Sci.,12:7575(1981)により記載されたデキストラン硫酸
法を用いて、NL1、NL5、NL8、またはNL4 DNAを、293細胞に
一過的に導入し得る。293細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖さ
せ、そして700μgのpRK5−NL1、NL5、NL8、またはNL4 D
NAを添加する。細胞を、最初に、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し
、そしてPBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で
4時間インキュベートする。細胞を、20%グリセロールで90秒間処理し、組
織培養培地で洗浄し、そして組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン、お
よび0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再導入す
る。約4日後、馴化培地を遠心分離し、そして濾過して細胞および破片を除去す
る。次いで、発現NL1、NL5、NL8、またはNL4を含むサンプルを濃縮
し、そして任意の選択した方法(例えば、透析および/またはカラムクロマトグ
ラフィー)により精製し得る。
胞において発現し得る。pRK5−NL1、NL5、NL8、またはNL4を、
既知の試薬(例えば、CaPO4またはDEAE−デキストラン)を用いて、C HO細胞にトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベー
トし、そして培地を、培養培地(単独)または放射性標識(例えば、35S−メチ
オニン)を含む培養培地で置換し得る。発現ポリペプチドの存在を決定した後、
培養培地を無血清培地で置換し得る。好ましくは、培養物を約6日間インキュベ
ートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現NL1、NL5、NL8、
またはNL4を含む培地を濃縮し、そして任意の選択した方法により精製し得る
。
細胞において発現され得る。NL1、NL5、NL8、またはNL4 DNAを
、pRK5ベクターからサブクローニングし得る。サブクローン挿入物は、バキ
ュロウイルス発現ベクターに、選択したエピトープタグ(例えば、ポリ−his
タグ)とインフレームで融合するためにPCRを受け得る。次いで、ポリ−hi
sタグ化NL1、NL5、NL8、またはNL4挿入物を、安定クローンの選択
のための選択マーカー(例えば、DHFR)を含むSV40駆動ベクターにサブ
クローニングし得る。最後に、CHO細胞を、SV40駆動ベクターで(上記の
ように)トランスフェクトし得る。標識を上記のように行って、発現を確かめ得
る。次いで、発現ポリ−Hisタグ化NL1、NL5、NL8、またはNL4を
含む培養培地を濃縮し、そして任意の選択した方法(例えば、Ni2+キレートア
フィニティークロマトグラフィー)により精製し得る。
おいて発現した。NL1を、IgG構築物(NL1−IgG免疫接着(immu
noadhesion))として発現し、ここでNL1タンパク質細胞外領域を
、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含むIgG1定常領域配列に融合し
た。NL5およびNL8を、ポリ−Hisタグ化形態で発現した。
otocols of Molecular Biology,Unit 3.
16,John Wiley and Sons(1997)に記載のような標
準的な技術を用いて、CHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現
ベクターを、目的のDNAの5’および3’に適合制限性の部位を有して簡便な
cDNAシャトリング(shuttling)を可能にするように構築する。C
HO細胞におけるNL1発現のために使用されるベクターは、Lucasら、N
ucl.Acids Res.24:9(1774−1779(1996)に記
載の通りであり、そして目的のcDNAの発現を駆動するためにSV40初期プ
ロモーター/エンハンサーおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を使用
する。DHFR発現は、トランスフェクション後のプラスミドの安定維持のため
の選択を可能にする。
クション試薬Superfect(登録商標)(Qiagen),Dosper
(登録商標)、またはFugene(登録商標)(Boehringer Ma
nnheim)を用いて、約1000万個のCHO細胞に導入した。細胞を、L
ucasら、前出に記載のように増殖させた。約3×10-7個の細胞を、以下に
記載のようなさらなる増殖および生成のためにアンプル中で凍結した。
そしてボルテックスにより混合した。内容物を、10mLの培地を含む遠心管に
ピペットで移し、そして1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引し、
そして細胞を、10mLの選択培地(5% 0.2μmダイアフィルトレーショ
ンしたウシ胎仔血清を含む0.2μm濾過PS20)に再懸濁した。次いで、細
胞を、90mLの選択培地を含む100mLスピナーにアリコートした。1〜2
日後、細胞を、150mLの選択増殖培地で満たした250mLスピナーに移し
、そして37℃でインキュベートした。さらに2〜3日後、250mL、500
mL、および2000mLスピナーに3×105個細胞/mLを播種した。培地 を、遠心分離および生成培地中への再懸濁により新鮮な培地と交換した。任意の
適切なCHO培地(例えば、1992年6月16日に発行された、米国特許第5
,122,469号に記載の培地)を、使用し得る。3L生成スピナーに、1.
2×106個細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数およびpHを測定した。 1日目に、スピナーをサンプリングし、そして濾過空気の散布を開始した。2日
目に、スピナーをサンプリングし、温度を33℃に変え、そして30mLの50
0g/L−グルコースおよび0.6mLの10%消泡剤(例えば、35%ポリジ
メチルシロキサンエマルジョン、Dow Corning 365 Medic
al Grade Emulsion)を添加した。生成の間、pHを、約7.
2で保持するために必要なように調節した。10日後、または生存率が70%未
満に下がるまで、遠心分離により細胞培養物を採集し、そして0.22μmフィ
ルターに通して濾過した。濾過物を、精製カラムへのローディングまで4℃で貯
蔵した。
、20mM リン酸Na緩衝液(pH6.8)で平衡化した5mlプロテインA
カラム(Pharmacia)にポンプで注入した。ローディング後、100m
Mクエン酸(pH3.5)での溶出前に、カラムを平衡化緩衝液で大量に洗浄し
た。溶出タンパク質を、275μLの1M Tris緩衝液(pH9)を含むチ
ューブに1ml画分を収集することにより直ぐに中和した。続いて、高度に精製
されたタンパク質を、10mM Hepes、0.14M NaCl、および4
%マンニトールを含む貯蔵緩衝液(pH6.8)中で、25ml G25 Su
perfine(Pharmacia)カラムを用いて脱塩し、そして−80℃
で貯蔵した。
気泳動(SDS−PEG)により確かめ、そしてN末端アミノ酸配列決定をエド
マン分解により行った。このタンパク質は、約37〜38kDの分子量を有する
ことが見出された。
。これらのポリHisタグ化構築物については、精製を、Ni−NTAカラム(
Qiagen)を用いて行った。精製前に、イミダゾールを、5mMの濃度まで
馴化培地に添加した。馴化培地を、流速4〜5ml/分、4℃で、0.3M N
aClおよび5mMイミダゾールを含む20mM Hepes(pH7.4)緩
衝液で平衡化した6ml Ni−NTAカラムにポンプで注入した。ローディン
グ後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を、0.25
Mイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。続いて、精製タンパク質を、1
0mM Hepes、0.14M NaCl、および4%マンニトールを含む貯
蔵緩衝液(pH6.8)中で、25ml G25 Superfine(Pha
rmacia)カラムを用いて脱塩し、そして−80℃で貯蔵した。
酸配列決定をエドマン分解により行った。
、酵母発現ベクターを、ADH2/GAPDHプロモーターから構築する。NL
1、NL5、NL8またはNL4をコードするDNA、選ばれたシグナルペプチ
ドおよびプロモーターを、NL1、NL5、NL8またはNL4の細胞内発現を
指示するために、選ばれたプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入する。分泌
に関しては、NL1、NL5、NL8またはNL4の発現のための、ADH2/
GAPDHプロモーターをコードするDNA、酵母α因子分泌シグナル/リーダ
ー配列、およびリンカー配列(もし必要なら)と共に、NL1、NL5、NL8
またはNL4をコードするDNAを、選ばれたプラスミドにクローニングし得る
。
ドで形質転換し、選ばれた発酵培地中で培養し得る。形質転換した酵母の上清を
、10%トリクロロ酢酸を用いた沈殿およびSDS−PAGEによる分離によっ
て、次にゲルをクマシーブルー染料で染色することによって分析し得る。
細胞を発酵培地から除去すること、次に選ばれたカートリッジフィルターを用い
てその培地を濃縮することによって、単離および精製し得る。NL1、NL5、
NL8またはNL4を含む濃縮液を、選ばれたカラムクロマトグラフィー樹脂を
用いて、さらに精製し得る。
びNL4の発現) 次の方法はバキュロウイルス発現系におけるNL1、NL5、NL8またはN
L4の組換え発現について述べる。
含まれるエピトープタグの上流に融合する。そのようなエピトープタグはポリヒ
スチジンタグおよび免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域のような)を含む。
pVL1393(Novagen)のような、市販のプラスミド由来のプラスミ
ドを含む、様々なプラスミドを利用し得る。簡単には、NL1、NL5、NL8
またはNL4をコードするDNA、またはNL1、NL5、NL8またはNL4
の望ましい部分(膜貫通タンパク質の細胞外領域をコードする配列のような)を
、5’および3’領域に相補的なプライマーを用いてPCRで増幅する。5’プ
ライマーを隣接する(選ばれた)制限酵素部位に組み込むことができる。産生物
を次にそれらの選ばれた制限酵素で消化して、発現ベクターにサブクローニング
する。
「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)に、リポフェクチン(GIB
CO−BRLから市販)を用いて、上記のプラスミドおよびBaculoGol
dTMウイルスDNA(Pharmingen)を同時にトランスフェクトするこ
とによって産生する。28℃で4−5日間インキュベートした後、放出されたウ
イルスを回収してさらに増幅するために使用する。ウイルス感染およびタンパク
質の発現を、O’Reilleyら、Baculovirus express
ion vectors:A laboratory Manual、Oxfo
rd:Oxford University Press(1994)によって
述べられたように、実施する。
L4を、例えばNi2+キレートアフィニティークロマトグラフィーによって、次
のように精製し得る。Rupertら、Nature、362:175−179
(1993)によって述べられたように、組換えウイルスが感染したSf9細胞
から抽出物を調製する。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理緩衝液(2
5mL Hepes、pH7.9;12.5mM MgCl2;0.1mM E DTA;10%グリセロール;0.1%NP−40;0.4M KCl)に再懸
濁し、氷上で20秒間、2回超音波処理する。超音波処理したものを遠心分離に
より透明にし、上清をローディング緩衝液(50mMリン酸、300mM Na
Cl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍に希釈し、0.45μmのフ
ィルターで濾過する。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販
)を床容積5mLで調製し、25mLの水で洗浄して25mLのローディング緩
衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出液を1分あたり0.5mLカラムにロード
する。カラムをA280のベースラインになるまでローディング緩衝液で洗浄し、 その時点から画分の回収を開始する。次に、非特異的に結合したタンパク質を溶
出する2番目の洗浄緩衝液(50mMリン酸;300mM NaCl、10%グ
リセロール、pH6.0)でカラムを洗浄する。再びA280のベースラインに達 した後、2番目の洗浄緩衝液中、0から500mMまでのイミダゾールの勾配で
カラムを展開する。1mLの画分を回収し、SDS−PAGEおよび、銀染色ま
たはアルカリホスファターゼに結合したNi2+−NTAを用いたウエスタンブロ
ット(Qiagen)によって分析する。溶出されたヒスチジン10タグのついた
NL1、NL5およびNL8を含む画分をプールし、ローディング緩衝液に対し
て透析する。
NL8の精製を、例えばプロテインAまたはプロテインGカラムクロマトグラフ
ィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて精製し得る。
させた。発現は実際には0.5−2Lの規模で実施したが、より大きな(例えば
8L)調製法に簡単に規模を拡大することができる。NL1を、NL1タンパク
質細胞外領域が、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含むIgG1の定常領
域配列と融合している、IgG構築物(NL1−IgGイムノアドヘシン)とし
て発現させた。NL5およびNL8もまたポリヒスチジンタグのついた形で発現
させた。
gG融合物にはpb.PH.IgG、およびポリヒスチジンタグのついたタンパ
ク質にはpb.PH.His.c)にサブクローニングした後、ベクターおよび
Baculogold(登録商標)バキュロウイルスDNA(Pharming
en)を105 Spodoptera frugiperda(「Sf9」)
細胞(ATCC CRL 1711)に、リポフェクチン(GibcoBRL)
を用いて、同時にトランスフェクトした。pb.PH.IgGおよびpb.PH
.Hisは市販のバキュロウイルス発現ベクターpVL1393(Pharmi
ngen)を修飾したものであり、ヒスチジンまたはFcタグ配列を含む修飾さ
れたポリリンカー領域を持つ。その細胞を10%FBS(Hyclone)を追
加したHink’s TNM−FH培地中で増殖した。細胞を28℃で5日間イ
ンキュベートした。上清を回収し、次に10%FBSを追加したHink’s
TNM−FH培地中のSf9細胞に、感染多重度(MOI)約10で感染させる
ことにより、最初のウイルス増幅に使用した。細胞を28℃で3日間インキュベ
ートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおけるNL1、NL
5およびNL8構築物の発現を、1mlの上清の、ヒスチジンタグのついたタン
パク質については25mLのNi−NTAビーズ(QIAGEN)、またはIg
Gタグのついたタンパク質についてはプロテインAセファロースCL−4Bビー
ズ(Pharmacia)に対するバッチ結合によって決定し、次にSDS−P
AGE分析でクマーシーブルー染色によって既知の濃度の標準タンパク質と比較
した。
ystems LLC)中で増殖された、Sf9細胞のスピナー培養物(500
ml)への感染に、約0.1のMOIで使用した。細胞を28℃で3日間インキ
ュベートした。上清を回収し、濾過した。もし必要なら、スピナー培養物での発
現が確認できるまで、バッチ結合とSDS−PAGE分析を繰り返した。
によって回収し細胞を除いて、0.22ミクロンフィルターを通して濾過した。
ポリヒスチジンタグのついた構築物については、タンパク質構築物をNi−NT
Aカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを馴化
培地に5mMの濃度まで加えた。馴化培地を、0.3M NaClおよび5mM
イミダゾールを含む20mM Hepes緩衝液、pH7.4で平衡化した6m
lのNi−NTAカラムに、4℃、流速4−5ml/分で注入した。ロード後、
カラムを追加の平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を0.25Mのイミダゾール
を含む平衡化緩衝液で溶出した。高度に精製されたタンパク質を、10mM H
epes、0.14M NaClおよび4%マンニトールを含む、pH6.8の
保存緩衝液に、25mlのG25 Superfine(Pharmacia)
カラムを用いて脱塩し、−80℃で保存した。
ら精製した。馴化培地を20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8で平衡化
した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に注入した。ロード後
、カラムを平衡化緩衝液で徹底的に洗浄し、次に100mMクエン酸、pH3.
5で溶出した。溶出したタンパク質を、275mLの1M Tris緩衝液、p
H9を含むチューブに1mlの画分を回収することによって、すぐに中和した。
高度に精製されたタンパク質を次に、上記でポリヒスチジンタグのついたタンパ
ク質について述べられたように、保存緩衝液で脱塩した。NL1、NL5および
NL8タンパク質の均質性を、SDSポリアクリルアミドゲル(PAG)電気泳
動およびエドマン分解によるN末端アミノ酸配列決定によって実証した。
クローナル抗体の調製を説明する。
oding、前出において述べられている。利用し得る免疫原は、本発明の精製
されたリガンド、そのようなリガンドを含む融合タンパク質、および細胞表面に
組換えリガンドを発現した細胞を含む。当業者は過度な実験をせずに免疫原を選
択し得る。
で免疫し、1−100μgの量を皮下または腹腔内に注射する。その代わりに、
免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemica
l Research、Hamilton、MT)に乳化し、動物の後足肉趾内
に注射する。免疫されたマウスに、次に10から12日後に選ばれたアジュバン
トに乳化した追加の免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスを追加の免
疫注射で追加免疫もし得る。抗体を検出するELISAアッセイを実施するため
に、血清試料を定期的にマウスから眼窩後方の出血によって採取し得る。
的に静脈内注射し得る。3日から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収する
。次に脾臓細胞を、ATCC、No.CRL 1597より入手可能なP3X6
3AgU.1のような選ばれたマウスミエローマ細胞株と融合する(35%ポリ
エチレングリコールを用いて)。融合したものはハイブリドーマ細胞を産生し、
次にこれを、融合していない細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハ
イブリッドの増殖を阻害するために、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン
、およびチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートにプレートし得る。
ングする。本明細書中のTIEリガンドホモログに対する望ましいモノクローナ
ル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当業者に同知である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系Balb/cマウスの腹腔内に注射し得る。その
代わりに、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増
殖させ得る。腹水中で産生されたモノクローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウ
ム沈殿、次にゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成し得る。その代わりに、
抗体のプロテインAまたはプロテインGへの結合に基づくアフィニティークロマ
トグラフィーを利用し得る。
を、96ウェルマイクロタイタープレート(Amersham Life Sc
ience)で、100μLあたり500個の細胞/ウェルの密度で、3ng/
mLのVEGFを追加した低グルコースDMEM、10%仔ウシ血清、2mMグ
ルタミン、1×pen/streptおよびファンギゾン中にプレートした。コ
ントロールを同じ方法でプレートしたが、いくつかはVEGFを含まなかった。
NL8ポリペプチドのテスト試料を100μl容量で加えて、最終的な容積を2
00mcL容量とした。細胞を37℃で6−7日間インキュベートした。培地を
吸引し、細胞をPBSで1回洗浄した。酸性ホスファターゼ反応混合物(100
μL、0.1M酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%Triton−100、
10mM p−ニトロフェニルリン酸)を加えた。37℃で2時間インキュベー
トした後、10mcLの1N NaOHを加えて反応を止めた。マイクロタイタ
ープレートリーダーで405nmの光学密度を測定した。コントロールは細胞な
し、細胞のみ、細胞+FGF(5ng/mL)、細胞+VEGF(3ng/mL
)、細胞+VEGF(3ng/ml)+TGF−β(1ng/ml)、および細
胞+VEGF(3ng/mL)+LIF(5ng/mL)であった(1ng/m
lの濃度のTGF−βはVEGF刺激による細胞増殖を70−90%阻害するこ
とが知られている)。
、VEGF(3ng/ml)刺激による細胞増殖の阻害の割合を計算することに
よって、(1)刺激なしの細胞と比較して、および(2)VEGF刺激活性の参
照TGF−β阻害と比較して、結果を評価した。阻害が30%以上であれば、結
果を陽性と判断する。ポリヒスチジンタグのついた形で試験されたNL5はVE
GF刺激による内皮細胞の増殖を有意に阻害した。これらの結果はNL5、およ
び可能性のある関連ポリペプチドの、ガン治療および特に腫瘍血管形成の阻害に
おける有用性を示している。
する能力を、96ウェル形式で、100ng/mlのVEGFを追加した0%血
清培地中で、ヒト静脈性臍静脈内皮細胞(HUVEC、Cell System
s)において試験した(HUVEC細胞は容易にプレート表面から取り除かれる
ので、ウェル中のすべてのピペット操作はできる限り静かに行わなければならな
い)。
175フラスコ中の細胞に加え、細胞がプレートから離れるまで(約5−10分
)静置した。5mlの増殖培地を加えることにより、トリプシン処理を止めた。
細胞を4℃、1000rpmで5分間、回転(spin)した。培地を吸引し、
細胞を10mlの10%血清補充培地(Cell Systems)、1×pe
nn/strepに再懸濁した。
Science、cytostar−T scintillating mic
roplate、RPNQ160、滅菌、組織培養処理、個々に包装)で、10
%血清(CSG培養液、Cell Systems)中で、総容積100μl、
ウェルあたり2×104個の細胞密度でプレートした。NL5およびNL8ポリ ペプチドを1%、0.33%、0.11%の希釈で3組づつ加えた。細胞無しの
ウェルをブランクとして、細胞のみのウェルをネガティブコントロールとして使
用した。ポジティブコントロールとして、50μlのスタウロスポリン3倍スト
ックを1:3に連続的に希釈したものを使用した。NL5ポリペプチドがアポト
ーシスを誘導する能力を、アポトーシスを検出するためにカルシウムおよびリン
脂質結合タンパク質の1つであるアネキシンVを用いて決定した。
.6mlの2×Ca2+結合緩衝液および2.5%BSAに希釈した(1:25希
釈)。50μlの希釈したアネキシンV−ビオチン溶液を各ウェルに加え(コン
トロールを除いて)、最終的な濃度を1.0μg/mlとした。35S−ストレプ
トアビジンを直接加える前に、試料をアネキシン−ビオチンと共に10−15分
間インキュベートした。35S−ストレプトアビジンを2×Ca2+結合緩衝液、2
.5%BSAで希釈し、全てのウェルに最終的な濃度が3×104cpm/ウェ ルになるように加えた。プレートに封をし、1000rpmで15分間遠心分離
して軌道振盪機(orbital shaker)に2時間置いた。1450M
icrobeta Trilux(Wallac)で分析を行った。
関連する分子の、ガン治療における潜在的な有用性をさらに確認している。
的にはTリンパ球のアロ抗原の存在に反応して増殖する能力を評価する。一方向
性MLRアッセイでは、末梢血単核細胞(PBMC)のドナー細胞群が、照射を
受けたPBMCの刺激細胞群でチャレンジされる。Tリンパ球が反応する抗原は
、刺激細胞群中の抗原提示細胞に発現および提示されているミスマッチMHC分
子である。このアッセイは提示されたアロ抗原での刺激に応じた反応Tリンパ球
の増殖を、増強または阻害する分子を同定する。
強化する。よって、そのような分子(または低分子、またはそのような分子の抗
体アゴンスト)は、免疫反応の増強が有益である状態の治療のための候補である
。それに加えて、そのような刺激分子の阻害剤は免疫反応の抑制が有益である場
合に有用であり得る。例えば、MLRにおいて刺激活性を持つ分子を阻害する、
中和抗体または低分子のアンタゴニストを使用することは、免疫を介した炎症性
疾患の処置に有益であり得る。MLRを阻害する分子(またはその低分子、また
は抗体アゴニスト)は免疫反応を阻害し免疫を介した疾患を改善するのに有用で
あり得る。
FBS中で培養した。細胞をRPMI+10%FBSに3×106個の細胞/m lの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液100μlを、NL5およびNL4のテスト
試料100μlと共に37℃、5%COでインキュベートした。5日目に、細胞
を6時間パルスラベルし、次に回収した。
の増殖を阻害することが判明した。
されていることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、これはNL8タン
パク質が肺ガンのような、および可能性のある他の、結腸ガン、乳房ガン、およ
び/または前立腺ガンのような、特定のガンにおける治療的介入の有用な標的で
あることを示している。治療剤は、NL8をコードする遺伝子のアンタゴニスト
、例えば、NL8に対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化、またはヒト抗体、また
は天然のポリペプチドの低分子またはペプチドアンタゴニストの形をとり得る。
であった。DNAを例えば蛍光測定によって正確に定量化する。ネガティブコン
トロールとして、10人の正常健常個体の細胞からDNAを単離し、それをプー
ルして健常個体の遺伝子コピーのためのアッセイコントロールとして使用した(
示さず)。5’ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TaqManTM)および同時定
量PCR(例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Det
ection SystemTM(Perkin Elmer、Applied
Biosystems Division、Foster City、CA))
を、特定のガンで増幅された可能性のある遺伝子を発見するのに使用した。その
結果を、NL8をコードするDNAが、スクリーニングされたあらゆる原発性肺
ガン中で過剰に発現しているかどうかを決定するのに使用した。その結果をデル
タ(Δ)CT単位で報告する。1単位は1PCRサイクルまたは正常に比べて約
2倍の増幅に対応し、2単位は4倍、3単位は8倍の増幅(以下同様)に対応す
る。プライマーおよびNL8をコードする遺伝子由来のTaqmanTM蛍光を用
いて定量化した。特有の核酸配列を含む可能性が最も高く、スプライシングでイ
ントロンを除いた可能性が最も低いNL8遺伝子の領域がプライマー誘導に好ま
しい。それは例えば3−非翻訳領域である。NL8に使用したプライマーおよび
プローブ(正方向、逆方向、およびプローブ)の配列は次の通りである: 23339.tm.5 GTCAGCAGGAGCCCAAGTTG (配列番号33) 23339.tm.3 ACGGTTACACAGGGTGTCTT (配列番号34) 23339.tm.p TCTGGCCACACCTTCTTTGTGGCTC (配列番号35)。
増幅をモニタリングするためにTaqDNAポリメラーゼ酵素の5’エキソヌク
レアーゼ活性を利用する。2つのオリゴヌクレオチドプライマーをPCR反応に
代表的なアンプリコンを産生するのに使用する。3番目のオリゴヌクレオチドま
たはプローブを2つのPCRプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出
するために設計する。プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素によって伸長可
能ではなく、リポーター蛍光色素および消光蛍光色素で標識する。レーザーによ
って誘起されるあらゆるリポーター色素からの発光は、2つの色素がプローブに
あってお互いに近く位置する場合には、消光色素によって消光される。増幅反応
の間、TAQ DNAポリメラーゼ酵素は鋳型依存的な方法でプローブを切断す
る。得られるプローブフラグメントは溶液中に解離し、放出されたリポーター色
素からのシグナルは2番目の蛍光物質(fluorophore)の消光効果を
受けない。1分子のリポーター分子が新しく分子が合成されるごとに遊離し、消
光されないリポーター色素の検出はデータの定量的解釈の基礎を提供する。
のような同時定量PCR装置で5’ヌクレアーゼ手順を実施する。この系はサー
モサイクラー(thermocycler)、レーザー、電荷結合素子(CCD
)カメラおよびコンピューターからなる。この系はサーモサイクラー上の96ウ
ェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザーによって誘起された蛍光シグナ
ルを、96ウェル全てについて光ファイバーケーブルを通じて同時に集め、CC
Dで検出する。この系は器械の運転およびデータの分析のためのソフトウェアを
含む。
reshold cycle)として表わす。リポーターシグナルがバックグラ
ウンドの蛍光レベルを越えて蓄積するサイクルとしてこれを定義する。ΔCtの
値を、核酸試料中に存在する特定の標的配列の、相対的な最初のコピー数の定量
的な測定値として使用する。
iagenの精製キット#13362(各400μgのゲノムDNAの容量をも
つ10個の精製チップを含む)、緩衝液セット#1960およびプロテアーゼ#
19155および#19101を用いて、製造会社の使用説明書および以下の記
述に従って単離を行った。
/2量のPBSを用いて再遠心分離し再び洗浄した。ペレットを3回目に洗浄し
、懸濁した細胞を回収しPBSで2回洗浄した。次に細胞を10mLのPBSに
懸濁した。緩衝液C1を4℃で平衡化した。Qiagenプロテアーゼ#191
55を6.25mlの冷却ddH2Oに最終的な濃度が20mg/mlになるよ うに希釈し、4℃で平衡化した。10mLのG2緩衝液をQiagenRNアー
ゼAストック(100mg/ml)を最終的な濃度が200μg/mlになるよ
うに希釈して調製した。
た。細胞核をBeckmanスイングバケットローターで4℃、2500rpm
で15分間遠心分離することによりペレットにした。上清を捨て、核を2mLの
緩衝液C1(4℃)および6mLのddH2Oにボルテックスして懸濁した。次 に2度目に4℃、2500rpmで15分間遠心分離した。次に核を残りの緩衝
液にチップあたり200μlを用いて再懸濁した。G2緩衝液(10ml)を懸
濁した核に静かにボルテックスしながら加えた。緩衝液を加え終わった後、30
秒間強くボルテックスした。Qiagenプロテアーゼ(200μl、上記で述
べられたように調製された)を加え、50℃で60分間インキュベートした。溶
解物が透明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した(例えば、
さらに30−60分間のインキュベート、4℃、3000×gで10分間のペレ
ット化)。
理は1調製あたり組織250mg以下に限った(1チップ/調製)。プロテアー
ゼ溶液を、6.25mlの冷ddH2Oに最終的な濃度が20mg/mlになる ように希釈して新しく調製し、4℃で保存した。G2緩衝液(20ml)を、D
NアーゼAを最終的な濃度が200mg/mlになるように(100mg/ml
のストックから)希釈して調製した。腫瘍組織を、エアロゾルの吸入を避けるた
めに層流TCフード(laminar−flow TC hood)中で、ポリ
トロンの大きいチップを用いて、19mlのG2緩衝液中で60秒間ホモジナイ
ズし、室温で保持した。試料と試料の間には、ポリトロンを2LのddH2O、 次にG2緩衝液(50ml)中で2回30秒間回転させることにより掃除した。
組織がまだジェネレーターチップ(generator tip)に存在する場
合、器具を分解して掃除した。
を加え、次にボルテックスして50℃で3時間インキュベートした。溶解物が透
明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した(例えば、さらに3
0−60分間のインキュベート、4℃、3000×gで10分間のペレット化)
。
、チップあたり10mlの試料中に滴定した。Qiagenプロテアーゼを、6
.25mlの冷ddH2Oに最終的な濃度が20mg/mlになるように希釈し て新しく調製し、4℃で保存した。G2緩衝液を、RNアーゼAを最終的な濃度
が200μg/mlになるように100mg/mlのストックから希釈して調製
した。血液(10ml)を50mlのコニカルチューブに入れ、10mlのC1
緩衝液および30mlのddH2O(どちらも前もって4℃に平衡化された)を 加えた。成分を逆さにして混合し、氷上で10分間保持した。核を、Beckm
anスイングバケットローターを用いて、4℃、2500rpmで15分間ペレ
ット化し、上清を捨てた。ボルテックスして核を2mlのC1緩衝液(4℃)お
よび6mlのddH2O(4℃)に懸濁した。ペレットが白くなるまでボルテッ クスを繰り返した。核を次に200μlのチップを用いて残りの緩衝液に懸濁し
た。G2緩衝液(10ml)を静かにボルテックスしながら懸濁した核に加え、
次に30秒間強くボルテックスした。Qiagenプロテアーゼを加え(200
μl)、50℃で60分間インキュベートした。溶解物が透明になるまで、イン
キュベーションと遠心分離を繰り返した(例えば、さらに30−60分間のイン
キュベート、4℃、3000×gで10分間のペレット化)。
の調製あたり1試料)。QF溶出緩衝液を50℃で平衡化した。試料を30秒間
ボルテックスし、次に平衡化したチップに添加し重力によって排出した。チップ
を2回15mlのQC緩衝液で洗浄した。DNAを、15mlのQF緩衝液(5
0℃)を用いて、シラン処理し、オートクレーブにかけた30mlのCorex
チューブに溶出した。イソプロパノール(10.5ml)を各試料に加え、チュ
ーブにパラフィンで封をして、DNAが沈殿するまで繰り返し逆さにして混合し
た。試料をSS−34ローターで、4℃、15,000rpmで10分間遠心分
離してペレット化した。ペレットの位置に印をつけ、上清を捨て、10mlの7
0%エタノール(4℃)を加えた。試料をSS−34ローターで、4℃、10,
000rpmで10分間遠心分離して再びペレット化した。ペレットの位置に印
をつけ、上清を捨てた。チューブを次に乾燥棚において、試料が乾燥しすぎない
ように気をつけて37℃で10分間乾燥した。
2時間置いた。溶解が続いている間、試料を1晩4℃で保持した。次にDNA溶
液をツベルクリンシリンジ上の26ゲージの針を持つ1.5mlのチューブに移
した。DNAを切断するために移動を5回繰り返した。試料を次に50℃で1−
2時間置いた。
のddH2O)で、0.1mlの石英キュベットを用いてBeckman DU 640分光光度計で、標準的なA260、A280分光光度法によって定量化し
た。A260/A280比は1.8−1.9の範囲であった。次に各DNA試料
をさらに、TE(pH8.5)に約200ng/mlまで希釈した。もしもとの
材料の濃度が高い場合($700ng/μl)、材料を50℃で1−2時間置い
た。
業社の指針を用いて、蛍光測定によるDNAの定量化を行った。これをHoef
fer DyNA Quant 200蛍光計を約15分間ウォームアップして
おくことにより達成した。ヘキスト色素作用溶液(#H33258、10μl、
使用の12時間以内に調製された)を100mlの1×TNE緩衝液に希釈した
。2mlのキュベットを蛍光計溶液で満たし、器械に置き、器械を0の位置に合
わせた。pGEM3Zf(+)(2μl、ロット番号360851026)を2
mlの蛍光計溶液に加え、200ユニットに目盛りを定めた。2回目の2μlの
pGEM3Zf(+)DNAを次に試験し、400+/−10単位を示すことを
確認した。次に各試料を少なくとも3つづつ測定した。3つの試料がお互いに1
0%以内であった場合、その平均をとってこの値を定量化した値として使用した
。
型試料で、500−1000回のアッセイを行うのに十分な材料とともに、同時
に行った。試料を3つづつ、正常ヒトDNAおよび鋳型を含まないコントロール
を持つ1つのプレート上で、B−アクチンおよびGAPDHの両方で試験した。
テストDNAから引いた正常ヒトDNAのCT値が+/−1CTなら、希釈した
試料を使用した。希釈した、よく検定を受けた(lot−qualified)
ゲノムDNAを1.0mlのアリコートにして−80℃で保存した。次に遺伝子
増幅アッセイに使用するアリコートは4℃で保存した。各1mlのアリコートは
8−9プレートまたは64回の試験に十分である。
的に増幅得点(amplification scoring)の閾値として使
用した。上記の表はNL8DNAの有意な増幅が様々な原発性肺腫瘍で起こって
いることを示す。これはこの分子がガン治療の有益な標的であることを示してい
る。特に、NL8タンパク質に対するアンタゴニスト(例えば抗体)がガン治療
に有用であることが期待される。
胞株で起こっているかどうかを決定するためには、さらなる実験が必要である。
本明細書中で前に述べられたように、枠組み構造および中心(epicente
r)のマッピングおよびさらなる細胞を基礎とするアッセイ、または動物モデル
によって、観察を補足し正確にすることができる。
ーズハムスター卵巣(CHO)細胞が、VEGFがCHO細胞の増殖に直接効果
を持たないにも関わらず、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成する能力を獲得する
という実験的な発見に基づいている(Ferraraら、J.Clin.Inv
est.91:160[1993])。従って、正常CHO細胞は十分な増殖能力
を持つが、腫瘍形成能力は、血管形成を誘発することができないことによって制
限される。このアッセイは他の分子がVEGFのようにCHO細胞を腫瘍形成性
にするように機能し得るかどうかを決定しようとするものである。血管の供給の
非存在下で、栄養分の拡散は、腫瘍結節の大きさを直径約1mmに制限すること
が知られているので、そのような分子のインヒビターは、ガン治療に有用であり
得る。
トランスフェクトした。VEGFをコードする配列を含む同じベクター、または
空のベクターでトランスフェクトしたCHO細胞を、ポジティブおよびネガティ
ブコントロールとした。細胞を雌ヌードマウスの側腹部に皮下注射した(100
万個の細胞/マウス、形質転換体あたり5匹のマウス)。注射部位を毎週腫瘍結
節の出現に関してチェックした。組織学的な評価を発生したあらゆる結節につい
て行った。
めた。これはNL1およびNL8が、VEGFのようにCHO細胞を腫瘍形成性
にする能力があることを示している。
al Cell Research、224:39−51(1996)で述べら
れたアッセイまたは、次のようなその変形の1つに従う: プロトコール:HUVE細胞(継代回数が初代培養から8回未満)をI型ラット
テイルコラーゲンと混合する。6×105個の細胞/mlの密度で最終的な濃度 は2.6mg/ml、96ウェルプレート上でウェルあたり50μlをプレート
した。ゲルを37℃で1時間凝固させておいて、ウェルあたり50μlの1%F
BSを追加したM199培養培地およびNL1ポリペプチド試料(各1%、0.
1%、0.01%の希釈で)を、液胞が形成されているならそれを染色する1μ
Mの6−FAM−FITC色素と共に加える。細胞を37℃/5%CO2で48 時間インキュベートし、3.7%ホルマリンを用いて室温で10分間固定し、P
BSで5回洗浄した。次にRh−ファロイジンを用いて4℃で1晩染色し、次に
4μMのDAPIで核を染色した。
AなしのbFGF)存在下で、細胞の生存を促進する因子を同定する。
アポトーシスをおこしている、2=50%未満の細胞がアポトーシスをおこして
いる、3=50%以上の細胞がアポトーシスをおこしている。この系でアポトー
シスを刺激する物質はアポトーシス因子として期待され、インヒビターはアポト
ーシスを防止または抑制することが期待される。
皮の液胞形成および管腔形成を刺激する因子を同定する。
0−50%の細胞に液胞が存在する、3=50%以上の細胞に液胞が存在する。
このアッセイをピノサイトーシス、イオン輸送、透過性、および結合形成の刺激
に関与する因子を同定するために設計する。
る。このアッセイは、3次元マトリックス中で外来性の成長因子(VEGF、b
FGF)存在下で、内皮細胞の管様構造への分化を刺激する因子を同定する。
、3=細胞はいくらか結合した管を形成している、4=細胞は複雑な管ネットワ
ークを形成している。このアッセイはトラッキング、走化性、または内皮の形状
変化の刺激に関与し得る因子を同定する。
NL1ポリペプチド、および1%希釈の緩衝液コントロール(10mM HEP
ES/0.14M NaCl/4%マンニトール、pH6.8)の効果を示して
いる。IgG融合物として試験した、もう1つの新規のTIEリガンドホモログ
(NL6)および2つの既知のTIEリガンドであるTIE−1およびTIE−
2と比較した結果も図に示している。
e Collection、12301 Parklawn Drive、Ro
ckville、MD、USA(ATCC)に寄託した:
national Recognition of the Deposit
of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure and the Regulation
s thereunder(ブダペスト条約)の規定の下になされた。これは寄
託の生存可能な培養物を寄託日から30年間維持することを保証する。寄託物は
ブダペスト条約の条項の下で、Genentech,Inc.およびATCC間
の合意を条件として、ATCCによって入手可能となり、これは、適切な米国特
許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点
のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手
できることを保証する。そして、35USC§122およびそれに準ずるCom
missioner’s rules(886OG683に特に言及している3
7C.F.R.§1.14を含む)によって、米国特許庁長官によってその権利
があると決定されたものが子孫を入手できることを保証する。
に死滅または失われたまたは破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう1つの
同じものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政
府の権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施す
るライセンスとは解釈されるべきではない。
れる。寄託された実施態様は本発明の特定の局面の1つの例示として意図されて
おり、機能的に等しいあらゆる構築物は本発明の範囲内であるので、本発明は寄
託された構築物によって範囲が制限されるべきではない。本明細書中の材料の寄
託は、書面の記述がその最上のものを含む本発明のあらゆる局面の実施を可能に
するのに不適切であるという承認を構成しない。また請求の範囲をそれが表す特
定の例示に制限するように解釈されるべきではない。実際に、本明細書中に示さ
れ記述されたものに加えて、本発明の様々な変形が、前述の記述から当業者に明
らかになり、添付される請求の範囲の範囲内に入る。
NA22779)。
NA28497)。
NA23339)。
ョンによって決定した場合の種々の組織におけるNL1の発現を示す。
ョンによって決定した場合の種々の組織におけるNL5の発現を示す。
ーションによって決定した場合の種々の組織におけるNL8の発現を示す。
の発現を示すノーザンブロットである。
の発現を示すノーザンブロットである。
。
KSクローンに由来するヒトTIE−2リガンド2のアミノ酸配列とのアライ
ンメントである(配列番号20)。
由来するヒトTIE−2リガンド1のアミノ酸配列とのアラインメントである(
配列番号21)。
1%希釈で緩衝液コントロール(10mM HEPES/0.14M NaCl
/4%マンニトール、pH 6.8)の、HUVECチューブ形成における効果
を示す。IgG融合体としてテストした、もう1つの新規TIEリガンドホモロ
グ(NL6)および2つの公知のTIEリガンドTIE−1およびTIE−2と
の比較結果も、図中で示す。
有効量で該内皮細胞を処理する工程、を包含する、方法。
法であって、該ポリペプチドを含む疑いのある細胞を、該ポリペプチドに対する
抗体に曝露する工程、および該細胞への該抗体の結合を決定する工程、を包含す
る、方法。
乳動物から得られる組織細胞のテスト試料において、および(b)同じ細胞タイ
プの公知の正常組織細胞のコントロール試料において、請求項8に記載のポリペ
プチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出する工程を包含し、ここで、テ
スト試料におけるより高い発現レベルが、テスト組織細胞を得た哺乳動物におけ
る腫瘍の存在を示す、方法。
法。
法であって、請求項8に記載のポリペプチドを過剰発現する細胞を、該ポリペプ
チドの発現および/または活性を阻害する有効量の薬剤に曝露する工程、を包含
する、方法。
L8抗体である、請求項41に記載の方法。
化学療法剤による処理にさらに曝露される、請求項42に記載の方法。
のラベルは、該組成物が、請求項8に記載のポリペプチドの過剰発現によって特
徴づけられる症状を処置するために使用され得ることを示し、そして該組成物に
おける活性薬剤が、該ポリペプチドの発現および/または活性を阻害する薬剤で ある 、製品。
抗NL8抗体である、請求項44に記載の製品。
Claims (47)
- 【請求項1】 TIEリガンドホモログポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸分子であって、該ポリペプチドが、 (1)ネイティブなヒトNL1(配列番号2)、ネイティブなヒトNL5(配
列番号4)、ネイティブなヒトNL8(配列番号6)、もしくはネイティブなN
L4(配列番号19)ポリペプチド;または (2)非ヒト哺乳動物種における(1)のポリペプチドのホモログ;または (3)ネイティブなヒトNL1、ネイティブなヒトNL5、ネイティブなヒト
NL8、もしくはネイティブなNL4のフィブリノーゲン様ドメインと少なくと
も約90%配列同一性を有するポリペプチド、 である、単離された核酸分子。 - 【請求項2】 配列番号1;配列番号3;配列番号5;または配列番号18
のコード領域を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項3】 配列番号1;配列番号3;配列番号5;または配列番号18
のフィブリノーゲン様ドメインコード配列を含む、請求項1に記載の単離された
核酸分子。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベク
ター。 - 【請求項5】 請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子で形質転換し
た、組換え宿主細胞。 - 【請求項6】 原核生物細胞である、請求項5に記載の組換え宿主細胞。
- 【請求項7】 真核生物細胞である、請求項5に記載の組換え宿主細胞。
- 【請求項8】 以下のアミノ酸配列を含む、単離されたTIEリガンドホモ
ログポリペプチド: (1)ネイティブなヒトNL1(配列番号2)、ネイティブなヒトNL5(配
列番号4)、ネイティブなヒトNL8(配列番号6)、もしくはネイティブなN
L4(配列番号19)ポリペプチド;または (2)非ヒト哺乳動物種における(1)のポリペプチドのホモログ;または (3)ネイティブなヒトNL1、ネイティブなヒトNL5、ネイティブなヒト
NL8、もしくはネイティブなNL4ポリペプチドのフィブリノーゲン様ドメイ
ンと少なくとも約90%配列同一性を有するポリペプチド。 - 【請求項9】 請求項8に記載のポリペプチドを特異的に結合する、抗体。
- 【請求項10】 モノクローナル抗体である、請求項9に記載の抗体。
- 【請求項11】 非ヒト相補性決定領域(CDR)残基およびヒトフレーム
ワーク(FR)残基を有する、請求項10に記載の抗体。 - 【請求項12】 内皮細胞の増殖を阻害する、請求項9に記載の抗体。
- 【請求項13】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項12に記載の抗体。
- 【請求項14】 細胞のアポトーシスを誘導する、請求項9に記載の抗体。
- 【請求項15】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項14に記載の抗体。
- 【請求項16】 腫瘍細胞の血管形成を阻害する、請求項9に記載の抗体。
- 【請求項17】 前記腫瘍細胞が、肺ガン、結腸ガン、乳ガン、または前立
腺ガン細胞である、請求項16に記載の抗体。 - 【請求項18】 NL1、NL5、NL8、またはNL4ポリペプチドをコ
ードする遺伝子が増幅される細胞の増殖を阻害し、細胞死を誘導し、または血管
形成を阻害する、請求項9に記載の抗体。 - 【請求項19】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項18に記載の抗体。
- 【請求項20】 前記腫瘍細胞が、肺ガン、結腸ガン、乳ガン、または前立
腺ガン細胞である、請求項19に記載の抗体。 - 【請求項21】 前記腫瘍細胞が、NL8ポリペプチドをコードする遺伝子
の増幅によって特徴づけられる、請求項20に記載の抗体。 - 【請求項22】 抗NL1、抗NL5、または抗NL8抗体である、請求項
9に記載の抗体。 - 【請求項23】 標識されている、請求項9に記載の抗体。
- 【請求項24】 請求項8に記載のポリペプチドをキャリアとともに含む、
組成物。 - 【請求項25】 請求項9に記載の抗体をキャリアとともに含む、組成物。
- 【請求項26】 前記抗体の増殖阻害量を含む、請求項25に記載の組成物
。 - 【請求項27】 前記抗体が、抗NL5または抗NL8抗体である、請求抗
26に記載の組成物。 - 【請求項28】 細胞傷害性薬剤または化学療法剤の二次抗体をさらに含む
、請求項25に記載の組成物。 - 【請求項29】 さらなる治療剤または細胞傷害性薬剤に融合された、請求
項8に記載のポリペプチドまたは請求項9に記載の抗体を含む、結合体。 - 【請求項30】 前記さらなる治療剤が、トキシン、異なるTIEリガンド
、または血管内皮増殖因子(VEGF)ファミリーのメンバーである、請求項2
9に記載の結合体。 - 【請求項31】 TIEレセプターを発現する細胞を同定するための方法で
あって、該レセプターへの該TIEリガンドホモログの結合を可能にする条件下
で、ネイティブなヒトNL1(配列番号2)、ネイティブなヒトNL5(配列番
号4)、ネイティブなヒトNL8(配列番号6)、およびネイティブなNL4(
配列番号19)ポリペプチドからなる群より選択される検出可能に標識されたT
IEリガンドホモログ、および非ヒト哺乳動物種におけるそれらのホモログと、
細胞とを接触させる工程、ならびに該結合をモニタリングする工程、を包含する
、方法。 - 【請求項32】 血管新生の存在を画像化するための方法であって、請求項
8に記載の検出可能に標識されたTIEリガンドホモログ、または請求項9に記
載のアゴニスト抗体を患者に投与する工程、および血管新生をモニタリングする
工程、を包含する、方法。 - 【請求項33】 血管形成を阻害するための方法であって、請求項8に記載
のTIEリガンドホモログまたは請求項9に記載のアゴニスト抗体の有効量を患
者に投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項34】内皮細胞増殖の阻害のための方法であって、請求項8に記載
のTIEリガンドホモログポリペプチドの有効量で、該内皮細胞を処理する工程
、を包含する、方法。 - 【請求項35】 前記ポリペプチドがNL5またはNL8である、請求項3
4に記載の方法。 - 【請求項36】 前記処理がインビボである、請求項35に記載の方法。
- 【請求項37】 内皮細胞アポトーシスの誘導のための方法であって、請求
項8に記載のTIEリガンドホモログポリペプチドの有効量で該内皮細胞を処理
する工程、を包含する、方法。 - 【請求項38】 前記ポリペプチドがNL5またはNL8である、請求項3
7に記載の方法。 - 【請求項39】 前記処理がインビボである、請求項38に記載の方法。
- 【請求項40】 請求項8に記載のポリペプチドの存在を決定するための方
法であって、該ポリペプチドを含む疑いのある細胞を、該ポリペプチドに対する
抗体に曝露する工程、および該細胞への該抗体の結合を決定する工程、を包含す
る、方法。 - 【請求項41】 哺乳動物における腫瘍を診断する方法であって、(a)哺
乳動物から得られる組織細胞のテスト試料において、および(b)同じ細胞タイ
プの公知の正常組織細胞のコントロール試料において、請求項8に記載のポリペ
プチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出する工程を包含し、ここで、テ
スト試料におけるより高い発現レベルが、テスト組織細胞を得た哺乳動物におけ
る腫瘍の存在を示す、方法。 - 【請求項42】 前記ポリペプチドがNL8である、請求項41に記載の方
法。 - 【請求項43】 腫瘍細胞増殖を阻害するための方法であって、請求項8に
記載のポリペプチドを過剰発現する細胞を、該ポリペプチドの発現および/また
は活性を阻害する有効量の薬剤に曝露する工程、を包含する、方法。 - 【請求項44】 前記ポリペプチドがNL8であり、そして前記薬剤が抗N
L8抗体である、請求項43に記載の方法。 - 【請求項45】 前記腫瘍細胞が、照射処理または細胞傷害性薬剤もしくは
化学療法剤による処理にさらに曝露される、請求項44に記載の方法。 - 【請求項46】 以下: 容器; 該容器上のラベル;および 該容器内に含まれている、活性薬剤を含む組成物、 を含む製品であって、 ここで、該組成物が、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効であり、概容器上
のラベルは、該組成物が、請求項8に記載のポリペプチドの過剰発現によって特
徴づけられる症状を処置するために使用され得、そして該組成物における活性薬
剤が、該ポリペプチドの発現および/または活性を阻害することを示す、製品。 - 【請求項47】 前記ポリペプチドがNL8であり、そして前記活性薬剤が
抗NL8抗体である、請求項46に記載の製品。
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