JPH07506242A - Ｔｉｅ，新規内皮細胞受容体チロシンキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＩＥ、新規内皮細胞受容体チロシンキナーゼ発明の分野 この発明は、一般的には遺伝子工学の分野に関し、特に受容体チロシンキナーゼ 、組み曽えＤＮＡベクターへのこれらの挿入、およびその結果として微生物宿主 （ｒａｅｉｐｉｅｎｔ）菌株と真核生物細胞宿主中で得られるタンパク質の生産 に関する。より詳細には、この発明はｔｉｅ、新規受容体チロシンキナーゼに関 し、ｔｉｅをコードする塩基配列に関し、ｔｉｅをコードするＤＮＡとその遺伝 子産物を生成させる方法に関する。この発明のｔｉｅＤＮＡとポリペプチドは、 内皮細胞と、これに結合するｔｉｅ受容体が関与する病気、例えば腫瘍原管形成 （ｔ＋ｎ＋＋。

ｒ　ａｎ（ｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が関与する腫瘍性の病気（ｎｅｏｐｌａｓｔｉ ｃ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）　、創傷治−（ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ）　、血栓 塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）　、アテローム性 動脈硬化症（ａｔｈａｒｏｍｃ　１ａｒｏｓｉ　ｓ）および炎症性の病気（ｉｎ ｆｌａ關ａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）の診断および治療に役立つであろう。

発明の背景 分化細胞と組織の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）　、保存（ｍａｉｎｔｅｎａ ｎｃｅ）　、修復（ｒｅｐａｉｒ）の原因となる細胞の挙動は、大部分が、成長 因子（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ）と類似したリガンドとその受容体によっ て伝達される細胞内のシグナルにより、制御されている。該受容体は、応答細胞 （ｒｓｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅｌ＋）の細胞表面に局在しており、他のホルモン 様リガンドと同様に成長因子として知られるペプチドやポリペプチドと結合する 。この反応の結果は、細胞内遺伝子発現のすばやく長期的な再適応（ｒｅａｄｊ ｕｓｔｍｅｎｔ）と同様に、応答細胞の速い生化学的変化である。積々の細胞表 面に結合するいくつかの受容体は、特異的な成長因子に結合するであろう。

チロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は血 漿膜（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通したシグナルトランスダクション （ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の鍵となるモード（■ｏｄｅｓ） のなかの一つである。いくつかの現在知られているタンパク質チロシンキナーゼ 遺伝子は、ポリペプチド成長因子とホルモン、例えば表皮（ｅｐｉｄｓｒ■ａｌ ）成長因子（ＥＧＦ）インシュリンまたはインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ　 −Ｉ）、成長因子に由来する血小板（ＦＤＯＦ−Ａと−Ｂ）、繊維芽細胞（ｆｉ ｂｒｏｂｌａｓｔ）成長因子（ｐＧＦｓ）のようなポリペプチド成長因子とホル モンの誤貫通型（ｔｒａｎｓｍａｍｂｒａｎｅ）受容体をコードする一ヘルプイ ン（Ｂｅｌｄｉｎ）ら、Ｃａ１１１１ｇｇｕｌａｔｉｏｎ、　ｌ：　５５５−５ ６６　（＋９９０）；　ウルリッチ（［ｌ１ｌｒｉｃｈ）ら、Ｃｅ１ｌ、　６１ ：　２４３| ５４　（１９９０１，脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ、ａｎｇＬｏｇ ｅｎｅｓｉｓ）　＊アテローム性動脈硬化症、と１１１ｍ性の病気などのいくつ かの生理学的、病堰学的プロセスにおける、成長因子、例えばＦＧＦｓ、の関与 の可能性のために、内皮ｌＩ胞の成長因子受容体は特に興味を覚える；フォルク マン（Ｆｏｌｋｍａｎ）も、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５：４４２−４４７（１９８ ７）。

またいくつかの造血（ｂｓｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）成長因子の受容体もまたチ ロシンキナーゼである；これらはｃ−ｆｍｓ、　コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎ ｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）１受容体（シェル（５ｈｅｒｒ） ら、Ｃ＠ｌｌ、　４１：　６６５−６７６　（１９８５１）　と、ファング（Ｈ ｕａｎｇ）ら、Ｃｅ１ｌ　６３：　２２５−３３　（＋９９０１で報告されたｃ −ｋｉｔ、原始的（ｐｒｉｓ＋１ｔｉｖａ）造血成長因子受容体を含む。

構造的類似性の観点から、受容体チロシンキナーゼは進化的なサブファミリー（ ｓｕｂｆａｍｉＨｅｓ）に分けることができる；ウルリツチ（υ１ｌｒｉｃｈ） ら、　Ｃａ１ｌ、　６１：２４３−５４（＋９９０１．このようなサブファミリ ーは、ＥＧＦ受容体様キナーゼ（サブクラスエ）、インシュリン受容体様（サブ クラスＩＩ）キナーゼを含み、これらの各々が反復した相同性の（ｈａ園ｏ１ｏ ｇｏｕ＋＋）富システィンな配列をそれらの細胞外領域（ａｘｔｒａｃｅｌｌｕ ｌａｒ　ｄｏｍｅｉｎｓ）に含む、−ツの富システィン領域もまた、ｅｐｈ様キ ナーゼの細胞外領域中に見いだされる；　ヒライ（Ｈｉｒａｉ）ら、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２３ｇ・１７１フ−１７２０（１９８７）ｉ　リンドパーグ（Ｌｉｎ ｄｂｅｒｇ）ら、Ｍｏ１．　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１０：　６３１６−２ ４　ｆ＋９９０１；　ロタツク（Ｌｈｏｔａｋ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　 Ｒｉａｌ、、　＋Ｉ：　２４９６−２５０２　＋１９９{ １＊ｃ−ｆｍｇとｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼと同様にＰＤＧＦ受容体も サブクラスＩＩＩにグループ分けされるかもしれない　；一方、ＦＧＦ受容体は サブクラス！Ｖを構成する。これらのサブクラスの両方のメンバーに典型的なも のは、鋼内（１ｎｔｒａｃｈａｉｎ）ジスルフィド結合により安定化される細胞 外の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）ユニットである。これらのいわゆる免疫グロブ リン（Ｉｇ）様折り畳み体（ｆ。

Ｉｄｓ）は、細胞結合または可溶性リガンｐを有する広範な種類の他の細胞表面 受容体を含む免疫グロブリンのサブファミリーのタンパク質中に見いたされる； ウィリアム（ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、　Ａｒ＋ｎ、　Ｒａｙ、　Ｉｍｗｕｎｏｌ 、、　６：　３ｇ＋−４０５（１９８８Ｌ受容体チロシンキナーゼはそれらの特 異性と親和性で異なる。一般的には、受容体チロシンキナーゼは糖タンパク質で 、これは（１）特異的成長因子と結合できる細胞外領域と、（２）通常タンパク 質のα−ヘリックス部分である誤貫通型（ｔｒａｎｓ■ｅ謙ｂｒａｎｓ）領域と ；　（３）受容体が、例えばタンパク質リン酸化により、そこて制御される膜近 接型（ｊｕｘｔａｓｅｍｂｒａｎｓ）領域と；　（４）受容体の酵素的成分であ るチロシンキナーゼ領域と；　（５）多くのレセプターにおいて、認識とチロシ ンキナーゼの基質結合に関与するカルボキシル末端部から構成される。

代わりのスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と代わ りのポリアデニル化（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏ ｎ）などのプロセスが、同じ遺伝子カラＬ％＜ツカの真なるポリペプチドを生産 できると最近報告されている。これらのポリペプチドは、上記の檀々の領域を含 んでいるかもしれないし、含んでいないかもしれない、結果として、ある細胞外 領域が別々の分泌されたタンパク質として発現されているかもしれないし、ある 受容体の形態がチロシンキナーゼを欠き、膜貫通型領域と（ｐｌｕｇ）短いカル ボキシル末端部によってプラズマ膜中に挿入された細胞外領域のみを含んでいる かもしれない。

この発明は、バータネン（Ｐａｒｔａｎｅｎ）ら、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：１１９１３−１１９１７　（１９９０ １により、ヒト白血病＠ＩＩ　（ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｔｓｉａ　ｃｅｌｌｓ） からの未知のチロシンキナーゼ相同的ＰＣＲ−ｃＤＮＡ断片として元来同定され ていた新規内皮細胞受容体チロシンキナーゼを提供するものである。この遺伝子 とこれがコードするタンパク質は、′免疫グロブリン様とＥＧＦ様反復を含むチ ロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１ ｍｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｎｄ　ＥＧＦ−ｒｅｐｅａｔｓ）　”■ 略語から、　ｔｉｅと呼ばれる・ 発明の要旨 ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼをコードする明確な構造のＤＮＡまたはＲＮＡ部 分を提供することが、この発明の目的である。この発明によるＤＮＡまたはＲＮ Ａは、合成的に生産され、または自然渾から分離されてもよいし、また所望の組 み替えＤＮＡベクターの生産において使用されてもよいし、または他の供給源か ら関連する遺伝子を得る（ｒｅｃｏｖｅｒ）ために使用されてもよい、さらに、 コードされたタンパク質の発現のために、微生物または真核生物に挿入されるこ とができるｔｉｅ受容体チロシンキナーゼまたは関連するタンパク質をコードす るヘテロな（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）部分を含む組み替えＤＮＡベクターを 提供することもこの発明の目的である。この発明はまた。有用な量の、ｔｉｅ受 容体チロシンキナーゼと多様な種からの同様な機能を有するタンパク質を生産す ることができる真核生物を提供する。この発明のもう１つの態様においては、実 験室で合成的に、または天然のｔ１ｅ受容体チロシンキナーゼタンパク質の活性 に似ている微生物により生産されても良いし、また再生産可能（ｒｓｐｒｏｄｕ ｃｉｂｌｅ）な標準化された（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ）方法で、真核生物細 胞中でｔｉｅ受容体チロシンキナーゼを生産するために使用されても良いペプチ ドが開示されている。特に好ましくは以下のものにより構成されたグループから 選択されたペプチドである。

（ａ）第１の配列 ４１　Ｌ＠ｕＴｈｒＣｙｓＶａｌＳａｒＧｌｙＧｌｕＡｌａＧｌｙ八ｌａＧｌｙ ＡｒｇＧｉｙ５ａｒＡｓｐＡｌａＴｒｐＧｌへＰｒｏＰｒ。

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ａｇｇｇａｇａａ　ａａａａａｇｇｇａｔ　ｃｔｇｇｇｇａｔｑｇコア０１　ａ ｔｃｃｃａｃｔｇｃ　ｔｃｃｃｃｃａａｃａ　ｃａａａｃｃｃｃｃａ　ｃｔｃｃ ａｇｃｔｃｃ　ｔｔｃｇｃｔｔａａｇコア５１　ｃｅａｑｃａｃｔｃａ　ｃａｃ ｃａｃｔａａｃ　ａｔｑｃｃｃｔｇｔｔ　ｃａｇｃｔａｃｔｃｃ　ｃａｃｔｃｃ ｃｇｇｃコ８０１　Ｃｔ（ＪｔＣａｔｔＣａ　ｑａａａａａａａｔａ　ａａｔｑ ｔｔｃｔａａ　ｔａａｑｃｔｃｃａａ　ａａａａａ配列番号：　２　（ＳＥＱ　 １０　Ｎｏ　２）と；または第２配列、ここて第１配列の６７６から８０７に対 応するヌクレオチドは第２配列て欠けている。

より長い配列の部分を含むＤＮＡおよびＲＮＡ分子もまた、遺伝子工学の技術お よびオリゴヌクレオチドプローブ（ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄａ　ｐｒｏｂ ｅｓ）の生産により、このようなペプチドの生産に関連した発明の好ましい態様 を実現することにおける使用のために提供される＊　ｔｉｅタンパク質をコード するＤＮＡ配列は十分に確認されているので、例えば、ポリメラーゼ頗反応によ り、または商業的に利用できる装置を用いた合成化学により、遺伝子全部を生産 することが可能であり、その後に、この遺伝子は周知の組み替えＤＮＡ技術を用 いて、多くの利用可能なりＮＡベクターのどれかに挿入されることができる。さ らに、自動化装置もまた利用でき、この利用により、ここで開示されたいずれの ペプチドの直接合成も容易となる。このようにして、この発明は、当業會にとっ て容易に利用できる試栗、プラスミド、微生物を用いて、実行することができる 。

図面の簡単な説明 濃付された図１から図１３は本発明を具体的に説明するためのものであるが、そ れによフてより特定化されたものに限定されるように考慮すべきものでない。

図１はｔｉｅｃＤＮＡの核酸と相補的なアミノ酸配列である。その３８４５ｂｐ ヌクレオチド配列は、１１３８アミノ酸の開放読み取り枠（ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒ ｅａｄｉｎｇ　ｆｒａ■ｅ）を含むＨＥＬライブラリーから合成した２つのオー バーラッピングｃＤＮＡクローンから編さんされる（単レターコード中に標され た）、そのｔｉｅブレカーサはヌクレオチド第３７番とアミノ酸２２（ヌクレオ チド第１００番）からの成熟したｔｉｅタンパクを起源とする。疎水性の信号配 列と推定の膜貫通型領域は潜在Ｎ−結合性グリコシル化（細線）のための部位で あるとしてアンダーライン（太線）した、ｌＩ胞外領域に見出される成熟したｔ ｉｅタンパクのシスティン残基は区切られており、そのチロシンキナーゼ領域は 水平の矢印とイタリックでキナーゼ挿入とによって示される。ＥＧＦ様の領域へ のホモロジーを持つ３つの富システィン配列もまた区切られている（ＥＧＦＨ１ −１１１）　、その整列を図２中に示す、クローン３ａ中のＥＧＦ反復の欠落の 第１は垂直の矢印によって示される。その配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬに嵜 託されている（受託番号Ｘ６０９５７）、Ａはアラニンであり、Ｃはシスティン であり、Ｈはヒスチジンであり、■はイソロイシンであり、Ｋはリジンであり、 Ｌはロイシンであり、Ｍはメチオニンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ｐはプ ロリンであり、Ｑはグルタミンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｓはセリンであ り、Ｔはスレオニンてあり、■はバリンであり、Ｗはトリプトファンであり、及 びＹはチロシンである。

図２ＡＬｔｔｉｅのＥＧＦ様領域の配列、比較はヒトＥＧＦ配列（アミノ酸残基 １−４４）と成長因子ＣＲＩＰＴＯ（６７−１０８）中の相同体配列、ラミニン Ａ鎖（１０９２−１１３８）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ 　ｓ＋ｅｌａｎｏｇａｓｔａｒ　Ｎｏｔｃｈ、　Ｎｏｔｃｈと記す）（８９７− ９’４５）とカエノウハプディチスエレガンス（Ｃａｓｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ 　ａｌｓｇａｒ＋＋＋　Ｌｉｐ−１２、Ｌｉｎ−１２と記す）（２０４−２４６ ）発育性コントロールタンパク質、ヒト血液凝固因子ＩＸａ　（８３−１３０） とマウスのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（１８−６５）とから形 成される。アステリスクは保存された残基とシスティン残基相同体が区切られて いるのを示す、切痕と因子ＩＸａの繰り返し中にあるＳ−ヒドロキシル化のため の一致した残基は太字で印刷されている。

Ｂ、ｔｉｅタンパク質の３つのフィブロネクチン型ＩＩＩの繰り返しとヒトＬＡ Ｒ受容体ホスホチロシンホスファターゼの最初の３つのＦＮＩＩＩ繰り返しの比 較。免疫グロブリン領域のための幾つかの別な一致する残基の典型と同じように そのシスティン残基はｔｉｅタンパク賀の第２のＦＮＩ　Ｉ　Ｉ繰り返しの上に 示される。

図３はＣＯ５細胞中のｔｉｅｃＤＮＡの発現である。Ｃ０８ＩＩ胞はｔｉｅ（Ｓ Ｖ１４−１、５Ｖ１４−２）　とＦＧＦＲ−４（Ｃ，Ｐａｒｔａｎｅｎ、Ｊ、、 丁、Ｐ、Ｍａｋｅｌａ。

Ｅ、　Ｅｅｒｏｌａ、　Ｊ、　Ｅｏｒｈａｎｅｎ、　）１．　［１ｉｒｖｏｎａ ｎ、　Ｌ、　Ｃ１ａａｓｓｏｎ−１１ｅｌｓｂ、と区、＾１奄狽≠撃潤A　Ｅ ＭＢＯＪ、　１０：　１３４７−１３５４．１９９１）　ツタメツＳＶ４０ニ基 づいた発現ベクターでトランスフェクションされ、３５Ｓ−メチオニンで＊＊＊ され、実施例３の材料と方法に記載されたように溶解され、免疫沈降される。沈 澱したタンパク質の５ＤＳ−パージ分析のオートラジオグラムが示される。Ａ、 ＣＯ３細胞中の発現されたポリペプチドの同定、ＨＩ、ｓ−ｇａｌ−ｔｉｅ融合 他の悪質に対する免疫血清；ＨＯ１免疫前駆体血清、免疫血清は（りで表示され た抗原で妨害される。Ｂ、ｔｉｅタンパク質の分子量に関するツニカマイシンの 影曽、Ｍ１．カルボキシル末端ｔｉｅタンパク質に対する免疫血清、ＭＯ免疫前 駆体血清、いずれも（＋）表示された、トランスフェクションされた細胞の培養 はツニカマイシンの存在中で標識した０分子量マーカーの移動は左に示した。

図４．ｔｉｅタンパク質発現細胞系の免疫プロット分析、ブタ大動脈内皮細胞（ ＰＡＥ）と同様にｔｉ＋Ｊ！現ベクターでトランスフェクションされた（ＬＴＲ １４−２）またはトランスフェクションされていない（ＮＥＯＩ）ＮＩＨ３Ｔ３ 細胞はカルボキシ末端ｔｉｅペプチドに抗血清で免疫ブロッティングすることに よって分析した。２つの右側の大部分のレーン（ａＰＹ、ＩＰ）中の試料は免疫 プロッティングの前に抗−ホスホチロシン抗体で免疫沈澱させる。

図５．ｔｉｅ遺伝子座の染色体地図、放射性同位体標識されたＪＴＫ１４ＤＮＡ は正常ヒト男性末梢リンパ球中期試料にハイブリダイゼーシヨンされ；スライド は洗浄し、曝露の後展開し、かつ染色体は個々の染色体を区別するのにＧ−バン ドとされる０粒度の偏在は粒度３で表現される各々のドツトである概要染色体１ について表示した。幾つかの非特異的パックグラウンド信号は別な染色体で検出 した一群Ａの別な染色体について１２．６％（４０／３１７）　、群Ｂの染色体 について８．５％（２７／３１７）、Ｃ一群の染色体について２９．６％（９４ ／３１７）及び別な染色体の群について１４．８％（４７／３１））。

図６．白血病細胞系中に発現するｔｉｅｍＲＮＡ、指示された細胞系からのポリ （Ａ）＋ＲＮＡはノザン法（Ｎｏｒｔｈｅｒｒ＋　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）とｃＤＮ Ａプローブでのハイブリダイゼーションによって分析される。グリセロアルデヒ ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブでのハイブリダイゼー ションは分析するＲＮＡの開蓋の負目のための内部標準として使用される。

図７．内皮の細胞系におけるｔ　ｉｅｍＲＮＡの発現、ＰＡＥとＥＡｂｙ９２６ 内皮細胞系におけるｔ　ｉｅｍＲＮＡ５！現のノザン法分析、ダミ細胞（Ｄａｓ ｉ　ｅｅｌｌ）からのポリ（Ａ）”ＲＮＡを含むレーンが陽性コントロールとし て包含される図８　、　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成による胃管の内皮中の ｔｉｅｍＲＮＡの局在。

暗部の範囲で象徴して示すハイプリデイゼーション信号が頂部（Ａ）上にある。

Ａと一致する相−コントラスト顕微鏡像が下部に示される（Ｂ）。

図９．免疫グロブリンとフィブロネクチン型ＩＩＩ繰り返しを含む幾つかの別な 受容体チロシンキナーゼをもつｔｉｅタンパク質の構造の比較。

開環が免疫グロブリンループ、その白抜き箱型のフィブロネクチン型ＩＩＩ繰り 返しと塗りつぶし楕円型のＥＧＦ相同領域を表現する。斜線箱型はｅｐｈ様キナ ーゼの富システィン領域を表現する。細胞質のチロシンキナーゼ領域は黒い箱と して描かれる。

図１０．ヒトｔｉｅ受容体チロシンキナーゼの概略構造と２匹のマウスのｔｉｅ ｃＤＮＡクローン（ＩＣＩＤとＤ１０Ｅ５）をもった相対するアミノ酸配列。

そのｔＬｅ受容体は、２つの免疫グロブリン様ループ（Ｉｇ）、３つのフィブロ ネクチンＩＩＩ様額域によって生じた３つ（又は２つ）の表皮の成長因子（ＥＧ Ｆ）、膜内外領域（Ｔ　Ｍ　）及び２つの細胞質のチロシンキナーゼ優域（ＴＫ ＩどＴＫ２）とからなる、マウスとヒトのｔｉｅアミノ酸配列配列のアミノ酸ホ モロジーは断片ＩＣＩＤとＤ１０Ｅ５の各々で９６％と９５％である。アミノ酸 残基記号は図１中の通りである。

図１１、ヒト組織中のｔｉｅｍＲＮＡの発現、１７−１９週の胎児組織から隔離 された全ＲＮＡはノザン法によって分析される（Ａ）、ヒトの成人組織からのポ リアデニル化されたＲＮＡのハイブリダイゼーシヨンをＢ中に示す、そのＳ−ア クチンとＧＡＰＤＨプローブは負荷されたＲＮＡの量のための内部標準として使 用される。

図１２．１２日ｐ、ｃ、マウス胎児におけるｔｉｅｍＲＮＡ発現のｉｎ　５ｉｔ ｕハイブリツド形成。

ＩＣＩＤアンチセンス（Ａ、Ｂ）でハイプリディゼションされた矢状のセクショ ンの顕微鏡写真で明領域（Ａ）と暗引域（Ｂ）、及びセンスプローブ（Ｃ）が示 されるｅ　ｔｉｅｍＲＮＡの発現は血管の内皮に制限される。使用した略語＝ｂ ｒ　（ｍｌ）　、　ｍｇ　（髄膜）、１ｇ（肺）、ｍｂ（下顎骨）’、ｈｔ（心 臓）、ｖｎ（室（ｖ６０ｔｒｉｃｕｌｅ）　）　、　ａ　ｔ　（房（ａｔｒｉｕ −）　）　、ｓ　ｃ　（を髄）、ｐｖ（を椎前）、及びｃｖ（後主静脈）。

図１３．８日ｐ、ｃ、マウス胎盤におけるｔ　ｉｅｍＲＮＡ　（Ａ）と因子ＶＩ ＩＩ　（Ｂ）発現の比較。

因子Ｖｌ１１は、（Ａｌ中に血球の凹みの周辺の暗い堆積として見られ、ｔｉｅ 信号が同様であるが分層されたセクション（Ｂ）が白色粒として見える。線図か ら見ることがてきるように、両方の信号は迷路が形成された血球の凹みの内皮細 胞に局在される。

詳細な説明 次の記載において、組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）技法において使用される幾つか の用語を援用して使用する。明細書と請求の範囲の明確化と矛盾なき理解を提供 するために、同様な用語に与えられる範囲を包含し、以下の定義で規定する。

遺伝子：　ＤＮＡ配列はＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を含む、遺伝子から転 写されたＲＮＡはタンパク質をコードし、或いはしない、タンパク質をコードす るＲＮＡはメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）と称され、真核ｌＩ胞において はＲＮＡポリメラーゼＴＩによって転移される。しかしながら、それはまたＲＮ ＡポリメラーゼＩＩの鋳型を含む遺伝子を構成するものとして知られ、ここでの ＲＮＡ配列は、特有なｍＲＮＡであるが正常でない翻訳をする相補的配列を有し て転移される。同様の遺伝子横進はここでは１アンチセンスＲＮＡ遺伝子”と称 され、かつ同様なＲＮＡ転移はゝアンチセンスＲＮＡ″と称される。アンチセン スＲＮＡはアンチセンスＲＮＡ配列中の翻訳停止コドンの存在のために正常に翻 訳することができない０組換え遺伝子を含む”相補的ＤＮＡ’または’ｃ　Ｄ　 ＮＡ”遺伝子は、介在配列（イントロン）を欠＜ｍＲＮＡの逆転写によって合成 される。

クローニング搬送体（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅ）　：　宿主細胞中で自 律的複製が可能であり、同様のＤＮＡ配列におけるエンドヌクレアーゼＩ！織部 位の１つ又は少数によって特徴付けされる、プラスミドまたはファージＤＮＡま たは他のＤＮＡ配列は、搬送体の必須の生物学的機能の損すること無しに決定し 得る方法において切断して良く、ＤＮＡがその複製とクローニングを引き起こす ために岨継ぎされて良い、クローニング搬送体は、そのクローニング搬送体で形 質転換された細胞の同定に用いるために適したマーカーを更に備えていて良い、 マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。′ ベクター２の言葉は”クローニングベクター”に時折用いられる。

発現ベクター：　搬送体またはクローニング搬送体と類似するがその内部でクロ ーン化されている遺伝子の発現をすることのできるベクター、宿主内に形質転換 の後、クローン化された遺伝子は、プロモーター配列と同じような一定のコント ロール配列の（即ち、操作可能に結合された）制御のもとで通常的に配置される 。５！現制御配列は、ベクターが原核生物または真植生物のいずれかの宿主中に 操作可能に結合された遺伝子を発現させることによって変化するであろうし、エ ンハンサ−１終了配列、組繊−特性要素、および／または翻訳イニシエーターと 終Ｔ部位と同じような転移要素を付加上包含して良い０本発明は、組換えｔｉｅ タンパク質の発現と、このタンパク質の機能的な派生物とに関する。

機能的な派生物：　ｔｉｅタンパク質の１機能的な派生物２とは、非組換えｔｉ ｅタンパク質の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的と構造的 のいずれか）を所有するタンパク質である＊　ｔＬｅタンパク質の機能的な派生 物は、特有な機能の実現のための同様な変形の必要によって、共有結合された糖 質のような翻訳後の筆鋒を含みまたは含まない、その１機能的な派生物”の言葉 は、分子の１断片（フラグメント）”、′変異体”、′類似物１または２化学的 派生物”を含むように企図される。ここでの使用として、分子は、その分子の部 分の正常でない付加の化学的特性を含む時に、他の分子の１化学的派生物”と言 われる。そのような特性は、分子の溶解度、吸収性、生物学的な半減期、などを 利用して良い。

その特性は、その分子の毒性を減少させる、その分子の好ましくない何等かの副 作用を除去するまたは弱めること、などから選択して良い、そのような効果を介 在できる特性はレミントンファーマセウチカルサイエンス（＋９８０１　（Ｒｅ ■ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｅａｓ　１９ ８０）中に記載されている１分子にそのような特性を結合させるための手続は当 該技術分野では周知である。

断片（Ｆｒａ（ｓｅｎｔ）　：　ｔ　ｉ　ｅタンパク質のような分子の１断片ゝ は、ペプチド核、またはペプチド核の変形と同様の分子のなんらかの変形に言及 することを意味するｅ　ｔｚｅタンパク質と同様の分子の２変形”は、構造と完 全な分子のいずれかの生物学的活性、またはそれの断片における実質的に類似し た分子に言及されることを意味する。このように、類似した活性を所有する２つ の分子が規定され、それらは、組成物またはその分子の１つの第２の、第３の又 は第４の構造が他方で見出されるものと同一でないならば、或いはもしアミノ酸 残基の配列が同一でないならば、その用語がここて使用されるような変形体とみ なされる。

類似物：　ｔｉｅタンパク質またはゲノムの配列の１１［似物２は、ここでのｔ １ｅタンパク賓とゲノム配列への俵用において実質的に類似のタンパク質又はゲ ノム配列に言及されることを意味する。

好ましい実施態様の説明 本発明は、”ｔｉｅ”、新規な受容体チロシンキナーゼ、ｔｉｅ−エンコーディ ング核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ 等）、ｔｉｅ遺伝子及びその生成物からのｔｉｅペプチドまたはｔｉｅタンパク 質の製造、再配列ｔｉｅ発現ベクター、ｔｉｅｌｌ似体及び誘導体、及び、ｔｉ ｅ及び関連タンパク質、ｔｉｅ−エンコーディング核酸分子、ｔｉｅリガンド、 ｔｉｅ拮抗体及び抗−ｔｉｅ抗体の診断及び／または治療的用途に向けられてい る。

火ＩＪ１１ えｔｉｅの 生物学的に活性なｔｉｅは、クローニング及びｔｉｅ−エンコーディングヌクレ オチドまたはその機能的等側体の好適な宿主細胞における発現によって生成され る０組換えＤＮＡ技術を用いたｔｉｅの生成は、説明を目的として、以下の工程 を含む段階的工程に分けられる。（１）設計されたｔｉｅのコーディング配列（ 遺伝子）の単離または生成、（２）設計されたｔｉｅの合成を制御することがで きる発現ベクターの構成、（３）ｔｉｅ遺伝子を複写または発現することが可能 な適当な宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換、及び／またはその遺 伝子生成物の設計されたｔｉｅを生成するための処理、及び、（４）設計された ｔｉｅ生成物の同定と精製。

Ａ、ｔｉｅの ｔｉｅの配列をコードするヌクレオチド、またはその機能的等価体が、設計され たｔｉｅ生成物の発現を制御する組換え発現ベクターを構成するために使用する ことができる。ｔｉａのヌクレオチドコーディング配列は、配列より番号１（Ｓ ＥＱ　１０　Ｎｏ　ｌ）に記されている。そこに記されたヌクレオチド配列、ま たはフラグメントまたはその機能的等価体は、適当な宿主細胞における組換えｔ ｉｅ生成物の発現を制御する組換え分子の生成に使用することができるｍ　ｔｉ ｅ−エンコーディングヌクレオチド配列は、ｔｉｅに類似した活性をもつ生成物 を生成する及び／またはｔｉｅ−エンコーディングｍＲＮＡを発現する種々の細 胞源から得ることができる。出願人は、内皮細胞、白血病細胞、及び横絞筋肉腫 及び線維肉腫細胞を含む、ｔｉｅの多くの好適なヒト細胞源を同定した。

ｔｉｅコーディング配列は、そのような細胞源から単離され精製されたＲＮＡか らのｃＤＮＡクローニングまたはゲノムクローニングによって得ることができる ０例えば、ｔｉｅ配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ材料から、この分野で良 く知られた技術を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる 。クローンのｃＤＮＡまたはゲノムのいずれかのライブラリーは、この分野で良 く知られた技術を用いて調整でき、ｔｉｅ遺伝子の任意の部分を実質的に補足す るスクレオチドプロープを有する特別なｔｉｅＤＮＡにスクリーン（ｓｃｒｅｅ ｎ）され得る。全長クローン、即ち、設計されたｔｉｅ遺伝子の全コーディング 領域を含むものが、発現ベクターの構成に使用するために選択される。さもなく ば、ｔｉｓ−エンコーディングＤＮＡは、全部または一部が、標準的技術を用い て化学合成により合成される。

ヌクレオチドコーディング配列が本来持っている同義性により、実質的に同じま たは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の方法 の実施において使用される。ｔｉｅヌクレオチド配列のそのような変化は、同じ または機能的に等価な遺伝子生成物をエンコードする配列になるような異なるヌ クレオチドの欠失、付加、もしくは置換を含む、その遺伝子生成物は、生活性ｔ ｉｅ生成物を生成するような”サイレント（ｇｉｌｅｎｔｌ“変化をもたらす配 列を有するアミノ酸残基の欠失、付加、もしくは置換を含んでいてもよい、その ようなアミノ酸欠失、付加、もしくは置換は、含まれるアミノ酸の極性、電艙、 溶解性、ｍ水性、ｌＬ水性及び／または両親媒性の類似性に基づいてなされる０ 例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む；正 に荷電したアミノ酸は、リジン及びフルギニンを含む；荷電していない先端基ま たは類似の親水性値を有する非極性先端基は、以下のものを含む・ロイシン、イ ソロイシン、バリン；グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン 、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン。

Ｂ、ＬＬＬ！ＵＬでじ一乞二１１級 上記の情報を用いて、ｔｉｓ受容体チロシンキナーゼの合理的な量を発現するこ とができる種々の組換えＤＮＡベクターが提供される。ここで定義された鍵とな る構造特徴を持つ合成タンパク質と同様に、他の渾からの同じ科のタンパク質を コードする関連した構造の付加組換えＤＮＡベクターは、ｔｉｅ受容体チロシン キナーゼｃＤＮＡから、組換えＤＮＡ技術の標準的な技術を用いて製造される、 ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼを発現する形質転換体は、この技術の一例として 製造される（実施例３及び４参ＷＡ）、真核生物細胞のトランスフェクションを 通して、新たに発見された配列及び構造情報が、生物学的目的のために、そのｔ ｉｅ受容体チロシンキナーゼ及びその種々の領域を生成するために用いられる。

Ｃ，ｔｉｅ　を　るトランスフェクション　またはシｑ」定 組換えコーディング配列を含み、生物学的に活性で成熟した生成物を発現する宿 主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチによって同定される。（ａ）ＤＮ Ａ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ！たはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡ交雑；　（ｂ） ”引「遺伝子機能の存在あるいは不在；　（Ｃ）宿主細胞におけるｔｉｅ、ｍＲ ＮＡの転写の発現によって測定された転写レベルの検定；　（ｄ）免疫検定、及 び根本的には、その生物学的活性によって測定された成熟した遺伝子生成物の検 出。

第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入されたｔｉｅコーディング配列 の存在は、ｔｉｅコーディング配列と同型であるヌクレオチド配列からなるプロ ーブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡ交雑によって検知てきる。

第２のアプローチにおいて、組換え発現ベクター／＋１！主系は、ある”標識” 遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、耐抗生物質性、耐メトトレキセー ト性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける咬合体形成、等）の存在また は不在に基づいて同定され選択される０例えば、ｔｉｅコーディング配列がベク ターの標識遺伝子配列に挿入されたとすると、そのコーディング配列を含む組換 えは、標識遺伝子機能が無いことによって同定される。一方、標識遺伝子は、ｔ ｉｅコーディング配列の発現を制御するために用いられる同種または異種のプロ モーターの制御下で、ｔｉｅ配列と直列に配置してもよい、誘導または選択に対 する応答においてその標識の発現はｔｉｅコーディング配列の発現を示している 。

第３のアプローチにおいて、ｔｉｅコーディング領域の転写活性は、交雑検定に よって試験される０例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは、ｔｉｅコーディング配列 またはその特殊部位と同型のプローブを用いたノーザンプロットによって単離さ れ、分析される。一方、宿主ＩＩＩＩｌ！の全核酸は、そのようなプローブとの 交雑のために、抽出されて検定される。

第４のアプローチにおいて、ｔｉｅの発現は、例えば、ウェスタンプロット、放 射性免疫沈降、酵素結合免疫検定等のような免疫検定によって免疫学的に試験さ れる。しかし、発現系の成功の根本的な試験は、生物学的に活性なｔｉｅ遺伝子 生成物の検出を含んでいる。培養したトランスフェクション体（ｔｒａｎｓｆｅ ｃｔａｎｔ）宿主細胞から得た細胞無しの媒体は、遺伝子生成物が分泌されたと きのｔｉｅ活性が検定される。遺伝子生成物が分泌されないとき、摺胞溶＠液が そのような活性を検定される。どちらの場合も、ｔｉｅに結合したリガンドまた は別な生物活性が測定される検定が用いられる。

Ｄ、ｋｉ　ベブ ｔｉｅに関連した誘導体　＊似体及びペプチドの製造及び用途もまた本発明の範 囲内である。そのような誘導体、類似体またはペプチドは、自然のｔｉｅと比較 して、生物学的活性が向上しているかまたは減少している０本発明のｔｉｅ関連 誘導体、類似体及びペプチドはこの分野で知られた手段により製造される。遺伝 子的及びタンパク質レベルでの方法及び操作は、本発明の範囲内である。この分 野で標準的なペプチド合成が、ｔｉｅペプチドの合成に使用されてもよい、タン パク質レベルでは、多くの化学修飾が、ｔｉｓ様誘様体導体似体、あるいはペプ チドの、この分野で知られた技術による製造に用いられ、エンドペプチダーゼ（ 例えば、実相シアン、トリプシン、キモトリプシン、ｖ８プロテアーゼ、等）ま たはエキソペプチダーゼ、アセチル化、フオーミュレーション（（ＯｒｌＩｕｌ ａｔｉｏｎｌ、酸化、等による特殊な化学的開裂を含むがそれに限られるもので はない。

Ｅ４二１上見抗焦 ｔｉｅまたは関連タンパク質をｉ！麿するポリクローナル及びモノクローナル抗 体の製造もまた本発明の範囲内である。この分野で知られている様々な方法が、 ｔｉｅのエピトープに対するポリクローナル抗体の製造に使用される。抗体の製 造のために、種々の宿主動物が、ｔｉｅあるいは合成ｔｉｅペプチドの注入によ って免疫化される。その動物は、ウサギ、マウス、及びラットを含むがそれらに 限られない０種々のアジュバントが、免疫学的応答を上昇させるために、宿主の 種に応じて使用される。それは、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、 水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質 、プルロニックポリオール、ポリアニオン、オイル乳濁液、キーホールリンベッ ト（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔｌヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び Ｂ　ＣＧ　（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やコリネバク テリウムパルパム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｓ）のような 潜在的に有効なヒトアジュバントを含むが、それらに限られない。

ｔｉｅのエピトープに対抗するモノクローナル抗体は、培地の連続細胞ラインに よる抗体分子の製造のために提供される任意の技術を用いて製造される。こ“れ らは、最初にコーラ−とミルシュタイン（区ｏｈｌ＠ｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ ｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５−４９７　（＋９７５１によって記 述されたハイブリドーマ技術、及び、さらにコスバーらの最近のヒトＢ−細胞ハ イブリドーマ技術Ｋｏｓｂｏｒ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｉｓｍｏｎｏｌｏｇｙ　Ｔ 。

ｄａｙ、　４：　７２　（１９＋１３１及びコールらのＥＢＶ−ハイブリドーマ 技術Ｃｏ１ｅ、　ａｔ　ｍｌ、。

ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ 、７７−９６（ＡｌａｎＲ，Ｌｉｍ５．Ｉｎｃ、＋９８５）を含むが、それらに 限られる句のではない。

分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術で生成てきる。

例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生成され るＦ　（ａｌ）’　）２フラグメント；Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントのジス ルフィド架橋を取り除くことによって生成されるＦａｂ’フラグメント；及び抗 体分子をパパインと還元試薬とで処理することにより得られる２つのＦａｂフラ グメントを含んでいるがそれらに限られない。

ｔｉｅに対する抗体は、成熟したｔｉｅ及びその前駆体及びサブコンポーネント −７１−ムス（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｆｏｒｍｓ）の定量的及び定性的検 出、ｔｉｅポリペプチドのアフィニティー精製、及びｔｉｅ生合成、代謝及び機 能の解明における用途が見いだされた＋ｔｉｅチロシンキナーゼ活性の検出は、 そのような検定におけるｔｉｅ特異的信号の発生及び増幅の酵素的手段として用 いられる。ｔ１ｅに対する抗体は、診断及び治療試薬としてもまた有用である。

Ｆ、ｔｉｅ　ｔｉｅ−エンコーディング　−ｔｉｅ　の　造本発明の組成物は、 ｔｉｅ、ｔｉｅｌｌｌｌ似体及び誘導体、ｔｉｅ−エンコーディング核酸分子、 アンチセンス核酸分子、及び抗−ｔｉｅ抗体の診断及び／または治療用途を含む 種々の用途に応用することができる。

ｔｉｅ−エンコーディング核酸分子またはそのフラグメントは、ｔ　ｘ　ｅをエ ンコードするｍＲＮＡの検出及び定量のためのプローブとして用いられる。公知 の遺伝子配列の全てまたは一部からなる配列を検出するために核酸プローブを利 用する検定はこの分野でよく知られている＊　ｔｉｅのｍＲＮＡレベルは、新形 成の出現及び／または退行と同様に、他のヒト疾患の初期及び／または進行を示 す。

従って、ｔｉｓのｍＲＮＡの検出及び定量する検定は、かなりの診断的価値があ る。

アンチセンスｔ　１ｅＲＮＡ分子は、ｔｉｅエンコーディングｍＲＮＡの翻訳を 治療的にＭ害するのに有用である。ここで、治療目的は、ｔｉｅの存在の除去ま たはそのレベルの下方調整を含んでいる６例えば、ｔｉｅアンチセンスＲＮＡは 、ｔｉｅが、例えばその過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌに依存して、 原因となる試薬として含まれている疾患治療におけるｔｉｅ拮抗試薬として有用 である。

さらに、ｔｉｅアンチセンスＲＮＡは、ｔｉｅの機能的機構を明らかにすること において有用である＊　ｔｉｌｌｌエンコーディング核酸分子は、本出願で別に 議論したように、組換えｔｉｅタンパク質及び関連した分子を製造するために使 用される。

抗−ｔｉｅ抗体は、種々の状況においてｔｉｅを診断及び定量するのに用いられ る０例えば、ｔｉｅの種々の領域に対する抗体は、ｔｉｅ免疫検定またはｔｉｅ の免疫組織化学測定の基礎として使用される。これらの検定においてｔｉｅのチ ロシンキナーゼ活性は、ｔｉｅ信号の発生に対する酵素的増幅反応として有用で ある。抗−ｔｉｅ抗体は、細胞表面上のｔｉｅの量を調査することにおいても有 用である。

ｔｉｅリガンドアゴニストまたは拮抗体として機能する抗体が製造され、それに よってｔｉｅ活性の調整が可能になる＊　ｔｌｅは明らかに、血管内腔に面した 内皮表面上に局在しているの）、細胞外領域、そのフラグメントまたは類似体、 リガンドまたは抗−ｔｉｅ細胞外領域抗体の血流への導入は、内皮！Ｉ胞挙動及 び疾患初期７８行の影響をともなって、インビボでのｔｉｅ活性及び機能を操作 することを許容する。

インビボでの内皮細胞での遺伝子の導入及び発現が見られ、それは内皮細胞での ｔｉｅ及びその種々の機能的誘導体を製造する発現ベクターを通して、ｔｉｅ活 性のさらなる操作を許容するだろう０例えば、インビトロ突然変異誘発によって チロシンキナーゼ領域が特異的に不活性化された受容体チロシンキナーゼが十分 に過発現したときは、優性阻害削または受容体機能として機能する＊ｔｉｅプロ モーター及び調整配列のクローニングは、遺伝子発現の目標を主にインビボの内 皮細胞にすることができる。

Ｑ、ｔｉｅの ＥＧＦ様、免疫グロブリン様、フィブロネクチン様、及びチロシンキナーゼ領域 を含むｔｉｅは、４つの異なる遺伝子超族に属する。細胞外領域において、免疫 グロブリン、フィブロネクチン及びＥＧＦ−同型超族からのすべてのモチーフ（ ■ｏｔｉｆ）を組み合わせることは、知られた受容体チロシンキナーゼの中で独 自の特徴となる。

ＥＧＦＩｍ領域は、タンパク質−タンパク質相互作用に含まれる細胞表面及び細 胞外タンパク質に、構造的モチーフが共通に見いたされる。デービス（Ｄａｖｉ ｓ）　＋Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、　２：　４１０−４１９．　（ ＋９９０１．可溶性または細胞結合リガンドのいずれかの多くの膜貫通型受容体 は、ＥＧＦ繰り返しを含んでいる。さらに、トロンホモドウリン（ｔｈｒｏｓｂ ｏｍｏｄｕｌｉｎｌの２つの６個のＥＧＦ繰り返しである内皮細胞表面糖タンパ クが、トロンビン結合に応答性があることが報告されている、ステアースら（Ｓ ｔａａｒｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６ ４．：　３３５２−３３５６．　（１９８９）Aそ して、リンパ節ホーミング受容体のＥＧＦ領域は、リンパ球接着中に、高い内皮 細静脈へ向けて含蓄されている。シーゲルマンら（Ｓｉｅｇｅｌｍａｎ、　ｅｔ 　ａｌ、）　、　Ｃｅ１ｌ。

８１：　６１１−２２．　（１９９０１，また、キイロショウジョウバエのノツ チ（Ｎｏｔｃｈ　）、デルタ（ｄｅｌｔａ）、クランブス（ｃｒｕｍｂｓｌのよ うなホメオテイツク遺伝子のいくつか（Ｖｈａｒｔ。

ｎ、　ｓｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　４３：　５６７−５８１．　１９８５．　 Ｖｉｓ＋＋ｉｎ、　ａｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、、　６：R４３１−３４４０ 、　Ｔｅｐａｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　６１：　７８７−７９９． １９９０）、及びカエノールハプヂチスーｘレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉ ｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｙｏｃｈｅ＋＋、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　３３５：　５４７−T５０．１ ９８８、Ｙｏｅｈｅｍ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、　Ｃｅ１ｌ、　５８：　 ５５３−５６３１９１１９）も、数個のＥＧＦ様繰り返しを含む大きなトランス メンブレンタンパク質をエンコードする。これらのタンパク質は、細胞−細胞コ ミュニケーションを必要とするいくつかのセルーフエイト（Ｃｅｌｌ−ｆａｔｅ ）決定に参加する。遺伝子的証拠は、さらに、異なるタンパク質−タンパク質相 互作用において機能する種々のＥＧＦモチーフ機能を示唆する、キリ−ら（Ｋｅ ｌｌｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｃｅ１ｌ、　５１：　５３９−５４８．　（ １９８７１，多数のＥＧＦ繰り返しが、ラミニン及びテネイシンのような、細胞 接着を媒介する細胞外マトリックスタンパク質にも見いだせる。さらに、ＥＧＦ 繰り返しは、凝固因子ＶＩ１、ＩＸ、Ｘ、タンパク質Ｃ及びＳと同様に組織−及 びウロキナーゼ−型プラスミノーゲン活性化因子を含む、血液凝固に含まれる選 択されたタンパク質における共通のモチーフである。フリー（Ｆｕｒｉｅ　ａｎ ｄ　Ｆｕｒｉｅ）　、　Ｃｅ１ｌ、　５３：　５０５−５１８＋　＋１９８８） 、ウロキナーゼ−型プラスミノーゲン活性化因子のＥＧＦ様領域は、その受容体 結合に応答性があると報告された。アラベラら（＾ｐｐａｌｌａ、　ｅｔ　ａｌ 、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｉ／ｈｅ＠、、　２６２：　４４３７−４４４０ ．　ｆ１９１１７１゜ｔｉｅのＥＧＦ様繰り返しは、通常は６個であるにもかか わらず、８個のシスティン残基を含んでいる。８ｆｌｉｌのシスティンは、ラミ ニンのＥＧＦ繰り返しにも見られるが、ｔｉｅの繰り返しは明らかに最も相互に 関連している＊　ｔ　１ｅの繰り返しで、アスパラギン／アスパラギン酸Ｓヒド ロキシレーション及びカルシウム結合に必要とされる共通配列を含むものはない 、第１のＥＧＦＩｉ繰り返しを欠いたタンパク質をエンコードしたｔｉｅのｃＤ ＮＡクローンを見いだすことは、さらに、これらの領域が離間したエクソンに局 在しており、繰り返し構造は、ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼの分子発生の過程 におけるエクソン複製によっておそらく生成されることを示唆している。さらに 、ＥＡｈｙ９２６細胞におけるいくつかのｔｉｅ受容体チロシンキナーゼの観察 は、おそらく差別的な切り継ぎに応じて、ｔｉｅ受容体の種々の形態が生成され るという考えを支持する。

免疫グロブリン及びフィブロネクチン（ｆｉｂｆｏｎｅｃｔｉｎｌ超族もまた、 細胞外タンパク質−タンパク質相互作用と可溶ｄ飯たは細胞結合分子のいずれか に含まれる糖タンパク質からなる。ウィリアムスとバークレイ（Ｗｉｌｌｉａ■ ｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｃｌａｙ）、　Ａｎｎ、　Ｒａｗ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　 ６：　３８１−４０５．　（１９８８１，ＰＤＧ　Ｆ、　ＣＦ　Ｓ　−１受容体 、Ｃ−キット・プロト−癌遺伝子と同様にＦＧＦ受容体のような多くの受容体チ ロシンキナーゼは、Ｉｇ様ループを含んでいる。ニーリッチとシュレジンジャー （０１１ｒｉｃｂ　ａｎｄ　５ｅｈｌｅ＋＋ｓｉｎｇｅｒ）　＋　Ｃａ１ｌ、　 ６１：　２４３−５４．　（１９９０）＊多くの場合、免疫グロブリン及びフィ ブロネクチンタイプＩＩＩ領域の両方が同じタンパク質に見いだせる。このタイ プの複数領域（マルチドメイン）構造は、最近、いくつかの受容体チロシンキナ ーゼに存在することが報告された。オブリャン（０’　Ｂｒｙａｎ　）ら、　Ｍ ｏ１、　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｉ＋＋　５０１６−５０３１．　（１９９ １１；　レスシグノ（Ｒｅｓｃｉｇｎｏ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１６・１９０９ −１９１３．　（１９９１１，免疫グロブリンとＦＮＩＩＩ繰り返しの両方が共 通の発生起源を有することが示唆されているので（パンザン（Ｂａｎｉａｎ）　 ＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：　６９３４−６９３８．１９９０）、 ｔｉｅタンパク質の繰り返し領域が、これらのクラスの両方の特徴を有すること を記すのは興味深い、ｔｉｅタンパク質の細胞外領域におけるＥＧＦ、免疫グロ ブリン、及びフィブロネクチン様構造モチーフの存在は、ｔｉｅ受容体が、いく つかの興なった細胞外分子と相互作用をすることを示唆している。

１ｐ３３−９３４での、ｔｉｅ遺伝子の領域的局在化は、ｔｉｅに対して負であ るＰＢ５−５ハイブリツドが、Ｊｕｎに対しては正であるので、ｔｉｅの遺伝子 座がｊｕｎ遺伝子座のテロメリツクであることを示している。ハルスカ（Ｈａｌ ｕｓｋａ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ｌｌ５Ａ、 　８５：　２２１５−２２１８．　（１９８８１，染色体領域P ｐ３２−３４は、神経芽細胞腫、悪性リンパ腫、神経膠層及び他の悪性腫瘍の削 除に含まれる。トレンド（τｒｅｎｔ）ら、　Ｃｙｔｏｇａｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｇｅｎｅｔ、、　５１：　５３３−５６２゜（＋９８９１゜ 我々の以前の及び現在の実験は、ｔｉｅ受容体に対するｍＲＮＡが、培地のほん の数種の腫瘍細胞ラインにおいてのみ発現されることを示している。しかしなが ら、発現は、調査した全てのマウス及びヒト組織のノザンプロットにおいて明白 であった。この発現のパターンは、ｔｉｅのｍＲＮＡを、第１に培養したヒト内 皮細胞と同様にＥＡ、ｈｙ９２６及びＰＡＥＣ内皮細胞ラインに見いだしたこと によって示唆されているように、組織から得られた信号が内皮細胞から導かれた ものである可能性と両立てきる。さらに、マウスにおけるのと同様に、ヒトにお けるｔｉｅ発現のｉｎ　５ｉｔｕ交雑分析は＊　ｔｉｅのｍＲＮＡが内皮細胞に 存在することを示している。

ｔｉｅのｍＲＮＡ発現についての上述した発見は、ｔｉｅ５！！現生成物が、内 皮細胞直系と同様に、赤色を帯び、目積芽球分化容量を保持したとポテンシャル （ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ　）造血細胞直系であることを特徴としていることを 示唆している。目積芽球及び内皮細胞の間を占めるいくつかの分化抗原が存在を 示されており、−例は血小板糖タンパク質１１１ａである。　Ｂｌｏｏｄ、　７ ２：　１４７８−１４８６．　（１９８８１；　キーフ７−　（Ｋｉｅｆｆａｒ ）ら、　Ｂｌｏｏｄ、　７２：　１２０９−１２１５．　＋１９８８）；　パリ ソン（Ｂａｒｒｉｄｇｅ）ら、　Ｂｌｏｏｄ、　６６：　７６−８５．　（１９ ８５）、　Ｅ　Ｇ　Ｆモチーフは、血管との結び付きを媒介するタンパク質と同 様に、止血を制御するタンパク質の共通の主題であるので、観察されたｔｉｅの ｍＲＮＡの発現パターンはとても興味深い。

実施例１ ｉｅ　コー　ｃＤＮＡクローン　′ バクテリオファージＩｇｔｌｌ　（Ｄｒ、　Ｍｏｒｔｉｍａｒ　Ｐｏｎｃｚより 寄１１．Ｃｈｉｌｄｒａｎｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌｏｆ　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉ ａ、Ｐ＾；（Ｐｏｎｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ、８９：２１９−２２３， １９１１７））に含まれてい■ オリゴ−ｄＴプライマーを有するヒトＨＥＬＩＩ胞ｃＤＮＡライブラリーと、任 意のプライマーを有するヒト内皮細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ 　Ｃａｔ、　＃　１０７０ｂｌは、Ｋ５６２白血病細胞のポリアデニル酸が付加 されたＲＮＡを逆転写したものからＰＣＲ増幅させて得られたＪＴＫ１４　ｃＤ ＮＡ断片を用いて選別される・バータネン（Ｐａｒｔａｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８７：　１１９１３−８９１７ ．ｆ＋９９０）、サムプルツク（Ｓａａｂｒｏｏｋｌら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ｃｌｏｎｉｎｇ　−ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅ＋＋ｓ、　１９８９ ．に示された方法により、陽性のプラークが同定、精製される。バクテリオファ ージ　ラムダのｃＤＮＡ挿入物がＥｃｏＲＩ−断片として単離され、ＧＥＭ３Ｚ ｆ　（＋）プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）でサブクローニングされる。完全なｔ ｉｅタンパクをコードする領域は、両方のライブラリーから単離される。Ｉ（Ｅ Ｌ−ライブラリーから単離された二つの重なり合うクローン（ＨＥ１１−１．図 １に示す塩基対６２から３８４５、および、１２ａ。

塩基対１から２４４６）が、得られる配列に晶づいて構成されたオリゴヌクレオ チドプライマーを用いた頗終Ｔ法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅ ｔｈｏｄ）によって配’Ｎ決定される。ｃＤＮＡの全ての部分が両鎖について配 列決定される。配列の解析は、ＧＣＧパッケージ　プログラム（デベロウクス（ Ｄ＠ｖａｒｅａｘ）ら、　Ｎｕｅｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　１２：　３ ８７−３９５．１９８４）と、アップル　マツキントラシュのプロサイト　プロ グラム（ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｉｔｅ　ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて行われる。

Ｋ５６２細胞ｃＤＮＡからＰＣＲクローニング法により単離された２００塩基対 の長さのｔｉｅｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを有するヒト赤白血病細胞ｃ ＤＮＡライブラリーと、任意のプライマーを有するヒト内皮細ａｃＤＮＡライブ ラリーを選別するための分子プローブとして用いられる。）ＩＥＬ　ライブラリ ーから単離されたＨＥ１１−１と１２ａのクローンの塩基配列解析は、１１３８ アミノ酸の読み取り枠を示す（図１）０図１′ｒ！示されている翻訳開始因子、 メチオニン、は、典型的な共通配列（コザック（［ｏｚａｋ）　ｒ　Ｎｕｃｌａ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　＋２：８５７−８７２．１９８４）によって囲 まれており、小胞体に転送されるためのシグナル配列としての特性を示す疎水性 のアミノ酸配列が続いている。読み取り枠のアミノ酸残基２１４から始まる、２ ４のシスティン残基を含む１３０のアミノ酸残基かもなる一つの領域がある。こ の領域は、それぞれ８つのシスティン残基を含む３回繰り返される相同的な領域 に並べられていてもよい（ｒＭ２Ａ）、図２Ａは、また、ｔｉｅの富システィン 領域の、上皮増殖因子（ＥＧＦ）とＣＲＩＰＴＯ成長因子のタンパク質や、ラミ ニンＡ１１ｌのＥＧＦ様の繰り返し配列、ＮｏｔｃｈとＬｉｎ１２のようなキイ ロショウジョウバエや線虫（Ｃａａｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｔ） それぞれの発達制御タンパク、血ｗｉｓＩ固因子ＩＸａとの比較を示している０ 重要な構造上の類似が、ｔｉｅとＥＧＦファミリーとの間に存在し、これは、Ｅ ＧＦ繰り返しファミリーに、ｔｉｅの富システィン繰り返し配列が包含されるこ とを認めるものである。しかしながら、ｔｉｅの繰り返し配列は、ＥＧＦ繰り返 しファミリーの他のものに対してより、互いのものに対して、より密接に関連し ている。このことは、繰り返し配列のアミノ終末端を調べたときに特に明確であ り、それらの３つのシスティン残基は、他のＥＧＦの繰り返し配列には保存され ていない（図２Ａ）、３つのＥＧＦ繰り返し配列をコードしている、いくつかの ｔ　ｉ　ｅｃＤＮＡに加えて、あるｃＤＮＡクローンがＨＥＬＩＩｍｃＤＮＡラ イブラリーから単離される。これは、読み取り枠に影響するものを除いては、Ｅ ＧＦ繰り返し配列の最初の部分（図１において矢印の間に示される）を欠くもの である＊ｔｉｅの細胞外領域のアミノ末端領域は、ニワトリＮ−ＣＡＭタンパク のアミノ末端と、弱いながら重要な相同性がある（タンニンガム（Ｃｕｎｎｉｎ ｇｈａ−）も、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３６：７９９−８０６．　＋９８７１． 　Ｎ−ＣＡＭに見られるように、免疫グロブリンの超科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌ ｙ）のタンパク質に特徴的な共通配列に囲まれる一対のシスティン残基が確認さ れる（図１におけるＩｇ＋）　（ウィリアムスとパークレイ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ 　ａｎｄ　Ｂａｒｅｌａｙ）　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．、６ ：　３８１−４０５．１９８８）　＊さらに、２組のシスティン残基が、３つの ＥＧＦ繰り返し配列のカルボキシル末端に位置している。最初の岨のシスティン の周辺のアミノ酸配列は、免疫グロブリンの領域に対し、付加的な相同性を示す （図１における１ｇ２）、Ｉｇ２領域に続く細胞外領域（一方のシスティンの組 を包含する）は、フィブロネクチンのタイプＩＩＩ　（ＦＮＩ　Ｉ　Ｉ）の繰り 返し配列に相同な、３つの繰り返し配列に並べられてもよい、ｔｉｅタンパクの ３つの繰り返し配列、および、これらとヒトＬＡＲホスホチロシンホスファター ゼに存在するＦＮＩ　Ｉ　Ｉ繰り返し配列との比較（ストレウリ（Ｓｔｒ＠ｕｌ ｉ）ら。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、、　＋６８：　１５５３−１５６２．１９８８）が、 図２Ｂに示されている。興味深いことに、これらの３つの繰り返し配列の二番目 （ＦＮ２）は、免疫グロブリン領域の何らかの他の特徴たけでなく、−組のシス ティン残基を含んでおり、従って、ＦＮＩＩＩ繰り返し配列と免疫グロブリン領 域の中間に相当する。

Ｎ−グリコジル化が起こりうる５つの共通な部位（ＮＸＳ／Ｔ、Ｘ＝全てのアミ ノ酸）は、細胞外の領域に区別されてもよい、これらのどれ一つをとっても、Ｅ ＧＦ繰り返し配列には見られない、７６１−７８７のアミノ酸は、配列の疎水性 領域を形成し、これが受容体の形質膜領域として機能するらしく、ポリペプチド の推定上細胞質側となるいくつかの基本的な残基がこれに続いている。ジュク膜 近位領域は、８３７番アミノ酸で始まるチロシンキナーゼ配列に相同な領域の前 の５０残基の長さである。１４アミノ酸（図１においてイタリック字体で示され ている）のキナーゼの挿入配列に相同性の阻害があり、この相同性は、受容体の カルボキシル末端尾部の３１アミノＩｉア始めから、最初に失われる。アミノ酸 配列データベース（Ｓｗｉｇａｐｒｏｔ　ａｎｄ　ＮＢＲＦ）におけるチロシン キナーゼ領域と同族のものを調査することによって、ＦＧＦＲ−１、ｒｅｔ、ｃ −ｆｍｓ、ＰＤＧＦＲ５およびｃ−ｋｉｔ　受容体チロシンキナーゼが、ｔｉｅ と極めて近い相同性（チロシンキナーゼ領域において、約４０％のアミノ酸配列 の同一性）を有するとして同定される。

実施例２ バ龜え！！！ １９６のカルボキシ末端のアミノ酸をコードしているｔｉｓｃＤＮＡ断片は、ｐ ＥＸ２細菌発現ベクター（スタンレイとルジオ（Ｓｔａｎｌｅｙ　ａｎｄ　Ｌｕ ｚｉｏ）　、　ＥＭＢＯＪ、　３：　１４２９−１４３４．１９８４）内に、内 部のＸｈｏＩ部位を使って挿入される。その結果としてのＳ−ガラクトシダーゼ の融合タンパク質が細菌内に生産され、分離用ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって部分精製される。

ポリペプチドのバンドはこのゲルから切り出され、細かく砕かれ、フロインドア ジュバントと混ぜられて、ウサギの免疫感作として使用される。抗血清は、三次 免疫注射の後に使用される。予測されたｔｉｅタンパクのカルボキシル末端から １５アミノ酸に対応するペプチドが合成され、グルタルアルデヒドによってキー ホール　リンベット　ヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ園）と架橋さ れる。免疫感作は、実施例１に示したように行われる。簡潔に述べると、７．５ ｍｇの輸送タンパク質を、０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸、ｐＨ８，０に溶解し、 ７．５ｍｇのペプチドと混合し、５ｍｌの２０ｍＭグルタルアルデヒドを加える 。その溶液を混ぜた後、１１温で１５分間放置し、その後、２．５ｍｌのグルタ ルアルデヒドを再度加え、再度１５分間の放置を繰り返す１次に、Ｏ，１ｍｌの １Ｍグリシン、ｐＨ６，０を、未反応のグルタルアルデヒドをブロックするため に４加し、さらに１０分間撹拌を再開する。その産物は、リン酸バッファー生理 食塩水で完全に透析される。免疫感作のために、０．５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７， ５に溶けている１、２５ｍｇの合成ペプチド−ＫＬＨ抱合体が、０．５ｍｌの完 全フロインドアジュバントと混合される。この乳濁液は、皮下注射によって、生 後三ケ月の二二−シーラントシロウサギに、１０匹それぞれに対しＯ，１ｍｌず つ注入される。

２週間に一度、等量の抗原を用いて、免疫感作を繰り返す、血清は、二次および その次の三次免疫注射した一週間後に耳の血管から集めた血液から調製される。

実施例３ に　墨　゛ ｔｉｅタンパク質の全長をコードする配列（二つの重なり合うクローン、ＨＥ１ １−１および１２ａ１かも組み合わせられる）は、Ｓｖ　ポリー哺乳類発現ベク ター（ステーシーとシュナイフ（Ｓｔａｃｅｙ　ａｎｄ　５ｅｈｎｉｅｋｅ）　 、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｇ、、　＋８＋　１８２９．１９９０； 　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　５ＶＩ４−２）のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入される。５ Ｖ１４−１ベクターは、シグナル配列から最初の７アミノ酸を欠くものであるが 、Ｓｖ−ポリベクターにあるＡＴＧコドンから開始される。発現ベクター（３ｖ １４−２，５Ｖ１４−１）は、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法 により、ＣＯ３−１１１胞に接種される（マツクチャンとバガノ（ＭｃＣｕｔｃ ｈａｎ　ａｎｄＰａｇａｎｏ）　＋　Ｊ、　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　１ｏｓｔ 、、　４１：　３５１−３５７１１９６８）＠接種から二日後、その細胞は、３ ５３−メチオニンを用いて、ｌｏｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下、あるいは 否存在下で４時間標識される。ｌＢ胞は、ＰＢＳで洗浄し免疫沈降緩衝液（ｌｏ ｍＭ）リス　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣ１，’　０．５％デオキシコール酸 ナトリウム、０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　４０　、０　、１％ ＳＤＳ、Ｏ。

ＩＴＩＵ／ｍｌアプロチニン）でかき集める。細胞溶解物は、超音波処理し、１ ５分間、１００００ｇで遠心し、抗血清３ｍｌと水中に一晩放置される。プロテ ィンＡセファロース（Ｐｈａｒ簡ａｃｉａ）を加え、旋回させつつ３０分間放置 される。

沈澱物は、免疫沈降緩衝液を用いて、また一度はＰＢＳを用ｔ１て、また５ＤＳ −ＰＡＧＥでの解析の前の一度は水を用いて、４回洗浄される。

ｔｉｅｃＤＮＡ配列の構造上の予測は、ｔｉｅタンパク質をコードしている全領 域を、ｐＳＶＳリポ現ベクター（ｐＳＶ１４−２とｐＳＶ１４−１を構成スル） のＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングすることによって調べられ、続し九てこれ らの発現ベクターは、ＣＯ８細胞に尋人される。これらの二つの構成物によって 生産されたタンパク質は、そのシグナル配列において上記の違ｔ）があるが、予 測される完全なタンパク質の産物は、同一のものである。二日後、その細胞は、 代謝的に標識され、生成された抗体を用いて抗体で沈降される。前記抗体として は、Ｓ−ガラクトシダーゼ−ｔｉｅのような、予測されるｔｉｅタンパク質の１ ９５カルボキシル末端アミノ酸残基を含む融合タンパク質に抗するもの（抗血清 ＨＩ）、あるいは、ｔｉｅのカルボキシル末端に一致する１５アミノ酸ペプチド に抗するもの（抗血清　ＭＩ）である０図３は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動による、免疫沈降された放射活性のあるポリペプチドの解析を示すも のである０図３Ａに見られるように、ＨＩ抗血清は、未接種のｃｏｓｍ胞から、 なんらかの弱く標識されたポリペプチドを沈降させる。ｃｏｓｍ胞がそのｍＲＮ Ａを発現しないことから、これらのポリペプチドは、ｔｉｅとは恐らく関係な− ものであろう。

ｐＳＶ１４発現ベクターを用いて形質転換された細胞は、さらに特別な１１７ｋ Ｄのポリペプチド（図３にｔｉｅと記した）を示す、このｔｉｅポリペプチドは 、免疫感作前の血清や、抗原でブロックされた抗血清を用いた場合には、沈降さ れない、１１７ｋＤのポリペプチドは、カルボキシ末端のペプチドに抗するＭＩ 抗血清によっても確認される（図３Ｂ）、タンパク質のＮ−グリコジル化を妨げ るためにツニカマイシンの存在下で代謝的に標識され、形質転換されたＣＯ８細 胞からのｔｉｅポリペプチドの免疫沈降は、見かけの分子量が約１０５　ｋＤの 特別なポリペプチドを与える（図３Ｂにおいて、ｔｉｅ”と記す）。

実施例４ ＮＩＨ３Ｔ３　におけるｔｉｅの ｔｉｅｃＤＮＡの全長は、モロニーマウス白血病ウィルスの長１）末端繰り返し プロモーターの制御のもとにサブクローンされる。この発現ベクターは、ｐＳＶ ｎｅｏｌマーカープラスミドを持ったＮＩＨ３Ｔ３細胞と、ｔｉｅ発現のために 解析される０４１８耐性クローンとの共移入（ｃｏ−ｔｒａｎｇｆｅｃｔ）に用 ｂ）られる、一つの集密的なプレートの細胞が、イムノプロット解析のために、 ２．５％　ＳＤＳ、１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ６，５中で溶解される。細胞溶 解物は、ＳＤＳ−ｐａｇｅで電気泳動され、ニトロセルロース膜に電気的に移さ れる。その膜は合した抗体は、ブタの抗−ウサギ　抗血清が接合した西洋ワサビ のペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）や、ＥＣＬ試莱（Ａｍａｒｉｈａ−）によって 染色される。チロシンのリン酸化を受けたタンパク質は、記述の通りに免疫沈降 される（フラツケルトン（ＦｒａｃｋｅｌｔｏｎＪら、　＋９９１．　Ｉｎ　Ｔ 、　Ｈｕｎｔｅｒａｎｄ　Ｂ、　Ｍ、　５ｅｆｔｏｎ　（ａｄ、）、　Ｐｒｏｔ ｅｉｎ　ｐ■盾唐垂■盾■ ｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｒｔ　Ｂ、　Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ、　２０１：　 ７９−９１Ｌ簡単に述べると、一つの集密の細胞が、抽出緩衝液（１％　トリト ン！−１００，ｌ　ＯｍＭ　）リス　ｐＨ７，６，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 　ＮａＣ１，１００Ｍ　オルトバナジン酸ナトリウム。

１ｍＭ　ＰＭＳＦ）で溶解し、その溶解物は、抗−リン酸化チロシン抗体（ＩＣ ２−Ａ、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）が接合されたアガロースと混ぜ 、水中に２時間旋回させつつ放置させる。免疫沈降物は、抽出緩衝液を用いて４ 回洗浄し、チロシンがリン酸化されたタンパク質は、１＋ｎＭのリン酸フェニル を用いて溶出される。

溶出されたタンパク質は、上記のイムノプロット法により解析される。１１７ｋ Ｄのｔｉｅタンパク質は、ｔｉｅのカルボキシル末端に一致するペプチドに抗し て生成された抗血清を用いたイムノプロット法により確認される（図４）、さら に、類似の分子量を有する内在のｔｉｅタンパク質が、Ｐ　Ａ　Ｅ　（ｐｏｒｃ ｉｎｅ　ａｏｒｔｉｃｓｏｄｏｔｈｅｌｉａｌ）細胞に確認される。そのｔｉｅ タンパク質もまた、ｔｉｅ−移入細胞の抗−リン酸化チロシン免疫沈降で確認さ れる。

実施例５ ｔ゛　マ・ビゞ 正常なヒトの男性の末梢血液のバフィーコート（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔｌ白血球 からの中期拡散物を準備し、ハーバ−とサウンダ−（Ｉｌａｒｐｅｒ　ａｎｄ　 ５ａｕｎｄｅｒｓ）　、　Ｃｈｒｏｓｏｓｏｍａ＋８３：　４３１−４３９．　 ｆｆ９８１１に記述される通りに本質的にハイブリッド形成される。ｌｎｇｉｔ ｕハイブリデイゼーションのため、約１ｍｇのＨＥＬＬ−ＩＣＤＮＡ挿入物が、 ４糟の３Ｈ４１１１されたＮＴＰを用いて、約４−＋３Ｘ１０７Ｃｐｍ／ｍＫの 比活性になるよう、ニックトランスレーションにより＊＊＊される。ノーイブ１ ノデイゼーシヨン後、スライドは、５０％のホルムアミド、２ＸＳＳＣ１３９℃ で洗浄し、１２日間、４℃でコダックＮτＢ２　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｃｋ感 光乳剤に感光させる。ステは、最初は、Ｗｒｉｇｈｔ−ギムザ着色剤（カニッツ アロとエマニュエル（Ｃａｎｎｉｚａｒｒｏ　ａｎｄ　Ｅｍａｎｕａｌ）　、　 Ｃｙｔｏｇｓｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎａｔ、、　３８：　３Ｇｇ−３０９１ を用いてＧ−バンド化され、必要ならば、トリプシンーギムザ（ＧＴＧＩ技術に より再度バンド化される。

放射活性のあるｔｉｅプローブの正常なヒトの中期の染色体へのｉｎ　５ｉｔｕ ハイブリデイゼーシヨンでは、ｔｉｅの配列を染色体１に局在させる。全部で３ １７の、染色体に局在化された粒子は、１４５の中期（染色体）に取り入れられ る。

３４パーセント（１０９／３１７）の粒子が、染色体ｌ上にあり、染色体ｌの粒 子の６９％（７５／１０９）が、１ｐ３３−９３４に局在していた。染色体１上 の粒子の局在化は、概略的に図５に示されており、この図における点は、それぞ れ３つの粒子を示している。これは、１ｐ３３−ｐ３４のバンド間の境界近辺に 粒子の高度の集中化により、１ｐ３３−９３４への局在を狭めている。マウス− ヒト雑種形成した体細胞の系統のパネル（ｐａｎｅｌ　）を用いた染色体の局在 性も、ｔｉｅの遺伝子座をヒトの染色体１に配置するものであった。

実施例６ 血　細　および　細胞　のｔｉｅ−ｍ上コＬΔぷり１区本研究に用いた白血病細 胞系については、数種の既刊の出版物に報告がなされてきた１Ｋ５６２　（ロヅ ツイオ（Ｌｏｚｔｉｏ）とロツツイオ（Ｌｏｚｚｉｏｌ、　Ｂｌｏｏｄ＋　４５ 　＋　３２１−３３４．１９７５）　、　ＨＬ　−６０（コリンズ（Ｃｏｆｆｉ ｎｓｌら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７０　：　３４７−３４９．１９７７）、ＨＥ Ｌ（マーティン（Ｍａｒｔｉｎｌとパパヤノブ−ロー（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｕ ｏｌｏｕ）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１６　：　１２３３−１２３５．１９８２ ）　、　Ｄ　ａ　ｍ　ｉ　（グリーンパーグ（Ｇｒｓｅｎｂｕｒｇ　ｌら、　ｌ ｌｏB ｄ、　７２：　１９６８−１９７７、１９８８１　、　ＭＯＬＴ−４（ミノワダ （Ｍｉｎｏｗａｄａｌら、　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｅａｒ　Ｉｎ５ｔ、、　４９ ：８９１−８９５．１９７２）　、　Ｊｕｒｋａｔ　（シュヴエンク（Ｓｃｈｗ ｅｎｋ）とシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｌ、　Ｂｌｕｔ、　３１　：　２ ９９−３０６．１９７５）　、　Ｕ　９３７　（サンドストロム（Ｓｕｎｄｓｔ ｒｏｓ）とエルシン（Ｎｉｌｓｇｏｎ）、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　＋７ ：　５６５−５７７、１９７６）　、　ＫＯ−１（ケフラー（［ｏｅｆｆｌｅｒ ）とゴルデ（Ｇｏｌｄｅｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２００　：　１１５３−１１ ５４．１９７８）、ＪＯＫ−１（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、　＋ ９８２．　Ｒ，Ｆ、リヴオルテラ（Ｒ，Ｆ。

Ｉ！６ｖｏｌｔｅｌｌａｌｌｉによる１癌細胞中の分化した機能の発現”　ｐ、 ２３９−２４５．　Ｒａｖａｎ　ＰｒｅＩＩ、　Ｎｓｗ　Ｙｏｒｋ）　、ＭＫ　 −２（ガーンベルク（Ｇａｈｓｂａｒｇｌら、　１９８５．　Ｌ、　Ｃ，アンダ ーラン（Ａｎｄｅｒｓｇｏｎｌら纏による“正常および悪性の分化の過程におけ る遺伝子の発現”　ｐ、＋０７−１２３．　Ａｃａｄｓｍｉｅ　Ｐｒ１Ｊｌ＋　 Ｌｏｎｄｏｎ）およびＲＣ−２Ａ　（ブラッドーイ（Ｂｒａｄｌｅｙ）ら、　Ｂ ｒ、−１，Ｈａｅｍａｔ、　、　５１　：　５９５．１９１１２）−白血病細胞 は１０％のＦｅ２および抗生物質を含有するＲＰＭＩ中で培養されるｅ　Ｄ　ａ 　ｍ　ｉ　ＩＩ胞は、１０％の馬血清を含みＩｇｃｏｖｅｓで修飾したＤＭＥＭ 中で培養される０人間のへその緒の静脈内皮細胞の最初の継代とＡ３４９肺癌騰 細胞（ニドゲルｆＥｄｇａｌｌ）ら、Ｐｒａｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　５０：　３７３４−３７３７）とを融合して得た永久複合細 胞系列（ＥＡ、ｈｙ９２６）Ｌｔ、１０％のＦｅ２および抗生物質を含有するＤ ＭＥＭ−ＨＡＴ培養液中で培養される。ＰＡＥ細胞（クレッソンーウェルシュ博 士（Ｄｒ、ＬｅｎａＣｌａｅｇｇｏｎ−ｗｓｌｇｈ、ＬｕｄｗｉｇＩｒｕ＋ｔｉ ｔｕｔｅｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、１ｌｐｐｓａｌａ、Ｓｗ■р■ ｎ）の厚意による）は、１０％のＦｅ２を含有するＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培Ｉ液中 で培養される。

ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはサンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる“分子クロー ニング−実験の手引”　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）に叙述の方法で細胞系より抽出される。

５グラムのポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルは、ホルムアルデヒドを含有するアガロ ースゲル中で電気泳動し、標準条件（サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｌら、 ５ｕｐｒａ）を用いてプロットされる。ＨＥＩ　１−１　ΩＤＮＡクローンの挿 入断片は、ランダム開始法によって標識され、吸収に対合させる。ホルムアミド ５０％、５ｘデンハ−ツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）溶液（１００ｘフイコール 、ポリビニルピロリドンおよび牛血清アルブミンをそれぞれ２％ずつ含むデンハ ーツ溶ｆｉ）、５ｘＳＳＰＥ　（３Ｍ　ＮａＣ１，２００ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４ ，Ｈ２Ｏ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，０１，０，１％　ＳＤＳ　（ドデシル 硫酸ナトリウム）、および０．１ｍｇ／ｍｌの音波処理した鮭の精子ＤＮＡ中で ４２℃で１８〜２４時間で、ハイブリッド形成を行なった。フィルタは６５℃に て１ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ，０）および０．１％ＳＤＳ中て洗い、コダックＸＡＲ−５フィルムに露光する 。

図６は、１０の白血病細胞系列中のｔｉｅｍＲＮＡの分析結束を示したものであ る。３．８ｋｂのｔｉｅｃＤＮＡプローブによって探索したところ、ＨＥＬ赤血 赤面白血病細胞Ｏ−１骨髄性白血病細胞およびＤａｍｉ巨核芽球核芽球白血病細 胞４．４ｋｂのｔｉｅｍＲＮＡとして発現するｅ　ＪｕｒｋａｔおよびＭＯＬＴ −４Ｔ−（！＠１１白血病のほかにＨＬ−６０前骨髄球白血病、Ｕ９３７および ＲＣ−２Ａ単環式白血病、ＪＯＫ−１毛状細胞白血病およびＭＬ−２骨髄性白血 病細胞もｔｉｅｍＲＮＡに対して負である。ｔｉｅ　ｍＲＮＡもまた、Ｋ５６２ 細胞のＴＰＡ処置の後、細胞が目抜芽球への分化を軽る際に誘導される。興味深 いことに豚の大動脈性内皮細胞（ＰＡＥ）は、数種の内皮標識がインビトロに発 現すると報告されティる（ニドゲル（Ｅｄｇｅｌ　ｌ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　［ＩＳＡ、　５０：３７３４−３７３７．１９ ８３およびエマイス（Ｅｓｃｉｓ）とニドゲル（Ｅｄｇｅｌｌ）、Ｂｌｏｏｄ、 ７１：１６６９−１６７５．１９８８）ヒトの雑種内皮細胞系列ＥＡ、ｂｙ９２ ６と同様で、ｔｉｅｍＲＮＡは豊富に出現する。ＥＡ、ｂｙ９２６細胞系は、人 のへその緒の内皮細胞とＡ３４９肺癌腫細胞系列とを融合させることにより作る ことが出来る。Ａ３４９１１胞は、ｔｉｅｍＲＮＡの発現に関しては負である。

４．４ｋｂのｍＲＮＡに加えて、ＥＡ、ｂｙ９２６細胞は３．９．４．２および ４．７ｋｂのｔｉｅｍＲＮＡ種を発現する。細胞系中のｔｉｅ　ｍＲＮＡ発現の ノザンプロット分析の結果を表１に示した。

実施例７ に　ｉ 他の受容体チロシンキナーゼに対して低い相同性を示すチロシンキナーゼ領域以 外では、クローン化した人のｔｉｅｃＤＮＡの選択断片は、ｔｉｓｍＲＮＡを探 索するためｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成プローブとして用いられる。特に我 々は、ＰｓｔｌとＳａｌ　Ｉを用いてより小さな断片に加水分解したｔｉｅクロ ーンの細胞外領域に相当する、通常の長さのΩＤＮＡクローンのＳｍａｒ断片（ ヌクレオチド２６Ｂ−１７６７）を用いた。プローブはｉｎ　５ｉｔｕハイプリ デイゼーシヨン（ファインベルク（Ｆｅｉｎｂｅｒｇｌとフォーゲルスタイン（ Ｖｏｇｅｌｓｔａｉｎ）＋Ａａａ１．１ｉｏｃｈｅｓ、、＋３２：５−１３．１ ９８３）のために３５８−デオキシ（チオ）ＡＴＰを用いて標識した、バクテリ オファージラムダＤＮＡのＢｇＩＩにより生じた１００−７９０−ｂｐの断片も 同様に標識し、負の制御プローブとして用いた。胎児の堕胎によるの合同倫理委 員会の許可の下に得たものである。　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリデイゼーシヨンは 、前述のように（サンドバーブ（Ｓａｎｄｂｅｒｇ）とヴオリオ（Ｖｕｏｒｉｏ ）　＋Ｊ、　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、、＋０４＋１０７７−１０８４）実施され る。概要を記すと、治療上の堕胎から得た１５〜１９週目の人の胎児の組織サン プルは、ホルマリンで定着させ、区分のためパラフィンに埋め込む、切片はプロ テナーゼにと塩酸とで前処理を行ない、アセチル化される。ハイブリッド化は３ ５８−デオキシ（チオ）ＡＴＰで標識したプローブを用いて４２℃にて２４時間 行ない、次いで洗浄し、４℃にて５〜２５日間オートラジオグラフィーを行ない 、ヘマトキシリンを用いて切辺の焼き付けを行なう。

組織におけるｔ　ｉｅｍＲＮＡの発現は、１５〜１９週目の人の胎児の組織のｍ ＲＮＡハイプリディゼーションにより研究される。内皮細胞系列中のｔｉｅの発 現に一致して、ｔｉｅ　ｍＲＮＡは腎臓の中程度および大型の導管の壁中に位置 するようである（Ｆｉｇ、８）、［識したラムダＤＮＡは、負の制御として用い られ、パックグラウンドに関して探知できるハイブリッド牝シグナルは得られな かった。

実施例８ Ｗ２に＋　ｔｉｅ　ｍＲＮＡ 二つのＩｇｔｌｏライブラリーから贈られたほぼ１０６のプラーク（ズリオツド 博士（Ｄｒ、Ｂｒ１ｇ１ｔｔｅ　Ｇａ１ｌｉｏｔ、Ｚｅｎｔｒｕｓ　ｆｕｒ　） ｌｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅ窒■AＧｅｒ ｍａｎｙ＋の厚層による。）は、交尾後１０日か１１日（ｐ、ｃ、）のマウス胎 児のｍＲＮＡを、ＳｍａＩ断片（ヌクレオチド１５５−１７６５ｉこのｃＤＮＡ は最初の免疫グロブリン領域とｔｉｅ受容体の細胞外部のＥＧＦ様領域ｌ−１１ １とを暗号化する）および人のｔｉｅ受容体ｃＤＮＡ（バータネン（Ｐａｒｔａ ｎｅｎ　ｌら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｌｉｎ　ｐｒｅｓｓ）の３．８ｋｂ のＥｃｏＲ１断片を用いて選択することにより調製される。このｃＤＮＡ断片は 、他の既知の遺伝子に対して僅かな相同性をもつのみである。そのプローブはラ ンダム開始法により［ａ−３５Ｐ３　ｄＣＴＰを用いて標識される。それぞれの ファージ感染した培地のニトロセルロースレプリ、１％ＳＤＳおよび１００ｍｇ ／ｍｌの５ｓＤＮＡ中でハイブリッド形成される、上程の正のクローンが精製さ れて得られ、そのうち四種はサッククローン化されてｐＧＥＭ　３Ｚｆ　（＋） （Ｐｒｏｍｅｇａ）となり、配列される。ＤＮＡ配列は、サンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）らによるジデオキシ頗終Ｔ法（Ｐｒｏｃ、ｌ１ａｔ１．＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 １ｌｓＡ７４：５４６３−５４６７．１９７７）によって、修飾Ｔ７ＤＮＡポリ メラーゼ（配列酵素ＴＭ、［１、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ）を用いて行なわ れる。その配列は、母集団のｐＧＫＭ配列プライマーを用いて、サブクローン化 された制限断片の両端から生じる。大断片の分子内配列は、全ての断片の相補的 頗と同様に、先行配列上の配列情報によって合成されたオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いて決定される。ＤＩＯＥ５およびＩｃＩＤと名付けた、マウスのｔ ｉｅ　ｃＤＮＡプラスミドクローンの二種の卵重なり挿入断片（図１０）をハイ ブリダイゼーシヨンプローブとして用いた。８日から１４日ｐ、ｃ、のマウスの 胎児は、ＣＢＡおよびＮＭＲマウスのつがいの相手から取り出された。胎児の齢 については、交尾プラーグが検出された日をＯＢ目として（交尾の時刻は午前２ 時と判断した）算出した。妊娠したマウスは頸管脱日によって殺し、胎児を直ち に取り出し、リン酸を緩衝剤とした塩ａｍ池（ＰＢＳ）を通してバラホルムアル デヒドの４％ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，２）中に移送した。胎児は４℃で１８時間固 定し、脱水し、ワックス（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅ＋＋ｔｉｆｉｅ社製）に包理 し、５〜６ｍｍ切片に切り分けた０分離されたマウスの器官は同様に処理した。

すべてのＲＮＡは、カークウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らによる方法（Ｂｉｏｃ ｈｅｗｉｎｔｒｙ、　Ｉｌｌ：５２９４−５２９９）で成体マウスの器官および 発生分化しつつある胎児から分離された。ポリ（Ａ）　＋ＲＮＡ　（５ｇ＞　と ＲＮＡの総量（２０ｇ）は、ホルムアルデヒドを含有する０、８％アガロースゲ ル中を電気泳動し、標準条件を用いてハイボンド−Ｎ　（Ａ＊ｅｒｓｈａ■）フ ィルタに吸収転移された。転移の後、フィルタを４分間紫外線照射に曝露し、サ ンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）らによる緊縮条件（“分子クローニング−実 験の手引’　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｐｒｅｓｓ、　＋９８９）によってハイブリッド形成し、洗浄した。切片の ｉｎ　５ｉｔｅハイブリデイゼーシヨンは、ウィルキンソンｆＷｉ　ｌｋｉｎｇ ｏｎ　ｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｓ＋ｅｎｔ　９９：４９３−５００（＋９１１？） による、以下の修正に従ってなされた・１）パラフィンワックスに包理するに先 立ち、トルエンの代りにキシレンを用い、２）５〜６ｍｍの切片を切り分け、２ ％の３−トリエトキシシリルプロビルアミン（ＴＥＳＰＡ）（Ｓｉｇｍａ）で前 処理を行なったスライドガラス表面にジエチルとロヵーボネート処理した（ＤＥ ＰＣ）水の層を設けた上に置き、３）プローブのアルカリ加水分解を省略し、４ ）ハイブリディゼーション混合物は、６０％の脱イオン化ホルムアルデヒドを含 有し、５）５０ｍＭのＤＤＴおよび１ｘＳＳＣを含有する溶液中、６５℃にて８ ０分間、高軍縮性の洗浄を行ない、６）切片をＮＴＢ−２感光乳化剤（Ｋｏｄａ ｋ）で覆い、４℃にて保存した。１４日はどの露光時間の後、スライドはコダッ ク（［ｏｄａｋ）Ｄ−１９現像液中て２．５分間現像され、ユニフィックス（Ｉ ｌｎｉｆｉｘ）　（Ｋ　ｏ　’ｄａｋ）を用いて５分間定着させた。切片は、０ ．０２％のトルイジンブルー水溶液を用いて着色された。センスストランドおよ びＲＮＡ５ｅ　Ａ処理した切片を用いた制御ハイブリダイゼーションは、上記バ ックグラウンドレベルに特異な信号を示さなかった。免疫ペルオキシダーゼの着 色は、人のモノクローナルなアンチファクターＶｌｌｌ抗体および標準技術を用 いて行なった。

すべてのＲＮＡおよびポリアデニル化ＲＮＡは、マウスの組織と同様に、種々の 人の胎児および成人の組織より分離され、ノザンプロット法にかけ、ｔｉｅｃＤ ＮＡプローブを用いてハイブリッド化される１図１１Ａは、検査を行なったすべ てのヒトの胎児組織が、４．４ｋｂのｔｉｅｍＲＮＡを含有することを示してい る。ヒトの成人組織より得たポリアデニル化ＲＮＡでは、高度に血管化した肺、 胎盤および心臓においてｔｉｅ信号が最も顕著であったが、他の組織においても 、特にオートラジオグラムの露光が長い場合に、より弱い信号が確認された（図 １１Ｂ）、ｔｉｅの発現は非常に早い時期に始る；懐胎期間９日から１ｅ日で、 ｔｉｅは弱く発現し、そのＭｌ　ｔ　ｉ　ｅ転写の数が増加する（最高は懐胎期 間１４日目）、新生マウスおよび出産直後のマウスには、ｔｉｅ　ｍＲＮＡが比 較的少量である。１２日ｐ、ｃ、のマウス胎児のＩＩＩ！Ｉ切片は、ＩＣＩＤプ ラスミドの挿入断片から転写されたアンチセンスおよびセンスＲＮＡを用いてハ イブリッド形成された６図１２Ａは、アンチセンスＲＮＡを用いて詳細に調べた 典型的な切片の明領域Ｗ像を示している０図１２Ａは、オートラジオグラフの粒 度が、主要な血管の内壁を装飾している様子を図解している。しかし信号は、同 一の切片の暗望域マイクロスコープにおいて、よりよく視覚化された（図１２Ｂ ）、この結果は、ｔｉｅｍＲＮＡが全ての管において遍在的に発現することを証 明している。

ｔｈｅの発現を引起こす細胞は、ファクターＶＩＩＩ抗体染色が内皮細胞に特異 なものであることから、内皮細胞である。センスプローブは、図１２Ｃに見られ るように上記パックグラウンドレベルに信号を示さなかった。８日ｐ、Ｑ、マウ スの胎盤（図１３Ａ）におけるｔｉｅハイブリッド化信呼信号隣接切片のファク ターＶ！！■の染色模様と非常に類似しており、実際に腫ね写し可能である（図 １３Ｂ）。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人　バータネン、ジュハ アームストロング、エリナ アリタロ、カリ （ｉｉ）発明の名称：　ｔｉｅ、新規内皮細胞受容体チロシンキナーゼ（ｉｉｉ ）配列の数・　４ （ｉｖ）通信用住所。

（Ａｌ受信人、　ヘルシンキュニパーシティ　ホルディングリミテッドｆＢ１通 り　テオルリスウスカツ　２３（Ｃ）市：　００５１０　ヘルシンキ ｆＥ）Ｉ！ｉ：　フィンランド国 （Ｆ）郵便番号・　００５１０ （ｖｌコンピュータ読み取り可能形態・（Ａ）媒体タイプ　フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）　ｔへル−ティンク゛シ ステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄｌ　ソ　）　ト　ウェア　、　ハ” テントイン　（ｐａｔｅｎｔｒｎ）　リリース１１．０．　バージ゛ヨン　ｆｌ 、２５（ｖｉ　ｌ現出願データ。

（＾）出願番号： （Ｂ）出覇日： （Ｃ）分類・ （ｖｉｉｉ）弁護士／代理人情報。

＋Ａ）氏名：　オイ　コルスターアブ ＣＢ１通り・　ストラ　ロベルツガタン　２３（Ｃ１市　００１２０　ヘルシン キ ｆＥ１国　フィンランド国 （Ｆ）郵便番号・　００１２０ （２）配列番号　１に関する情報 （ｉｌ配列の特性 （＾）長さ゛　１１３８アミノ酸 （Ｂ）型゛　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、　直線状 （ｉｔ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｖｉ　）起源： （Ａｌ生物名・　ホモサピエンス （ｘｉ）配列：　配列番号＝１ Ｈａｔ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　 Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＸＬｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａｌ　Ｓ　１０　１ｓ Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　ＡｒｇＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖ ａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＡｌａＧｌｙ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＡｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｍ　Ｇｉｎ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　５ｅｒ　Ｃｙｓ　 Ｖａｔ　にｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃ１ｙ　八１＆　八ｒ９八ｒｇ　Ｔｈｒ　Ａ ｒｇ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＨＬｓ　Ａｓｎ　５ａｒ　Ｐｒｏ　（ ｌｙ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌ＊ｕＰｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　八Ｇｎ　Ｌ、ｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ｌａ■ ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　１１ｅ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　５ｅｒ八ｉｎ　にｌｙ　ｓ ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　ＨＬＩＩ　 Ｇｌｕ　ＡＬａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｃ１■ 八ｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　にｌｙ　Ｘ１ｅＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ（ｉ）配列の特性： （Ａｌ長さ：　１０９４アミノ酸 （Ｂｌ型・　アミノ酸 （Ｃ）　ＩＩのＩ：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー−直線状 （ｉｉ）配列の種類・　ｃＤＮＡ （ｖｉ　）起源： （Ａ）生物名：　ホモサピエンス （ｘｉ　）配列：　配列番号＝２： Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｔｒｐ　）Ｉｔｓ　Ｇｌｕ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌ■ １６５　１フロ　ニア５ Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｔｓ　Ｇｉｎ　５ａ■ Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　八Ｌ ａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ｌｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＶａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｌ＊ｕＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓ ａｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ：　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　＾１■ Ｐｈ＠　ｋＬａ　Ａｆｑ　Ｇｌｕ　ＨＬｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　八Ｌａ　Ｓｅｒ　 Ｔｈｒ　Ｌｌｌｌｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌ■■ Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　八ｌａ　Ａｓｎ　 にｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇ１．ｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｒ　に１■ Ｌ、ｙ＊　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｌａ 　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　ＡＬａ　５ＩＩｒ　Ｌｙｇ　Ｚｌ＠　Ａｌａ　Ａｓｐ 　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　５＊ｒ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃ１■ ９４５　９５０　９５Ｓ　９６０ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　１４ｅ■ 八ｌａ　ｌｉｅ　Ｇｌｊ＋　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ 　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＶａP Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　ｌ ｉｅ　Ｖａｌ５ａｒ　Ｌｓ＋ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｃｙ ｓ　Ｃ１ｙ　Ｈｅセ　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｙｒ　にＬ ｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｎｌｏｌｏ　１０１５　１０２０ ＾Ｌａ　Ａ＠ｐ　Ａｒｇ　Ｍ＠ｔ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　＄ｒｏ　入ｒ９　＾−ｎ　 Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｍ＠ｔ　八 ｒｇ　Ｇｉｎ　ＣＹＳ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ１０４５　１０ｓｏ　１０５５ ＾１ａ　Ｇｉｎ　Ｉｎ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｍ ｅｔ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙ＠＾１ａＴｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ 　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ａｌａ　にｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓρ１０フＳ　１０Ｂ０　１０８５ （２）配列番号：３に関する情報： （ｉ＞配列の特性・ （＾）長さ：　３８４５塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−末鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　直線状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｖｉ　）起源： （Ａ）生物名、　ホモサピエンス （ｘｉ　ｌ配列：　配列番号：３： ＧＣ；ＴＣＡＴＴＴＴＧ　ＧＧＣＣＴＧＡＴＴＯ（：ＣＧＡＣＴＣＣＡＧ　Ｔｃ ＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧｋｋＴＧＧＴＧＧ　ＣＡｃＴＴＧＴＧ`Ｃ１０２０ Ｃ１：ＣＴＴＣＡＧＴＧ　ＧＴ？ＣＴＣＴＣＴＧ　ＣＣＣＣＴＣＴＧＧＧ　ＴＧ Ｃ，ＣＡＴＧＧＡＧ　ＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡ　ＧＡＡＧＴＣ`ＧＡＣ１０１３０ ＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡ　ＣＣＴにＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴ ＴＴＴＡＡ　ＣＣＣＴＧＣ，ＴＣ，ＴＣＣＡＴＣＣＧＣＡに`　２４００ ＣＡＡＡＣＣＣＣＣＡ　ＣτＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＡＡＧ　ＣＩＪＧ ＣＡＣＴＣＡ　ＣＡＣＣＡＣ丁入ＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＴ@３７ＢＯ ＣｋＧＣＴＡｃＴＣＣ（ＪＣＴＣＣＣＣ７ＧＣＣＴＧ丁ＣＡＴＴＣＡ　ＧｋＡ） ＡｐＡＡＴ＾　入ＡＴＣＴｒＣＴλ＾　ＴｋＡＧＣＴＣＣｋ■@３８４０ ＴＧτＣＧ八ＴＣＴＧ　ＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧ　ＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣｋｋＣ ，Ａ入ＧＣＴＴ　ｃＴｃＣＣＣＣＴＧＧ　丁ＣＡＴ’Ｔ丁ＴfＧＣ，８４０ ＣＣＴＧｋｋＧＡＧＧ　ＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡ　ＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣ； ＧＣＧＣ；ＴＧＧ　ＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴ　ＧＴＣ？ＣＣＣ`ＣＣ２２２０ 輌　≧嘱次π寂　−−Ｊ慎１宵ｉドロπ九すＩ中＝なキコーα１幀ηＶπ…二ニ ニニニ−ニ一一−２」−二一、ＡｌＮＶＧＡＡｌ１６Ｌ”Ｌ　Ｌ　＋１　５ＳＩ 　ＣＯＥ　＊　＊”ｔ　−ｊ’−Ｊ　Ｚ　’ｌ　ｅ　ＯＡ　Ｉ　”’−’Ａ　Ｌ ’−Ｌ’ｔ　ＣＬ’ｔ　ｌ　’Ｃｆｆ　Ｕ　Ｗ　Ｏ−Ｌ’■V　：：１ Ｂ。

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Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼのタンパク質配列をエンコードする配列又は 機能的誘導体或いはそれらの断片を備えることを特徴とする単離されたヌクレオ チド配列。
2. ２．配列番号：１中のヌクレオチド番号約１からヌクレオチド番号約３８４５ま でに実質的に示されたようなヌクレオチド配列を有するｔｉｅ前駆体をエンコー ドすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離されたヌクレオチド配列。
3. ３．配列番号：１中のヌクレオチド番号約３７からヌクレオチド番号約３８４５ までに実質的に示されたような配列をコードするヌクレオチドを有するｔｉｅ前 駆体をエンコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離されたヌク レオチド配列。
4. ４．配列番号：１中のヌクレオチド番号約１００からヌクレオチド番号約３８４ ５までに実質的に示されたような配列をコードするヌクレオチドを有する成熟し たｔｉｅをエンコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離された ヌクレオチド配列。
5. ５．請求の範囲第１項から第４項のうちいずれか一項によるヌクレオチド配列か らなる群より選ばれるアクレオチド配列を有することを特徴とする組換え体ＤＮ Ａ分子。
6. ６．上記ヌクレオチド配列が、適当な発現制御配列に操作可能的に連結されてい ることを特徴とする請求の範囲第５項記載の組換え体ＤＮＡ分子。
7. ７．上記発現制御配列は、上記組換え体ＤＮＡ分子が上記ヌクレオチド配列の発 現を可能ならしめることを特徴とする請求の範囲第６項記載の組換え体ＤＮＡ分 子。
8. ８．上記発現制御配列は、上記組換え体ＤＮＡ分子が上記ヌクレオチド配列への アンチセンスＲＮＡの発現を可能ならしめることを特徴とする請求の範囲第６項 記載の組換え体ＤＮＡ分子。
9. ９．請求の範囲第５項に記載の組換え体ＤＮＡ分子を用いて形質転換されたこと を特徴とする宿主細胞。
10. １０．上記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求の範曲第９項記載の宿主 細胞。
11. １１．上記細胞が哺乳類の細胞であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載 の宿主細胞。
12. １２．実質的に純粋なｔｉｅタンパク質又は機能的誘導体或いはそれらの断片。
13. １３．ｔｉｅタンパク質が、配列番号：１中でアミノ酸残基番号約１からアミノ 酸残基番号約１１３８まてに実質的に示れたようなアミノ酸配列を有するｔｉｅ 前駆体であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋なｔｉｅ タンパク質。
14. １４．ｔｉｅタンパク質が、配列番号：１中でアミノ酸残基番号約２２からアミ ノ酸残基番号約１１３８までに実質的に示されたようなアミノ酸配列を有する成 熟したｔｉｅであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋な ｔｉｅタンパク質。
15. １５．上記タンパク質がヒトタンパク質てあることを特徴とする請求の範囲第１ ２項記載の実質的に純粋なｔｉｅタンパク質。
16. １６．上記タンパク質が組換え手法で主成されたｔｉｅであることを特徴とする 請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋なｔｉｅタンパク質。
17. １７．上記ｔｉｅが哺乳類の細胞培養中で生成されることを特徴とする請求の範 囲第１６項記載の突質的に純粋なｔｉｅタンパク質。
18. １８．以下の工程を含むことを特徴とする組換え体ｔｉｅタンパク質の生産方法 ： １）上記ｔｉｅタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列を単離すること、 ２）このヌクレオチド配列を、適当なクローニングベクターに導入することによ って ３）上記兜現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換すること、４）上記宿 主細胞を培養すること、および５）このｔｉｅ生成物を単離すること。
19. １９．上記ｔｉｅがヒトのｔｉｅであることを特徴とする請求の範囲第１８項記 載の組換え体ｔｉｅの生産方法。
20. ２０．上記宿主細胞が哺乳類の細胞であることを特徴とする請求の範囲第１８項 記載の組換え体ｔｉｅの生産方法。
21. ２１．ｔｉｅをエンコードするヌクレオチド配列が、配列番号：１中のヌクレオ チド番号約１からヌクレオチド番号約３８４５まてに実質的に示されたようなヌ クレオチド配列を有することを特徴とする請求の範囲第１８項記載の生産方法。
22. ２２．ｔｉｅをエンコードするアクレオチド配列が、配列番号：１中のヌクレオ チド番号約３７からアクレオチド番号約３８４５までに実質的に示されれたよう な配列をコードするヌクレオチドを有することを特徴とする請求の範囲第１８項 記載の生産方法。
23. ２３．ｔｉｅをエンコードするヌクレオチド配列が、配列番号：１中でヌクレオ チド番号約１００からアクレオチド番号約３８４５までに実質的に示されたよう な配列をコードするヌクレオチドを有することを特徴とする請求の範囲第１８項 記載の生産方法。