ES2263152T3

ES2263152T3 - Anticuerpo monoclonal contra el receptor flt4 tirosina quinasa y su uso en diagnostico y terapia.

Info

Publication number: ES2263152T3
Application number: ES95922533T
Authority: ES
Inventors: Kari c/o Molecular/Cancer Biology Lab. Alitalo; Arja Kaipainen; Jaana Korhonen; Tuija Mustonen; Marja-Terttu Matikainen; Katri Pajusola; Paivi C/O Molecular/Cancer Biology Lab. Karnani
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: DE69534996D1; MX9606218A; CA2192235A1; NZ288235A; NO965231D0; AU2738895A; AU694524B2; FI964862A0; JP2005139199A; NO965231L; PT807124E; WO1995033772A1; DE69534996T2; ATE326484T1; JPH10500858A; EP0807124B1; CA2192235C; JP2009102415A; JP2012193191A; FI964862A

Abstract

ANTICUERPOS ANTI-FLT4,ESPECIALMENTE ANTICUERPO ANTI FLT4 MONOCLONALES, QUE SON UTILES COMO UN MARCADOR ESPECIFICO PARA CELULAS ENDOTELIALES DE VASOS LINFATICOS Y HEV, COMO UNA HERRAMIENTA DE DIAGNOSTICO PARA DETECTAR CAMBIOS EN EL TEJIDO LINFATICO, ESPECIALMENTE EN LOS VASOS LINFATICOS Y HEV EN ESTADOS ENFERMOS, TALES COMO LINFAGIOMA, MODULOS LINFATICOS METASTATICOS Y ENFERMEDAD INFLAMATORIA, INFECCIOSA E INMUNOLOGICA.

Description

Anticuerpo monoclonal contra el receptor FLT4 tirosina quinasa y su uso en diagnóstico y terapia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a receptores tirosina quinasa, sondas de ácido nucleico y anticuerpos que reconocen específicamente dichos receptores, y al uso de dichas sondas y anticuerpos para identificar los vasos linfáticos y vénulas endoteliales altas (VEAs) en tejidos animales y humanos y las células linfáticas endoteliales en cultivo. Más concretamente, la presente invención va dirigida a los anticuerpos específicos para FLT4, un receptor tirosina quinasa, a los métodos para identificar la expresión del FLT4 en los vasos linfáticos y fundamentalmente para diagnosticar y tratar las condiciones patológicas en animales y humanos que involucran cambios en el tejido linfático, tales como enfermedades inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, ganglios linfáticos metastáticos y
linfangiomas.

Antecedentes de la invención

El endotelio vascular que recubre los vasos sanguíneos está implicado en la fisiología del sistema vascular, la vasculogénesis y la angiogénesis embrionarias, la coagulación de la sangre, la cicatrización de las heridas y la reproducción, así como en varias enfermedades. El desarrollo del árbol vascular se produce a través de la angiogénesis y, según algunas teorías, la formación del sistema linfático empieza poco después del desarrollo arterial y venoso mediante el brote de las venas (1, 2).

Después del periodo fetal, las células endoteliales proliferan sólo muy lentamente, salvo durante la angiogénesis asociada con la neovascularización. Los factores de crecimiento que estimulan la angiogénesis ejercen sus efectos a través de receptores tirosina quinasa específicos en la superficie de las células endoteliales.

El producto proteico del ADNc del receptor FLT4 tirosina quinasa, clonado de una línea eritroleucémica de células humanas, está N-glicosilado y contiene siete bucles tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular. El dominio citoplásmico del FLT4 tirosina quinasa es idéntico en aproximadamente el 80% al nivel de los aminoácidos con los correspondientes dominios del FLT1 y del KDR, e idéntico en aproximadamente el 60% con los receptores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el factor estimulante de colonias-1, el factor de células madre y el receptor FLT3 (3).

Aunque la función biológica del FLT4 no se ha aclarado todavía, su patrón de expresión restringida indica que sus funciones pueden implicar el endotelio vascular. Resultados nuestros anteriores revelaron que la expresión del ARNm del FLT4 en células endoteliales en los vasos en desarrollo de varios órganos fetales tal como se describe en Kaipainen et al., J Exp Med 178: 2077-2088, 1993. Una comparación de las señales del ARNm de los receptores FLT4, FLT1 y KDR/FLK-1 mostró un solapamiento aunque con patrones distintos de expresión en el tejido del estudio (4). Estos datos sugieren que los receptores tirosina quinasa codificados por esta familia de genes pueden tener funciones diferentes en la regulación del crecimiento y/o la diferenciación de los vasos sanguíneos.

Una función principal del sistema linfático es proporcionar un retorno para el líquido desde los tejidos y trasportar muchas sustancias extravasculares de nuevo a la sangre. Adicionalmente, durante el proceso de maduración, los linfocitos dejan la sangre, migran a través de los órganos linfoides y otros tejidos, y entran en los vasos linfáticos, y vuelven a la sangre a través del conducto torácico. Vénulas especializadas, denominadas vénulas endoteliales altas (VEAs) les unen a los linfocitos sanguíneos de nuevo con lo que se provoca su extravasación a los tejidos. Por tanto, los vasos linfáticos y especialmente los ganglios linfáticos desempeñan un papel importante en la inmunología y también son sitios de desarrollo de metástasis de diferentes tumores.

Desde principios del siglo veintiuno, han surgido tres diferentes teorías sobre el origen del sistema linfático. Sin embargo, antes de la presente invención, ha sido difícil identificar los vasos linfáticos ya que no existen marcadores específicos para ellos.

Los vasos linfáticos se suelen estudiar con la ayuda de la linfografía. En la linfografía, el medio de contraste de los rayos X se inyecta directamente en un vaso linfático. El medio de contraste se distribuye a lo largo de los vasos eferentes de drenaje del sistema linfático. El medio de contraste se recoge en los ganglios linfáticos, donde permanece hasta medio año, y durante este periodo los análisis por rayos X permiten un seguimiento del tamaño de los ganglios linfáticos y de su estructura. Este diagnóstico es especialmente importante en pacientes de cáncer con metástasis en los ganglios linfáticos y en neoplasias malignas linfáticas, tales como el linfoma.

Resumen de la invención

La presente solicitud se refiere a los péptidos FLT4 y otros constructos y al uso del FLT4 como un marcador específico para las células endoteliales linfáticas.

La invención se refiere a los anticuerpos que reconocen específicamente el FLT4, especialmente a los anticuerpos monoclonales, y a las composiciones que contienen dichos anticuerpos. Además, la presente solicitud describe el uso de estos anticuerpos monoclonales para fines diagnósticos, para la detección y medición de la cantidad de receptores FLT4 en tejidos, especialmente en tejidos linfáticos y en células endoteliales linfáticas.

En una realización preferida, la invención proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente el receptor FLT4. Más concretamente, esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal designado 9D9F9. La línea hibridoma de células que produce el anticuerpo monoclonal 9D9F9 se ha depositado en el Deutsche Sammlong von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) bajo lo provisto en el Tratado de Budapest (número de accesión DSM ACC2210).

Se proporcionan también los anticuerpos monoclonales marcados con un marcador detectable. Tal como se emplea en la presente memoria, el término marcador detectable engloba cualquier marcador detectable conocido para los expertos en la materia. Sin embargo, en una realización preferida de la presente invención, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en los radioisótopos, los fluorocromos, los colorantes, las enzimas y la biotina. Para los fines de esta invención, los radioisótopos apropiados incluyen, pero no se limitan a, ^{125}I y ^{131}I.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden también usarse en un método para la detección de la presencia de los receptores FLT4 en una muestra de células, que comprende los pasos de exponer una muestra de células a un anticuerpo monoclonal de la presente invención y detectar la unión de dicho anticuerpo monoclonal a los receptores FLT4.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de receptores de FLT4 en la muestra de células, que comprende las etapas de:

(a): exponer una muestra de células a un anticuerpo de la presente invención;

(b): detectar la unión de dicho anticuerpo monoclonal a los receptores de FLT4.

La exposición de una mezcla de células a los anticuerpos monoclonales de la invención puede llevarse a cabo en la disolución, como es el caso del análisis activado por fluorescencia para la clasificación de células, o puede ser en muestras de tejido sólidas, tales como material de biopsia, o puede ser con el anticuerpo monoclonal inmovilizado en un soporte sólido, tal como es el caso de la cromatografía en columna o la adherencia directa inmunológica. La mezcla de células para exponerse al anticuerpo monoclonal puede ser cualquier disolución de células sanguíneas o células de tejido. Preferiblemente, la mezcla de células proviene de tejido normal o patológico que contiene o que se sospecha que contiene células linfáticas endoteliales. Después de la exposición de la mezcla de células a los anticuerpos monoclonales, aquellas células con los receptores FLT4 se unirán al anticuerpo monoclonal para formar un complejo de anticuerpo-receptor FLT4, y por lo tanto, los receptores FLT4 pueden detectarse mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Dichos métodos incluyen los métodos inmunohistoquímicos normales en la técnica, tales como la inmunofluorescencia, análisis FACS, ELISA, IRMA (un ensayo inmunoquímico tipo sándwich), la inmunohistoquímica, RIA con marcaje con ^{125}I y autoradiografía.

La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales conjugados a un agente que se puede usar para tomar imágenes. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término que se puede usar para tomar imágenes, incluye, pero no se limita a los radioisótopos. Un radioisótopo preferido es el 99m-tecnecio.

En una realización específica, la invención se refiere a un método para el seguimiento de los vasos linfáticos y sus células endoteliales en las muestras de tejido y en los organismos. La presente invención también proporciona métodos de detección clínicos para describir el estado del tejido linfático, y especialmente los vasos linfáticos (inflamación, infección, traumas, crecimiento, neoplasias, etc.) y métodos para detectar los vasos linfáticos y así la vascularización linfática en un organismo.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para detectar e identificar los cambios linfáticos caracterizados mediante la expresión del FLT4 en relación con los cánceres metastáticos, y condiciones inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, comprendiendo dicho método las etapas de

(a): obtener un tejido y/o líquido corporal que se sospecha de cambios linfáticos, y

(b): exponer la muestra a un anticuerpo monoclonal específico para el FLT4 en condiciones apropiadas para formar un complejo entre el anticuerpo monoclonal y el antígeno, y

(c): detectar la presencia de cualquier complejo que se forma.

Un tejido que se puede detectar con este método es cualquier tejido de tumor sólido precanceroso o canceroso con células linfáticas que contienen el FLT4 o células que expresan el receptor FLT4. En una realización de la presente invención, el anticuerpo monoclonal se marca con un marcador detectable tal como se describe en la presente memoria. Los métodos de la invención son útiles para detectar y diferenciar entre varias formas de cáncer, especialmente las metástasis en los ganglios linfáticos y otros procesos neoplásicos linfáticos, tales como linfomas, así como linfangiomas.

La presente invención también proporciona un método para formar una imagen de los vasos linfáticos, las vénulas endoteliales altas o ganglios linfáticos en los pacientes humanos. Este método comprende la administración de anticuerpos marcados y la detección mediante la imagen en los sitios donde las células que expresan el FLT4 están presentes, en vasos linfáticos o ganglios linfáticos.

La invención se refiere además a un método para estimular o antagonizar la función del FTL4 en la vascularización linfática y en condiciones inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, comprendiendo dicho método la inhibición de la vascularización linfática mediada por el FLT4 con cantidades suficientes de un compuesto que se une al FLT4 para bloquear los sitios del FLT4 en las células endoteliales que participan en dicha reacción, especialmente donde la función del FLT4 se asocia con una enfermedad tal como cánceres metastáticos, linfomas, inflamación (crónica o aguda), infecciones y enfermedades inmunológicas.

Descripción breve de las figuras

Figura 1. La expresión del ARNm del FLT4 en tejidos murinos. A. La hibridación del ARN poliadenilado aislado de los tejidos indicados de ratones adultos. El tamaño de la banda del ARNm del FLT4 se expresa en kilobases. B Análisis de la protección por la ARNasa del ARN aislado de embriones murinos a varias edades de gestación (E8-E18) y de un ratón recién nacido (1 día). La muestra E8+P contiene también placenta. El tamaño de la sonda y el fragmento protegido se dan en nt; se utilizó \beta-actina como control.

Figura 2. La expresión del ARNm del FLT4 en embriones de 7,5, 8,5 y 11,5 días p.c.. Se presentan los fotomicrografías de campo oscuro y de campo claro de los autoradiografías in situ. No se pudo detectar la expresión del ARNm del FLT4 en un embrión de 7,5 días (A). LA expresión de un embrión murino de 8,5 días p.c. se presenta en (B) y (C). Las flechas apuntan a las células positivas para el FLT4 en el endotelio de la vena posterior cardinal (vc), en el alantoides (al) en (B) y en los angioblastos (ab) del mesénquima de la cabeza en (C). En la placenta de 8,5 días p.c., los transcriptos de FLT4 pueden objetarse en las células endoteliales de las lagunas venosas (lv) (D). Los paneles E y F muestran una comparación de las señales de hibridación del FLT4 y del Tie en embriones de 11,5 días p.c. Se muestra la región de la aorta dorsal en desarrollo y el metanefros (mn) (20x). Fíjese que la aorta dorsal es negativa para el FLT4, pero positiva para el ARNm del Tie, mientras que ambas sondas hibridan con el endotelio de la vena subendocárdico (sv). También, la sonda del FLT4 da una señal de la vena ureteral (v), mientras el Tie hibrida generalmente con los capilares ureterales (c, flechas). Ad: aorta dorsal, sn; surco neural. Barra de escala: 30 \mum.

Figura 3. La expresión del ARNm del FLT4 en un embrión de 12,5 días. Se muestra una sección sagital a través del plano axilar. Nótese que el ARNm del FLT4 es prominente en los vasos dilatados de la axila (ax), en un patrón tipo plexo en la región periorbital (po), en el tejido paravertebral (flechas) y en el tejido subcutáneo (sc). c: cerebro, hi: hígado. Barra de escala: 5 \mum.

Figura 4. El FLT4 en embriones de 14 y 16,5 días. Los paneles A y B muestran las imágenes de campos claro y oscuro de una sección mediosagital. Po: periorbital, mi: mandíbula inferior, cu: región del cuello, sc: subcutáneo, mt, mesenterio, ao: aorta, ct: conducto torácico. (C) muestra una sección transversal de un embrión de 16,5 días después de la tinción con hematoxilina-eosina. Ti: timo, tr: traquea, e: esófago, ca: arteria carótida, ba: arteria braquiocefálica, ct: conducto torácico. (D) muestra una magnificación mayor (40x) de la región del conducto torácico; los granos autoradiográficos se pueden distinguir por encima de las células endoteliales. Además, el vaso pequeño (v) en la parte superior de la fotografía es positivo. Barra de escala: 10 \mum (A-C), 1 \mum (D).

Figura 5. Una comparación de la expresión del ARNm del FLT4 y del Tie en células endoteliales en cultivo. Un análisis por el método Northern del ARN poliadenilado de las células microvasculares del prepucio (MV), vena femoral (VE), aórtico (AO) y umbilical (HU) humanos. Como comparación, se muestra la señal de la hibridación del ARNm del receptor Tie tirosina quinasa. Las bandas que resultan de la unión específica de la sonda al ARN ribosomal se indican con asteriscos.

Figura 6. El FLT4 en vasos linfáticos del mesenterio (A, B), del pulmón (C, D), y de la amígdala (E, F) de adultos humanos. Nótese que sólo vasos linfáticos en A y C dan lugar a una señal del FLT4, mientras que las venas, los capilares y las arterias son negativos para el ARNm del FLT4. En la amígdala, se encuentra una señal en los endotelios de algunos VEAs. Barra de escala: 200 \mum.

Figura 7. El ARNm del FLT4 en ganglios linfáticos normales (A, B) y metastáticos (C, D) y en un linfangioma (E, G). Las flechas indican los senos linfáticos y las VEAs, que son positivos para el FLT4. Una comparación del FLT4 y las señales del factor de von Willebrand muestra que ambos están presentes en el endotelio linfático pero sólo la señal del factor de von Willebrand está presente en los endotelios capilar (c) y venoso (v). Barras de escala: 10 \mum (A-D) y 100 \mum (E-G).

Figura 8. La expresión del FLT4 en vasos mesentéricos fetales detectados mediante la tinción con la inmunoperoxidasa. Las secciones se tiñeron con anticuerpos para el FLT4 purificados mediante técnicas de afinidad (A), con suero bloqueado con el antígeno (B) y con suero preinmunológico (C) y con antisuero específico contra el antígeno relacionado con el factor VIII (D). Nótese que la tinción se limita a algunos pero no todos los vasos (v). Barra de escala: 0,05 mm.

Descripción detallada de la invención

En reconocimiento de la importancia de identificar los cambios en tejidos linfáticos, especialmente en los ganglios linfáticos en relación con cánceres metastáticos y enfermedades inmunológicas, los presentes inventores han demostrado que el FLT4 es un marcador específico que detecta el endotelio de vasos linfáticos y por lo tanto es útil como un marcador de los cambios linfáticos en estados patológicos en humanos.

Los presentes inventores han demostrado anteriormente que el patrón de expresión de FLT4 en comparación con el FLT1 y KDR es muy diferente en los tejidos de fetos humanos de 18 semanas (4). Con tal de entender el papel del FLT4 durante el desarrollo, los inventores clonaron los ADNc parciales del FLT4 murino. Utilizando estas sondas en hibridación in situ, la expresión del ARNm del FLT4 durante el desarrollo del ratón se analizó y se encontró que el FLT4 se expresa durante la vasculogénesis y angiogénesis del sistema linfático. La relevancia de estos hallazgos también se confirmó en tejidos humanos normales y patológicos, ya que el FLT4 se encontró en las células endoteliales linfáticos de tejidos de humanos adultos tanto en condiciones normales como patológicas, así como en algunas vénulas endoteliales altas (VEAs).

La clonación de fragmentos del ADNc del FLT murino mostró que la secuencia de aminoácidos deducida es casi idéntica a la secuencia human correspondiente (identidad de aminoácidos de aproximadamente el 96% en los dos segmentos estudiados). Más indicios de la identidad del ADNc del FLT4 murino se obtuvo de la hibridación Northern donde las sondas de ambas especies proporcionaron la señal típica del ARNm de tejidos de ratón de 5,8 kb. El análisis del ARN aislado de varios tejidos de ratones adultos mostró una expresión del FLT4 en el hígado, pulmón, corazón, bazo, y riñón, con ninguna o poca hibridación en el cerebro y los testes. Este patrón es similar al patrón descrito anteriormente por Galland et al (5). Los resultados de la protección por la ARNasa sugieren que se necesita el gen del FLT4 durante el desarrollo del ratón, empezando desde los embriones de 8,5 días p.c., y los niveles de expresión relativos aparecieron bastante estables.

Para la hibridación in situ se seleccionaron dos fragmentos del ADNc del FLT4, que codificaron secuencias del dominio extracelular. Esto permitió hacer una distinción clara entre los patrones de la hibridación de los receptores FLK-1 y FLT-1, que sólo muestran un grado bajo de identidad de secuencia en la región extracelular (6, 7, 8, 9). El FLT4, al igual que los genes del FLK-1, FLT-1, Tie y receptor Tek endotelial tirosina quinasa, no se expresó en los embriones de 7,5 días p.c.. En un embrión de 8,5 días p.c., las señales más fuertes se localizan en el alantoides, los angioblastos del mesénquima de la cabeza y la vena cardinal. En cambio, la aorta dorsal, el endocardio del corazón y los angioblastos del saco vitelino fueron negativos, a cambio del Tie, Tek, FLK1 y FLT1, Tie y Tek (10, 8). La restricción de la expresión del FLT4 al sistema venoso estaba aún más clara en muestras de los embriones de ratones de 11,5 días, en los cuales el ARNm del Tie se expresó también en las arterias. En los embriones de 12,5 días p.c., la señal del FLT4 apareció en los endotelios venoso y putativamente linfático, pero a diferencia del receptor Tie tirosina quinasa, los endotelios arteriales fueron negativos. Durante las etapas más tardías del desarrollo, el ARNm del FLT4 ha ido restringiéndose a los plexos vasculares que carecieron de células sanguíneas, que representan los vasos linfáticos en desarrollo. Sólo el endotelio linfático y algunas vénulas endoteliales altas expresaron el ARNm del FLT4 en el tejido de un humano adulto. La expresión aumentada ocurrió en los senos linfáticos y las vénulas endoteliales altas y en los ganglios linfáticos metastáticos y en el linfangioma.

Debido a las dificultades para interpretar los datos de los embriones de ratón, se estudiaron endotelios humanos, ya que el sistema linfático está mucho mejor definido en humanos. Además, las células establecidas de varios endotelios pudieron estudiarse en un cultivo de células con el fin de averiguar si la especificidad de la expresión del FLT4 persiste en condiciones in vitro. Se sabe que las líneas de células endoteliales pierden características de diferenciación al cultivarse in vitro. Por lo tanto, cabría esperar que fueron negativos para el FLT4. Las células endoteliales aórticas también carecían del mARN del FLT4. Sin embargo, se obtuvieron señales de las células endoteliales humanas cultivadas de la microvasculatura y de las venas femoral y umbilical. Por ende, al menos algo de la especificidad de la expresión de FLT4 se mantuvo en el cultivo de las células.

El análisis de la hibridación in situ de los tejidos adultos humanos confirmó la restricción del FLT4 al sistema linfático observado en los embriones de ratón en desarrollo. La expresión del FLT4 se observó en los endoteliales linfáticos y en los senos de los ganglios linfáticos humanos. Es interesante que algunas de las VEAs que tienen un endotelio cuboide y que se ha comprobado que están implicadas en el transporte de leucocitos a los ganglios linfáticos, también fueron positivas para el FLT4. Además, un análisis en paralelo de la hibridación mostró que los niveles del ARNm del FLT4 se potenciaron en estas estructuras metastáticas en comparación con los ganglios linfáticos normales. El FLT4 también fue muy prominente en los linfangiomas, que son tumores benignos compuestos por estroma de tejido conectivo y canales linfáticos en crecimiento con un recubrimiento endotelial. El ARNm del FLT4 se limitó al endotelio linfático de estos tumores y no se observó en sus arterias, venas y capilares. En el pulmón humano, pudimos identificar las estructuras linfáticas, que fueron los únicos vasos positivos para el FLT4 en este
tejido.

Los resultados presentados sugieren que el FLT4 es un marcador novedoso de los vasos linfáticos y algunas vénulas endoteliales altas en los tejidos humanos de adultos. También apoyan la teoría sobre el origen venoso de los vasos linfáticos. El FLT4, como un receptor del factor de crecimiento, puede estar implicado en la diferenciación y el funcionamiento de estos vasos.

Estos resultados, en combinación con los compuestos de unión del FLT4 según la presente invención, permiten un marcaje selectivo del endotelio linfático, especialmente mediante el uso de anticuerpos de la presente invención acoplados a sustancias radioactivas o con alta densidad de electrones u otras sustancias indicadoras que pueden visualizarse. Puede ser posible inyectar en el sistema linfático sustancias que contienen el receptor del FLT4 según la invención para la detección de las vénulas endoteliales altas, especialmente las VEAs activadas, que expresan niveles potenciados del receptor del FLT4. Que conozcamos, no se disponen de tales marcadores específicos para el endotelio linfático en la actualidad.

Los siguientes ejemplos se presentan solamente para ilustrar la presente invención y no limitan el alcance de la misma de ninguna forma.

Ejemplos Ejemplo 1 La clonación de sondas del ADNc del FLT4 de ratón

Se ensayaron aproximadamente 10^{6} placas de un biblioteca genómica de iFIX®II de ratones 129SV (Stratagene) con el fragmento del ADNc del receptor del FLT4 humano que correspondía al dominio extracelular (3). Un fragmento Bam HI de 2,5 kb se subclonó de una placa positiva y se secuenció desde ambos extremos. De este subclón, se empleó la reacción de cadena de polimerasa para amplificar y clonar un fragmento de exón que correspondía a los nucleótidos 1745-2049 de la secuencia del ADNc del FLT4 del ratón en un vector pBluescript KSII+/- (Stratagene) (9).

Un segundo fragmento que correspondía a los nucleótidos 1-192 se clonó de forma idéntica.

Ejemplo 2 Análisis del ARNm del FLT4 en tejidos murinos

El ARN total se aisló de embriones en desarrollo (8-18 días p.c. y en ratones de un día) según Chomczynski et al. (11). La muestra de los embriones de 8 días también incluyó la placenta.

Para el análisis de la protección por la ARNasa, la sonda del ARN se generó del plásmido linear del FLT4 obtenido según el ejemplo 1 con [^{32}P]-UTP y polimerasa T7 para la orientación antisentido. La sonda de \beta-actina utilizada corresponde a los nucleótidos 1188-1279 de la secuencia publicada de \beta-actina murina (12). Después de la purificación en un gel con 6% de poliacrilamida/7M urea, los transcritos marcados se hibridaron a 30 \mug del ARN total durante la noche a 52ºC. Se digirió el ARN no hibridado con la ARNasa A (10 U/ml) y T1 (1 \mug/ml) a 37ºC, pH 7,5 durante 1 hora. Las ARNasas se desactivaron mediante la digestión con proteinasa K a 37ºC durante 15 minutos y las muestras se analizaron en un gel de 6% poliacrilamida/7M urea.

El patrón de expresión del FLT4 analizado en este experimento mostró que las señales del ARNm muy débiles se obtuvieron del pulmón, hígado, corazón, riñón, músculo esquelético y del bazo, muestras de las que no se detectó señal específica en los testes y el cerebro (figura 1A). El análisis de las series del ARN recogidas durante las diferentes fases del desarrollo del ratón en el ensayo de la protección del ARN mostró que el ARNm del FLT4 se expresó a lo largo de la embriogénesis desde el día 8 p.c. hasta ratones recién nacidos sin que hubiera grandes variaciones en la intensidad de la señal (figura 1B).

Ejemplo 3 Hibridación in situ del FLT4 en embriones de ratón

Para asignar mejor los transcritos del FLT4 a células y tejidos, se hibridaron secciones de embriones de ratón de 7,5 y 8,5 días p.c. con moléculas del ARN del FLT4. Los embriones se derivaron del cruce entre ratones CBA y ratones NMRI. Los ratones preñados se sacrificaron mediante una dislocación cervical y los embriones se congelaron inmediatamente o se transfirieron mediante un tampón de fosfato a paraformaldehido al 4%. Los embriones y los órganos aisla-
dos se fijaron durante 18 horas a 4ºC, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 6 \mum.

Las sondas del ARN (antisentido y sentido) de los nucleótidos 192 y 349 (véase el ejemplo 1) se generaron de plásmidos lineales con [^{35}S]-UTP. La hibridación in situ de las secciones se llevó a cabo según lo descrito por Wilkinson et al (13, 14), con las siguientes modificaciones: 1) en vez del tolueno, se utilizó xileno antes de incluir en la cera de parafina, 2) se cortaron secciones de 6 \mum, se colocaron en una capa de agua tratada con dietil pirocarbonato en la superficie de unos portaobjetos de vidrio pre-tratados con 3-trietoxisililpropilamina al 2%, 3) se omitió la hidrólisis de las sondas, y 4) se realizó el lavado de alto astringencia durante 80 minutos a 65ºC en una solución que contenía 30 mM de DTT y 1 x SSC. Las secciones se cubrieron con una emulsión de NTB-2 (Kodak) y se almacenaron a 4ºC. Los portaobjetos se expusieron durante 14 días, se desarrollaron y se tiñeron con hematoxilina. Las hibridaciones de control con la cadena sentido y las secciones tratadas con la ARNasa A no exhibieron una señal específica por encima del fondo.

Tal como se muestra en las figuras 2A y B, el ARNm del FLT4 no se expresó en los embriones de ratones de 7,5 días, pero señales claras se detectaron en la vena cardinal posterior (vc) en el día 8,5 del desarrollo. A cambio, el corazón en desarrollo y la aorta dorsal (ad) fueron negativos para el FLT4 (datos no presentados). En los tejidos extraembrionicos, el FLT4 se expresó de forma prominente en el alantoides ("al" en el cuadro B), mientras que los islotes sanguíneos del saco vitelino en desarrollo fueron negativos (datos no presentados). Por otro lado, los angioblastos (ab) del mesénquima de la cabeza fueron altamente positivos para el FLT4 (C). En la placenta en desarrollo, la señal del FLT4 se observó por primera vez en las venas sinusoidales periféricas (datos no presentados). En la placenta de 9,5 días p.c., el endotelio de las lagunas venosas (lv en D) y las células gigantes parcialmente fusionadas a la membrana de Reichert (datos no presentados) expresaron el ARNm del FLT4.

Por tanto, aunque la expresión del FLT4 fue muy prominente en los precursores más tempranos de las células endoteliales, los angioblastos, dicha expresión parece limitarse a ciertos vasos de los embriones de 8,5 días p.c. Se sabe que el receptor Tie se expresa en todas las células endoteliales de los embriones de ratón en desarrollo y así proporciona un marcador para estas células. Notablemente, a cambio de la sonda del Tie, la sonda del FLT4 se hibridó de forma muy débil o casi nada con los endotelios arteriales de los embriones del día 11,5 p.c., por ejemplo, con el endotelio de la aorta dorsal en desarrollo (ad en la figura 2 E, F) o las arterias carótidas (datos no presentados). En vez de esto, la señal del FLT4 fue mucho más prominente en las venas en desarrollo. Por ejemplo, la señal del FLT4 se detectó en venas alrededor de los metanefros en desarrollo (v, sv en E), mientras que la sonda del Tie reconoció primariamente los capilares (c) dentro del metanefros (F).

Tal como se puede apreciar en la figura 3, el ARNm del FLT4 se distribuye en varias regiones de un embrión de ratón de 12,5 días, estando especialmente prominente en el vaso dilatado de la región axilar (ax). Un vaso de FLT4 positivo con una estructura similar se observó en la sección mediosagital en la zona yugular (datos no presentados). Un patrón tipo plexo de los vasos que expresan el FLT4 apareció en la región periorbital (po) y los vertebres en desarrollo (vb). Además, se pudo ver justo por debajo de la piel en desarrollo, una red vascular positiva para el FLT4 (sc). Señales más débiles de los capilares se obtuvieron de varias regiones, entre ellas, el cerebro en desarrollo (c) El ARNm del FLT4 pudo detectarse también en los vasos pequeños de la región del cuello, del hocico en desarrollo y en la base de la lengua en desarrollo así como en la región de la cola (datos no presentados). Es más, el hígado (hi) fue altamente positivo para el ARNm del FLT4 con un patrón de punteado.

Durante el desarrollo adicional, parecía que el ARN del FLT4 se restringía más a ciertos vasos del embrión. Un embrión de 14,5 días ilustra bien este patrón restringido de expresión (figura 4 A, B). En la sección mediosagital de la figura 4, se aprecia la señal más prominente del FLT4 a lo largo de la columna vertebral en desarrollo en su parte anterior. La señal parecía originarse de las células endoteliales en el conducto torácico (ct), que es el vaso linfático más grande que se forma en este momento del desarrollo. En cambio, la aorta dorsal (ad) y la vena cava inferior (vc) fueron negativas. Los vasos dilatados en la región mesentérica también fueron altamente positivos para el FLT4. Además, tal como ocurre en los embriones de 12,5 días p.c., las redes de vasos cerca de las fronteras anatómicas en la mandíbula (ma) periorbital (po) así como en la región del cuello (cu) contenían endotelios positivos para el FLT4. Estructuras similares estuvieron presentes en el espacio pericárdico y en todo el tejido subcutáneo (sc). Notablemente, y a cambio de los vasos negativos para el FLT4, todos los vasos positivos para el FLT4 carecían de células sanguíneas en su lumen. Estos patrones de expresión sugieren que el FLT4 se limita a los vasos linfáticos del endotelio en este momento del desarrollo.
Un sitio adicional donde se observó la expresión del FLT4 fue en las sinusoides de la médula ósea en desarrollo (mo).

Las fotografías de una sección transversal del tórax superior de un embrión de 16,5 días p.c. hibridado con una sonda del FLT4 se presentan en los cuadros C y D de la figura 4. La sección que se presenta en C se ha teñido con hematoxilina-eosina para visualizar los diferentes tipos de los vasos en esta zona. Estos incluyen las arterias carótida y braquicefálica (ac, ab), la vena cava (vc) y el conducto torácico, que es de un tamaño más pequeño y carece del tejido muscular y conectivo circundante (flecha). Una magnificación de la región del conducto torácico se muestra en el cuadro D, donde se pueden apreciar los granos del FLT4 autoradiográficos. Las células endoteliales del conducto torácico así como un vaso pequeño (v) próximo hibridan con la sonda del FLT4.

Ejemplo 4 Análisis del ARNm del FLT4 en células endoteliales en cultivo

Los resultados de la hibridación in situ descritos en el ejemplo 3 mostraron que el FLT4 se expresa en las células endoteliales venosas y más tarde en los vasos linfáticos y en algunas células endoteliales venosas pero no en los endotelios arteriales. Con tal de averiguar si esta regulación se mantuviera in vitro, estudiamos células endoteliales en cultivo mediante un análisis del Northern y un análisis de la hibridación.

Las células endoteliales humanas de la aorta, vena femoral, vena umbilical y de los microvasos del prepucio se aislaron, se cultivaron y se caracterizaron tal como ha descrito anteriormente Van Hinsberg (15, 16). A continuación, se usaron a una densidad confluyente después de cinco a ocho pasos (relación de división 1:3) para el aislamiento del ARN poliadenilado.

Las líneas de células endoteliales EA-hy926, BCE y LEII no expresaron el FLT4 (datos no presentados). Sin embargo, células microvasculares, venosas y umbilicales humanas cultivadas dieron positivas para los ARNs específicos de 5,8 y 4,5 kb para el FLT4, mientras que las células endoteliales aórticas fueron negativas (figura 5). A cambio, otro gen del receptor endotelial tirosina quinasa, Tie, se expresó como un ARNm de 4,4 kb en todos los tipos de célula endotelial estudiados.

Ejemplo 5 El ARNm del FLT4 en tejidos adultos humanos

Los resultados obtenidos en el ejemplo 3 indicaron que el ARNm del FLT4 se limita en mayor medida al endotelio de los vasos linfáticos durante el desarrollo. En vista del significado potencial de este hallazgo en humanos, también estudiamos el FLT4 en tejidos adultos humanos con la sonda del FLT humano. La sonda del FLT humano utilizada fue un fragmento de EcoRI-Sph1 que correspondía a los pares de bases 1-595 del ADNc (3). La sonda del factor de von Willebrand fue un fragmento de EcoRI-HindIII que correspondía a los pares de bases 1-2334 (17).

De forma rutinaria, fijamos material para enviar a un diagnóstico histopatológico. Se obtuvo tejido de pulmón normal de una resección del lóbulo inferior del pulmón izquierdo afectado por un cáncer epidermoide. El mesenterio y los ganglios linfáticos mesentéricos se obtuvieron de un paciente con un adenocarcinoma del colon. Un ganglio linfático normal contiguo a la glándula salival se nucleó porque tenía un tamaño anormal. Las amígdalas de dos pacientes y dos apéndices no presentaron cambios diagnósticos. Dos linfangiomas y tres linfangiomas quísticos se estudiaron con resultados similares.

Para los tejidos humanos, que fueron muestras rutinarias fijadas con formalina al 10% para el diagnóstico histopatológico, el protocolo normal in situ proporcionó sólo una señal de fondo, mientras que el tratamiento con microondas en vez de la proteinasa K permitió una hibridación específica (18, 19).

En el mesenterio, el pulmón y los endotelios linfáticos del apéndice (lv) proporcionaron señales del FLT4, mientras que las venas (v), arterias (a) y capilares (c) fueron negativos (figura 6A-D y datos no presentados). Para estudiar si el FLT4 se expresa en las VEAs, se estudiaron las amígdalas. De hecho, en las amígdalas, se detectaron granos autoradiográficos específicos para el FLT4 en algunas VEAs (E, F).

Ejemplo 6 Análisis del ARNm del FLT4 en los ganglios linfáticos normales y metastáticos y en el linfangioma

Una porción de un ganglio linfático mesentérico humano (ver el ejemplo 5) se analizó para detectar la expresión del FLT4. Los resultados se presentan en la figura 7.

El FLT4 se expresa en los senos linfáticos (sl) y los vasos linfáticos aferentes y eferentes (datos no presentados). El mismo patrón se observa en un ganglio linfático que contiene metástasis de adenocardinoma (C, D). Algunas VEAs en ganglios linfáticos tanto normales como metastáticos fueron positivas también. En el cuadro E, la expresión del FLT4 se muestra en un linfangioma quístico (véase la comparación con la sección teñida con hematoxilina-eosina en F). Fue notable que la especificidad del FLT4 hacia los endotelios linfáticos fuera evidente en una comparación con las señales in situ del factor de von Willenbrandt en todos los vasos sanguíneos (F).

Ejemplo 7 Localización del FLT4 en las células fetales endoteliales

Un fragmento del ADNc del FLT4 que codifica los 40 aminoácidos con el extremo carboxi de la forma corta se clonó como un fragmento de EcoRI de 657 bp en el vector de expresión bacteriana pGEX-1IT (Pharmacia) en un marco con la región que codifica la glutatión S transferasa. La proteína de fusión resultante, GST-FLT4, se produjo en E. coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad con una columna de glutatión-sefarosa 4B. La proteína purificada se liofilizó, se disolvió en PBS, se mezcló con un adyuvante de Freund y se utilizó para la inmunización de conejos. Se utilizaron antisueros después de la cuarta inmunización de recuerdo.

Los tejidos de los fetos humanos de 17 y 20 semanas se obtuvieron de abortos legales inducidos por prostaglandinas. El estudio recibió la aprobación del Comité Ético del Hospital Central Universitario de Helsinki. La edad de gestación se estimó midiendo la longitud del pie del feto. Los tejidos se impregnaron en Tissue-Tek (Miles) y se congelaron de inmediato y se almacenaron a -70ºC.

Se practicó una absorción cruzada del antisuero anti-FLT4 en una columna de GST-sefarosa para eliminar los anticuerpos anti-GST y se purificó mediante una cromatografía de afinidad GST-FLT4. Se fijaron varias secciones criostatas de los tejidos con un grosor de 6 \mum con acetona y se trataron con H_{2}O_{2} al 0,3% en metanol durante 30 minutos para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Después del lavado, las secciones se incubaron con suero normal del cerdo al 5%. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos contra el FLT4, se lavaron, y los anticuerpos unidos se detectaron con IgG anti-conejo de cerdo conjugado con peroxidasa seguido de una tinción para la actividad peroxidasa con 3,3-diaminobenzidina al 0,2% (Amersham) como sustrato. Las secciones se contratiñeron en hematoxilina de Meyer.

La tinción con inmunoperoxidasa anti-FLT4 del mesenterio de fetos humanos mostró una proteína FLT4 en el endotelio de varios vasos (figura 4A), mientras las tinciones de control con anticuerpos anti-FLT4 bloqueados con antígenos (B) y sueros preinmunes (C) fueron negativos. Para comparación, la figura 4 muestra los resultados de la tinción con un antisuero contra el antígeno relacionado con el factor VIII, que es específico para las células endoteliales vasculares.

Ejemplo 8 La producción de anticuerpos monoclonales contra el FLT4

Fusión I

Ratones varones Balb/c de cuatro meses se inmunizaron mediante una inyección intraperitoneal de la proteína FLT4 producida mediante técnicas de recombinación (véase el ejemplo 7) en un medio concentrado (150 \mug/ratón), emulsificado con el adyuvante completo de Freund. Inyecciones de recuerdo de 150 \mug se administraron en intervalos de tres a cuatro semanas y una inyección de recuerdo final (10 \mug del FLT4 en PBS administrado por vía intraperitoneal) se administró después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de la dosis final de la inyección de recuerdo, se sacrificaron los ratones y las células linfoides esplénicas murinas se fusionaron con células de plasmacitomas SP 2/0 a una relación de 2:1, respectivamente.

Las células fusionadas se cosecharon en placas de cultivo de 96 pocillos (NUNC) en medio Ex-Cell 320 (SERALAB) que contenía suero fetal bovino al 20% y el suplemento HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; GIBCO, 043-01060H; diluido 50 veces). Las células se cultivaron a +37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a medio de cultivo de células con el suplemento HT (GIBCO; 043-01065H, diluido 50 veces). El medio HT es idéntico al medio HAT, salvo que no contiene la aminopterina.

Después de tres semanas, la producción de anticuerpos específicos se determinó mediante el ensayo inmunofluorométrico específico para los antígenos (IFMA), descrito en el ejemplo 10. Los clones maestros se clonaron mediante diluciones tal como se ha descrito en Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 57: 865-868 (1984). Los clones positivos se expandieron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (NUNC), se clonaron de nuevo, y se re-ensayaron de nuevo siguiendo el mismo método. Los clones positivos se ensayaron mediante la clasificación de células por medio del análisis activado por fluorescencia para clasificación de células (FACS).

Los clones estables secretaron inmunoglobulinas que pertenecen a la clase de IgF1, salvo uno, que produjo Ig que probablemente pertenecía a la clase de IgA. La subclase del anticuerpo monoclonal se determinó mediante un anticuerpo monoclonal de rata para la subclase murina como un conjugado de biotina (SEROTEC) en IFMA.

Los ratones Balb/c se utilizaron para producir anticuerpos monoclonales en el líquido ascítico. Los hibridomas descritos anteriormente se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones después del pre-tratamiento de los animales con pristano (2,6,10,14-tetrametil pentadecano al 98%, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Núm. de Cat. T 2, 280-2). 0,5 ml de pristano (i.v.) se inyectó aproximadamente dos semanas antes de las células hibridoma. La cantidad de células inyectadas fue aproximadamente 7,5 a 9 x 10^{6} por ratón. La ascitis se recogió de 10 a 14 días después de la inyección de los hibridomas.

Fusión II

Los ratones Balb/c (hembras) de dos meses se inmunizaron mediante la inyección intraperitoneal de una proteína FLT4 producida mediante la recombinación (véase el ejemplo 7) (20 \mug/ratón), se emulsificaron con el adyuvante completo de Freund. Inyecciones de recuerdo de 20 \mug se administraron a intervalos de tres a cuatro semanas y una inyección de recuerdo final (10 \mug de FLT4 en PBS administrado i.v.) se administró después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de la dosis final de la inyección de recuerdo, se sacrificaron los ratones y las células linfoides esplénicas murinas se fusionaron con células de plasmacitomas SP 2/0 a una relación de 2:1, respecti-
vamente.

Las células fusionadas se cosecharon en placas de 96 pocillos (FALCON) en medio OptiMEM 1 (con Glutamax 1, 51985-026, GIBCO BRL) que contenía suero fetal bovino al 20% y el suplemento HAT (hipoxantina- aminopterina-timidina; GIBCO BRL 21060-017; diluido 50 veces). Las células se cultivaron a +37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a un medio de cultivo de células suplementado con HT (GIBCO BRL; 41065-012, diluido 50 veces). El medio HT es idéntico al medio HAT, pero no contiene aminopterina.

Después de tres semanas, la producción de anticuerpos específicos se determinó mediante el ensayo inmunofluorométrico específico para los antígenos (IFMA), descrito en el ejemplo 9. Los clones maestros se clonaron mediante diluciones limitadas tal como se describe en Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 57: 865-868 (1984). Los clones positivos se expandieron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (FALCON), se reclinaron, y se re-ensayaron con el mismo método. Los clones positivos se ensayaron mediante la clasificación de células por medio de la florescencia activada (FACS).

Los clones 2E11 y 6B2 secretaron las inmunoglobulinas que pertenecen a la clase IgF_{1}, los clones 2B12 produjeron Ig que pertenece a la subclase IgM. La subclase IgG_{1} de ratón se determinó con el anticuerpo monoclonal de rata contra la subclase murina de cadena larga como conjugado de biotina (SEROTEC) en IFMA y la subclase murina IgM se determinó con el equipo para medir isotopos de anticuerpos monoclonales (formato de tira reactiva) (19663-012, Life Technologies Inc.)

Ejemplo 9 La especificidad de los anticuerpos monoclonales contra el FLT4 Los anticuerpos de fusión I

El dominio extracelular del FLT4 que se describe en el ejemplo 7 se marcó de acuerdo con lo descrito en Mukkala et al. en Anal. Biochem. 176(2): 319-325, 1989, con la siguiente modificación: un exceso molar de 250 veces de isotiocianato DTTA-Eu (N1 quelato, WALLAC, Finlandia) se añadió a la solución del FLT4 (0,5 mg/ml en PBS) y el pH se ajustó a aproximadamente 9 mediante la adición de 0,5 mol/L de tampón de carbonato de sodio, pH 9,8. El marcaje se llevó a cabo durante la noche a +4ºC. Las moléculas de marcaje no unidas se eliminaron utilizando PD-10 (PHARMACIA, Suecia) con tampón de TSA (50 mmol/L, Tris-HCl, pH 7,8 que contenía 0,15 mol/l NaCl) como eluyente.

Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 marcado y se almacenó a +4ºC. El número de iones de europio que se había incorporado por cada molécula de FLT4 fue 1,9, una cifra que se determinó mediante la medición de la fluorescencia a una relación que correspondía a la de estándares de EuCl_{3} conocidos (Hemmilä et al., Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984).

Los anticuerpos producidos en el ejemplo 8 se rastrearon mediante un ensayo inmunofluorométrico tipo sándwich con tiras de micropocillos (NUNC, polysorb) recubierto de Ig anti-murino de conejo (Z 259, DAKOPATTS). Los pocillos previamente recubiertos se lavaron una vez con la solución de lavado DELFIA en el equipo Platewash 1296-024 (WALLAC). El tampón de ensayo DELFIA se utilizó como un tampón de dilución para los sobrenadantes de los cultivos de células y para el suero de los ratones esplenectomizados (a diluciones de entre 1:1000 a 1:100.000) utilizados como control positivo en el ensayo de rastreo preliminar.

Una incubación durante la noche a +4ºC (o como alternativa, durante 2 horas a temperatura ambiente) se comenzó con agitación en un agitador Plateshake (1296-001, WALLAC) durante 5 minutos seguidos de cuatro lavados con la solución de lavado tal como se ha descrito anteriormente.

Se añadió el FLT4 marcado con Europio a una dilución de 1:500 en 100 \mul del tampón del ensayo. Después de 5 minutos en un agitador Plateshake y una hora de incubación a temperatura ambiente, las tiras se lavaron tal como se ha descrito anteriormente.

Se añadió una solución de potenciación (DELFIA) a 200 \mul/pocillo. Las placas se agitaron durante 5 minutos en un agitador Plateshake y se midió la intensidad de la fluorescencia con ARCUS-1230 (WALLAC) durante 10-15 minutos (Lövgren et al., en: Collins W.P. (Ed) Alternative Microassays, John Wiley & Sons Ltd, 1985, pp. 203-216).

Los anticuerpos monoclonales contra el FLT4 resultantes y los resultados correspondientes del FACS se resumen en la tabla 2.

TABLA 2

Clones MAb	LTR%^{(a)}	NEO%^{(b)}	Recuentos DELFIA
1B1	67,3	1	20625
1B1D11	75	1,2	19694
1B1F8	76,1	1,4	18580
4F6	69,9	1,2	23229
4F6B8G12	75	0,3	24374
4F6B8H11	75,9	0,3	28281
4F6B8E12	74,8	0,4	27097
4F6B8G10	75,3	0,4	26063

TABLA 2 (continuación)

Clones MAb	LTR%^{(a)}	NEO%^{(b)}	Recuentos DELFIA
9D9	45,1	0,75	17316
9D9D10	71,7	2,3	18230
9D9F9	73	1,8	11904
9D9G6	74,3	2,9	16743
9D9G7	70,7	1,3	17009
10E4	24,2	1,4	39202
10E4B10E12	32,3	0,3	42490
10E4B10G10	36,5	0,3	54815
10E4B10F12	45,6	0,4	43909
10E4B10G12	45,7	0,5	35576
11G2	30,2	1,6	11304
11G2D12	74,4	1,5	14660
11G2G9	74,2	0,9	10283
11G2H7	74,4	2,1	25382
^{(a)} Resultados del FACS con células transfectadas con LTR
^{(b)} Resultados del FACS con células NEO (control)

Se observó que un clon, designado anti-FLT4 9D9F9, secretó de forma estable el anticuerpo monoclonal que se determinó que pertenecía a la clase inmunoglobulina IgG1 mediante IFMA. El hibridoma 9D9F9 se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células, Departamento de Cultivos de Células Humanas y Animales y de Virus, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Alemania, el 23 de marzo, 1995, y se le proporcionó el número de accesión ACC2210.

Anticuerpos de fusión

El dominio extracelular del FLT4 que se describe en el ejemplo 7 se marcó según lo descrito por Mukkala et al., en Anal. Biochem. 176(2): 319-325, 1989, con la siguiente modificación: se añadió un exceso molar de 250 veces de isotiocianato DTTA-Eu (quelato N1, Wallac, Finlandia) a la disolución de FLT4 (0,5 mg/ml en PBS) y el pH se ajustó a 9 mediante la adición de un tampón de carbonato de sodio a 0,5 mol/L y un pH de 9,8. El marcaje se llevó a cabo durante la noche a +4ºC. El marcado no unido se eliminó utilizando PD-10 (PHARMACIA) con tampón TSA (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7,8 que contenía 0,15 mol/L NaCl) como eluyente.

Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 marcado y se almacenó a +4ºC. El número de iones de europio que se incorporaron por cada molécula de FLT4 fue 1,9 tal como se determinó midiendo la fluorescencia a una relación que correspondía a la de estándares de EuCl_{3} conocidos (Hemmil et al., Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984).

Los anticuerpos producidos en el ejemplo 8 se rastrearon con un IFMA específico para FLT4 utilizando micropocillos (Nunc, Polysorb) recubiertos con Ig anti-ratón de conejo (Z 259 DAKO). Los pocillos precubiertos se lavaron una vez en la disolución de lavado (Wallac) con el equipo DELFIA Platewash.

El tampón de ensayo de DELFIA se utilizó como un tampón de dilución para el cultivo de sobrenadantes de las células (dilución 1:2 en el rastreo preliminar) y para el suero de los ratones esplenectomizados (diluciones 1:1000 y 1:100.000) que se utilizó como control positivo. Como estándar, el anti-FLT49 9D9F9 purificado (subclase murina IgG1) se usó a concentraciones entre 1,0 ng/ml y 250 ng/ml. Las muestras se agitaron primero a temperatura ambiente durante 5 minutos en el equipo Plateshake (Wallac) y a continuación se incubaron durante aproximadamente 18 horas a +4ºC. Los marcos se lavaron primero cuatro veces, luego se añadió el FLT4 marcado en el Eu (1:2000 en 100 \mul de tampón de ensayo) y finalmente se incubaron los marcos durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tal como se ha descrito, se añadió la disolución de potenciación (200 \mul/pocillo, Wallac) y los marcos se agitaron durante 5 minutos en el equipo Plateshake. La intensidad de la fluorescencia se midió con el ARCUS-1230 (Wallac).

Los anticuerpos monoclonales resultantes contra el FLT4 y los resultados correspondientes se resumen en la tabla 3.

Una curva estándar para la cuantificación de los anticuerpos anti-FLT4 se construyó con anti-FLT4 9D9F9 purificado mediante afinidad. El intervalo linear se extendió desde 1,0 ng/ml hasta 250 ng/ml.

El lisado de las células NIH 3T3 co-transfectadas con el constructo pLTRFLT4 que expresa el FLT4 completo en la superficie se sometió a una electroforesis en SDS-PAGE al 6,5%; las proteínas se transfirieron a la membrana nitrato nitrocelulosa (0,45 \mum, SCHLEICHER & SCHUELL) y se llevó a cabo una inmunotransferencia con los sobrenadantes de los cultivos de las células MAb (1:10, 50 mmol/L TRIS - tampón de 40 mmol/L de glicina que contenía metanol al 4% y SDS al 0,04%). La especificidad del MAb se detectó mediante la incubación con Ig anti-ratón de conejo conjugado en HRP (P 161, DAKO, con dilución de 1:1000 en tampón TRIS de 20 mmol/L a pH 7,5 que contenía 150 mmol/L de solución salina, y polvo de leche al 5%) y ECL (quimioluminiscencia potenciada, AMERSHAM).

TABLA 3

Clones MAb	LTR%^{(a)}	NEO^{(b)}	Prod. Aprox. de	WB
			MAb ng/ml/10^{6}
			células
2B12E10	39,5	6,0	440	+

2E11D11	44,6	8,8	110	+
2E11F9	49,5	4,5	100	+
2E11F12	46,0	4,1	180	+
2E11G8	41,2	7,8	160	+

6B2E12	NF	NF	1390	+
6B2F8	NF	NF	470	+
6B2G6	NF	NF	630	+
6B2H5	NF	NF	740	+
6B2H8	NF	NF	1800	+
^{(a)} Resultados del FACS con células LTR transfectadas
^{(b)} Resultados del FACS con células NEO (control)
NF: No funcional en el FACS
^{(c)} \begin{minipage}[t]{158mm} Cuantificación de la producción de MAb basada en anticuerpo anti-FLT 9D9F9 purificado mediante afinidad como estándar.\end{minipage}

Como se deduce de lo anterior, los anticuerpos según la presente invención son útiles en el diagnóstico y la identificación de los vasos linfáticos, las células endoteliales linfáticas, las vénulas endoteliales altas, los linfangiomas, los ganglios linfáticos metastáticos, y otras condiciones patológicas del sistema linfático, la detección y el seguimiento de la extensión de la metástasis, en la estimulación e inhibición de las células endoteliales de los vasos linfáticos y las vénulas altas linfáticas, en la introducción selectiva de moléculas en las células endoteliales y en la toma de imágenes de los vasos linfáticos en sujetos enfermos. Otras utilidades de lo descrito en la presente invención son evidentes para alguien que conoce la técnica.

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Referencias

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3. Pajusola, K., O. Aprelikova, J. Korhonen, A. Kaipainen, L. Pertovaara, R. Alitalo, and K. Alitalo. 1992. FLT4 receptor tyrosine kinase contains seven immunoglobulin-like loops and is expressed in multiple human tissues and cell fines. Cancer Res. 52:5738.

4. Kaipainen, A., J. Korhonen, K. Pajusola, O. Aprelikova, M.G. Persico, B.I. Terman, and K. Alitalo. 1993. The Related FLT4, FLT1 and KDR receptor tyrosine kinases show distinct expression patterns in human fetal endothelial cells. J. Exp. Med. 1782077.

5. Galland, F., A. Karamysheva, M.-J. Pebusque, J.-P. Borg, R. Rottapel, P. Dubreuil, O. Rosnet, and D. Birnbaum. 1993. The FLT4 gene encodes a transmembrane tyrosine kinase relatad to the vascular endothelial growth factor receptor. Oncogene. 8:1233.

6. Millauer, B., S. Wizigmann-Voos, H. Schnürch, R. Martinez, N.-P.H. Moller, W. Risau, and A. Ullrich. 1993. High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell. 72:835.

7. Yamaguchi, T.P., D. Dumont, R.A. Conlon, M.L. Breitman, and J. Rossant. 1993. flk-1, an flt-related tyrosine kinase is an early marker for edotheilal cell precursors. Development. 118:489.

8. Peters, K.G., C. De Vries, atad L. T. Williams. 1993. Vascular endothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tissue repair suggests a role in endothelial differentiation and blood vessel growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8915.

9. Finnerty, H., K. Kelleher, G. Morris E., K. Bean, D. Merberg, R. Kritz, J. Morris C., H. Sookdeo, K.J. Turner, and C.R. Wood 1993. Molecular cloning of murine FLT and FLT4. Oncogene. 8:2293.

10. Korhonen, J., A. Polvi, J. Partanen, and K. Alitalo. 1993. The mouse tia receptor tyrosine kinase gene: expression during embryonic angiogenesis. Oncogene. 8:395.

11. Chomczynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocynate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156.

12. Tokunaga, K., H. Taniguchi, K. Yoda, M. Shimizu, and S. Sakiyama. 1986. Nucleotide sequence of a full-length cDNA for mouse cytoskeletal beta-acting mRNA. Nucleic. Acid. Res. 14:2829.

13. Wilkinson, D.G., J.A. Bailes, J.E. Champion, and A.P. McMahon. 1987. A molecular analysis of mouse development from 8 to 10 days post coitum detects changos only in embryonic giobin expression. Development. 99:493.

14. Wilkinson, D.G., J.A. Bailes, and A.P. McMahon. 1987. Expression of the proto-oncogene int-1 is restricted to specific neural celis in the developing mouse embryo. Cell. 50:79.

15. Van Hinsberg, V.W.M., D. Binnema, M.A. Scheffer, E.D. Sprengers, T. Kooistra, and D.C. Rijken. 1987. Production of plasminogen activators and inhibitors by serially propagated endothelial celis from adult human blood vessels. Arteriosclerosis. 7:389.

16. Van Hinsberg, V.W.M., M.A. Scheffer, and T. Kooistra. 1987. Effect of thrombin on the production of plasminogen activators and PA inhibitor-1 by human foreskin microvascular endothelial cells. Thromb. Haemostas. 57:148.

17. Bonthron, D.T., E.C. Orr, L.M. Mitsock, D. Ginsberg, R.I. Handin, and S.H. Orkin. 1986. Nucleotide sequence of pre-pro-von Willebrand factor cDNA. Nucleic Acids Res. 141:7125.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: Alitalo, Kari

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(B): CALLE: Nyyrikintie 4 A

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(C): CIUDAD: ESPOO

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-02100

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(A): NOMBRE: Kaipainen, Arja

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(B): CALLE: Messeniuksenkatu 7 A 9

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(C): CIUDAD: HELSINKI

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-00250

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(A): NOMBRE: Korhonen, Jaana

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(B): CALLE: Agricolankatu 7 C 68

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(C): CIUDAD: HELSINKI

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-00530

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(A): NOMBRE: Mustonen, Tuija

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(B): CALLE: Pihlajatie 8 A 2

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(C): CIUDAD: HELSINKI

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-00270

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(A): NOMBRE: Pajusola, Katri

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(B): CALLE: Kasteholmantie 4 A 8

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(C): CIUDAD: HELSINKI

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-00900

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(A): NOMBRE: Matikainen, Marja-Terttu

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(B): CALLE: Lankkistentanhua 12

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(C): CIUDAD: MYÄMÄKI

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-23100

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(A): NOMBRE: Karnani, Päivi

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(B): CALLE: Mullintie 10 B 62

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(C): CIUDAD: TURKU

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(D): PAÍS: FINLANDIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: FIN-20300

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR FLT4 DE TIROSINA QUINASA Y SU USO EN EL DIAGNÓSTICO Y LA TERAPIA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv): INFORMACIÓN INFORMÁTICA

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(A): SOPORTE INFORMÁTICO: disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con el PC IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión 1.25 (OEP)

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(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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: NÚMERO DE SOLICITUD: WO TO BE ASIGNADO

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(vi): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/257754

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 9-JUN-1994

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(2) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 1

1

2

3

4

5

6

7

Claims

1. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la preparación de una composición diagnóstica para tomar imágenes de los vasos linfáticos, los ganglios linfáticos o las vénulas endoteliales altas (VEAs).

2. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la preparación de una composición diagnóstica para detectar el tejido linfático, los vasos linfáticos, o las vénulas endoteliales altas (VEAs).

3. El uso de la reivindicación 2, en donde el tejido linfático para la detección es el tejido de un ganglio linfático.

4. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la vascularización linfática mediada por el FLT4 que se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: cánceres metastáticos, linfomas, linfangiomas, la inflamación (crónica o aguda), infecciones, y enfermedades inmunológicas.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-FLT4 producido de una línea de hibridoma de células depositada con el número DSM ACC 2210.

6. Un método para la toma de imágenes in vitro de vasos linfáticos en una muestra de tejido, que comprende los pasos de:

(a) aplicar un anticuerpo anti-FLT4 marcado para permitir su detección a dicha muestra de tejido con sospecha de contener vasos linfáticos; y

(b) detectar dicho anticuerpo anti-FLT4 marcado para permitir su detección que está unido a dicha muestra de tejido.

7. Un método para diagnosticar enfermedades caracterizadas por cambios en los vasos linfáticos y las VEAs, que comprende los pasos de:

(a) exponer una muestra de tejido obtenida de un paciente con sospecha de padecer una enfermedad caracterizada por cambios en las células linfáticas y las VEAs a un anticuerpo anti-FLT4 marcado;

(b) lavar dicha muestra de tejido; y

(c) detectar la presencia de dicho anticuerpo anti-FLT4 marcado para permitir su detección en dicha muestra de tejido.