ES2604309T3 - Anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3, CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinaxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPALPHA xCD3 específico entre especies - Google Patents

Abstract

Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de la cadena de CD3ε (épsilon) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8, y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión que se une un antígeno seleccionado del grupo que consiste en antígeno de células madre prostático (PSCA), antígeno CD19 de linfocitos B (CD19) receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (C-MET), endosialina, el dominio 1 similar a EGF de EpCAM, codificado por el exón 2, proteína alfa de activación de fibroblastos (FAP alfa) y receptor de factor de crecimiento I similar a la insulina (IGF-IR o IGF-1R).

Description

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del cáncer en los últimos años. En el transcurso de estos esfuerzos de investigación, se han identificado varios marcadores endoteliales tumorales. Marcadores endoteliales tumorales (TEM) como endosialina (= TEM1 o CD248) se sobreexpresan durante la angiogénesis tumoral (St. Croix et al., Science 289 (2000), 1197-1202). A pesar del hecho de que sus funciones no se han caracterizado en detalle hasta la fecha, está bien establecido que se expresan fuertemente en células endoteliales vasculares en estudios con tumores y embriones en desarrollo (Carson-Walter et al., Cancer Res. 61: 6649-6655, 2001). Por consiguiente, la endosialina, una proteína transmembrana de tipo I de 165 kDa, se expresa sobre la superficie celular del endotelio de vasos sanguíneos tumorales en una amplia gama de cánceres humanos pero no se detecta en vasos sanguíneos u otros tipos de células en muchos tejidos normales. Es una molécula similar a lectina de tipo C de 757 aminoácidos compuesta por un péptido líder señal, cinco dominios extracelulares globulares (incluyendo un dominio de lectina de tipo C, un dominio con similitud al patrón Sushi/ccp/scr, y tres repeticiones de EGF), seguidor por una región similar a mucina, un segmento transmembrana y una cola citoplasmática corta (Christian et al., J. Biol. Chem. 276: 7408-7414, 2001). La proteína núcleo de endosialina porta oligosacáridos unidos a O, abundantemente sialilados y es sensible a Osialoglicoproteína endopeptidasa, lo que la coloca en el grupo de moléculas similares a sialomucina. Los 360 aminoácidos N-terminales de endosialina muestran homología con trombomodulina, un receptor implicado en la regulación de la coagulación sanguínea, y con el receptor del complemento C1qRp. Esta relación estructural indica una función de la endosialina como receptor endotelial tumoral. Aunque el ARNm de endosialina se expresa de manera ubicua en células endoteliales en tejidos somáticos humanos y murinos normales, la proteína endosialina está en gran medida restringida al cuerpo lúteo y tejidos altamente angiogénicos tales como el tejido granular de tumores o heridas en cicatrización (Opavsky et al., J. Biol. Chem. 276 (2001, 38795-38807; Rettig et al., PNAS 89 (1992), 10832-36). La expresión de proteína endosialina está regulada por incremento en células endoteliales tumorales de carcinomas (de mama, riñón, pulmón, colorrectal, colon, páncreas, mesotelioma), sarcomas y tumores neuroectodérmicos (melanoma, glioma, neuroblastoma) (Rettig et al., loc. cit.). Además, la endosialina se expresa a un bajo nivel en un subconjunto de fibroblastos del estroma tumoral (Brady et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (2004), 1274-83; Opavsky et al., loc. cit.). Debido a su distribución restringida en tejido normal y expresión abundante en células endoteliales tumorales de muchos tipos diferentes de tumores sólidos, se ha discutido la endosialina como una diana para estrategias de tratamiento antiangiogénico basado en anticuerpos del cáncer. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún enfoque terapéutico eficaz que use endosialina como diana endotelial tumoral.

Una molécula que se usa muy frecuentemente y se expresa altamente en la mayoría de las células de adenocarcinoma humano y varias de carcinoma de células escamosas es EpCAM (CD326) (Went et al., Br. J. Cancer 94 (20006), 128-135). Estudios recientes han mostrado que EpCAM es una molécula de señalización que puede regular por incremento la expresión nuclear del protooncogén c-Myc y ciclinas (Munz et al., Oncogene 23 (2004), 5748-58). Cuando se sobreexpresa en células quiescentes, EpCAM induce proliferación celular, independencia de factores de crecimiento y crecimiento de colonias en agar blando, lo que son todos signos distintivos de proteínas oncogénicas. Cuando se inactiva la expresión de EpCAM mediante ARN de interferencia pequeño (ARNip) en células de cáncer de mama, tales células dejan de proliferar, migran y son invasivas (Osta et al., Cancer Res. 64 (2004), 5818-24). Esta señalización oncogénica de EpCAM puede explicar por qué la sobreexpresión de EpCAM se correlaciona con una escasa supervivencia global en varios tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama y ovario (Spizzo et al., Gynecol. Oncol. 103 (2006), 483-8). EpCAM ya se ha empleado como antígeno diana en varios enfoques terapéuticos basados en anticuerpos, incluyendo un anticuerpo humano (Oberneder et al., Eur. J. Cancer 42 (2006), 2530-8) y un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 denominado MT110. La características de MT110 se ha descrito recientemente en detalle (Brischwein et al., 43 (2006), 1129-43). Este anticuerpo es activo contra una variedad de líneas de carcinoma humano que expresan el antígeno diana y está sometiéndose a prueba actualmente en un estudio de fase I para determinar la seguridad y signos tempranos de eficacia.

Más específicamente, el cáncer ha sobrepasado a la cardipatía como la mayor causa de muerte de los estadounidenses por debajo de 85 años en 2005. En la actualidad, el cáncer se clasifica por detrás de las enfermedades cardiovasculares como la segunda causa de muerte en Alemania. A menos que se logren avances drásticos en la prevención del cáncer en los siguientes años comparables a los logrados para la enfermedad cardiovascular, el cáncer se convertirá en la principal causa de muerte en Alemania en el plazo de 15-20 años. Entre los más de 100 tipos de cánceres diferentes, el cáncer epitelial es la principal causa de muertes por cáncer en Alemania. En el cáncer epitelial, la invasión y metástasis de células epiteliales malignas al interior de tejidos normales van acompañadas por cambios adaptativos en el estroma de soporte derivado del mesénquima de los órganos diana. Se ha discutido que la expresión génica alterada en estas células estromales no transformadas proporciona posibles dianas para la terapia. La proteasa de superficie celular, proteína alfa de activación de fibroblastos (FAP alfa) es un ejemplo de una diana de este tipo de fibroblastos tumorales activados. Proteína alfa de activación de fibroblastos es una glicoproteína de superficie celular inducible que se ha identificado originalmente en fibroblastos cultivados usando el anticuerpo monoclonal F19. Estudios inmunohistoquímicos han mostrado que FAP alfa se expresa de manera transitoria en determinados tejidos mesenquimatosos fetales normales pero que tejidos adultos normales así como células epiteliales, neurales y hematopoyéticas malignas son generalmente negativas para FAP alfa. Sin embargo, la mayoría de los tipos comunes de cánceres epiteliales contienen abundantes fibroblastos estromales reactivos con FAP alfa. Scanlan et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 5657-5661, 1994) clonaron un ADNc de FAP alfa a partir de una biblioteca de expresión de ADNc de fibroblastos humanos WI-38 mediante

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anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende por tanto un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies para el antígeno de células madre prostático (PSCA) de ser humano y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntica puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como fármaco en seres humanos. Dicho de otro modo, la misma molécula puede usarse en estudios preclínicos en animales así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y un poder de predicción muy aumentado de los estudios en animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de la especie. Puesto que tanto el CD3 como el dominio de unión a PSCA del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y de primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármaco en seres humanos.

CD19 es una molécula de superficie celular expresada sólo por linfocitos B y células dendríticas foliculares del sistema hematopoyético. Es el más temprano de los antígenos restringidos por el linaje B en expresarse y está presente en la mayoría de las células pre-B y la mayoría de las células de leucemia linfocítica aguda de células no T y células de leucemia linfocítica crónica de tipo de células B.

En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención comprende un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies con la CD19 de ser humano y un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntica puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y como fármaco en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y a un poder de predicción muy aumentado de los estudios en animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de la especie. Puesto que tanto el CD3 como el dominio de unión a CD19 del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla CD19xCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y de primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármaco en seres humanos.

Tal como se describió anteriormente en el presente documento, el oncogén MET, que codifica para la tirosina quinasa receptora (RTK) para el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y factor de dispersión (SF), controla los programas genéticos que conducen a crecimiento celular, invasión y protección frente a la apoptosis. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos,el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla C-METxCD3 de la invención proporciona por tanto proporciona una herramienta ventajosa con el fin de destruir células cancerosas que expresan C-MET, tal como se ejemplifica por la línea celular de cáncer de mama positivo para C-MET humano MDA-MB-231. La actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla C-METxCD3 de la invención es mayor que la actividad citotóxica de los anticuerpos descritos en la técnica. Puesto que preferiblemente tanto el dominio de unión a CD3 como a C-MET del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla C-METxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y primates distintos de chimpancé, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla C-METxCD3 de la invención puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates como (en forma idéntica) como fármaco en seres humanos.

Ventajosamente, la presente invención proporciona en una realización alternativa anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla C-METxCD3 que comprenden un segundo dominio de unión que se une tanto a C-MET humano como al homólogo de C-MET de macaco, es decir el homólogo de un primate distinto de chimpancé. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende por tanto un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies con C-MET humano y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntico puede usarse para tanto la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y como fármacos en seres humanos. Dicho de otra forma, la misma molécula puede usarse en estudios con animales preclínicos así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y a un poder de predicción muy aumentado de los estudios con animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de especie. Puesto que tanto el dominio de unión a CD3 como a C-MET del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla C-METxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármacos en seres humanos.

La angiogénesis, es decir la formación de nuevos capilares, es esencial para varios acontecimientos fisiológicos importantes, tanto normales como patológicos. Recientemente, se ha puesto más atención en la purificación y caracterización de inhibidores de este proceso, debido al posible valor terapéutico de inhibidores de la angiogénesis en el control de tumores sólidos. Debido a su distribución tisular normal restringida y su abundante expresión en células endoteliales tumorales de muchos tipos diferentes de tumores sólidos, puede usarse la endosialina como diana para estrategias de tratamiento antiangiogénico del cáncer basadas en anticuerpos. En particular, la selección como diana de células endoteliales tumorales en lugar de las células cancerosas tiene la ventaja de que la expresión

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de la diana en las células endoteliales no transformadas de vasos sanguíneos tumorales es más estable que la expresión de la diana en las células cancerosas genéticamente inestables. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EndosialinxCD3 de la invención proporciona una herramienta ventajosa con el fin de inhibir la formación de nuevos capilares en tumores sólidos que desempeñan un papel importante en el soporte del crecimiento de los tumores. En este enfoque terapéutico novedoso e inventivo, no son las células tumorales las que se seleccionan como diana si no los vasos sanguíneos tumorales. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EndosialinxCD3 de la invención recluta células T citotóxicas a las células endoteliales positivas para endosialina en tumores, incluyendo, pero sin limitarse a, carcinomas (de mama, riñón, pulmón, colorrectal, colon, páncreas, mesotelioma), sarcomas y tumores neuroectodérmicos (melanoma, glioma, neuroblastoma), dando como resultado el agotamiento de las células endoteliales que expresan endosialina del tumor. De este modo, se inhibe la angiogénesis tumoral dando como resultado regresión tumoral o incluso agotamiento. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, la actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EndosialinxCD3 de la invención es mayor que la actividad de anticuerpos descritos en la técnica. Puesto que el crecimiento de neoplasmas sólidos requiere el reclutamiento de vasos sanguíneos de soporte, el uso terapéutico del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EndosialinxCD3 de la invención proporciona un enfoque novedoso e inventivo para la selección como diana y destrucción endotelial del tumor.

Ventajosamente, la presente invención proporciona también anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla EndosialinxCD3 que comprenden un segundo dominio de unión que se une tanto a la endosialina humana como al homólogo de endosialina de macaco, es decir el homólogo de un primate distinto de chimpancé. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende por tanto un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies con la endosialina humana y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntico puede usarse para tanto la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y como fármacos en seres humanos. Dicho de otra forma, la misma molécula puede usarse en estudios con animales preclínicos así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y a un poder de predicción muy aumentado de los estudios con animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de especie. Puesto que tanto el dominio de unión a CD3 como a endosialina del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EndosialinxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármacos en seres humanos.

Se ha encontrado recientemente que EpCAM se expresa en las denominadas “células madre de cáncer” (Dalerba et al., PNAS 104 (2007), 10158-63; Dalerba et al., Ann. Rev. Med. 58 (2007), 267-84). En vista de esto, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 de la invención no sólo proporciona una herramienta ventajosa con el fin de destruir células cancerosas que expresan EpCAM en cáncer epitelial o cáncer residual mínimo, sino que también puede ser útil para la eliminación de los presuntos culpables responsables de la recidiva del tumor tras la terapia. Además, la actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 de la invención es mayor que la actividad citotótica de los anticuerpos descritos en la técnica.

En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención comprende un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies con el EpCAM humano y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntico puede usarse para tanto la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y como fármacos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y a un poder de predicción muy aumentado de los estudios con animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de especie. Puesto que tanto el dominio de unión a CD3 como a EpCAM del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármacos en seres humanos.

El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla FAPalphaxCD3 de la invención proporciona una herramienta ventajosa con el fin de atacar al estroma de tumores sólidos, tales como tumores epiteliales, que desempeña un papel importante en el soporte del crecimiento y la neovascularización de tumores. En este enfoque terapéutico novedoso e inventivo, no son las células tumorales las que se seleccionan como diana si no los fibroblastos estromales activados. Estudios previos han mostrado que la mayoría de los tipos comunes de cánceres epiteliales, incluyendo más del 90% de carcinomas de mama, de pulmón y colorrectales primarios y malignos, contienen abundantes fibroblastos estomales reactivos con FAP alfa (Scanlan et al., PNAS 91 (1994), 5657-5661 y referencias citadas en el mismo). En cambio, los tejidos normales y las lesiones epiteliales benignas y premalignas sólo contienen raramente células estromales positivas para FAP alfa. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla FAPalphaxCD3 de la invención recluta células T citotóxicas a los fibroblastos estromales positivos para FAP alfa en tumores epiteliales primarios y malignos dando como resultado el agotamiento de las células estromales del tumor. En particular, la selección como diana de células estromales tumorales en vez de las células cancerosas tiene la ventaja de que la expresión de la diana en las células estromales no transformadas es más estable que la expresión de la diana en las células cancerosas genéticamente inestables. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, la

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biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 de la invención preferiblemente humano puede usarse como agente terapéutico contra diversas enfermedades, incluyendo pero sin limitarse a cáncer, preferiblemente cáncer epitelial. Dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla IGF-1RxCD3 preferiblemente humano de la invención puede usarse como agente terapéutico contra diversas enfermedades, incluyendo pero sin limitarse a cáncer, preferiblemente cáncer de huesos o tejidos blandos (por ejemplo sarcoma de Ewing), cáncer de mama, hígado, pulmón, cabeza y cuello, colorrectal, próstata, leiomiosarcoma, de cuello uterino y endometrial, de ovarios, próstata y pancreático. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla IGF-1RxCD3 de la invención puede usarse como agente terapéutico contra enfermedades autoinmunitarias, preferiblemente psoriasis.

En vista de lo anterior, desaparece la necesidad de construir un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 sustituto (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3) para pruebas en una especie filogenética distante (de los seres humanos). Como resultado, puede usarse la molécula idéntica en pruebas preclínicas en animales tal como pretende administrarse a seres humanos en pruebas clínicas así como tras la aprobación para la comercialización y la administración terapéutica de fármacos. La capacidad para usar la misma molécula para pruebas preclínicas en animales como en la administración posterior a seres humanos elimina prácticamente, o al menos reduce enormemente, el peligro de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tengan una aplicabilidad limitada al caso humano. Brevemente, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se administrará realmente a seres humanos no garantiza en gran medida la aplicabilidad de los datos a un escenario relevante para seres humanos. En cambio, en enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, dichas moléculas sustitutas han de adaptarse de manera molecular al sistema de prueba en animales usado para la evaluación preclínica de la seguridad. Por tanto, la molécula que va a usarse en terapia en seres humanos difiere de hecho en la secuencia y también probablemente en la estructura de la molécula sustituta usada en pruebas preclínicas en parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tienen aplicabilidad / capacidad de transferencia limitada al caso humano. El uso de moléculas sustitutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de un constructo completamente nuevo. Este conduce a tiempo y costes de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En suma, tienen que desarrollarse sustitutos por separado además del fármaco que va a usarse en realidad en terapia en seres humanos, de modo que tienen que llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas. Por tanto, una ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención que muestra especificidad entre especies descrito en el presente documento es que puede usarse la molécula idéntica para agentes terapéuticos en seres humanos y en pruebas preclínicas en animales.

Se prefiere que al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención esté injertado con CDR, sea humanizado o humano, tal como se expone en más detalle a continuación. Preferiblemente, ambos dominios de unión primero y segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención están injertados con CDR, son humanizados o humanos. Para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención, se excluye la generación de una reacción inmunitaria frente a dichas moléculas de unión en el máximo grado posible tras la administración de la molécula a pacientes humanos.

Otra ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención es su aplicabilidad para pruebas preclínicas en diversos primates. El comportamiento de un candidato a fármaco en animales debe ser indicativo de manera ideal del comportamiento esperado de este candidato a fármaco tras la administración a seres humanos. Como resultado, los datos obtenidos a partir de tales pruebas preclínicas deben tener por tanto generalmente un alto poder de predicción para el caso humano. Sin embargo, tal como se aprendió a partir del trágico desenlace del reciente ensayo clínico de fase I con TGN1412 (un anticuerpo monoclonal frente a CD28), un candidato a fármaco puede actuar de diferente manera en una especie de primate que en seres humanos: aunque en pruebas preclínicas de dicho anticuerpo no se han observado efectos adversos o sólo limitados en estudios en animales realizados con macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desarrollaron fallo multiorgánico tras la administración de dicho anticuerpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Los resultados de estos acontecimientos no deseados, dramáticos sugieren que puede no ser suficiente limitar las pruebas preclínicas a una sola especie (primate distinto de chimpancé). El hecho de que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3) de la invención se una a una serie de monos del nuevo mundo y del viejo mundo puede ayudar a superar los problemas encarados en el caso mencionado anteriormente. Por consiguiente, la presente invención proporciona medios y métodos para minimizar diferencias entre especies en los efectos cuando están desarrollándose y sometiéndose a prueba fármacos para terapia en seres humanos.

Con el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3) preferiblemente humano, específico entre especies de la invención, tampoco es necesario ya adaptar el animal de prueba al candidato a fármaco destinado para la

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administración a seres humanos, tal como por ejemplo la creación de animales transgénicos. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención que presenta especificidad entre especies según los usos y los métodos de invención puede usarse directamente para pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé, sin ninguna manipulación genética de los animales. Tal como saben bien los expertos en la técnica, los enfoques en los que el animal de prueba se adapta al candidato a fármaco siempre corren el riesgo de que los resultados obtenidos en las pruebas preclínicas de seguridad sean menos representativos y predictivos para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes a menudo se sobreexpresan altamente. Por tanto, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra este antígeno de proteína pueden estar limitados en cuanto a su valor de predicción para seres humanos en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.

Una ventaja adicional de los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3) preferiblemente humano de la invención que presenta especificidad entre especies es el hecho de que se evitan los chimpancés como especie en peligro para las pruebas en animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos de los seres humanos y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos basándose en los datos de secuenciación del genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por tanto, se consideran generalmente los datos obtenidos con chimpancé como altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su estatus como especie en peligro, el número de chimpancés que puede usarse para experimentos médicos está altamente restringido. Tal como se estableció anteriormente, por tanto, el mantenimiento de chimpancés para pruebas en animales es tanto costoso como éticamente problemático. Los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención, evitan tanto las objeciones éticas como la carga económica durante pruebas preclínicas sin perjuicio de la calidad, es decir la aplicabilidad, de los datos obtenidos en las pruebas en animales. En vista de esto, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención prevén una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.

Una ventaja todavía adicional del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención es la capacidad para extraer múltiples muestras de sangre cuando se usa como parte de pruebas preclínicas en animales, por ejemplo en el transcurso de estudios farmacocinéticos en animales. Las múltiples extracciones de sangre pueden obtenerse mucho más fácilmente con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, por ejemplo un ratón. La extracción de múltiples muestras de sangre permite someter a prueba de manera continua parámetros sanguíneos para la determinación de los efectos biológicos inducidos por el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención. Además, la extracción de múltiples muestras de sangre permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento. Además, pueden medirse posibles efectos secundarios, que pueden inducirse por dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención que se reflejen en parámetros sanguíneos en diferentes muestras de sangre extraídas durante el transcurso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del posible perfil de toxicidad del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento.

Las ventajas del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento que presenta especificidad entre especies pueden resumirse brevemente tal como sigue:

En primer lugar, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento usado en pruebas preclínicas es el mismo que se usa en terapia en seres humanos. Por tanto, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes, que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y actividad biológica. Esto es altamente ventajoso porque, por ejemplo, los resultados farmacocinéticos pueden transferirse y aplicarse más directamente al caso humano que, por ejemplo, en enfoques con sustitutos convencionales.

En segundo lugar, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSCAxCD3 (respectivamente CD19xCD3, C-METxCD3, EndosialinxCD3, EpCAMxCD3, IGF-1RxCD3 o FAPxCD3), preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento para la preparación de agentes terapéuticos en ser humano es menos costoso y requiere menos mano de obra que los enfoques con sustitutos. En tercer lugar, el anticuerpo biespecífico

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reivindicaciones y un segundo dominio de unión que se une a PSCA (respectivamente CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP), en el que el segundo dominio de unión se une preferiblemente a PSCA (respectivamente CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP) de un ser humano y un primate distinto de chimpancé. La ventaja de las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla como candidatos a fármaco que satisfacen los requisitos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla preferido de la invención es el uso de tales moléculas en pruebas preclínicas con animales así como en estudios clínicos e incluso para terapia en seres humanos. En una realización preferida de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies de la invención, el segundo dominio de unión que se une un antígeno de superficie celular es humano. En una molécula biespecífica específica entre especies según la invención, el dominio de unión que se une a un epítopo de cadena CD3 épsilon de ser humano y primate distinto de chimpancé está ubicado en el orden VH-VL o VL-VH en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la molécula biespecífica. Se describen ejemplos para moléculas biespecíficas específicas entre especies según la invención en diferentes disposiciones de la cadena VH y la VL en los dominios de unión primero y segundo en los ejemplos adjuntos.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo biespecífico de cadena sencilla” indica una única cadena de polipéptido que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH”), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula de CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP. Los dos dominios de unión se conectan opcionalmente entre sí mediante un espaciador de polipéptido corto. Un ejemplo no limitativo de un espaciador de polipéptido es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) y repeticiones del mismo. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo (“región VL”), conectándose la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo entre sí a través de un ligador de polipéptido, por ejemplo del tipo dado a conocer y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso lo suficientemente largo como para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se apareen unas con otras de tal manera que, conjuntamente, pueden unirse específicamente a los dominios de unión primero y segundo respectivos.

El término “proteína” se conoce bien en la técnica y describe compuestos biológicos. Las proteínas comprenden una

o más cadenas de aminoácidos (polipéptidos), mediante las cuales los aminoácidos se unen entre sí a través de un enlace peptídico. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas, que consiste en más de 30 aminoácidos. Según la invención, el grupo de polipéptidos comprende “proteínas” siempre que las proteínas consistan en una única cadena de polipéptido. También en línea con la definición, el término “polipéptido” describe fragmentos de proteínas siempre que estos fragmentos consistan en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, por consiguiente, homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma que se produce de manera natural, consiste en dos cadenas ligeras de polipéptido idénticas y dos cadenas pesadas de polipéptido idénticas. Los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a proteínas/polipéptidos modificados de manera natural en los que se efectúa la modificación, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones se conocen bien en la técnica.

El término “dominio de unión” caracteriza, en relación con la presente invención, un dominio de un polipéptido que se une específicamente a/interacciona con una estructura/antígeno/epítopo diana dado. Por tanto, el dominio de unión es un “sitio de interacción con antígeno”. El término “sitio de interacción con antígeno” define, según la presente invención, un motivo de un polipéptido, que puede interaccionar específicamente con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos, por ejemplo el antígeno idéntico en diferentes especies. Dicha unión/interacción se entiende también que define un “reconocimiento específico”. El término “que reconoce específicamente” significa según esta invención que la molécula de anticuerpo puede interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un antígeno, por ejemplo el antígeno CD3 humano y los antígenos diana tal como se definen en el presente documento. Tal unión puede ejemplificarse mediante la especificidad de un “principio de llave y cerradura”. Por tanto, motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria así como el resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar resultado también una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del dominio de unión/sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado alternativamente la iniciación de una señal, por ejemplo debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Un dominio de unión en línea con la presente invención es un anticuerpo. El dominio de unión puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o derivarse de un anticuerpo monoclonal o policlonal. El término “anticuerpo” comprende derivados o fragmentos funcionales del mismo que conservan todavía la especificidad de unión. Se conocen bien en la técnica técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, por ejemplo en Harlow y Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término “anticuerpo”

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también comprende inmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir IgA, IgG, IgM, IgD e IGE) y subclases (tales como IgG1, IgG2 etc.). La definición del término “anticuerpo” incluye también realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo, como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab’)2, Fv, scFv o anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de un solo dominio variable o un solo dominio variable de inmunoglobulina que comprende únicamente un dominio variable, que podría ser VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otros dominios o regiones V; véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. Un solo dominio variable de inmunoglobulina de este tipo engloba no sólo un polipéptido de un solo dominio de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptido de un solo dominio de anticuerpo.

Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de tales anticuerpos y/o fragmentos. Por tanto, los derivados (de anticuerpo) pueden producirse también por peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, entre otros, la patente estadounidense 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para polipéptido(s) elegido(s). Además, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares.

Los ejemplos de tales técnicas incluyen la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Puede usarse resonancia por plasmones de superficie tal como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un polipéptido diana, tal como CD3 épsilon, PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Se prevé también en el contexto de esta invención que el término “anticuerpo” comprenda constructos de anticuerpos, que pueden expresarse en un huésped tal como se describe a continuación en el presente documento, por ejemplo constructos de anticuerpos que pueden transfectarse y/o transducirse a través de, entre otros, virus o vectores de plásmido.

El término “interacción específica” tal como se usa según la presente invención significa que el dominio de unión no experimenta reacción cruzada o no lo hace significativamente con polipéptidos que tienen estructura similar a los que se unen por el dominio de unión, y que podrían expresarse por las mismas células que el polipéptido de interés. Puede someterse a prueba la reactividad cruzada de un panel de dominios de unión en investigación, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de dominios de unión en condiciones convencionales (véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Los ejemplos de la interacción específica de un dominio de unión con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la interacción de ligandos, que inducen una señal tras su unión a su receptor específico. Los ejemplos de dicha interacción, que está también particularmente comprendida por dicha definición, es la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el dominio de unión (sitio de unión antigénico) de un anticuerpo.

El término “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” tal como se usa en el presente documento significa la unión de un dominio de unión descrito en el presente documento a la misma molécula diana en seres humanos y primates distintos de chimpancé. Por tanto, “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” ha de entenderse como una reactividad interespecies con la misma molécula “X” (es decir, el homólogo) expresada en diferentes especies, pero no con una molécula distinta de “X”. Puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo CD3 épsilon humano, con un CD3 épsilon de primate distinto de chimpancé, por ejemplo CD3 épsilon de macaco, por ejemplo, mediante análisis FACS. El análisis FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos CD3 épsilon de ser humano y de primate distinto de chimpancé, respectivamente. Se muestra un ensayo apropiado en los siguientes ejemplos. El contenido mencionado anteriormente se aplica cambiando lo que se deba cambiar para los antígenos PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R y FAP: puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP humano, por un PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP de primate distinto de chimpancé, por ejemplo PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R o FAP de macaco, por ejemplo, mediante análisis FACS. El análisis FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos PSCA, CD19, CMET, endosialina, EpCAM, IGF-1R y FAP de ser humano y primate distinto de chimpancé, respectivamente.

Tal como se usa en el presente documento, CD3 épsilon indica una molécula expresada como parte del receptor de células T y tiene el significado que se le atribuye normalmente en la técnica anterior. En ser humano, engloba en

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forma combinada individual o independientemente todas las subunidades de CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos CD3 no humanos, de primate distinto de chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularis y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularis, engloba CD3 épsilon negativo para FN-18 y CD3 épsilon positivo para FN-18, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferiblemente, dicho CD3 tal como se usa en el presente documento es CD3 épsilon. El CD3 épsilon humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000733 y comprende SEQ ID NO. 1. El CD3 gamma humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000073. El CD3 delta humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000732. El CD3 épsilon “negativo para FN-18” de Macaca fascicularis (es decir CD3 épsilon no reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo tal como se expuso anteriormente) se indica en el n.º de registro GenBank AB073994. El CD3 épsilon “positivo para FN-18” de Macaca fascicularis (es decir CD3 épsilon reconocido por anticuerpo monoclonal FN-18) se indica en el n.º de registro GenBank AB073993. El CD3 gamma de Macaca fascicularis se indica en el n.º de registro GenBank AB073992. El CD3 delta de Macaca fascicularis se indica en el n.º de registro GenBank AB073991.

Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de los homólogos respectivos de CD3 épsilon, gamma y delta de Macaca mulatta pueden identificarse y aislarse mediante técnicas recombinantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001). Esto se aplica cambiando lo que se deba cambiar a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros primates distintos de chimpancé tal como se definen en el presente documento. La identificación de la secuencia de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus y Saguinus oedipus se describe en los ejemplos adjuntos. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del CD3 épsilon de Callithrix jacchus se representa en SEQ ID NO: 3, la de Saguinus oedipus se representa en SEQ ID NO: 5 y la de Saimiri sciureus se representa en SEQ ID NO: 7.

El PSCA humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_005672. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 444 y 443, respectivamente. La clonación del homólogo de PSCA de macaco se demuestra en los siguientes ejemplos, las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 446 y 445, respectivamente. El CD19 humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_001770. Basándose en esta información de secuencia, es posible para el experto en la técnica sin ninguna adición inventiva clonar (y expresar) la molécula de CD19 de macaco. Por ejemplo, puede usarse el ADNc de CD19 humano o un fragmento del mismo indicado en el n.º de registro GenBank NM_001770 como sonda de hibridación con el fin de examinar una biblioteca de ADNc de macaco (por ejemplo una biblioteca de ADNc de mono cinomolgo

o mono Rhesus) en condiciones de hibridación apropiadas. Se describen técnicas recombinantes y métodos de examen (incluyendo enfoques de hibridación) en biología molecular por ejemplo en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001.

El C-MET humano se indica en el n.º de registro GenBankNM_000245. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 776 y 777, respectivamente. La clonación del homólogo de C-MET de macaco se demuestra en los siguientes ejemplos, las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 788 y 789, respectivamente. La endosialina humana se indica en el n.º de registro GenBank NM_020404. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 913 y 914, respectivamente. La clonación del homólogo de endosialina de macaco se demuestra en los siguientes ejemplos, las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 915 y 916, respectivamente. El EpCAM se indica en el n.º de registro GenBank NM_002354. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 1029 y 1028, respectivamente. Tal como se demuestra en los siguientes ejemplos, el segundo dominio de unión del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla EpCAMxCD3 de la invención se une a un epítopo localizado en los residuos de aminoácido 26 a 61 del dominio 1 similar a EGF de EpCAM que está codificado por el exón 2 del gen de EpCAM. Dichos residuos de aminoácidos 26 a 61 del dominio 1 similar a EGF de EpCAM humano se muestran en SEQ ID NO. 1130. Basándose en esta información de secuencia es posible para el experto en la técnica sin ninguna adición inventiva clonar (y expresar) la molécula de EpCAM de macaco. Por ejemplo, puede usarse el ADNc de EpCAM humano o un fragmento del mismo indicado en el n.º de registro GenBank NM_002354 puede usarse como sonda de hibridación con el fin de examinar una biblioteca de ADNc de macaco (por ejemplo una biblioteca de ADNc de mono cinomolgo o mono Rhesus) en condiciones de hibridación apropiadas. Se describen técnicas recombinantes y métodos de examen (incluyendo enfoques de hibridación) en biología molecular por ejemplo en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001. La FAP alfa humana se indica en el n.º de registro GenBank NM_004460. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 1149 y 1150, respectivamente. La clonación del homólogo de FAP alfa de macaco se demuestra en los siguientes ejemplos, las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 1151 y 1152, respectivamente. El IGF-1R humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000875. Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 1988 y 1989, respectivamente. La secuencia codificante de IGF-1R de macaco tal como se publica en GenBank (número de registro M_001100407). Las secuencias de ADNc y aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 1998 y 1999, respectivamente.

En línea con lo anterior, el término “epítopo” define un determinante antigénico, que se une/identifica específicamente por un dominio de unión tal como se define en el presente documento. El dominio de unión puede

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no se observó redistribución de células T repetida y el paciente no desarrolló de nuevo ningún síntoma en el SNC (figura 23B). Debido a que este paciente no tenía tampoco esencialmente células B circulantes, las células T circulantes pudieron reaccionar con cinética de redistribución rápida incluso a cambios sutiles en la exposición al fármaco tal como se observó. Los acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de células 5 T en pacientes que no tienen esencialmente células diana circulantes pueden explicarse por un aumento transitorio de la adhesión de células T a las células endoteliales seguido por una adhesión simultánea masiva de células T circulantes a las paredes de los vasos sanguíneos con una caída consecutiva de los números de células T en la sangre circulante tal como se observó. La unión simultánea masiva de células T a las paredes de los vasos sanguíneos puede provocar un aumento en la activación de células endoteliales y la permeabilidad endotelial. Las 10 consecuencias del aumento de la permeabilidad endotelial son desplazamientos de fluidos desde el compartimento intravascular a los compartimentos del tejido intersticial incluyendo el intersticio del SNC. La activación de células endoteliales por células T unidas puede tener efectos procoagulatorios (Monaco et al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659668) con posibles alteraciones en el flujo de sangre (incluyendo flujo de sangre cerebral) particularmente con respecto a la microcirculación capilar. Por tanto, acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la 15 redistribución de células T en pacientes esencialmente sin células diana circulantes pueden ser la consecuencia de fuga capilar y/o alteraciones en la microcirculación capilar a través de la adherencia de células T a células endoteliales. El estrés endotelial provocado por un episodio de redistribución de células T lo toleran la mayoría de los pacientes, mientras que el estrés endotelial potenciado provocado por la redistribución de células T repetida provoca frecuentemente acontecimientos adversos en el SNC. Más de un episodio de redistribución de células T 20 puede ser menos peligroso sólo en pacientes que tienen bajos recuentos iniciales de células T circulantes. Sin embargo, también el estrés endotelial limitado provocado por un episodio de redistribución de células T puede provocar acontecimientos adversos en el SNC en casos raros de aumento de la susceptibilidad a tales acontecimientos tal como se observa en 1 de 21 pacientes en los ensayos de infusión en bolo con la molécula de unión a CD19xCD3. Sin querer restringirse a la teoría, el aumento transitorio de adhesión de células T a las células 25 endoteliales en pacientes que no tienen esencialmente células diana circulantes puede explicarse como una reacción de células T a la interacción monovalente de una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3 (por ejemplo, el documento WO 99/54440), a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon que da como resultado un cambio alostérico en la conformación de CD3 seguido por el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon tal como se describió anteriormente. Puesto que Nck2 se une

30 directamente a integrinas por medio de PINCH e ILK (figura 28), el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon que sigue a un cambio alostérico en la conformación de CD3 a través de la unión de una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3, a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon, puede aumentar la adhesión de células T a células endoteliales por el cambio transitorio de integrinas en la superficie de células T a su isoforma más adhesiva por medio de señalización de dentro a fuera.

35 Tabla 3. Demografía de pacientes y desenlace clínico

Cohorte

Paciente Edad/ sexo Enfermedad (clasificación de Ann Arbor) Nivel de dosis [g/m2/día] Aclaramiento de la médula ósea Mejor respuesta* (duración de CR en meses o semanas)

1

1

71/m IC, Binet C 0,0005 Ninguno SD

2

67/f MCL, estadio IV/A/E 0,0005 n.d. PD

3

67/m CLL, estadio IV/B/E 0,0005 n.d. MR

2

4 69/m MCL, estadio IV/B 0,0015 n.i. SD

5

49/m MCL, estadio IV/A/S 0,0015 n.d. SD

6

71/m MCL, estadio IV/B/E 0,0015 n.i. PD

7

77/m MCL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.i. SD

8

65/m CLL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.d. PD

9

75/m FL, estadio II/B 0,0015 n.i. SD

3

10 58/m MCL, estadio III/B/S 0,005 n.i. PD

11

68/f FL, estadio IV/B 0,005 n.d. SD

12

65/m MCL, estadio III/A/E 0,005 n.i. SD

4a

13 60/m SLL, estadio IV/B/S 0,015 Completo PR

14

73/m MCL, estadio II/A/E 0,015 n.i. SD

15

44/m FL, estadio IV/B/E/S 0,015 Parcial PR

16

61/m FL, estadio IV/A/S 0,015 Completo CR (7mo)

17

67/m MZL, estadio IV/B/S 0,015 n.i. n.e.

18

64/m FL, estadio IV/A/E 0,015 n.i. PD

19

75/m MCL, estadio III/A 0,015 n.i. n.e.

20

65/f FL; estadio III/A 0,015 n.i. SD

21

60/m MCL, estadio IV/A/E 0,015 Ninguno SD

22

67/f FL, estadio IV/B 0,015 Completo MR

23

67/m DLBCL, estadio III/B 0,015 n.i. n.e.

24

65/f FL, estadio III/A 0,015 n.d. SD

76

25

74/f WD, estadio IV/B 0,015 Parcial SD

5

26 67/m MCL, estadio IV/A 0,03 Completo SD

27

48/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. PD

28

58/m MCL, estadio III/A 0,03 n.i. CR (10mo+)

29

45/f MCL, estadio IV/B 0,03 Parcial PD

30

59/m MZL, estadio III/A 0,03 n.i. n.e.

31

43/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. MR

6

32 72/m MCL, estadio IV/A 0,06 Completo PR

33

55/m MCL, estadio IV/B 0,06 Completo CR (4mo+)

34

52/m FL, estadio IV/A 0,06 n.i. CRb (1w+)

*Respuestas completa (CR) y parcial (PR) confirmadas de manera central mediante criterios de Cheson en negrita; MR, respuesta mínima (de 25 a <50%); SD, enfermedad estable; PD, enfermedad progresiva; duración desde la primera documentación de la respuesta entre paréntesis; + indica una respuesta en curso

aLa cohorte 4 se expandió para estudiar tres programas diferentes de inicio del tratamiento

5 bPR tras 8 semanas de tratamiento que se convirtió en una CR tras un ciclo de tratamiento adicional de 4 semanas a la misma dosis tras 7 semanas de intervalo libre de tratamiento n.e.: no evaluable, debido a que el periodo de tratamiento <7 d n.d.: no determinado (infiltrado, pero no se realizó una segunda biopsia al final del tratamiento) n.i.: no infiltrado al inicio del tratamiento

10 Tabla 4. Incidencia de acontecimientos adversos observados durante el tratamiento

Acontecimientos adversos independientemente de la relación, que se producen en  3 pacientes (N=34)

Grado 1-4 N (%) Grado 3-4 N (%)

Pirexia

22 (64,7) 2 (5,9)

Leucopenia

21 (61,8) 11 (32,4)

Linfopenia

21 (61,8) 21 (61,8)

Coagulopatía (aumento de dímeros D)

16 (47,1) 6 (17,6)

Anomalía enzimática (AP, LDH, CRP)

16 (47,1) 10 (29,4)

Anomalía de la función hepática (ALT, AST, GGT)

16 (47,1) 1 (2,9)

Anemia

13 (38,2) 5 (14,7)

Escalofrío

13 (38,2) 0 (0,0)

Cefalea

12 (35,3) 1 (2,9)

Hipocalemia

12 (35,3) 2 (5,9)

Trombocitopenia

12 (35,3) 6 (17,6)

Aumento de peso

12 (35,3) 0 (0,0)

Hiperglucemia

11 (32,4) 2 (5,9)

Neutropenia

11 (32,4) 8 (23,5)

Hematuria

10 (29,4) 0 (0,0)

Edema periférico

10 (29,4) 2 (5,9)

Anorexia

9 (26,5) 1 (2,9)

Diarrea

9 (26,5) 0 (0,0)

Disminución de peso

9 (26,5) 0 (0,0)

Fatiga

8 (23,5) 1 (2,9)

Proteinuria

8 (23,5) 0 (0,0)

Hipocalcemia

7 (20,6) 2 (5,9)

Anomalía de enzimas pancreáticas

7 (20,6) 0 (0,0)

Tos

6 (17,6) 0 (0,0)

Disnea

6 (17,6) 0 (0,0)

Dolor de espalda

5 (14,7) 0 (0,0)

Dolor en el sitio del catéter

5 (14,7) 0 (0,0)

Hiperbilirubinemia

5 (14,7) 2 (5,9)

Hipoalbuminemia

5 (14,7) 0 (0,0)

Hipogammaglobulinemia

5 (14,7) 1 (2,9)

Hipoproteinemia

5 (14,7) 0 (0,0)

Efusión pleural

5 (14,7) 1 (2,9)

Vómitos

5 (14,7) 0 (0,0)

Astenia

4 (11,8) 1 (2,9)

Estado de confusión

4 (11,8) 0 (0,0)

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Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Tras la verificación de la secuencia se usó el plásmido para transfectar células CHO/dhfr-tal como sigue. Se usó un plásmido de secuencia verificada para transfectar células CHO/dhfr(n.º de la ATCC CRL 9096; se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada obtenida de Biochrom AG Berlín, Alemania, complementado con FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% obtenidos todos de Biochrom AG Berlín, 5 Alemania y nucleósidos de una disolución madre de reactivos de calidad para cultivo celular obtenidos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania, hasta una concentración final de adenosina 10 g/ml, desoxiadenosina 10 g/ml y timidina 10 g/ml, en un incubador a 37ºC, 95% de humedad y 7% de CO2). Se realizó la transfección usando el reactivo de transfección PoliFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 g de ADN de plásmido según el protocolo del fabricante. Tras un periodo de cultivo de 24 horas se lavaron las células una vez con 10 PBS y se cultivaron de nuevo en el medio de cultivo celular mencionado anteriormente excepto porque el medio no se complementó con nucleósidos y se usó FCS dializado (obtenido de Biochrom AG Berlín, Alemania). Por tanto el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y de ese modo se aplicó la selección sobre las células transfectadas. Aproximadamente 14 días tras la transfección se observó el crecimiento de células resistentes. Tras de 7 a 14 días adicionales se sometieron a prueba los transfectantes positivos para detectar la expresión del

15 constructo por medio de FACS. La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realiza tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

25.2. Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de CD19 y CD3

20 Generalmente, las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, que comprenden cada una un dominio con una especificidad de unión por el antígeno CD3 humano de macaco así como un dominio con una especificidad de unión por el antígeno CD19 humano, se diseñaron tal como se expone en la siguiente tabla 8:

Tabla 8: Formatos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies anti-CD3 y anti-CD19

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de constructos proteicos (N → C)

482/481

HD37 LH x I2C HL

486/485

HD37 LH x F12Q HL

484/483

HD37 LH x H2C HL

534/533

hCD19 47-A3 LH x I2C HL

522/521

hCD19 46-B11 LH x I2C HL

510/509

hCD19 45-A10 LH x I2C HL

498/497

hCD19 26-D6 LH x I2C HL

546/545

HD37-DT LH x I2C HL

558/557

HD37-A LH x I2C HL

570/569

HD37-G LH x I2C HL

582/581

HD37-S LH x I2C HL

594/593

HD37-T LH x I2C HL

606/605

HD37-I LH x I2C HL

618/617

HD37-L LH x I2C HL

630/629

HD37-V LH x I2C HL

642/641

HD37-E LH x I2C HL

654/653

HD37-Q LH x I2C HL

666/665

HD37-N LH x I2C HL

678/677

HD37-K LH x I2C HL

690/689

HD37-R LH x I2C HL

702/701

HD37-H LH x I2C HL

714/713

HD37-Y LH x I2C HL

726/725

HD37-P LH x I2C HL

738/737

HD37-F LH x I2C HL

750/749

HD37-W LH x I2C HL

762/761

HD37-M LH x I2C HL

1283/1282

hCD19 5-A9 LH x I2C HL

1297/1296

hCD19 2-C6 LH x I2C HL

1311/1310

hCD19 4-C7 LH x I2C HL

1325/1324

hCD19 2-D7 LH x I2C HL

1339/1338

hCD19 2-D4 LH x I2C HL

1353/1352

hCD19 5-G3 LH x I2C HL

1367/1366

hCD19 4-E10 LH x I2C HL

1381/1380

hCD19 4-E3 LH X I2C HL

1395/1394

hCD19 3-H7 LH X I2C HL

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Claims (1)

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