EA035745B1

EA035745B1 - Связующие молекулы на основе домена фибронектина типа iii с внедренными остатками цистеина

Info

Publication number: EA035745B1
Application number: EA201690773A
Authority: EA
Inventors: Шалом Голдберг; Стивен ДЖЕКОБС; Триция Лин; Кэрин О' Нил
Original assignee: Янссен Байотек, Инк.
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2020-08-05
Also published as: AU2014334627A1; IL244623B; US10196446B2; CA2926262A1; MX2016004862A; US11702475B2; BR112016008125A2; IL244623A0; CN105899226B; WO2015057545A2; WO2015057545A3; JP2017500003A; KR20160067966A; AU2019253863A1; US20190263915A1; JP2020011969A; JP6585040B2; AU2014334627B2; EP3057608A2; US11072663B2

Abstract

Моноспецифические и биспецифические к EGFR и/или c-Met молекулы с внедренными остатками цистеина, содержащие домен FN3, которые содержат одну или более свободных аминокислот цистеина, получают путем мутагенеза нуклеотидной последовательности исходной молекулы и замены одного или более аминокислотных остатков на цистеин для кодирования моноспецифических или биспецифических молекул с внедренными остатками цистеина, содержащих домен FN3; экспрессии молекул с внедренными остатками цистеина, содержащих домен FN3; и извлечения молекулы с внедренными остатками цистеина, содержащей домен FN3. Выделенная моноспецифическая или биспецифическая молекула введенным цистеином, содержащая домен FN3, может быть ковалентно связана с детекторной меткой или фрагментом лекарственного средства и использована в терапевтических целях.

Description

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к связующим молекулам с введенными цистеиновыми остатками, а также к способам их получения и использования. Более конкретно, изобретение относится к молекулам с доменами фибронектина типа III (FN3), которые могут связываться с EGFR и/или c-Met, и в которые введен цистеин.

Предпосылки создания изобретения

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, или ErbBl, или HER1) представляет собой трансмембранный гликопротеин массой 17 0 кДа, кодируемый протоонкогеном c-erbBl. EGFR является членом семейства человеческих рецепторов эпидермальных факторов роста (HER), которые представляют собой рецепторные тирозинкиназы (RTK), включающие в себя HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4). Эти RTK имеют гомологичную структуру, которая состоит из лиганд-связывающего внеклеточного домена (ECD), одиночного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, содержащего каталитический киназный домен и C-концевой хвост. EGFR-сигнализация запускается связыванием лиганда, за которым следует индукция конформационного изменения, димеризация и трансаутофосфорилирование рецептора (Ferguson et al., Annu Rev Biophys, 37: 353-73, 2008), в результате чего запускается каскад передачи сигналов, который в конечном счете влияет на широкий спектр клеточных функций, включая пролиферацию и выживаемость клеток. Повышение экспрессии или киназной активности EGFR связано с рядом типов рака у человека, что делает EGFR привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства (Mendelsohn et al., Oncogene 19: 6550-6565, 2000; Grunwald et al., J Natl Cancer Inst 95: 851-67, 2003; Mendelsohn et al., Semin Oncol 33: 369-85, 2006). Более того, как увеличение числа копий гена EGFR, так и повышение экспрессии белка связывают с благоприятными ответами на ингибитор тирозинкиназ EGFR IRESSA™ (гефитиниб) при немелкоклеточном раке легких (Hirsch et al., Ann Oncol 18:752-60, 2007).

К связанным с EGFR терапевтическим средствам относятся как низкомолекулярные соединения, так и антитела к EGFR, одобренные для лечения колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи и немелкоклеточного рака легких (NSCLC) (Baselga and Arteaga, J Clin Oncol 23:24452459 (20005; Gill et al., J Biol Chem, 259:7755-7760, 1984; Goldstein et al., Clin Cancer Res, 1:131 1-1318; 1995; Prewett et al., Clin Cancer Res, 4:2957-2966,1998).

Эффективность терапевтических средств против EGFR может зависеть от типа опухоли и статуса мутации/амплификации EGFR в опухоли, и они могут вызывать кожную токсичность (De Roock et al., Lancet Oncol 11:753-762, 2010; Linardou et al., Nat Rev Clin Oncol, 6: 352-366, 2009; Li and Perez-Soler, Targ Oncol 4: 107-119, 2009). Ингибиторы тирозинкиназы EGFR (TKI) обычно применяют в качестве терапевтических средств 2-ой линии при немелкоклеточном раке легких (NSCLC), но часто они прекращают работать в течение двенадцати месяцев из-за обуславливающих резистентность путей (Riely et al., Clin Cancer Res 12: 839-44, 2006).

c-Met кодирует тирозинкиназный рецептор. Впервые его обнаружили как протоонкоген в 1984 г., после того как было выявлено, что воздействие канцерогена приводило к появлению конститутивно активного слитного белка TPR-MET (Cooper et al., Nature 311:29-33, 1984). Активация c-Met через его лиганд HGF вызывает стимуляцию большого числа клеточных процессов, включая рост, подвижность, вовлечение в злокачественный процесс, метастазирование, эпителиально-мезенхимальное превращение, ангиогенез/заживление ран и регенерацию тканей (Christensen et al., Cancer Lett 225:1-26, 2005; Peters and Adjei, Nat Rev Clin Oncol 9:314-26, 2012). c-Met синтезируется в виде одноцепочечного белка, который протеолитически расщепляется на альфа-субъединицу массой 50 кДа и бета-субъединицу массой 140 кДа, соединенные дисульфидной связью (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). cMet структурно аналогичен другим мембранным рецепторам, таким как Ron и Sea, и состоит из внеклеточного лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена (который содержит тирозинкиназный домен и C-концевую хвостовую область). Точная стехиометрия связывания HGF:c-Met неизвестна, но по существу считается, что две молекулы HGF связываются с двумя молекулами c-Met, что приводит к димеризации рецептора и аутофосфорилированию по тирозиновым остаткам в положениях 1230, 1234 и 1235 (Stamos et al., The EMBO Journal 23: 2325-2335, 2004). Также возможно независимое от лиганда аутофосфорилирование c-Met вследствие амплификации гена, мутации или сверхэкспрессии рецептора.

c-Met часто является амплифицированным, мутированным или сверхэкспрессированным при многих типах рака, включая рак желудка, легких, толстой кишки, молочной железы, мочевого пузыря, головы и шеи, яичников, простаты, щитовидной железы, поджелудочной железы и ЦНС. Миссенс-мутации, как правило, локализованные в киназном домене, часто обнаруживают при наследственных папиллярных почечных карциномах (PRCC) и в 13% случаев спорадических PRCC (Schmidt et al., Oncogene 18: 23432350, 1999). Напротив, мутации c-Met, локализованные в семафориновом или околомембранном доменах c-Met, часто обнаруживают при раке желудка, головы и шеи, печени, яичников, NSCLC и раке поджелудочной железы (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003; Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305). При раке мозга, колоректальном раке, раке желудка и раке легких определяется амплификация c-Met, что часто коррелирует с прогрессированием заболевания (Ma et al., Cancer

- 1 035745 and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). До 4 и 20% случаев немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и рака желудка соответственно характеризовались амплификацией c-Met (Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305: Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011). При раке легких, даже в отсутствие амплификации гена, часто наблюдают сверхэкспрессию c-Met (Ichimura et al., Jpn J Cancer Res, 87:1063-9, 1996). Более того, почти половина клинических образцов легочных аденокарцином характеризовалась высокими уровнями c-Met и HGF, оба из которых коррелируют с повышенной скоростью роста опухоли, метастазированием и плохим прогнозом (Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011; Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66: 1915-8, 1998).

Приблизительно в 60% всех опухолей, приобретших резистентность к ингибиторам тирозинкиназы EGFR, повышается экспрессия c-Met, амплификация c-Met или увеличивается уровень его единственно известного лиганда HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010), что предполагает существование компенсаторного пути для EGFR через c-Met. Амплификация c-Met впервые была выявлена в культивируемых клетках, приобретших резистентность к гефитинибу, ингибитору киназы EGFR, и демонстрирующих повышенную выживаемость посредством пути НегЗ (Engelman et al., Science, 316:1039-43, 2007). Это было дополнительно подтверждено с помощью клинических образцов, в которых у девяти из 43 пациентов с приобретенной резистентностью к эрлотинибу или гефитинибу проявилась амплификация cMet по сравнению лишь с двумя из 62 пациентов без лечения. Интересно, что четверо из девяти получавших лечение пациентов также приобрели активирующую EGFR мутацию T790M, что демонстрирует параллельные обуславливающие резистентность пути (Beat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104:20932-7, 2007).

В настоящее время отдельные роли как EGFR, так и c-Met при раке хорошо известны, что делает данные мишени привлекательными для комбинированной терапии. Оба рецептора осуществляют сигнализацию через одни и те же пути, связанные с выживанием и антиапоптозным эффектом (ERK и AKT). Таким образом, одновременное ингибирование этой пары может ограничивать потенциал активации компенсаторного пути и, таким образом, повышать общую эффективность. Комбинированные виды терапии, мишенями при которых являются EGFR и c-Met, тестировали в клинических испытаниях Tarceva® (эрлотиниб) в комбинации с одновалентным антителом к c-Met при NSCL (Spigel et al., 2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011, Journal of Clinical Oncology: Chicago, IL. p. 7505) и Tarceva (эрлотиниб) в комбинации с ARQ-197, низкомолекулярным ингибитором c-Met (Adjei et al., Oncologist, 16:78899, 2011). Комбинированные виды терапии или биспецифические молекулы анти-EGFR/c-Met описаны, например, в международной патентной публикации № WO 2008/127710, патентной публикации США № US 2009/0042906, международной патентной публикации № WO 2009/111691, международной патентной публикации № WO 2009/126834, международной патентной публикации № WO2010/039248, международной патентной публикации № WO 2010/115551.

Современные подходы с использованием низкомолекулярных и высокомолекулярных (например, антитела) терапевтических средств, являющихся антагонистами к сигнальным путям EGFR и/или c-Met, могут быть недостаточно оптимальными вследствие возможного отсутствия низкомолекулярной специфичности и, следовательно, потенциальной побочной активности и ограничивающей дозу токсичности, проявляющейся при использовании низкомолекулярных ингибиторов. Типичные двухвалентные антитела могут приводить к кластеризации связанных с мембраной рецепторов и нежелательной активации нижележащих сигнальных путей, а одновалентные антитела (полуплечи) являются очень сложными и затратными при производстве.

Соответственно существует потребность в дополнительных моноспецифических и биспецифических ингибиторах EGFR и/или c-Met, которые также имеют дополнительную способность к конъюгации с цитотоксическими лекарственными средствами, таким образом нацеливая эти высокоэффективные соединения на экспрессирующие EGFR/c-met опухолевые клетки и усиливая противоопухолевую активность этих ингибиторов EGFR/c-Met. Хотя конъюгаты антител с лекарственными средствами известны в данной области, традиционный способ присоединения фрагмента лекарственного средства, как правило, приводит к образованию гетерогенной смеси молекул, в которой фрагменты лекарственного средства присоединены к нескольким сайтам на антителе. Например, цитотоксические лекарственные средства, как правило, конъюгированы с антителами посредством зачастую многочисленных лизиновых остатков на антителе, в результате чего получается гетерогенная смесь конъюгатов антитела с лекарственным средством. В зависимости от условий реакции гетерогенная смесь обычно имеет распределение антител, содержащих от 0 до около 8 присоединенных фрагментов лекарственного средства. Кроме того, в пределах каждой подгруппы конъюгатов с определенным целочисленным соотношением фрагментов лекарственного средства к антителам имеется потенциально гетерогенная смесь, в которой определенный фрагмент лекарственного средства присоединен к различным сайтам на антителе. Аналитические и препаративные способы не позволяют разделить и охарактеризовать типы молекул-конъюгатов антителолекарственное средство в гетерогенной смеси, полученной в результате реакции конъюгации. Антитела представляют собой крупные, сложные и структурно разнородные биомолекулы, зачастую содержащие множество реакционных функциональных групп. Их способность к реакции с линкерными реагентами и промежуточными продуктами лекарственное средство-линкер зависит от таких факторов, как pH, кон

- 2 035745 центрация, концентрация солей и сорастворители. Кроме того, многоэтапный процесс конъюгации может быть невоспроизводимым вследствие сложностей, связанных с контролем условий реакции и характеризации реагентов и промежуточных продуктов.

Также продемонстрирована химическая конъюгация при помощи остатков цистеина, присутствующих в антителах. Однако введение цистеиновых тиольных групп посредством мутации различных аминокислотных остатков белка в цистеиновые аминокислотные остатки является потенциально проблематичным, в особенности в случае непарных остатков (свободные Cys) или тех, которые являются относительно доступными для реакции или окисления. Непарные остатки Cys на поверхности белка могут образовывать пары и окисляться с образованием межмолекулярных дисульфидных связей и, следовательно, димеров или мультимеров белка.

Образование дисульфидного димера делает новый остаток Cys неспособным к реакции конъюгации с лекарственным средством, лигандом или иной меткой. Более того, если белок в реакции окисления образует внутримолекулярную дисульфидную связь между встроенным Cys и существующим остатком Cys, обе группы Cys становятся недоступными для участия в активном сайте и взаимодействий. Кроме того, белок может стать неактивным или неспецифичным вследствие неправильного сворачивания или потери третичной структуры (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).

Следовательно, существует потребность в молекуле, способной подвергаться гомогенной химической конъюгации и избегать проблем, характерных для конъюгатов антител.

Изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложен выделенный домен фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, который содержит по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 и 93 домена FN3, основанного на SEQ ID NO: 27, и в эквивалентных положениях в родственных доменах FN3. Цистеиновая замена в некотором положении в домене или белке представляет собой замену существующего аминокислотного остатка на остаток цистеина.

В настоящем изобретении также предложен выделенный домен фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27 с, по меньшей мере, одной цистеиновой заменой из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, который специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR.

В настоящем изобретении дополнительно предложен выделенный домен фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 с, по меньшей мере, одной цистеиновой заменой из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114, который специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.

В настоящем изобретении предложены новые положения, в которых можно выполнить цистеиновые замены с получением доменов FN3 с внедренными остатками цистеина. К упомянутым положениям относятся один или более остатков 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 или 93 из SEQ ID NO: 11-114 и/или 122-137.

Один аспект изобретения представляет собой способ получения выделенных доменов FN3 с внедренными остатками цистеина путем мутагенеза нуклеотидной последовательности исходного домена FN3 с заменой одного или более аминокислотных остатков на цистеиновый остаток для кодирования домена FN3 с внедренными остатками цистеина; экспрессии домена FN3 с внедренными остатками цистеина; и выделения домена FN3 с внедренными остатками цистеина.

Другой аспект изобретения представляет собой химически конъюгированный выделенный домен FN3 с внедренными остатками цистеина, причем домен FN3 ковалентно связан с химическим реагентом, содержащим малеимидный фрагмент.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой химически конъюгированный выделенный домен FN3 с внедренными остатками цистеина, который ингибирует рост линий опухолевых клеток со сверхэкспрессией EGFR и/или с экспрессией c-Met.

В настоящей заявке предложена выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина, содержащая первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый и второй домены FN3 содержат цистеиновые замены в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 и 93, которая специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (с-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.

Другой аспект изобретения представляет собой химически конъюгированную выделенную биспецифическую молекулу с внедренными остатками цистеина, причем биспецифическая молекула ковалентно присоединена к химическому реагенту, содержащему малеимидный фрагмент.

Дополнительный аспект изобретения представляет собой способ получения выделенных биспеци

- 3 035745 фических FN3 с внедренными остатками цистеина путем мутагенеза нуклеотидной последовательности исходной биспецифической молекулы FN3 с заменой одного или более аминокислотных остатков на цистеиновые остатки для кодирования биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина; экспрессии молекулы с внедренными остатками цистеина; и выделения биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A и 1B. Выравнивание аминокислотной последовательности EGFR-связывающих доменов FN3. В прямоугольники заключены петли BC и FG в остатках 22-28 и 75-86 в SEQ ID NO: 18. Некоторые варианты включают в себя повышающие термическую стабильность замены L17A, N46K и E86I (нумерация остатков соответствует Tencon SEQ ID NO: 1).

Фиг. 2. Структуры цитотоксин/линкер.

Фиг. 3. Ленточное представление кристаллической структуры белка P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27). Конечные положения, определенные как толерантные к цистеиновым заменам, показаны штифтами и окрашены сплошным черным цветом. Связующие петли BC/FG показаны затененным серым цветом.

Фиг. 4. Выравнивание последовательностей каркаса Tencon27 (SEQ ID NO: 99) и библиотеки TCL14 (SEQ ID NO: 100), имеющей рандомизированную альтернативную поверхность C-CD-F-FG. Остатки петли заключены в прямоугольники. Над последовательностями указаны петли и тяжи.

Фиг. 5A и 5B. Выравнивание последовательности c-Met-связывающих доменов FN3. Петля C и тяж CD, а также петля F и тяж FG заключены в прямоугольники и охватывают остатки 29-43 и 65-81.

Фиг. 6. Показано ингибирование фосфорилирования c-Met в клетках H292, предварительно обработанных моноспецифическими или биспецифическими молекулами, содержащими домены FN3, и стимулированных HGF. Наблюдали существенное увеличение эффективности биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ECB1) по сравнению с моноспецифическим c-Met-связывающим доменом FN3 (P114AR5P74A5, показан на фигуре как элемент A5), используемым отдельно или в комбинации с EGFRсвязывающим доменом FN3 (P54AR4-83v2, показан на фигуре как элемент 83v2).

Фиг. 7. Ингибирование фосфорилирования EGFR и c-Met в клетках, предварительно обработанных моноспецифическими или биспецифическими молекулами, содержащими домены FN3. В клеточных линиях с высокими уровнями экспрессии EGFR, H292 (A) и H596 (B) анти-EGFR моноспецифические и биспецифические молекулы, содержащие домены FN3, в равной степени эффективно могут уменьшать фосфорилирование EGFR. В клеточных линиях с низкими уровнями экспрессии EGFR относительно cMet, H441 (C), биспецифические к EGFR/c-Met молекулы повышают эффективность ингибирования фосфорилирования EGFR по сравнению только с моноспецифическим EGFR-связывающим доменом FN3. В клеточных линиях с низкими уровнями экспрессии c-Met относительно EGFR, H292 (D) и H596 (E), ингибирование фосфорилирования c-Met существенно усиливалось при использовании биспецифической к EGFR/c-Met молекулы по сравнению только с моноспецифическим c-Met-связывающим доменом FN3. В исследовании использовали следующие молекулы: биспецифическая ECB5 (показана на фигуре как элемент 17-A3), моноспецифический EGFR-связывающий домен FN3 P53A1R5-17 (показан на фигуре как элемент 17), биспецифическая к EGFR/c-Met молекула ECB3 (показана на фигуре как элемент 83-H9) и моноспецифический c-Met-связывающий домен FN3 P114AR7P93-H9 (показан на фигуре как элемент H9).

Фиг. 8. Показана фармакодинамическая сигнализация в опухолях, выделенных у мышей, получавших дозы биспецифических к EGFR/c-Met молекул в течение 6 или 72 ч. Все молекулы в значительной степени снижали фосфорилирование c-Met, EGFR и ERK как через 6 ч, так и через 72 ч, причем степень ингибирования зависела от аффинности доменов FN3 к EGFR и/или c-Met. Биспецифические молекулы создавали путем соединения EGFR-связывающего домена FN3 с высокой (показано как элемент 83, p54AR4-83v2) или средней (показано на фигуре как элемент 17v2, P53A1R5-17v2) аффинностью с c-Metсвязывающим доменом FN3 с высокой (показано на фигуре как элемент A3, P114AR7P94-A3) или средней (показано на фигуре как элемент A5, P114AR5P74-A5) аффинностью.

Фиг. 9. Накопление в плазме (сверху) и опухоли (снизу) биспецифических к EGFR/c-Met молекул с различными значениями аффинности, связанных с альбумин-связывающим доменом (ABD), показано через 6 ч (слева) и 72 ч (справа) после интраперитонеального (и/п) введения. Через шесть часов после введения накопление в опухоли было максимальным у мышей, получавших биспецифическую молекулу, в которой удерживается EGFR-связывающий домен FN3 (17v2) со средней аффинностью или c-Metсвязывающий домен (83v2) с высокой аффинностью.

Биспецифические молекулы включали следующие EGFR- или c-Met-связывающие домены FN3 со средней или высокой аффинностью: 83v2-A5-ABD (ECB18; высокая/средняя к EGFR/cMet); 83v2-A3ABD (ECB38; высокая/высокая); 17v2-A5 (ECB28; средняя/средняя); 17v2-A3-ABD (ECB39; средняя/высокая). 83v2 обозначает p54AR4-83v2; 17v2 обозначает p53A1R5-17v2; A3 обозначает p114AR7P94-A3; A5 обозначает p114AR5P74-A5.

Фиг. 10. Ксенотрансплантаты опухоли H292-HGF имплантировали мышам линии SCID Beige. Когда опухоли достигали среднего объема приблизительно 80 мм³, мышам три раза в неделю вводили биспецифические к EGFR/c-Met молекулы (25 мг/кг) или носитель PBS. Все биспецифические молекулы

- 4 035745 уменьшали рост опухоли, причем ингибирование роста опухоли (TGI) зависело от аффинности молекул к c-Met и EGFR (высокая EGFR - высокая cMet обозначает p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3 (ECB38); высокая EGFR - средняя cMet обозначает p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5 (ECB18); средняя EGFR - высокая cMet обозначает p53A1R5-17v2-p114AR7P94-A3 (ECB39); средняя EGFR - средняя -cMet обозначает p53A1R5-17-p114AR5P74-A 5 (ECB28)).

Фиг. 11. Ксенотрансплантаты опухоли H292-HGF имплантировали мышам линии SCID Beige и проводили обработку разными терапевтическими средствами. Показана противоопухолевая активность терапевтических средств (биспецифическая к EGFR/c-Met молекула обозначает p54AR4-83v2p114AR7P94-A3-ABD (ECB38); другие лекарственные препараты представляют собой кризотиниб, эрлотиниб, цетуксимаб и комбинацию кризотиниба и эрлотиниба).

Подробное описание изобретения

Применяемый в настоящем документе термин домен фибронектина типа III (FN3) (домен FN3) относится к домену, часто встречающемуся в белках, включая фибронектины, тенасцин, белки внутриклеточного цитоскелета, цитокиновые рецепторы и прокариотические ферменты (Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265: 15659-15665, 1990). Примеры доменов FN3 представляют собой 15 разных доменов FN3, присутствующих в тенасцине C человека, 15 разных доменов FN3, присутствующих в фибронектине (FN) человека, и синтетические домены FN3 неприродного происхождения, описанные, например, в патентной публикации США № 2010/0216708. Отдельные домены FN3 называют по номеру домена и названию белка, например, 3-й домен FN3 тенасцина (TN3) или 10-й домен FN3 фибронектина (FN10).

Применяемый в настоящем документе термин замена, или замещенный, или мутация, или мутированный относится к изменению, делеции или вставке одной или более аминокислот или нуклеотидов в последовательности полипептида или полинуклеотида для создания варианта этой последовательности.

Применяемый в настоящем документе термин рандомизация, или рандомизированный, или диверсифицированный, или диверсификация относится к выполнению по меньшей мере одной замены, вставки или делеции в последовательности полинуклеотида или полипептида.

Применяемый в настоящем документе термин вариант относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или более модификациями, например, заменами, вставками или делециями.

Применяемый в настоящем документе термин специфически связывается или специфическое связывание относится к способности домена FN3 изобретения связываться с заданным антигеном с константой диссоциации (KD) 1 х 10^-6 М или менее, например 1 х 10^-7 М или менее, 1х10^-8 М или менее, 1х10^-9М или менее, 1х10^-10 М или менее, 1х10^-11 М или менее, 1х10^-12 М или менее или 1х10^-13 М или менее. Как правило, домен FN3 изобретения связывается с заданным антигеном (т.е. EGFR или c-Met) с K_D, которая, по меньшей мере, в десять раз меньше его KD для неспецифического антигена (например, BSA или казеин), что измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием, например, прибора Proteon (BioRad). Таким образом, биспецифическая к EGFR/c-Met молекула изобретения, содержащая домен FN3, специфически связывается как с EGFR, так и с c-Met с аффиностью связывания (KD), по меньшей мере 1х 10^-6 М или менее как для EGFR, так и для c-Met. Однако выделенный домен FN3 изобретения, который специфически связывается с заданным антигеном, может иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, с таким же заданным антигеном другого вида (гомологи).

Термин библиотека относится к группе вариантов. Библиотека может быть образована из вариантов полипептида или полинуклеотида.

Применяемый в настоящем документе термин стабильность относится к способности молекулы сохранять свернутое состояние в физиологических условиях, так чтобы сохранять по меньшей мере одну из своих обычных функциональных возможностей, например способность связываться с заданным антигеном, таким как EGFR или c-Met.

Применяемый в настоящем документе термин рецептор эпидермального фактора роста или EGFR относится к EGFR человека (также известному как HER-1 или Erb-B1 (Ullrich et al., Nature 309:418-425, 1984) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, и по номеру доступа NP 005219 в GenBank, а также ее вариантам природного происхождения. К таким вариантам относятся хорошо известный вариант EGFRvIII и другие варианты альтернативного сплайсинга (например, обозначенные в SwissProt номерами доступа P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4), варианты GLN-98, ARG266, Lys-521, ILE-674, GLY-962 и PRO-988 (Livingston et al., NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHS ES15478).

Применяемый в настоящем документе термин лиганд EGFR включает в себя все (например, физиологические) лиганды для EGFR, включая EGF, TGF-α, гепарин-связывающий EGF (HB-EGF), амфирегулин (AR) и эпирегулин (EPI).

Применяемый в настоящем документе термин эпидермальный фактор роста (EGF) относится к

- 5 035745 хорошо известному EGF человека из 53 аминокислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74.

Применяемый в настоящем документе термин рецептор фактора роста гепатоцитов или c-Met относится к c-Met человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 101, или по номеру доступа в GenBank NP_001120972, и ее природным вариантам.

Применяемый в настоящем документе термин фактор роста гепатоцитов (HGF) относится к хорошо известному HGF человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 102, которая расщепляется с образованием димера альфа- и бета-цепи, связанной дисульфидной связью.

Применяемые в настоящем документе на взаимозаменяемой основе термины блокирует связывание или ингибирует связывание относятся к способности доменов FN3 изобретения биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домены FN3, блокировать или ингибировать связывание лиганда EGFR, например EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, и включает в себя как частичное, так и полное блокирование/ингибирование.

Блокирование/ингибирование лиганда EGFR, например, EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, посредством домена FN3 или биспецифической к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащей домен FN3, частично или полностью снижает нормальный уровень сигнализации EGFR и/или сигнализации c-Met по сравнению со связыванием лиганда EGFR с EGFR и/или связыванием HGF с c-Met без блокирования или ингибирования. Домен FN3 или биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, блокирует связывание лиганда EGFR, например, EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, когда ингибирование составляет по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. Ингибирование связывания можно измерить при помощи хорошо известных способов, например путем измерения ингибирования связывания биотинилированного EGF на экспрессирующих EGFR клетках A431, которые подвергали воздействию домена FN3 или биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, с помощью FACS и с применением способов, описанных в настоящем документе, или путем измерения связывания биотинилированного HGF с внеклеточным доменом c-Met с применением хорошо известных способов и способов, описанных в настоящем документе.

Термин сигнализация EGFR относится к трансдукции сигнала, индуцированной связыванием лиганда EGFR с EGFR, что приводит к аутофосфорилированию по меньшей мере одного тирозинового остатка в EGFR. Пример лиганда EGFR представляет собой EGF.

Применяемый в настоящем документе термин нейтрализует сигнализацию EGFR относится к способности домена FN3 изобретения ингибировать EGFR-сигнализацию, индуцируемую лигандом EGFR, таким как EGF, по меньшей мере, на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

Термин сигнализация c-Met относится к трансдукции сигнала, индуцированной связыванием HGF с c-Met, что приводит к аутофосфорилированию, по меньшей мере, одного тирозинового остатка в c-Met. Как правило, по меньшей мере, один тирозиновый остаток в положениях 1230, 1234 или 1235 после связывания HGF подвергается аутофосфорилированию.

Применяемый в настоящем документе термин нейтрализует сигнализацию c-Met относится к способности домена FN3 изобретения ингибировать сигнализацию c-Met, индуцируемую HGF, по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

Применяемые в настоящем документе на взаимозаменяемой основе термины сверхэкспрессия, сверхэкспрессируемый и сверхэкспрессирующий относятся к раковой или злокачественной клетке, которая имеет на поверхности повышенные до определенной степени уровни EGFR и/или c-Met по сравнению с нормальной клеткой из ткани того же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией генов или повышенной транскрипцией или трансляцией. Экспрессию и сверхэкспрессию EGFR и/или c-Met можно измерить, применяя хорошо известные анализы, например, ИФА, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию или радиоиммунный анализ на живых или лизированных клетках. Альтернативно или дополнительно уровни молекул нуклеиновых кислот, кодирующих EGFR и/или c-Met, можно измерить в клетке, например, применяя флуоресцентную гибридизацию in situ, саузернблоттинг или ПЦР. Сверхэкспрессия EGFR и/или c-Met означает, что уровень EGFR и/или c-Met на поверхности клетки по меньшей мере в 1,5 раза выше по сравнению с уровнем нормальной клетки.

Применяемый в настоящем документе термин Tencon относится к синтетическому домену фибронектина типа III (FN3) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 и описанной в патентной публикации США № US 2010/0216708.

Применяемый в настоящем документе термин раковая клетка или опухолевая клетка относится к раковой, предраковой или преобразованной клетке либо in vivo, либо ex vivo и к культуре клеток, которая имеет спонтанные или индуцированные фенотипические изменения, которые не обязательно затрагивают получение нового генетического материала. Хотя преобразование может быть вызвано инфицированием преобразующим вирусом и встраиванием новой геномной нуклеиновой кислоты или поглощением экзогенной нуклеиновой кислоты, оно также может возникнуть спонтанно или после воздействия канцерогена, в результате чего происходит мутация эндогенного гена. Преобразование/рак проявляется, например, в морфологических изменениях, иммортализации клеток, нарушении контроля роста, образо

- 6 035745 вании очагов, пролиферации, злокачественности, уровнях маркеров, специфичных для опухоли, инвазивности, росте опухоли или ее подавлении у подходящих животных-хозяев, таких как бестимусные мыши и т.п., in vitro, in vivo и ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).

Термин вектор обозначает полинуклеотид, способный к воспроизведению внутри биологической системы, или который можно переместить между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или маркеры выбора, способствующие воспроизведению или сохранению этих полинуклеотидов в биологической системе. Примеры таких биологических систем могут включать в себя клетку, вирус, животное, растение и реконструированные биологические системы, в которых используются биологические компоненты, способные к воспроизведению вектора. Полинуклеотид, который является вектором, может представлять собой молекулы ДНК или РНК или их гибрид.

Термин вектор экспрессии обозначает вектор, который можно использовать в биологической системе или реконструированной биологической системе для прямой трансляции полипептида, закодированного полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторе экспрессии.

Термин полинуклеотид обозначает молекулу, содержащую цепь нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную основную цепь или другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. Двухцепочечные и одноцепочечные молекулы ДНК и РНК представляют собой типичные примеры полинуклеотидов.

Термин полипептид, или белок, обозначает молекулу, которая содержит по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью с образованием полипептида. Малые полипептиды, содержащие менее чем приблизительно 50 аминокислот, могут называться пептидами.

Применяемый в настоящем документе термин биспецифическая к EGFR/c-Met молекула или биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3 относится к молекуле, содержащей EGFR-связывающий домен FN3 и отдельный c-Met-связывающий домен FN3, которые ковалентно связаны либо напрямую, либо посредством линкера. Пример биспецифической к EGFR/c-Met молекулы содержит первый домен FN3, специфически связывающий EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающий c-Met.

Применяемый в настоящем документе термин валентный относится к наличию в молекуле установленного числа сайтов связывания, специфичных для антигена. Таким образом, термины одновалентный, двухвалентный, четырехвалентный и шестивалентный относятся к наличию в молекуле соответственно одного, двух, четырех и шести сайтов связывания, специфичных для антигена.

Применяемый в настоящем документе термин смесь относится к образцу или препарату из двух или более доменов FN3, не связанных вместе ковалентной связью. Смесь может состоять из двух или более идентичных доменов FN3 или разных доменов FN3.

Композиции настоящего изобретения

В настоящем изобретении предложены моноспецифические и биспецифические EGFR- и/или cMet-связывающие молекулы, содержащие домены FN3, с внедренными остатками цистеина, а также способы их получения и применения.

Моноспецифические EGFR-связывающие молекулы

В настоящем изобретении предложены домены фибронектина типа III (FN3), которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокируют связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR и, следовательно, могут широко применяться в терапии и диагностике. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие домены FN3 изобретения, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.

Домены FN3 изобретения связываются с EGFR с высокой аффинностью, ингибируют сигнализацию EGFR и могут обеспечивать благоприятный эффект в плане специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами EGFR и иметь улучшенное проникание в ткани по сравнению с традиционными терапевтическими средствами на основе антител.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR.

Домены FN3 изобретения могут блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 1х 10^-7 M, менее чем приблизительно 1 х 10^-8 М, менее чем приблизительно 1х 10^-9 М, менее чем приблизительно 1х 10^-10 M, менее чем приблизительно 1х 10^-11 М или менее чем приблизительно 1 х 10^-12 M в конкурентном анализе с использованием клеток A431 и обнаружения величины флуоресценции от связанного биотинилированного EGF с использованием конъюгата стрептавидин-фикоэритрин при 600 нм в клетках A431, инкубированных с доменами FN3 изобретения или без них. Примеры доменов FN3 могут блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC₅₀ в диапазоне от около 1 х 10^-9 М до около 1х10^-7 М, например EGFR-связывающие домены FN3 с аминокислотной последовательностью

- 7 035745

SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137. Домены FN3 изобретения могут блокировать связывание EGF с EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием EGF с EGFR в отсутствие доменов FN3 изобретения при использовании одинаковых условий анализа.

Домен FN3 изобретения может ингибировать сигнализацию EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие доменов FN3 изобретения при использовании одинаковых условий анализа.

Связывание лиганда, например EGF с EGFR, стимулирует димеризацию рецепторов, аутофосфорилирование, активацию внутреннего рецептора, цитоплазматического тирозинкиназного домена и инициирование множества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Ингибирование сигнализации EGFR может приводить к ингибированию одного или более расположенных ниже сигнальных путей EGFR, и, следовательно, нейтрализация EGFR может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование.

Сигнализацию EGFR можно измерять различными известными способами, например, путем измерения аутофосфорилирования рецептора по любому из тирозиновых остатков Y1068, Y1148 и Y1173 (Downward et al., Nature 311:483-5, 1984) и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Фосфорилирование можно обнаруживать хорошо известными способами, такими как анализ ИФА или вестерн-блоттинг, с применением антитела, специфического к фосфотирозину. Примеры анализа можно найти в Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 и Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998.

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 2,5х10^-6 М, например, менее чем приблизительно 1х 10^-6 M, менее чем приблизительно 1х10^-7 M, менее чем приблизительно 1х10^-8 М, менее чем приблизительно 1х10^-9 М, менее чем приблизительно 1х10^-10 M, менее чем приблизительно 1х 10^-11 М или менее чем приблизительно 1 х 10^-12 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF.

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ от около 1,8х10^-8М до около 2,5х10^-6 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF. Такие примеры доменов FN3 представляют собой домены с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения связывает человеческий EGFR с константой диссоциации (KD) менее чем приблизительно 1х 10^-8 М, например, менее чем приблизительно 1х 10^-9М, менее чем приблизительно 1х 10^-10 М, менее чем приблизительно 1х 10^-11 М, менее чем приблизительно 1х 10^-12 М или менее чем приблизительно 1х 10^-1 М при определении методом поверхностного плазмонного резонанса или методом кинетического исключения (Kinexa), известным специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления домен FN3 изобретения связывается с человеческим EGFR с KD в диапазоне от около 2х10^-10 М до около 1х 10^-8 М. Аффинность домена FN3 к EGFR можно определить экспериментально с применением любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); а также способы, описанные в настоящем документе). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре домен FN3 - антиген может изменяться при измерении в разных условиях (например, осмолярность, pH). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, K_on, K_off) предпочтительно выполняют с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, такого как буфер, описанный в настоящем документе.

Примеры доменов FN3 изобретения, которые связываются с EGFR, включают в себя домены FN3 с SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.

В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с EGFR, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 87% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.

В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с EGFR, содержит петлю FG, содержащую последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), где X₉ представляет собой M или I; и петлю BC, содержащую последовательность X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); где

X1 представляет собой A, T, G или D;

X₂ представляет собой A, D, Y или W;

X3 представляет собой P, D или N;

X₄ представляет собой L или отсутствует;

- 8 035745

X₅ представляет собой D, H, R, G, Y или W;

X6 представляет собой G, D или A;

X₇ представляет собой A, F, G, H или D и

X8 представляет собой Y, F или L.

Домены FN3 изобретения, которые специфически связываются с EGFR и ингибируют аутофосфорилирование EGFR, могут содержать в качестве структурного элемента петлю FG, которая содержит последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), где X₉ представляет собой M или I. Такие домены FN3 могут дополнительно содержать петлю BC длиной 8 или 9 аминокислот, которая описана последовательностью X₁X₂X₃X₄X₅X6X₇X₈(SEQ ID NO: 181), и могут ингибировать аутофосфорилирование EGFR со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 2,5x10-6 М и со значением IC₅₀ в диапазоне от около 1,8x10-8 М до около 2,5x10-6 М при измерении в клетках A431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF.

Домены FN3 изобретения, которые специфически связываются с EGFR и ингибируют аутофосфорилирование EGFR, дополнительно содержат последовательность

ILPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVS IYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182) или последовательность

ILPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), где

X₁ представляет собой A, Т, G или D;

X₂ представляет собой A, D, Y или W;

X₃ представляет собой P, D или N;

X₄ представляет собой L или отсутствует;

X₅ представляет собой D, H, R, G, Y или W;

X₆ представляет собой G, D или A;

X₇ представляет собой A, F, G, H или D;

X₈ представляет собой Y, F или L и

X₉ представляет собой M или I.

EGFR-связывающие домены FN3 можно создать и протестировать на способность ингибировать аутофосфорилирование EGFR с использованием известных способов и способов, описанных в настоящем документе.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR, причем домен FN3 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.

В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающие домены FN3 содержат инициаторметионин (Met), связанный с N-концом, или цистеин (Cys), связанный с C-концом конкретного домена FN3, например, для облегчения экспрессии и/или конъюгации с молекулами, увеличивающими период полужизни.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, причем домен FN3 выделен из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.

Моноспецифические c-Met-связывающие молекулы

В настоящем изобретении предложены домены фибронектина типа III (FN3), которые специфически связываются с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокируют связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met и, следовательно, могут широко применяться в терапии и диагностике. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие домены FN3 изобретения, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.

Домены FN3 изобретения связываются с c-Met с высокой аффинностью, ингибируя сигнализацию c-Met, могут обеспечивать благоприятный эффект в отношении специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами c-Met и иметь улучшенное проникновение в ткани по сравнению с традиционными терапевтическими средствами на основе антител. Домены FN3 изобретения являются одновалентными, и, следовательно, предотвращается нежелательная кластеризация и активация рецептора, которая возможна при использовании других двухвалентных молекул.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.

Домены FN3 изобретения могут блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 1x10-7 М, менее чем приблизительно 1x10-⁸ M, менее чем приблизительно 1x10-⁹ M, менее чем приблизительно 1x10-¹⁰ M, менее чем приблизительно 1x10-11 М или менее чем приблизительно

- 9 035745

1x 10^-12 M в анализе на обнаружение ингибирования связывания биотинилированного HGF со слитным белком c-Met-Fc в присутствии доменов FN3 изобретения. Примеры доменов FN3 могут блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC₅₀ от около 2x10^-10 М до около 6x10^-8. Домены FN3 изобретения могут блокировать связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% по сравнению со связыванием HGF с c-Met в отсутствие доменов FN3 изобретения при использовании одинаковых условий анализа.

Домен FN3 изобретения может ингибировать сигнализацию c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие доменов FN3 изобретения при использовании одинаковых условий анализа.

Связывание лиганда, например, HGF с c-Met, стимулирует димеризацию рецептора, аутофосфорилирование, активацию внутреннего рецептора, цитоплазматического тирозинкиназного домена и инициирование множества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Ингибирование сигнализации c-Met может приводить к ингибированию в одном или более расположенных ниже сигнальных путях передачи c-Met, и, следовательно, нейтрализация c-Met может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование.

Сигнализацию c-Met можно измерять различными известными способами, например, путем измерения аутофосфорилирования рецептора, по меньшей мере, одного из тирозиновых остатков Y1230, Y1234 или I1235 и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Фосфорилирование можно обнаруживать, например, при помощи антитела, специфического к фосфотирозину, в анализе методом ИФА или вестерн-блоттинга. Некоторые анализы активности тирозинкиназ (Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997; Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998).

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 1 x 10^-6 M, менее чем приблизительно 1 x 10^-7 M, менее чем приблизительно 1x10^-8 М, менее чем приблизительно 1x10-9 М, менее чем приблизительно 1x 10^-10 M, менее чем приблизительно 1x 10^-11 M или менее чем приблизительно 1 x 10^-12 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF.

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении Y1349 со значением IC50 в диапазоне от около 4x10^-9 М до около 1x 10^-6 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF.

В одном варианте осуществления домен FN3 изобретения связывает человеческий c-Met с константой диссоциации (KD), которая равна или менее чем приблизительно 1x 10^-7 М, 1x 10^-8 М, 1x 10^-9 М, 1x 10^-10М, 1x 10^-11 М, 1x 10^-12 М, 1x 10^-13 М, 1x 10^-14 М или 1x 10^-15 М в соответствии с данными поверхностного плазмонного резонанса или метода Kinexa, известного специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления домен FN3 изобретения связывается с человеческим c-Met с KD от около 3x10^-10М до около 5x10^-8 М. Аффинность домена FN3 к c-Met можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); а также способы, описанные в настоящем документе). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре домен FN3 - антиген может изменяться при измерении в разных условиях (например, осмолярность, pH). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, K_on, K_off) предпочтительно выполняют с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, такого как буфер, описанный в настоящем документе.

Примеры доменов FN3 изобретения, которые связываются с c-Met, включают в себя домены FN3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.

В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с c-Met, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 83% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.

В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с c-Met, содержит тяж C и петлю CD, содержащую последовательность DSFX10IRYX11E X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆ (SEQ ID NO: 184), где

X₁₀ представляет собой W, F или V;

X11 представляет собой D, F или L;

X₁₂ представляет собой V, F или L;

X₁₃ представляет собой V, L или T;

X₁₄ представляет собой V, R, G, L, T или S;

X₁₅ представляет собой G, S, A, T или K и

- 10 035745

X16 представляет собой E или D; и тяж F и петлю FG, содержащую последовательность TEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), где

X₁₇ представляет собой Y, W, I, V, G или A;

X₁₈ представляет собой N, T, Q или G;

X₁₉ представляет собой L, М, N или I;

X₂₀ представляет собой G или S;

X₂₁ представляет собой S, L, G, Y, T, R, H или K;

X22 представляет собой I, V или L и

X₂₃ представляет собой V, T, Н, I, P, Y, Т или L.

Домены FN3 изобретения, которые специфически связываются с c-Met и ингибируют аутофосфорилирование c-Met, дополнительно содержат последовательность

LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXiqIRYXiiE X12X13X14X15GX16

AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXi7VXi₈IXi₉X2oVKGGX2iX22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO : 18 6) , где

X₁₀ представляет собой W, F или V;

X11 представляет собой D, F или L;

X₁₂ представляет собой V, F или L;

X₁₃ представляет собой V, L или T;

X₁₄ представляет собой V, R, G, L, T или S;

X₁₅ представляет собой G, S, A, T или K;

X₁₆ представляет собой E или D;

X₁₇ представляет собой Y, W, I, V, G или A;

X₁₈ представляет собой N, T, Q или G;

X₁₉ представляет собой L, М, N или I;

X₂₀ представляет собой G или S;

X₂₁ представляет собой S, L, G, Y, T, R, H или K;

X22 представляет собой I, V или L и

X23 представляет собой V, T, Н, I, P, Y, T или L.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met, причем домен FN3 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, причем домен FN3 выделен из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.

Выделение EGFR- или c-Met-связывающих доменов FN3 из библиотеки, основанной на последовательности Tencon

Tencon (SEQ ID NO: 1) представляет собой домен фибронектина типа III (FN3) неприродного происхождения, разработанный на основе консенсусной последовательности пятнадцати доменов FN3 тенасцина-С человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; патентная публикация США № 2010/0216708). Кристаллическая структура Tencon демонстрирует шесть открытых на поверхности петель, соединяющих семь бета-тяжей, характерных для доменов FN3, причем бета-тяжи обозначены как A, B, C, D, E, F и G, а петли обозначены как AB, BC, CD, DE, EF и FG (Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; патент США № 6673901). Эти петли или выбранные остатки в пределах каждой петли можно рандомизировать для конструирования библиотек доменов фибронектина типа III (FN3), которые можно применять для выбора новых молекул, связывающихся с EGFR. В табл. 1 представлены положения и последовательности каждой петли и бета-тяжа в Tencon (SEQ ID NO: 1).

Таким образом, библиотека, разработанная на основе последовательности Tencon, может иметь рандомизированную петлю FG или рандомизированные петли BC и FG, например, библиотеки TCL1 или TCL2, как описано ниже. Петля BC Tencon имеет длину 7 аминокислот. Таким образом, в библиотеке на основе последовательности Tencon с диверсификацией по петле BC можно рандомизировать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот. Петля FG Tencon имеет длину 7 аминокислот, таким образом, в библиотеке на основе последовательности Tencon с диверсификацией по петле FG можно рандомизировать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот. Дополнительного разнообразия в петлях библиотек Tencon можно достичь путем вставки и/или делеций остатков в петлях. Например, петли FG и/или BC можно расширить на 1-22 аминокислоты или уменьшить на 1-3 аминокислоты. Петля FG в Tencon имеет длину 7 аминокислот, тогда как соответствующая петля в тяжелых цепях антител имеет длину в диапазоне от 4 до 28 остатков. Для обеспечения максимального разнообразия петлю FG можно диверсифицировать в последовательности, а также по длине для соответствия диапазону длины CDR3 антитела из 4-28 остатков. Например, петлю FG можно дополнительно диверсифицировать по длине, удлинив ее на дополнительные 1, 2, 3, 4 или 5 ами

- 11 035745 нокислот.

Библиотека, разработанная на основе последовательности Tencon, также может иметь альтернативные рандомизированные поверхности, образованные сбоку от домена FN3 и содержащие два или более бета-тяжей и, по меньшей мере, одну петлю. Одна такая альтернативная поверхность образована аминокислотами в бета-тяжах С и F и в петлях CD и FG (поверхность C-CD-F-FG). Разработка библиотеки, основанной на альтернативной поверхности C-CD-F-FG в Tencon, показана на фиг. 4, и подробное создание таких библиотек описано в заявке на патент США № 13/852,930.

Библиотеки, разработанные на основе последовательности Tencon, также включают в себя библиотеки, разработанные на основе вариантов Tencon, таких как варианты Tencon, имеющие замены в положениях остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86 (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 1), и такие варианты демонстрируют повышенную термическую стабильность. Примеры вариантов Tencon описаны в патентной публикации США № 2011/0274623 и включают в себя Tencon 27 (SEQ ID NO: 99), имеющую замены E11R, L17A, N46V, E86I по сравнению с Tencon с SEQ ID NO: 1.

Библиотеки на основе Tencon и другой последовательности FN3 можно рандомизировать по выбранным положениям остатков с использованием случайного или определенного набора аминокислот. Например, варианты библиотеки, имеющие случайные замены, можно создать с использованием кодонов NNK, которые кодируют все 20 аминокислот природного происхождения. В других схемах диверсификации можно применять кодоны DVK для кодирования аминокислот Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys. Альтернативно для получения всех 20 аминокислотных остатков и одновременного снижения частоты стоп-кодонов можно применять кодоны NNS. Библиотеки доменов FN3 со смещенным распределением аминокислот в диверсифицируемых положениях можно синтезировать, например, с использованием технологии Slonomics® (http:_//www_sloning_com). В данной технологии применяют библиотеку предварительно приготовленных двухцепочечных триплетов, которые выступают в качестве универсальных строительных блоков, достаточных для тысяч процессов синтеза генов. В библиотеке триплетов представлены все возможные комбинации последовательностей, необходимые для построения любой желаемой молекулы ДНК. Для обозначения кодонов используется хорошо известный код IUB.

Домены FN3 изобретения, специфически связывающие EGFR или c-Met, можно выделить путем получения библиотеки FN3, такой как библиотека Tencon, с использованием cis-дисплея для лигирования фрагментов ДНК, кодирующих каркасные белки, с фрагментом ДНК, кодирующим RepA, для создания пула комплексов белок - ДНК, образованных после трансляции in vitro, причем каждый белок стабильно связан с кодирующей его ДНК (патент США № 7,842,476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004), и анализа библиотеки на специфическое связывание с EGFR и/или c-Met любым способом, известным в данной области или описанным в примере. Примеры хорошо известных способов, которые можно применять, представляют собой ИФА, иммуноанализ сэндвич-типа и конкурентный и неконкурентный анализы (см., например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Дополнительно характеризуют идентифицированные домены FN3, специфически связывающие EGFR или c-Met, по способности блокировать связывание лиганда EGFR, например, EGF, с EGFR, или связывание HGF с c-Met, а также по способности ингибировать сиг

- 12 035745 нализацию EGFR и/или c-Met с применением способов, описанных в настоящем документе.

Домены FN3 изобретения, специфически связывающие EGFR или c-Met, можно создавать, применяя любой домен FN3 в качестве матрицы для создания библиотеки и проведения скрининга в библиотеке молекул, специфически связывающих EGFR или c-Met, с применением предложенных в ней способов. Примеры подходящих для применения доменов FN3 включают в себя 3-й домен FN3 тенасцина С (TN3) (SEQ ID NO: 75), Fibcon (SEQ ID NO: 76) и 10-й домен FN3 фибронектина (FN10) (SEQ ID NO: 77). Применяют стандартные методики клонирования и экспрессии для клонирования библиотек в вектор или синтеза кассет библиотеки с двухцепочечной кДНК, чтобы экспрессировать библиотеки или транслировать их in vitro. Например, можно использовать рибосомный дисплей (Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), мРНК-дисплей (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997) или другие бесклеточные системы (патент США № 5,643,768). Библиотеки вариантов домена FN3 можно экспрессировать как слитные белки, отображающиеся на поверхности, например, любого подходящего бактериофага. Хорошо известны способы отображения слитных полипептидов на поверхности бактериофага (патентная публикация США № 2011/0118144; международная патентная публикация № WO 2009/085462; патент США № 6969108; патент США № 6172197; патент США № 5223409; патент США № 6582915; патент США № 6472147).

Домены FN3 изобретения, специфически связывающие EGFR или c-Met, можно модифицировать для улучшения их свойств, например, улучшения термической стабильности и обратимости термического свертывания и развертывания. Для повышения эффективной термической стабильности белков и ферментов использовали ряд способов, включая рациональную конфигурацию, основанную на сравнении с термостабильными последовательностями с высокой степенью сходства, конфигурацию стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации для повышения склонности к образованию альфа-спирали, конструирование солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и композицию консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). Высокая термическая стабильность может повышать выход экспрессируемого белка, растворимость или активность, снижать иммуногенность и минимизировать необходимость в холодной линии при производстве. Остатки, в которые можно ввести замены для повышения термической стабильности Tencon (SEQ ID NO: 1), представляют собой положения остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86, как описано в патентной публикации США № 2011/0274623. Замены, соответствующие этим остаткам, можно вводить в домены FN3 или в биспецифические молекулы изобретения, содержащие домены FN3.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137, и дополнительно содержит замены в одном или более положениях остатков, соответствующих положениям 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1).

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32-49, 111-114, и дополнительно содержит замены в одном или более положениях остатков, соответствующих положениям 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1).

Примеры замен представляют собой замены E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y и E86I (нумерация соответствует SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления домены FN3 изобретения содержат замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).

Домены FN3, специфически связывающие EGFR (фиг. 1), имеют удлиненную петлю FG по сравнению с Tencon (SEQ ID NO: 1). Следовательно, остатки, соответствующие остаткам 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1), представляют собой остатки 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 91 в доменах FN3 EGFR, показанных на фиг. 1A и 1B, кроме домена FN3 с SEQ ID NO: 24, в котором соответствующие остатки представляют собой остатки 11, 14, 17, 38, 74 и 92 вследствие вставки одной аминокислоты в петлю BC.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137, и необязательно имеет замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления изобретения предложен выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114, и необязательно имеет замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).

Измерение стабильности белка и лабильности белка можно рассматривать как один или разные аспекты целостности белка.

Белки чувствительны, или лабильны, при денатурации, вызванной нагревом, ультрафиолетовым или ионизирующим излучением, изменениями осмолярности окружающей среды и pH при нахождении в жидком растворе, механическим сдвиговым усилием, вызванным фильтрованием через поры малого

- 13 035745 размера, ультрафиолетовым излучением, ионизирующим излучением, таким как гамма-облучение, химической или термической дегидратацией или любым другим воздействием или усилием, которые могут привести к разрушению структуры белка. Стабильность молекулы можно определить с применением стандартных способов. Например, стабильность молекулы можно определить путем измерения температуры термического плавления (TM) - температуры в градусах Цельсия (°C), при которой половина молекул разворачивается, с применением стандартных способов. Как правило, чем выше TM, тем более стабильной является молекула. Помимо нагрева способность белка сохранять конкретную трехмерную структуру также может изменяться в зависимости от химической среды.

В одном варианте осуществления домены FN3 изобретения, связывающие EGFR или c-Met, демонстрируют стабильность, повышенную по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более по сравнению с таким же доменом до конструирования, что измеряется по повышению TM.

Химическую денатурацию аналогичным образом можно измерить различными способами. К химическим денатурирующим соединениям относятся гидрохлорид гуанидина, тиоцианат гуанидина, карбамид, ацетон, органические растворители (диметилформамид, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстановители (например, дитиотреитол, бета-меркаптоэтанол, динитротиобензол и гидриды, такие как борогидрид натрия), неионные и ионные детергенты, кислоты (например, соляная кислота (HCl), уксусная кислота (CH₃COOH), галогенуксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфолипиды) и специализированные денатурирующие соединения. Количественное определение степени денатурации может быть основано на потере функционального свойства, такого как способность связываться с молекулоймишенью, или на физико-химических свойствах, таких как склонность к агрегации, открытие доступа к ранее недоступным растворителю остаткам, или на разрушении или образовании дисульфидных связей.

В одном варианте осуществления домены FN3 изобретения, связывающие EGFR или c-Met, демонстрируют стабильность, повышенную по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более по сравнению с таким же каркасом до конструирования, что измеряется путем применения гидрохлорида гуанидина в качестве химического денатурирующего вещества. Повышение стабильности можно измерять в зависимости от снижения флуоресценции триптофана при обработке повышающимися концентрациями гидрохлорида гуанидина с применением хорошо известных способов.

Домены FN3 изобретения можно создать в виде мономеров, димеров или мультимеров, например, как средство повышения валентности и, следовательно, авидности к связыванию молекулы-мишени или создания би- или мультиспецифических каркасов, одновременно связывающих две или более разных молекулы-мишени. Димеры и мультимеры можно создать путем связывания моноспецифических, биили мультиспецифических белковых каркасов, например, путем включения аминокислотного линкера, например, линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин или аланин и пролин. Примеры линкеров включают в себя (GS)₂, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)₁₀ (SEQ ID NO: 82), (AP)₂₀ (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)₅AAA (SEQ ID NO: 84), линкеры. Димеры и мультимеры могут соединяться друг с другом в направлении от N-конца к C-концу. Применение природных и искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитные полипептиды хорошо известно в литературе (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; патент США № 5 856456).

Биспецифические молекулы, связывающие EGFR и c-Met

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домены FN3, могут обеспечивать благоприятный эффект в плане специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами EGFR и иметь улучшенное проникание в ткани по сравнению с традиционными терапевтическими средствами на основе антител. Настоящее изобретение, по меньшей мере, частично основано на неожиданном открытии того, что биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домены FN3, обеспечивают существенно повышенный синергический ингибиторный эффект по сравнению со смесью EGFR- и c-Met-связывающих доменов FN3. Молекулы можно настроить на конкретную аффинность в отношении как EGFR, так и c-Met для максимального проникновения в опухоль и удержания в ней.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенную биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домены FN3, можно создать путем ковалентного связывания любого EGFR-связывающего домена FN3 и любого c-Met-связывающего домена FN3 напрямую или посредством линкера. Следовательно, первый домен FN3 биспецифической

- 14 035745 молекулы может иметь характеристики, описанные выше применительно к EGFR-связывающим доменам FN3, а второй домен FN3 биспецифической молекулы может иметь характеристики, описанные выше применительно к c-Met-связывающим доменам FN3.

В одном варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 менее чем приблизительно 2,5х10^-6 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование cMet по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 1,5х 10^-6 М при измерении в клетках NCI-H441 с применением 100 нг/мл человеческого HGF.

В другом варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ в диапазоне от около 1,8х10^-8 М до около 2,5х10^-6 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC50 в диапазоне от около 4х10^-9 М до около l,5x 10^-6 M при измерении в клетках NCI-H441 с применением 100 нг/мл человеческого HGF.

В другом варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, связывается с человеческим EGFR с константой диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 1х 10^-8 М, а второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, связывается с человеческим c-Met с K_D менее чем приблизительно 5х 10^-8 М.

В биспецифической молекуле, связывающей как EGFR, так и c-Met, первый домен FN3 связывается с человеческим EGFR с K_D в диапазоне от около 2х10^-10 до около 1х 10^-8 М, а второй домен FN3 связывается с человеческим c-Met с K_D в диапазоне от около 3х10^-10до около 5х10^-8 М.

Аффинность биспецифической к EGFR/c-Met молекулы по отношению к EGFR и c-Met можно определить так, как описано выше для моноспецифических молекул.

Первый домен FN3 в биспецифической к EGFR/c-Met молекуле изобретения может блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC₅₀ в диапазоне от около 1х 10^-9 М до около 1,5х 10^-7 М в анализе с использованием клеток A431 и детекции величины флуоресценции от связанного биотинилированного EGF с использованием конъюгата стрептавидин-фикоэритрин при длине волны 600 нм в клетках A431, инкубированных с первым доменом FN3 или без него. Первый домен FN3 биспецифической к EGFR/cMet молекулы изобретения может блокировать связывание EGF с EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием EGF с EGFR в отсутствие первых доменов FN3 при использовании одинаковых условий анализа.

Второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы изобретения может блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC₅₀ в диапазоне от около 2х10^-10 М до около 6х10^-8 М в анализе на детекцию ингибирования связывания биотинилированного HGF со слитным белком c-Met-Fc в присутствии второго домена FN3. Второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы может блокировать связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием HGF с c-Met в отсутствие второго домена FN3 при использовании одинаковых условий анализа.

Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула изобретения может ингибировать сигнализацию EGFR и/или c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие биспецифической к EGFR/c-Met молекулы изобретения при использовании одинаковых условий анализа.

Сигнализацию EGFR и c-Met можно измерить с применением различных хорошо известных способов, описанных выше применительно к моноспецифическим молекулам.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие первый домен FN3, специфически связывающий EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающий c-Met, обеспечивают значительно более высокое синергичное ингибирование сигнализации EGFR и c-Met и пролиферации опухолевых клеток по сравнению с синергичным ингибированием, наблюдаемым в случае смеси первого и второго доменов FN3. Синергичное ингибирование можно оценивать, например, путем измерения ингибирования фосфорилирования ERK посредством биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, и посредством смеси двух моноспецифических молекул, одна из которых связывается с EGFR, а другая - с c-Met. Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения могут ингибировать фосфорилирование ERK со значением IC₅₀, которое по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньше, например по меньшей мере в 500, 1000, 5000 или 10000 раз меньше по сравнению со значением IC₅₀ для смеси двух моноспецифических доменов FN3, что указывает на по меньшей мере 100-кратно более высокую эффективность биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, по сравнению со смесью двух моноспецифических доменов FN3. Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул,

- 15 035745 содержащих домен FN3, могут ингибировать фосфорилирование ERK со значением IC50 около 5х10^-9 М или менее. Фосфорилирование ERK можно измерять с применением стандартных способов и способов, описанных в настоящем документе.

Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула изобретения, содержащая домен FN3, может ингибировать пролиферацию клеток H292 со значением IC₅₀, которое, по меньшей мере, в 30 раз меньше значения IC₅₀ ингибирования роста клеток H292 смесью первого домена FN3 и второго домена FN3, причем пролиферация клеток индуцируется средой, содержащей 10% FBS с добавлением 7,5 нг/мл HGF. Биспецифическая молекула изобретения может ингибировать пролиферацию опухолевых клеток со значением IC₅₀, которое в около 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или около 1000 раз меньше по сравнению со значением IC₅₀ ингибирования пролиферации опухолевых клеток смесью первого домена FN3 и второго домена FN3. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток можно измерять с применением стандартных способов и способов, описанных в настоящем документе.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем первый домен FN3 содержит петлю FG, содержащую последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), где X₉ представляет собой M или I; и петлю BC, содержащую последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 181), причем

X1 представляет собой A, T, G или D;

X₂ представляет собой A, D, Y или W;

X₃ представляет собой P, D или N;

X₄ представляет собой L или отсутствует;

X₅ представляет собой D, H, R, G, Y или W;

X6 представляет собой G, D или A;

X7 представляет собой A, F, G, H или D;

X₈ представляет собой Y, F или L и второй домен FN3 содержит тяж C и петлю CD, содержащую последовательность DSFX10IRYX11E X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆ (SEQ ID NO: 184), где

X₁₀ представляет собой W, F или V;

X11 представляет собой D, F или L;

X₁₂ представляет собой V, F или L;

X₁₃ представляет собой V, L или T;

X₁₄ представляет собой V, R, G, L, T или S;

X₁₅ представляет собой G, S, A, T или K;

X₁₆ представляет собой E или D и тяж F и петлю FG, содержащую последовательность TEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀V KGGX₂₁X₂₂SX₂₃ (SEQ ID NO: 185), где

X₁₇ представляет собой Y, W, I, V, G или A;

X₁₈ представляет собой N, T, Q или G;

X₁₉ представляет собой L, M, N или I;

X20 представляет собой G или S;

X₂₁ представляет собой S, L, G, Y, T, R, H или K;

X22 представляет собой I, V или L; и

X₂₃ представляет собой V, T, Н, I, P, Y, T или L.

В другом варианте осуществления биспецифическая молекула содержит первый домен FN3, связывающийся с EGFR, который содержит последовательность

LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X₂X₃X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX₉RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182) или последовательность

LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8 DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV LGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), причем в SEQ ID NO: X и X;

X1 представляет собой A, T, G или D;

X₂ представляет собой A, D, Y или W;

X3 представляет собой P, D или N;

X4 представляет собой L или отсутствует;

X₅ представляет собой D, H, R, G, Y или W;

- 16 035745

X6 представляет собой G, D или A;

X7 представляет собой A, F, G, H или D;

X8 представляет собой Y, F или L и

Х₉ представляет собой M или I.

В другом варианте осуществления биспецифическая молекула содержит второй домен FN3, связывающийся с c-Met, который содержит последовательность

LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXiqIRYXiiE X12X13X14X15GX16

AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYXi₇VXi₈IXi9X2oVKGGX2iX22SX₂3PLSAEFTT (SEQ ID

NO : 18 6) , где

X₁₀ представляет собой W, F или V;

X11 представляет собой D, F или L;

X₁₂ представляет собой V, F или L;

X₁₃ представляет собой V, L или T;

X₁₄ представляет собой V, R, G, L, T или S;

X₁₅ представляет собой G, S, A, T или K;

X₁₆ представляет собой E или D;

X17 представляет собой Y, W, I, V, G или A;

X₁₈ представляет собой N, T, Q или G;

X₁₉ представляет собой L, M, N или I;

X20 представляет собой G или S;

X₂₁ представляет собой S, L, G, Y, T, R, H или K;

X₂₂ представляет собой I, V или L; и

X₂₃ представляет собой V, T, Н, I, P, Y, T или L.

Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домены FN3, содержат аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 или 138-165.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения имеют некоторые структурные характеристики, связанные с их функциональными характеристиками, такими как ингибирование аутофосфорилирования EGFR, например петля FG первого домена FN3, связывающегося с EGFR, которая содержит последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), где X₉ представляет собой M или I.

В одном варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домен FN3 ингибируют индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 8х10^-7 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF;

ингибируют индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 8,4х10^-7 М при измерении в клетках NCIH441 с применением 100 нг/мл человеческого HGF;

ингибируют индуцированную HGF пролиферацию клеток NCI-H292 со значением IC50 менее чем приблизительно 9,5х10^-6 М, причем пролиферацию клеток индуцируют 10% FBS, содержащим 7,5 нг HGF;

связываются с EGFR с K_D менее чем приблизительно 2,0х10^-8 М;

связываются с c-Met с KD менее чем приблизительно 2,0х10^-8М.

В другом варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домен FN3 ингибируют индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ в диапазоне от около 4,2х10^-9 М до 8х10^-7 М при измерении в клетках A431 с применением 50 нг/мл человеческого EGF;

ингибируют индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ от около 2,4х10^-8 М до около 8,4х10^-7 М при измерении в клетках NCIH441 с применением 100 нг/мл человеческого HGF;

ингибируют индуцированную HGF пролиферацию клеток NCI-H292 со значением IC50 в диапазоне от около 2,3х10^-8 М до около 9,5х10^-6 М, причем пролиферацию клеток индуцируют 10% FBS, содержащим 7,5 нг HGF;

связываются с EGFR с KD от около 2х10^-10 М до около 2,0х10^-8М;

связываются с c-Met с KD от около 1 х 10^-9 М до около 2,0 х 10^-8 М.

В одном варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы содержат EGFRсвязывающий домен FN3, содержащий последовательность

LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV HNVYKDTNX₉RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182),

- 17 035745 где

X1 представляет собой D;

X2 представляет собой D;

X₃ представляет собой P;

X4 отсутствует;

X5 представляет собой H или W;

X6 представляет собой A;

X7 представляет собой F;

X8 представляет собой Y; и

Х₉ представляет собой M или I; и c-Met-связывающий домен FN3 с последовательностью:

PAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXiqIRYXiiE X12X13X14X15GX16

AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYXi₇VXi₈IXi9X₂oVKGGX2iX22SX23 PLSAEFTT (SEQ

ID NO: 186), где

X₁₀ представляет собой W;

Xu представляет собой F;

X₁₂ представляет собой F;

X₁₃ представляет собой V или L;

X₁₄ представляет собой G или S;

X₁₅ представляет собой S или K;

X₁₆ представляет собой E или D;

X₁₇ представляет собой V;

X₁₈ представляет собой N;

X₁₉ представляет собой L или M;

X₂₀ представляет собой G или S;

X₂₁ представляет собой S или K;

X22 представляет собой I и

X₂₃ представляет собой P.

Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул представляют собой молекулы с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 57, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 и 68.

Биспецифические молекулы изобретения могут дополнительно содержать замены в одном или более положениях остатков в первом домене FN3 и/или втором домене FN3, соответствующих положениям 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1), как описано выше, и замену в положении 29. Примеры замен представляют собой замены E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y, E86I и D29E (нумерация соответствует SEQ ID NO: 1). Специалисту в данной области будет понятно, что для замен можно использовать другие аминокислоты, например, аминокислоты из семейства аминокислот, связанных по боковым цепям, как описано ниже. Созданные варианты можно протестировать на стабильность и связывание с EGFR и/или c-Met с применением способов, описанных в настоящем документе.

В одном варианте осуществления биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, содержит первый домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающийся с c-Met, причем первый домен FN3 содержит последовательность

LPAPKNLWSX24VTX25DSX2₆RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX3oLTVP IGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO:

187) , где

X24 представляет собой E, N или R;

X25 представляет собой E или P;

X26 представляет собой L или A;

X27 представляет собой H или W;

X₂₈ представляет собой E или D;

X₂₉ представляет собой E или P;

X30 представляет собой N или V;

X31 представляет собой G или Y;

X32 представляет собой M или I; и

X33 представляет собой E или I; и второй домен FN3 содержит последовательность

LPAPKNLWSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X4oGX4iAIX₄₂L

TVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIX₄3X44VKGGX₄₅ISPPLSAX₄₆FTT (SEQ ID NO:

8 ) ;

где

- 18 035745

X₃₄ представляет собой E, N или R;

X₃₅ представляет собой E или P;

X₃₆ представляет собой L или A;

X₃₇ представляет собой E или P;

X₃₈ представляет собой V или L;

X₃₉ представляет собой G или S;

X₄₀ представляет собой S или K;

X₄₁ представляет собой E или D;

X₄₂ представляет собой N или V;

X₄₃ представляет собой L или M;

X44 представляет собой G или S;

X45 представляет собой S или K и

X₄₆ представляет собой E или I.

В других вариантах осуществления биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, содержит первый домен FN3, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 87% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, и второй домен FN3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 83% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домен FN3, могут быть созданы с учетом конкретной аффинности в отношении EGFR и c-Met для максимального накопления в опухоли.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенную биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем первый домен FN3 и второй домен FN3 выделены из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.

Биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу изобретения, содержащую домен FN3, можно создать путем ковалентного соединения EGFR-связывающего домена FN3 и c-Met-связывающего домена FN3 изобретения с применением известных способов. Домены FN3 можно соединить посредством линкера, например, линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин или аланин и пролин. Примеры линкеров включают в себя (GS)₂, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)₃ (SEQ ID NO: 81), (AP)₁₀ (SEQ ID NO: 82), (AP)₂₀ (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84), линкеры. Применение природных и искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитные полипептиды хорошо известно в литературе (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 52605268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; патент США № 5,856,456). Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения можно соединить вместе C-концом первого домена FN3 к N-концу второго домена FN3 или C-концом второго домена FN3 к N-концу первого домена FN3. Любой EGFR-связывающий домен FN3 можно ковалентно соединять с cMet-связывающим доменом FN3. Примеры EGFR-связывающих доменов FN3 представляют собой домены с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137, а примеры c-Met-связывающих доменов FN3 представляют собой домены с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 32-49 и 111-114. EGFR-связывающие домены FN3, которые нужно соединить с биспецифической молекулой, могут дополнительно содержать инициатор-метионин (Met) на своих N-концах.

Варианты биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, находятся в рамках объема изобретения. Например, в биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домены FN3, можно вводить заместители, если полученный вариант будет сохранять аналогичную исходной молекуле избирательность и эффективность в отношении EGFR и c-Met. Примеры модификаций представляют собой, например, консервативные замены, приводящие к получению вариантов с характеристиками, которые аналогичны характеристикам исходных молекул. Консервативными называют замены, проводимые внутри семейства аминокислот, связанных по боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты можно разделить на четыре семейства:

(1) кислые (аспартат, глутамат);

(2) щелочные (лизин, аргинин, гистидин);

(3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и (4) незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин).

Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в одну группу ароматических аминокислот. Альтернативно набор аминокислот можно разделить на следующие группы:

(1) кислые (аспартат, глутамат);

(2) щелочные (лизин, аргинин, гистидин);

- 19 035745 (3) алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), причем серин и треонин могут при необходимости образовывать отдельную группу алифатических-гидроксильных;

(4) ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан);

(5) амидные (аспарагин, глутамин) и (6) серосодержащие (цистеин и метионин) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981).

Возможно введение в биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, неконсервативных замен, которые включают в себя замены аминокислотных остатков на другие классы аминокислот для улучшения свойств биспецифических молекул. Чтобы быстро определить возможность получения функционального гомолога в результате изменения аминокислотной последовательности полипептида или его фрагмента, можно оценить способность модифицированного полипептида или фрагмента вызывать ответ аналогично немодифицированному полипептиду или фрагменту с применением анализов, описанных в настоящем документе. Пептиды, полипептиды или белки с более чем одной заменой также можно легко протестировать аналогичным образом.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домен FN3, можно создавать, например, в форме димеров или мультимеров в качестве средства повышения валентности и, таким образом, авидности связывания с молекулой-мишенью. Мультимеры можно получать путем соединения одного или более EGFR-связывающих доменов FN3 и одного или более c-Met-связывающих доменов FN3 с образованием молекул, содержащих, по меньшей мере, три отдельных домена FN3, которые являются, по меньшей мере, биспецифическими к EGFR или c-Met, например, посредством включения аминокислотного линкера с применением хорошо известных способов.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем молекула содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50-72 или 106.

Фрагменты, увеличивающие период полужизни

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, или моноспецифические EGFR- или c-Met-связывающие домены FN3 настоящего изобретения могут включать в себя другие субъединицы, например, посредством ковалентного взаимодействия. В одном аспекте изобретения биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домен FN3, дополнительно содержат фрагмент, увеличивающий период полужизни. Примеры фрагментов, увеличивающих период полужизни, представляют собой альбумин, альбумин-связывающие белки и/или домены, трансферрин и их фрагменты и аналоги, а также Fc-области. Пример альбумин-связывающего домена представлен в SEQ ID NO: 117.

К молекулам изобретения можно присоединить всю константную область антитела или ее часть для придания им антителоподобных свойств, особенно тех свойств, которые связаны с Fc-участком, например эффекторные функции Fc, такие как связывание с C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, подавление ингибирования рецепторов клеточной поверхности (например, Bклеточного рецептора; BCR), и их можно дополнительно модифицировать путем модификации остатков, которые в Fc отвечают за данные функции (см. обзор в публикации Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685691, 2009).

В биспецифические молекулы изобретения можно встроить дополнительные фрагменты, такие как молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), такие как ПЭГ-5000 или ПЭГ -20000, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот с различной длиной цепи, например, лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандиовую кислоту, тетрадекандиовую кислоту, октадекандиовую кислоту, докозандиовую кислоту и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлозу, олиго- или полисахариды) для получения желаемых свойств. Эти фрагменты могут представлять собой результаты прямого слияния с кодирующими белковый каркас последовательностями, и их можно создавать с помощью стандартных методик клонирования и экспрессии. Альтернативно для прикрепления фрагментов в формируемые рекомбинантным способом молекулы изобретения можно применять хорошо известные способы химического связывания.

К биспецифическим или моноспецифическим молекулам изобретения можно добавить, например, пегильный фрагмент путем добавления цистеинового остатка к C-концу молекулы и присоединения пегильной группы к цистеину с помощью хорошо известных способов. Примеры биспецифических молекул с C-концевым цистеином представляют собой молекулы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ IN NO: 170-178.

Моноспецифические и биспецифические молекулы изобретения, которые включают дополнительные фрагменты, можно сравнить по функциональности с помощью ряда известных анализов. Например,

- 20 035745 изменение свойств моноспецифических и/или биспецифических молекул вследствие встраивания доменов Fc и/или вариантов домена Fc можно проанализировать в анализах связывания с рецепторами Fc с применением растворимых форм рецепторов, таких как рецепторы FcyRI, FcyRII, FcyRIII или FcRn, или с применением хорошо известных клеточных анализов для измерения, например, ADCC или CDC или оценки фармакокинетических свойств молекул изобретения на моделях in vivo.

Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева

В изобретении предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие EGFR- или c-Met-связывающие домены FN3 или биспецифические к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащие домены FN3 в виде выделенных полинуклеотидов или в виде участков векторов экспрессии, или в виде участков линейных последовательностей ДНК, включая линейные последовательности ДНК, применяемые для транскрипции/трансляции in vitro, векторов, совместимых с экспрессией, секрецией и/или представлением композиций или результатов их направленного мутагенеза в прокариотах, эукариотах или нитчатых фагах. В настоящем документе описаны некоторые примеры полинуклеотидов, однако другие полинуклеотиды, которые, учитывая вырожденность генетического кода или предпочтения в отношении кодона в данной системе экспрессии, кодируют белковые каркасы и библиотеки белковых каркасов изобретения, также входят в объем изобретения.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, который имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 97-98 или 168-169.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий домен FN3, специфически связывающийся с c-Met, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий биспецифическую к EGFR/-C-Met молекулу, содержащую домен FN3, имеющую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 или 138-165.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 115-116 или 166-167.

Полинуклеотиды изобретения можно получить путем химического синтеза, такого как синтез полинуклеотидов в твердой фазе на автоматическом синтезаторе полинуклеотидов, и сборки в полные одно- или двухцепочечные молекулы. Альтернативно полинуклеотиды изобретения можно получить другими методиками, такими как ПЦР с последующим стандартным клонированием. Методики производства или получения полинуклеотидов с заданной известной последовательностью хорошо известны в данной области.

Полинуклеотиды изобретения могут содержать по меньшей мере одну некодирующую последовательность, такую как промоторная или энхансерная последовательность, интрон, сигнал полиаденилирования, cis-последовательность, облегчающую связывание с RepA, и т.п. Полинуклеотидные последовательности также могут содержать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, которые кодируют, например, маркерную последовательность или последовательность тега, такую как гистидиновый тег или HA-тег для облегчения очистки или определения белка, сигнальную последовательность, партнер для слитного белка, такой как RepA, Fc или белок покрытия бактериофага, такой как pIX или pill.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой вектор, содержащий, по меньшей мере, один полинуклеотид изобретения. Такие векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы для экспрессии бакуловируса, векторы на основе транспозонов или любые другие векторы, подходящие для введения полинуклеотидов изобретения в данный организм или генетическое окружение любым образом. Такие векторы могут представлять собой векторы экспрессии, содержащие элементы нуклеотидной последовательности, которые могут контролировать, регулировать, вызывать или допускать экспрессию полипептидов, кодируемых таким вектором. Такие элементы могут содержать сайты связывания энхансера транскрипции, сайты инициации РНК-полимеразы, сайты связывания рибосом и другие сайты, способствующие экспрессии закодированных полипептидов в заданной экспрессирующей системе. Такие экспрессирующие системы могут представлять собой клеточные или бесклеточные системы, хорошо известные в данной области.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор изобретения. Моноспецифический EGFR- или c-Met-связывающий домен FN3 или биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу изобретения, содержащую домены FN3, можно необязательно получить с помощью клеточной линии, смешанной клеточной линии, иммортализованной клетки или клональной популяции иммортализованных клеток, как хорошо известно в данной области. См., например, публикации Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Pro

- 21 035745 tocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Выбранная для экспрессии клетка-хозяин может быть получена от млекопитающего или ее можно выбрать из клеток COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, миеломы, лимфомы, дрожжей, насекомых или растений или любых производных, иммортализованных или преобразованных упомянутых клеток. Альтернативно клетку-хозяина можно выбирать из видов или организмов, неспособных к гликозилированию полипептидов, например, прокариотической клетки или организма, такого как BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), и любого из природных или сконструированных штаммов Е. coli, Klebsiella или Pseudomonas.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения выделенного домена FN3 изобретения, специфически связывающегося с EGFR или c-Met, или выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулы изобретения, содержащей домен FN3, включающий в себя культивирование выделенной клетки-хозяина изобретения в таких условиях, чтобы экспрессировался выделенный домен FN3, специфически связывающийся с EGFR или c-Met, или выделенная биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, а также очистки домена или молекулы.

Домен FN3, специфически связывающийся с EGFR или c-Met, или выделенную биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу изобретения, содержащую домен FN3, можно очистить из рекомбинантных клеточных культур с помощью хорошо известных способов, например, путем очистки белком A, осаждением сульфатом аммония или этанолом, кислотной экстракцией, анионной или катионной обменной хроматографией, фосфоцеллюлозной хроматографией, хроматографией с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографией, гидроксилапатитной хроматографией, лектиновой хроматографией или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Использование биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домены FN3, и EGFRили c-Met-связывающих доменов FN3 изобретения

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены FN3 или c-Met-связывающие домены FN3 можно применять для диагностики, мониторинга, модуляции, лечения, ослабления, профилактики развития или снижения симптомов заболевания человека или конкретных патологий клеток, тканей, органов, текучих сред или по существу хозяина. Способы изобретения можно применять для лечения любого пациента-животного в рамках любой классификации. Примеры таких животных включают в себя млекопитающих, таких как люди, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные.

Один аспект изобретения представляет собой способ ингибирования роста или пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR и/или c-Met, включающий в себя приведение в контакт клеток с выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулой, содержащей домен FN3, EGFR-связывающим доменом FN3 или c-Met-связывающим доменом FN3.

Другой аспект изобретения представляет собой способ ингибирования роста или метастазирования экспрессирующих EGFR и/или c-Met опухолевых или раковых клеток у субъекта, включающий в себя введение субъекту эффективного количества выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домены FN3, EGFR-связывающего домена FN3 или c-Met-связывающего домена FN3 таким образом, чтобы ингибировать рост или метастазирование экспрессирующих EGFR и/или c-Met опухолевых или раковых клеток.

Биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, EGFR-связывающий домен FN3 или c-Met-связывающий домен FN3 изобретения можно применять для лечения любого заболевания или расстройства, характеризующегося аномальной активацией или продукцией EGFR, c-Met, EGF или иного лиганда EGFR или HGF, или расстройства, связанного с экспрессией EGFR или c-Met, которые могут быть связаны или не связаны со злокачественными образованиями или раком, причем аномальная активация и/или продукция EGFR, c-Met, EGF или иного лиганда EGFR или HGF происходит в клетках или тканях субъекта с заболеванием или расстройством или субъекта, предрасположенного к заболеванию или расстройству.

Биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу изобретения, содержащую домен FN3, можно применять для лечения опухолей, включая раковые заболевания и доброкачественные опухоли. Виды рака, которые поддаются лечению с помощью биспецифических молекул изобретения, включают в себя виды, связанные со сверхэкспрессией EGFR и/или c-Met. Примеры видов рака, которые поддаются лечению посредством биспецифических молекул изобретения, включают в себя виды рака эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, колоректальный рак, рак анального канала, рак предстательной железы, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, рак яичек, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).

Домены FN3 изобретения, специфически связывающиеся с c-Met и блокирующие связывание HGF с c-Met, можно применять для лечения опухолей, включая раковые и доброкачественные опухоли. Виды

- 22 035745 рака, которые поддаются лечению посредством c-Met-связывающих доменов FN3 изобретения, включают в себя виды, связанные со сверхэкспрессией c-Met. Примеры видов рака, которые поддаются лечению посредством доменов FN3 изобретения, включают в себя виды рака эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак предстательной железы, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, рак яичек, рак желудка и рак тимуса.

Section 1.01 Домены FN3 изобретения, специфически связывающиеся с EGFR и блокирующие связывание EGF с EGFR, можно применять для лечения опухолей, включая раковые и доброкачественные опухоли. Виды рака, которые поддаются лечению посредством доменов FN3 изобретения, включают в себя виды, связанные со сверхэкспрессией EGFR, или варианты. Примеры видов рака, которые поддаются лечению посредством доменов FN3 изобретения, включают в себя виды рака эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак предстательной железы, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, рак яичек, рак желудка и рак тимуса.

Введение/фармацевтические композиции

Для терапевтического применения биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены FN3 или c-Met-связывающие домены FN3 изобретения, можно получить в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество домена или молекулы в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которыми вводят активное соединение. Такие носители могут быть жидкостями, таким как вода или масла, включая масла, получаемые из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Например, можно применять 0,4% соляной раствор и 0,3% раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых частиц. Их стерилизацию можно проводить с помощью стандартных хорошо известных методик стерилизации (например, фильтрования). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты для регулирования и буферизации pH, стабилизаторы, загустители, увлажняющие и красящие агенты и т. п. Концентрация молекул изобретения в таком фармацевтическом составе может значительно варьироваться, т.е. обычно от менее чем приблизительно 0,5% или по меньшей мере около 1 и до 15 или 20 вес.%, и определяется преимущественно на основе необходимой дозы, объемов текучей среды, вязкости и т.п. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Подходящие носители и составы, включая другие белки человека, например, сывороточный альбумин человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, см. в особенности pp. 958-989.

Способ введения для терапевтического применения биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домены FN3, EGFR-связывающих доменов FN3 или c-Met-связывающих доменов FN3 может представлять собой любой подходящий путь, обеспечивающий доставку агента в организм хозяина, такой как парентеральное введение, например, внутрикожное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное, подкожное, легочное;

чресслизистое (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное); с применением состава в виде таблетки, капсулы, раствора, порошка, геля, гранул; и содержащегося в шприце, имплантированном устройстве, осмотическом насосе, картридже, микронасосе; или же с помощью других средств, очевидных для квалифицированного специалиста, которые хорошо известны в данной области. Локализованное введение можно обеспечить, например, путем доставки в сустав, бронхи, брюшную полость, внутрь капсулы, хрящ, полость, клетку, мозжечок, желудочек мозга, толстую кишку, шейку матки, желудок, печень, миокард, кость, таз, перикард, полость живота, плевру, простату, легкие, прямую кишку, почку, сетчатку, позвоночник, суставную сумку, грудную клетку, матку, сосуд, внутрь мочевого пузыря, внутрь пораженных тканей, вагинально, ректально, буккально, сублингвально, интраназально или трансдермально.

Таким образом, фармацевтическую композицию изобретения для внутримышечной инъекции можно получить с содержанием 1 мл стерильной забуференной воды и от около 1 нг до около 100 мг, например, от около 50 нг до около 30 мг, или более предпочтительно от около 5 до около 25 мг домена FN3 изобретения. Аналогичным образом, фармацевтическая композиция изобретения для внутривенного введения может содержать около 250 мл стерильного раствора Рингера и от около 1 до около 30 мг, например, от около 5 до около 25 мг биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, EGFR-связывающего домена FN3 или c-Met-связывающего домена FN3 изобретения. Фактические способы получения композиций для парентерального введения хорошо известны и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены

- 23 035745

FN3 или c-Met-связывающие домены FN3 изобретения можно лиофилизировать для хранения и перед применением восстанавливать в подходящем носителе. Было показано, что данная методика эффективна для стандартных белковых препаратов, при этом можно использовать известные в данной области способы лиофилизации и восстановления.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены FN3 или c-Met-связывающие домены FN3, можно вводить пациенту одной дозой, или же введения могут быть повторными, например, через одни сутки, двое суток, трое суток, пятеро суток, шестеро суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель, шесть недель, семь недель, два месяца или три месяца. Повторное введение можно выполнять в той же дозе или в другой дозе. Введение можно повторять один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены FN3 или c-Met-связывающие домены FN3, можно вводить в комбинации со вторым терапевтическим средством одновременно, последовательно или раздельно. Второе терапевтическое средство может представлять собой химиотерапевтический агент, противоангиогенный агент или цитотоксическое лекарственное средство. При применении для лечения рака биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домены FN3, EGFR-связывающие домены FN3 или c-Met-связывающие домены FN3, можно применять в комбинации с традиционными средствами лечения рака, такими как хирургия, радиотерапия, химиотерапия или их комбинации. Примеры агентов, которые можно применять в комбинации с доменами FN3 изобретения, представляют собой антагонисты HER2, HER3, HER4, VEGF и белковые ингибиторы тирозинкиназ, такие как Iressa® (гефитиниб) и Tarceva (эрлотиниб).

Хотя изобретение описано в общих терминах, варианты осуществления изобретения будут более подробно описаны в следующих примерах, которые не следует толковать как ограничивающие объем формулы изобретения.

Пример 1. Создание библиотек Tencon

Tencon (SEQ ID NO: 1) представляет собой каркасный иммуноглобулин-подобный домен фибронектина типа III (FN3), разработанный на основе консенсусной последовательности пятнадцати доменов FN3 тенасцина-C человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; патентная публикация США № 2010/0216708). На кристаллической структуре Tencon имеются шесть поверхностных петель, соединяющих семь бета-тяжей. Данные петли или выбранные остатки в пределах каждой петли можно подвергать рандомизации для создания библиотеки доменов фибронектина типа III (FN3), которые можно применять для выбора новых молекул, связывающихся с конкретными мишенями.

Tencon:

ILPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT

GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO 1):

Создание библиотеки TCL1

Библиотека, разработанная с рандомизацией только петли FG в Tencon (SEQ ID NO: 1), TCL1, была создана для применения с cis-дисплейной системой (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). В этой системе создается одноцепочечная ДНК, в которую включены последовательности для промотора Tac, кодовая последовательность библиотеки Tencon, кодовая последовательность RepA, cis-элемент и ori-элемент. При экспрессии в системе транскрипции/трансляции in vitro формируется комплекс слитного белка Tencon-RepA, связанный в cis с ДНК, которая его кодирует. Затем комплексы, связывающиеся с молекулой-мишенью, выделяют и амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) так, как описано ниже.

Конструирование библиотеки TCL1 для применения с cis-дисплеем осуществляли путем последовательных циклов ПЦР с получением конечных линейных двухцепочечных молекул ДНК из двух половин; 5'-фрагмент содержит последовательности промотора и Tencon, а 3'-фрагмент содержит ген repA и элементы cis- и ori. Эти две половины объединяют путем рестриктазного расщепления с получением полного конструкта. Библиотека TCL1 была разработана с возможностью включения случайных аминокислот только в петлю FG в Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO: 86). При создании данной библиотеки применяли NNS-кодоны, что позволило встроить в петлю FG все 20 аминокислот и один стоп-кодон. Библиотека TCL1 содержит шесть отдельных подбиблиотек, каждая из которых имеет разную рандомизированную длину петли FG - от 7 до 12 остатков - для дополнительного повышения разнообразия. Конфигурация библиотек на основе Tencon представлена в табл. 2.

- 24 035745

Таблица 2

Библиотека	Конфигурация петли ВС	Конфигурация петли FG

WT Tencon	TAPDAAFD*	KGGHRSN**
TCL1	TAPDAAFD*	ХХХХХХХ
		ХХХХХХХХ
		ХХХХХХХХХ
		хххххххххх
		ххххххххххх
		хххххххххххх
TCL2	########

*TAPDAAFD: остатки 22-28 в SEQ ID NO: 1.

**KGGHRSN: SEQ ID NO: 86.

X обозначает вырожденные аминокислоты, кодируемые NNS-кодонами.

# обозначает разработанное распределение аминокислот, описанное в тексте.

Для создания библиотеки TCL1 выполняли последовательные циклы ПЦР для присоединения промотора Тас, введения вырожденных элементов в петлю F:G и добавления необходимых сайтов рестрикции для конечной сборки. Сначала в два этапа создали последовательность ДНК, содержащую промоторную последовательность и последовательность 5'-фрагмента петли FG Tencon. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК, соответствующую полной последовательности гена Tencon, с праймерами POP2220 (SEQ ID NO: 2) и TC5'toFG (SEQ ID NO: 3). Полученный в результате этой реакции продукт ПЦР использовали в качестве матрицы для следующего цикла ПЦР-амплификации с праймерами 130mer (SEQ ID NO: 4) и Tc5'toFG для завершения присоединения последовательности 5'-фрагмента и промоторной последовательности к Tencon. Затем в петлю F:G вводили диверсификацию путем амплификации ДНК-продукта, полученного на первом этапе, с прямым праймером POP2222 (SEQ ID NO: 5) и обратными праймерами TCF7 (SEQ ID NO: 6), TCF8 (SEQ ID NO: 7), TCF9 (SEQ ID NO: 8), TCF10 (SEQ ID NO: 9), TCF11 (SEQ ID N NO: 10) или TCF12 (SEQ ID NO: 11), содержащими вырожденные нуклеотиды. Выполняли по меньшей мере по восемь ПЦР-реакций по 100 мкл для каждой подбиблиотеки, чтобы свести к минимуму число циклов ПЦР и максимально увеличить разнообразие библиотеки. По меньшей мере 5 мкг этого продукта ПЦР очищали из геля и использовали на последующем этапе с праймерами POP2222 (SEQ ID NO: 5) и POP2234 (SEQ ID NO: 12), выполнив в результате прикрепление 6xHis-тега и сайта рестрикции NotI к 3'-концу последовательности Tencon. Эту ПЦР-реакцию проводили с использованием лишь пятнадцати циклов ПЦР и по меньшей мере 500 нг ДНК-матрицы. Полученный продукт ПЦР очищали из геля, расщепляли рестрикционным ферментом NotI и очищали на колонке Qiagen.

3'-фрагмент библиотеки представляет собой константную ДНК-последовательность, содержащую элементы дисплея, включая сайт рестрикции PspOMI, кодирующую область гена repA и cis- и oriэлементы. ПЦР проводили с использованием плазмиды (pCR4Blunt) (Invitrogen), содержащей данный ДНК-фрагмент, с праймерами M13 Forward (прямой) и M13 Reverse (обратный). Полученные продукты ПЦР расщепляли PspOMI в течение ночи и очищали из геля. Для лигирования 5'-участка библиотечной ДНК с 3'-фрагментом ДНК, содержащим ген repA, 2 пмоль 5'-фрагмента ДНК лигировали с эквимолярным количеством 3'-фрагмента repA ДНК в присутствии ферментов NotI и PspOMI и лигазы T4. После лигирования в течение ночи при 37°C небольшую часть лигированной ДНК прогоняли через гель для проверки эффективности лигирования. Цитированный библиотечный продукт разделяли на двенадцать ПЦР-амплификации и проводили ПЦР в 12 циклов с парой праймеров POP2250 (SEQ ID NO: 13) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Выход ДНК для каждой подбиблиотеки в библиотеке TCL1 находился в диапазоне от 32 до 34 мкг.

Для оценки качества библиотеки небольшой участок рабочей библиотеки амплифицировали с праймерами Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) и Tcon6 (SEQ ID NO: 16) и клонировали в модифицированном векторе pET посредством безлигазного клонирования. Плазмидную ДНК трансформировали в компетентные клетки BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) и 96 случайно выбранных колоний секвенировали с применением праймера промотора T7. Дублирующиеся последовательности обнаружены не были. В целом приблизительно 70-85% клонов имели полный промотор и кодирующую последовательность Tencon без мутации сдвига рамки считывания. Доля функционального секвенирования, которая исключает клоны со стоп-кодонами, находилась в диапазоне от 59 до 80%.

Создание библиотеки TCL2

Была создана библиотека TCL2, в которой в Tencon были рандомизированы как петля BC, так и петля FG, а распределение аминокислот в каждом положении строго контролировалось. В табл. 3 представлено распределение аминокислот в желаемых положениях петель в библиотеке TCL2. Разработанное

- 25 035745 распределение аминокислот имело две цели. Во-первых, библиотека была ориентирована на остатки, которые предположительно являются структурно значимыми для сворачивания и стабильности Tencon на основании анализа кристаллической структуры Tencon и/или гомологического моделирования. Например, положение 29 было предназначено только для подмножества гидрофобных аминокислот, так как этот остаток погружен в гидрофобную сердцевину свернутого Tencon. Второй уровень разработки включал в себя смещение распределения аминокислот к распределению остатков, которые предпочтительно находятся в тяжелой цепи HCDR3 антител, для эффективного получения соединений с высокой аффинностью связывания (Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). Таким образом, разработанное распределение из табл. 3 относится к представленному ниже распределению: 6% аланина, 6% аргинина, 3,9% аспарагина, 7,5% аспарагиновой кислоты, 2,5% глутаминовой кислоты, 1,5% глутамина, 15% глицина, 2,3% гистидина, 2,5% изолейцина, 5% лейцина, 1,5% лизина, 2,5% фенилаланина, 4% пролина, 10% серина, 4,5% треонина, 4% триптофана, 17,3% тирозина и 4% валина. В данном распределении отсутствуют метионин, цистеин и стоп-кодоны.

Таблица 3

Положение остатка*	Остатки дикого типа (д.т.)	Распределение в библиотеке TCL2
22	Т	Разработанное распределение
23	А	Разработанное распределение
24	Р	50% Р+разработанное распределение
25	D	Разработанное распределение
26	А	20% А+20% G+разработанное распределение
27	А	Разработанное распределение
28	F	20% F, 20% I, 20% L, 20% V, 20% Y
29	D	33% D, 33% Е, 33% Т
75	К	Разработанное распределение
76	G	Разработанное распределение
77	G	Разработанное распределение
78	Н	Разработанное распределение
79	R	Разработанное распределение
80	S	100% S
81	N	Разработанное распределение
82	Р	50% Р+разработанное распределение

^Нумерация остатков основана на последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.

5'-фрагмент библиотеки TCL2 содержал промотор и кодирующую область Tencon (SEQ ID NO: 1), который химически синтезировали в виде библиотечного пула (Sloning Biotechnology). Данный пул ДНК содержал, по меньшей мере, 1 х 10¹¹ разных элементов. В конец фрагмента был включен сайт рестрикции BsaI в конфигурации для лигирования с RepA.

3'-фрагмент библиотеки представлял собой константную ДНК-последовательность, содержащую элементы дисплея, включая 6xHis-тег, кодирующую область гена repA и cis-элемент. ДНК получали в ПЦР-реакции с помощью существующей ДНК-матрицы (выше) и праймеров LS1008 (SEQ ID NO: 17) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Для сборки готовой библиотеки TCL2 общее количество 1 мкг расщепленного рестриктазой BsaI 5'-фрагмента библиотечной ДНК Tencon лигировали с 3,5 мкг 3'-фрагмента, полученного путем рестрикционного расщепления этим же ферментом. После лигирования в течение ночи ДНК очищали на колонке Qiagen и проводили количественную оценку ДНК путем измерения поглощения при 260 нм. Лигированный библиотечный продукт амплифицировали ПЦР в 12 циклов с парой праймеров POP2250 (SEQ ID NO: 13) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Всего провели 72 реакции, в каждой из которых в качестве матрицы использовали 50 нг лигированных ДНК-продуктов. Общий выход рабочей библиотеки ДНК TCL2 составил около 100 мкг. Небольшой участок рабочей библиотеки подвергли субклонированию и секвенированию, как описано выше для библиотеки TCL1. Дублирующиеся последовательности обнаружены не были. Около 80% последовательностей содержали полный промотор и кодирующие последовательности Tencon без мутаций сдвига рамки считывания.

Создание библиотеки TCL14

Верхние (BC, DE и FG) и нижние (AB, CD и EF) петли, например, отмеченные поверхности связывания в доменах FN3, разделены бета-тяжами, которые образуют центр структуры FN3. Альтернативные

- 26 035745 поверхности, расположенные с двух сторон доменов FN3 и имеющие другие формы, нежели поверхности, образованные только петлями, образованы с одной стороны домена FN3 двумя антипараллельными бета-тяжами, бета-тяжами C и F и петлями CD и FG, и в настоящем документе называются поверхностью C-CD-F-FG.

Была создана библиотека, рандомизирующая альтернативную поверхность Tencon путем рандомизации выбранных открытых на поверхности остатков, относящихся к тяжам C и F, а также к участкам петель CD и FG, как показано на фиг. 4. Для создания библиотеки использовали вариант Tencon Tencon27 (SEQ ID NO: 99), имеющий следующие замены по сравнению с Tencon (SEQ ID NO: 1): E11R L17A, N46V, E86I. Полное описание способов, применяемых для разработки этой библиотеки, приведено в заявке на патент США № 13/852930.

Пример 2. Выбор доменов фибронектина типа III (FN3), связывающихся с EGFR и ингибирующих связывание с EGF

Скрининг библиотеки

Для выбора EGFR-связывающих доменов из библиотек TCL1 и TCL2 применяли cis-дисплей. Рекомбинантный человеческий внеклеточный домен EGFR, слитый с IgG1 Fc (R&D Systems), биотинилировали стандартными способами и применяли для пэннинга (остатки 25-645 полноразмерного EGFR с SEQ ID NO: 73). Для транскрипции и трансляции in vitro (ITT) 2-6 мкг библиотечной ДНК инкубировали с 0,1 мМ полного набора аминокислот, компонентами 1X премикса S30 и 30 мкл экстракта S30 (Promega) в общем объеме 100 мкл и инкубировали при 30°C. Через 1 ч добавляли 450 мкл блокирующего раствора (PBS, pH 7,4, с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина, 100 мкг/мл ДНК спермы сельди и 1 мг/мл гепарина) и реакционную смесь инкубировали на льду в течение 15 мин. Собирали комплексы EGFR-Fc:EGF с молярными соотношениями 1:1 и 10:1 для EGFR к EGF путем смешивания рекомбинантного человеческого EGF (R&D Systems) с биотинилированным рекомбинантным EGFR-Fc в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре. Для связывания 500 мкл заблокированных реакционных смесей ITT смешивали с 100 мкл комплексов EGFR-Fc:EGF и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего связанные комплексы извлекали магнитными гранулами с нейтравидином или стрептавидином (Seradyne). Несвязанные элементы библиотеки удаляли путем последовательных промывок PBST и PBS. После промывки ДНК элюировали из связанных комплексов путем нагревания до 65°C в течение 10 мин, амплифицировали ПЦР и присоединяли к ДНК-фрагменту, кодирующему RepA, путем рестрикционного расщепления и лигирования для дополнительных циклов пэннинга. Соединения с высокой аффинностью связывания выделяли путем последовательного понижения концентрации мишени EGFR-Fc в каждом цикле от 200 нМ до 50 нМ и повышения жесткости условий промывки. В циклах 4 и 5 несвязанные и слабо связанные домены FN3 удаляли путем промывки в присутствии 10-кратного молярного избытка небиотинилированных EGFR-Fc в течение ночи в PBS.

После пэннинга выбранные домены FN3 амплифицировали ПЦР с применением олигонуклеотидов Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) и Tcon6 (SEQ ID NO: 16), субклонировали в вектор pET, модифицированный путем включения сайта безлигазного клонирования, и трансформировали в клетки BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) для экспрессии растворимого продукта в Е. coli с применением стандартных методик молекулярной биологии. К каждому домену FN3 добавляли генную последовательность, кодирующую Cконцевой полигистидиновый тег, для обеспечения возможности очистки и обнаружения. Культуры выращивали до достижения оптической плотности 0,6-0,8 в среде 2YT с добавлением 100 мкг/мл карбенициллина в 96-луночных блоках объемом 1 мл при 37°C, затем добавляли IPTG до 1 мМ и в этот момент температуру снижали до 30°C. Клетки собирали приблизительно через 16 ч путем центрифугирования и замораживали при -20°C. Лизирование клеток проводили путем инкубации каждого осадка в 0,6 мл лизирующего буфера BugBuster® HT (Novagen EMD Biosciences) со встряхиванием при комнатной температуре в течение 45 мин.

Выбор доменов FN3, связывающихся с EGFR на клетках

Для оценки способности разных доменов FN3 связываться с EGFR в более физиологическом контексте измеряли их способность связываться с клетками A431. Клетки A431 (Американская коллекция типовых культур, № по кат. CRL-1555) обладают сверхэкспрессией EGFR ~2х10⁶ рецепторов на клетку. Клетки высевали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, давали им прикрепиться в течение ночи при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Лизаты экспрессирующих домены FN3 бактерий 1000-кратно разбавляли в буфере для окрашивания при FACS (Becton Dickinson) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Лизаты удаляли и клетки промывали 3 раза, добавляя в лунки буфер для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата антител к пентагистидину His-Alexa488 (Qiagen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 488 нм с помощью считывателя Acumen eX3. Бактериальные лизаты, содержащие домены FN3, отбирали посредством скрининга по их способности связываться с клетками A431 (1320 неочищенных бактериальных лизатов по библиотекам TCL1 и

- 27 035745

TCL2) и выявили 516 позитивных клонов, у которых связывание > 10-кратно превосходило фоновый сигнал. Для связывания посредством скрининга отбирали 300 лизатов из библиотеки TCL14, получив 58 уникальных последовательностей доменов FN3, связывающихся с EGFR.

Выбор доменов FN3, ингибирующих связывание EGF с EGFR на клетках

Чтобы лучше охарактеризовать механизм связывания с EGFR, измеряли способность различных обнаруженных клонов домена FN3 связываться с EGFR в конкуренции с EGF с применением клеток A431 параллельно со скрининговым анализом связывания с A431. Клетки A431 высевали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяя им прикрепиться в течение ночи при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка разбавленного 1:1000 лизата бактерий в течение 1 часа при комнатной температуре в трех планшетах. Биотинилированный EGF (Invitrogen, № по кат. E-3477) добавляли в каждую лунку с конечной концентрацией 30 нг/мл и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза буфером для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата стрептавидин-фикоэритрин (Invitrogen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 600 нм с помощью считывателя Acumen eX3.

Скрининг бактериальных лизатов, содержащих домены FN3, проводили в анализе на конкуренцию с EGF, описанном выше. Скринингу подвергли 1320 неочищенных бактериальных лизатов из библиотек TCL1 и TCL2, получив 451 позитивный клон с ингибированием связывания с EGF > 50%.

Экспрессия и очистка идентифицированных доменов FN3, связывающихся с EGFR

Домены FN3 с His-тегом очищали из лизатов Е. coli с использованием планшетов His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) и элюировали в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия и 250 мМ имидазола, pH 7,4. В очищенных образцах для анализа заменяли буфер на PBS, pH 7,4, с применением планшетов PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).

Анализ методом эксклюзионной хроматографии

Для оценки состояния агрегации доменов FN3, связывающих EGFR, применяли эксклюзионную хроматографию (SEC). Аликвоты (10 мкл) каждого очищенного домена FN3 вводили в колонку Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) со скоростью потока 0,3 мл/мин в подвижной фазе PBS с pH 7,4. Элюирование с колонки отслеживали по поглощению на 280 нм. Centyrin, показывающие высокие уровни агрегации по SEC, исключали из дополнительного анализа.

Скорость диссоциации выбранных EGFR-связывающих доменов FN3 от EGFR-Fc

Для выбранных EGFR-связывающих доменов FN3 проводили скрининг для идентификации доменов с низкими константами диссоциации (koff) при связывании с EGFR-Fc на приборе ProteOn XPR-36 (Bio-Rad) для упрощения выбора соединений с высокой аффинностью связывания. Козьи антитела к человеческим Fc IgG (R&D systems) в концентрации 5 мкг/мл напрямую иммобилизовали посредством аминного связывания (при pH 5,0) во всех 6 горизонтально ориентированных лигандных каналах на чипе при скорости потока 30 мкл/мин в PBS, содержащем 0,005% Tween-20. Значения плотности иммобилизации в среднем составляли около 1500 отвечающих единиц (RU) с менее чем 5%-ным разбросом между разными каналами. EGFR-Fc захватывался поверхностью с антителами к человеческому Fc IgG с плотностью около 600 RU в вертикальной ориентации лиганда. Все протестированные домены FN3 нормализовали к концентрации 1 мкМ и тестировали их на связывание в горизонтальной ориентации. Для доменов FN3 применяли все 6 каналов для аналита, чтобы максимально увеличить производительность скрининга. Фазу диссоциации отслеживали в течение 10 мин при скорости потока 100 мкл/мин. В качестве эталонов при отслеживании неспецифического связывания между аналитами и поверхностью с иммобилизованными IgG применяли сигналы связывания между пятнами, и сигналы вычитали из всех сигналов связывания. Обработанные данные связывания локально аппроксимировали простой моделью связывания Ленгмюра 1:1 для получения koff по каждому домену FN3, связывающемуся с захваченными EGFRFc.

Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR

Очищенные EGFR-связывающие домены FN3 тестировали на их способность ингибировать стимулированное EGF фосфорилирование EGFR в клетках A431 в одной концентрации. Фосфорилирование EGFR отслеживали с помощью набора EGFR phospho(Tyr1173) (Meso Scale Discovery). Клетки высевали по 20000/лунка на прозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования ткани (Nunc), в среду RPMI 100 мкл/лунка (Gibco), содержащую GlutaMAX™, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco), и позволяли им прикрепиться на ночь при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Культуральную среду полностью удаляли и клетки выдерживали в течение ночи в условиях голодания в 100 мкл/лунка среды, не содержащей FBS, при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Затем клетки обрабатывали по 100 мкл/лунка предварительно нагретой (37°C) средой без питательных веществ, содержащей EGFR-связывающие домены FN3, в концентрации 2 мкМ в течение 1 ч при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Контроли обрабатывали только средой без питательных веществ. Клетки

- 28 035745 стимулировали путем добавления и осторожного перемешивания 100 мкл/лунка подогретой (37°C) среды без питательных веществ, содержащей 100 нг/мл рекомбинантного человеческого EGF (R&D Systems, № по кат. 236-EG) с конечными концентрациями 50 нг/мл EGF, а также 1 мкМ EGFR-связывающего домена FN3 и инкубированием при 37°C, 5% CO₂ в течение 15 мин. Один набор контрольных лунок оставляли без стимуляции в качестве отрицательных контролей. Среду полностью удаляли и клетки лизировали при помощи 100 мкл/лунка лизирующего буфера Complete Lysis Buffer (Meso Scale Discovery) в течение 10 мин при комнатной температуре при встряхивании, как описано в инструкциях производителя. Планшеты для анализа, предназначенные для измерения EGFR, фосфорилированного по тирозиновому остатку 1173 (Meso Scale Discovery), блокировали входящим в комплект блокирующим раствором в соответствии с инструкциями производителя при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч. Затем планшеты промывали 4 раза, используя 200 мкл/лунка 1X Tris Wash Buffer (Meso Scale Discovery). Аликвоты клеточных лизатов (30 мкл/лунка) переносили в планшеты для анализа, которые закрывали пленкой для герметизации планшетов (VWR), и инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч. Планшеты для анализа промывали 4 раза, по 200 мкл/лунка Tris Wash Buffer, после чего в каждую лунку добавляли по 25 мкл ледяного раствора детекторного антитела (Meso Scale Discovery), стараясь избегать появления пузырей. Планшеты инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч, затем промывали 4 раза по 200 мкл/лунка Tris Wash Buffer. Сигналы обнаруживали путем добавления по 150 мкл/лунка буфера считывания (Meso Scale Discovery) и считывали на приборе SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) с применением заданных производителем параметров для данного анализа по умолчанию. Процентное ингибирование стимулированного EGF позитивного контрольного сигнала вычисляли для каждого EGFR-связывающего домена FN3.

Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR измеряли для 2 32 идентифицированных клонов из библиотек TCL1 и TCL2. 22 из этих клонов ингибировали фосфорилирование EGFR на величину > 50% при концентрации 1 мкМ. После удаления клонов, которые либо плохо экспрессировались, либо были сочтены мультимерами в соответствии с данными эксклюзионной хроматографии, отобрали девять клонов для дополнительной биологической характеризации. Последовательности петель BC и FG данных клонов представлены в табл. 4. Восемь из девяти выбранных клонов имели общую последовательность петли FG (HNVYKDTHMRGL; SEQ ID NO: 95), и между несколькими клонами наблюдали существенное сходство в последовательностях петель BC.

Таблица 4

Домен FN3	Петля ВС	Петля FG
Идентификационный номер клона	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
P53A1R5-17	18	ADPHGFYD	87	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-17	19	TYDRDGYD	88	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-47	20	WDPFSFYD	89	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-48	21	DDPRGFYE	90	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-73	22	TWPYADLD	91	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-74	23	GYNGDHFD	92	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-81	24	DYDLGVYD	93	HNVYKDTNMRGL	95
P54AR4-83	25	DDPWDFYE	94	HNVYKDTNMRGL	95
P54CR4-31	26	TAPDAAFD	85	LGSYVFEHDVM	96

Пример 3. Характеризация EGFR-связывающих доменов FN3, которые ингибируют связывание EGF

Крупномасштабная экспрессия, очистка и удаление эндотоксина доменов FN3, представленных в табл. 4, подвергли крупномасштабной экспрессии, чтобы получить больше материала для подробной характеризации. Культивируемую в течение ночи культуру, содержащую каждый из вариантов EGFR-связывающего домена FN3, инокулировали в 0,8 л бульонной питательной среды Terrific с добавлением 100 мкг/мл ампициллина с разбавлением 1/80 ночной культуры свежей средой и инкубировали при встряхивании при 37°C. Когда была достигнута оптическая плотность - 1,2-1,5 при 600 нм, культуру индуцировали путем добавления IPTG до конечной концентрации 1 мМ и снижали температуру до 30°C. Через 4 ч клетки собирали путем центрифугирования и клеточный осадок хранили при -80°C столько, сколько необходимо.

Для лизирования клеток оттаявший осадок повторно суспендировали в растворе 1X BugBuster® с добавлением 25 Е/мл Benzonase® (Sigma-Aldrich) и 1 тыс. ЕД/мл rLysozyme™ (Novagen EMD Biosciences) в соотношении 5 мл BugBuster® на грамм осадка. Лизирование проводили в течение 1 ч при комнатной температуре с осторожным встряхиванием, затем центрифугировали при 56000 х g в течение 50 мин при 4°C. Супернатант отбирали и фильтровали через фильтр 0,2 мкм, после чего наносили на 5миллилитровую колонку HisTrap FF, предварительно доведенную до равновесного состояния при помощи буфера A (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола) с применением хроматографической системы GE Healthcare AKTAexplorer 100s. Колонку промывали буфером A объемом, составляю

- 29 035745 щим 20 объемов колонки, и дополнительно промывали 16% буфером B (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола) с объемом, составляющим 6 объемов колонки. Домены FN3 элюировали 50% буфером В с объемом, составляющим 10 объемов колонки, а затем градиентом 50-100% буфера B с объемом, составляющим 6 объемов колонки. Фракции, содержащие белок домена FN3, объединяли, концентрировали с использованием концентратора Millipore 10K MWCO и фильтровали, после чего наносили на колонку HiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 (GE Healthcare), предварительно доведенную до равновесного состояния PBS. Выбирали пик мономерного белка, элюирующийся из эксклюзионной колонки.

Эндотоксины удаляли, используя пакетный подход, при помощи смолы ActiClean Etox (Sterogene Bioseparations). Перед удалением эндотоксина смолу предварительно обрабатывали 1 н. NaOH в течение 2 ч при 37°C (или в течение ночи при 4°C) и обильно промывали PBS до стабилизации pH на уровне ~ 7 по измерениям с помощью индикаторной бумаги для определения pH. Очищенный белок фильтровали через фильтр 0,2 мкм, затем добавляли 1 мл смолы Etox в соотношении 10 мл белка на 1 мл смолы. Связывание эндотоксина со смолой проводили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч при осторожном вращении. Смолу удаляли центрифугированием при 500 х g в течение 2 мин и отбирали белковый супернатант. Уровни эндотоксина измеряли с применением кассет EndoSafe®-PTS™ и анализировали на считывателе EndoSafe®-MCS (Charles River). Если уровень эндотоксина превышал 5 ЭЕ/мг после первой обработки Etox, описанную выше процедуру повторяли до тех пор, пока уровень эндотоксина не снижался до {{{ 5 ЭЕ/мг. Когда уровень эндотоксина был выше 5 ЭЕ/мг и стабилизировался после двух последовательных обработок Etox, для белка разрабатывали условия анионообменной или гидрофобной хроматографии для удаления оставшихся эндотоксинов.

Определение аффинности выбранных EGFR-связывающих доменов FN3 к EGFR-Fc (аффинность к EGFR-Fc)

Аффинность связывания выбранных EGFR-связывающих доменов FN3 с рекомбинантным внеклеточным доменом EGFR дополнительно характеризовали методами поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора Proteon (BioRad). Схема анализа (подготовка чипа, захват EGFR-Fc) была аналогична описанной выше схеме применительно к анализу скорости диссоциации. Выбранные EGFR-связывающие домены FN3 тестировали в концентрации 1 мкМ в серии 3-кратных разбавлений в горизонтальной ориентации. Для отслеживания исходной стабильности также вводили образец буфера.

Фазу диссоциации для всех концентраций каждого EGFR-связывающего домена FN3 отслеживали при скорости потока 100 мкл/мин в течение 30 минут (для доменов с ko_ff ~ 10^-2 с^-1 в соответствии с данными скринингового исследования скорости диссоциации) или 1 ч (для доменов с koff ~ 10^-3 с^-1 или менее). Из данных ответов вычитали два набора эталонных данных: 1) сигналы между пятнами для коррекции неспецифических взаимодействий между EGFR-связывающим доменом FN3 и поверхностью с иммобилизованными IgG; 2) сигналы канала буфера для коррекции смещения базовой линии из-за диссоциации со временем захваченного EGFR-Fc с поверхности. Обработанные данные связывания при всех концентрациях для каждого домена FN3 глобально аппроксимировали простой моделью связывания Ленгмюра 1:1 для получения кинетических констант (kon, ko_ff) и константы аффинности (KD). В табл. 5 представлены кинетические константы для каждого из конструктов с аффинностью от 200 пМ до 9,6 нМ.

Связывание выбранных EGFR-связывающих доменов FN3 с EGFR на клетках (анализ связывания с клетками A431)

Клетки A431 высевали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяя им прикрепиться в течение ночи при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Очищенные EGFRсвязывающие домены FN3 (от 1,5 нМ до 30 мкМ) добавляли к клеткам (50 мкл) в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Супернатант удаляли и клетки промывали 3 раза, добавляя в лунки буфер для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата антител к пентагистидину His-Alexa488 (Qiagen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 488 нм с помощью считывателя Acumen eX3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений EC₅₀. В таблице 5 представлены значения EC₅₀ для каждого из конструктов в диапазоне от 2,2 до > 2 0 мкМ.

Ингибирование связывания EGF с EGFR на клетках с использованием выбранных EGFRсвязывающих доменов FN3 (анализ конкуренции с EGF на клетках A431)

Клетки A431 высевали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяя им прикрепиться в течение ночи при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Очищенные EGFRсвязывающие домены FN3 (от 1,5 нМ до 30 мкМ) добавляли к клеткам (50 мкл/лунка) в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Биотинилированный EGF (Invitrogen, № по кат. E-3477) добавляли в каждую лунку с конечной концентрацией 30 нг/мл и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза буфером для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка.

- 30 035745

Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата стрептавидин-фикоэритрин (Invitrogen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 600 нм с помощью считывателя Acumen eX3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений IC₅₀. В табл. 5 представлены значения IC₅₀ для каждого из конструктов в диапазоне от 1,8 до 121 нМ.

Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR (анализ фосфо-EGRF)

Выбранные домены FN3, которые в значительной степени ингибировали стимулированное EGF фосфорилирование EGFR, более полно оценивали путем измерения значений IC₅₀ для ингибирования. Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR анализировали при разных концентрациях домена FN3 (от 0,5 нМ до 10 мкМ), как описано выше в разделе ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR. Строили график зависимости сигнала электрохемилюминесценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определяли значения IC₅₀ путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). В табл. 5 представлены значения IC₅₀ для каждого из конструктов в диапазоне от 18 нМ до > 2,5 мкМ.

Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток (анализ роста клеток NCI-H292 и NCI-H322)

Ингибирование EGFR-зависимого роста клеток оценивали по измерению жизнеспособности клеток человеческих опухолевых клеточных линий со сверхэкспрессией EGFR, NCI-H292 и NCI-H322 (Американская коллекция типовых культур, № по кат. CRL-1848 и CRL-5806 соответственно) после воздействия EGFR-связывающим доменом FN3. Клетки высевали по 500 клеток/лунка (NCI-H292) или по 1000 клеток/лунка (NCI-H322) на непрозрачные белые 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования тканей (Nunc), в среду RPMI (Gibco) 100 мкл/лунка, содержащую GlutaMAX™ и 10 мМ HEPES, с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco), и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Клетки обрабатывали фосфатно-буферным соляным раствором (PBS), содержащим разные концентрации EGFR-связывающих доменов FN3, по 5 мкл/лунка. Контроли обрабатывали 5 мкл/лунка только PBS или 25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в PBS. Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 120 ч. Жизнеспособные клетки обнаруживали путем добавления 75 мкл/лунка реагента CellTiter-Glo® (Promega) с последующим перемешиванием на шейкере для планшетов в течение 2 мин и инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение дополнительных 10 мин. Планшеты считывали на считывателе для планшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices) в режиме люминесценции с временем считывания 0,5 с/лунка по сравнению с пустой средой. Строили график зависимости процента роста обработанных PBS клеток от логарифма молярной концентрации домена FN3. Значения IC₅₀ определяли путем аппроксимации данных уравнением сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном с использованием GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). В табл. 5 представлены значения IC₅₀ в диапазоне от 5,9 нМ до 1,15 мкМ и от 9,2 нМ до >3,1 мкМ при применении клеток NCI-H292 и NCI-H322 соответственно.

В табл. 5 представлена сводная информация по биологическим свойствам EGFR-связывающих доменов FN3 для каждого анализа.

Таблица 5

Идентификатор клона домена FN3	SEQ ID NO:	Аффинность к EGFR-Fc (нМ)	Связывание с клетками А431	Конкуренция с EGF на клетках А431	Фосфо-EGFR	Рост NCI- Н292	Рост NCI- Н322
ЕС₅₀ (нМ)	1С₅₀ (нМ)	1С₅₀ (нМ)	1С₅₀ (нМ)	1С₅₀ (нМ)
P53A1R5-17	18	1,89	4,0	9, 8	> 2500	86	65
P54AR4-17	19	9, 62	16	21	184	Н/о	Н/о
P54AR4-47	20	2,51	8, 6	7,1	295	44	39
P54AR4-48	21	7,78	12	9, 8	170	Н/о	Н/о
P54AR4-73	22	0, 197	9, 4	4, 6	141	83	73
P54AR4-74	23	Н/о	77	Н/о	Н/о	Н/о	Н/о
P54AR4-81	24	Н/о	84	121	Н/о	Н/о	Н/о
P54AR4-83	25	0,255	2,2	1,8	18	5, 9	9, 2
P54CR4-31	26	0,383	> 20000	55	179	1150	> 3073

- 31 035745

Пример 4. Конструирование EGFR-связывающих доменов FN3

Было сконструировано подмножество EGFR-связывающих доменов FN3 для увеличения конформационной стабильности каждой молекулы. Мутации L17A, N46V и E86I (описаны в патентной публикации США № 2011/0274623) были введены в клоны P54AR4-83, P54CR4-31 и P54AR4-37 путем синтеза ДНК. Новые мутанты, P54AR4-83v2, P54CR431-v2 и P54AR4-37v2, экспрессировали и очищали так, как описано выше. Для оценки стабильности каждого мутанта для сравнения с соответствующей исходной молекулой применяли дифференциальную сканирующую калориметрию в PBS. В табл. 6 показано, что каждый клон в значительной степени стабилизировали со средним увеличением Tm=18,5°C.

Пример 5. Введение цистеина и химическая конъюгация EGFR-связывающих доменов FN3

Цистеиновые мутанты доменов FN3 получали из базовой молекулы Tencon и ее вариантов, которые не содержат цистеиновых остатков. Эти мутации можно получить с применением стандартных методик молекулярной биологии, известных в данной области, чтобы ввести уникальный цистеиновый остаток в базовую последовательность Tencon (SEQ ID NO: 1) или в другие домены FN3, чтобы он служил сайтом для химической конъюгации с низкомолекулярными лекарственными средствами, флуоресцентными метками, полиэтиленгликолем или любым числом других химических объектов. Выбираемый для мутации сайт должен удовлетворять определенным критериям. Например, молекула Tencon, в которую вводятся мутации для получения свободного цистеина, должна: (i) хорошо экспрессироваться в Е. coli; (ii) сохранять высокий уровень растворимости и термической стабильности; и (iii) сохранять связывание с мишенью-антигеном после конъюгации. Поскольку Tencon-каркас содержит всего -90-95 аминокислот, можно легко сконструировать варианты с одиночным цистеином в каждом положении каркаса и точно определить идеальное (-ые) положение (-я) для химической конъюгации.

Каждый отдельный аминокислотный остаток в положениях 1-95 (или 2-96 при наличии Nконцевого метионина) мутанта P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), связывающегося с EGFR, меняли на цистеин для оценки наилучших сайтов для химической конъюгации.

Конструирование, экспрессия и очистка

Аминокислотную последовательность каждого отдельного цистеинового варианта P54AR4-83v2 обратно транслировали в нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, с применением предпочтительных для экспрессии в Е. coli кодонов, и получали синтетический ген (ДНК 2.0). Эти гены клонировали в вектор pJexpress401 (ДНК 2.0) для экспрессии, стимулируемой промоторной последовательностью T5, и трансформировали в штамм Е. coli BL21(Agilent). Библиотека cys-сканирования P54AR483v2 была получена в виде наборов в глицерине, нанесенных на 96-луночный планшет, и экспрессию и очистку каждого гена проводили в соответствии с процедурой, описанной в примере 2.

Химическая конъюгация

В случае библиотеки «cys-сканирования» P54AR4-83v2 конъюгация была встроена в процесс очистки. Цистеиновые варианты в очищенном лизате связывали со смолой Ni-NTA в 96-луночном формате с применением планшетов His-trap HP (№ по кат. 28-4008-29, GE Healthcare) путем добавления лизатов в лунки и центрифугирования при 100xg в течение 5 мин. Смолу 3 раза промывали буфером A, а затем добавляли N-этилмалеимид (NEM) в виде 500 мкл 1,5 мМ раствора. После часовой инкубации при комнатной температуре на вращательном шейкере излишки NEM удаляли путем центрифугирования и трех промывок буфером A.

Конъюгированные цистеиновые варианты элюировали 2x150 мкл буфера B и меняли на PBS на фильтрующих планшетах Multiscreen с мембраной Ultracel-10 (№ по кат. MAUF1010, Millipore) или 96луночных планшетах PD MultiTrap (№ по кат. 28-9180-06, GE Healthcare). Конъюгаты характеризовали с помощью масс-спектрометрии (табл. 7). Цистеиновые варианты, которые плохо экспрессировались (менее чем 0,1 мг полученного белка из 5 мл культуры или белок не детектируется масс-спектрометрией) или плохо конъюгировались с NEM (менее чем 80% конъюгированных по данным масс-спектрометрии) исключали из дополнительного анализа. При этом из-за плохой экспрессии убирали L1C, W21C, Q36C, E37C, A44C, D57C, L61C, Y67C и F92C, а из-за низкой эффективности конъюгации - A17C, L19C, I33C, Y35C, Y56C, L58C, T65C, V69C, I71C и T94C.

- 32 035745

Таблица 7

Цистеиновый вариант P54AR4-83v2	Выход белка (мг)	Конъюгация
L1C	0,58	Белок не определялся
Р2С	0,28	Да
АЗС	1,05	Да
Р4С	0,77	Да
К5С	0, 19	Да
N6C	0,56	Да
L7C	0, 96	Да
V8C	1,40	Да
V9C	0, 92	Да
S10C	0, 91	Да
Е11С	0, 82	Да
V12C	0,76	Да
Т13С	0,53	Да
Е14С	1,05	Да
D15C	1, 12	Да
S16C	0, 65	Да
А17С	0,70	Нет
R18C	1,14	Да
L19C	0,47	Нет
S20C	1,02	Да
W21C	0, 09	Нет белка
D22C	0, 80	Да
D23C	0, 90	Да
Р24С	0, 63	Да
W25C	1,24	Да
А2 6С	1,34	Да
F27C	0, 92	Да
Y28C	1, 15	Да
Е29С	1,10	Да
S30C	0, 80	Да
F31C	0,75	Да
L32C	0, 64	Да
I33C	0, 09	Нет
Q34C	1,14	Да
Y35C	0, 85	Нет
Q36C	0, 04	Нет белка
Е37С	0, 84	Нет белка
S38C	0, 80	Да
Е39С	0,72	Да
К40С	1,20	Да
V41C	0, 99	Да
G42C	1,27	Да
Е43С	0,22	Да
А44С	0, 07	Да
I45C	1, 14	Да
V4 6C	0, 14	Да
L47C	1, 12	Да
Т48С	1,22	Да
V4 9C	1,10	Да
Р50С	0, 69	Да
G51C	1,15	Да

- 33 035745

Эксклюзионную хроматографию для каждого из конъюгированных с NEM цистеиновых вариантов

P54AR4-83v2 выполняли так, как описано в примере 2. Результаты представлены в табл. 8. Процентную долю мономера для каждого белка определяли путем интегрирования сигнала Abs280 и сравнения пика в области мономера (5,5-6 мин) с пиками в области олигомеров (4-5,3 мин).

- 34 035745

Таблица 8
Цистеиновый вариант P54AR4-83v2	Процентная доля мономера
L1C	100
Р2С	86
АЗС	100
Р4С	100
К5С	100
N6C	94
L7C	93
V8C	91
V9C	Двойной пик
S10C	80
Е11С	100
V12C	66
Т13С	82
Е14С	96
D15C	97
S16C	75
А17С	93
R18C	93
L19C	83
S20C	94
W21C	Нет белка
D22C	85
D23C	100
Р24С	88
W25C	76
А2 6С	95
F27C	97
Y28C	92
Е29С	85
S30C	94
F31C	57
L32C	100
I33C	100
Q34C	97
Y35C	100
Q36C	100
Е37С	87
S38C	93
Е39С	100
К40С	97
V41C	98
G42C	87
Е43С	100
А44С	100
I45C	97
V4 6C	100

- 35 035745

L47C	100
T48C	90
V4 9C	88
P50C	100
G51C	96
S52C	100
E53C	97
R54C	96
S55C	100
Y56C	97
D57C	100
L58C	67
T59C	100
G60C	100
L61C	нет белка
K62C	95
P63C	92
G64C	100
T65C	83
E66C	100
Y67C	Нет белка
T68C	100
V69C	90
S70C	100
I71C	Двойной пик
Y72C	100
G73C	66
V74C	100
H75C	100
N7 6C	94
V77C	92
Y78C	90
K79C	100
D80C	79
T81C	86
N82C	100
M83C	91
R84C	100
G85C	95
L86C	83
P87C	98
L88C	98
S89C	96
A90C	100
I91C	100
F92C	Нет белка
T93C	100
T94C	100
G95C	100
83v2His₆-cys (SEQ ID NO: 217 и 255)	97

- 36 035745

Анализ связывания EGFR

Относительную аффинность связывания конъюгированных с NEM цистеиновых вариантов P54AR4-83v2 с EGFR оценивали так, как описано в примере 2. В табл. 9 представлены сводные данные, показывающие отношения значений аффинности связывания каждого цистеинового варианта с EGFR относительно исходного белка P54AR4-83v2. Цистеиновые конъюгаты, которые имели уменьшенное связывание с EGFR (< 65% от сигнала, наблюдаемого для исходного белка P54AR4-83v2 при обработке 10 нМ белка) по данным иммуноферментного анализа (ИФА), были исключены из дополнительного анализа: P2C, A3C, P4C, K5C, L7C, D23C, W25C, F27C, Y28C, F31C, S55C, G73C, H75C, V77C, Y78C, Т81С, N82C, M83C и G85C.

- 37 035745

L47C	0, 91	1,02	0, 92
Т48С	0, 93	1,00	0, 88
V4 9C	0, 98	1,01	0, 96
Р50С	0, 97	1,05	0, 91
G51C	0, 92	1,03	0, 88
S52C	0, 93	1,03	0,78
Е53С	0, 91	1,02	0, 91
R54C	0, 93	1,01	0, 89
S55C	0, 11	0, 00	0, 00
Т59С	0, 93	1,04	0, 83
G60C	0, 93	1,02	0,86
К62С	0, 61	0,73	0, 64
Р63С	0, 92	1,02	0, 95
G64C	1,36	1,42	1,28
Е66С	H/o	H/o	H/o
Т68С	0, 95	1,04	0, 83
S70C	0, 93	1,01	0,86
Y72C	0, 93	1,00	0, 93
G73C	0,21	0, 02	0, 00
V74C	0, 95	1,01	0,76
Н75С	0,25	0, 19	0, 07
N7 6C	0, 91	0, 97	0,75
V77C	0, 03	0, 00	0, 03
Y78C	0, 68	0, 63	0,31
К79С	0, 93	0, 99	0, 90
D80C	0, 91	0, 97	0,70
Т81С	1, 02	0, 90	0,50
N82C	0, 96	0, 97	0,56
М83С	0,24	0, 04	0, 07
R84C	0, 98	1,04	0, 91
G85C	0,29	0, 02	0, 19
L86C	0, 92	0, 96	0,77
Р87С	0, 91	0, 93	0,73
L88C	0, 97	1,03	0, 95
S89C А90С I91C Т93С	1,04 1,01 1,00 1,04	1,02 1,05 1,01 1,05	0, 97 0, 94 0, 90 0, 96
G95C	1,00	1,03	1,01
83v2His₆-cys (SEQ ID NO: 217 и 255)	1,00	1,00	1,00

Термическая стабильность

Термическую стабильность конъюгатов цистеин-NEM оценивали методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Тестировали только конъюгаты, которые были определены как экспрессирующиеся с высокой эффективностью, эффективно конъюгируемые и сохраняющие связывание с EGFR. Кроме того, были исключены цистеиновые варианты внутри петель BC и FG. Данные по стабильности получали путем нагревания 400 мкл аликвоты варианта от 25 до 100°C при скорости нагрева 1°C в минуту в микрокалориметре VP-DSC (MicroCal). Для оценки обратимости термического сворачивания/разворачивания провели на образце второе идентичное сканирование. Для вычисления температуры

- 38 035745 плавления полученные данные аппроксимировали в модели разворачивания с 2 состояниями (табл. 10). Из дополнительного анализа были исключены цистеиновые варианты со сниженными температурами плавления (< 63°C или на > 8°C ниже, чем у исходного белка P54AR4-83v2) или варианты, демонстрирующие необратимое разворачивание: V9C, V12C, T13C, R18C, E29C, E39C, G42C, V49C, P50C, G51C и P63C.

Таблица 10

Цистеиновый вариант P54AR483v2	Первое сканирование, Тт (°C)	Второе сканирование, Тт (°C)	Обратимо?
N6C	71	70	Да
V8C	69	69	Да
V9C	46	46	Нет
S10C Е11С V12C Т13С Е14С D15C S16C R18C S20C Е29С S30C L32C Q34C S38C Е39С К40С V41C G42C I45C L47C Т48С V4 9C Р50С G51C Е53С R54C Т59С G60C К62С Р63С	68 71 58 63 70 73 68 62 70 63 71 71 75 65 67 70 71 65 69 67 72 54 63 61 76 65 67 66 65 60	68 72 58 63 71 73 68 62 70 66 71 70 74 65 69 70 71 67 68 67 72 55 65 61 75 65 67 66 65 62	Да Да Да Да Да Да Да Да Да Да Да Да Да Да Нет Да Да Нет Да Да Да Нет Нет Да Да Да Да Да Да Нет
G64C	70	70	Да
Т68С	72	72	Да
S70C	73	72	Да
Y72C	70	69	Да
V74C	68	67	Да

- 39 035745

L88C	70	70	Да
S89C	72	71	Да
А90С	67	67	Да
I91C	70	69	Да
Т93С	69	69	Да
83v2His₆-cys (SEQ ID NO: 217 и 255)	71	71	Да
P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27)	71	71	Да

Анализ цитотоксичности

Цистеиновые варианты P54AR4-83v2 конъюгировали с цитотоксическим ингибитором тубулина монометилауристатином F (MMAF) посредством отщепляемого ферментом линкера Val-Cit или неотщепляемого линкера PEG4 (VC-MMAF; см. фиг. 2) с применением методологии, описанной для конъюгации с NEM. Выполняли конъюгацию 32 вариантов, оставшихся после исключений на предыдущих этапах, с исходным белком P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 217 и 255) и Tencon (SEQ ID NO: 265) в качестве от рицательного контроля.

Уничтожение клеток оценивали путем измерения жизнеспособности клеток человеческой опухолевой линии H1573 со сверхэкспрессией EGFR после воздействия конъюгатов цистеиновых вариантов с цитотоксином. Клетки высевали на черные планшеты с прозрачным дном, обработанные для культивирования клеток (Falcon 353219), в количестве 7000/лунка, 100 мкл на лунку среды RPMI без фенолового красного (Gibco 11835-030) с 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco). Клетки оставляли на ночь для прикрепления при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Среду отсасывали из 96-луночного планшета и клетки обрабатывали 50 мкл свежей среды и 50 мкл 2X ингибитора, приготовленного в свежей среде. Жизнеспособность клеток определяли по анализу по конечной точке с помощью Cell TiterGlo (Promega) через 70 ч. Значения IC₅₀ определяли путем аппроксимации данных уравнением сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). В табл. 11 приведены значения IC₅₀, полученные на основе данных анализа CellTiter Glo. Среднее значение IC₅₀ для двух повторностей конъюгата 83v2-cys/vcMMAF составляло 0,7 нМ. Четыре из 32 протестированных конъюгатов имели значения IC50, которые более чем в два раза превышали значение для исходного белка (более 1,4 нМ), и были отброшены: L32C, T68C, Y72C и V74C. Кроме того, три конъюгата давали значения IC₅₀, в два раза более эффективные, чем у исходного белка, и они могут особенно хорошо подходить для преобразования в конъюгаты лекарственного средства: N6C, E53C и T93C.

- 40 035745

Таблица 11

Вариант	IC₅₀ (hM)
N6C	0, 16
V8C	0, 35
S10C	0, 43
Е11С	0, 94
Е14С	0, 34
D15C	0, 33
S16C	0, 75
S20C	0, 36
S30C	0, 78
L32C	2, 92
Q34C	0, 74
S38C	0,76
К40С	0, 73
V41C	1, 13
I45C	0, 63
L47C	1, 03
Т48С	0, 59
Е53С	0, 09
R54C	0, 37
Т59С	0, 44
G60C	1, 00
К62С	1,25
G64C	0, 36
Т68С	3, 70
S70C	1, 14
Y72C	1, 85
V74C	3, 13
L88C	0, 81
S89C	0, 94
А90С	1,00
I91C	0,54
Т93С	0,20
83v2His₆-cys (SEQ ID NO: 217 и 255)	0, 61
83v2His₆-cys (SEQ ID NO: 217 и 255)	0,79
Д.т.	146, 00
Д.т.	166,30

Конечные цистеиновые варианты

Было показано, что из 96 протестированных положений для 28 цистеиновых вариантов наблюдалось выполнение критериев сохранения высокого уровня экспрессии в Е. coli, эффективной конъюгации посредством тиол-малеимидной реакции, сохранения связывания с антигеном-мишенью EGFR, сохранения свойств термостабильности и обратимого разворачивания и сохранения способности к уничтожению клеток с высокой экспрессией EGFR при конъюгации цистеинового варианта с цитотоксическим лекарственным средством. Эти положения таковы: N6C (SEQ ID NO: 210 и 248), V8C (SEQ ID NO: 189 и 227), S1°C (SEQ ID NO: 190 и 228), E11C (SEQ ID NO: 191 и 229), E14C (SEQ ID NO: 192 и 230), D15C (SEQ ID NO: 193 и 231), S16C (SEQ ID NO: 194 и 232), S2°C (SEQ ID NO: 195 и 233), S3°C (SEQ ID NO: 196 и 234), Q34C (SEQ ID NO: 197 и 235), S38C (SEQ ID NO: 198 и 236), K4°C (SEQ ID NO: 199 и 237), V41C (SEQ ID NO: 200 и 238), I45C (SEQ ID NO: 201 и 239), L47C (SEQ ID NO: 202 и 240), T48C (SEQ ID NO: 203 и 241), E53C (SEQ ID NO: 204 и 242), R54C (SEQ ID NO: 205 и 243), T59C (SEQ ID NO: 206 и 244), G6°C (SEQ ID NO: 207 и 245), K62C (SEQ ID 208 и 246), G64C (SEQ ID NO: 209 и 247), T68C (SEQ ID NO: 210 и 248), S7°C (SEQ ID NO: 211 и 249), L88C (SEQ ID NO: 212 и 250), S89C (SEQ ID NO: 213 и 251), A9°C (SEQ ID NO: 214 и 252), I91C (SEQ ID NO: 215 и 253) и T93C (SEQ ID NO: 216 и 254). Местоположения этих 28 положений в пределах структуры белка 83v2 показаны на фиг. 3.

Пример 6. Выбор доменов фибронектина типа III (FN3), связывающихся с c-Met и ингибирующих связывание с HGF

Пэннинг на человеческом c-Met

Проводили скрининг библиотеки TCL14 на биотинилированный внеклеточный домен человеческого c-Met (bt-c-Met) для идентификации доменов FN3, способных к специфическому связыванию с c-Met. Для выбора 3 мкг библиотеки TCL14 транскрибировали и транслировали in vitro (IVTT) в линейном экстракте S30 Е. Coli (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и экспрессированную библиотеку блокировали Cis Block (2% BSA (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди (Promega) и 1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich)). Для выбора добавляли bt-c-Met в концентраци

- 41 035745 ях 400 нМ (цикл 1), 200 нМ (циклы 2 и 3) и 100 нМ (циклы 4 и 5). Связанные элементы библиотеки извлекали с применением магнитных гранул с нейтравидином (Thermo Fisher, г. Рокфорд, штат Иллинойс, США) (циклы 1, 3 и 5) или магнитных гранул со стрептавидином (Promega) (циклы 2 и 4), а несвязанные элементы библиотеки удаляли путем промывки гранул 5-14 раз 500 мкл PBS-T с последующей 2-кратной промывкой 500 мкл PBS.

Выполняли дополнительные циклы выбора для идентификации молекул доменов FN3 с улучшенными значения аффинности. Вкратце, результаты цикла 5 получали так, как описано выше, и подвергали дополнительным итерационным циклам выбора со следующими изменениями: инкубацию с bt-c-Met уменьшили с 1 ч до 15 мин, продолжительность захвата на гранулы снизили с 20 до 15 мин, концентрацию bt-c-Met уменьшили до 25 нМ (циклы 6 и 7) или 2,5 нМ (циклы 8 и 9) и провели дополнительную промывку в присутствии избытка небиотинилированного c-Met в течение 1 ч. Цель данных изменений заключалась в одновременном выборе связующих с потенциально более высокой скоростью ассоциации и более низкой скоростью диссоциации, что позволяет получить, по существу, меньшее значение K_D.

Продукты циклов 5, 7 и 9 клонировали с помощью ПЦР в модифицированный вектор pET15 (EMD Biosciences, г. Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США), содержащий сайт безлигазного клонирования (pET15-LIC), с применением праймеров TCON6 (SEQ ID NO: 30) и TCON5 E86I short (SEQ ID NO: 31), а белки экспрессировали как белки с His6-тегом на C-конце после преобразований и индукции IPTG (конечная концентрация 1 мМ, 30°C в течение 16 ч) с применением стандартных протоколов. Клетки собирали путем центрифугирования и затем лизировали с помощью Bugbuster HT (EMD Biosciences) с добавлением 0,2 мг/мл лизоцима из белка куриного яйца (Sigma-Aldrich). Бактериальные лизаты очищали путем центрифугирования и супернатанты переносили в новые 96-луночные планшеты deep-well.

Скрининг на домены FN3, ингибирующие связывание HGF с c-Met Домены FN3, присутствующие в лизатах Е. coli, подвергали скринингу на их способность ингибировать связывание HGF с очищенным внеклеточным доменом c-Met в биохимическом формате. Рекомбинантный человеческий химерный белок c-Met Fc (0,5 мкг/мл в PBS, 100 мкл/лунка) наносили на 96-луночные планшеты White Maxisorp Plates (Nunc) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшеты дважды промывали, используя 300 мкл/лунка трис-буферного соляного раствора с 0,05% Tween 20 (TBS-T, Sigma-Aldrich) в приборе для промывки планшетов Biotek. Планшеты для анализа блокировали StartingBlock T20 (200 мкл/лунка, Thermo Fisher Scientific, г. Рокленд, штат Иллинойс, США) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) при встряхивании и повторно дважды промывали 300 мкл TBS-T. Лизаты с доменом FN3 разбавляли в StartingBlock T20 (от 1:10 до 1:100000) с помощью роботизированной системы Hamilton STARplus. Лизаты (50 мкл/лунка) инкубировали на планшетах для анализа в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании. Без промывки планшетов добавляли bt-HGF (1 мкг/мл в StartingBlock T20, 50 мкл/лунка, биотинилированный) на 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. В контрольные лунки, содержащие лизаты Tencon27, добавляли либо Starting Block T20, либо разбавленный bt-HGF. Затем планшеты промывали четыре раза 300 мкл/лунка TBS-T и инкубировали с 100 мкл/лунка Streptavidin-HRP (1:2000 в TBS-T, Jackson Immunoresearch, г. Вест Гроув, штат Пенсильвания, США) в течение 30-40 минут при комнатной температуре при встряхивании. Планшеты повторно промывали TBS-T четыре раза. Для формирования сигнала на планшет добавляли хемилюминесцентный субстрат, POD Chemiluminescence Substrate (50 мкл/лунка, Roche Diagnostics, г. Индианаполис, штат Индиана, США), полученный в соответствии с инструкциями производителя, и в течение приблизительно 3 мин регистрировали хемилюминесценцию на приборе Molecular Devices M5 с использованием SoftMax Pro. Процентное ингибирование определяли с применением следующих расчетов: 100 - ((RLU_o6p^ - среднее RLU_kohтроль без ы-№г)/(среднее KLU^h^ы-hgf - среднее RL^h^ без ·····> 100). Значения процентного ингибирования 50% или более считались успешными.

Высокопроизводительная экспрессия и очистка доменов FN3 Домены FN3 с His-тегом очищали из лизатов Е. coli с использованием планшетов His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) и элюировали в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия и 250 мМ имидазола, pH 7,4. В очищенных образцах для анализа заменяли буфер на PBS, pH 7,4, с применением планшетов PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).

Определение IC₅₀ для ингибирования связывания HGF с c-Met Выбранные домены FN3 дополнительно характеризовали в анализе на конкуренцию с HGF. Строили кривые доза - ответ для очищенных доменов FN3 с использованием описанного выше анализа (начальные концентрации - 5 мкМ). Вычисляли значения процентного ингибирования. Строили график зависимости % ингибирования от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определяли значения IC₅₀ путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4.

В цикле 5 идентифицировали 35 уникальных последовательностей, показывающих активность при разбавлениях 1:10 со значениями IC₅₀ в диапазоне от 0,5 до 1500 нМ. В цикле 7 получали 39 уникальных последовательностей с активностью при разбавлениях 1:100 и значениями IC50 в диапазоне от 0,16 до 2,9 нМ. В цикле 9 идентифицировали 66 уникальных последовательностей, среди которых удачными считались варианты, демонстрирующие активность при разбавлениях 1:1000. В цикле 9 (табл. 13) наблюдали

- 42 035745 значения IC₅₀ лишь 0,2 нМ.

Пример 7. Характеризация доменов FN3, связывающихся с c-Met и ингибирующих связывание HGF

Домены FN3 экспрессировали и очищали так, как описано выше в примере 2. Эксклюзионную хроматографию и кинетический анализ проводили так, как описано выше в примерах 1 и 2 соответственно. В табл. 12 показаны последовательности тяжа С, петли CD, тяжа F и петли FG, а также полная аминокислотная последовательность SEQ ID NO: для каждого домена.

Таблица 12

Клон
Название	SEQ ID NO:	Петля С	Тяж CD	Петля F	Тяж FG
P114AR5P74- А5	32	FDSFWIRYDE	WVGGE	TEYYVNILGV	KGGSISV
P114AR5P75- Е9	33	FDSFFIRYDE	FLRSGE	TEYWVTILGV	KGGLVST
P114AR7P92- F3	34	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYIVNIMGV	KGGSISH
P114AR7P92- F6	35	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWNILGV	KGGGLSV
P114AR7P92- G8	36	FDSFVIRYFE	FLGSGE	TEYWQILGV	KGGYISI
P114AR7P92- Н5	37	FDSFWIRYLE	FLLGGE	TEYAWQIMGV	KGGTVSP
P114AR7P93- D11	38	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWGINGV	KGGYSSY
P114AR7P93- G8	39	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYGVTINGV	KGGRVST
PI14AR7P93- Н9	40	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWQIIGV	KGGHISL
P114AR7P94- АЗ	41	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWNIMGV	KGGKISP
P114AR7P94- Е5	42	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYAVNIMGV	KGGRVSV
P114AR7P95- В9	43	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWQILGV	KGGSISV
P114AR7P95- D3	44	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWNIMGV	KGGSISY
P114AR7P95- D4	45	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWQILGV	KGGYISI
P114AR7P95- ЕЗ	46	FDSFWIRYFE	FLGSGE	TEYWQIMGV	KGGTVSP
P114AR7P95- F10	47	FDSFWIRYFE	FTTAGE	TEYWNIMGV	KGGSISP
P114AR7P95- G7	48	FDSFWIRYFE	LISTGE	TEYWNIMGV	KGGSISP
P114AR7P95- Н8	49	FDSFWIRYFE	FVSKGE	TEYWNIMGV	KGGSISP

Остатки петли С соответствуют остаткам 28-37 указанной SEQ ID NO:

Остатки тяжа CD соответствуют остаткам 38-43 указанной SEQ ID NO:

Остатки петли F соответствуют остаткам 65-74 указанной SEQ ID NO:

Остатки тяжа FG соответствуют остаткам 75-81 указанной SEQ ID NO:

Связывание выбранных c-Met-связывающих доменов FN3 с c-Met на клетках

Клетки NCI-H441 (№ по кат. HTB-174, Американская коллекция типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния, США) высевали по 20000 клеток на лунку на покрытые поли^-лизином черные 96луночные планшеты с прозрачным дном (BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США) и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. Очищенные домены FN3 (50 мкл/лунка; 0-1000

- 43 035745 нМ) добавляли к клеткам на 1 ч при 4°C на двух планшетах. Супернатанты удаляли и клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка, BD Biosciences, № по кат. 554657). Клетки инкубировали с биотинилированным антителом к HIS (с разбавлением 1:160 в буфере для окрашивания при FACS, 50 мкл/лунка, R&D Systems, № по кат. BAM050) в течение 30 мин при 4°C. Клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка), после чего инкубировали с конъюгированными антителами к мышиному IgG1-Alexa 488 (с разбавлением 1:80 в буфере для окрашивания при FACS, 50 мкл/лунка, Life Technologies, № по кат. A21121) в течение 30 мин при 4°C. Клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка) и оставляли в буфере для окрашивания при FACS (50 мкл/лунка). Определяли полную флуоресценцию на считывателе Acumen eX3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений EC₅₀. Было обнаружено, что домены FN3 показывают диапазон значений активности связывания со значениями EC50 в диапазоне от 1,4 до 22,0, как показано в табл. 13.

Ингибирование стимулированного HGF фосфорилирования c-Met

Очищенные домены FN3 тестировали на их способность ингибировать стимулированное HGF фосфорилирование c-Met в NCI-H441 с применением набора c-Met phospho(Tyr1349) производства Meso Scale Discovery (г. Гейтерсберг, штат Мерилэнд, США). Клетки высевали по 20000/лунка на прозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования ткани, в среду RPMI 100 мкл/лунка (содержащую Glutamax и HEPES, Life Technologies), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Life Technologies) и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°C с 5% CO₂. Культуральную среду полностью удаляли и клетки выдерживали в условиях голодания в бессывороточной среде RPMI (100 мкл/лунка) при 37°C с 5% CO₂. Затем к клеткам добавляли свежую бессывороточную среду RPMI (100 мкл/лунка), содержащую домены FN3 в концентрации 20 мкМ и ниже, на 1 ч при 37°C с 5% CO2. Контроли обрабатывали только средой. Клетки стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF (100 мкл/лунка, R&D Systems, № по кат. 294-HGN) и инкубировали при 37°C, 5% CO₂, в течение 15 мин. Один набор контрольных лунок оставляли без стимуляции в качестве отрицательных контролей. Среду полностью удаляли и лизировали клетки полным лизирующим буфером Complete Lysis Buffer (50 мкл/лунка, Meso Scale Discovery) в течение 10 мин при комнатной температуре со встряхиванием в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты для анализа, предназначенные для измерения фосфорилированного c-Met, блокировали входящим в комплект блокирующим раствором в соответствии с инструкциями производителя при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты трижды промывали Tris Wash Buffer (200 мкл/лунка, Meso Scale Discovery). Клеточные лизаты (30 мкл/лунка) наносили на планшеты для анализа и инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч. Затем планшеты для анализа четырехкратно промывали Tris Wash Buffer, после чего в каждую лунку добавляли ледяной раствор детекторного антитела (25 мкл/лунка, Meso Scale Discovery) на 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Планшеты повторно четырехкратно промывали Tris Wash Buffer. Сигналы обнаруживали путем добавления буфера 150 Read Buffer (150 мкл/лунка, Meso Scale Discovery) и считывания на приборе SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) с применением заданных производителем параметров для данного анализа по умолчанию. Строили график зависимости сигнала электрохемилюминесценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определили значения IC₅₀ путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4. Было обнаружено, что домены FN3 ингибировали фосфорилированные c-Met со значениями IC₅₀ в диапазоне от 4,6 до 1415 нМ, как показано в табл. 13. Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток Ингибирование c-Met-зависимого роста клеток оценивали путем измерения жизнеспособности клеток U87-MG (Американская коллекция типовых культур, № по кат. HTB-14) после воздействия c-Met-связывающих доменов FN3. Клетки высевали по 8000 клеток на лунку на непрозрачные белые 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования ткани (Nunc), в среду RPMI 100 мкл/лунка с добавлением 10% FBS и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. Через 24 ч после высевания среду отсасывали и к клеткам добавляли свежую бессывороточную среду RPMI. Через 24 ч после обработки бессывороточной средой клетки обрабатывали путем добавления бессывороточной среды, содержащей c-Met-связывающие домены FN3 (30 мкл/лунка). Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 72 ч. Жизнеспособные клетки обнаруживали путем добавления 100 мкл/лунка реагента CellTiter-Glo® (Promega) с последующим перемешиванием на шейкере для планшетов в течение 10 мин. Планшеты считывали на считывателе для планшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices), настроенном на режим люминесценции, с временем считывания 0,5 секунды/лунка. Строили график зависимости исходных единиц люминесценции (RLU) от логарифма молярной концентрации домена FN3. Значения IC₅₀ определяли путем аппроксимации данных уравнением сигмовидной кривой доза - ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4. В табл. 13 показаны значения IC₅₀ в диапазоне от 1 нМ до > 1000 нМ.

- 44 035745

Таблица 13

Сводная информация по биологическим свойствам c-Met-связывающих доменов FN3

Клон	Аффинность (Kd, нМ)	Конкуренция с HGF, 1С₅₀(нМ)	Связывание с клетками Н441 (ЕС₅₀, нМ)	Ингибирование	Ингибирование пролиферации клеток U87-MG (1С₅₀, нМ)
Название	SEQ ID NO:
pMet Н441	в клетках (1С₅₀, нМ)
Pl14ARSP74-А5	32	10, 1	5, 2	18,7		1078	464,4
P114AR5P75-E9	33	45, 8	51,9	Н/о		1415	1193,9
P114AR7P92-F3	34	0,4	0,2	1,5		8,3	2,7
P114AR7P92-F6	35	3, 1	2,2	4,9		165, 3	350,5
P114AR7P92-G8	36	1,0	1, 6	S, 9		155, 3	123, 9
P114AR7P92-H5	37	11, 6	Н/о	22,0		766, 4	672,3
P114AR7P93-D11	38	Н/о	Н/о	2,3		16	14,4
P114AR7P93-G8	39	6, 9	1	3,8		459, 5	103,5
P114AR7P93-H9	40	3,3	2,9	1,2, 9		288,2	2,69,9
P114AR7P94-A3	41	0,4	0,2	1,4		5	9, 3
P114AR7P94-E5	42	4,2	0,7	3,4		124,3	195, 6
P114AR7P95-B9	43	0,5	0,3	Н/о		9, 8	17,4
P114AR7P95D3	44	0,3	0,2	1,5		4, 6	1,7
P114AR7P95-D4	45	0,4	Н/о	1,4		19, 5	19, 4
P114AR7P95-E3	46	1,5	Н/о	3,2		204, 6	209, 2
P114AR7P95-F10	47	4,2	1,4	4,4		187, 6	3,29, 7
P114AR7P95-G7	48	20, 0	Н/о	11,3	659, 3	692
P114AR7P95-H8	49	3,7	Н/о	4,1	209, 8	280,7

Термическая стабильность c-Met-связывающих доменов FN3

Для оценки стабильности каждого домена FN3 применяли дифференциальную сканирующую калориметрию в PBS. Результаты эксперимента показаны в табл. 14.

Пример 8. Создание и характеризация биспецифических к EGFR/c-Met молекул

Создание биспецифических к EGFR/c-Met молекул

Множество комбинаций EGFR- и c-Met-связывающих доменов FN3, описанных в примерах 1-6, соединяли в биспецифические молекулы, способные связываться как с EGFR, так и с c-Met. Кроме того, были созданы и соединены в биспецифические молекулы EGFR-связывающих доменов FN3, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 107-110, и c-Metсвязывающих доменов FN3, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 111-114. Были созданы синтетические гены, кодирующие аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO 50-72 и 106 (табл. 15), так чтобы сохранялся следующий формат: EGFR- 45 035745 связывающий домен FN3, затем пептидный линкер, затем c-Met-связывающий домен FN3. Для обеспечения очистки на C-конце встраивали полигистидиновый тег. Помимо этих молекул, описанных в табл. 15, линкер между двумя доменами FN3 варьировали по длине, составу последовательности и структуре в соответствии с указанным в табл. 16. Предусмотрена возможность применения ряда других линкеров для соединения таких доменов FN3. Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы экспрессировали и очищали из Е. coli, как описано применительно к моноспецифическим EGFR или c-Met доменам FN3, с применением этапов IMAC и гельпроникающей хроматографии.

Таблица 15

Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула	EGFR-связывающий домен FN3	c-MET-связывающий FN3	домен	Линкер
Идентификационный номер клона	SEQ ID	Идентификационный номер клона	SEQ ID	Идентификационный номер клона	SEQ ID	Последовательность	SEQ ID
ЕСВ1	50	P54AR4-83v2	27	P114AR5P74-A5	32	(GGGGS)4	79
ЕСВ2	51	P54AR4-83v2	27	P114AR7P94-A3	41	(GGGGS)4	79
ЕСВЗ	52	P54AR4-83v2	27	P114AR7P93-H9	40	(GGGGS)4	79
ЕСВ4	53	P54AR4-83v2	27	P114AR5P75-E9	33	(GGGGS)4	79
ЕСВ5	54	P53A1R5-17V2	107	P114AR7P94-A3	41	(GGGGS)4	79
ЕСВ6	55	P53A1R5-17V2	107	P114AR7P93-H9	40	(GGGGS)4	79
ЕСВ7	56	P53A1R5-17V2	107	P114AR5P75-E9	33	(GGGGS)4	79
ЕСВ15	57	P54AR4-83v2	27	P114AR7P94-A3	41	(AP)₅	81
ЕСВ27	58	P54AR4-83v2	27	P114AR5P74-A5	32	(AP)₅	81
ЕСВ60	59	P53A1R5-17V2	107	P114AR7P94-A3	41	(AP)₅	81
ЕСВ37	60	P53A1R5-17V2	107	P114AR5P74-A5	32	(AP)₅	81
ЕСВ94	61	P54AR4-83v22	108	P114AR7P94-A3v22	111	(AP) ₅	81
ЕСВ95	62	P54AR4-83v22	108	P114AR9P121-A6v2	112	(AP)₅	81
ЕСВ96	63	P54AR4-83v22	108	P114AR9P122-A7v2	113	(AP)₅	81
ЕСВ97	64	P54AR4-83v22	108	P114AR7P95-C5v2	114	(AP)₅	81
ЕСВ106	65	P54AR4-83v23	109	P114AR7P94-A3v22	111	(AP)₅	81
ЕСВ107	66	P54AR4-83v23	109	P114AR9P121-A6v2	112	(AP)₅	81
ЕСВ108	67	P54AR4-83v23	109	Pl14AR9P122-A7v2	113	(AP)₅	81
ЕСВ109	68	P54AR4-83v23	109	Pl14AR7P95-C5v2	114	(AP)₅	81
ЕСВ118	69	P53A1R5-I7v22	110	Pl14AR7P94-A3v22	111	(AP) ₅	81
ЕСВ119	70	P53A1R5-I7v22	110	P114AR9P121-A6v2	112	(AP)₅	81
ЕСВ120	71	P53A1R5-I7v22	110	Pl14AR9P122-A7v2	113	(AP)₅	81
ЕСВ121	72	P53A1R5-I7v22	110	Pl14AR7P95-C5v2	114	(AP) ₅	81
ЕСВ91	106	P54AR4-83v22	108	Pl14AR7P95-C5v2	114	(AP)₅	81
ЕСВ18	118	P54AR4-83v2	27	Pl14AR5P74-A5	32	(AP) ₅	81
ЕСВ28	119	P53A1R5-I7v2	107	P114AR5P74-A5	32	(AP)₅	81
ЕСВ38	120	P54AR4-83v2	27	Pl14AR7P94-A3	41	(AP)₅	81
ЕСВ39	121	P53A1R5-I7v2	107	Pl14AR7P94-A3	41	(AP)₅	81

Таблица 16

Линкер	SEQ ID NO:	Длина линкера в аминокислотах	Структура
GS	78	2	Неупорядоченная
GGGGS	105	5	Неупорядоченная
(GGGGS)4	79	20	Неупорядоченная
(AP)₂	80	4	Жесткая
(AP)₅	81	5	Жесткая
(AP) ₁₀	82	20	Жесткая
(AP)₂₀	83	40	Жесткая
A(EAAAK) ₅AAA	84	29	а-спиральная

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы повышают эффективность по сравнению с отдельными моноспецифическими молекулами, что указывает на авидность.

Клетки NCI-H292 высевали на 96-луночные планшеты в среду RPMI, содержащую 10% FBS. Через 24 ч среду заменяли на бессывороточную RPMI. Через 24 ч после бессывороточной среды клетки обрабатывали различными концентрациями доменов FN3: моноспецифического к EGFR домена FN3 с высокой аффинностью (P54AR4-83v2), моноспецифического к c-Met домена FN3 с низкой аффинностью (P114AR5P74-A5), смеси двух моноспецифических к EGFR и c-Met доменов FN3 или биспецифических к

- 46 035745

EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3 с низкой аффинностью к c-Met, соединенный с доменом FN3 с высокой аффинностью к EGFR (ECB1). Клетки обрабатывали в течение 1 ч моноспецифическими или биспецифическими молекулами и затем стимулировали EGF, HGF или комбинацией EGF и HGF в течение 15 мин при 37°C, 5% CO2. Клетки лизировали лизирующим буфером MSD и оценивали сигнализацию в клетках с применением соответствующих планшетов для анализа MSD в соответствии с инструкциями производителя, как описано выше.

Домен FN3 с низкой аффинностью к c-Met ингибировал фосфорилирование c-Met со значением IC₅₀, равным 610 нМ (фиг. 6). Как и ожидалось, домен FN3, связывающийся с EGFR, не был способен ингибировать фосфорилирование c-Met, а смесь моноспецифических молекул выглядела идентично только домену FN3, связывающемуся с c-Met. Однако биспецифическая к EGFR/c-Met молекула ингибировала фосфорилирование c-Met с IC₅₀, равным 1 нМ (фиг. 6), т.е. с обеспечением сдвига эффективности более чем на 2 порядка относительно одной моноспецифической к c-Met молекулы.

Потенциал биспецифической к EGFR/c-Met молекулы в отношении увеличения ингибирования фосфорилирования c-Met и/или EGFR посредством эффекта авидности оценивали на множестве типов клеток с различными значениями плотности и соотношениями c-Met и EGFR (фиг. 7). Клетки NCI-H292, NCI-H441 или NCI-H596 высевали на 96-луночные планшеты в среду RPMI, содержащую 10% FBS. Через 24 ч среду заменяли на бессывороточную RPMI. Через 24 ч после бессывороточной среды клетки обрабатывали разными концентрациями моноспецифического EGFR-связывающего домена FN3, моноспецифического c-Met-связывающего домена FN3 или биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ECB5, образована из P53A1R5-17v2 и P114AR7P94-A3). Клетки обрабатывали в течение 1 ч моноспецифическими или биспецифическими молекулами, а затем стимулировали EGF, HGF или комбинацией EGF и HGF в течение 15 мин при 37°C, 5% CO2. Клетки лизировали лизирующим буфером MSD и оценивали сигнализацию в клетках с применением соответствующих планшетов для анализа MSD в соответствии с инструкциями производителя, как описано выше.

На фиг. 7 (A-C) показано ингибирование EGFR с помощью моноспецифического EGFRсвязывающего домена FN3 по сравнению с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой в трех разных клеточных линиях. Для оценки авидности в анализе на фосфорилирование EGFR EGFR-связывающий домен FN3 со средней аффинностью (1,9 нМ) (P53A1R5-17v2) сравнивали с биспецифической к EGFR/cMet молекулой, содержащей тот же EGFR-связывающий домен FN3, соединенный с c-Met-связывающим доменом FN3 с высокой аффинностью (0,4 нМ) (P114AR7P94-A3). В клетках H292 и H596 ингибирование фосфорилирования EGFR для моноспецифических и биспецифических молекул было сопоставимым (фиг. 7A и 7B), вероятно, вследствие того, что данные клеточные линии имели высокое соотношение рецепторов EGFR и c-Met. Для проверки данной теории оценивали ингибирование фосфорилирования EGFR в клетках NCI-H441, содержащих больше рецепторов c-Met, чем EGFR. Обработка клеток NCIH441 биспецифической к EGFR/c-Met молекулой снижала IC50 для ингибирования фосфорилирования EGFR по сравнению с моноспецифическим EGFR-связывающим доменом FN3 в 30 раз (фиг. 7C).

Потенциал повышения эффективности в случае биспецифической к EGFR/c-Met молекулы оценивали в анализе фосфорилирования c-Met с применением молекулы с высокой аффинностью к EGFR (0,26 нМ) и средней аффинностью к c-Met (10,1 нМ). Как в клетках NCI-H292, так и в клетках NCI-H596 ингибирование фосфорилирования c-Met биспецифической молекулой было увеличено по сравнению с моноспецифическим c-Met-связывающим доменом FN3 в 134 и 1012 раз соответственно (фиг. 7D и 7E).

Было подтверждено, что повышенная эффективность ингибирования фосфорилирования EGFR и cMet биспецифическими к EGFR/c-Met молекулами отражается в увеличенном ингибировании сигнализации и пролиферации. В этих экспериментах смесь EGFR- и c-Met-связывающих доменов FN3 сравнивали с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой. Как описано в табл. 17 и 18, значения IC₅₀ для фосфорилирования ERK (табл. 17) и пролиферации клеток H292 (табл. 18) были снижены при обработке клеток биспецифической к EGFR/c-Met молекулой по сравнению с моноспецифическими связующими. IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK биспецифической к EGFR/c-Met молекулой было в 143 раза ниже, чем в случае смеси двух моноспецифических к EGFR и c-Met доменов FN3, что демонстрирует влияние авидности на эффективность молекул в данном анализе. В табл. 17 моноспецифические EGFR- или c-Met-связывающие домены FN3 ингибируют активность не полностью, и, следовательно, показанные значения IC₅₀ следует считать нижними пределами. Анализ пролиферации выполняли с применением разных комбинаций EGFR- и c-Met-связывающих доменов FN3 либо в виде смеси, либо в виде связанных в биспецифический формат. IC₅₀ для ингибирования пролиферации для биспецифической к EGFR/cMet молекулы было в 34-236 раз ниже, чем при использовании смеси моноспецифических исходных EGFR- или c-Met-связывающих доменов FN3. Это подтверждает, что эффект авидности, наблюдавшийся на уровне рецепторов (фиг. 6 и 7), преобразуется в улучшение ингибирования сигнализации в клетках (табл. 17) и пролиферации (табл. 18).

- 47 035745

Таблица 17

Специфичность молекулы, содержащей домен FN3	Клон №	Тип	1С₅₀ (нМ) (фосфорилирование ERK)
EGFR	P54AR4-83v2	Моноспецифическая	> 10000
c-Met	P114AR5P74-A5	Моноспецифическая	2366
EGFR или с- Met	P54AR4- 83ν2+Ρ114AR5P 7 4-A5	Смесь моноспецифических молекул	798,4
EGFR и c-Met	ECB1	Биспецифическая	5, 6

Таблица 18

EGFR-связыв ающий домен FN3 (аффинность)	c-Met-связывающий домен FN3 (аффинность)	1С₅о для смеси моноспецифических молекул (нМ)	ICso ДЛЯ биспецифических молекул (нМ)	Кратность повышения 1С₅₀ для биспецифических молекул/смеси моноспецифических молекул
P54AR4-83v2 (0,28 нМ)	P114ARP94-A3 (0,4 нМ)	36, 5	1,04	35
P54AR4-83v2 (0,26 нМ)	P114AR7P93-H9 (3,3 нМ)	274,5	8,05	34
P54AR4-83v2 (0,26 нМ)	P114AR5P74-A5 (10,1 нМ)	1719	7,29	236

Опухолевые ксенотрансплантаты in vivo: фармакокинетика/фармакодинамика (ФК/ФД)

Для определения эффективности моноспецифических и биспецифических молекул, содержащих домены FN3, in vivo конструировали опухолевые клетки, секретирующие человеческий HGF (мышиный HGF не связывается с человеческим HGF). Человеческий HGF стабильно экспрессировался в клетках NCI-H292 с применением инфицирования лентивирусом (лентивирусный ДНК-вектор, экспрессирующий человеческий HGF (№ по кат. X16322), и набор для лентивирусной упаковки производства Genecopoeia). После инфицирования экспрессирующие HGF клетки выбирали, используя 4 мкг/мл пуромицина (Invitrogen). Человеческий белок HGF обнаруживали в кондиционированной среде объединенных клеток с применением планшетов для анализа производства MesoScale Discovery.

Мышей линии SCID Beige подкожно инокулировали клетками NCI-H292, экспрессирующими человеческий HGF (2,0х 10⁶ клеток в Cultrex (Trevigen) в объеме 200 мкл), в дорзальную часть бока каждого животного. Измерения опухолей проводили дважды в неделю до тех пор, пока объем опухоли не составил 150-250 мм³. Затем мышам и/п вводили одну дозу биспецифических к EGFR/c-Met молекул (связанных с альбумин-связывающим доменом для увеличения периода полужизни) или носитель PBS. Через 6 или 72 ч после введения опухоли извлекали и немедленно замораживали в жидком азоте. Образцы крови собирали посредством кардиальной пункции в 3,8% цитрат, содержащий ингибиторы протеаз. Сразу же после сбора образцы крови центрифугировали, полученную плазму переносили в пробирки для образцов и хранили при -80°C. Опухоли взвешивали, разрезали на небольшие части и лизировали в пробирках Lysing Matrix A (LMA), содержащих буфер RIPA с ингибиторами протеаз/фосфатаз HALT (Pierce), 50 мМ фторида натрия (Sigma), 2 мМ активированного ортованадата натрия (Sigma) и 1 мМ PMSF (MesoScale Discovery). Лизаты удаляли из матрицы LMA и центрифугировали для удаления нерастворимого белка. Растворимый белок опухоли количественно определяли в анализе на белок BCA и разбавляли до эквивалентных уровней белка в лизирующем буфере для опухоли. Фосфорилированные c-Met, EGFR и ERK измеряли при помощи планшетов для анализов производства MesoScale Discovery (в соответствии с протоколом производителя и приведенным выше описанием).

На фиг. 6 показаны результаты экспериментов. Каждая биспецифическая к EGFR/c-Met молекула в значительной степени снижала уровни фосфорилированных c-Met, EGFR и ERK как через 6 ч, так и через 72 ч. Данные, представленные на фиг. 6, показывают значимость одновременного ингибирования как c-Met, так и EGFR, а также то, как аффинность биспецифической к EGFR/c-Met молекулы для каждого рецептора влияет на ингибирование расположенной ниже ERK. Молекулы, содержащие высокоаффинные EGFR-связывающие домены FN3 (P54AR4-83v2; показан как элемент 8 на фигуре, K_D=0,26 нМ), ингибировали фосфорилирование EGFR в большей степени, чем молекулы, содержащие среднеаффинные EGFR-связывающие домены FN3 (P53A1R5-17v2; показан как элемент 17 на фигуре, KD=1,9 нМ), как через 6, так и через 72 ч. Все четыре протестированные биспецифические молекулы полностью ингибировали фосфорилирование ERK в момент времени через 6 ч независимо от аффинности. К 72

- 48 035745 часовому сроку молекулы, содержащие высокоаффинный c-Met-связывающий домен (P114AR7P94-A3; показан как элемент A3 на фигуре, K_D=0,4 нМ), в значительной степени ингибировали фосфорилирование ERK по сравнению со среднеаффинным c-Met-связывающим доменом FN3 (P114AR5P74-A5; показан как элемент A5 на фигуре; K_D=10,l нМ; фиг. 6).

Концентрацию каждой биспецифической к EGFR/c-Met молекулы измеряли через 6 и 72 ч после введения в крови и в опухоли (фиг. 9). Интересно, что биспецифическая молекула со среднеаффинным EGFR-связывающим доменом (P53A1R5-17v2; K_D=1,9 нМ), но высокоаффинным c-Met-связывающим доменом FN3 (P114AR7P94-A3; K_D=0,4 нМ) значительно сильнее накапливалась в опухоли через 6 часов по сравнению с другими молекулами, причем различие уменьшалось к 72 ч. Можно предположить, что клетки за пределами опухоли имеют более низкие уровни экспрессии как EGFR, так и c-Met на поверхности, и, следовательно, молекула со средней аффинностью к EGFR не связывается с нормальной тканью так прочно, как EGFR-связывающий домен FN3 с высокой аффинностью. Таким образом, для связывания с опухолью остается больше свободного EGFR-связывающего домена FN3 со средней аффинностью. Таким образом, определение соответствующих значений аффинности к каждому рецептору может позволить обнаружить терапевтическое средство со сниженными значениями системной токсичности и повышенным накоплением в опухоли.

Исследования эффективности биспецифических к EGFR/c-Met молекул в отношении опухоли

Мышей линии SCID Beige подкожно инокулировали клетками NCI-H292, экспрессирующими человеческий HGF (2,0х10⁶ клеток в Cultrex (Trevigen), 200 мкл), в дорзальную часть бока каждого животного. Через одну неделю после имплантации мышей делили на группы с эквивалентными объемами опухолей (средний объем опухоли=77,9+/-1,7 мм³). Мышам три раза в неделю вводили биспецифические молекулы и дважды в неделю регистрировали объем опухоли. Ингибирование роста опухоли (TGI) наблюдали при использовании четырех разных биспецифических молекул с различными значениями аффинности к c-Met и EGFR. На фиг. 10 показан благоприятный эффект ингибирования как c-Met, так и EGFR, поскольку наблюдали задержку роста опухоли у мышей, получавших обработку молекулами, содержащими EGFR-связывающий домен FN3 с высокой аффинностью, по сравнению с EGFR-связывающим доменом FN3 со средней аффинностью, когда c-Met-связывающий домен FN3 имел среднюю аффинность (незаштрихованные и заштрихованные треугольники, P54AR4-83v2-P114AR5P74-A5 по сравнению с P53A1R5-17-P114AR5P74-A5). Кроме того, данные показывают значимость наличия c-Metсвязывающего домена FN3 с высокой аффинностью, поскольку биспецифические молекулы, содержащие EGFR-связывающие домены FN3 либо с высокой, либо со средней аффинностью, но c-Met-связывающий домен FN3 с высокой аффинностью, показали наибольшую эффективность (пунктирные серые и черные линии, P54AR4-83v2-P114AR7P94-A3 и P53A1R5-17v2-P114AR7P94-A3).

Эффективность биспецифической молекулы и других ингибиторов EGFR и c-Met

Терапевтическую эффективность in vivo биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ECB38) и низкомолекулярных ингибиторов кризотиниба (ингибитор c-Met) и эрлотиниба (ингибитор EGFR), цетуксимаба (антитела к EGFR), каждого по отдельности, а также комбинации кризотиниба и эрлотиниба оценивали в модели подкожной ксенотрансплантации клеток человеческого рака легких H292-HGF мышам линии SCID/Beige (фиг. 11).

Клетки H292-HGF культивировали in vitro в среде RPMI1640 с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (10% об./об.) и L-глутамина (2 мМ) при 37°C в воздушной атмосфере с 5% CO₂. Клетки регулярно пересевали дважды в неделю с обработкой трипсин-ЭДТА. Клетки, достигшие фазы экспоненциального роста, собирали и подсчитывали для инокуляции опухоли.

Для развития опухоли мышей подкожно инокулировали в область правого бока опухолевыми клетками H292-HGF (2х10⁶) в 0,1 мл PBS с Cultrex (1:1). Обработку начинали, когда средний размер опухоли достигал 139 мм³. Введение тестового препарата и число животных в каждой экспериментальной группе показаны в таблице плана эксперимента ниже (табл. 26). Дату инокуляции опухолевыми клетками обозначали как 0 сутки.

- 49 035745

Таблица 26

Группа	N	Обработка	Доза (мг/кг)	Способ введения	Плановый график	Фактический график
1	10	Контроль с носителем	0	и/п	QD	х 3	недели	QD >	< 3 недели
2	10	Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула	25	и/п	3 раза неделю недели	в х 3	3 раза в неделю х 3 недели
3	10	Кризотиниб	50	п/о	QD	х 3	недели	QD >	< 17 суток
4	10	Эрлотиниб	50	п/о	QD	х 2	недели	QD >	< 3 недели
5	10	Кризотиниб	50	п/о	QD	х 3	недели	QD >	< 3 недели
		Эрлотиниб	50	п/о	QD	х 2	недели	QD >	< 3 недели
6	10	Цетуксимаб	1 мг/мышь	и/п	Q4d	х	6	Q4d	х 6

N: число животных; п/о: пероральное введение; и/п: интраперитонеальная инъекция 3 раза в неделю: введение доз в 1, 3 и 5 сутки недели.

QD: один раз в сутки; Q4d: один раз в четверо суток; интервал для комбинации кризотиниба и эрлотиниба составлял 0,5 ч; объем дозы корректировали с учетом массы тела (10 л/г); а: дозу не давали на 14 сутки после деления на группы.

Перед началом обработки всех животных взвешивали и измеряли объемы опухолей. Поскольку объем опухоли может влиять на эффективность любой конкретной обработки, мышей распределяли по группам в соответствии с планом с рандомизированными блоками на основе объемов опухолей у них. Это гарантирует, что все группы на исходном уровне будут сопоставимы. Для распределения экспериментальных животных по группам применяли план с рандомизированными блоками. Во-первых, экспериментальных животных делили на однородные блоки в соответствии с исходным размером опухолей у них. Во-вторых, в пределах каждого блока проводили рандомизацию экспериментальных животных по типам обработки. Распределение экспериментальных животных с использованием плана с рандомизированными блоками гарантирует, что у всех животных имеется одинаковая вероятность получения конкретного типа обработки, и, следовательно, снижается систематическая ошибка.

Во время регулярного контроля у животных проверяли влияние роста опухоли и типа обработки на нормальное поведение, в частности на подвижность, визуальную оценку потребления корма и воды, прирост/потерю массы тела (вес тела измеряли дважды в неделю), помутнение глаз/шерсти и любые другие аномальные влияния.

Основная конечная точка - возможность замедлить рост опухоли или излечить мышей-носителей опухоли. Размер опухоли измеряли дважды в неделю в двух направлениях с помощью штангенциркуля; объем выражали в мм³ с применением формулы: V=0,5 a х b², где a и b представляют собой большой и малый диаметры опухоли соответственно. Затем размер опухоли применяли для вычислений значений как T-C, так и T/C. Вычисляли значение T-C, где T - время (в сутках), необходимое для того, чтобы опухоль среднего размера в группе лечения достигла 1000 мм³, а C - время (в сутках), необходимое для того, чтобы опухоль среднего размера в контрольной группе достигла того же размера. Значение T/C (в процентах) представляло собой показатель противоопухолевой эффективности; T и C представляли собой средние объемы в группе обработки и контрольной группе соответственно в заданные сутки. Полную регрессию опухоли (CR) определяли как уменьшение опухолей до предела, который не обнаруживается при пальпации (62,5 мм³). Частичную регрессию опухоли (PR) определяли как уменьшение опухолей относительно исходного объема опухоли. Чтобы CR или PR расценивались как устойчивые, требовалось, чтобы CR или PR определялись минимум в течение 3 или более последовательных измерений опухоли.

Животных, у которых потеря массы тела превышала 20% или у которых средний размер опухоли в группе превышал 2000 мм³, усыпляли. Исследование завершали через две недели наблюдения после введения конечной дозы.

Сводная статистика, включающая среднее и стандартную погрешность среднего (СПС), представлена для объема опухоли в каждой группе и в каждый момент времени (показана в табл. 19 ниже). Статистические анализы различий в объеме опухоли между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими отдельными сравнениями с применением критерия Геймса-Хоуэлла (не предполагает равные дисперсии). Все данные анализировали с применением SPSS 18.0. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

- 50 035745

Таблица 19. Размеры опухолей в группах обработки

Сутки	Объем опухоли (мм³) а
	Носитель	Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула 25 мг/кг	Кризотиниб при дозе 50 мг/кг	Эрлотиниб при дозе 50 мг/кг	Кризотиниб; эрлотиниб при дозе 50 мг/кг; 50 мг/кг	Цетуксимаб при дозе 1 мг/мышь
7	13 9+7	137+7	140+9	141+8	139+8	139+10
9	230+20	142+7	217+20	201+19	134+9	168+13
13	516+45	83+6	547+43	392+46	109+10	212+20
16	808+104	44+7	914+92	560+70	127+15	252+28
20	1280+209	30+6	1438+239	872+136	214+30	371+48
23	1758+259	23+7	2102+298	1122+202	265+40	485+61
27	2264+318	21+5	--	1419+577	266+42	640+82
30	--	23+6	--	1516+623	482+61	869+100

Средний размер опухоли в группе, получавшей обработку носителем (группа 1), достиг 1758 мм³ на 23 сутки после инокуляции опухоли. Лечение биспецифической к EGFR/c-Met молекулой при уровне дозы 25 мг/кг (группа 2) приводило к полной регрессии опухоли (CR) у всех мышей, которая была устойчива при > 3 последовательных измерениях опухоли (среднее значение объема опухоли 23 мм³, значение T/C=1%, p=0,004, по сравнению с группой, получавшей носитель, на 23 сутки).

Обработка только кризотинибом при уровне дозы 50 мг/кг (группа 3) не показала противоопухолевой эффективности; средний размер опухоли составил 2102 мм³ на 23 сутки (значение T/C=120%, p=0,944, по сравнению с группой, получавшей носитель).

Обработка только эрлотинибом при уровне дозы 50 мг/кг (группа 4) показала небольшую противоопухолевую эффективность, но не было выявлено достоверных отличий от группы, получавшей носитель; средний размер опухоли составил 1122 мм³ на 23 сутки (значение T/C=64%, p=0,429, по сравнению с группой, получавшей носитель), при этом наблюдалась задержка роста опухоли на 4 суток при размере опухоли 1000 мм³ по сравнению с группой, получавшей носитель.

Комбинация кризотиниба (50 мг/кг, группа 5) и эрлотиниба (50 мг/кг, группа 5) продемонстрировала значительную противоопухолевую активность; средний размер опухоли составил 265 мм³ на 23 сутки (T/C=15%; p=0,008), при этом наблюдалась задержка роста опухоли на 17 суток при размере опухоли 1000 мм³ по сравнению с группой, получавшей носитель.

Обработка только цетуксимабом при уровне дозы 1 мг/мышь (группа 6) не продемонстрировала значительной противоопухолевой активности; средний размер опухоли составил 485 мм³ на 23 сутки (T/C=28%; p=0,018), при этом наблюдалась задержка роста опухоли на 17 суток при размере опухоли 1000 мм³ по сравнению с группой, получавшей носитель. На фиг. 11 показаны значения противоопухолевой активности различных терапевтических средств.

Противоопухолевая активность

Таблица 20

Обработка	Размер опухоли (мм³) на 23 сутки	Т/С (%)	Т - С (сутки) при 1000 мм³	Значение Р

Носитель	1758+259	--	--	--
Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула (25 мг/кг)	2 317	1	—	0, 004
Кризотиниб (50 мг/кг)	21021298	120	-1	0, 944
Эрлотиниб (50 мг/кг)	1122+202	64	4	0,429
Кризотиниб+эрлотиниб (50 мг/кг+50 мг/кг)	265140	15	17	0, 008
Цетуксимаб (1 мг/мышь)	485161	28	17	0, 018

Потерю массы тела от средней до тяжелой наблюдали в группе, получавшей носитель, что может быть обусловлено растущей опухолевой нагрузкой; 3 мыши погибли, а 1 мышь усыпили, когда потеря массы тела (BWL) к 23 суткам составила > 20%. Небольшую токсичность биспецифической к EGFR/cMet молекулы наблюдали в группе 2; 3 мышей усыпили при достижении в период обработки BWL >

- 51 035745

20%; масса тела постепенно восстанавливалась при отмене обработки в течение 2-недельного периода наблюдения. Более тяжелую потерю массы тела наблюдали в группе монотерапии кризотинибом или эрлотинибом по сравнению с группой, получавшей носитель, что указывает на связанную с обработкой токсичность. Комбинация кризотиниба и эрлотиниба по существу переносилась на фазе дозирования, но к концу исследования наблюдали сильную потерю массы тела, что может быть связано с возобновлением быстрого роста опухоли в период отсутствия обработки. Монотерапия цетуксимабом переносилась в исследовании хорошо; потерю массы тела наблюдали только к концу исследования из-за возобновления роста опухоли.

Таким образом, биспецифическая к EGFR/c-Met молекула при 25 мг/кг (3 раза в неделю х 3 недели) обеспечивала полный ответ в модели ксенотрансплантации клеток человеческого рака легких H292-HGF мышам линии SCID/Beige. Обработку перенесли 7 из 10 мышей, а у 3 из 10 мышей наблюдали сильную потерю массы тела. На фиг. 11 и в табл. 20 показано влияние различных терапевтических средств на размер опухоли в моменты времени после обработки.

Пример 9. Продление периода полужизни биспецифических к EGFR/c-Met молекул

Было описано множество способов уменьшения почечной фильтрации и, таким образом, продления периода полужизни белков в сыворотке, включая модификацию полиэтиленгликолем (ПЭГ) или другими полимерами, связывание с альбумином, слияние с доменами белков, которые связываются с альбумином или другими сывороточными белками, генетическое слияние с альбумином, слияние с Fc-доменами IgG и слияние с длинными неструктурированными аминокислотными последовательностями.

Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы модифицировали с помощью ПЭГ для увеличения гидродинамического радиуса путем встраивания свободного цистеина на C-конце молекулы. Чаще всего свободная тиольная группа цистеинового остатка применяется для присоединения молекул ПЭГ, которые функционализировали группами малеимида или йодацетимида с применением стандартных способов. Для модификации белка можно применять различные формы ПЭГ, включая линейные ПЭГ с массой 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 или 40000 кДа. Также для модификации можно применять разветвленные молекулы ПЭГ с этими значениями молекулярной массы. В некоторых случаях группы ПЭГ также можно присоединять при помощи первичных аминов в биспецифических к EGFR/c-Met молекулах.

Помимо пегилирования период полужизни биспецифических к EGFR/c-Met молекул продлевали путем получения этих белков в виде слитных молекул с природным 3-спиральным связывающим сывороточный альбумин доменом (ABD) или консенсусным альбумин-связывающим доменом (ABDCon). Эти белковые домены присоединяли к C-концу c-Met-связывающего домена FN3 посредством любого из линкеров, описанных в табл. 16. Домен ABD или ABDCon также можно помещать в первичную последовательность между EGFR-связывающим доменом FN3 и c-Met-связывающим доменом FN3.

Пример 10. Характеризация выбранных биспецифических к EGFR/c-Met молекул

Выбранные молекулы EGFR/c-Met характеризовали по их аффинности как к EGFR, так и к c-Met, по их способности ингибировать аутофосфорилирование EGFR и c-Met и по их воздействию на пролиферацию клеток HGF. Аффинность связывания биспецифических к EGFR/c-Met молекул с рекомбинантным внеклеточным доменом EGFR и/или c-Met дополнительно оценивали методами поверхностного плазмонного резонанса с помощью прибора Proteon (BioRad) в соответствии с протоколом, описанным в примере 3. Результаты характеризации показаны в табл. 21.

Таблица 21

	K_d (EGFR, нМ)	K_d (c-Met, нМ)	Ингиби- рование pMet в клетках Н441 (ic₅₀, нМ)	Н292 ингибирование pEGFR в клетках Н292 (_1С50, нМ)	H292-HGF ингибирование пролиферации в индуцированных HGF клетках Н292 (тс₅₀, нМ)
ЕСВ15	0,2	2, 6	н/д	4,2	23
ЕСВ94	1	4,3	53, 8	5, 1	29, 6
ЕСВ95	1, 1	6, 2	178,8	13, 6	383,4
ЕСВ96	1, 6	22,1	835, 4	24,7	9480
ЕСВ97	1,3	1,7	24,2	16, 6	31,0
ЕСВ106	16, 7	5, 1	53,3	367,4	484,5
ЕСВ107	16, 9	9	29, 9	812,3	2637
ЕСВ108	15, 3	25, 5	126, 2	814,4	11372
ЕСВ109	17,3	2,1	26	432	573, 6

Пример 11. Создание и характеризация биспецифических к EGFR/c-Met молекул с внедренными остатками цистеина

Создание биспецифических к EGFR/c-Met молекул

На основе данных, полученных в результате цистеинового сканирования мутанта P54AR4-83v2

- 52 035745 (пример 5), для продления периода полужизни также были разработаны цистеиновые мутанты, обозначенные ECB147 (SEQ ID NO: 218 и 256), в биспецифической к EGFR/c-Met молекуле, которая состоит из P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), связующего cMet P114AR7P95-C5v2 (SEQ ID NO: 114) и альбуминсвязывающего домена. Эти три домена соединены линкерами (Ala-Pro) 5 (SEQ ID NO: 81). Были разработаны варианты с одним, двумя или четырьмя цистеинами с заменами на C-конце, в линкерных областях или в положении Lys-62 одного из доменов FN3 (SEQ ID NO: 219-225 и 257-263). Другой биспецифический вариант, ECB82cys (SEQ ID NO: 226 и 264), состоит из P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), P114AR7P94-A3v22 (SEQ ID NO: 111), варианта альбумин-связывающего домена, причем все три домена соединены линкерами AP, и одного C-концевого цистеина. Также для конструирования контрольных конъюгатов применяли дополнительный цистеиновый вариант не нацеленного на мишень каркаса Tencon (SEQ ID NO: 265). Все варианты конструировали, экспрессировали и очищали так, как описано в предыдущих примерах. Чистоту оценивали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза. Аналитическая эксклюзионная хроматография с применением колонки Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) показывает, что препараты с доменом FN3 не содержат агрегатов и элюируются во время, соответствующее мономерному белку, По данным масс-спектрометрии, массы соответствовали теоретическим массам (табл. 22).

Таблица 22

Название варианта	Расчетная MW (Да)	Экспериментальная MW (Да)
ECB147V1	27895	27894
ECB147v2	27838	27837
ECB147v3	27877	27876
ECB147v4	27895	27894
ECB147v5	27813	27812
ECB147v6	27838	27837
ECB147v7	27927	27926
P54AR4-83v2-cys	11789	11790
Tencon-cys	10820

Химическая конъюгация

Для химической конъюгации очищенных биспецифических цистеиновых вариантов с малеимидсодержащими молекулами белки сначала восстанавливали с помощью TCEP, получив свободные тиолы. 1-2 мг каждого биспецифического цистеинового варианта смешивали с избытком TCEP при нейтральном pH (Sigma, № по кат. 646547) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-60 мин. TCEP удаляли путем добавления 3 объемов насыщенного раствора сульфата аммония (4,02 М) с осаждением цистеиновых вариантов. После центрифугирования при 16000-20000xg при 4°C в течение 20 мин и удаления супернатанта осадок белка растворяли в PBS или натрий-фосфатном буфере и сразу же смешивали с 5- или 10-кратным избытком малеимид-содержащей молекулы. Реакционную смесь инкубировали в течение 30-60 мин при комнатной температуре, а затем гасили избытком свободного тиола, например цистеином или β-меркаптоэтанолом, чтобы убрать избыток малеимида. Несвязанный малеимид удаляли при помощи обессоливающих колонок Zeba (Thermo, № по кат. 89890), препаративной эксклюзионной хроматографии (SEC) на колонке Tosoh G3000SWxl (№ P4619-14N; 7,8 мм x 30 см; 5 мкм) или путем связывания цистеинового варианта со смолой Ni-NTA, промывки и элюирования по существу так, как описано выше. Конъюгаты характеризовали при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза и масс-спектрометрии. Этот общий способ применяли для конъюгации биспецифических цистеиновых вариантов с молекулами флуоресцеин-малеимида (Thermo, № по кат. 62245), ПЭГ24-малеимида (Quanta Biodesign, № по кат. 10319) и малеимид-цитотоксина с помощью различных линкеров (см. структуры на фиг. 2).

Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR Очищенные биспецифические конъюгаты с ПЭГ24-малеимидом тестировали на способность ингибировать стимулированное EGF фосфорилирование EGFR в клетках человеческой опухолевой линии NCI-H292 (Американская коллекция типовых культур, № по кат. CRL-1848) с применением набора EGFR phospho(Tyr1173) производства Meso Scale Discovery (г. Гейтерсберг, штат Мерилэнд, США), а также так, как описано в примере 3. Эти конъюгаты сравнивали с немодифицированным ECB38 (SEQ ID No. 109), который отличается от ECB147 двумя аминокислотами. Конъюгаты и ECB38 ингибировали EGFR с аналогичными значениями IC₅₀, как показано в табл. 23, и этот факт демонстрирует, что модификация в обозначенных сайтах в значительной степени не влияла на связывание с мишенью.

- 53 035745

Ингибирование стимулированного HGF фосфорилирования c-Met Очищенные биспецифические конъюгаты с ПЭГ24-малеимидом также тестировали на их способность ингибировать стимулированное HGF фосфорилирование c-Met в NCI-H292 с помощью набора c-Met phospho(Tyr1349) производства Meso Scale Discovery (г. Гейтерсберг, штат Мерилэнд, США), а также так, описано в примере 7. Конъюгаты и ECB38 ингибировали cMet с аналогичными значениями IC50, как показано в табл. 24, и этот факт демонстрирует, что модификация в этих сайтах в значительной степени не влияет на связывание с мишенью.

Таблица 24

Анализ цитотоксичности

Конъюгаты, состоящие из цистеиновых вариантов ECB147, 83v2-cys или Tencon-cys, соединенные с цитотоксическим ингибитором тубулина из семейства ауристатинов (фиг. 2), тестировали на зависимую от мишени цитотоксичность в раковых клетках. Ингибитор был присоединен к цистеин-содержащему белку посредством нерасщепляемого линкера PEG₄ или расщепляемого ферментом линкера валинцитруллин или валин-лизин. Уничтожение клеток оценивали путем измерения жизнеспособности клеток человеческих опухолевых линий H1573 и A431 со сверхэкспрессией EGFR, а также EGFR-негативной опухолевой линии MDA-MB-435 после воздействия конъюгатов белок-токсин с применением процедуры, описанной в примере 4. В табл. 25 приведены значения IC₅₀, полученные при анализе либо прибором CellTiter Glo, либо счетчиком объектов IncuCyte для моментов времени 66, 72 или 90 часов. Конъюгаты белок-лекарственное средство продемонстрировали эффективное уничтожение клеток, экспрессирующих антиген-мишень EGFR. Конъюгаты с несколькими лекарственными средствами также продемонстрировали повышенную цитотоксичность во многих протестированных клеточных линиях.

- 54 035745

Таблица 25

Конъюгаты ММАЕ
Конъюгат	IC₅o H1537 (нМ)	IC₅₀ A431 (нМ)	IC50 MDA-MB-435 (нМ)
TenconCys-mal-PEG₄-MMAE	H/o	> 500
TenconCys-mal-PEG₄-VC-MMAE	H/o	841	Плохое соответствие
TenconCys-mal-PEG₄-VK-MMAE	H/o	4,5	Плохое соответствие
8 3v2cys-mal-PEG₄-MMAE	H/o	> 500
8 3v2cys-mal-PEG₄-VC-MMAE	H/o	315	512
8 3v2cys-mal-PEG₄-VK-MMAE	H/o	19, 6	62
Конъюгаты MMAF
Конъюгат	IC₅₀ H1537 (нМ)	ic₅₀ A431 (нМ)	IC50 MDA-MB-435 (нМ)
TenconCys-mal-PEG₄-MMAF	H/o	> 1000
TenconCys-mal-PEG₄-VC-MMAF	996 1541	> 500	> 500
TenconCys-mal-PEG₄-VK-MMAF	H/o	> 500	> 500
8 3v2cys-mal-PEG₄-MMAF	H/o	> 1000
83v2cys-mal-PEG₄-VC-MMAF	1, 19 1, 05	1, 6	> 500
83v2cys-mal-PEG₄-VK-MMAF	H/o	3, 9	> 500
ECB147v3- (mal-PEG₄-VC-MMAF) ₄	0, 15 0, 075	0,0078 0,0197	H/o
ECB147v5- (mal-PEG₄-VC-MMAF) ₂	0, 056 0, 050	0, 087 0, 071	H/o
ECB82cys-mal-PEG₄-VC-MMAF	0,576 0,249	1,1 0, 64	H/o

Перечень последовательностей

SEQ ID NO:	Тип	Вид	Описание	Последовательность
1	PRT	Искусственная	Тепсоп	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYRYSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
2	ДНК	Искусственная	РОР2220	CGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACC
3	ДНК	Искусственная	ТС5’toFG	AACAC C G TAGATAGAAAC G G T
4	ДНК	Искусственная	130mer	CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTMTACATA4CCCCATCCCCCTGTTGACAATTAAT CATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTG
5	ДНК	Искусственная	РОР2222	CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
6	ДНК	Искусственная	TCF7	GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN AACAC C G TAGATAGAAAC G G T
7	ДНК	Искусственная	TCF8	GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN S NNAACAC C G TAGATAGAAAC G G T
8	ДНК	Искусственная	TCF9	GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN S NN S NNAACAC C G TAGATAGAAAC G G T
9	ДНК	Искусственная	TCF10	GGTGGTGAMTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNAACACCGTAGA7AGAAACGGT
10	ДНК	Искусственная	TCF11	GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNSNNAACACCGTAGATAGAAACGGT

- 55 035745

11 12 13	ДНК ДНК ДНК	Искусственная Искусственная Искусственная	TCF12 POP2234 POP2250	GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNSNNSNNAACACCGTAGATAGaAAACGGT AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCATGGTGATG GTGATGGTGACCGCCGGTGGTGAATTCCGCAGACAG CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
14	ДНК	Искусственная	DidLigRev	CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
15	ДНК	Искусственная	TconSnew 2	GAGCCGCCGCCACCGGTTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCACCGGTGGTGAATTCC GCAGACAG
16	ДНК	Искусственная	Тсопб	AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCGAAAAAC
17	ДНК	Искусственная	LS1008	TTTGGGAAGCTTCTAGGTCTCGGCGGTCACCATCACC ATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCCCAAC T GATCTT С AC C AAAC
18	PRT	Искусственная	P53A1R517 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWADPHGFYDSFLIQYQESEKVGEA1NLWPGSERSYDLT GLKPGTFYTVSiYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
19	PRT	Искусственная	P54AR4-17 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTYDRDGYDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
20	PRT	Искусственная	P54AR4-47 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDSFUQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
21	PRT	Искусственная	P54AR4-48 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPRGFYESFUQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
22	PRT	Искусственная	P54AR4-37 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTWPYADLDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
23	PRT	Искусственная	54AR4-74 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDSFUQYQESEKVGEA1NLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
24	PRT	Искусственная	P54AR4-31 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDYDLGVYFDSFLIQYQE SEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHN VYKDTNMRGLPLSAEFTT
25	PRT	Искусственная	P54AR4-83 без met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPWAFYESFLIQYQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
26	PRT	Искусственная	P54CR4-31 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYGESE \| KVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSY VF E H DV MLR LSAEFTT
27	PRT	Искусственная	P54AR4-83v2 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES \| EKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNV YKDTNMRGLPLSAIFTT
28	PRT	Искусственная	P54CR4-31V2 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESE1 KVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSY \| VFEHDVMLPLSAIFTT
29	PRT	Искусственная	P54AR4-73v2 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTWPYADLDSFLIQYQES \| EKVGEA1NLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
30	ДНК	Искусственная	TCON6	AAG AAG GAG AAC CGG TAT GCT GCC GGC GCC \| G AA AAA C
31	ДНК	Искусственная	TCON5 Е8 61short	GAG CGG CGG CCA CCG GTT TAA TGG TGA TGG TG/i TGG TGA CCA CCG GTG GTG AAG АТС GCA GAC AG
32	PRT	Искусственная	P114AR5P74- A5	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYDEV \| WGGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGG \| SISVPLSAIFTT
33	PRT	Искусственная	P114AR5P75- E9	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFFIRYDEFLRSGEA1VLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYVWTiLGVKGGLVSTPLSAI FTT
34	PRT	Искусственная	P114AR7P92- F3	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL\| GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY1VNIMGVKGGS1\|SHPLSAIFTT

- 56 035745

35	PRT	Искусственная	Pi 14AR7P9 2-F6	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNILGVKGGGLSVPLSAIFTT
36	PRT	Искусственная	P114AR7P92- G8	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFVIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWQILGVKGGYISIPLSAiFTT
37	PRT	Искусственная	P114AR7P92- Н5	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYLEFLLGGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWQIMGVKGGTVSPPLSAIFTT
38	PRT	Искусственная	P114AR7P93- D11	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWGINGVKGGYISYPLSAIFTT
39	PRT	Искусственная	P114AR7P9 3-G8	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAiVLTVPGSERSYDLT DLKPGTEYGVTINGVKGGRVSTPLSAIFTT
40	PRT	Искусственная	P114AR7P93- Н9	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWQIIGVKGGHISLPLSAIFTT
41	PRT	Искусственная	P114AR7P9 4-АЗ	LP AP KNL WSRVTE DSAR LS WTAPDAAF DS F WIRY F E F L GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGKI SPPLSAiFTT
42	PRT	Искусственная	Pi 14AR7P9 4-Е5	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYAVNIIVIGVKGGRVSVPLSAIFTT
43	PRT	Искусственная	P114AR7P95- В9	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL G SG E Al VL TVP G S E RS Y D L TG L KP G ТЕ Y WQIL GV KG G SI SVPLSAIFTT
44	PRT	Искусственная	P114AR7P95- D3	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWNIMGVKGGSISYPLSAIFTT
45	PRT	Искусственная	P114AR7P9 5-D4	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWQILGVKGGYI SI PLSAIFTT
46	PRT	Искусственная	P114AR7P95- ЕЗ	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAiVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWQIIVIGVKGGTVSPPLSAIFTT
47	PRT	Искусственная	P114AR7P95- F10	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFTTAGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWNIMGVKGGSISPPLSAIFTT
48	PRT	Искусственная	P114AR7P9 5-G7	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFELLSTGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWNIMGVKGGSISPPLSAIFTT
49	PRT	Искусственная	P114AR7P95- Н8	LPAP KNLWS RVTE DSARLS WTAP DAAF DS FW i RYF E F V SKGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGSI SPPLSAiFTT
				MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES
				EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY
50	PRT	Искусственная	ЕСВ1	KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEW VGGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGGSIS VPLSAIFTT
				MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFUQYQES
				EKVGEAIVLWPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY
51	PRT	Искусственная	ЕСВ2	KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSL PAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLG SGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNiMGVKGGKiS PPLS.AlFTT
				MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFUQYQES
				EKVGEAIVLWPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY
52	PRT	Искусственная	ЕСВЗ	KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAP KNLWS RVTE DS ARLS W TAP DAAF DS F WIRY F E F L GSGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWQIiGVKGGHiS LPLSAIFTT

- 57 035745

53	PRT	Искусственная	ЕСВ4	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFUQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAP KNLWS RVTE DSARLS W ТАР D.AAF DS F F i RYDE F LR SGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVTILGVKGGLVS TPLSAIFTT
54	PRT	Искусственная	ЕСВ5	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLiQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAP KNLWS RVTE DS ARLS W TAP D.AAF DS F WI RY F E F L GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGKI SPPLSAiFTT
55	PRT	Искусственная	ЕСВ8	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFUQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAP KNLWS RVTE DS ARLS W TAP D.AAF DS F WI RY F E F L GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWQIiGVKGGHIS LPLSAIFTT
58	PRT	Искусственная	ЕСВ7	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLIQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSM LPAP KNLWS RVTE DS ARLS W TAP D.AAF DS F WI RY F E F L GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWQIiGVKGGHIS LPLSAIFTT
57	PRT	Искусственная	ЕСВ15	MLPAPKNLWSEVTED8ARLSWDDPWAFYE 8 FUQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLWSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWI RYFEF LGSGEAI VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGKISPPLSAIFTT
58	PRT	Искусственная	ЕСВ27	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES EKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWS1YGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLWSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEVWGGEAiVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGGSISVPLSAIFTT
59	PRT	Искусственная	ЕСВ60	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLIQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNMRGLPLSAIFT TAPAPAPAPAPML PAPKNLWS RVT EDSARLSWTAPDAAFDSFWI RYFEFLGSGEAi VLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGKiSPPLSAIFTT

- 58 035745

60	PRT	Искусственная	ЕСВ37	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFUQYQES EKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVHNVY KDTNMRGLPLSAI FT ТАРАРАРАРАР L PAPKNLW S RVT Е D SARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEVWGGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGGSiSVPLSAlFTT
61	PRT	Искусственная	ЕСВ94	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLiQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNi RGLPLSAIFTTAPAPAPAPAP L PAP К NL WS R VTE D SARLSWTAPDAAFDSFW I RYFEFLGSGEAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGKI SPPLSA1 FTT
62	PRT	Искусственная	ЕСВ95	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNi RGLPLSAI FT TАРАРАРАРАР L PAPKNLW S RVT E D SARLSWTAPDAAFDSFWiRYFEFVGSGEAlVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYWNILGVKGGSISPPLSAIFTT
63	PRT	Искусственная	ЕСВ96	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVS!YGVHNVY KDTNI RGLPLSAI FTTАРАРАРАРАРLPAPKNLWSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYEEFVSKGDAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGSI SPPLSA1 FTT
64	PRT	Искусственная	ЕСВ97	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVS!YGVHNVY К DTNi R G L P LSAi FTTAPAP AP APAPLPAP К NL WS R VTE D SARLSWTAPDAAFDSFWI RYFEFLGSGEAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LSVKGGSISPPLSAI FTT
65	PRT	Искусственная	ЕСВ106	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLiQYQES EKVGEA!VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVSIYGVHNVY KDTNI RGL.PLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWI RYFEF LGSGEA! VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNILGVKGGKISPPLSAIFTT
66	PRT	Искусственная	ЕСВ107	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLiQYQES EKVGEA!VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVS!YGVHNVY KDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWiRYFEFVGSGEAiVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYWNiLGVKGGSISPPLSAiFTT
67	PRT	Искусственная	ЕСВ108	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLIQYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVS!YGVHNVY К DTNi R G L P LSAi FTTAPAP APAPAPL PAP К NLWSRVTE D SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKGDA! VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGSISPPLSAIFTT

- 59 035745

68	PRT	Искусственная	ЕСВ109	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLiQYQES EKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVY KDTNI RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFW I RYFEFLGSGEAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LSVKGGSISPPLSAI FTT
69	PRT	Искусственная	ЕСВ118	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLIQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVHNVY KDTNI RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGKI SPPLSAI FTT
70	PRT	Искусственная	ЕСВ119	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLiQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVHNVY KDTNi RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED S AR L S W TAP D AAF D S F W IRYFEFVGSGEAiVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYWNiLGVKGGSISPPLSAiFTT
71	PRT	Искусственная	ЕСВ120	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLiQYQES EKVGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVHNVY KDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKGDAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGSI SPPLSAI FTT
72	PRT	Искусственная	ЕСВ121	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLIQYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSiYGVPfNVY KDTNI RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFW I RYFEF LGSGEAi VLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYWNI LSVKGGSiSPPLSAI FTT

- 60 035745

SEQ ID NO: 73, PRT, Homo Sapiens, EGFR

1 mrpsgtagaa	llallaalcp	asraleekkv	cqgtsnkltq	IgtfedhfIs
Iqrmfnncev 61 vlgnleityv	qrnydlsfIk	tiqevagyvl	ialntverip	lenlqiirgn
myyensyala 121 vlsnydankt	glkelpmrnl	qeilhgavrf	snnpalcnve	siqwrdivss
dfIsHMsmdf 181 qnhlgscqkc	dpscpngscw	gageencqkl	tkiicaqqcs	grergkspsd
cchnqcaagc 241 tgpresdclv	crkfrdeatc	kdtcpplmly	npttyqmdvn	pegkysfgat
cvkkcprnyv 301 vtdhgscvra	cgadsyemee	dgvrkckkce	gperkvengi	gigefkdsls
inatnikhfк 361 nctsisgdlh	ilpvafrgds	fthtppldpq	eldilktvke	itgflliqaw
penrtdlhaf 421 enleiirgrt	kqhgqfslav	vslnitslgl	rslkeisdgd	viisgnknlc
yantinwkkl 481 fgtsgqktki	isnrgensck	atgqvchalc	spegewgpep	rdcvscrnvs
rgrecvdkcn 541 llegeprefv	enseciqchp	eclpqamnit	ctgrgpdnci	qcahyidgph
cvktcpagvm 601 genntlvwky	adaghvchlc	hpnctygctg	pglegcptng	pkipsiatgm
vgalllllvv 661 algiglfmrr	rhivrkrtlr	rllqerelve	pltpsgeapn	qallrilket
efkkikvlgs 721 gafgtvykgl	wipegekvki	pvaikelrea	tspkankeil	deayvmasvd
nphvcrllgi 781 cltstvqlit	qlmpfgelid	yvrehkdnig	sqyllnwcvq	iakgmnyled
rrlvhrdlaa 841 rnvlvktpqh	vkitdfglak	llgaeekeyh	aeggkvpikw	malesilhri
ythqsdvwsy 901 gvtvwelmtf	gskpydgipa	seissilekg	erlpqppict	idvymimvkc
wmidadsrpk 961 freliiefsk	mardpqrylv	iqgdermhlp	sptdsnfyra	Imdeedmddv
vdadeylipq 1021 qgffsspsts	rtpllsslsa	tsnnstvaci	drnglqscpi	kedsfIqrys
sdptgalted 1081 siddtflpvp	eyinqsvpkr	pagsvqnpvy	hnqplnpaps	rdphyqdphs
tavgnpeyln 1141 tvqptcvnst	fdspahwaqk	gshqisldnp	dyqqdffpke	akpngifkgs

taenaeylrv

1201 apqssefiga

74

PRT

Homo sapiens

EGF

NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIG ERCQYRDLKWWELR

- 61 035745

SEQ ID NO:	75, PRT, Homo	Sapiens, тенасцин-С
1 mgamtqllag	vflaflalat	eggvlkkvir	hkrqsgvnat	Ipeenqpvvf
nhvyniklpv 61 gsqcsvdles	asgekdlapp	sepsesfqeh	tvdgenqivf	thriniprra
cgcaaapdvk 121 ellsrleele	nlvsslreqc	tagagcclqp	atgrldtrpf	csgrgnfste
gcgcvcepgw 181 kgpncsepec	pgnchlrgrc	idgqcicddg	ftgedcsqla	cpsdcndqgk
cvngvcicfe 241 gyagadcsre	icpvpcseeh	gtcvdglcvc	hdgfagddcn	kplclnncyn
rgrcvenecv 301 cdegftgedc	selicpndcf	drgrcingtc	yceegftged	cgkptcphac
htqgrceegq 361 cvcdegfagv	dcsekrcpad	chnrgrcvdg	rcecddgftg	adcgelkcpn
gcsghgrcvn 421 gqcvcdegyt	gedcsqlrcp	ndchsrgrcv	egkcvceqgf	kgydcsdmsc
pndchqhgrc 481 vngmcvcddg	ytgedcrdrq	cprdcsnrgl	cvdgqcvced	gftgpdcael
scpndchgqg 541 rcvngqcvch	egfmgkdcke	qrcpsdchgq	grcvdgqcic	hegftgldcg
qhscpsdcnn 601 Igqcvsgrci	cnegysgedc	sevsppkdlv	vtevteetvn	lawdnemrvt
eylvvytpth 661 egglemqfrv	pgdqtstiiq	elepgveyfi	rvfailenkk	sipvsarvat
ylpapeglkf 721 ksiketsvev	ewdpldiafe	tweiifгнМп	kedegeitks	Irrpetsyrq
tglapgqeye 781 islhivknnt	rgpglkrvtt	trldapsqie	vkdvtdttal	itwfkplaei

- 62 035745 dgieltygik

841 dvpgdrttid	Itedenqysi	gnlkpdteye	vslisrrgdm	ssnpaketft
tgldaprnlr 901 rvsqtdnsit	lewrngkaai	dsyrikyapi	sggdhaevdv	pksqqattkt
tltglrpgte 961 ygigvsavke	dkesnpatin	aateldtpkd	Iqvsetaets	Itllwktpla
kfdryrlnys 1021 Iptgqwvgvq	Iprnttsyvl	rglepgqeyn	vlltaekgrh	kskparvkas
teqapelenl 1081 tvtevgwdgl	rlnwtaadqa	yehfiiqvqe	ankveaarnl	tvpgslravd
ipglkaatpy 1141 tvsiygviqg	yrtpvlsaea	stgetpnlge	vvvaevgwda	Iklnwtapeg
ayeyffiqvq 1201 eadtveaaqn	Itvpgglrst	dlpglkaath	ytitirgvtq	dfsttplsve
vlteevpdmg 1261 nltvtevswd	alrlnwttpd	gtydqftiqv	qeadqveeah	nltvpgslrs
meipglragt 1321 pytvtlhgev	rghstrplav	evvtedlpql	gdlavsevgw	dglrlnwtaa
flHKyehfviq 1381 vqevnkveaa	qnltlpgslr	avdipgleaa	tpyrvsiygv	irgyrtpvls
aeastakepe 1441 ignlnvsdit	pesfnlswma	tdgifetfti	eiidsnrlle	tveynisgae
rtahisglpp 1501 stdfivylsg	lapsirtkti	satattealp	llenltisdi	npygftvswm
asenafdsf1 1561 vtvvdsgkll	dpqeftlsgt	qrklelrgli	tgigyevmvs	gftqghqtkp
Iraeivteae 1621 pevdnllvsd	atpdgfrlsw	tadegvfdnf	vlkirdtkkq	sepleitlla
pertrditgl 1681 reateyeiel	ygiskgrrsq	tvsaiattam	gspkevifsd	itensatvsw
raptaqvesf 1741 rityvpitgg	tpsmvtvdgt	ktqtrlvkli	pgveylvsii	amkgfeesep
vsgsfttald 1801 gpsglvtani	tdsealarwq	paiatvdsyv	isytgekvpe	itrtvsgntv
eyaltdlepa 1861 teytlrifae	kgpqksstit	akfttdldsp	rdltatevqs	etalltwrpp
rasvtgyllv 1921 yesvdgtvke	vivgpdttsy	sladlspsth	ytakiqalng	plrsHMiqti
fttigllypf 1981 pkdcsqamln	gdttsglyti	ylngdkaeal	evfcdmtsdg	ggwivfIrrk
ngrenfyqnw 2041 kayaagfgdr	reefwlgldn	Inkitaqgqy	elrvdlrdhg	etafavydkf
svgdaktryk 2101 Ikvegysgta	gdsmayhngr	sfstfdkdtd	saitncalsy	kgafwyrnch

rvnlmgrygd

2161 nnhsqgvnwf hwkghehsiq faemklrpsn frnlegrrkr a

- 63 035745

76	PRT	Искусст- венная	Fibcon	LdaptcHqvtnvtdtsitvswippsatit gyritytpsngpgepkeiivppsstw titgitpgveywslyalkdnqespplvgt qtt
77	PRT	Искусст- венная	10-й домен FN3 фибронектина (FN10)	VSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTV RYYRITYGETGGNSPV QE FTVPGSKS TATIS GLKPGVDYT1TVYA VTGRGDSPASSKPISINY RT
78	PRT	Искусст- венная	Линкер	GSGS
79	PRT	Искусст- венная	Линкер	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
80	PRT	Искусст- венная	Линкер	APAP
81	PRT	Искусст- венная	Линкер	APAPAPAPAP
82	PRT	Искусст- венная	Линкер	APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
83	PRT	Искусст- венная	Линкер	APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPA PAPAPAPA PAP

84	PRT	Искусственная	Линкер	АЕАААКЕАААКЕАААКЕАААКЕАААКААА
85	PRT	Искусственная	Петля ВС Tencon	TAPDAAFD
86	PRT	Искусственная	Петля GF Tencon	KGGHRSN
87	PRT	Искусственная	P53A1R5- 17 Петля ВС	ADPHGFYD
88	PRT	Искусственная	P54AR4-17 Петля ВС	TYDRDGYD
89	PRT	Искусственная	P54AR4-47 Петля ВС	WDPFSFYD
90	PRT	Искусственная	P54AR4-48 Петля ВС	DDPRGFYE
91	PRT	Искусственная	P54AR4-73 Петля ВС	TWPYADLD
92	PRT	Искусственная	P54AR4-74 Петля ВС	GYNGDHFD

- 64 035745

93	PRT	Искусственная	P54AR4-81 Петля ВС	DYDLGVYD
94	PRT	Искусственная	P54AR4-S3 Петля ВС	DDPWDFYE
95	PRT	Искусственная	Петли FG EGFR	HNVYKDTNMRGL
96	PRT	Искусственная	Петли FG EGFR	LGSYYFEHDVM
97 98 99	ДНК ДНК PRT	Искусственная Искусственная Искусственная	> EGFR часть ЕСВ97; P54AR483v22 > EGFR часть ЕСВ15; P54AR483v2 tencon 27	Atgttgccagcgccgaagaacctggtag Itagcgaggttactgaggac agcgcgcgtctgagctgggacgatccgt gggcgttctacgagagctttct gatccagtatcaagagagcgagaaagtc ggtgaagcgattgtgctgac cgtcccgggctccgagcgttcciacgac ctgaccggttigaagccgggt accgagtaiacggtgagcatctacggtg itcacaaigtctataaggaca ctaatatccgcggtcrgcctctgagcgc cattttcaccacc Atgctgccagcccctaagaatctggtcg tgagcgaagtaaccgagga cagcgcccgcctgagctgggacgacccg tgggcgttctatgagtctttcc tgattcagtatcaagaaagcgaaaaagt tggcgaagcgatcgtcctga ccgtcccgggtagcgagcgctcctacga tctgaccggcctgaaaccgg gtacggagtacacggtgiccatttacgg tgttcacaatgtgiataaagac aecaacatgcgtggcctgccgctgrcgg cgattttcaccacc LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLS AIFTT
10 0	PRT	Искусственная	Библиотек a TCL 14	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFD SFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSA IFTI

- 65 035745 > SEQ ID NO: 101

PRT

Homo sapiens c-Met mkapavlapg ilvllftlvq rsngeckeal aksemnvnMk yqlpnftaet piqnvilheh hiflgatnyi yvlneedlqk vaeyktgpvl ehpdcfpcqd csskanlsgg vwkdninMal

121 vvdtyyddql	iscgsvnrgt	cqrhvfphnh	tadiqsevhc	ifspqieeps
qcpdcvvsal 181 gakvlssvkd	rfinffvgnt	inssyfpdhp	Ihsisvrrlk	etkdgfmfIt
dqsyidvlpe 241 frdsypikyv	hafesnnfiy	fltvqretld	aqtfhtriir	fcsinsglhs
ymemp1e c i1 301 tekrkkrstk	kevfnilqaa	yvskpgaqla	rqigaslndd	ilfgvfaqsk
pdsaepmdrs 361 amcafpikyv	ndffnkivnk	nnvrclqhfу	gpnhehcfnr	tllrnssgce
arrdeyrtef 421 ttalqrvdlf	mgqfsevllt	sistfikgdl	tianlgtseg	rfmqvvvsrs
gpstphvnf1 481 Idshpvspev	ivehtlnqng	ytlvitgkki	tkiplnglgc	rhfqscsqcl
sappfvqcgw 541 chdkcvrsee	clsgtwtqqi	clpaiykvfp	nsapleggtr	iticgwdfgf
rrnnkfdlkk 601 trvllgnesc	tltlsestmn	tlkctvgpam	nkhfHMsiii	snghgttqys
tfsyvdpvit 661 sispkygpma	ggtlltltgn	ylnsgnsrhi	siggktctlk	svsnsilecy
tpaqtistef 721 avklkidlan	retsifsyre	dpivyeihpt	ksfistwwke	plnivsfifc
fasggstitg 781 vgknlnsvsv	prmvinvhea	grnftvacqh	rsnseiicct	tpslqqlnlq
iplktkaffm 841 Idgilskyfd	liyvhnpvfк	pfekpvmism	gnenvleikg	ndidpeavkg
evlkvgnksc 901 enihlhseav	ictvpndllk	inselniewk	qaisstvlgk	vivqpdqnft
gliagvvsis 961 talllllgff	iwlkkrkqik	dlgselvryd	arvhtphldr	ivsarsvspt

temvsnesvd

1021 yratfpedqf	pnssqngscr	qvqypltdms	piltsgdsdi	sspllqntvh
idlsalnpel 1081 vqavqhvvig	psslivhfne	vigrghfgcv	yhgtlldndg	kkihcavksl
nritdigevs 1141 qfltegiimk	dfshpnvlsl	igiclrsegs	plvvlpymkh	gdlrnfirne
thnptvkdli 1201 gfglqvakgm	kylaskkfvh	rdlaarncml	dekftvkvad	fglardmydk
eyysvhnktg 1261 aklpvkwmal	eslqtqkftt	ksdvwsfgvl	Iwelmtrgap	pypdvntfdi
tvyllqgrrl 1321 iqpeycpdpl	yevmlkcwhp	kaemrpsfse	Ivsrisaifs	tfigehyvhv
natyvnvkcv 1381 apypsllsse	flHKddevdtr	pasfwets

- 66 035745

102

PRT

Homo sapiens

HGF

QRKRRNTiHEFKKSAKTTLiKIDFALKIK TKKVNIADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDK ARKQCLWFPFNSMS 3GVKK ED LYE: NKDYIRNCIIGKGRSYXGTVSiTKSGIKCQP WSSMIPHEHSFLPSSYRG KDL.QENYCRNP RGE:E:GGPwYCPTSRPE:VRYEiVCD iPQCSEiVlECFUCRGiESYRGLMDH TE3GKCQRWDHQTP iHREiKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRP WCYTLDPHTRWEYCAiEl TCADNTMNDTDVPL ETTEGIQGQGEGYRGTVN™NGIPCQRWDSG YPE-IEHDMTPENFKC KDLRENYCRNPDGS ESPWCFTTDPNIRVGYCSQiPNCDMSHGQDC YRGNGKNYMGNLSQT RSGLTCSMWDKNME DLHRHiFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPW CYTGNPLIPWDYCPiS RCEGDTTPTIVNL DHPVISCAKTKQLRWRGIPTRTNIGWfvIV SLRYRNKHiCGGSUKESW VLTARQCFP3RD IKOYEAWLGiHDV' HGRGOEKCKQVLNVSQ LVYGPEGSDLVLMKLAR PAVLD0FV3TDLP NYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYOGLLRV AHLYMGNEKCSQHHRG KVTLNE3ECAG AEKIGSGPCEGOYGGPLVCEQHKMRMV1GV’ iVPGRGCAIPNRPGFV RV'AYYAKWIHKJi LTYKVPOS

- 67 035745

103	ДНК	Искусственная Искусст-	> СМЕТ часть ЕСВ97 P114AR7P95 -C5v2 > СМЕТ часть	Ctgccggctccgaagaacttggtggtgagcc gtgttaccgaagatagc gcacgccigagclggacggcaccggaigcgg cgltcgatagcticlgg altcgclaisttgagiiictggglagcggig aggcaatsgiiclgacggigcc gggcioigaacgctcciacgatttgaccggt ctgaaaccgggcaccga gtaigiggigaacaiictgagcgitaagggc ggiagcatcagcccaccg ctgagcgcgatcttcacgactggtggiigc Ctgccggcaecgaagaacctggttgtcagcc gtgtgaecgaggatag cgcacgltigagciggaccgciccggalgca gcctstgacagcltcigga ttcgitacittgaaiiictgggtagcggtga
104	ДНК	венная	ЕСВ15 P114AR7P94	ggcgatcgticigacggtgccg ggctctgaacgcagciaigatttgacgggcc
			-АЗ	tgaagccgggtactgagt
				acgiggitaacaicatgggcgitaagggigg
				iaaaatcagcccgccait
				gtccgcgatcittaccacg
105	PRT	Искусст- венная	линкер	GGGGS
				mipapkniwsevtedsarfswddpwafyesf
				liqyqesekvgeaivftvpgse
				rsyditglkpgteytvsiygvhnvykdtnir
106	PRT	Искусст- венная	ЕСВ91	giplsaifttapapapapapLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYF EFLGSGEAIVLTV PGSERSYDLTGLKPGTEYWNILSVKGGSIS PPLSAIFTT ipapkalvvsavtedsariswadphgfydsf
107	PRT	Искусст- венная	P53A1R5- 17v2	iiqyqesakvgeaivitvpgsersy dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrgip isaiftt

- 68 035745

108	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v22	papknlwsevtedsarlswddpwafyesf iiqyqesekvgeaivltvpgsers vdltglkpgteytvsiygvhnvykdtnir glplsaiftt
109	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v23	papknlwsevtedsarlswddphafyesf Iiqyqesekvgeaivltvpgsersу dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirg iplsaiftt
110	PRT	Искусственная	P53A1R5- 17v22	papknlwsevtedsarlswadphgfydsf iiqyqesekvgeaivl tvpgsersy dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirg iplsaiftt
111	PRT	Искусственная	P114AR7P94- A3v22	papknlwsrvtedsariswtapdaafdsf wiryfefIgsgeaivitvpgsersyd tgikpgteywnilgvkggkispplsaift t
112	PRT	Искусственная	P114AR9P121 -A6v2	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFVGSGEAI VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGV KGGSISPPLSAIFTT
113	PRT	Искусственная	P114AR9P122 -A7v2	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFVSKGDA VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGV KGGSISPPLSAIFTT
114	PRT	Искусственная	P114AR7P95- C5v2	LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFD SFWiRYFEFLGSGEAl 7LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILSV KGGSISPPLSAIFTT
115	ДНК	Искусственная	ECB97	atgttgccagcgccgaagaacctggtagt tagcgaggttactgaggac

- 69 035745

				agcgcgcgtctgagctgggacgatccgtg ggcgttctac.gagagcittct j atccagtatcaagagagcgagaaagtcg gtgaagegattgtgctgac cglcccgggctccgagcgttcctacgacc tgaccggtttgaagccgggt accgagtataeggtgagcatctacggtgt tcacaatgtetataaggaca ctaatatccgcggtctgcctctgagcgcc attttcaccaccgcaccggc accggctccggctcctgccccgctgccgg ctccgaagaacttggtggtg agccgigttaccgaagatagcgcacgcci gagctggacggcaccgga gcggcgttc.gatagcitctggattcgct attttgagtttctgggtagcggiga j gcaattgtictgacggtgccgggctcig aacgetcctacgatttgac. eg gtetgaaaccgggcaccgagtatgtggtg aacattctgagegttaaggg cggtagcatcagcccaccgctgagcgcga tcttcacgactggtggltgc
116	ДНК	Искусственная	ЕСВ15	atgctgecagecc.etaagaatetggteg tgagcgaagtaaccgaggae agcgcccgcctgagctgggacgacccgtg ggcgttctatgagtctttcct gattcagtalcaagaaagcgaaaaagttg gcgaagcgatcgtcclgac cgtcccggglagcgagcgctcctacgatc Igaccggcclgaaaccggg acggagtacacggtgtccatttaeggtgt tcacaatgtgtataaagaca ccaacatgcgtggccigccgctgtcggcg attttcaccaccgcgccigc gccagcgcctgcaccggctccgcigccgg
				caccgaagaacctggttgt cagccgtgtgacc.gaggatagcgcacgt ttgagctggaccgctccgga gcagcctttgacagcttc.tggattcgtt actttgaatitctgggtagcggig aggcgatcgttctgacgglgccgggctcl gaacgcagctatgatttgacg ggcctgaagccgggtactgagtacgtggt taacatcatgggcgttaagg gtggtaaaatcagcccgccattgtccgcg atctttaccacg
117	PRT	Искусственная	альбуминсвязывающий домен	idewllkeakekaieelkkagitsdyyfd linkaktvegvnalkdeilka

- 70 035745

118	PRT	Искусственная	ECB18	mlpapknlvvsevtedsariswddpwaf yesfliqyqesekvgeaivliv pgsersyditgikpgteytvsiygvhnv ykdtnmrglplsaifttapapapa paplpapknlvvsrvtedsariswtapd aafdsfwirydewvggeaivit vpgsersyditgikpgteyyvnilgvkg gsisvplsaifitapapapapapi aeakvianreldkygvsdyykniinnak tvegvkalidellaaip
119	PRT	Искусственная	ECB28	nrilpapknivvsevtedsarlswadph gfydsfliqyqesekvgealvltv pgsersyditgikpgteyivsrygvhnv ykdtnmrgipisaifttapapapa paplpapknlvvsrvtedsariswtapd aafdsfwirydewvggeaivit vpgsersyditgikpgteyyvnilgvkg gsisvplsaifttapapapapapi aeakvianreldkygvsdyykniinnak tvegvkalldeilaalp

- 71 035745

120	PRT	Искусственная	ЕСВ38	mlpapknlvvsevtedsariswddpwaf yesfliqyqesekvgeaivltv pgsersydliglkpgteytvsiygvhnv ykdtnmrgipisaifttapapapa paplpapknlvvsrvtedsariswtapd aafdsfwiryfefIgsgeaivltv pgsersydltglkpgteyvvnimgvkgg kispplsaifttapapapapapl aeakvlanreldkygvsdyyknlinnak tvegvkalldeilaalp
121	PRT	Искусственная	ЕСВ39	mlpapknlvvsevtedsariswadphgf ydsfliqyqesekvgeaivltv pgsersydltglkpgteytvsiygvhnv ykdtnmrgipisaifttapapapa paplpapknlvvsrvtedsariswtapd aafdsfwiryfefIgsgeaivltv pgsersyditglkpgteyvvnirngvkg gkispplsaifttapapapapapl aeakvianreldkygvsdyykniinnak ivegvkalideiiaaip
122	PRT	Искусственная	P53A1R5 -17 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWADPHGFY DSFLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKP GTEYTVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
123	PRT	Искусственная	P54AR4- 17 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTYDRDGY DSFLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKP GTEYTVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
124	PRT	Искусственная	P54AR4- 47 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDH FDSFLiQYQESEKVGEAINLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNM RGLPLSAEFTT
125	PRT	Искусственная	P54AR4-	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPRGFY

- 72 035745

			48 с	ESFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSY
			Met	DLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMR
				GLPLSAEFTT
				M L P AP KN L WS EVTE DSL
			P54AR4-	RLSW TW PYADLDSFLIQY
126	PRT	Искусственная	73 с	QESEKVGEAiNLTVPGSERSYDLTGLKP
			Met	GTEYTVSiY
				GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
127	PRT	Искусственная	54AR4- 74 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDH EDS FLiQYQESEKVGEAINLTVPGSERS YDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNM RGLPLSAEFTT
				MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDYDLGVY
			P54AR4-	FDSFLiQ YQ E S E К VG
128	PRT	Искусственная	81 с	EAINLTVPG S E RS Y D LTG L
			Met	KP GTE Y TVS I
				YGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
129	PRT	Искусственная	P54AR4- 83 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPWAFY ESFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
130	PRT	Искусственная	P54CR4- 31 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAF DSFUQYQESEKVGEAiNLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVM LPLSAEFTT
131	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFY ESFLIQYQESEKVGEAiVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMR GLPLSAIFTT
132	PRT	Искусственная	P54CR431v2 с Met	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWTAPDAAF DSFLIQYQESEKVGEAiVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVSIY GVLGS WFEHDVMLPLSAI FIT
133	PRT	Искусственная	P54AR4-	MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTWPYADL

- 73 035745

			73v2 с Met	DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVSIY GVH NVYKDTNMRGLPL SAEFTT
134	PRT	Искусственная	P53A1RS -17v2 с Met	mipapknivvsevtadsariswadpbgf ydsfiiqyqesekvgeaivitvpgser sydltglkpgteytvsiygvhnvykdtn mrglplsaiftt
135	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v22 с Met	mipapkniwsevtedsarfswddpwafу esfliqyqesekvgeaivftvpgse rsydltglkpgteytvsiygvhnvykdt nirgiplsaiftt
136	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v23 с Met	rnlpapkriivvsevtedsariswddph afyesniqyqesekvgeaivitvpgser sydltglkpgteytvsiygvhnvykdtn irgiplsaiftt
137	PRT	Искусственная	P53A1R5 -17v22 c Met	mlpapknlwsevtedsarlswadphgfу dsfliqyqesekvgeaivl tvpgser sydltglkpgteytvsiygvtinvykdt nirgiplsaiftt
138	PRT	Искусственная	ECB1 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRG LPLSAI FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWT APDAAF D S F W i RYD EWv ’ GG EAi VLTVP GSERSYDLTGLKPG TEYYVNi LGVKGGSI SVPLSAi FIT
139 140	PRT PRT	Искусственная Искусственная	ECB2 без Met ECB3 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGE.AiVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMR GLPLSAI FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTA PDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYWNIMGVKGGKIS PPLSAIFTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYTVSiYG VHNVYKDTNMRGLPLSAI FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFLGSGEAiVLTVPGSERSY DLTGLKPG TEYWQIIGVKGGHISLPLSAIFTT

- 74 035745

				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPCSERSYD LTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNMRG
141	PRT	Искусственная	ЕСВ4 без Met	LPLSAI FTTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FFI RYDEFLRSGEAiVLTVPGSERSYDLTGL KPGTEYWVTiLGVKGGLVSTPLSAIFTT
				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYD SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYTVSiYG VHNVYKDTNMRGLPLSAI
142	PRT	Искусственная	ЕСВ5 без Met	FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPG TEYWNIMGVKGGKISPPLSAIFTT
				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYD SFLIQYQ ESEKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYTVSiYG VHNVYKDTNMRGLPLSAI
143	PRT	Искусственная	ЕСВ6 без Met	FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPG TEYWQII GVKGGHi SLPLSAi FTT
				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYD SFLIQYQ ESEKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPG
144	PRT	Искусственная	ЕСВ7 без Met ЕСВ15 о о 1\/Го Ή	TEYTVSiYG VHNVYKDTNMRGLPLSAI FTTGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPG TEYWQII GVKGGHi SLPLSAI FTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPCSERSYD LTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMRG
145	PRT	Искусственная	L PL SAi FT TAPAPAPAPAPL PAPKN LWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRY FEFLGSGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKP GTEYWNiMGVKGGKISPPLSAI FTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPCSERSYD LTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMRG
и С J net



146	PRT	Искусственная	EjU-DZ / без Met	L PL SAi FT TAPAPAPAPAPL PAPKN LWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRY DEVWGGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYYVNILGVKGGSISVPLSAIFTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYD SFLiQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYD
				LTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMRG
147	PRT	Искусственная	LCD Ό U без Met	L PL SAi FT TAPAPAPAPAPML PAPK NLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLK PGTEYWNIMGVKGGKiSPPLSAIFTT
				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYD SFLiQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYD
			17 CD Q Π	LTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNMRG
148	PRT	Искусственная	без Met	LPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKN LWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRY DEVWGGEAiVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYYVNILGVKGGSISVPLSAIFTT

- 75 035745

149 150	PRT PRT	Искусственная Искусственная	ЕСВ94 без Met ЕСВ95 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQ ESEKVGEAIVLTVPCSERSYDLTGLKPGT EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F W 1 RYE E F L GS G E AiVL’EVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIL GVKGGKIS PPLSA1FTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYE SFLIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL. WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F W1R YF E FVG S G EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNI LGVKGGSI SPPLSAIFTT
151	PRT	Искусственная	ЕСВ96 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEA1VLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVS1YGVHNVYKDTNi RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFE EV SKGDAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYWNILGVKGGSISPPLSAIFTT
152	PRT	Искусственная	ЕСВ97 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYES FLIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WS RVTE D SAR LSW TAP D AAF D S F WIRY F E F L GS G E AiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILS VKGGSISP PLSAIFTT
153	PRT	Искусственная	ЕСВ106 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYE SFLIQYQESEKVGE.AIV LTVPGSERSY DLTGLKPGTEYTVS iYGVHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYF EFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYWNILGVKGGKISPPLSAIFTT
154	PRT	Искусственная	ЕСВ107 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYES FLIQYQ ESEKVGEAIVLTV'PGSERSYDLTGLKPG TEYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAi FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F W i RYF E F VG S G EAiVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNiL

- 76 035745

155	PRT	Искусственная	ЕСВ108 без Met	GVKGGSI SPPLSAIFTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYE SFLIQYQESEKVGEAIVLTVPCSERSYDL TGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL 'WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYF EFVSKGDAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EY'WNILGVKGGSISPPLSA1FTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPHAFYE SFLIQYQ ESEKVGEA1VLTVPGSERSYDLTGLKPGT
156	PRT	Искусственная	ЕСВ109 без Met	EYTVSiYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FT TAPAPAPAPAPL PAPKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFE FLGSGE AIVLTv’PGSERSYDLTGLKPGTEYWNIL SVKGGSISP PLSAI FTT LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDS FUQYQ ESEKVGEAIVLTVPCSERSYDLTGLKPGT
157	PRT	Искусственная	ЕСВ118 без Met	EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F WIRYF E F L GS G E AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILG VKGGKIS PPLSAIFTT
				LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDS
				FUQYQ
				ESEKVGEAIVLTVPCSERSYDLTGLKPGT
158	PRT	Искусственная	ЕСВ119 без Met	EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL. WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F WIR YF E FVG S G EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIL

- 77 035745

				GVKGGSI SPPLSAIFTT
159	PRT	Искусственная	ЕСВ120 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDS FLIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNL WS RVTE D SAR LS W TAP D AAF D S F WI RYF E F VS KG D AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILG VKGGSIS PPLSA1FTT
160	PRT	Искусственная	ЕСВ121 без Met	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWADPHGFYDS FLIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGT EYTVSIYG VHNVYKDTNI RGLPLSAI FT TAPAPAPAPAPL PAPKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFE FLGSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILS VKGGSISP PLSAIFTT
161	PRT	Искусственная	ЕСВ91 без Met	ipapknlwsevtedsarlswddpwafyes fliqyqesekvgeaivltvpgsers ydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnir glplsaifttapapapapapLPAPK NLWSRVTFDSARLSWTAPDAAFDSFWi RYFER.GSGEAiyL.TVP GSERSYDLTGLKPGTEYWN1LSVKGGSIS PPLSAIFTT
162	PRT	Искусственная	ЕСВ18 без Met	Ipapknlwsevtedsarlswddpwaf ye sfliqyqesekvgeaivltvp gsersydltglkpgteytvsiygvhnvyk dtnmrglplsaifttapapapap aplpapknlwsrvtedsarlswtapdaaf dsfwirydevvvggeaivltv pgsersydltglkpgteyyvriilgvkgg sisvpisaifttapapapapapla

- 78 035745

				eakvlanreldkygvsdyykniinnaktv
				egvkalldeilaalp
				IpapknivvsevTedsarlswadphgfyd
				sfliqyqesekvgeaivltvpg
				sersydltglkpgteytvsiygvhnvykd
				tnmrglplsaifttapapapapa
163	PRT	Искусственная	ЕСВ28 без Met	plpapknlvvsrvtedsarlswtapdaaf dsfwirydevwggeaivltvp gsersydltglkpgteyyvnilgvkggsi svplsaifttapapapapaplae akvlanreldkygvsdyyknlinnaktve gvkalldeilaalp Ipapknlvvsevtedsarlswddpwafye sfliqyqesekvgeaivltvp gsersyditglkpgteytvsiygvhnvyk dtnmrglplsaifttapapapap
164	PRT	Искусственная	ЕСВ38 без Met	aplpapkniwsrvtedsarlswtapdaaf dsfwiryfefIgsgeaivltvp gsersydltglkpgteyvvriimgvkggk ispplsaifttapapapapapla eakvlanreldkygvsdyykniinnaktv egvkalldeilaalp
				Ipapknlvvsevtedsarlswadphgfу
				dsfliqyqesekvgeaivltvpg
				sersydltglkpgteytvsiygvhnvyk
				dtnmrglplsaifttapapapapa
165	PRT	Искусственная	ЕСВ39 без Met	plpapknlvvsrvtedsarlswtapdaa fdsfwiryfefIgsgeaivltvpg sersydltglkpgteyvvnimgvkggki spplsaifttapapapapaplae akvlanreldkygvsdyyknlinnaktv egvkalldeilaalp
166	ДНК	Искусственная	ЕСВ97 без Met	ttgccagcgccgaagaacctggtagtta gcgaggttactgaggacagc

- 79 035745

				gcgcgtctgagctgggacgatccgtggg cgttctacgagagctttctgat ccagtatcaagagagcgagaaagtcggt gaagcgattgtgctgaccgt cccgggctccgagcgttcctacgacctg accggtttgaagccgggtacc gagtatacggtgagcatctacggtgttc acaatgtctataaggacactaa tatccgcggtctgcctctgagcgccatt ttcaccaccgcaccggcaccg gctccggctcctgccccgctgccggctc cgaagaacttggtggtgagcc gtgttaccgaagatagcgcacgcctgag ctggacggcaccggatgcg gcgttcgatagcttctggattcgctatt ttgagtttctgggtagcggtgaggc aattgttctgacggtgccgggctctgaa cgctcctacgatttgaccggtct gaaaccgggcaccgagtatgtggtgaac attctgagcgttaagggcggt agcatcagcccaccgctgagcgcgatct tcacgactggtggttgc
167	ДНК	Искусственная	ЕСВ15 без Met	ctgccagcccctaagaatctggtcgtga gcgaagtaaccgaggacag cgcccgcctgagctgggacgacccgtgg gcgttctatgagtctttcctga ttcagtatcaagaaagcgaaaaagttgg cgaagcgatcgtcctgaccg tcccgggtagcgagcgctcctacgatct gaccggcctgaaaccgggta cggagtacacggtgtccatttacggtgt tcacaatgtgtataaagacacc aacatgcgtggcctgccgctgtcggcga ttttcaccaccgcgcctgcgc cagcgcctgcaccggctccgctgccggc

- 80 035745

				accgaagaacctggttgtca gccgtgtgaccgaggatagcgcacgttt gagctggaccgctccggatg cagcctttgacagcttctggattcgtta ctttgaatttctgggtagcggtgag gcgatcgttctgacggtgccgggctctg aacgcagctatgatttgacggg cctgaagccgggtactgagtacgtggtt aacatcatgggcgttaagggtg gtaaaatcagcccgccattgtccgcgat ctttaccacg
168	ДНК	Искусственная	> EGFR часть ЕСВ97; P54AR483v22 без Met	ttgccagcgccgaagaacctggtagtta gcgaggttactgaggacagc gcgcgtctgagctgggacgatccgtggg cgttctacgagagctttctgat ccagtatcaagagagcgagaaagtcggt gaagcgattgtgctgaccgt cccgggctccgagcgttcctacgacctg accggtttgaagccgggtacc gagtatacggtgagcatctacggtgttc acaatgtctataaggacactaa tatccgcggtctgcctctgagcgccatt ttcaccacc
169	ДНК	Искусственная	> EGFR часть ЕСВ15; P54AR483v2 без Met	ctgccagcccctaagaatctggtcgtga gcgaagtaaccgaggacag cgcccgcctgagctgggacgacccgtgg gcgttctatgagtctttcctga ttcagtatcaagaaagcgaaaaagttgg cgaagcgatcgtcctgaccg tcccgggtagcgagcgctcctacgatct gaccggcctgaaaccgggta cggagtacacggtgtccatttacggtgt tcacaatgtgtataaagacacc aacatgcgtggcctgccgctgtcggcga ttttcaccacc

- 81 035745

170	PRT	Искусственная	ЕСВ94 с сконцевы м цистеин ом	MLPAPKN LWSEVTEDSARLSWD D PWAFYESFLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKP GTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAP APAPLPAPKN LWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFLGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWN ILGVKGGKI SPPLSAIFTTC
171	PRT	Искусственная	ЕСВ95 с сконцевы м цистеин ом	MLPAPKN LWSEVTEDSARLSWD D PWAFYESFLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKP GTEYTVSIY GVHNVYKDTNI RGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKN LWSRVTED SARLSWTAPDAAF DSFWIRYFEFVGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWN ILGVKGGSI SPPLSAIFTTC
172	PRT	Искусственная	ЕСВ96 с Сконцевым цистеином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPW AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP APAPAP L PAPKNL WS RVT E D S ARL S WTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKG DAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV VNILGVKGGSISPPLSAIFTTC
173	PRT	Искусственная	ЕСВ97 с Сконцевым цистеином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPW AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP APAPAP L PAPKNL WS RVT E D S ARL S WTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV

- 82 035745

174	PRT	Искусственная	ЕСВ106 с С-концевым	VNILSVKGGSISPPLSAIFTTC MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPH AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP АРАРАР L PAPKNL WS RVT Е D S ARL S
175	PRT	Искусственная	цистеином ЕСВ107 с С-концевым	WTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV VNILGVKGGKISPPLSAIFTTC MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPH AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP
176	PRT	Искусственная	цистеином ЕСВ108 с С-концевым	APAPAP L PAPKNL WS RVT E D S ARL S W TAP DAAFD S FWIRY FE FVGS G EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV VNILGVKGGSISPPLSAIFTTC MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPH AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP
177	PRT	Искусственная	цистеином ЕСВ109 с С-концевым	APAPAP L PAPKNL WS RVT E D S ARL S WTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKG DAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV VNILGVKGGSISPPLSAIFTTC MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPH AFYE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAP
178	PRT	Искусственная	цистеином ЕСВ91 с Сконцевым цистеином	APAPAP L PAPKNL WS RVT E D S ARL S WTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYV VNILSVKGGSISPPLSAIFTTC mlpapknlwsevtedsarlswddpwa fyesfliqyqesekvgeaivltvpgs ersydltglkpgteytvsiygvhnvy kdtnirglplsaifttapapapapap LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDA AFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTV PGSERSYDLTGLKPGTEYWNILSVK GGSISPPLSAIFTTC

- 83 035745 > SEQ ID NO: 179

PRT

Искусственная

Петля FG EGFR-связывающего домена FN3 HNVYKDTNXgRGL;

где X₉ представляет собой M или I > SEQ ID NO: 180

PRT

Искусственная

Петля FG EGFR-связывающего домена FN3 LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), > SEQ ID NO: 181

PRT

Искусственная

Петля ВС EGFR-связывающего домена FN3

Х1Х2Х3Х4Х5Х6Х7Х8 (SEQ ID NO: 181); где

Xi представляет собой A, T, G или D;

X₂ представляет собой A, D, Y или W;

X₃ представляет собой P, D или N;

X₄ представляет собой L или отсутствует;

X₅ представляет собой D, Н, R, G, Y или W

Хе представляет собой G, D или А;

Х₇ представляет собой А, F, G, Н или D; и

Х₈ представляет собой Y, Е или L.

> SEQ ID NO: 182

PRT

Искусственная

EGFR-связывающий домен FN3

LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERS YDLTGLKPGTEYTVSI YGVHNVYKDTNXgRGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182)

- 84 035745

Xi	представляет	собой	А, Т, G или	D;
X₂	представляет	собой	A, D, Y I	тли	W;
Хз	представляет	собой	Р, D или	N;
X₄	представляет	собой	L или отсутствует;
x₅	представляет	собой	D, Н, R,	G,	Y или W;
Хб	представляет	собой	G, D или	А;
x₇	представляет	собой	А, Е, G,	Н	или D;
Xs	представляет	собой	Y, F или	L;	и
X₉	представляет	собой	М или I

> SEQ ID NO: 183

PRT

Искусственная

EGFR-связывающий домен FN3

LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWXiX₂X3X₄X₅X₆X₇X₈DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), где

Х1	представляет собой А, Т,	G или D;
Х₂	представляет собой A, D,	Y или W;
Хз	представляет собой Р, D	или N;
χ₄	представляет собой L или	: отсутствует;
χ₅	представляет собой D, Н,	R, G, Y или W
Хе	представляет собой G, D	или А;
х₇	представляет собой А, Е,	G, Н или D; и
х₈	представляет собой Y, Е	или L.

> SEQ ID NO: 184

PRT

Искусственная

Последовательность тяжа С и петли CD c-Met-связывающего домена FN3

DSFXioIRYXiiE X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), где

Хю	представляет	собой	W,	Е	или	V;
Хи	представляет	собой	D,	Е	или	L;
Х12	представляет	собой	V,	Е	или	L;
Х13	представляет	собой	V,	L	или	Т;
Х1₄	представляет	собой	V,	R,	G,	L, Т или S;
Х15	представляет	собой	G,	S,	А,	Т или К; и

- 85 035745

Xie представляет собой Е или D; и > SEQ ID NO: 185

PRT

Искусственная

Тяж F и петля FG c-Met-связывающего домена FN3

TEYXi₇VXi₈IXi9X₂oV	KGGX21X22SX23	(SEQ	ID	NO:	185) ,	где
Xi₇ представляет	собой Y, W,	I, V,	G	или	А;
Xis представляет	собой N, Т,	Q или	G;
Xi9 представляет	собой L, М,	N или	I;
X20 представляет	собой G или	S;
X21 представляет	собой S, L,	G, Y,	т,	R,	Н или	К;
Х22 представляет	собой I, Vi	тли L;	и
Х₂з представляет	собой V, Т,	Н, I,	Р,	Y,	Т или	L.

> SEQ ID NO: 186

PRT

Искусственная c-Met-связывающий домен FN3

LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF

DSFX₁₀IRYXiiE

X12X13X14X15GX16

AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₇VXi₈IXi9X₂oVKGGX2iX22SX23PLSAEFTT (SEQ ID

NO : 18 6) где

Хю	представляет	собой	W,	Е	или	V;	и
Хи	представляет	собой	D,	Е	или	L;
Х12	представляет	собой	V,	Е	или	L;
Х13	представляет	собой	V,	L	или	Т;
Х14	представляет	собой	V,	R,	G,	L,	Т или
Х15	представляет	собой	G,	S,	А,	Т I	тли К;
Х16	представляет	собой	Е	или D;
Х17	представляет	собой	Y,	W,	I,	V,	G или
Хю	представляет	собой	N,	т,	Q или	G;
Х19	представляет	собой	L,	М,	N 1	яли	I;
ХгО	представляет	собой	G	или S;
Х₂1	представляет	собой	S,	L,	G,	Y,	Т, R,
Х₂2	представляет	собой	I,	V	или	L;	и
Хгз	представляет	собой	V,	т,	н,	I г	Р, Y,

S;

А;

Н или К;

Т или L.

> SEQ ID NO: 187

- 86 035745

PRT

Искусственная

Домен FN3 EGFR биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3

LPAPKNLWSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LTVP

GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), где

X₂4	представляет	собой	Е,	N или R
X25	представляет	собой	Е	или Р ;
X26	представляет	собой	L	или А;
X27	представляет	собой	Н	или W;
X28	представляет	собой	Е	или D;
X₂9	представляет	собой	Е	или Р ;
Х30	представляет	собой	N	или V;
Х31	представляет	собой	G	или Y;
Х32	представляет	собой	М	или I; и
ХЗЗ	представляет	собой	Е	или I;

> SEQ ID NO: 188

Домен FN3 c-Met биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3

LPAPKNLVVSX34VTX3₅DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX3₈X39X₄oGX₄iAIX₄₂L

TVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIX₄₃X₄₄VKGGX₄₅ISPPLSAX₄₆FTT (SEQ ID NO: 188); где

Х34	представляет	собой	Е,	. N или R
Х35	представляет	собой	Е	или Р ;
Хзб	представляет	собой	L	или А;
Х37	представляет	собой	Е	или Р;
Хз8	представляет	собой	V	или L;
Х39	представляет	собой	G	или S;
Х40	представляет	собой	S	или К;
Х41	представляет	собой	Е	или D;
Х42	представляет	собой	N	или V;
Х₄з	представляет	собой	L	или М;
Х44	представляет	собой	G	или S ;
Х₄₅	представляет	собой	S	или К; и
Х46	представляет	собой	Е	или I .

- 87 035745

189	PRT	Искусственная	P54AR483v2-V9C с метионином	MLPAPKNLCVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
190	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-S11C с метионином	MLPAPKNLWCEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
191	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-E12C с метионином	MLPAPKNLWSCVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
192	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-E15C с метионином	MLPAPKNLWSEVTCDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
193	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-D16C с метионином	MLPAPKNLWSEVTECSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
194	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S17C с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDCARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
195	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S21C С метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLCWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
196	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S31C с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYECFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
197	PRT	Искусственная	P54AR483v2-Q35C с	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLICYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD

- 88 035745

			метионином	THMRGLPLSAIFTT
198	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S39C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQECEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
199	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-K41C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESECVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
200	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-V42C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKCGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
201	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-I46C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEACVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
202	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-L48C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVCTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
203	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-T49C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLCVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
204	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-E54C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSC RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
205	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-R55C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE CSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
206	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-T6C с	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE

- 89 035745

			метионином	RSYDLCGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
207	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-G61C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTCLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
208	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-K63C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
209	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-G65C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPCTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
210	PRT	Искусственная	P54AR483v2-N7C с метионином	MLPAPKCLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
211	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S71C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVCIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTT
212	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-L89C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPCSAIFTT
213	PRT	Искусственная	P54AR483v2-S9C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLCAIFTT
214	PRT	Искусственная	P54AR483v2A91C с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSCIFTT
215	PRT	Искусственная	P54AR4-	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA

- 90 035745

			83v2-I92C с метионином	FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSACFTT
216	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-T94C с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFCT
217	PRT	Искусственная	P54AR483v2-cys с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTGGHHHHHHC
218	PRT	Искусственная	ЕСВ147 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPSPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
219	PRT	Искусственная	ECB147V1 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPSPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
220	PRT	Искусственная	ECB147v2 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPA

- 91 035745

				PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPAPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
221	PRT	Искусственная	ECB147v3 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
222	PRT	Искусственная	ECB147v4 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD T HMRGL PL SAlFT TAPAPAPAPAP L PA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
223	PRT	Искусственная	ECB147v5 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKD T HMRGL PL SAIFT TAPAPAPAPAP L PA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPAPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD

- 92 035745

				EILAALP
224	PRT	Искусственная	ECB147v6 с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPAPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
225	PRT	Искусственная	ECB147v7 с метионином	MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLS AlFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANREL DKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLD EILAALP
226	PRT	Искусственная	ECB82-cys с метионином	MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWA FYESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSE RSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKD THMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPA PKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS FWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYWNIMGVKGGKISPPLS AlFT TAPAPAPAPAP TIDEWLLKEAKE KAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVE GVNALKDEILKAGGHHHHHHC
227	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-V8C без метионина	LPAPKNLCVSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT

- 93 035745

228	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-S1C без метионина	LPAPKNLWCEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
229	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-E11C без метионина	LPAPKNLWSCVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
230	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-E14C без метионина	LPAPKNLWSEVTCDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
231	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-D15C без метионина	LPAPKNLWSEVTECSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
232	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S16C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDCARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
233	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S2C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLCWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
234	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S3C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YECFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
235	PRT	Искусственная	P54AR483V2-Q34C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
236	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S38C без	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQECEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT

- 94 035745

			метионина	HMRGLPLSAIFTT
237	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-K4C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESECVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
238	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-V41C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKCGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
239	PRT	Искусственная	P54AR4- 83V2-I45C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEACVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
240	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-L47C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVCTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
241	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-T48C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLCVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
242	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-E53C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YE S FLIQYQE SEKVGEAIVLTVPGS CR SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
243	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-R54C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSEC SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
244	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-T59C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLCGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
245	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-G6C	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER

- 95 035745

			без метионина	SYDLTCLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
246	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-K62C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFT
247	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-G64C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPCTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
248	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-N6C без метионина	LPAPKCLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
249	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S7C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVCIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTT
250	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-L88C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPCSAIFTT
251	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-S89C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLCAIFTT
252	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2A9°C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSCIFTT
253	PRT	Искусственная	P54AR4- 83v2-I91C без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSACFTT
254	PRT	Искусственная	P54AR4-	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF

- 96 035745

			83v2-T93C без метионина	YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFCT
255	PRT	Искусственная	P54AR483v2-cys без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTGGHHHHHHC
256	PRT	Искусственная	ЕСВ147 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IETTAPSPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
257	PRT	Искусственная	ECB147V1 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IETTAPSPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
258	PRT	Искусственная	ECB147v2 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTAPAPAPAPAPLAEAKVLANRELD

- 97 035745

				KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
259	PRT	Искусственная	ECB147v3 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS Е WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
260	PRT	Искусственная	ECB147v4 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
261	PRT	Искусственная	ECB147v5 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLCPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTАРАРАРАРАРLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
262	PRT	Искусственная	ECB147v6 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLCPGTEYTVSIYGVHNVYKDT

- 98 035745

				HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWS RVTE DSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTAPAPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
263	PRT	Искусственная	ECB147v7 без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPCPAPAPAPLPAP KNLWS RVTE DSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMSVKGGSISPPLSA IFTTAPCPAPAPAPLAEAKVLANRELD KYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALLDE ILAALP
264	PRT	Искусственная	ECB82-cys без метионина	LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAF YESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDT HMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAP KNLWS RVTE DSARLSWTAPDAAFDS F WIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYWNIMGVKGGKISPPLSA IFT TAPAPAPAPAPTIDEWLLKEAKEK AIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEG VNALKDEILKAGGHHHHHHC
265	PRT	Искусственная	Tencon-cys	LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAA FDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSER SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSN PLSAEFTTGGHHHHHHC

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 53 и 88, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
2. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 8, 10, 14, 15, 20, 45, 48, 54, 59 и 64, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
3. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 11, 16, 30, 34, 38, 40, 41, 47, 60, 62, 70, 83, 84 и 85, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
4. Пептид по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий фрагмент, увеличивающий период полужизни.
5. Пептид по п.4, в котором фрагмент, увеличивающий период полужизни, представляет собой альбумин-связывающую молекулу, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или, по меньшей мере, участок Fc-области иммуноглобулина.
6. Способ получения пептида домена FN3 с внедренными остатками цистеина по любому из пп.1-5, включающий:

(i) мутагенез нуклеотидной последовательности исходного домена FN3 путем замены одного или более нуклеотидных остатков на нуклеотидные остатки, кодирующие остаток аминокислоты цистеина, для кодирования домена FN3 с внедренными остатками цистеина;

(ii) экспрессию домена FN3 с внедренными остатками цистеина и (iii) извлечение домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
7. Способ по п.6, где этап мутагенеза включает выполнение сайт-направленного мутагенеза.
8. Способ по п.7, включающий экспрессию домена FN3 с внедренными остатками цистеина в E.coli.

- 99 035745
9. Способ по п.7, дополнительно включающий после этапа извлечения реагирование домена FN3 с внедренными остатками цистеина с химическим реагентом, реагирующим с тиольной группой, с созданием химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
10. Способ по п.9, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение связывания EGFR с химически конъюгированным доменом FN3 с внедренными остатками цистеина.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией EGFR после добавления химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
12. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение связывания cMet с химически конъюгированным доменом FN3 с внедренными остатками цистеина.
13. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией c-Met после добавления химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
14. Способ по п.10, в котором реагент, реагирующий с тиольными группами, содержит малеимидный фрагмент.
15. Способ по п.14, в котором реагент, реагирующий с тиольными группами, содержит малеимидный фрагмент, который выбирают из группы, состоящей из NEM, MMAE и MMAF.
16. Способ по п.15, в котором химически конъюгированный домен FN3 с внедренными остатками цистеина имеет значение IC50 для роста клеток от около 1,7x10-10 М до около 1,3x10-9 М при измерении в клетках H1573 со сверхэкспрессией EGFR.
17. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.1, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 242, 248 и 250.
18. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина, содержащая первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, где первый домен FN3 представляет собой домен FN3 с внедренными остатками цистеина по любому из пп.1-5, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.
19. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина по п.18, в которой второй домен FN3 содержит цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 и 93 второго домена FN3.
20. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина по п.19, содержащая аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 219-226 и 257-264.
21. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.19, причем молекула химически конъюгирована с реагентом, реагирующим с тиольными группами.
22. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.21, причем реагент, реагирующий с тиольными группами, представляет собой малеимидный фрагмент.
23. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.22, в которой малеимидный фрагмент выбирают из группы, состоящей из NEM, ПЭГ24-малеимида, флуоресцеинмалеимида, MMAE и MMAF.
24. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.23, в которой первый домен FN3 ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ от около 0,9x10-9 М до около 2,3x10-9 М при измерении в клетках NCI-H292 с применением 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ot около 4x10-10 М до около 1,3x10-9 М при измерении в клетках NCI-H292 с применением 100 нг/мл человеческого HGF.
25. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.24, имеющая значение IC50 для роста клеток, которое выбирают из группы, состоящей из:

(i) от около 5,0x10-11 М до около 5,8x10-10 М при измерении в клетках H1573 со сверхэкспрессией EGFR и (ii) от около 7,8x10-12 М до около 1,1x10-9 М при измерении в клетках A731 со сверхэкспрессией EGFR.
26. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.25, дополнительно содержащая фрагмент, увеличивающий период полужизни.
27. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.26, в которой фрагмент, увеличивающий период полужизни, представляет собой альбумин-связывающую молекулу, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или, по меньшей мере, участок Fc-области иммуноглобулина.
28. Способ получения выделенной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина

- 100 035745 по любому из пп.18-27, включающий:

(i) мутагенез нуклеотидной последовательности исходной биспецифической молекулы путем замены одного или более нуклеотидных остатков на нуклеотидные остатки, кодирующие остаток цистеина, для кодирования биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина;

(ii) экспрессию биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина и (iii) извлечение биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
29. Способ по п.28, в котором этап мутагенеза включает выполнение сайт-направленного мутагенеза.
30. Способ по п.29, включающий экспрессию биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина в E.coli.
31. Способ по п.29, дополнительно включающий после этапа извлечения реагирование биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина с химическим реагентом, реагирующим с тиольными группами, с созданием химически конъюгированной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
32. Способ по п.31, дополнительно включающий этап, который выбирают из группы, состоящей из:

(i) измерения связывания с EGFR химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина;

(ii) измерения ингибирования стимулированного EGF фосфорилирования EGFR в клеточной линии химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина;

(iii) измерения ингибирования стимулированного HGF фосфорилирования с-Met в клеточной линии химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина и (iv) измерения ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией EGFR после добавления химически конъюгированной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
33. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.1, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
34. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.33, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 210 и SEQ ID NO: 212.
35. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.2, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 247.
36. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.2, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
37. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.36, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206 и SEQ ID NO: 209.
38. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.3, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246 и SEQ ID NO: 249.
39. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.3, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
40. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.39, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 и SEQ ID NO: 211.