TWI836609B - 纖維黏蛋白第iii型結構域衍生的蛋白質及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提出一種蛋白質，其包含第10人類纖維黏蛋白第III型結構域，且包含將一胺基酸位點取代為一半胱胺酸的第一突變及將另一胺基酸位點取代為另一半胱胺酸的第二突變，第一突變與第二突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此第一突變取代成的半胱胺酸與第二突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵。
Description
本發明涉及蛋白質工程，特別關於一種纖維黏蛋白第III型結構域衍生的蛋白質及其應用，包括：治療或預防第二型血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的方法、或治療或預防血管新生導致之疾病或失調的方法。
近年致力開發蛋白質支架為基礎的分子辨識模組來取代利用免疫球蛋白建構的模組，以期克服利用免疫球蛋白作為分子辨識模組主體所產生的既定限制，如：過大尺寸、複雜的異二聚體結構、及需要正確形成雙硫鍵等。此種蛋白質工程的基本理論在於：透過於非抗體的適當蛋白質框架或分子支架建構出結合界面，以開發具有與抗體相當之親和性與特異性的分子。
第10人類纖維黏蛋白第III型結構域(10th human fibronectin type III domain，10Fn3)為目前廣泛使用於製備新穎結合蛋白質的非抗體支架之一。數種10Fn3為主體的分子正逐漸開發並嘗試於疾病的治療，惟多數仍處於臨床試驗階段。
10Fn3具備許多優於免疫球蛋白衍生之系統的特徵。基於整體的β-三明治(β-sandwich)摺疊，10Fn3屬於免疫球蛋白的超家族成員之一，近於N
端的三個表面環狀區域於結構上與免疫球蛋白之變異區域的三個抗原辯識環區域或互補決定區(complementarity-determining region，CDR)類似。然而，與免疫球蛋白的典型區域不同，10Fn3不含雙硫鍵。而且，10Fn3的熱轉移溫度大於80℃，構型穩定。另外，10Fn3具備可逆且快速的展開與再摺疊特性。10Fn3具有約94個胺基酸殘基，小於重鏈抗體的抗原結合單元(VHH)。上述特性使10Fn3可與不同的分子表現系統與簡單有效的生產方法兼容。
美國專利申請號11/448,171，專利名稱為「INHIBITORS OF TYPE 2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS」，提出一種第二型血管內皮生長因子受體的結合蛋白質C7。蛋白質C7以10Fn3為結構主體，與野生型的差異在於：將野生型的三個表面環狀區域序列23DAPAVTVRY、51PGSKST、與75VTGRGDSPASSKP各以23RHPHFPTRY、51PLQPPT、與75VTDGRNGRLLSIP取代。透過上述三個突變區域作為第二型血管內皮生長因子受體的結合位點，使蛋白質C7可作為第二型血管內皮生長因子受體的拮抗劑，並有成為抗癌藥物的潛力。然而，礙於熱穩定性不足且溶解度低，使其於藥物的發展受阻。
職是之故，開發高熱穩定性以及高溶解度之以10Fn3為結構主體的蛋白質支架確實為本發明所屬技術領域人士積極解決的課題之一。
先前改良蛋白質C7來取得變異蛋白質C7-NM。本發明乃根據以下事項完成：利用軟體Disulfide by Design 2.0(DbD2)並參考B因子(B-factor)、χ3扭轉角(χ3 angle)、與能量等參數來於蛋白質C7-NM的結構設計雙硫鍵的引入，以取得具雙硫鍵的變異體，其可於不影響與特定蛋白質結合的活性下來提升
熱穩定性與溶解度，從而具有作為生物藥的潛力。
準此，本發明提出一種蛋白質，其包含第10人類纖維黏蛋白第III型結構域，且包含將一胺基酸位點取代為一半胱胺酸的第一突變及將另一胺基酸位點取代為另一半胱胺酸的第二突變，第一突變與第二突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此第一突變取代成的半胱胺酸與第二突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵。
示例地，第10人類纖維黏蛋白第III型結構域包含一如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
示例地，蛋白質更包含將環BC之胺基酸序列取代為RHPHFPTRY的突變、將環DE之胺基酸序列取代為PLQPPT的突變、以及將環FG之胺基酸序列取代為VTDGRNGRLLSIP的突變。
示例地，第一突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、與環EF中的任一者，第二突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、與環EF中的任一者。
示例地，第一突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、與環EF中的任一者，第二突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、與環EF中的任一者。
示例地，第一突變與第二突變發生於相同區域或不同區域。
示例地，第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸、位置17
的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置19的白胺酸取代為半胱胺酸、位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63的離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸、位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。
示例地，第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置19的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置70的異白胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置63的離胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸；
或第一突變包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。
示例地，蛋白質包含一如SEQ ID NOs：4至14中任一所示的胺基酸序列。
示例地，蛋白質包含一如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
示例地，於第一突變及第二突變未包含位置19之白胺酸取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二
突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置63之離胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，蛋白質包含一如SEQ ID NOs：17至26中任一所示的胺基酸序列。
示例地，蛋白質更包含將又一胺基酸位點取代為又一半胱胺酸的第三突變及將再一胺基酸位點取代為再一半胱胺酸的第四突變，第三突變與第四突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此第三突變取代成的半胱胺酸與第四突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵。
示例地，第三突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β
股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、與環EF中的任一者，第四突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、與環EF中的任一者。
示例地，第三突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、與環EF中的任一者，第四突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、與環EF中的任一者。
示例地，第一突變、第二突變、第三突變、與第四突變發生於不同區域。
示例地，第三突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸、位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置19的白胺酸取代為半胱胺酸、位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63的離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸、位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。
示例地，第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置17的絲胺酸取代
為半胱胺酸，第四突變包含：位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸。
示例地，蛋白質包含一如SEQ ID NO：15或16所示的胺基酸序列。
示例地，於第一突變、第二突變、第三突變、及第四突變未包含位置19之白胺酸取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天
門冬胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸的條件下，蛋白質包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
示例地，蛋白質包含一如SEQ ID NO：27或28所示的胺基酸序列。
示例地，蛋白質用於結合至DLL4、EGFR、VEGFR2、或IGF-1R。
本發明的蛋白質以第10人類纖維黏蛋白第III型結構域為主體，並於主體特定位置引入雙硫鍵來提升熱穩定性與溶解度。本發明的蛋白質可進一步地利用胺基酸序列的取代來建構蛋白質結合界面，以與特定蛋白質結合，如：DLL4、EGFR、VEGFR2、或IGF-1R，以作為受體拮抗劑，具有作為生物藥的潛
力。
本發明另提出一種醫藥組合物，其包含：如上所述的蛋白質；以及一醫藥上可接受的載體。
示例地，醫藥組合物為口服投予配製物、注射投予配製物、吸入投予配製物、或局部或經皮投予配製物。
本發明又提出一種上述醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的醫藥。
示例地，第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯的疾病或失調包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變(retinopathy)、腎病、成血管細胞瘤(hemangioblastoma)、血管瘤(hemangioma)、甲狀腺增生(thyroid hyperplasia)、慢性炎症、梅格斯氏徵候群(Meigs syndrome)、心包膜積水(pericardial effusion)、肋膜積水(pleural effusion)、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。
示例地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明更提出一種治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的方法，其包含：投予如上所述的醫藥組合物至一有此需求的個體，藉此結合至個體的第二型血管內皮生長因子受體以抑制其活性。
示例地，第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與
其相關聯的疾病或失調包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。
示例地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明更提出一種上述醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防血管新生導致之疾病或失調的醫藥。
示例地，血管新生導致的疾病或失調包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。
示例地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明復提出一種治療或預防血管新生導致之疾病或失調的方法，其包含：投予如上所述的醫藥組合物至一有此需求的個體，藉此結合至個體的第二型血管內皮生長因子受體以抑制血管新生。
示例地，血管新生導致的疾病或失調包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。
示例地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明又提出一種核酸，其包含用於編碼如上所述之蛋白質的核苷酸序列。
本發明再提出一種宿主細胞，其包含如上所述的核酸。
示例地，宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
示例地，原核細胞為大腸桿菌，真核細胞為CHO細胞、COS細胞、或HEK293細胞。
本發明尚提出一種製備如上所述之蛋白質的方法，其包含培養如上所述的宿主細胞使其表現蛋白質。
圖1為蛋白質結構圖，呈現蛋白質C7-NM的三維結構；圖2為蛋白質結構圖，呈現蛋白質C7-NM於三維結構可設計雙硫鍵的位置；圖3為差示掃描量熱法結果圖，比較蛋白質C7及其變異蛋白質的熔點溫度；圖4為差示掃描量熱法結果圖，比較蛋白質C7及C7-SL1-LL2的熔點溫度；圖5為溶解度結果圖，比較蛋白質C7及C7-SL1-LL2的溶解度；圖6為酵素結合免疫吸附分析法結果圖，比較蛋白質C7及C7-SL1-LL2結合至第二型血管內皮生長因子受體的親和力。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特
舉較佳實施方式，作詳細說明於下：
一、術語的定義
本文所指的「蛋白質」若無特殊定義下，包含天然細胞表現的野生蛋白質、利用基因工程技術表達的重組蛋白質、或利用化學方式取得的合成蛋白質。於不影響原有的活性下，可於蛋白質序列中取代、刪除、且/或插入至少一個胺基酸。
本文所指的「胺基酸」若無特殊定義下，包含D-胺基酸或L-胺基酸。D-與L-表示胺基酸的絕對構型，而非平面偏光的特定旋轉方向。若無特殊情況下，本文採用IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推薦的單字母符號來表示胺基酸。蛋白質序列由多個單字母符號組成的字串表示，單字母符號順序對應胺基酸自蛋白質N端至C端之方向的順序。若單字母符號之前有上標數字，其表示對應胺基酸位於蛋白質自N端起算的位置順序；舉例而言，23DAPAVTVRY表示天門冬胺酸位於蛋白質的位置23；其餘以此類推，不再贅述。
蛋白質序列的取代、刪除、及/或插入可發生於蛋白質的非骨架區域，此通常不影響原有的活性。另外，蛋白質序列的取代可包含保留性胺基酸的取代，保留性取代意指具有相似特性或相關側鏈之胺基酸間的取代。相似特性之胺基酸間的取代，例如：酸性胺基酸可互相替代，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；鹼性胺基酸可互相替代，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、與組胺酸(histidine)；非極性胺基酸可互相替代，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、與色胺酸(tryptophan)；非帶電極性胺基酸可互相替代，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、
麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、與酪胺酸(tyrosine)。相關側鏈之胺基酸間的取代，例如：脂肪羥基類(aliphatic-hydroxy)胺基酸可互相替代，即絲胺酸與蘇胺酸；含醯胺類胺基酸(amide-containing)胺基酸可互相替代，即天門冬醯胺與麩醯胺酸；脂肪類胺基酸可互相替代，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、與異白胺酸；芳香類(aromatic)胺基酸可互相替代，即苯丙胺酸、色胺酸、與酪胺酸。
本文所指的「第10人類纖維黏蛋白第III型結構域」若無特殊定義下，自N端至C端依序含有N端區域、β股A(β-strand A)、環AB(loop AB)、β股B(β-strand B)、環BC(loop BC)、β股C(β-strand C)、環CD(loop CD)、β股D(β-strand D)、環DE(loop DE)、β股E(β-strand E)、環EF(loop EF)、β股F(β-strand F)、環FG(loop FG)、β股G(β-strand G)、與C端區域，至少有94個胺基酸，不具任何雙硫鍵，如：SEQ ID NO：1。參照美國專利申請號13/757,664，專利名稱為「FIBRONECTIN BINDING DOMAINS WITH REDUCED IMMUNOGENICITY」，N端區域定義為位置1至7的胺基酸片段，β股A定義為位置8至13的胺基酸片段，環AB定義為位置14至17的胺基酸片段，β股B定義為位置18至22的胺基酸片段，環BC定義為位置23至31的胺基酸片段，β股C定義為位置32至36的胺基酸片段，環CD定義為位置37至47的胺基酸片段，β股D定義為位置48至50的胺基酸片段，環DE定義為位置51至56的胺基酸片段，β股E定義為位置57至62的胺基酸片段，環EF定義為位置63至67的胺基酸片段，β股F定義為位置68至74的胺基酸片段，環FG定義為位置75至87的胺基酸片段，β股G定義為位置88至92的胺基酸片段，C端區域定義為位置93及94的胺基酸片段；環BC、環
DE、與環FG位於分子的一側，環AB、環CD、與環EF位於分子的另一側。舉例而言，N端區域包含1VSDVPRD，β股A包含8LEVVAA，環AB包含14TPTS，β股B包含18LLISW，環BC包含23DAPAVTVRY，β股C包含32YRITY，環CD包含37GETGGNSPVQE，β股D包含48FTV，環DE包含51PGSKST，β股E包含57ATISGL，環EF包含63KPGVD，β股F包含68YTITVYA，環FG包含75VTGRGDSPASSKP，β股G包含88ISINY，C端區域包含93RT。
本文所指的「蛋白質C7」若無特殊定義下，係指第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的變異體，可結合至第二型血管內皮生長因子受體以抑制其活性，如：SEQ ID NO：2。申言之，其對應於野生型之環BC的胺基酸序列為23RHPHFPTRY，對應於野生型之環DE的胺基酸序列為51PLQPPT，對應於野生型之環FG的胺基酸序列為75VTDGRNGRLLSIP，透過上述三個突變區域構成第二型血管內皮生長因子受體的結合界面。
本文所指的「蛋白質C7-NM」若無特殊定義下，係指蛋白質C7的變異體，如：SEQ ID NO：3。申言之，其對應於參考序列位置12的胺基酸為麩胺酸，對應於參考序列位置14的胺基酸為絲胺酸，對應於參考序列位置18的胺基酸為異白胺酸，對應於參考序列位置19的胺基酸為麩醯胺酸。
本文所指的「第二型血管內皮生長因子受體」若無特殊定義下，係指一跨膜受體酪胺酸激酶(transmembrane receptor tyrosine kinase)，其可調控VEGF-A與VEGF-B導致的血管新生。第二型血管內皮生長因子受體與激酶插入結構域受體(kinase insert domain receptor，KDR)及胎肝激酶(fetal liver kinase 1，FLK-1)同義，可交替使用。
本文所指的「治療」若無特殊定義下，係指治療性介入以治癒或
改善病症，即包含完全或局部治癒或改善。
本文所指的「預防」若無特殊定義下，係指完全地或近乎完全地防止病症。舉例而言，於未有病症或疑似有病症但尚未造成病症時，可預防性介入以避免病症發生。
本文所指的「醫藥上可接受的載體」若無特殊定義下，係指於健全的醫療判斷範圍內，適合與個體接觸且無過量毒性、刺激性、過敏反應、或其他問題或併發症，並具有合理利弊比例的添加物，如：填充劑、稀釋劑、凝集劑、接合劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、著色劑、潤濕劑、或崩解劑。
二、第10人類纖維黏蛋白第III型結構域為主體的蛋白質
本發明第一實施方式揭示一種蛋白質，其以第10人類纖維黏蛋白第III型結構域為主體，並將主體特定位置的胺基酸取代引入雙硫鍵，藉此提升蛋白質的熱穩定性與溶解度。基於上述的高熱穩定性與高溶解度及第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的原有特性，可進一步地利用胺基酸取代來建構蛋白質結合界面，以與特定蛋白質結合，如：DLL4、EGFR、VEGFR2、或IGF-1R。藉此，本實施方式的蛋白質可作為受體拮抗劑，作為生物藥使用。
本實施方式的蛋白質包含第10人類纖維黏蛋白第III型結構域，且包含將一胺基酸位點取代為一半胱胺酸的第一突變及將另一胺基酸位點取代為另一半胱胺酸的第二突變，第一突變與第二突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此第一突變取代成的半胱胺酸與第二突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵。較佳地，第10人類纖維黏蛋白第III型結構域包含一如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
依第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的區域而言，第一突變可發
生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、或環EF，第二突變可發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、或環EF。較佳地，第一突變發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、或環EF，第二突變發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、或環EF。
第一突變與第二突變可發生於以上區域群組中的一相同者或二不同者。舉例而言，第一突變與第二突變均可發生環CD或環EF。再舉例而言，第一突變可發生於β股A，第二突變可發生於β股B；第一突變可發生於β股A，第二突變可發生於β股G；第一突變可發生於環AB，第二突變可發生於β股E；第一突變可發生於β股B，第二突變可發生於β股E；第一突變可發生於β股C，第二突變可發生於β股D；第一突變可發生於β股C，第二突變可發生於環CD；第一突變可發生於β股C，第二突變可發生於β股F；第一突變可發生於環CD，第二突變可發生於環EF；或第一突變可發生於環EF，第二突變可發生於β股G。
依第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的胺基酸序列而言，第一突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸、位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置19的白胺酸取代為半胱胺酸、位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63的離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸、位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70的
異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。具體而言，第一突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置19的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置70的異白胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸；第一突變可包含：位置63的離胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變可包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。
本實施方式的蛋白質更可包含將又一胺基酸位點取代為又一半胱胺酸的第三突變及將再一胺基酸位點取代為再一半胱胺酸的第四突變，第三突變與第四突變發生於第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此第三突變取代成的半胱胺酸與第四突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵。於含有至少二個雙硫鍵的條件下，蛋白質可進一步提升熱穩定性與溶解度。
依第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的區域而言，第三突變可發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、或環EF，第四突變可發生β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環BC、環CD、環DE、或環EF。較佳地，第三突變發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、或環EF，第四突變發生於β股A、β股B、β股C、β股D、β股E、β股F、β股G、環AB、環CD、或環EF。
第一突變、第二突變、第三突變、與第四突變可發生於以上區域群組中的四不同者。舉例而言，第一突變可發生於β股A，第二突變可發生於β股G，第三突變可發生於環AB，第四突變可發生於β股E；或第一突變可發生於β股A，第二突變可發生於β股G，第三突變可發生於環CD，第四突變可發生於環EF。
依第10人類纖維黏蛋白第III型結構域的胺基酸序列而言，第三突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸、位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置19的白胺酸取代為半胱胺酸、位置34的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36的酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37的甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63的離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第四突變可包含：位置22的色胺酸取代為半胱胺酸、位置45的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48的苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58的蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66的纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70的異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91的天門冬醯胺取代為半胱胺酸。具體而言，第一突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置89的絲胺酸取代為半
胱胺酸，第三突變可包含：位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸，第四突變可包含：位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變可包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變可包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變可包含：位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸，第四突變可包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸。
如前所述，本實施方式的蛋白質可結合至DLL4、EGFR、VEGFR2、或IGF-1R。為與VEGFR2結合，本實施方式的蛋白質另可包含將環BC之胺基酸序列取代為RHPHFPTRY的突變、將環DE之胺基酸序列取代為PLQPPT的突變、以及將環FG之胺基酸序列取代為VTDGRNGRLLSIP的突變。
較佳地，本實施方式的蛋白質包含一如SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16所示的胺基酸序列。更佳地，本實施方式的蛋白質包含一如SEQ ID NO：11、15、或16所示的胺基酸序列。
先前發現蛋白質C7-NM可提高熱穩定性與溶解度。本實施方式的蛋白質可參照蛋白質C7-NM的胺基酸序列進行修飾。
於第一突變及第二突變未包含位置19之白胺酸取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可進一步地包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。具體而言，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天門冬胺酸取代為半
胱胺酸，第二突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可進一步地包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。更具體而言，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸；第一突變包含：位置63之離胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可進一步地包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為
絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
較佳地，本實施方式的蛋白質包含一如SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26所示的胺基酸序列。
於第一突變、第二突變、第三突變、及第四突變未包含位置19之白胺酸取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可另包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。具體而言，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸、位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置34之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置35之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置36之酪胺酸取代為半胱胺酸、位置37之甘胺酸取代為半胱胺酸、位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置63之離胺酸取代為半胱胺酸、或位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置22之色胺酸取代為半胱胺酸、位置45之纈
胺酸取代為半胱胺酸、位置48之苯丙胺酸取代為半胱胺酸、位置58之蘇胺酸取代為半胱胺酸、位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸、位置66之纈胺酸取代為半胱胺酸、位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸、位置70之異白胺酸取代為半胱胺酸、位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸、或位置91之天門冬醯胺取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可進一步包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。更具體而言，於第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置17之絲胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置60之絲胺酸取代為半胱胺酸；或第一突變包含：位置8之白胺酸取代為半胱胺酸，第二突變包含：位置89之絲胺酸取代為半胱胺酸，第三突變包含：位置39之蘇胺酸取代為半胱胺酸，第四突變包含：位置67之天門冬胺酸取代為半胱胺酸的條件下，本實施方式的蛋白質可再包含將位置12之丙胺酸取代為麩胺酸的突變、將位置14之蘇胺酸取代為絲胺酸的突變、將位置18之白胺酸取代為異白胺酸的突變、以及將位置19之白胺酸取代為麩醯胺酸的突變。
較佳地，本實施方式的蛋白質包含一如SEQ ID NO：27或28所示的胺基酸序列。
本實施方式的蛋白質可透過基因工程技術或化學方式製備，化學方式如：固相合成或溶液合成。可於後續採用硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、離子交換層析、親和層析、或凝集素層析等方法分離取得或純化本實施方式的蛋白質，較佳地採用高效液相層析。
本實施方式的蛋白質更可具有一親水性基團，藉以提升水溶性或
循環半衰期。親水性基團可連接蛋白質的N端。較佳地，親水性基團為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、或聚葡萄醣。更佳地，親水性基團為2至40個乙二醇重複單元組成的聚乙二醇。
本實施方式的蛋白質更可含有一純化標籤，藉以協助純化。純化標籤可連接蛋白質的N端或C端。較佳地，純化標籤為組胺酸標籤(His-tag)、谷胱甘肽S-轉移酶標籤(GST-tag)、麥芽糖結合蛋白標籤(MBP-tag)、轉錄終止/抗終止蛋白(NusA-tag)、或小泛素相關修飾物標籤(SUMO-tag)。
三、醫藥組合物
本發明第二實施方式揭示一種醫藥組合物，其含有第一實施方式的蛋白質，故可投予至個體以與其特定蛋白質結合，以作為特定蛋白質的拮抗劑，從而抑制特定蛋白質的活性或阻斷相關的訊息傳遞。本實施方式的醫藥組合物包含：第一實施方式的蛋白質；以及一醫藥上可接受的載體。
醫藥上可接受的載體可使醫藥組合物整體呈現不同型態或適用於不同投藥途徑。較佳地，醫藥組合物為口服投予配製物、注射投予配製物、吸入投予配製物、或局部或經皮投予配製物，以使用於不同投藥途徑。較佳地，醫藥組合物為錠劑、膠囊、顆粒劑、散劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、或乳劑。
醫藥上可接受的載體可為賦形劑、填充劑、稀釋劑、凝集劑、接合劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、著色劑、潤濕劑、或崩解劑。賦形劑的實例可為檸檬酸鈉、碳酸鈣、或磷酸鈣，填充劑的實例可為乳糖或高分子量聚乙二醇，稀釋劑的實例可為水、乙醇、丙二醇、或甘油，接合劑的實例可為蔗糖、明膠、或阿拉伯膠，潤滑劑的實例可為硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸鈉、硬脂酸、硬脂酸鋁、白胺酸、山嵛酸甘油酯、或氫化植物油，助流劑的實例可為鋁
矽酸鈉、矽酸鈣、微晶纖維素、玉米澱粉、苯甲酸鈉、碳酸鈣、碳酸鎂、滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、月桂基硫酸鎂、或氧化鎂，穩定劑的實例可為檸檬酸或抗壞血酸，著色劑的實例可為二氧化鈦或氧化鐵，潤濕劑的實例可為普朗尼克F68(Pluronic F68)、吐溫20(Tween 20)、或吐溫80(Tween 80)，崩解劑的實例可為馬鈴薯澱粉、樹薯澱粉、或矽酸鹽。
四、醫藥用途
本發明第三實施方式揭示一種第二實施方式之醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的醫藥。可投予製備的醫藥至個體，以抑制第二型血管內皮生長因子受體活性或阻斷其訊息傳遞。亦即，可投予製備的醫藥至有治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調需求的個體，以透過抑制個體的第二型血管內皮生長因子受體活性或阻斷其訊息傳遞，來達到治療或預防功效。
可採用不同的方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。
第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯的疾病或失調可包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。較佳地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明第四實施方式揭示一種治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的方法，其包含：投予第二實施方式的醫藥組合物至一有此治療或預防需求的個體，藉此結合至個體的第二型血管內皮生長因子受體以抑制其活性或阻斷其訊息傳遞。
可採用不同的方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。
第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯的疾病或失調可包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。較佳地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明第五實施方式揭示一種第二實施方式之醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防血管新生導致之疾病或失調的醫藥。可投予製備的醫藥至個體，以抑制血管新生。亦即，可投予製備的醫藥至有治療或預防血管新生導致之疾病或失調需求的個體，以透過抑制個體的血管新生來達到治療或預防功效。
可採用不同的方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。
血管新生導致的疾病或失調可包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格
斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。較佳地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
本發明第六實施方式揭示一種治療或預防血管新生導致之疾病或失調的方法，其包含：投予第二實施方式的醫藥組合物至一有此治療或預防需求的個體，藉此結合至個體的第二型血管內皮生長因子受體以抑制血管新生。
可採用不同的方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。
血管新生導致的疾病或失調可包含：自體免疫失調症、心臟失調症、視網膜病變、腎病、成血管細胞瘤、血管瘤、甲狀腺增生、慢性炎症、梅格斯氏徵候群、心包膜積水、肋膜積水、糖尿病、子宮內膜異位、不良纖維化、或癌症。較佳地，癌症包含：腎癌、胰腺癌、乳癌、頭頸部癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑色素瘤。
五、其他事項
本發明第七實施方式揭示一種核酸，其包含用於編碼第一實施方式之蛋白質的核苷酸序列。為調控蛋白質的表現，核酸更可含有一啟動子，其為可操作地連接編碼蛋白質的核苷酸序列。此處「可操作地連接」係指二個或二個以上核酸序列彼此間呈功能關係。
本發明第八實施方式揭示一種宿主細胞，其包含第七實施方式的核酸。由於本實施方式的宿主細胞含有編碼蛋白質的核苷酸序列，故可透過培養
宿主細胞來生成蛋白質。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。原核細胞的實例可為大腸桿菌，真核細胞的實例可為CHO細胞、COS細胞、或HEK293細胞。
本發明第九實施方式揭示一種製備第一實施方式之蛋白質的方法，其包含培養第八實施方式的宿主細胞使其表現蛋白質。可依啟動子來選擇適當的誘導子誘導細胞表現蛋白質。
茲以下列實施例，示範地說明本發明：
<實施例1：引入雙硫鍵的設計>
如圖1所示，蛋白質C7-NM具有8個β股，相鄰的二個β股之間形成有一個環狀結構。以蛋白質C7-NM為親本蛋白質，並利用軟體Disulfide by Design 2.0(DbD2)且參考B因子、χ3扭轉角、與能量等參數來於親本蛋白質的結構設計引入雙硫鍵。如圖2與表1所示，可設計雙硫鍵的位置位於親本蛋白質的二個β股之間、二個環之間、及一個β股與一個環之間。如表2所示，呈現帶有雙硫鍵之變異蛋白質的胺基酸序列，其以蛋白質C7的胺基酸序列為參考序列並依設計的雙硫鍵位置進行胺基酸取代而取得。
<實施例2：蛋白質的製備>
蛋白質C7及其變異蛋白質為於大腸桿菌內表現。簡言之，蛋白質C7及其變異蛋白質為利用pET21a表現載體及BL21(DE3)pLysS菌株或SHuffle菌株製備取得的，其中BL21(DE3)pLysS菌株的培養基為LB培養基，SHuffle菌株的培養基為LLB培養基。
首先，BL21(DE3)pLysS菌株於37℃下培養於5mL培養基約16至18小時(SHuffle菌株於30℃培養)。將BL21(DE3)pLysS菌株轉至500mL培養基後於37℃下培養約4小時(SHuffle菌株於30℃培養約6小時)。接著，添加500μL的IPTG(濃度1M)後於25℃下誘導BL21(DE3)pLysS菌株表現蛋白質約16至18小時(於16℃誘導SHuffle菌株約48小時)，然後離心收集細胞沉澱物。
將細菌溶解於binding Buffer A(50mM磷酸鈉，300mM氯化鈉，pH7.0)，並以法式壓濾器破裂細胞(壓力維持於1500psi)。透過高速離心取得上層液，並載入至經Buffer A預平衡的鎳離子螯合管柱。利用提取緩衝液(300mM咪唑於Buffer A，pH7.0)的梯度提取目標蛋白質。提取後以甘胺酸SDS-PAGE確認目標蛋白質。最後，以PBS透析得到的重組蛋白質並儲存於-80℃直至使用。
<實施例3：蛋白質特性的分析>
利用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)測
定蛋白質熔點溫度。如表3與圖3所示，蛋白質C7-SL1與蛋白質C7的熔點溫度差為37.0℃，較其他具單個雙硫鍵的蛋白質與蛋白質C7的熔點溫度差高，表示蛋白質C7-SL1的熱穩性佳。如表3與圖3、4所示，以蛋白質C7-SL1為主體並引入其他雙硫鍵取得的蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3可進一步提升熱穩性。
參照J Pharm Sci.2008 Oct；97(10)：4155-66，利用硫酸銨沉澱方式測定蛋白質溶解度。如表3所示，蛋白質C7-SL1的PBS溶解度約為蛋白質C7的6倍，較其他具單個雙硫鍵的蛋白質高，表示蛋白質C7-SL1的溶解度佳。如表3與圖5所示，以蛋白質C7-SL1為主體並引入其他雙硫鍵取得的蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3可進一步提升PBS溶解度至約為蛋白質C7的7倍。
利用細胞增生實驗分析蛋白質對人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)增生的抑制活性。如表3所示，蛋白質C7-SL1對HUVEC增生的抑制活性與蛋白質C7無明顯差異，表示蛋白質C7-SL1具有抑制血管新生的能力。如表3所示，以蛋白質C7-SL1為主體並引入其他雙硫鍵取得之蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3對HUVEC增生的抑制活性亦與蛋白質C7無明顯差異，表示蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3亦具有抑制血管新生的能力。
利用酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析蛋白質結合至第二型血管內皮生長因子受體的親和力。如表3所示，蛋白質C7-SL1結合至第二型血管內皮生長因子受體的親和力與蛋白質C7無明顯差異，表示蛋白質C7-SL1具有結合至第二型血管內皮生長因子受體的能力。如表3與圖6所示，以蛋白質C7-SL1為主體並引入其他雙硫鍵取得之蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3結合至第二型血管內皮生長因子受體的親和力亦與
蛋白質C7無明顯差異，且蛋白質C7-SL1-LL2結合至第二型血管內皮生長因子受體的親和力略優於蛋白質C7，表示蛋白質C7-SL1-LL2與C7-SL1-LL3亦具有結合至第二型血管內皮生長因子受體的能力。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
Claims (9)
- 一種蛋白質，係包括：第10人類纖維黏蛋白第III型結構域，且該蛋白質包含將一胺基酸位點取代為一半胱胺酸的第一突變及將另一胺基酸位點取代為另一半胱胺酸的第二突變，該第一突變與該第二突變發生於該第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此該第一突變取代成的半胱胺酸與該第二突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵；其中，該第10人類纖維黏蛋白第III型結構域包含一如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；其中，該第一突變包含：位置8的白胺酸取代為半胱胺酸，該第二突變包含：位置89的絲胺酸取代為半胱胺酸；其中，該蛋白質更包含將環BC之胺基酸序列取代為RHPHFPTRY的突變、將環DE之胺基酸序列取代為PLQPPT的突變、以及將環FG之胺基酸序列取代為VTDGRNGRLLSIP的突變。
- 如請求項1所述之蛋白質，包含一如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之蛋白質，更包含將又一胺基酸位點取代為又一半胱胺酸的第三突變及將再一胺基酸位點取代為再一半胱胺酸的第四突變，該第三突變與該第四突變發生於該第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此該第三突變取代成的半胱胺酸與該第四突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵；其中，該第三突變包含：位置17的絲胺酸取代為半胱胺酸，該第四突變包含：位置60的絲胺酸取代為半胱胺酸。
- 如請求項3所述之蛋白質，包含一如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之蛋白質，更包含將又一胺基酸位點取代為又一半胱胺酸的第三突變及將再一胺基酸位點取代為再一半胱胺酸的第四突變，該第三突變與該第四突變發生於該第10人類纖維黏蛋白第III型結構域之環FG以外的其他區域，藉此該第三突變取代成的半胱胺酸與該第四突變取代成的半胱胺酸形成雙硫鍵；其中，該第三突變包含：位置39的蘇胺酸取代為半胱胺酸，該第四突變包含：位置67的天門冬胺酸取代為半胱胺酸。
- 如請求項5所述之蛋白質，包含一如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
- 一種醫藥組合物，係包括：一如請求項1至6中任一所述之蛋白質；以及一醫藥上可接受的載體。
- 一種如請求項7所述之醫藥組合物的用途，係用於製備治療或預防第二型血管內皮生長因子受體活性或訊息傳遞導致或與其相關聯之疾病或失調的醫藥。
- 一種如請求項7所述之醫藥組合物的用途，係用於製備治療或預防血管新生導致之疾病或失調的醫藥。
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| TW201412770A (zh) * | 2012-06-07 | 2014-04-01 | Univ Nat Cheng Kung | 經修飾纖維黏連蛋白片段或變體及其用途 |
| CN105899226A (zh) * | 2013-10-14 | 2016-08-24 | 詹森生物科技公司 | 半胱氨酸工程化iii型纤连蛋白域结合分子 |
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