KR20100128291A - Ｅｇｆｒ에 결합하는 조작된 단백질을 기초로 하는 표적화된 치료제 - Google Patents

Ｅｇｆｒ에 결합하는 조작된 단백질을 기초로 하는 표적화된 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하는 단일 도메인 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 진단, 연구 및 치료 용도에서 사용하기 위한 단일 도메인 단백질에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 이같은 단백질을 포함하는 세포, 이같은 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

Description

ＥＧＦＲ에 결합하는 조작된 단백질을 기초로 하는 표적화된 치료제{TARGETED THERAPEUTICS BASED ON ENGINEERED PROTEINS THAT BIND EGFR}
관련 출원
본 출원은 2008년 2월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/065,955를 우선권으로 청구한다. 상기 언급된 출원의 모든 교시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하는 단일 도메인 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 진단, 연구 및 치료 용도에서 사용하기 위한 단일 도메인 단백질에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 이같은 단백질을 포함하는 세포, 이같은 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
서론
HER 패밀리의 수용체 타이로신 카이네이스는 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개물이다. 이러한 수용체 패밀리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1, 또는 HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)가 포함되는 4가지 별개의 구성원을 포함한다.
HER 패밀리는 인간 악성종양에 인과적으로 연루되었다. Her 패밀리의 수용체들의 비정상적인 활성이 유방암과 관련된다. EGFR, Her-3, 및 Her-4가 난소 과립층 세포 종양에서 빈번하게 발현된다 ([Leibl, S. et al., Gynecol Oncol 101:18-23 (2005)]). 특히, EGFR의 증가된 발현이 유방암, 방광암, 폐암, 두경부암 및 위암, 뿐만 아니라 교모세포종에서 관찰되었다.
증가된 EGFR 수용체 발현은 동일한 종양 세포에 의한 EGFR 리간드인 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α)의 증가된 생산과 회합되어, 자가분비 자극 경로에 의한 수용체 활성화를 초래할 수 있다. [Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)]. EGFR 또는 이의 리간드에 대해 지시된 모노클로날 항체가 이같은 악성종양의 치료에서 치료제로서 평가되었다. 예를 들어, [Baselga and Mendelsohn., 상기 문헌]; [Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984)]; 및 [Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)].
일반적으로 HER 수용체는 세포 내에서 다양한 조합으로 존재한다. 이들의 이종이량체화는 다양한 HER 리간드에 대한 세포 응답의 다양성을 증가시키는 것으로 생각된다 ([Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)]). EGFR은 6개 이상의 상이한 리간드에 결합된다; 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 앰피레귤린(amphiregulin), 헤파린 결합 표피 성장 인자 (HB-EGF), 베타셀룰린(betacellulin) 및 에피레귤린(epiregulin) ([Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)]).
EGF는 EGFR에 결합하고, 이는 HER2와 이종이량체를 형성하여, EGFR을 활성화시키고 HER의 인산전이(transphosphorylation)를 초래한다. 이량체화 및/또는 인산전이는 HER2 타이로신 카이네이스를 활성화시킨다.
치료제의 가능한 부작용은 치료 요법을 고안할 때 고려해야 할 중요한 쟁점이다. 예를 들어, 항-EGFR 항체인 세툭시맵 (Erbitux™)은 잠재적으로 생명을 위협하는 주입 반응과 관련되었다 ([Thomas, M., Clin J Oncol Nurs. 9(3):332-8 (2005)]). 양쪽 모두 EGFR 특이적 소형 분자 억제제인 제피티닙 (Iressa™) 및 에를로티닙 (Tarceva™)은 간질성 폐 질환의 위험과 관련된다 ([Sandler A,. Oncology 20(5 Suppl 2):35-40 (2006)]). 개별적인 환자들이 약물 치료의 선택에 영향을 미치는 특정 유형의 합병증에 걸리기 쉬울 수 있다. 더 큰 범위의 치료 선택권을 제공하는 것은 의사가 개별적인 환자에 대한 최상의 부작용 프로파일이 있는 치료제를 선택하도록 한다. 본 발명은 치료 방법에서 유용한 신규 폴리펩티드 및 단백질 치료제를 제공한다.
암 및 및 증식성 장애가 포함되는 장애에서 EGFR 신호전달이 발휘하는 역할의 관점에서, EGFR을 선택적으로 조정, 억제 또는 차단하는 치료제, 예컨대 EGFR 결합 폴리펩티드를 생성시키는 것이 바람직할 것이다.
또한, 이같은 치료제가 비용 면에서 효과적인 방식으로 발현되고, 원하는 생물리학적 성질 (예를 들어 Tm, 실질적으로 단량체성임, 또는 잘 폴딩(folding)됨)을 지니며, 조직을 투과하는 작은 크기를 지니고, 적절한 생체내 반감기를 지니는 것이 바람직할 것이다.
발명의 개요
본 출원의 한 양상은 (i) 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; (ii) 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 변경된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프를 가지며, (iii) 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하는 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드는 EGFR에 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-9 M보다 낮은 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인의 2개 이상의 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, 루프 BC 및 루프 FG가 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인의 3개 이상의 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인의 2개 이상의 루프가 EGFR에 결합한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인의 3개 이상의 루프가 EGFR에 결합한다. 일부 실시양태에서, 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프 내의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 야생형 서열과 상이한 아미노산으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 결실 또는 부가된다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 관련된 수용체, 예컨대 HER2 또는 HER3에 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 또는 10-2 M을 초과하는 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 열번째 제III형 피브로넥틴 도메인 (10Fn3)이다. 일부 실시양태에서, 10Fn3은 서열 207-231 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 10Fn3은 서열 215의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 10Fn3은 서열 207-231 중 어느 하나에 대해 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 98％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 폴리옥시알킬렌 모이어티(moiety), 인간 혈청 알부민 결합 단백질, 시알산, 인간 혈청 알부민, 트랜스페린, IgG, IgG 결합 단백질 및 Fc 단편으로부터 선택된 하나 이상의 약동학 (PK) 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리옥시알킬렌 모이어티이고, 상기 폴리옥시알킬렌 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 Cys 또는 Lys 아미노산을 통해 EGFR 결합 폴리펩티드에 공유결합으로 연결된다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 0.5 kDa 내지 약 100 kDa 사이이다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리펩티드의 하나 이상의 약동학 성질, 예를 들어, 생체이용률, 혈청 반감기, 생체내 안정성, 및 약물 분포를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 EGFR 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기를 EGFR 결합 폴리펩티드 단독에 비해 적어도 20％, 30％, 40％, 50％, 70％, 90％, 100％, 120％, 150％, 200％, 400％, 600％, 800％ 또는 그보다 크게 증가시킨다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티를 추가로 포함하는 EGFR 결합 폴리펩티드는 생체내 혈청 반감기가 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일이다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티와 Fn3 도메인은 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당, 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티와 Fn3 도메인은 서열 232-235의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 통해 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 항체 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 50 KDa 미만이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 40 KDa 미만이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 단일쇄 Fv (scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 디술피드-연결 Fv (sdFv), Fv, 디아바디(diabody), 또는 전체 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 인간 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 IGF-IR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, c-Kit, 인간 p185 수용체-유사 타이로신 카이네이스, HER2, HER3, c-Met, 폴레이트 수용체, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) A, VEGF C, VEGF D, 인간 CD20, 인간 CD18, 인간 CD11a, 인간 세포자멸사 수용체-2 (Apo-2), 인간 알파4베타7 인테그린, 인간 GPIIb-IIIa 인테그린, 줄기 세포 인자 (SCF), EGFR, 또는 인간 CD3에 결합한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 리포칼린의 유도체, 테트라넥틴의 유도체, 아비머(avimer), 또는 안키린의 유도체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드에 인간 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 IGF-IR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, c-Kit, 인간 p185 수용체-유사 타이로신 카이네이스, HER2, HER3, c-Met, 폴레이트 수용체, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) A, VEGF C, VEGF D, 인간 CD20, 인간 CD18, 인간 CD11a, 인간 세포자멸사 수용체-2 (Apo-2), 인간 알파4베타7 인테그린, 인간 GPIIb-IIIa 인테그린, 줄기 세포 인자 (SCF), EGFR, 또는 인간 CD3에 결합한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fn3 도메인이고, 제2 Fn3 도메인을 추가로 포함한다. 제2 Fn3 도메인은 (i) 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 및 루프 FG를 포함하고; (ii) 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 변경된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프를 가지며, (iii) 인간 Fn3 도메인에 의해 결합되지 않는 인간 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 Fn3 도메인은 IGF-IR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, c-Kit, 인간 p185 수용체-유사 타이로신 카이네이스, HER2, HER3, c-Met, 폴레이트 수용체, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) A, VEGF C, VEGF D, 인간 CD20, 인간 CD18, 인간 CD11a, 인간 세포자멸사 수용체-2 (Apo-2), 인간 알파4베타7 인테그린, 인간 GPIIb-IIIa 인테그린, 줄기 세포 인자 (SCF), EGFR, 또는 인간 CD3에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 Fn3 도메인은 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-9 M보다 낮은 KD로 인간 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 Fn3 도메인의 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프 내의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 야생형 서열과 상이한 아미노산으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 결실 또는 부가된다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 제2 10Fn3 도메인을 추가로 포함하는 EGFR에 결합하는 10Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 IGF-IR에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 VEGFR2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 EGFR에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 2-125, 184-204 또는 236 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 2-125, 184-204 또는 236 중 어느 하나에 대해 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 55％, 또는 98％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 126-183, 205 또는 206 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 126-183, 205 또는 206 중 어느 하나에 대해 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 55％, 또는 98％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 207-231 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 10Fn3 도메인은 서열 207-231 중 어느 하나에 대해 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 55％, 또는 98％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당, 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 통해 작동가능하게 연결된 제2 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 0.5 kDa 내지 약 100 kDa 사이이다. 일부 실시양태에서, PEG는 폴리펩티드 및 제2 도메인에 Cys 또는 Lys 잔기를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 적어도 EGFR 결합 폴리펩티드 또는 제2 도메인은 1개를 초과하는 Cys 또는 Lys를 지니지 않는다. 일부 실시양태에서, 단일 Cys 또는 Lys은 아미노산 서열 내의 비-야생형 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 서열 235를 포함한다.
한 양상에서, 본 출원은 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-알파) 또는 표피 성장 인자 (EGF)가 EGFR에 결합하는 것을 억제하고, 세포-기반 분석법에서 IC50 미만의 농도에서 인간 EGFR을 활성화시키지 않는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다.
한 양상에서, 본 출원은 EGFR에의 결합에 대해 항-EGFR 항체와 경쟁하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 파니투무맵, 니모투주맵, 잘루투무맵, EMD72000, 및 세툭시맵으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 출원은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 또는 10-9 M 미만의 IC50으로 EGFR의 전체적인 EGF-자극 포스포타이로신 활성화를 억제하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다.
한 양상에서, 본 출원은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 또는 10-9 M 미만의 IC50으로 ERK 인산화를 억제하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다.
한 양상에서, 본 출원은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 또는 10-9 M 미만의 IC50으로 AKT 인산화를 억제하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다.
한 양상에서, 본 출원은 EGFR 활성화에 의존적인 세포주에서 세포 기반 분석법에서 세포자멸사를 유도하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합제는 EGFR 활성 예컨대 세포자멸사, 인산화 또는 이량체화의 제어를 차단한다.
한 양상에서, 본 출원은 하나 이상의 T-세포 에피토프가 제거되도록 탈면역화된 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 한 양상에서, 본 출원은 하나 이상의 B-세포 에피토프가 제거되도록 탈면역화된 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다.
한 양상에서, 본 출원은 a) 인간 Fn3 도메인 코딩 서열과 상이한 후보 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인 서열을 각각 포함하는 후보 핵산 분자들의 집단을 생산하고, 이때 상기 핵산 분자들이 각각 상기 후보 Fn3 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 번역 개시 서열 및 시작 코돈을 포함하고, 각각 3' 말단에서 핵산-푸로마이신 링커(linker)에 작동가능하게 연결된 단계; b) 상기 후보 Fn3 도메인 코딩 서열들을 시험관 내에서 번역시켜 후보 핵산-Fn3 융합물들의 집단을 생산하는 단계; c) 후보 핵산-Fn3 융합물들의 상기 집단을 EGFR과 접촉시키는 단계; 및 d) 단백질 부분이 EGFR에 대한 상기 인간 Fn3의 결합 친화력 또는 특이성에 비해 변경된 EGFR에 대한 결합 친화력 또는 특이성을 갖는 핵산-Fn3 융합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 선별된 EGFR 결합 Fn3 도메인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 선택된 핵산-Fn3 융합물이 하나 이상의 핵산 잔기를 변경시키고 융합물을 EGFR로 다시 스크리닝하여 개선된 결합제를 선택하는 것에 의해 추가로 최적화된다. 일부 실시양태에서, 후보 핵산 분자는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 후보 핵산 분자는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산-푸로마이신은 DNA-푸로마이신이다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 10Fn3이다.
한 양상에서, 본 출원은 EGFR 결합 폴리펩티드를 포함하는 제약상 허용가능한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본질적으로 내독소가 없다. 일부 실시양태에서, 조성물은 미생물 오염이 실질적으로 없어서, 이를 생체내 투여에 적절하게 한다. 예를 들어, IV, IP 또는 피하 투여용으로 조성물이 제형될 수 있다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다.
본 출원의 한 양상은 EGFR 결합 폴리펩티드를 단독으로 또는 또다른 세포독성제 또는 치료제와 함께 투여함으로써 암에 걸린 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 암은, 예를 들어, 유방암, 결장암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 윤활액 암종, 교모세포종, 췌장암, 또는 비-종양발생 세포와 비교하여 생리학 면에서 EGFR 수준이 상승, 상향조절, 돌연변이 또는 변경된 아직 결정되지 않은 기타 암 중 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 한 양상은 EGFR 결합 폴리펩티드를 단독으로 또는 또다른 세포독성제 또는 치료제와 함께 투여함으로써 암에 걸린 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 바람직한 세포독성제 및 치료제에는 도세탁셀, 파클리탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 트라스투주맵, 카페시타빈, 타목시펜, 토레미펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 풀베스트란트, 엑세메스탄, 고세렐린, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 덱사메타손, 안타이드, 베바시주맵, 5-플루오로우라실, 류코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에토포시드, 토포테칸, 젬시타빈, 비노렐빈, 에스트라무스틴, 미톡산트론, 아바렐릭스, 졸레드로네이트, 스트렙토조신, 리툭시맵, 이다루비신, 부술판, 클로람부실, 플루다라빈, 이마티닙, 사이타라빈, 이브리투모맵, 토시투모맵, 인터페론 알파-2b, 멜팔람, 보르테조밉, 알트레타민, 아스파라기네이스, 제피티닙, 에를로티닙, 항-EGF 수용체 항체 (예를 들어, 세툭시맵 또는 파니투무맵), 익사베필론, 및 에포틸론 또는 이의 유도체가 포함된다. 더욱 바람직하게는, 치료제는 백금 작용제 (예컨대 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 시스플라틴), 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀), 젬시타빈, 또는 캄토테신이다.
본 출원의 또다른 양상은 본원에 기술된 요소들 중 하나 이상, 및 이러한 요소들의 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 EGFR 결합 폴리펩티드를 단독으로 또는 제2 치료제와 함께 포함한다. EGFR 결합 폴리펩티드를 단독으로 또는 제2 치료제와 함께 사용하여 암 세포의 성장을 억제하는 것에 대한 설명서, 및/또는 이를 사용하여 암에 걸린 환자를 치료하는 방법에 대한 설명서.
본 출원의 추가적인 양상은 EGFR 결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 이같은 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또한 포함된다. 바람직하게는, 사용된 세포 유형에서의 발현을 최대화하도록 서열들이 최적화된다. 바람직하게는, 대장균에서 발현된다. 예를 들어, 효모 (예를 들어, 피키아(pichia) 또는 세레비지아에(cerevisiae)) 또는 남조류가 포함되는 진핵 미생물에서 EGFR 결합 폴리펩티드가 또한 발현될 수 있다. 원하는 글리코실화를 일으키도록 효모 세포가 조작될 수 있다. 본 발명의 세포는 포유류 세포일 수 있다. 한 양상에서, 원하는 글리코실화를 일으키도록 포유류 세포가 조작될 수 있다. 한 양상에서, 세포는 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질을 발현한다. 한 양상에서, 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택된 세포 유형에서의 발현에 대해 코돈이 최적화된다.
도 1. EGFR-결합 클론의 단리를 위한 선별 프로파일
각각의 선별 라운드 후에 EGFR-Fc에 결합된 실시예 1로부터의 라이브러리의 백분율이 제시된다. 각각의 RNA-단백질 융합물 라이브러리가 5회 사이클의 선별 후 표적에 결합하였다.
도 2. 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법
LA-1 (항-EGFR 모노클로날 항체), 및 PBS 완충제 또는 트리스(Tris) 완충제에 희석된 679F09 (EGFR 결합 클론) 미드스케일(Midscale) 단백질 제제를 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법에서 분석하였다 (상세사항에 대해 <물질 및 방법> 섹션 참조). LA-1 (원), 679F09 미드스케일 PBS (사각형) 및 679F09 미드스케일 트리스 (삼각형) 모두 A431 세포 상의 EGFR에의 결합에 대해 Eu-EGF와 경쟁하였다. IC50은 하기와 같았다: LA-1 (2.254 nM), 679F09 미드스케일 PBS (13.018 nM) 및 679F09 미드스케일 트리스 (20.002 nM).
도 3. 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법
LA-1 (항-EGFR 모노클로날 항체), 679F09 (EGFR 결합 클론, 미드스케일 제제) 및 867A01 (EGFR 결합 클론, HTPP 제제)을 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법에서 분석하였다. LA-1 (원), 679F09 (사각형) 및 867A01 (삼각형) 모두 A431 세포 상의 EGFR에의 결합에 대해 Eu-EGF와 경쟁하였다. IC50은 하기와 같았다: LA-1 (6.641 nM), 679F09 (14.726 nM) 및 867A01 (258.258 nM).
도 4. 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법
LA-1 (항-EGFR 모노클로날 항체) 및 679F03 (EGFR 결합 클론, 미드스케일 제제)을 세포-기반 경쟁 리간드 결합 분석법에서 분석하였다. LA-1 (사각형) 및 679F03 (삼각형)이 A431 세포 상의 EGFR에의 결합에 대해 Eu-EGF와 경쟁하였다. IC50은 하기와 같았다: LA-1 (6.944 nM) 및 679F03 (26.847 nM).
도 5. EGFR-특이적 클론의 최적화
실시예 4에 기술된 바와 같은 EGFR 결합 클론의 추가적인 최적화를 위한 공정의 개략도.
도 6은 본 출원 전반에 걸쳐 기술된 서열들을 나타낸다.
정의
"폴리펩티드"는 길이, 번역후 변형 또는 기능과 관계없이 아미노산 2개 이상의 임의의 서열을 의미한다. "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산 예컨대 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 6,559,126에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 또한 임의의 다양한 표준 화학 방식으로 폴리펩티드가 변형될 수 있다 (예를 들어, 아미노산이 보호기로 변형될 수 있거나; 카르복시-말단 아미노산이 말단 아미드 기로 만들어질 수 있거나; 아미노-말단 잔기가 예를 들어 친지성을 강화하기 위한 기로 변형될 수 있거나; 또는 안정성 또는 생체내 반감기를 증가시키도록 폴리펩티드가 화학적으로 글리코실화되거나 다른 방식으로 변형될 수 있다). 폴리펩티드 변형은 폴리펩티드에 대한 또다른 구조 예컨대 고리형 화합물 또는 또다른 분자의 부착을 포함할 수 있고, 입체 형상 (즉, R 또는 S; 또는 L 또는 D)이 변경된 하나 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다.
용어 "단일 도메인 폴리펩티드"는, 예를 들어, 일반적으로 항원 결합 활성에 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 양쪽 모두가 기여하는 항체 및 단일쇄 항체와 다르게, 대상 폴리펩티드의 표적 결합 활성 (예를 들어, EGFR 결합 활성)이 단일 구조 도메인 내에 위치한다는 것을 지시하도록 사용된다. 단일 도메인 폴리펩티드는 임의 개수의 다른 폴리펩티드, 예컨대 형광 폴리펩티드, 표적화 폴리펩티드 및 별개의 치료 효과를 지니는 폴리펩티드에 (예를 들어, 융합 단백질로서) 부착될 수 있다.
용어 "PK"는 "약동학"에 대한 두문자어이고, 대상에 의한 흡수, 분포, 대사 및 제거가 예를 들어 포함되는, 화합물의 성질을 포함한다. "PK 조정 단백질" 또는 "PK 모이어티"는 생물학적으로 활성인 분자에 융합되거나 이와 함께 투여되는 경우 이러한 생물학적으로 활성인 분자의 약동학 성질에 영향을 미치는 임의의 단백질, 펩티드 또는 모이어티를 지칭한다. PK 조정 단백질 또는 PK 모이어티의 예로는 PEG, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 공개 번호 20050287153 및 20070003549에 개시됨), 인간 혈청 알부민, Fc 또는 Fc 단편, 및 당 (예를 들어, 시알산)이 포함된다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"에는 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이같은 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하고, 이같은 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 분석법을 사용하여 이를 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역에는 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환이 있고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환이 있다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과의 서열 동일성이 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상일 것이다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
본원에서의 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 하기에 기술된 바와 같이 ％ 아미노산 서열 동일성 값이 수득된다. 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작된 ALIGN-2 서열 비교 프로그램은 사용자 문서와 함께 미국 저작국(U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있고, 제넨테크 인코포레이티드 (South San Francisco, Calif.)를 통해 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링(compiling)되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
본원에서의 목적을 위해, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 ％ 아미노산 서열 동일성 (소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 100 × 분수 X/Y [식중, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A와 B의 정렬에서 이러한 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 전체 개수이다]. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
"단리된" 폴리펩티드는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％ 초과의 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드에는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드가 포함되는데, 이는 폴리펩티드의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
표적은 또한 상기 표적의 단편일 수 있다. 따라서, 또한 표적은 면역 응답을 일으킬 수 있는, 상기 표적의 단편이다. 또한 표적은 전장 표적에 대해 생성된 단일 도메인 항체에 결합할 수 있는, 상기 표적의 단편이다.
본원에서 사용된 단편은 서열의 100％ 미만 (예를 들어, 99％, 90％, 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 10％ 등)이지만 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 이를 초과하는 개수의 아미노산을 포함하는 것을 지칭한다. 단편은 관심 대상인 상호작용이 1×10-6 M 또는 이보다 양호한 친화력으로 유지되도록 하기에 충분한 길이이다.
본원에서 사용된 단편은 야생형 표적에 대해 생성된 단일 도메인 항체에 결합하는 표적의 능력을 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 임의적인 삽입, 결실 및 치환을 또한 지칭한다. 아미노산 삽입, 결실 또는 치환의 개수는 바람직하게는 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개 또는 70개의 아미노산이다.
"세포 사망을 유도하는" 본 발명의 단백질은 생육성 세포를 비-생육성이게 하는 것이다. 일반적으로 세포는 이러한 단백질이 결합하는 항원을 발현하는 것이고, 특히 세포가 항원을 과발현하는 경우이다. 바람직하게는, 세포는 암 세포, 예를 들어, 유방, 난소, 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서, 세포는, 예를 들어, SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사망과 구별하기 위해 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 시험관 내에서의 세포 사망을 결정할 수 있다. 따라서, 열 불활성화 혈청을 사용하여 (즉, 보체의 부재 하에), 면역 이펙터 세포의 부재 하에 세포 사망 분석법을 수행할 수 있다. 본 발명의 단백질이 세포 사망을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 요오드화 프로피듐 (PI), 트립판 블루 ([Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가되는 바와 같은 막 완전성의 손실을 미처리 세포와 비교하여 평가할 수 있다.
"세포자멸사를 유도하는" 본 발명의 단백질은 세포자멸사 관련 분자의 결합 또는 이벤트, 예컨대 아넥신(annexin) V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (세포자멸사체(apoptotic body)로 칭해짐)의 형성에 의해 결정되는 바와 같이 계획된(programmed) 세포 사망을 유도하는 것이다. 세포는 단백질이 결합하는 항원을 발현하는 것이고, 이러한 항원을 과발현하는 것일 수 있다. 세포는 종양 세포, 예를 들어, 유방, 난소, 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포일 수 있다. 시험관 내에서, 세포는, 예를 들어, SKBR3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 다양한 방법이 세포자멸사와 관련된 세포성 이벤트의 평가에 이용가능하다. 예를 들어, 아넥신 결합에 의해 포스파티딜 세린 (PS) 전위를 측정할 수 있고; 본원의 실시예에 개시된 바와 같은 DNA 래더링(laddering)을 통해 DNA 단편화를 평가할 수 있으며; 저이배체(hypodiploid) 세포에서의 임의의 증가에 의해 DNA 단편화와 함께 핵/크로마틴 응축을 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸사를 유도하는 단백질은 본 발명의 단백질이 결합하는 항원을 발현하는 세포를 사용하는 아넥신 결합 분석법에서 미처리 세포와 비교하여 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 유도하는 것이다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료적 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; 주변 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고/있거나; 장애와 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지할 수 있고/있거나 이를 사망시킬 수 있다는 점에서, 이는 세포정지성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법에 대해, 생체내 효율을, 예를 들어, 질환 진행까지의 시간 (TTP)의 평가 및/또는 응답률 (RR)의 결정에 의해 측정할 수 있다.
아미노산 서열 또는 화합물의 반감기는, 예를 들어 천연 메커니즘에 의한 서열 또는 화합물의 소거 또는 격리 및/또는 서열 또는 화합물의 분해로 인해, 폴리펩티드의 혈청 농도가 50％ 만큼 감소되는데 걸리는 시간으로 일반적으로 정의될 수 있다. 반감기는 그자체로 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약동학 분석에 의해 결정될 수 있다. 적절한 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어, 치료될 영장류에게 적절한 용량의 아미노산 서열 또는 화합물을 적절하게 투여하는 단계; 혈액 샘플 또는 기타 샘플을 상기 영장류로부터 일정한 간격으로 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플 내의 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 결정하는 단계; 및 이렇게 수득된 데이터(의 플롯)로부터 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투약 시의 초기 수준과 비교하여 50％만큼 감소되었을 때까지의 시간을 계산하는 단계를 일반적으로 수반할 수 있다. 표준 편람 예컨대 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]를 예를 들어 참조한다. ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker (제2 개정판) (1982)]를 또한 참조한다.
t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 파라메터를 사용하여 반감기가 또한 표현될 수 있다. 본 명세서에서, "반감기 증가"는 이러한 파라메터들 중 임의의 하나, 예컨대 이러한 파라메터들 중 임의의 2개, 또는 본질적으로 이러한 파라메터 3개 모두에서의 증가를 지칭한다. "반감기 증가"는 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 양쪽 모두에서의 증가와 함께 또는 이러한 증가 없이 t1/2-베타가 증가되는 것을 특히 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "EGFR"은 용어 HER-1과 등가이다. 용어 "EGFR 리간드 또는 EGFR 리간드"는 EGFR 리간드들, 예컨대 EGFR에 결합하는 천연 발생 단백질들 중 하나 이상을 지칭한다.
용어 "HER"은 EGFR, Her-2, Her-3, 및 Her-4가 포함되는 Her 수용체 패밀리의 구성원을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 Her 패밀리 구성원은 EGFR이다.
EGFR 결합 폴리펩티드
한 양상에서, 본 출원은 EGFR에 결합하는 단일 도메인 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양상에서, 단일 도메인 폴리펩티드는, 면역글로불린 및 면역글로불린-유사 도메인에 의해 예시되는 바와 같이, 2개 이상의 베타 시트 사이에 분포된 적어도 5개 내지 7개의 베타 또는 베타-유사 가닥을 포함할 수 있다. 베타-유사 가닥은 단일 도메인 폴리펩티드의 안정화에 참여하지만 반드시 베타 가닥 입체형상을 취하지는 않는 일련의 아미노산들이다. 단일 도메인 폴리펩티드는 2개 이상의 베타 시트 사이에 분포된 7개 이상의 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥, 및 2개의 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥을 연결하고 EGFR에의 결합에 참여하는 1개 이상의 루프 부분을 포함하는 구조적 구성의 약 80개 내지 약 150개 사이의 아미노산을 포함할 수 있다. 바꾸어 말하면, 루프 부분이 2개의 베타 가닥, 2개의 베타-유사 가닥, 또는 1개의 베타 가닥과 1개의 베타-유사 가닥을 연결할 수 있다. 전형적으로, 루프 부분들 중 하나 이상이 EGFR 결합에 참여할 것이지만, 베타 또는 베타-유사 가닥 부분들 중 하나 이상, 특히 루프 부분에 가장 가깝게 위치하는 베타 또는 베타-유사 가닥 부분들이 EGFR 결합에 또한 참여하는 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다.
한 양상에서, 단일 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 (Ig) 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 인간 VL 도메인, 인간 VH 도메인 및 카멜리드(camelid) VHH 도메인으로 구성된 군으로부터 Ig 가변 도메인이 선택될 수 있다. Ig 가변 도메인의 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 루프가 EGFR에의 결합에 참여할 수 있고, 전형적으로는 CDR1, CDR2 또는 CDR3으로 공지된 루프들 중 임의의 것이 EGFR 결합에 참여할 것이다.
한 양상에서, 단일 도메인 폴리펩티드는 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질, 즉, 제III형 피브로넥틴 도메인 (Fn3)을 기초로 하는 폴리펩티드이다. 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질의 예는 애드넥틴(Adnectins)™ (Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company)이다. 피브로넥틴은 세포외 매트릭스의 형성 및 세포-세포 상호작용에서 필수적인 역할을 하는 대형 단백질이다; 이는 3가지 유형 (제I형, 제II형, 및 제III형)의 소형 도메인들의 다수의 반복물로 구성된다 ([Baron et al., 1991]). Fn3 자체는 세포 부착 분자, 세포 표면 호르몬 및 사이토카인 수용체, 샤페론 역할(chaperoning), 및 탄수화물-결합 도메인의 일부분들을 포함하는 대형 서브패밀리의 패러다임이다. 리뷰를 위해, [Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Oct 1;89(19):8990-4]; [Bork et al., J Mol Biol. 1994 Sep 30;242(4):309-20]; [Campbell & Spitzfaden, Structure. 1994 May 15;2(5):333-7]; [Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 May 13;238(4):528-39]를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 EGFR에 결합하는 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인을 제공한다. 이같은 도메인은, N-말단 → C-말단의 순서로, 베타 또는 베타-유사 가닥 A; 루프 AB; 베타 또는 베타-유사 가닥 B; 루프 BC; 베타 또는 베타-유사 가닥 C; 루프 CD; 베타 또는 베타-유사 가닥 D; 루프 DE; 베타 또는 베타-유사 가닥 E; 루프 EF; 베타 또는 베타-유사 가닥 F; 루프 FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥 G를 포함할 수 있다. 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 중 임의의 루프 또는 모든 루프가 EGFR 결합에 참여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프 BC 및 FG가 EGFR 결합에 참여한다. 일부 실시양태에서, 루프 BC, DE 및 FG가 EGFR 결합에 참여한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 변경된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프가 있는 Fn3 도메인을 제공한다. "변경된"은 주형 서열 (상응하는 인간 피브로넥틴 도메인)과 비교하여 1개 이상의 아미노산 서열 변경을 의미하고, 아미노산 부가, 결실 및 치환을 포함한다. 아미노산 서열 변경은 의도적, 맹목적 또는 자발적 서열 변동, 일반적으로는 핵산 코딩 서열의 이러한 변동을 통해 달성될 수 있고, 임의의 기술, 예를 들어, PCR, 오류-경향(error-prone) PCR, 또는 화학적 DNA 합성에 의해 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 Fn3 도메인은 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 Fn3은 EGFR 신호전달을 억제한다.
일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 피브로넥틴, 특히 서열 1에 제시된 바와 같은 피브로넥틴의 열번째 Fn3 도메인 (10Fn3)으로부터 유래된 Fn3 도메인이다. 다양한 돌연변이체 10Fn3 스캐폴드들이 보고되었다. 한 양상에서, Asp 7, Glu 9, 및 Asp 23 중 하나 이상이 또다른 아미노산, 예를 들어, 음성 전하를 띠지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, Asn, Lys 등)로 교체된다. 이러한 돌연변이는 야생형 형태와 비교하여 중성 pH에서 돌연변이체 10Fn3의 더 큰 안정성을 촉진하는 효과가 있는 것으로 보고되었다 (PCT 공개 번호 WO02/04523 참조). 이롭거나 중립적인, 10Fn3 스캐폴드에서의 다양한 추가적인 변경이 개시되었다. 예를 들어, [Batori et al., Protein Eng. 2002 Dec;15(12):1015-20]; [Koide et al., Biochemistry 2001 Aug 28;40(34):10326-33] 참조.
변이체 및 야생형 10Fn3 단백질 양쪽 모두 동일한 구조, 즉 A 내지 G로 지정된 7개의 베타-가닥 도메인 서열 및 이러한 7개의 베타-가닥 도메인 서열을 연결하는 6개의 루프 영역 (AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프, 및 FG 루프)을 특징으로 한다. N- 및 C-말단에 가장 가깝게 위치하는 베타 가닥은 용액 내에서 베타-유사 입체형상을 취할 수 있다. 서열 1에서, AB 루프는 잔기 15-16에 상응하고, BC 루프는 잔기 22-30에 상응하고, CD 루프는 잔기 39-45에 상응하고, DE 루프는 잔기 51-55에 상응하고, EF 루프는 잔기 60-66에 상응하고, FG 루프는 잔기 76-87에 상응한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 10Fn3 폴리펩티드는 서열 1에 제시된 인간 10Fn3 도메인에 대해 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 또는 90％ 동일할 수 있다. 대부분의 가변성은 일반적으로 루프들 중 하나 이상에서 발생할 것이다. 10Fn3 폴리펩티드의 각각의 베타 또는 베타-유사 가닥은 서열 1의 상응하는 베타 또는 베타-유사 가닥의 서열에 대해 적어도 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％ 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성될 수 있고, 단 이러한 변동은 생리학적 조건에서 폴리펩티드의 안정성을 파괴하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 변경된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프가 있는 열번째 제III형 피브로넥틴 (10Fn3) 도메인을 포함하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. "변경된"은 주형 서열 (상응하는 인간 피브로넥틴 도메인)과 비교하여 1개 이상의 아미노산 서열 변경을 의미하고, 아미노산 부가, 결실 및 치환을 포함한다. 아미노산 서열 변경은 의도적, 맹목적 또는 자발적 서열 변동, 일반적으로는 핵산 코딩 서열의 이러한 변동을 통해 달성될 수 있고, 임의의 기술, 예를 들어, PCR, 오류-경향 PCR, 또는 화학적 DNA 합성에 의해 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프가 상응하는 인간 피브로넥틴 루프에 비해 길이 면에서 연장되거나 짧아질 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이가 2-25개의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이가 1-11개의 아미노산만큼 감소할 수 있다. 특히, 10Fn3의 FG 루프는 12개 잔기 길이인 반면, 항체 중쇄에서의 상응하는 루프는 4-28개의 잔기 범위이다. 따라서, 항원 결합을 최적화하기 위해, 항원 결합에서의 최고의 가능한 가요성 및 친화력을 수득하도록 잔기 4-28개 범위의 CDR3을 포함하기 위해 10Fn3의 FG 루프의 구간이 길이 면에서, 뿐만 아니라 서열 면에서 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린-결합 모티프인 "아르기닌-글리신-아스파르트산" (RGD)이 극성 아미노산-중성 아미노산-산성 아미노산 서열 (N-말단 → C-말단 방향)로 교체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 207-231 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 추가적인 서열이 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 MG 서열이 N-말단에 놓일 수 있다. 일반적으로 M이 절단되어, GVS... 서열이 N-말단에 남을 것이다. 일부 실시양태에서, 링커 서열, 예를 들어, 서열 233 및 235이 10Fn3 도메인의 C-말단에 놓일 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 EGFR 결합을 매개하는 짧은 펩티드 서열을 제공한다. 이같은 서열은 단리된 형태로 또는 특정 단백질 구조물, 예컨대 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 도메인 내로 삽입되는 경우에 EGFR 결합을 매개할 수 있다. 이같은 서열의 예로는 서열 207-231로부터의 BC, DE 및 FG 루프에 상응하는 아미노산 잔기가 포함된다. 일부 실시양태에서, 이러한 펩티드는 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-9 M 이하보다 낮은 KD로 EGFR에 결합한다.
EGFR에 결합하는 폴리펩티드를 평형 상수 (예를 들어, 해리 상수 KD)의 관점 및 동역학 상수 (예를 들어, 온(on) 속도 상수 kon 및 오프(off) 속도 상수 koff)의 관점에서 평가할 수 있다. 전형적으로 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-9 M 이하보다 낮은 KD로 EGFR에 결합하도록 단일 도메인 폴리펩티드가 선택될 것이지만, koff가 충분히 낮거나 kon이 충분히 높은 경우 더 높은 KD 값이 허용될 수 있다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 관련된 수용체, 예컨대 HER2 또는 HER3에 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M 또는 그보다 많이 초과하는 KD로 결합한다.
한 양상에서, 본 출원은 약동학 (PK) 모이어티를 추가로 포함하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 개선된 약동학을 인지되는 치료 요구에 따라 평가할 수 있다. 가능하게는 투약 후 단백질이 혈청 내에서 이용가능하게 유지되는 시간을 증가시킴으로써, 용량들 사이의 시간을 증가시키고/시키거나 생체이용률을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 일부 예에서, 시간에 따른 단백질의 혈청 농도의 연속성을 개선하는 것 (예를 들어, 투여 직후와 다음 투여 직전의 단백질의 혈청 농도에서의 차이를 감소시키는 것)이 바람직하다. 변형되지 않은 폴리펩티드에 비해 3배를 초과하는 만큼 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 인간)에서 폴리펩티드의 소거율을 감소시키는 모이어티에 EGFR 결합 폴리펩티드가 부착될 수 있다. 개선된 약동학의 또다른 척도는 알파 단계 및 베타 단계로 종종 나뉘는 혈청 반감기를 포함할 수 있다. 적합한 모이어티의 부가에 의해 어느 한쪽 단계 또는 양쪽 단계가 유의하게 개선될 수 있다.
본원에서 "PK 모이어티"로 칭해지는, 혈액으로부터 단백질의 소거를 느리게 하는 경향이 있는 모이어티에는 폴리옥시알킬렌 모이어티, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 당 (예를 들어, 시알산), 및 잘 허용되는 단백질 모이어티 (예를 들어, Fc, Fc 단편, 트랜스페린, 또는 혈청 알부민)가 포함된다. 미국 공개 번호 20070048282에 기술된 바와 같이 알부민 또는 알부민의 단편 (일부분) 또는 변이체에 EGFR 결합 폴리펩티드가 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 알부민 결합 단백질 예컨대 미국 공개 번호 2007/0178082 및 2007/0269422에 기술된 것들이다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 면역글로불린 결합 단백질 예컨대 미국 공개 번호 2007/0178082에 기술된 것들이다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 단백질 상의 여러 위치에서 하나 이상의 PEG 분자가 부착될 수 있고, 이같은 부착은 아민, 티올 또는 기타 적절한 반응기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 아민 모이어티는, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에서 발견되는 1차 아민 또는 아미노산, 예컨대 라이신 또는 아르기닌 내에 존재하는 아민 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 a) N-말단; b) N-말단과 가장 N-말단 쪽인 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥 사이; c) EGFR-결합 부위 반대편의 폴리펩티드 면에 위치하는 루프; d) C-말단과 가장 C-말단 쪽인 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥 사이; 및 e) C-말단으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 상의 위치에 부착된다.
부위-지정 PEG화에 의해 PEG화가 달성될 수 있고, 이때 PEG화가 우선적으로 발생하는 부위가 생성되도록 적절한 반응기가 단백질 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 원하는 위치에 시스테인 잔기가 도입되도록 단백질이 변형되어, 이러한 시스테인 상에서의 부위 지정 PEG화를 허용한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 부위 지정 PEG화를 허용하는 Cys 함유 링커 예컨대 서열 235를 포함한다. PEG는 분자량이 광범위하게 변할 수 있고, 분지형 또는 선형일 수 있다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fn3 도메인 및 PK 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 10Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 EGFR 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기를 Fn3 도메인 단독에 비해 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000％ 또는 그보다 많이 초과하는 만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당, 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 Fn3 도메인에 작동가능하게 연결된다. 예시적인 폴리펩티드 링커에는 PSTSTST (서열 232), EIDKPSQ (서열 233), 및 GS 링커, 예컨대 GSGSGSGSGS (서열 234) 및 이들의 다량체가 포함된다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 인간 혈청 알부민이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 트랜스페린이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 제1 포유동물로부터의 EGFR 및 제2 포유동물로부터의 이의 상동체에 결합하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 이같은 폴리펩티드는 제1 포유동물이 인간이고 제2 포유동물이 전-임상 테스트를 수행하기 위한 바람직한 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 기니피그, 개 또는 비-인간 영장류인 경우에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 미리 선택된 인간 표적 단백질 및 이의 상동체 양쪽 모두에 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-9 M 이하보다 낮은 KD로 결합할 것이다.
EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR의 임의의 부분에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 EGFR의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 EGFR의 리간드 결합 도메인에 결합하고, EGFR과 하나 이상의 리간드 (TGF-알파 및 EGF 포함)의 상호작용을 파괴한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR에의 결합에 대해 항-EGFR 항체와 경쟁한다. 항-EGFR 항체는 판니투무맵 (Amgen), 니모투주맵 (YM Biosciences), 잘루투무맵 (Genmab), EMD72000 (Merck KGaA), 및 세툭시맵 (ImClone Systems)이 포함되는 임의의 공지된 항-EGFR 항체로부터 선택될 수 있다,
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 EGFR에 결합하고 수용체 이량체화를 파괴한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다.
일부 실시양태에서, EGFR에 결합하는 폴리펩티드는 세포-기반 분석법에서 IC50 미만의 농도에서 EGFR을 활성화시키지 않는다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR의 하류 신호전달을 억제한다. EGFR 리간드 결합은 EGFR 또는 또다른 HER 패밀리 구성원과의 동종이량체성 또는 이종이량체성 수용체 이량체화에 이른다. 이량체화는 수용체 자가인산화를 촉진하고, 차례로 이는 여러 신호전달 경로의 활성화에 이른다. 활성화되는 한 경로는 MEK의 인산화를 포함하는 MAPK 경로이다. 또다른 활성화되는 경로는 AKT의 인산화를 포함하는 포스파티딜이노시톨 3-카이네이스 (PI3K) 경로이다. 신호전달이 핵으로 도입되어, 다양한 전사 인자의 활성화를 초래한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 리간드 매개-EGFR 인산화, ERK 인산화, AKT 인산화, 또는 임의의 또다른 EGFR 신호전달 경로 구성원을 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 또는 10-9 M 미만의 IC50으로 억제한다.
다중 도메인 실시양태
본 출원의 한 양상은 제2 도메인을 추가로 포함하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 제2 도메인은 EGFR 또는 상이한 단백질, 바람직하게는 인간 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 도메인은 FGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, c-Kit, 인간 p185 수용체-유사 타이로신 카이네이스, EGFR, HER2, HER3, HER4, c-Met, 폴레이트 수용체, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-C, VEGF-D, 인간 CD20, 인간 CD18, 인간 CD11a, 인간 세포자멸사 수용체-2 (Apo-2), 인간 알파4베타7 인테그린, 인간 GPIIb-IIIa 인테그린, 줄기 세포 인자 (SCF), 인간 CD3, IGF-IR, Ang1, Ang2, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 또는 Tie2.3으로부터 선택된 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 도메인은 인간 표적 단백질에 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-9 M보다 낮은 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 도메인은 표적 단백질에 관련된 단백질에 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M 또는 그보다 많이 초과하는 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 도메인은 결합 표적을 억제한다.
본 출원의 한 양상은 종양 관련 표적 또는 항원에 결합하는 제2 도메인을 추가로 포함하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 표적화는 조직 분포, 또는 조직 또는 원하는 세포 유형에서의 증가된 국소 농도 효과의 관점에서 EGFR 결합 폴리펩티드를 국소화하는 것을 도울 것이다. 별법적으로, 제2 도메인은 EGFR 결합 폴리펩티드와 함께 암에 대항하는 추가적인 작용 메커니즘을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 종양 관련 표적 또는 항원, 예를 들어, 탄산 탈수효소 IX, A3, A33 항체에 대해 특이적인 항원, BrE3-항원, CD1, CD1a, CD3, CD5, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD45, CD74, CD79a, CD80, HLA-DR, NCA95, NCA90, HCG 및 이의 서브유닛, CEA (CEACAM-5), CEACAM-6, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, Ba 733, HER2/neu, 저산소증 유도 인자 (HIF), KC4-항원, KS-1-항원, KS1-4, Le-Y, 대식세포 억제 인자 (MIF), MAGE, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PAM-4-항원, PSA, PSMA, RS5, S100, TAG-72, p53, 테나신, IL-6, IL-8, 인슐린 성장 인자-I (IGF-I), 인슐린 성장 인자-II (IGF-II), Tn 항원, 톰슨-프리덴리히(Thomson-Friedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, 태반 성장 인자 (PlGF), 17-1A-항원, 혈관생성 마커 (예를 들어, ED-B 피브로넥틴), 종양유전자 마커, 종양유전자 생성물, 및 기타 종양-관련 항원에 결합한다. 종양 관련 항원에 대한 최근의 보고에는 각각 거명에 의해 본원에 포함되는 [Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11:992-97)]; [Hatfield et al., (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48)]; [Vallbohmer et al. (2005, J. Clin. Oncol. 23:3536-44)]; 및 [Ren et al. (2005, Ann. Surg. 242:55-63)]이 포함된다.
임의 유형의 종양 및 임의 유형의 종양 항원이 치료제의 상응하는 생물학으로 표적화될 수 있다. 암은, 예를 들어, 유방암, 결장암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 윤활액 암종, 췌장암, 흑색종, 다발 골수종, 신경모세포종, 및 횡문근육종, 또는 비-종양발생 세포와 비교하여 생리학 면에서 EGFR 수준이 상승, 상향조절, 돌연변이 또는 변경된 아직 결정되지 않은 기타 암 중 하나일 수 있다.
표적화될 수 있는 또다른 예시적인 유형의 종양에는 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담낭암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 폐암, 수질성 갑상선암, 비-호지킨 림프종, 다발 골수종, 신암, 난소암, 췌장암, 신경아교종, 흑색종, 간암, 전립선암, 및 방광암이 포함된다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 항체 모이어티로부터 선택된다. 항체 모이어티는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 일부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, 용어 항체 모이어티는 전체 항체 분자만이 아니라, 항체 다량체 및 항체 단편, 뿐만 아니라 항체, 항체 다량체 및 항체 단편의 변이체 (유도체 포함)를 또한 포함한다. 항체 모이어티의 예로는 단일쇄 Fv (scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 디술피드 연결 Fv (sdFv), 및 Fv가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항체 모이어티는, 예를 들어, 모노클로날, 키메라, 인간, 또는 인간화 모이어티일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인이 있는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단의 하나 이상의 시스테인 잔기가 있는 Fab 단편인 Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인이 있는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인, 및 CH1 도메인의 C-말단의 하나 이상의 시스테인 잔기가 있는 Fd' 단편; (v) 항체의 한쪽 팔의 VL 및 VH 도메인이 있는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 ([Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]); (vii) 단리된 CDR 영역; (viii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ix) 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일쇄 Fv; scFv) ([Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]; 및 [Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)]); (x) 동일한 폴리펩티드 사슬 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 "디아바디" (예를 들어, EP 특허 공개 번호 404,097; WO93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 (xi) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 직렬 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체" ([Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]; 및 미국 특허 번호 5,641,870)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 단일 도메인 항체이다. 예로는 중쇄 항체, 천연적으로 경쇄가 없는 항체, 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체, 및 항체로부터 유래된 것들 이외의 단일 도메인 스캐폴드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 리마, 염소, 토끼, 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 천연 발생 단일 도메인 항체 예컨대 VHH 도메인이다. VHH는 천연적으로 경쇄가 없는 면역글로불린으로부터 유래된 중쇄 가변 도메인, 예컨대 WO94/04678에 기술된 바와 같은 낙타과(Camelidae) (낙타, 단봉낙타, 리마, 비큐나, 알파카 및 과나코 포함)로부터 유래된 것들이다. VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. VHH는 "독특한" 에피토프 예컨대 공동(cavity) 또는 홈(groove)에 결합하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이같은 VHH의 친화력이 치료 처치에 더욱 적합할 수 있다 (PCT 공개 번호 WO97/49805).
일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 미국 공개 번호 20070178082에 기술된 바와 같이 혈청 단백질에 결합하는 VHH이다. 혈청 단백질은 대상의 혈청에서 발견되는 임의의 적절한 단백질, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 단백질은 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 타이록신-결합 단백질, 트랜스페린, 또는 피브리노겐이다.
본 발명에서 사용되는 항체 단편을 제조하는데 사용될 수 있는 항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술들이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편들이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458 참조. 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에 예를 들어 기술된 것과 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 아비머 서열을 포함한다. 아비머는 시험관내 엑손 셔플링(shuffling) 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 개발되었다 ([Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94]; [Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220]). 생성된 다중도메인 단백질은 단일-에피토프 결합 단백질과 비교하여 개선된 친화력 (일부 경우에는 나노몰 미만) 및 특이성을 나타낼 수 있는 다수의 독립적인 결합 도메인들을 포함할 수 있다. 아비머의 구축 및 사용 방법에 관한 추가적인 상세사항이, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384 (전문이 거명에 의해 본원에 포함됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 리포칼린 관련 서열, 예를 들어, 안티칼린 또는 리포칼린 유도체를 포함한다. 안티칼린 또는 리포칼린 유도체는 본원에 기술된 것들이 포함되는 다양한 표적 분자에 대한 친화력 및 특이성이 있는 결합 단백질 유형이다. 이같은 단백질이 미국 특허 공개 번호 20060058510, 20060088908, 20050106660, 및 PCT 공개 번호 WO2006/056464에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 테트라넥틴 C-유형 렉틴 관련 서열 또는 트리넥틴, 예를 들어, 테트라넥틴 C-유형 렉틴 또는 테트라넥틴 C-유형 렉틴 유도체를 포함한다. 테트라넥틴 C-유형 렉틴 또는 테트라넥틴 C-유형 렉틴 유도체는 본원에 기술된 것들이 포함되는 다양한 표적 분자에 대한 친화력 및 특이성이 있는 결합 단백질 유형이다. 여러 테트라넥틴 C-유형 렉틴 및 관련 단백질이 PCT 공개 번호 WO2006/053568, WO2005/080418, WO2004/094478, WO2004/039841, WO2004/005335, WO2002/048189, WO98/056906, 및 미국 특허 공개 번호 20050202043에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 천연 안키린 반복 단백질, 예를 들어, DARPin (Molecular Partners)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 어피바디(Affibody)™를 포함한다. 어피바디™는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 단백질 A의 IgG 결합 도메인으로부터 유래된다. 단백질 A 도메인의 결합 표면 근처에 위치하는 잔기를 변경시킴으로써 신규 결합 성질이 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 시스테인 매듭을 기초로 하는 단백질 스캐폴드, 즉 미세소체(microbody) (셀레코어(Selecore)/나스카셀(NascaCell))를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 하나 이상의 트랜스바디(Transbody)™를 포함한다. 트랜스바디™는 트랜스페린 스캐폴드 (바이오레시스(BioResis)/화이자(Pfizer))를 기초로 한다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴을 기초로 하는 결합 단백질을 포함한다. 이러한 소위 어필린(Affilin)™ (Scil Proteins) 분자는 단백질의 베타 시트 구조 내의 결합 영역의 신생(de novo) 디자인에 의해 특성화된다. 미국 공개 번호 20070248536에 어필린™ 분자가 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 제2 도메인은 Fn3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 피브로넥틴으로부터 유래된 Fn3 도메인, 특히 피브로넥틴의 열번째 Fn3 도메인 (10Fn3)이다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fn3 도메인이다.
일부 실시양태에서, BC, DE 및 FG로부터 선택된 Fn3 도메인의 1개 이상의 루프가 상응하는 인간 피브로넥틴 루프에 비해 길이 면에서 연장되거나 짧아질 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이가 2-25개의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린-결합 모티프인 "아르기닌-글리신-아스파르트산" (RGD)이 극성 아미노산-중성 아미노산-산성 아미노산 서열 (N-말단 → C-말단 방향)로 교체될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 IGF-IR, EGFR, 또는 VEGFR2에 결합한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 IGF-IR에 결합하고, 서열 2-125, 184-204, 236 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, IGF-IR 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 EGFR에 결합하고, 서열 207-231 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, EGFR 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 VEGFR2에 결합하고, 서열 126-183, 205, 206 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, VEGFR2 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 서열 2- 231 또는 236 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 2-231 또는 236 중 어느 하나에 대해 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
접합
본 출원의 한 양상은 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당 또는 PEG 모이어티를 통해 작동가능하게 연결된 EGFR 결합 폴리펩티드 및 제2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드와 제2 도메인은 폴리펩티드를 통해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 서열 233 또는 235이다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드와 제2 도메인은 혈액 또는 표적 조직 내의 프로티에이스에 의해 절단가능한 프로티에이스 부위가 있는 폴리펩티드 링커를 통해 작동가능하게 연결된다. 이같은 실시양태는 2개 이상의 치료 단백질을 이같은 단백질들을 따로따로 생산하는 것에 비해 더욱 효율적인 생산 또는 더욱 양호한 전달 또는 치료 성질을 위해 방출시키는데 사용될 수 있다
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드와 제2 도메인은 생체적합성 중합체 예컨대 중합체성 당을 통해 연결된다. 이같은 중합체성 당은 혈액 또는 표적 조직 내의 효소에 의해 절단가능한 효소 절단 부위를 포함할 수 있다. 이같은 실시양태는 2개 이상의 치료 단백질을 이같은 단백질들을 따로따로 생산하는 것에 비해 더욱 효율적인 생산 또는 더욱 양호한 전달 또는 치료 성질을 위해 방출시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드와 제2 도메인은 중합체성 링커를 통해 작동가능하게 연결된다. 중합체성 링커는 하기 특성들 중 하나 이상이 있는 단백질이 생성되도록 각각의 단백질 모이어티 사이의 거리를 최적으로 변화시키는데 사용될 수 있다: 1) 관심 단백질에 결합할 때 하나 이상의 단백질 도메인의 결합의 입체 장애가 감소 또는 증가됨, 2) 안정성 또는 용해도를 증가시키기 위해 추가적인 아미노산 치환을 검색하지 않으면서 단백질 안정성 또는 용해도가 증가됨 (예를 들어, 약 20 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 50 ㎎/㎖ 이상의 용해도), 3) 안정성을 감소시키는 추가적인 아미노산 치환을 검색하지 않으면서 단백질 응집이 감소됨 (예를 들어, SEC로 측정 시), 및 4) 추가적인 결합 도메인을 첨가함으로써 단백질의 전체적인 결합력 또는 친화력이 증가됨.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 서열 235의 링커를 포함하는 10Fn3 도메인이다. PEG가 링커 서열 내의 시스테인 모이어티에 접합되고, EGFR 결합 폴리펩티드를 제2 도메인에 작동가능하게 연결한다.
PEG 화 실시양태
본 출원의 한 양상은 EGFR 결합 폴리펩티드를 비-단백질성 중합체에 연결시키는 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기술된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌이다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fn3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 PEG 모이어티이다. 또한, 본 출원은 항체 모이어티 (예를 들어, 낙타 항체 및 이의 유도체, 뿐만 아니라 단일쇄 및 도메인 항체; 특히 미생물로부터 발현된 것들) 및 항체-유사 모이어티 (예를 들어, 리포칼린, 안키린, 다중 Cys-Cys 도메인 및 테트라넥틴의 유도체; 특히 미생물에서 발현된 것들)에 대한 N 또는 C 말단 PEG 접합을 제공한다.
PEG는 시판되거나 당업계에 주지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는, 주지된 수용성 중합체이다 ([Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pp 138-161]). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 말단에서의 변형과 관계 없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하도록 광범위하게 사용되고, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
Figure pct00001
[식중, n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들어, C1 -4 알킬이다]. 한 실시양태에서, 본 발명의 PEG는 한쪽 말단에서 하이드록시 또는 메톡시로 종결되고, 즉 X가 H 또는 CH3 ("메톡시 PEG")이다. PEG는 결합 반응에 필요하거나, 분자의 화학적 합성으로부터 초래되거나 또는 분자들의 일부분들의 최적의 거리를 위한 스페이서인 추가적인 화학기를 함유할 수 있다. 또한, 이같은 PEG는 서로 연결된 하나 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 1개를 초과하는 PEG 사슬이 있는 PEG는 다지형(multiarmed) 또는 분지형 PEG로 칭해진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드를 다양한 폴리올 (글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨 포함)에 부가함으로써 분지형 PEG가 제조될 수 있다. 예를 들어, 펜타에리트리올 및 에틸렌 옥사이드로부터 팔이 4개인 분지형 PEG가 제조될 수 있다. 분지형 PEG가, 예를 들어, 유럽 출원 공개 번호 473084A 및 미국 특허 번호 5,932,462에 기술되어 있다. 한 형태의 PEG는 라이신의 일차 아미노기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄 (PEG2)를 포함한다 ([Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]).
펩티드 또는 단백질에 대한 PEG 접합은 일반적으로 PEG의 활성화, 및 활성화된 PEG-중간체를 표적 단백질/펩티드에 직접 연결하는 것 또는 이러한 중간체를 링커에 연결하고, 이어서 이러한 링커를 활성화시키고 표적 단백질/펩티드에 커플링시키는 것을 수반한다 ([Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977)] 및 [J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977)], [Zalipsky, et al., and Harris et al., Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris ed.), Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 & 22] 참조). PEG 분자를 함유하는 결합 폴리펩티드가 접합된 단백질로서 또한 공지된 한편, 부착된 PEG 분자가 없는 단백질은 미접합으로 지칭될 수 있음을 유념한다.
사용되는 PEG의 크기는 EGFR 결합 폴리펩티드의 의도되는 용도가 포함되는 여러 인자에 좌우될 것이다. 신체, 혈액, 비-혈액 세포외액 또는 조직에서의 반감기를 증가시키기 위해 대형 PEG가 바람직하다. 생체내 세포 활성을 위해, 약 10 내지 60 kDa 범위의 PEG, 뿐만 아니라 약 100 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 약 60 kDa 미만의 PEG가 바람직하지만, 약 100 kDa을 초과하는 크기 또한 사용될 수 있다. 생체내 영상화 용도를 위해, 더 빠른 분포 및 더 짧은 반감기를 허용하도록 대형 PEG만큼 많이 반감기를 증가시키지 않는 더 작은 PEG, 일반적으로 약 20 kDa 미만의 PEG가 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 폴리펩티드에 접합시키기 위해, 다양한 분자 질량 형태의 PEG, 예를 들어, 약 1,000 돌턴 (Da) 내지 100,000 Da (n은 20 내지 2300)가 선택될 수 있다. PEG 내의 반복 단위의 개수 "n"은 돌턴 단위로 기술된 분자 질량에 대한 근사값이다. 활성화된 링커 상의 PEG의 분자 질량 합계가 제약 용도에 적절한 것이 바람직하다. 따라서, 한 실시양태에서, PEG 분자의 분자 질량은 100,000 Da을 초과하지 않는다. 예를 들어, 각각의 PEG 분자의 분자 질량이 12,000 Da (각각의 n은 약 270)로 동일한 3개의 PEG 분자가 링커에 부착되는 경우, 링커 상의 PEG의 총 분자 질량은 약 36,000 Da (총 n은 약 820)이다. 링커에 부착된 PEG의 분자 질량들은 또한 상이할 수 있고, 예를 들어, 링커 상의 3개의 분자 중에서, 2개의 PEG 분자는 각각 5,000 Da (각각의 n은 약 110)일 수 있고, 1개의 PEG 분자는 12,000 Da (n은 약 270)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개의 PEG 모이어티가 EGFR 결합 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 KDa이다.
일부 실시양태에서, PEG화 EGFR 결합 폴리펩티드는 1개, 2개, 또는 이를 초과하는 개수의 PEG 모이어티를 함유한다. 한 실시양태에서, PEG 모이어티(들)은 단백질의 표면 상에 있고/있거나 표적 리간드와 접촉하는 표면에서 먼 아미노산 잔기에 결합된다. 한 실시양태에서, PEG-결합 폴리펩티드 내의 PEG의 분자 질량 합계 또는 총 분자 질량은 약 3,000 Da 내지 60,000 Da, 또는 약 10,000 Da 내지 36,000 Da이다. 한 실시양태에서, PEG화 결합 폴리펩티드 내의 PEG는 실질적으로 선형인 직쇄 PEG이다.
당업자는, 예를 들어, PEG화 결합 폴리펩티드가 치료적으로 사용되는 방식, 원하는 투여량, 순환 시간, 단백질분해에 대한 저항성, 면역원성, 및 기타 고려사항을 기초로 PEG에 대한 적절한 분자 질량을 선택할 수 있다. PEG, 및 단백질의 성질을 강화하기 위한 이의 용도의 논의를 위해, [N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993)]를 참조한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드가 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR의 폴리(에틸렌 글리콜) 1개에 공유결합으로 연결되고, 이때 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO (즉, 카르보닐)는 결합 폴리펩티드의 아미노 기들 중 하나와 아미드 결합을 형성하고; R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 약 950이고; n 및 m은 접합체의 분자량에서 결합 펩티드를 차감한 값이 약 10 내지 40 kDa이도록 선택된다. 한 실시양태에서, 결합 폴리펩티드의 라이신의 ε-아미노기가 이용가능한 (유리) 아미노기이다.
한 특정 실시양태에서, PEG의 카르보네이트 에스테르가 PEG-결합 폴리펩티드 접합체를 형성하는데 사용된다. N,N'-디숙신이미딜카르보네이트 (DSC)가 PEG와의 반응에 사용되어 혼합된 활성 PEG-숙신이미딜 카르보네이트가 형성될 수 있고, 이어서 이것이 링커의 친핵성 기 또는 결합 폴리펩티드의 아미노기와 반응될 수 있다 (미국 특허 번호 5,281,698 및 미국 특허 번호 5,932,462 참조). 유사한 유형의 반응에서, 1,1'-(디벤조트리아졸릴)카르보네이트 및 디-(2-피리딜)카르보네이트가 PEG와 반응하여 각각 PEG-벤조트리아졸릴 및 PEG-피리딜 혼합 카르보네이트가 형성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,382,657).
EGFR 결합 폴리펩티드의 PEG화는 당업계의 방법에 따라, 예를 들어, 결합 폴리펩티드와 친전자성으로 활성인 PEG (공급원: Shearwater Corp. (USA), www.shearwatercorp.com)의 반응에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 본 발명의 PEG 시약은, 예를 들어, N-하이드록시숙신이미딜 프로피오네이트 (PEG-SPA), 부타노에이트 (PEG-SBA), PEG-숙신이미딜 프로피오네이트 또는 분지형 N-하이드록시숙신이미드 예컨대 mPEG2-NHS ([Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69])이다. 이같은 방법들이 결합 폴리펩티드 라이신의 ε-아미노기 또는 결합 폴리펩티드의 N-말단 아미노기에서의 PEG화에 사용될 수 있다.
또다른 실시양태에서, PEG 분자가 결합 폴리펩티드 상의 설프하이드릴 기에 커플링될 수 있다 ([Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991)]; [Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996)]; [Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343]; 미국 특허 번호 5,766,897). 미국 특허 번호 6,610,281 및 5,766,897에 설프하이드릴 기에 커플링될 수 있는 예시적인 반응성 PEG 종이 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 부위-지정 PEG화에 의해, 특히 N- 또는 C-말단의 시스테인 모이어티에 대한 PEG의 접합에 의해 PEG화 EGFR 결합 폴리펩티드가 생산된다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 PEG 모이어티에 공유결합으로 결합된 Fn3 도메인이고, 이때 상기 Fn3 도메인의 루프들 중 1개 이상이 EGFR 결합에 참여한다. 부위 지정 PEG화에 의해, 예컨대 Cys 잔기에의 부착에 의해 PEG 모이어티가 Fn3 폴리펩티드에 부착될 수 있고, 이때 Cys 잔기는 Fn3 폴리펩티드의 N-말단에, 또는 N-말단과 가장 N-말단 쪽인 베타 또는 베타-유사 가닥 사이에, 또는 Fn3 폴리펩티드의 C-말단에, 또는 C-말단과 가장 C-말단 쪽인 베타 또는 베타-유사 가닥 사이에 위치할 수 있다. Cys 잔기는 또다른 위치, 특히 표적 결합에 참여하지 않는 루프들 중 임의의 것에 또한 놓일 수 있다. PEG 모이어티는 아민에의 접합을 포함하는 또다른 화학에 의해 또한 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG 분자가 결합 폴리펩티드 상의 시스테인 잔기에 접합되는 경우, 이러한 시스테인 잔기가 결합 폴리펩티드에 대해 천연의 것일 수 있는 한편, 또다른 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인 잔기가 결합 폴리펩티드 내로 조작될 수 있다. 시스테인 잔기가 생성되도록 결합 폴리펩티드 코딩 서열 내로 돌연변이가 도입될 수 있다. 이는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 시스테인 잔기로 돌연변이시키기 위한 바람직한 아미노산에는 세린, 트레오닌, 알라닌 및 기타 친수성 잔기가 포함된다. 바람직하게는, 시스테인으로 돌연변이될 잔기는 표면에 노출된 잔기이다. 1차 서열 또는 단백질을 기초로 잔기의 표면 접근가능성을 예측하기 위한 알고리즘이 당업계에 주지되어 있다. 별법적으로, 결합 폴리펩티드가 이를 기초로 하여 디자인되고 발달되는 프레임워크의 결정 구조가 해석되었고 ([Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414(6866):933-8] 참조), 따라서 표면-노출 잔기가 확인되었음을 고려하여, 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 비교함으로써 표면 잔기를 예측할 수 있다. 한 실시양태에서, N- 및/또는 C-말단에서 또는 N- 및/또는 C-말단 근처에서, 또는 루프 영역 내에서 시스테인 잔기가 결합 펩티드 내로 도입된다. 예를 들어, PEG-말레이미드, PEG-비닐술폰, PEG-요오도아세트아미드, 또는 PEG-오르토피리딜 디술피드를 사용하여, 시스테인 잔기의 PEG화가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG화 결합 폴리펩티드는 N-말단 아미노산의 알파 아미노기에 공유결합으로 부착된 PEG 분자를 포함한다. 부위 특이적 N-말단 환원성 아민화가 [Pepinsky et al., (2001) JPET, 297,1059], 및 미국 특허 번호 5,824,784에 기술되어 있다. 또다른 이용가능한 친핵성 아미노기를 사용하는 단백질의 환원성 아민화를 위한 PEG-알데하이드의 용도가 미국 특허 번호 4,002,531, [Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579], 및 [Chamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133]에 기술되어 있다.
또다른 실시양태에서, PEG화 결합 폴리펩티드는 링커에 공유결합으로 연결된 1개 이상의 PEG 분자를 포함하고, 차례로 이러한 링커가 결합 펩티드의 N-말단의 아미노산 잔기의 알파 아미노기에 부착된다. 이같은 접근법이 미국 공개 번호 2002/0044921 및 PCT 공개 번호 WO94/01451에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 결합 폴리펩티드가 C-말단에서 PEG화된다. 특정 실시양태에서, C-말단 아지도-메티오닌의 도입 및 이어지는 스타우딩거(Staudinger) 반응을 통한 메틸-PEG-트리아릴포스핀 화합물의 접합에 의해 C-말단에서 단백질이 PEG화된다. 이러한 C-말단 접합 방법이 [Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004; 15(5):1005-1009]에 기술되어 있다.
당업계에 공지된 통상적인 분리 및 정제 기술, 예컨대 크기 배제 (예를 들어, 젤 여과) 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 PEG화 결합 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 또한 SDS-PAGE를 사용하여 생성물을 분리할 수 있다. 분리될 수 있는 생성물에는 모노-, 디-, 트리-, 폴리- 및 비-PEG화 결합 폴리펩티드, 뿐만 아니라 유리 PEG를 포함한다. 조성물 내의 모노-PEG의 백분율이 증가되도록 용출 피크 주변의 더 넓은 분획을 풀링(pooling)함으로써 모노-PEG 접합체의 백분율이 제어될 수 있다. 약 90％의 모노-PEG 접합체가 수율과 활성의 양호한 균형을 나타낸다. 예를 들어, 92％ 이상 또는 96％ 이상의 접합체가 모노-PEG 종인 조성물이 바람직할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 모노-PEG 접합체의 백분율은 90％ 내지 96％이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 EGFR 결합 폴리펩티드 내의 PEG는 하이드록실아민 분석법, 예를 들어, 실온에서 8 내지 16시간에 걸친 450 mM 하이드록실아민 (pH 6.5)을 사용했을 때 PEG화 아미노산 잔기로부터 가수분해되지 않고, 따라서 안정적이다. 한 실시양태에서, 조성물의 80％ 초과, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상이 안정적인 모노-PEG-결합 폴리펩티드이다.
또다른 실시양태에서, 바람직하게는 PEG화 EGFR 결합 폴리펩티드는 변형되지 않은 단백질과 관련된 생물학적 활성의 적어도 약 25％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％를 유지할 것이다. 한 실시양태에서, 생물학적 활성은 KD, kon 또는 koff에 의해 평가되는, EGFR에 결합하는 이의 능력을 지칭한다. 한 특정 실시양태에서, PEG화 결합 폴리펩티드 단백질은 비-PEG화 결합 폴리펩티드에 비해 EGFR에의 결합에서 증가를 나타낸다.
PEG-변형 폴리펩티드의 혈청 소거율은 변형되지 않은 결합 폴리펩티드의 소거율에 비해 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 또는 심지어 90％만큼 감소될 수 있다. PEG-변형 폴리펩티드는 반감기 (t1/2)가 변형되지 않은 단백질의 반감기에 비해 강화될 수 있다. PEG-결합 폴리펩티드의 반감기가 변형되지 않은 결합 폴리펩티드의 반감기에 비해 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％, 125％, 150％, 175％, 200％, 250％, 300％, 400％ 또는 500％만큼, 또는 심지어 1000％만큼 강화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관 내에서, 예컨대 완충 염수 용액 내에서, 또는 혈청 내에서 단백질 반감기가 결정된다. 또다른 실시양태에서, 단백질 반감기는 생체내 반감기, 예컨대 동물의 혈청 또는 기타 체액 내에서의 단백질의 반감기이다.
EGFR 결합 폴리펩티드의 탈면역화
한 양상에서, 본 출원은 탈면역화된 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 B- 또는 T-세포 에피토프가 제거되도록 EGFR 결합 폴리펩티드의 서열이 변경되었다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 10Fn3 도메인을 포함한다.
EGFR 결합 폴리펩티드가 이를 소정의 종에 대해 면역원성이지 않거나 덜 면역원성이게 하도록 탈면역화될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 구조적 변경을 통해 탈면역화가 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈면역화 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 탈면역화를 위한 한 적절한 기술이 WO 00/34317에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다. 요약하면, WO 00/34317에 기술된 일반적인 방법 내의 전형적인 프로토콜은 하기의 단계들을 포함한다.
1. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
2. MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 결정하는 것, 치료 단백질이 제공될 종으로부터의 T-세포 수용체에 대한 펩티드:HLA 복합체의 결합을 결정하는 것, 치료 단백질이 제공될 종의 HLA 분자가 있는 트랜스제닉(transgenic) 동물을 사용하여 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 테스트하는 것, 또는 치료 단백질이 제공될 종으로부터의 면역계 세포로 재구성된 이같은 트랜스제닉 동물을 테스트하는 것이 포함되는 임의의 방법에 의해 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잠재적인 T-세포 에피토프들을 확인하는 단계;
3. 변형된 폴리펩티드를 생산하기 위한 유전자 조작 또는 기타 방법에 의해, 잠재적인 T-세포 에피토프들 하나 이상을 제거하도록 폴리펩티드를 변경시키고, 이같은 변경된 폴리펩티드를 테스트를 위해 생산하는 단계.
한 실시양태에서, MHC 클래스 II 결합 모티프의 존재에 대해 폴리펩티드의 서열들을 분석할 수 있다. 예를 들어, MHC-결합 모티프의 데이터베이스와의 비교가, 예컨대 sitewehil.wehi.edu.au의 월드와이드웹 상의 "모티프" 데이터베이스를 검색함으로써, 이루어질 수 있다. 별법적으로, 폴리펩티드로부터의 연속적인 중첩 펩티드들이 MHC 클래스 II 단백질에의 결합 에너지에 대해 테스트되는 [Altuvia et al., J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)]에 의해 고안된 방법과 같은 컴퓨터 쓰레딩(threading) 방법을 사용하여 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 확인할 수 있다. 컴퓨터 결합 예측 알고리즘에는 iTope™, 테피토프(Tepitope), SYFPEITHI, 에피매트릭스(EpiMatrix) (EpiVax), 및 MHCpred가 포함된다. MHC 클래스 II-결합 펩티드의 확인을 보조하기 위해, 양친매성 및 로스바드(Rothbard) 모티프, 및 카텝신 B 및 기타 프로세싱 효소에 대한 절단 부위와 같은 성공적으로 제시된 펩티드에 관한 관련 서열 양상들을 검색할 수 있다.
잠재적인 (예를 들어, 인간) T-세포 에피토프들이 확인되면, T-세포 에피토프를 제거하는데 필요한 만큼 하나 이상의 아미노산을 변경시킴으로써 이러한 에피토프들이 제거된다. 일반적으로, 이는 T-세포 에피토프 자체 내의 하나 이상의 아미노산의 변경을 수반할 것이다. 이는 단백질의 1차 구조의 관점에서 에피토프에 인접한 아미노산 또는 1차 구조에서는 인접하지 않지만 분자의 2차 구조에서 인접한 아미노산의 변경을 수반할 수 있다. 구현되는 일반적인 변경은 아미노산 치환일 것이지만, 특정 상황에서 아미노산 부가 또는 결실이 적합할 수 있다. 재조합 DNA 기술에 의해 모든 변경이 달성될 수 있어, 최종 분자가 재조합 숙주로부터의 발현에 의해, 예를 들어 잘 확립된 방법에 의해 제조될 수 있지만, 단백질 화학 또는 임의의 또다른 분자 변경 수단이 또한 사용될 수 있다.
일단 확인된 T-세포 에피토프들이 제거되면, 탈면역화된 서열을 새로운 T-세포 에피토프가 생성되지 않았는지를 확실히 하기 위해 다시 분석할 수 있고, 만약 생성되었다면 이러한 에피토프(들)을 결실시킬 수 있다.
컴퓨터로 확인된 모든 T-세포 에피토프가 제거될 필요는 없다. 당업자는 특정 에피토프의 "강도" 또는 다소 잠재적인 면역원성의 유의성을 이해할 것이다. 다양한 컴퓨터 방법에서 잠재적인 에피토프들이 채점된다. 당업자는 높은 점수의 에피토프들만이 제거될 필요가 있을 수 있음을 인지할 것이다. 당업자는 잠재적인 에피토프들의 제거와 폴리펩티드의 결합 친화력의 유지 사이의 균형이 있음을 또한 인지할 것이다. 따라서, 한 전략은 폴리펩티드 내로 순차적으로 치환을 도입한 후 항원 결합 및 면역원성에 대해 테스트하는 것이다.
한 양상에서, 탈면역화된 폴리펩티드는 인간 대상에서 원래의 폴리펩티드보다 덜 면역원성이다 (정확히는, 감소된 HAMA 응답을 유발한다). 면역원성을 결정하기 위한 분석법은 당업자에게 주지되어 있다. 당업계에서 인정된 면역 응답 결정 방법을 수행하여 특정 대상에서의 또는 임상 시험 동안의 HAMA 응답을 모니터링할 수 있다. 탈면역화된 폴리펩티드가 투여된 대상에게 상기 요법의 투여를 시작할 때 및 투여 전반에 걸쳐 면역원성 평가를 제공할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 기술 (BIACORE) 및/또는 고체-상 ELISA 분석이 포함되는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 대상으로부터의 혈청 샘플 내의 탈면역화된 폴리펩티드에 대한 항체를 검출함으로써 HAMA 응답이 측정된다. 별법적으로, T-세포 활성화 이벤트를 측정하도록 디자인된 시험관내 분석법이 또한 면역원성을 나타낸다.
추가적인 변형
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드가 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Fn3 도메인이다. Fn3 도메인은 일반적으로는 글리코실화 부위를 함유하지 않지만, 이같은 글리코실화가 단백질 내로 조작될 수 있다.
단백질의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 이들이 본 발명의 단백질, 특히 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 및 이의 상응하는 폴리뉴클레오티드 내로 조작될 수 있다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
단백질에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
일부 실시양태에서, 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 강화되도록 EGFR 결합 폴리펩티드가 변형된다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 Fc 영역을 추가로 포함하는 Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 ADCC 또는 CDC를 강화시키는 변이체이다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 천연 서열 Fc 영역에 비해 변이체 Fc 영역은 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 더욱 효율적으로 매개할 수 있거나, 또는 더욱 양호한 친화력으로 Fc 감마 수용체 (FcγR)에 결합할 수 있다. 이같은 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 위치 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430 중 임의의 하나 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이때 Fc 영역 내의 잔기의 번호매김은 캐벗(Kabat)에서의 EU 지수의 번호매김이다.
핵산-단백질 융합 기술
한 양상에서, 본 출원은 인간 표적, 예를 들어, EGFR, VEGFR2, IGF-IR, 및 기타 단백질에 결합하는 제III형 피브로넥틴 도메인을 제공한다. 특이적 결합 성질이 있는 Fn3 도메인을 신속하게 제조하고 테스트하는 한 방식은 <Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company>의 핵산-단백질 융합 기술이다. 본 개시내용은 EGFR 및 기타 단백질에의 결합에 중요한 신규 폴리펩티드 및 아미노산 모니프를 확인하기 위해 핵산-단백질 융합물 (RNA- 및 DNA-단백질 융합물)을 활용하는, 프로퓨전(PROfusion)™으로 칭해지는 이같은 시험관내 발현 및 태그부착(tagging) 기술의 사용을 기술한다. 핵산-단백질 융합 기술은 단백질을 이의 코딩 유전자 정보에 공유결합에 의해 커플링시키는 기술이다. RNA-단백질 융합 기술 및 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 라이브러리 스크리닝 방법의 상세한 설명을 위해, 거명에 의해 본원에 포함된 스조스탁(Szostak) 등의 미국 특허 번호 6,258,558; 6,261,804; 6,214,553; 6,281,344; 6,207,446; 6,518,018; PCT 공개 번호 WO00/34784; WO01/64942; WO02/032925; 및 [Roberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297-12302, 1997]을 참조한다. 핵산-단백질 융합 기술에 대한 추가적인 논의를 본 출원의 실시예 및 <재료 및 방법> 섹션에서 확인할 수 있다.
벡터 & 폴리뉴클레오티드 실시양태
본원에 개시된 다양한 단백질 또는 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산이 화학적으로 합성될 수 있다. 세포에서의 발현이 개선되도록 코돈 용법이 선택될 수 있다. 이같은 코돈 용법은 선택된 세포 유형에 좌우될 것이다. 대장균 및 기타 박테리아, 뿐만 아니라 포유류 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 특수 코돈 용법 패턴이 개발되었다. 예를 들어, [Mayfield et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jan 21;100(2):438-42]; [Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):96-105]; [Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):446-9]; [Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512-38]; 및 [Sharp et al. Yeast. 1991 Oct;7(7):657-78] 참조.
핵산 조작을 위한 일반적인 기술이, 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함되는 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989], 또는 [F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)] 및 정기 개정판에 기술되어 있다. 포유류, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 작동가능하게 연결된다. 이같은 조절 요소에는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의적인 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열이 포함된다. 복제 기원에 의해 일반적으로 부여되는, 숙주에서 복제되는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선별 유전자가 추가적으로 포함된다.
직접적으로, 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드 (바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙형 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단의 특이적 절단 부위가 있는 기타 폴리펩티드)와의 융합 폴리펩티드로서 본원에 기술된 단백질이 재조합에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포가 인식 및 프로세싱하는 것 (즉, 신호 펩티데이스에 의해 절단되는 것)이다. 천연 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해, 신호 서열이 알칼리성 포스파테이스, 페니실리네이스, lpp 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 예를 들어 선택되는 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 신호 서열이 효모 인버테이스 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 알파-인자 리더 포함), 또는 산 포스파테이스 리더, 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀레이스 리더, 또는 PCT 공개 번호 WO90/13646에 기술된 신호로 예를 들어 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열, 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) gD 신호가 이용가능하다. 이같은 전구체 영역에 대한 DNA가 단백질을 코딩하는 DNA에 대한 리딩 프레임(reading frame) 내에 결찰될 수 있다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터 양쪽 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터 내에서, 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 것이고, 복제 기원 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 이같은 서열들이 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그람(Gram)-음성 박테리아에 대해 적절하고, 2μ 플라스미드 기원이 효모에 적절하며, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 포유류 발현 벡터에 대해서는 복제 기원 성분이 요구되지 않는다 (SV40 기원이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 단지 SV40 기원이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 또한 칭해지는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 이용가능하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌을 코딩하는 유전자이다.
효모에서 사용하기에 적절한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 ([Jones, Genetics. 85:12 (1977)]). 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재하는 것은 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)가 보완된다.
발현 및 클로닝 벡터는 숙주 생물에 의해 인식되고, 본 발명의 단백질, 예를 들어, 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 일반적으로 함유한다. 원핵생물 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터로는 phoA 프로모터, 베타-락타메이스 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파테이스, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 박테리아 프로모터도 적절하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 또한 함유할 것이다.
진핵생물에 대해 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵생물 유전자에는 전사가 개시되는 부위로부터 염기 약 25개 내지 30개 상류에 위치한 AT-풍부 영역이 있다. 다수의 유전자의 전사 시작부로부터 염기 70개 내지 80개 상류에서 발견된 또다른 서열은 CNCAAT 영역 [식중, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다]이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이러한 서열들이 진핵생물 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적절한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 카이네이스 또는 기타 당분해성 효소, 예컨대 에놀레이스, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소카이네이스, 피루베이트 디카르복실레이스, 포스포프룩토카이네이스, 글루코스-6-포스페이트 아이소머레이스, 3-포스포글리세레이트 뮤테이스, 피루베이트 카이네이스, 트리오스포스페이트 아이소머레이스, 포스포글루코스 아이소머레이스 및 글루코카이네이스에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 전사가 제어되는 추가적인 장점이 있는 유도성 프로모터인 또다른 효모 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파테이스, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기 위한 적절한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 효모 인핸서 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이(Simian) 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격(heat-shock) 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단, 이같은 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터가 SV40 바이러스 복제 기원을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기술되어 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 카이네이스 프로모터의 제어 하에서의 마우스 세포에서의 인간 베타-인터페론 cDNA의 발현에 대해 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]를 또한 참조한다. 별법적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복물이 프로모터로 사용될 수 있다.
고급 진핵생물에 의한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA의 전사가 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 종종 증가된다. 다수의 인핸서 서열이 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스테이스, 알부민, 알파-태아단백질, 및 인슐린)로부터 현재 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예로는 복제 기원의 후기 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 또한 참조한다. 인핸서는 다가 항체-코딩 서열에 대해 5' 또는 3'인 위치에서 벡터 내로 스플라이싱(splicing)될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'인 부위에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포 (예를 들어, 효모 세포, 진균류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 또는 기타 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 또한 전형적으로 함유할 것이다. 이같은 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 및 때때로 3'의 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수가능하다. 이러한 영역들은 다가 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내에 폴리아데닐화 단편으로 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터 참조.
재조합 DNA는 단백질을 정제하는데 유용할 수 있는 임의 유형의 단백질 태그 서열을 또한 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예로는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 클로닝 및 발현 벡터를 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)]에서 확인할 수 있고, 이의 관련된 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
당업자에게 명백할, 숙주 세포에 적합한 방법을 사용하여 발현 구축물이 숙주 세포 내로 도입된다. 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 계면활성제를 사용하는 형질감염; 미세발사체(microprojectile) 포격; 리포펙션(lipofection); 및 감염 (벡터가 감염체인 경우)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
적절한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 포유류 세포, 또는 박테리아 세포가 포함된다. 적절한 박테리아에는 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어, 대장균 또는 바실루스(Bacillus) 종이 포함된다. 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 종으로부터의 효모, 예컨대 사카로마이에스 세레비지아에(S. cerevisiae)가 또한 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현하는데 또한 사용될 수 있다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템이 [Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에서 검토되었다. 적절한 포유류 숙주 세포 세포주의 예에는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주가 포함된다. 재조합 단백질을 발현하도록 적절한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 정제된 폴리펩티드가 제조된다. 다수의 용도에 대해, 본원에 개시된 폴리펩티드들 중 다수의 작은 크기는 대장균에서의 발현이 바람직한 발현 방법이도록 할 것이다. 그후, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 단백질을 정제한다.
본 발명의 글리코실화 단백질의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스(baculoviral) 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.
일부 예에서, 예컨대 글리코실화를 위해, 척추동물 세포에서 단백질을 생산하는 것이 바람직할 것이고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포; [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO; [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4; [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간세포암 세포주 (Hep G2); 및 골수종 및 림프종 세포 (예를 들어, Y0, J558L, P3 및 NS0 세포) (미국 특허 번호 5,807,715 참조)이다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 이용될 수 있다.
단백질 생산
단백질 생산을 위한 본원에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 숙주 세포가 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양소 배지에서 배양된다.
본 발명의 단백질을 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판 배지가 숙주 세포의 배양에 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO90/03430; WO87/00195; 또는 미국 특허 번호 Re. 30,985에 기술된 배지들 중 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 임의의 또다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 개시된 단백질을 세포-번역 시스템을 사용하여 또한 생산할 수 있다. 이같은 목적을 위해, mRNA를 생산하기 위한 시험관내 전사를 허용하도록, 그리고 사용되는 특정 무세포(cell-free) 시스템 (진핵생물 예컨대 포유류 또는 효모 무세포 번역 시스템 또는 원핵생물 예컨대 박테리아 무세포 번역 시스템)에서의 mRNA의 무세포 번역을 허용하도록 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 변형되어야 한다.
본 발명의 단백질은 화학적 합성에 의해 또한 생산될 수 있다 (예를 들어, [Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL]에 기술된 방법에 의해). 단백질에 대한 변형 또한 화학적 합성에 의해 일어날 수 있다.
단백질 화학 분야에 일반적으로 공지된 단백질 단리/정제 방법에 의해 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다. 비-제한적인 예로는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 또는 황산나트륨으로의 염석), 원심분리, 투석, 초미세여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상(normal phase) 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 젤 여과, 젤 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 역류(countercurrent) 분포 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 정제 후, 여과 및 투석을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 당업계에 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 폴리펩티드가 상이한 완충제 내로 교환되고/되거나 농축될 수 있다.
정제된 폴리펩티드는 바람직하게는 85％ 이상 순수하고, 더욱 바람직하게는 95％ 이상 순수하며, 가장 바람직하게는 98％ 이상 순수하다. 정확한 순도 수치와 관계없이, 폴리펩티드는 제약 제품으로 사용하기에 충분히 순수하다.
영상화, 진단 및 기타 용도
한 양상에서, 본 출원은 검출가능한 모이어티로 표지된 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 다양한 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생산할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소, 예컨대 H3, C14 또는 13, P32, S35, 또는 I131; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파테이스, 베타-갈락토시데이스 또는 양고추냉이 과산화효소일 수 있다.
[Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)]; [David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)]; [Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 기술된 방법들이 포함되는, 검출가능한 모이어티에 단백질을 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 시험관내 방법은 단백질과 상용성인 화학, 예컨대 Cys 및 Lys와 같은 특정 아미노산에 대한 화학이 포함되는, 당업계에 주지된 접합 화학을 포함한다. 모이어티 (예컨대 PEG)를 본 발명의 단백질에 연결하기 위해, 연결기 또는 반응성 기가 사용된다. 적절한 연결기는 당업계에 주지되어 있고, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티데이스-불안정 기 및 에스테레이스-불안정 기를 포함한다. 바람직한 연결기는 용도에 따라 디술피드 기 및 티오에테르 기이다. Cys 아미노산이 없는 폴리펩티드에 대해, 접합용 위치가 생성되는 한편 단백질의 활성은 존재하도록 하는 위치에서 Cys가 조작될 수 있다.
검출가능한 모이어티와 연결된 EGFR 결합 폴리펩티드는 생체내 영상화에 또한 유용하다. 이러한 폴리펩티드가 방사선 비투과성 작용제((radio-opaque agent) 또는 방사성동위원소에 연결될 수 있고, 이를 대상에게, 바람직하게는 혈류 내로 투여하고, 대상 내의 표지된 단백질의 존재 및 위치를 분석한다. 이러한 영상화 기술은 악성종양의 병기 결정 및 치료에서 유용하다. 핵 자기 공명, 방사선학 또는 당업계에 공지된 기타 검출 수단에 의해 대상 내에서 검출가능한 임의의 모이어티로 단백질이 표지될 수 있다.
EGFR 결합 폴리펩티드는 친화력 정제제로서 또한 유용하다. 이러한 프로세스에서, 당업계에 주지된 방법을 사용하여 적절한 지지체, 예컨대 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 여과지 상에 폴리펩티드가 고정된다.
EGFR 결합 폴리펩티드는 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석법, 및 면역침전 분석법에서 사용될 수 있다. ([Zola, Monoclonal Antidodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]).
특정 양상에서, 본 개시내용은 샘플 내의 EGFR을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 샘플을 본원에 기술된 EGFR 결합 폴리펩티드와 접촉시키고, 이때 상기 접촉이 폴리펩티드-EGFR 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 수행되는 단계; 및 상기 복합체를 검출함으로써, 상기 샘플 내의 상기 EGFR을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 방사선촬영, 면역학적 분석법, 형광 검출, 질량 분광법, 또는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 검출을 수행할 수 있다. 샘플은 종종 생물학적 샘플, 예컨대 생검, 특히 종양, 의심되는 종양의 생검에 의한 샘플일 것이다. 샘플은 인간 또는 기타 포유동물로부터의 샘플일 수 있다. 표지화 모이어티, 예컨대 방사성 모이어티, 형광 모이어티, 발색 모이어티, 화학발광 모이어티, 또는 합텐 모이어티로 EGFR 결합 폴리펩티드가 표지될 수 있다. EGFR 결합 폴리펩티드가 고체 지지체 상에 고정될 수 있다.
치료/ 생체내 용도
한 양상에서, 본 출원은 EGFR 관련 장애의 치료에서 유용한 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 본 출원은 대상에게 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상은 EGFR 관련 장애, 예컨대 암에 걸려 있다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다.
일부 실시양태에서, 동물에게 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 것은 EGFR-발현 종양에서의 EGFR 수준의 감소를 야기한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 처치되지 않은 동물과 비교하여 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80％ 또는 이를 초과하는 만큼 수용체 수준에서의 감소를 야기한다.
일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드의 투여는 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제한다. 종양 세포는 표피, 상피, 내피, 백혈병, 육종, 다발 골수종, 또는 중배엽 세포가 비제한적으로 포함되는 임의의 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 이종이식 종양 연구에서 사용하기 위한 통상적인 종양 세포주의 예로는 A549 (비-소세포 폐 암종) 세포, DU-145 (전립선) 세포, MCF-7 (유방) 세포, Colo 205 (결장) 세포, 3T3/IGF-IR (마우스 섬유모세포) 세포, NCI H441 세포, HEP G2 (간세포암) 세포, MDA MB 231 (유방) 세포, HT-29 (결장) 세포, MDA-MB-435 (유방) 세포, U266 세포, SH-SY5Y 세포, Sk-Mel-2 세포, NCI-H929, RPM18226, 및 A431 세포가 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 처치되지 않은 동물에서의 종양의 성장에 비해 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 처치되지 않은 동물에서의 종양의 성장에 비해 50, 60, 70, 80％ 또는 이를 초과하는 만큼 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 동물에서 폴리펩티드로의 처치를 시작하고 나서 적어도 7일 후 또는 적어도 14일 후에 종양 세포 성장의 억제가 측정된다. 일부 실시양태에서, 또다른 항신생물제가 이러한 폴리펩티드와 함께 동물에게 투여된다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 EGFR의 억제에 응답하는 용태, 즉, "EGFR-관련 질환"이 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 이같은 방법은 상기 대상에게 유효량의 임의의 본원에 기술된 EGFR 억제 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 EGFR 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EGFR 리간드에 대한 EGFR 결합을 억제한다.
용어 "EGFR-관련 질환"은 EGFR 활성에 의존적인 병리학적 상태에 관한 것이다. EGFR은 증식, 부착 및 이동, 뿐만 아니라 분화가 포함되는 다양한 세포 활성의 신호 전달 경로에서 직접적으로 또는 간접적으로 수반된다. EGFR 활성과 관련된 질환에는 종양 세포의 증식, 고형 종양의 성장을 촉진하는 병리학적 혈관신생, 눈에서의 혈관신생 (당뇨성 망막병증, 연령-유도 황반 변성 등) 및 염증 (건선, 류머티스성 관절염 등)이 포함된다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 종양 및/또는 종양 전이의 치료 및/또는 예방을 위해 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공하고, 이때 종양은 특히 바람직하게는 뇌 종양, 비뇨생식관의 종양, 림프계의 종양, 위 종양, 후두 종양, 단핵구성 백혈병, 폐 선암종, 소세포 폐 암종, 췌장암, 교모세포종 및 유방 암종으로 구성된 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 편평 세포 암종, 방광암, 위암, 간암, 신장암, 결장직장암, 유방암, 두부암, 경부암, 식도암, 부인과 암, 갑상선암, 림프종, 만성 백혈병 및 급성 백혈병으로 구성된 암성 질환의 군으로부터 선택된 질환의 치료를 위해 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 혈관생성에 의해 야기, 매개 및/또는 증식되는 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다. 혈관생성을 수반하는 이러한 유형의 질환은 안질환, 예컨대 망막 혈관화, 당뇨성 망막병증, 연령-유도 황반 변성 등이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 망막 혈관화, 당뇨성 망막병증, 연령-유도 황반 변성 및/또는 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 EGFR 결합 폴리펩티드 t를 투여하는 방법을 제공한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 건선, 류머티스성 관절염, 접촉 피부염, 지연형 과민증 반응, 염증, 자궁내막증, 흉터형성, 양성 전립선 비대증, 면역학적 질환, 자가면역 질환 및 면역결핍 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 골육종, 골관절염 및 구루병으로 구성된 군으로부터 선택된 골 병리학의 예방 및/또는 치료를 위해 EGFR 결합 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다.
본 출원의 한 양상은 생체 내에서 EGFR 타이로신 인산화 또는 수용체 수준 또는 양쪽 모두를 억제하는 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 동물에게 EGFR 결합제를 투여하는 것은 EGFR-발현 종양에서의 EGFR 포스포타이로신 신호에서의 감소를 야기한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합제는 적어도 20％만큼의 포스포타이로신 신호에서의 감소를 야기한다. 일부 실시양태에서, EGFR 결합제는 적어도 50, 60, 70, 80, 90％ 또는 이를 초과하는 만큼의 포스포타이로신 신호에서의 감소를 야기한다.
본 발명의 적합한 실시양태와 함께 사용될 수 있는 추가적인 작용제
본 발명의 한 양상은 세포독성제에 연결된 EGFR 결합 폴리펩티드를 제공한다. 이같은 실시양태는 적합한 바에 따라 시험관내 또는 생체내 방법에 의해 제조될 수 있다. 시험관내 방법은 단백질과 상용성인 화학, 예컨대 Cys 및 Lys와 같은 특정 아미노산에 대한 화학이 포함되는 당업계에 주지된 접합 화학을 포함한다. 세포독성제를 폴리펩티드에 연결시키기 위해, 연결기 또는 반응성 기가 사용된다. 적절한 연결기는 당업계에 주지되어 있고, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티데이스-불안정 기 및 에스테레이스-불안정 기를 포함한다. 바람직한 연결기는 디술피드 기 및 티오에테르 기이다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 항체와 세포독성제 사이에 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 접합체가 구축될 수 있다. 바람직한 세포독성제는 메이탄시노이드, 탁산, 및 CC-1065의 유사체이다.
일부 실시양태에서, 박테리아 독소, 식물 독소, 리신, 아브린, 리보뉴클리에이스 (RNase), DNase I, 프로티에이스, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 내독소-A, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 슈도모나스 내독소, 란피메이스(Ranpimase) (Rap), Rap (N69Q), 효소, 또는 형광 단백질에 EGFR 결합 폴리펩티드가 연결된다.
일부 실시양태에서, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체에 EGFR 결합 폴리펩티드가 연결된다. 적절한 메이탄시노이드에는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 포함된다. 적절한 메이탄시노이드가 미국 특허 번호 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 탁산에 EGFR 결합 폴리펩티드가 연결된다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 탁산이 미국 특허 번호 6,372,738 및 6,340,701에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, CC-1065 또는 이의 유사체에 EGFR 결합 폴리펩티드가 연결된다. CC-1065 및 이의 유사체가 미국 특허 번호 6,372,738; 6,340,701; 5,846,545 및 5,585,499에 개시되어 있다.
이같은 세포독성 접합체의 제조를 위한 매력적인 후보물은 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양 브로스(broth)로부터 단리된 강력한 항종양 항생체인 CC-1065이다. CC-1065는 통상적으로 사용되는 항암 약물, 예컨대 독소루비신, 메토트렉세이드 및 빈크리스틴보다 시험관 내에서 약 1000배 더 강력하다 ([B. K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)]).
메토트렉세이트, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 칼리키아마이신과 같은 세포독성 약물 또한 본 발명의 접합체의 제조에 적절하고, 약물 분자들 또한 혈청 알부민과 같은 중개 담체 분자를 통해 EGFR 결합 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
또다른 치료 처치 또는 조성물에서, EGFR 결합 폴리펩티드가 하나 이상의 추가적인 치료제와 공동 투여되거나 순차적으로 이와 함께 투여된다. 적절한 치료제에는 표적화된 치료제, 기타 표적화된 생물제제, 및 세포독성 또는 세포정지성(cytostatic) 작용제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 예에서, 동일한 또는 분리된, 액체 제형을 수용하는 치료적으로 허용가능한 바이알, 주사기 또는 기타 투여 장치로부터 작용제들을 투여하는 것이 바람직할 것이다.
암 치료제는 환자에 대한 최소의 효과를 지니면서 암 세포를 죽이거나 이의 성장을 제한하려는 작용제이다. 따라서, 이같은 작용제는 건강한 세포와 암 세포 성질 (예를 들어, 대사, 혈관화 또는 세포-표면 항원 제시)에서의 임의의 차이를 활용할 수 있다. 종양 형태학에서의 차이가 개입을 위한 가능한 부위이다: 예를 들어, 제2 치료제는 고형 종양의 내부의 혈관화를 지연시킴으로써 이의 성장 속도를 느리게 하는데 유용한 항-VEGF 항체와 같은 항체일 수 있다. 또다른 치료제에는 보조제 예컨대 그라니세트론 HCl, 안드로겐 억제제 예컨대 류프롤리드 아세테이트, 항생제 예컨대 독소루비신, 항-에스트로겐 예컨대 타목시펜, 항-대사물질 예컨대 인터페론 알파-2a, 세포독성제 예컨대 탁솔, 효소 억제제 예컨대 ras 파르네실-트랜스퍼레이스 억제제, 면역조정제 예컨대 알데스류킨, 및 질소 머스타드 유도체 예컨대 멜팔란 HCl 등이 포함된다.
개선된 항암 효능을 위해 EGFR 결합 폴리펩티드와 조합될 수 있는 치료제에는 종양학 진료에서 사용되는 다양한 작용제 (참고문헌 [Cancer, Principles & Practice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6th edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001]), 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 트라스투주맵, 카페시타빈, 타목시펜, 토레미펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 풀베스트란트, 엑세메스탄, 고세렐린, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 덱사메타손, 안타이드, 베바시주맵, 5-플루오로우라실, 류코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에토포시드, 토포테칸, 겜시타빈, 비노렐빈, 에스트라무스틴, 미톡산트론, 아바렐릭스, 졸레드로네이트, 스트렙토조신, 리툭시맵, 이다루비신, 부술판, 클로람부실, 플루다라빈, 이마티닙, 사이타라빈, 이브리투모맵, 토시투모맵, 인터페론 알파-2b, 멜팔람, 보르테조밉, 알트레타민, 아스파라기네이스, 제피티닙, 에르롤니팁, 항-EGF 수용체 항체 (예를 들어, 세툭시맵 또는 파니투무맵), 익사베필론, 에포틸론 또는 이의 유도체, 및 세포독성 약물과 세포-표면 수용체에 대한 항체의 접합체가 포함된다. 바람직한 치료제는 백금 작용제 (예컨대 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 시스플라틴), 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀), 젬시타빈, 및 캄토테신이다.
EGFR 결합 폴리펩티드 전에, EGFR 결합 폴리펩티드와 동시에, 또는 EGFR 결합 폴리펩티드 후에 하나 이상의 추가적인 치료제가 투여될 수 있다. 당업자는 각각의 치료제에 대해 특정 투여 순서에 대한 장점이 있을 수 있음을 이해할 것이다. 유사하게, 당업자는 각각의 치료제에 대해 작용제가 투여되는 시간과 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 접합체가 투여되는 시간 사이의 길이가 변할 것임을 이해할 것이다.
제형 및 투여
수용액, 동결건조 제형 또는 기타 건조 제형의 형태로, 원하는 정도의 순도를 지니는 기술된 단백질을 임의적인 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 함께 혼합함으로써 EGFR 결합 폴리펩티드를 포함하는 치료 제형이 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다면 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 활성 화합물들의 조합의 예가 본원에서 제공된다. 이같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 본 발명의 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로젤 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 디포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 하이드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 본 발명의 단백질이 신체 내에서 장기간 동안 유지될 수 있는 경우, 37℃에서 습도에 노출된 결과로 단백질이 변성되거나 응집될 수 있어, 생물학적 활성의 손실을 초래하거나 가능하게는 면역원성의 변화를 초래한다. 수반된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안된다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 설프하이드릴 잔기를 변형시킴, 산성 용액으로부터 동결건조시킴, 수분 함량을 제어함, 적합한 첨가제를 사용함, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
각각의 치료제의 투여량은 작용제의 신원에 좌우될 것임을 당업자가 이해할 것이지만, 바람직한 투여량은 약 10 mg/㎡ 내지 약 2000 mg/㎡, 더욱 바람직하게는 약 50 mg/㎡ 내지 약 1000 mg/㎡ 범위일 수 있다.
치료 용도를 위해, 제약상 허용가능한 투약 형태로 EGFR 결합 폴리펩티드가 대상에게 투여된다. 이는 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 정맥내로, 근육내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 국소적, 뿐만 아니라 전신적 치료 효과를 발휘하도록, 종양내, 종양주위, 병변내, 또는 병변주위 경로에 의해 단백질이 또한 투여될 수 있다. 적절한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제는 당업계에 주지되어 있고, 임상 상황이 허가하는 바에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 적절한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 약 1 ㎎/㎖ 내지 25 ㎎/㎖ 인간 혈청 알부민을 함유하는 둘베코 포스페이트 완충 염수 (pH 약 7.4), (2) 0.9％ 염수 (0.9％ w/v NaCl), 및 (3) 5％ (w/v) 덱스트로스를 포함한다. 본 발명의 방법은 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
공동-투여되든지 또는 순차적으로 투여되든지, EGFR 결합 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적인 치료제의 투여는 치료 용도에 대해 상기 기술된 바와 같이 일어날 수 있다. 공동-투여에 적절한 제약상 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제는 공동-투여되는 특정 치료제의 신원에 좌우되는 것으로 당업자에게 이해될 것이다.
동결건조되기보다는 수성 투약 형태로 존재하는 경우, 전형적으로 단백질은 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖의 농도로 제형될 것이지만, 이러한 범위를 벗어나는 광범위한 변동이 허용된다. 질환의 치료를 위해, EGFR 결합 폴리펩티드의 적합한 투여량은 상기 정의된 버와 같은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법의 경과, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 단백질이 환자에게 적절하게 투여된다.
본 발명은 본원에 기술된 요소들 중 하나 이상, 및 이러한 요소들의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 또한 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키트는 EGFR 결합 폴리펩티드 및 치료제를 포함한다. 이러한 바람직한 실시양태에 대한 설명서는 EGFR 결합 폴리펩티드 및 치료제를 사용하여 암 세포의 성장을 억제하는 것에 대한 설명서, 및/또는 EGFR 결합 폴리펩티드 및 치료제를 사용하여 암에 걸린 환자를 치료하는 방법에 대한 설명서를 포함한다.
바람직하게는, 키트에서 사용되는 치료제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 트라스투주맵, 카페시타빈, 타목시펜, 토레미펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 풀베스트란트, 엑세메스탄, 고세렐린, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 덱사메타손, 안타이드, 베바시주맵, 5-플루오로우라실, 류코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에토포시드, 토포테칸, 젬시타빈, 비노렐빈, 에스트라무스틴, 미톡산트론, 아바렐릭스, 졸레드로네이트, 스트렙토조신, 리툭시맵, 이다루비신, 부술판, 클로람부실, 플루다라빈, 이마티닙, 사이타라빈, 이브리투모맵, 토시투모맵, 인터페론 알파-2b, 멜팔람, 보르테조밉, 알트레타민, 아스파라기네이스, 제피티닙, 에를로티닙, 항-EGF 수용체 항체 (예를 들어, 세툭시맵 또는 파니투무맵), 익사베필론, 및 에포틸론 또는 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 치료제는 백금 작용제 (예컨대 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 시스플라틴), 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀), 젬시타빈, 또는 캄토테신이다.
본 발명의 키트의 요소들은 키트에 적절한 형태, 예컨대 용액 또는 동결건조 분말이다. 당업자는 키트의 요소들의 농도 및 양이 키트의 각각의 요소의 신원 및 의도된 용도에 따라 변한다는 것을 이해할 것이다.
키트의 설명서에서 지칭되는 암 및 세포에는 유방암, 결장암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 윤활액 암종, 췌장암, 흑색종, 다발 골수종, 신경모세포종, 및 횡문근육종이 포함된다.
당업자는 본원에 기술된 방법에서 투여되는 세포독성제 또는 치료제의 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 적합한 투여량을 결정할 때 제약 패키지 삽입물을 또한 참고할 수 있다.
추가적인 특허 참고문헌
하기의 추가적인 특허 출원 및 특허에 기술된 방법 및 조성물이 또한 본 개시내용에 포함된다:
미국 공개 번호 20050186203; 20050084906; 20050008642; 20040202655; 20040132028; 20030211078; 20060083683; 20060099205; 20060228355; 20040081648; 20040081647; 20050074865; 20040259155; 20050038229; 20050255548; 20060246059; 및 미국 특허 번호 5,707,632; 6,818,418; 및 7,115,396; 및 PCT 국제 출원 공개 번호 WO2005/085430; WO2004/019878; WO2004/029224; WO2005/056764; WO2001/064942; 및 WO2002/032925.
거명에 의한 포함
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실시예
이제 본 발명이 단지 예시적이고, 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는 하기의 실시예를 참조로 기술된다. 본 발명이 상세하게, 그리고 이의 특정 실시양태들과 관련하여 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 본 발명에 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1. EGFR 결합 분자의 초기 확인
위치 23-29, 52-55 및 77-86 (서열 1에 따른 아미노산 번호매김)에 3개의 무작위화 영역이 있는 인간 피브로넥틴의 열번째 제3형 도메인의 스캐폴드를 기초로 약 1013개의 RNA-단백질 융합물 변이체의 라이브러리를 구축하였다 ("NNS" 라이브러리) ([Xu et al, Chemistry & Biology 9:933-942, 2002]). 트립토판, 페닐알라닌 및 시스테인이 없는 무작위화된 영역 ("WFC" 라이브러리), 또는 트립토판, 페닐알라닌, 시스테인, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 발린이 없는 무작위화된 영역 ("NVH" 라이브러리)이 제공되도록 축퇴성 코돈 대신 포스포르아미디트 삼량체의 혼합물이 사용된 유사한 라이브러리들을 구축하였다. mRNA/cDNA 헤테로듀플렉스(heteroduplex)로의 전환 후, 각각 1조개 이상의 mRNA/cDNA-단백질 융합물의 라이브러리를 용액 내에서 100 nM EGFR-Fc와 함께 인큐베이션하고, 존재하는 복합체를 단백질 G-코팅 자석 비드 상에 포획하였다. cDNA를 높은 pH로의 처리에 의해 용출시키고, PCR로 증폭시켜, EGFR의 결합제에 대해 강화된 mRNA/cDNA-단백질 융합물의 새로운 더욱 집중적인 라이브러리를 생성시키는데 사용하였다. 증폭 및 선별의 5회 사이클을 이러한 방식으로 수행하고, 표적 결합을 정량적 PCR에 의해 모니터링하였다. EGFR-Fc의 s525 변이체 (Fc에 융합된 EGFR의 아미노산 1-525)를 사용하여, 또는 EGF의 존재 하에 EGFR-Fc를 사용하여 비슷한 실험을 수행하였다. 각각의 경우에, RNA-단백질 융합물 라이브러리가 5회 사이클의 선별 후 표적에 결합하였다.
실시예 2. EGFR 결합 클론의 확인
독립적인 클론들에 의해 코딩되는 단백질들을 단일 지점 직접 결합 분석법에서 EGFR의 전장 엑토도메인(ectodomain), 뿐만 아니라 EGFR 엑토도메인의 처음 525개의 아미노산을 함유하는 말단절단 버전 (EGFR 525)에의 결합에 대해 분석하였다. 항-His 항체를 사용하여 단백질 클론을 배향된 방식으로 포획한 후, 전장 EGFR 또는 EGFR 525 Fc 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 수용체-Fc를 발색 판독 (즉, A450)으로 항-인간 Fc HRP 접합체를 통해 검출하였다. 스크리닝으로부터의 대표적인 결과 (부분적)가 전장 및 말단절단 EGFR에 대한 24개 클론의 상대적인 결합 강도가 제시된 표 1에서 제공된다. 대조군 (SGE)과 비교하여, 모든 클론이 유의한 EGFR 결합을 나타낸다. SGE 대조군은 아미노산 SGE로 치환된 인테그린 결합 도메인 (RGD)이 있는 서열 1로 표시되는 10FN3 도메인이다.
Figure pct00002
실시예 3. 세포-기반 경쟁적 리간드 결합 분석법
세포-기반 경쟁적 리간드 결합 분석법은 인간 A431 세포의 표면 상의 EGFR에 결합하고, 유로퓸 태그로 표지된 천연 EGF 리간드 (Eu-EGF)의 결합과 경쟁하는 테스트 샘플의 능력을 측정한다. 형광 신호에서의 감소에 의해 세포 표면 상의 EGFR에 결합하는 것에 대한 테스트 샘플과 Eu-EGF의 경쟁이 측정된다. 항-EGFR 항체 (LA-1)의 경쟁적 결합이 도 2-4에서 2개의 EGFR 결합 클론 (679F03, 679F09 및 867A01)의 결합과 비교되었다.
실시예 4. EGFR-특이적 클론의 초기 최적화
친화력 및 특이성이 개선된 클론을 확인하기 위해, 추가적인 돌연변이유발이 수행되어, EGFR에 대한 루프 결합을 최적화하도록 더욱 집중된 라이브러리가 생성되었다.
한번에 1개의 루프가 무작위 서열로 교체된 3개의 라이브러리를 구축하였다. 3개의 루프 중 2개 내의 무작위 서열이 최적화될 클론에 상응하는 고정된 서열로 교체되는 것을 제외하고는, 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 DNA 수준에서 라이브러리가 구축되었다.
증폭, mRNA-단백질 융합물의 합성, 및 친화성 선별을 이러한 3개의 라이브러리로 수행하였다. 각각의 라운드에 결합 백분율을 모니터링하고, 각각의 라이브러리가 1％를 초과하는 결합을 나타낼 때까지 프로퓨전(PROfusion)™을 계속하였다. 이러한 시점에, 무작위 루프를 각각의 라이브러리로부터 증폭하고 다시 어셈블리시켜, 3개의 루프 모두가 최적화된 마스터(master) 라이브러리를 제조하였다 (도 5).
3개 모두의 최적화된 루프를 함유하는 마스터 라이브러리를 증폭, mRNA-단백질 융합물의 합성 및 친화력 선별의 사이클들을 통해 취하였다. EGFR-Fc를 감소되는 농도로 사용하여, 친화력이 가장 높은 결합제를 선별하였다. 라운드 1에서, EGFR-Fc의 농도는 100 nM이었다. 라운드 2에서, EGFR-Fc의 농도는 1 nM이었다. 라운드 3 및 4에서, EGFR-Fc의 농도는 0.1 nM이었다.
실시예 5. 최적화된 유도체 클론을 평가하기 위한 세포-기반 경쟁적 리간드 결합 분석법
인간 A431 세포의 표면 상의 EGF에 결합하고 유로퓸 태그로 표지된 천연 EGF 리간드 (Eu-EGF)의 결합과 경쟁하는 능력에 대해, 선별된 최적화된 클론을 미리 최적화된 클론과 비교하였다. HTPP 및 정량 후, 다수의 클론이 낮은 nM 범위의 IC50으로 출발 클론보다 탁월한 억제를 나타낼 수 있었다.
실시예 6. 최적화된 EGFR 경쟁적 IC50 클론의 열 안정성의 검사
선별된 EGFR 최적화 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 수행하여, 개별적인 클론들의 융점 Tm 또는 언폴딩(unfolding)의 에너지학을 특성화하였다.
실시예 7. 최적화된 EGFR 경쟁적 클론의 용액 성질의 검사
선별된 최적화 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 단량체성 거동을 결정하였다. 다각도 레이저 광 산란 (MALLS)과 조합된 SEC를 사용하여 단량체성이 확인되었다. "고전적인" 광 산란 ("정적" 또는 "레일리(Rayleigh)" 산란 또는 MALLS로 또한 공지됨)은 분자 질량의 직접적인 측정치를 제공한다. 따라서, 이는 단백질의 천연 상태가 단량체인지 또는 고급 올리고머인지 여부의 결정, 및 응집물 또는 기타 비-천연 종의 질량의 측정에 매우 유용하다.
실시예 8. 최적화된 EGFR 경쟁적 클론의 결합 친화력 및 동역학의 결정
선별된 최적화 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. 결합 동역학 및 결합 친화력을 결정하기 위해, 고정된 재조합 EGFR 및 용액-상 클론을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (BIAcore) 분석을 수행하였다.
실시예 9. 최적화된 EGFR 경쟁적 클론의 또다른 HER-패밀리 구성원에 대한 결합의 결정
선별된 최적화 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. EGFR 경쟁적 클론이 실제로 EGFR에 대해 특이적이라는 것을 확실히 하기 위해, 이들을 비아코어(BIAcore) 방법론을 사용하여 또다른 HER 패밀리 구성원 또는 또다른 관련되지 않은 수용체에 대해 고농도에서 평가하였다. HER 패밀리 구성원 또는 또다른 관련되지 않은 수용체를 비아코어 칩 상에 고정하고, 비-특이적 결합에 대한 대조군으로서 무관한 단백질을 또한 고정하였다. 클론들을 칩에 10 μM로 통과시켜, 비-특이적 결합 또는 특이성을 조사하였다.
실시예 10. 세포-기반 분석법에서의 EGFR 클론의 활성
활성을 확인하기 위해, 정제된 EGFR 클론을 세포-기반 분석법에서 평가하였다. 이러한 예에서, 클론 679F09 (서열 215)로부터의 결과가 기술된다. 리간드-자극 EGFR 활성화 및 하류 MAP 카이네이스 신호전달을 직접적으로 방해하는 능력에 대해 클론 679F09를 스크리닝하였다. 면역세포화학 분석법 (세포내 웨스턴(In Cell Western))을 사용하여 1) EGFR의 총 인산화, 2) 세포질 신호전달 단백질의 결합을 담당하는 기능적으로 중요한 잔기인 EGFR의 타이로신 1068의 인산화 및 3) EGFR 활성화에 응답하여 성장을 자극하는 MAP 카이네이스 경로의 성분인 ERK 인산화를 측정하였다. A431 표피양 암종 세포 및 FaDu 두경부 암종 세포 양쪽 모두에서 이러한 분석법들을 수행하였다.
FaDu 세포에서, 클론 679F09는 1.32 μM의 IC50으로 타이로신 1068 상에서의 EGF-자극 EGFR 인산화를 차단하였고, 2.8 μM의 IC50으로 EGF-자극 ERK 인산화를 차단하였다. A431 세포에서, 클론 679F09는 2.4 μM의 IC50으로 EGF-자극 총 EGFR 인산화를 차단하였고, 2.88 μM의 IC50으로 타이로신 1068 상에서의 EGF-자극 EGFR 인산화를 차단하였으며, 3.1 μM의 IC50으로 EGF-자극 ERK 인산화를 차단하였다.
AKT의 인산화, 총 EGFR 인산화, 타이로신 1068 상에서의 EGFR 인산화, 및 ERK 인산화를 측정하기 위한 ELISA 분석법을 사용하여 DiFi 결장 암종 세포에서 이러한 동일한 종점들을 평가하였는데, 이는 이러한 세포주가 세포내 웨스턴 분석법에 적절하지 않기 때문이었다. DiFi 세포에서, 클론 679F09는 1.8 μM 내지 5.3 μM 사이의 IC50으로 EGF-자극 AKT 인산화를 차단하였고, 5.3 μM의 IC50으로 EGF-자극 총 EGFR 인산화를 차단하였으며, 1.49 μM의 IC50으로 타이로신 1068 상에서의 EGF-자극 EGFR 인산화를 차단하였고, 4.4 μM을 초과하는 IC50으로 EGF-자극 ERK 인산화를 차단하였다.
실시예 11. 에피토프 지도작성
세포내 웨스턴 (ICW) 분석법을 사용하여, EGFR 클론이 EGFR 세포외 도메인 상의 공지된 에피토프에 대한 또다른 EGFR 항체의 결합을 방해할 수 있는지 여부를 결정하였다. 결합 영역이 규정된 항체들의 패널이 조립되었다 (표 2). EGFR 클론을 A431 세포와 함께 인큐베이션하고, 미결합 단백질을 세정하여 제거하고, 결합된 단백질을 BS3으로 수용체에 가교시켰다. 세포를 고정하고, 결합 부위가 공지된 항체로 프로빙하였다. EGFR 클론이 항체와 공통된 에피토프를 공유하면, EGFR에 대한 클론의 결합이 항체에 의한 결합을 방지하거나 감소시킨다.
표 2는 EGFR 결합 클론 679F09, 뿐만 아니라 항-EGFR 항체 세툭시맵 및 판니투무맵과의 경쟁 결합 연구의 결과를 나타낸다.
Figure pct00003
항체를 1:100 희석하고, 약한 결합제는 1:50 희석할 수 있다. a[JBC264(1989)17469] Ala351 - Asp364, b[J Immunological Methods 287(2004)147], c[Mol Biol Med1(1983)511], d마우스 EGFR에 대한 펩티드에 대해 생성됨, e[Int J Oncol4(1994)277]. C-세툭시맵; P-판니투무맵.
실시예 12. 클론들의 재최적화
보관 동안 단백질에 대해 통상적으로 나타나는 분해 프로세스들 중 하나는 메티오닌 또는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 트립토판, 타이로신, 또는 히스티딘의 산화이다. 출발 클론의 생물학적 활성 및 생물리학적 성질의 원하는 성질을 유지하지만, 루프 내의 바람직하지 않은 메티오닌 잔기(들) (존재하는 경우)에서 치환된 클론을 선별하기 위해 최적화를 수행할 수 있었다. 루프 내의 임의의 트립토판, 타이로신, 히스티딘 잔기가 산화 손상 경향이 있는 것으로 확인된 경우 동일한 접근법을 사용하였다.
실시예 13. 재최적화 유도체에 대한 직접 결합 분석법
직접 결합 분석법을 사용하여 재최적화 유도체를 EGFR에의 강화된 결합에 대해 스크리닝하였다. 단일 지점 분석법에서 결합을 나타내는 클론들을 클론 농도의 구배를 사용하여 추가로 분석하였다.
실시예 14. 재최적화 EGFR 경쟁적 클론의 용액 성질의 검사
재최적화 EGFR 경쟁적 클론에 대한 HTPP 물질의 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)는 전형적으로 단량체성 거동을 드러냈고, 이는 더 높은 단백질 농도에서, 최적화된 클론이 응집하는 경향이 없다는 것을 가리킨다.
실시예 15. 재최적화 EGFR 경쟁적 클론의 결합 친화력 및 동역학의 결정
선별된 FG 루프 최적화 EGFR 경쟁적 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. 결합 동역학 및 결합 친화력을 결정하기 위해, 고정된 재조합 EGFR 및 용액-상 클론을 사용하여 비아코어 분석을 수행하였다. 전형적으로, 결합 친화력은 클론들에 대해 2자리 내지 3자리 수 pM 범위일 수 있었다.
실시예 16. 재최적화 EGFR 경쟁적 클론의 또다른 HER-패밀리 구성원에 대한 결합의 결정
선별된 FG 루프 최적화 EGFR 경쟁적 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. EGFR 경쟁적 클론이 실제로 EGFR에 대해 특이적이라는 것을 확실히 하기 위해, 이들을 비아코어 방법론을 사용하여 또다른 HER 수용체 또는 또다른 관련되지 않은 수용체에 대해 고농도에서 평가하였다. 전형적으로, 대다수의 클론들은 이러한 고농도에서 또다른 EGFR 패밀리 구성원 또는 또다른 관련되지 않은 수용체에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았고, 이는 이러한 클론들이 실제로 EGFR에 대해 특이적이라는 것을 가리켰다.
실시예 17. EGFR에 대한 재최적화 클론의 열 안정성의 검사
선별된 재최적화 EGFR 경쟁적 클론의 1 ℓ 대장균 성장물을 제조하고, 단백질을 정제하였다. 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 수행하여, 개별적인 클론들의 융점 Tm 또는 언폴딩의 에너지학을 특성화하였다.
실시예 18. Fn3 도메인의 PEG화
약동학 성질을 강화하기 위해 Fn3 도메인의 PEG화를 수행하였다. 대장균 발현 시스템에서 C-말단 시스테인 치환이 있는 최적화 클론이 생산되었다.
서열 235를 시스테인 잔기가 없는 클론의 N-말단에 연결하였다. 표준 말레이미드 화학을 사용하여 PEG 변이체에 커플링시키는데 서열 235로부터의 시스테인 잔기의 단일 설프하이드릴이 사용되어, 2개의 상이한 PEG화 형태가 산출되었다. 선형 20 kDa 2관능성 PEG 및 단일관능성 분지형 40 kDa PEG (NOF Corporation) 양쪽 모두가 클론에 접합되었다. PEG화 형태의 단백질을 미반응 단백질 및 PEG로부터 이온 교환 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 다각 레이저 광 산란과 커플링된 SDS-PAGE, 질량 분광법 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 2개의 PEG 형태의 공유결합 연결이 확인되었다.
실시예 19. PEG화 Fn3 도메인 클론 변이체의 결합 친화력 및 동역학의 결정
PEG화 변이체의 결합 동역학 및 결합 친화력을 결정하기 위해, 항-인간 항체 표면 상에 포획된 재조합 EGFR-Fc 및 용액-상 분석물 (PEG화 클론)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (Biacore) 분석을 수행하였다.
실시예 20. EGFR-의존적 세포주에서의 항증식 활성에 대한 EGFR 결합 클론의 평가
성장을 위해 EGFR 신호전달에 의존하는 DiFi 결장 암종 세포주에서 항증식 활성에 대해 클론들을 평가하였다. 1차 스크린을 10 μM 및 1 μM에서 이중으로 수행하여, 활성 클론을 확인하였다. 활성 클론은 양쪽 농도에서 50％를 초과하는 억제를 나타냈고, 바람직하게는 용량 응답을 나타냈다. 8가지 농도의 단계 희석물을 삼중으로 테스트함으로써 IC50을 결정하면서 활성 클론을 추적하였다. 주요 분석 방법은 새롭게 합성된 DNA 내로의 3H-티미딘 혼입을 측정하였지만, 때때로 수용성 테트라졸륨 염의 유색 부산물로의 전환을 측정하는 대사 검출 분석법이 또한 사용되었다. 분석법 성능 및 재현성을 입증하기 위해 표준 화합물이 각각의 실험에 포함되었다.
DiFi 세포에서의 3H-티미딘 혼입 분석법을 사용했을 때, 클론 679F09는 한 실험에서는 증식을 다소 억제하였지만, 별도의 2회의 실험에서는 증식을 억제하는데 실패하였다.
실시예 21. PEG화 EGFR/IGF-IR 이중특이적 분자의 생성
EGFR 및 IGF-IR 양쪽 모두에 대해 지시된 이중특이적 분자가 2관능성 PEG 분자를 사용하여 각각의 표적에 대해 특이적인 피브로넥틴-기반 스캐폴드 도메인 클론들을 함께 연결시킴으로써 생성되었다. 2관능성 PEG가 말레이미드 화학을 통해 2개의 클론을 연결할 수 있도록 각각의 클론의 C-말단에서 시스테인 잔기가 치환되었다.
본 실시예에서, 서열 203에 제시된 IGF-IR 결합 클론 및 서열 231에 제시된 EGFR 결합 클론이 사용되었다. 2가지 접근법 중 하나를 사용하여 적합한 이중특이적 분자가 생성되었다. EGFR 클론, IGF-IR 클론 및 말레이미드-PEG-X-kDa-말레이미드의 등몰 혼합물을 적합한 기간 동안 혼합하고, 생성물을 pI에서의 차이를 기초로 2개의 단리된 클론의 분리에 대해 최적인 pH 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이러한 분리로부터의 이론적인 생성물 및 이들의 비율은 단일특이적 EGFR 1부, 단일특이적 IGF-IR 1부, 및 이중특이적 EGFR/IGF-IR 2부였다. 2번째 접근법은 PEG-링커에 대한 종의 순차적인 부가를 기초로 한다. 과량의 링커, 예를 들어 10배 과량을 종들 중 하나에 첨가하고, 반응을 완료될 때까지 진행시켰다. PEG화 단일-종을 PEG-연결 동종이량체 및 미반응 PEG-링커로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 회수하였다. 그후, 단리된 PEG화 단일-종을 등몰량의 또다른 클론 종과 반응시켜, 이중특이적 분자가 생성되었다.
실시예 22. PEG화 EGFR/VEGFR2 이중특이적 분자의 생성
EGFR 및 VEGFR2 양쪽 모두에 대해 지시된 이중특이적 분자가 2관능성 PEG 분자를 사용하여 각각의 표적에 대해 특이적인 피브로넥틴-기반 스캐폴드 도메인 클론들을 함께 연결시킴으로써 생성되었다. 2관능성 PEG가 말레이미드 화학을 통해 2개의 클론을 연결할 수 있도록 각각의 클론의 C-말단에서 시스테인 잔기가 치환되었다.
본 실시예에서, 서열 128에 제시된 VEGFR2 결합 클론 및 서열 231에 제시된 EGFR 결합 클론이 사용되었다. 2가지 접근법 중 하나를 사용하여 적합한 이중특이적 분자가 생성되었다. EGFR 클론, VEGFR2 클론 및 말레이미드-PEG-X-kDa-말레이미드의 등몰 혼합물을 적합한 기간 동안 혼합하고, 생성물을 pI에서의 차이를 기초로 2개의 단리된 클론의 분리에 대해 최적인 pH 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이러한 분리로부터의 이론적인 생성물 및 이들의 비율은 단일특이적 EGFR 1부, 단일특이적 VEGFR2 1부, 및 이중특이적 EGFR/VEGFR2 2부였다. 2번째 접근법은 PEG-링커에 대한 종의 순차적인 부가를 기초로 한다. 과량의 링커, 예를 들어 10배 과량을 종들 중 하나에 첨가하고, 반응을 완료될 때까지 진행시켰다. PEG화 단일-종을 PEG-연결 동종이량체 및 미반응 PEG-링커로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 회수하였다. 그후, 단리된 PEG화 단일-종을 등몰량의 또다른 클론 종과 반응시켜, 이중특이적 분자가 생성되었다.
실시예 23. PEG화 EGFR/EGFR 이중특이적 분자의 생성
EGFR에 대해 지시된 2도메인 분자가 2관능성 PEG 분자를 사용하여 EGFR에 대해 특이적인 피브로넥틴-기반 스캐폴드 도메인 클론들을 함께 연결시킴으로써 생성되었다. 2관능성 PEG가 말레이미드 화학을 통해 2개의 클론을 연결할 수 있도록 각각의 클론의 C-말단에서 시스테인 잔기가 치환되었다.
본 실시예에서, 서열 231에 제시된 EGFR 결합 클론이 사용되었다. 2:1 비율의 EGFR 클론 및 말레이미드-PEG-X-kDa-말레이미드를 적합한 기간 동안 혼합하고, 생성물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이러한 분리로부터의 이론적인 생성물 및 이들의 비율은 단일특이적 EGFR 2부, 및 EGFR/EGFR 2부였다.
실시예 24. 폴리펩티드-연결 EGFR/IGF-IR 이중특이적 분자의 생성
EGFR 및 IGF-IR 양쪽 모두에 대해 지시된 이중특이적 분자가 폴리펩티드 링커를 통해 2개의 클론을 연결시킴으로써 생성되었다. N-말단 클론 대 C-말단 클론에 관한 2개의 클론의 배향은 임의적이지만, 본 실시예에서는 EGFR 클론이 N-말단 위치에 있었다. 본 실시예에서, 서열 215에 제시된 EGFR 결합 클론 및 서열 236에 제시된 IGF-IR 결합 클론이 사용되었다.
따라서, 본 실시예에서의 DNA 구축물은 EGFR 결합 클론-폴리펩티드 링커-IGFR 결합 클론이었다. 이를 대장균에서 발현시키고, 평소대로 봉입체로부터 또는 가용성 분획으로부터 정제하였다.
실시예 25. 폴리펩티드-연결 EGFR/VEGFR2 이중특이적 분자의 생성
EGFR 및 VEGFR2 양쪽 모두에 대해 지시된 이중특이적 분자가 폴리펩티드 링커를 통해 2개의 클론을 연결시킴으로써 생성되었다. N-말단 클론 대 C-말단 클론에 관한 2개의 클론의 배향은 임의적이지만, 본 실시예에서는 EGFR 클론이 N-말단 위치에 있었다. 본 실시예에서, 서열 215에 제시된 EGFR 결합 클론 및 서열 129에 제시된 VEGFR2 결합 클론이 사용되었다.
따라서, 본 실시예에서의 DNA 구축물은 EGFR 결합 클론-폴리펩티드 링커-VEGFR2 결합 클론이었다. 이를 대장균에서 발현시키고, 평소대로 봉입체로부터 또는 가용성 분획으로부터 정제하였다.
실시예 28. 폴리펩티드-연결 EGFR/EGFR 이중특이적 분자의 생성
EGFR에 대해 지시된 2도메인 분자가 폴리펩티드 링커를 통해 2개의 클론을 연결시킴으로써 생성되었다. 본 실시예에서, 서열 215에 제시된 EGFR 결합 클론이 사용되었다. 따라서, 본 실시예에서의 DNA 구축물은 EGFR 결합 클론-폴리펩티드 링커-EGFR 결합 클론이었다. 이를 대장균에서 발현시키고, 평소대로 봉입체로부터 또는 가용성 분획으로부터 정제하였다.
본원에서 사용된 물질 및 방법
하기의 물질 및 방법이 실시예에서 기술된 실험에 사용되었다.
재조합 단백질:
Fc 융합물로서의 인간 EGFR의 엑토도메인으로 구성된 EGFR-Fc (R&D Systems (Minneapolis, MN))를 구입하였고, 이는 비아코어(Biacore)에 의해 EGF 결합에 대해 기능성인 것으로 나타났다. 인간 EGFR 세포외 도메인의 처음 525개의 아미노산을 인간 IgG1의 힌지 및 불변 영역으로 구성된 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드의 일시적인 형질감염으로 융합 단백질 EGFR 525-Fc가 생산되었고, 이어서 이를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 전장 엑토도메인 융합물에 대해 수행된 바와 같이 유사한 비아코어 분석법을 사용하여 이러한 단백질이 EGF에 결합할 수 있는 것으로 나타났다.
프라이머:
라이브러리 구축 및 선별된 클론의 돌연변이유발에서 궁극적으로 사용하기 위해 화학적 합성에 의해 하기의 올리고뉴클레오티드들이 제조되었다.
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Figure pct00006
1차 라이브러리 구축:
KOD 중합효소 (EMD Biosciences (San Diego, CA))를 사용하여, 상기 열거된 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드들의 확장에 의해 다양한 라이브러리를 구축하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드 명칭에서, "N"은 A, C, G 및 T의 혼합물을 가리키고; "V"는 A, C 및 G의 혼합물을 가리키며, "H"는 A, C 및 T의 혼합물을 가리키고, "S"는 C 및 G의 혼합물을 가리킨다. 루프 정의는 기존에 기술된 것들과 동일하다 ([Xu et al, 2002]). 1 M 베타인 및 3％ DMSO가 보충된 100 ㎕ KOD 반응물에서 50 pmol FnBC와 100 pmol FnCD의 확장에 의해 BC 루프가 구축되었다. 단편들의 완전한 확장을 확실히 하기 위해 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 68℃에서 1분의 온도 사이클 10회를 통해 반응시켰다. DE 루프에 대해서는 200 pmol FnDE와 100 pmol FnEF를, FG 루프에 대해서는 100 pmol FnFG10과 200 pmol FnG를 사용하여 DE 및 FG 루프가 유사한 방식으로 구축되었다. 3개의 개별적인 루프의 확장 후, DE 및 FG 루프를 조합하고, 추가적인 10회의 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 68℃에서 1분의 온도 사이클 동안 함께 확장시켰다. 유사한 방식으로 BC 루프가 100 pmol FnAB와 함께 확장되었다. DE/FG 혼합물 및 BC 루프를 신선한 KOD 시약으로 각각 10배 희석하고, 각각 FLAG 및 T7TMV로 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 68℃에서 1분의 온도 사이클 10회 동안 확장시켰다. 마지막으로, 단편들을 조합하고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 68℃에서 1분의 온도 사이클 10회 동안 함께 확장시켰다. 이에 의해, BC 루프 내의 7개의 무작위 아미노산, DE 루프 내의 4개의 무작위 아미노산, 및 FG 루프 내의 10개의 무작위 아미노산이 있는 라이브러리가 생산되었다. FnFG10 대신 올리고뉴클레오티드 FnFG6, FnFG8, FnFG12 또는 FnFG14를 사용함으로써 상이한 FG 루프 길이의 추가적인 라이브러리들이 구축되었다. 아미노산 6개 내지 14개 사이의 FG 루프 길이를 함유하는 라이브러리들을 조합하여, "NNS" 라이브러리가 제공되었다.
올리고뉴클레오티드 FnBC, FnDE 및 FnFG가 각각 FnBC (삼량체), FnDE (삼량체) 및 FnFG (삼량체)로 교체된 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여 "NVH" 및 "WFC" 라이브러리가 제조되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드들에서, X는 "NVH" 라이브러리에 대한 13개의 아미노산 (Lys, Asn, Thr, Gln, His, Pro, Arg, Glu, Asp, Ala, Gly, Tyr, Ser) 또는 "WFC" 라이브러리에 대한 17개의 아미노산 (Lys, Asn, Thr, Gln, His, Pro, Arg, Glu, Asp, Ala, Gly, Tyr, Ser, Leu, Ile, Met, Val)을 코딩하는 삼량체 포스포르아미디트의 혼합물 (Glen Research (Sterling, VA))을 표시한다.
RNA-단백질 융합물 생산:
본질적으로 기술된 바와 같이 이중-가닥 DNA 라이브러리를 RNA-단백질 융합물로 전환시켰다 (프로퓨전™) ([Xu et al, 2002, Kurz et al, Nuc. Acid Res. 28:83, 2000]). 간략하게, DNA 라이브러리를 시험관내 전사 키트 (MEGAscript™, Ambion (Austin, Tex))를 사용하여 전사시키고, 생성된 RNA를 NAP-5 칼럼 (GE Healthcare) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시켰다. 2 nmol RNA를 150 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl (pH 8) 및 1.5배 과량의 푸로마이신-함유 링커 (5'-Pso u agc gga ugc XXX XXX CC Pu-3' (Pu = 푸로마이신, Pso = C6-솔라렌, u, a, g, c = 2'-OMe-RNA, X=9-원자 PEG 스페이서))를 함유하는 200 ㎕의 용액 내에서 20분 동안 314 nM의 방사선조사에 의해 가교시켰다.
그후, mRNA-푸로마이신 분자를 3 ㎖ 토끼 세망세포 용해물 (Ambion (Austin, Tex))에서 번역시켰다. 생성된 mRNA-단백질 융합물을 올리고 dT 셀룰로스 (GE Healthcare)를 사용하여 정제하고, 제조사의 설명서에 따라 2 nmol의 프라이머 FLAG 및 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Invitrogen)를 사용하여 역전사시켰다.
cDNA/mRNA-단백질 융합물을 M2 플래그(Flag) 아가로스 (Sigma (St Louis, MO))에 의해 정제하고, PCR에 의해 정량하였다. 이로써 약 1012개의 전장 클론의 정제된 라이브러리가 제공되었고, 이를 후속 프로퓨전™ 실험에서의 사용을 위해 프라이머 T7TMV 및 FLAG를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다.
EGFR에의 결합에 대한 친화력 선별:
인간 IgG (Sigma)를 단백질 G-코팅 자기 비드 (Invitrogen) 상에 코팅하여, 음성 선별 매트릭스를 생산하였다. RNA-단백질 융합물 라이브러리를 음성 선별 매트릭스와 혼합하여, 단백질 G 또는 표적의 Fc 영역에 결합하는 클론을 제거하였다. 자석 상에서 비드를 분리하고, 결합되지 않은 분획을 수집하고, 0.05％ 트윈(Tween) 20 및 1 ㎎/㎖ BSA (Ambion)가 있는 PBS 내의 100 nM EGFR-Fc에 첨가하였다. 30분 후, 결합된 단백질을 단백질 G-코팅 자기 비드 상에서 포획하고, 킹피셔(Kingfisher) 자기 입자 프로세서 (Thermo Electron (Waltham, MA))를 사용하여 6회 세정하였다. cDNA를 100 mM KOH에서 용출시키고, 100 mM 트리스-HCl로 중화하고, PCR에 의해 증폭시켜, EGFR에 결합한 분자가 강화된 제2세대 라이브러리를 생성시켰다. 증폭, RNA-단백질 융합물의 합성 및 친화력 선별의 연속적인 공정을 총 5회 수행하고, 결합된 분자를 PCR로 정량하였다. 라운드 4 및 5 후에 수득된 결합 집단을 증폭하고, T7 RNA 중합효소용 프로모터 및 인-프레임(in-frame) His6 태그를 함유하는 대장균 발현 벡터 내로 재조합 (InFusion™, Clontech (Mountain View, CA))에 의해 결찰시켰다. 결찰된 혼합물을 IPTG로의 유도 시 T7 RNA 중합효소를 발현함으로써 유도성 단백질 발현을 제공하는 대장균 균주 BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) 내로 형질전환시켰다.
클론 679F09로부터의 단일 루프 무작위화 라이브러리의 구축
단일 루프들이 무작위 서열로 교체된 3개의 라이브러리를 구축하였다. 3개의 루프 중 2개 내의 무작위 서열이 클론 679F09에 상응하는 고정된 서열로 교체되는 것을 제외하고는, 상기 기술된 바와 같이 KOD 중합효소로의 중첩 확장에 의해 DNA 수준에서 라이브러리를 구축하였다. BC 루프에서는 올리고뉴클레오티드 679F09BC에 의해, DE 루프에서는 올리고뉴클레오티드 679F09DE에 의해, FG 루프에서는 올리고뉴클레오티드 679F09FG에 의해 고정된 서열이 제공되었다. 이로써 라이브러리 구축 동안 상응하는 무작위 올리고뉴클레오티드 FnBC, FnDE, 또는 FnFG10이 교체되었다. 위치 XX의 무작위화는 FnCD 대신 프라이머 FnCD', 그리고 FnBC 대신 FnBC8의 사용을 필요로 하였다. 또한, "NVH" 코돈의 사용은 라이브러리로부터 소수성 아미노산을 제거하였다.
클론 679F09로부터의 BC 루프가 무작위 아미노산에 의해 제거된 라이브러리가 상기 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 T7TMV + FnAB + FnBC8 + FnCD' + 679F09DE + FnEF + 679F09FG + FnG + FLAG의 어셈블리에 의해 제조되었다. 클론 679F09로부터의 DE 루프가 무작위 아미노산에 의해 제거된 라이브러리가 올리고뉴클레오티드 T7TMV + FnAB + 679F09BC + FnCD' + FnDE (삼량체) + FnEF + 679F09FG + FnG + FLAG의 어셈블리에 의해 제조되었다. 클론 679F09로부터의 FG 루프가 무작위 아미노산에 의해 제거된 라이브러리가 올리고뉴클레오티드 T7TMV + FnAB + 669F09BC + FnCD' + 679F09 + FnEF + FnFG10 (삼량체) + FnG + FLAG의 어셈블리에 의해 제조되었다.
클론 679F09로부터의 3-루프 무작위화 라이브러리의 구축
클론 679F09로부터 유래된 3개의 단일 루프 라이브러리를 상기 기술된 바와 같은 프로퓨전™ 선별에 적용하였다. 각각의 라이브러리 내의 생존 클론은 어버이 클론으로부터의 2개의 루프 및 각각의 클론의 결합과 상용성인 무작위 서열로부터의 1개의 루프를 함유하였다. 각각의 라이브러리로부터 1개씩의 3개의 무작위 루프를 주변의 스캐폴드 영역에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 FnB 및 FnCD'를 사용하여 가변성 BC 루프를 함유하는 라이브러리로부터 BC 루프가 증폭되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 FnD 및 FnEF를 사용하여 가변성 DE 루프를 함유하는 라이브러리로부터 DE 루프가 증폭되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 FnF 및 FnG를 사용하여 가변성 FG 루프를 함유하는 라이브러리로부터 FG 루프가 증폭되었다. 3개의 절제된 루프를 아가로스 젤 전기영동에 의해 정제하고, 동일한 비율로 혼합하고, 프라이머 FnAB 및 FnG에 이어서 T7TMV 및 FLAG로 KOD 중합효소에 의해 증폭시켰다.
3개의 무작위 루프를 함유하는 클론의 최적화:
상기 기술된 바와 같이 증폭, RNA-단백질 융합물의 합성 및 친화력 선별의 사이클을 통해 3-루프 무작위화 라이브러리를 취득하였다. 감소되는 농도로 EGFR-Fc를 사용하여 친화력이 가장 높은 결합제를 선별하였다. 4회의 라운드 후, 생성된 단백질 집단을 상기 기술된 바와 같이 분석을 위해 대장균 내로 클로닝하였다.
EGFR에 대한 직접 결합 ELISA
상기 선별로부터 생성된 단백질 집단을 His6 태그가 부착된 단백질로서 대장균에서 발현시켰다. 직접 결합 ELISA는 1-2시간 동안 카세인 차단 완충제 (Pierce (Rockford, IL))로 차단된 항-His 모노클로날 항체 플레이트 (EMD Biosciences (San Diego, CA))에 His6 태그가 부착된 클론이 지향성으로(oriented) 포획되는 것에 의존한다. 전형적으로, HTPP 물질 (0.2-2 ㎍)의 1:50 희석물이 1시간 동안 포획된 후, 50 nM의 EGFR-Fc 표적과의 인큐베이션이 이어진다. 결합된 EGFR-Fc를 항-인간 HRP와의 인큐베이션에 의해 검출한다. 결합된 HRP 접합체를 제조사의 설명서에 따라 비색 기질 TMB (BD Biosciences (San Jose, CA))를 사용하여 검출하였다.
세포-기반 경쟁적 리간드 결합 분석법
상기 선별로부터 생성된 클론을 세포-기반 경쟁적 리간드 결합 분석법에서 분석하여, 클론이 세포 표면 상에 위치하는 EGFR에의 결합에 대해 천연 리간드인 EGF와 경쟁하는지 여부를 결정하였다. 다수의 EGFR을 세포 표면 상에 발현하는 인간 상피 암종 세포인 클론 A431을 96웰 조직 배양 플레이트 내로 플레이팅하고, 48시간 동안 부착되도록 하였다. 세포를 무혈청 배지로 세정하고, 선별된 클론의 희석물을 세포와 함께 15분 동안 37℃, 5％ CO2에서 습식 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션은 클론이 세포 표면 상의 EGFR에 결합하도록 하였다. 그후, 최종 농도 10 nM의 유로퓸으로 표지된 EGF (Eu-EGF)를 세포에 첨가하고, 추가로 3시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 저온 PBS로 세정하여 미결합 클론 및 Eu-EGF를 제거하고, 50 ㎕의 강화 용액 (Perkin Elmer)을 세포에 첨가하고, 45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 단계에서, EGF 리간드로부터 유로퓸 표지가 해리되어 형광 신호가 생산되었고, 이를 시간 분해 형광에 의해 측정하였다. 신호의 강도가 세포 표면에 결합된 Eu-EGF의 양과 상관되었다. 신호 강도에서의 용량 응답 감소는 소정의 클론이 EGFR에의 결합에 대해 유로퓸으로 표지된 천연 EGF 리간드와 경쟁한다는 것을 가리켰다.
고처리량 단백질 생산 (HTPP):
pDEST-14 벡터 내로 클로닝되고 대장균 BL21 (DE3) pLysS 세포 내로 형질전환된 선별된 결합제를 24웰 포맷으로 50 ㎍/㎖ 카르베니실린 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 5 ㎖ LB 배지에 접종하고, 37℃에서 철야 배양하였다. 철야 배양물로부터 200 ㎕를 흡인하고 이를 적합한 웰 내로 배분함으로써 유도성 발현용으로 신선한 5 ㎖ LB 배지 (50 ㎍/㎖ 카르베니실린 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜) 배양물을 제조하였다. 배양물을 A600 0.6-1.0까지 37℃에서 성장시켰다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)로의 유도 후, 배양물을 추가로 4시간 동안 30℃에서 성장시키고, 4℃에서 30분 동안의 3220 g에서의 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다.
세포 펠렛 (24웰 포맷)을 450 ㎕의 용해 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1× 컴플리트(Complete)™ 프로티에이스 억제제 칵테일-EDTA 프리(free) (Roche), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, 1 ㎎/㎖ 라이소자임, 30 ㎍/㎖ DNAse, 2 ㎍/㎖ 아프로토닌, pH 8.0)에서의 재현탁에 의해 용해시키고 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 용해물을 정화하고, 96웰, 650 ㎕ 포착 플레이트가 장착된 96웰 와트만(Whatman) GF/D 유니필터(Unifilter) 내로 전달함으로써 96웰 포맷으로 재배치(re-racking)하고, 200g에서 5분 동안 원심분리하였다. 정화된 용해물을 평형 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 평형화된 96웰 Ni-킬레이팅 플레이트로 옮기고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 미결합 물질을 진공에 의해 제거하였다. 수지를 세정 완충제 #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 2×0.3 ㎖/웰로 세정하고, 각각의 세정액을 진공에 의해 제거하였다. 이어서, 수지를 PBS로 3×0.3 ㎖/웰로 세정하고, 각각의 세정 단계를 진공에 의해 제거하였다. 용출 전에, 각각의 웰을 50 ㎕ 용출 완충제 (PBS + 20 mM EDTA)로 세정하고, 5분 동안 인큐베이션하고, 이러한 세정액을 진공에 의해 폐기하였다. 추가적인 100 ㎕의 용출 완충제를 각각의 웰에 적용함으로써 단백질을 용출시켰다. 실온에서의 30분 인큐베이션 후, 플레이트(들)을 5분 동안 200 g에서 원심분리하고, 용출된 단백질을 Ni-플레이트의 바닥에 고정된 5 ㎕의 0.5 M MgCl2를 함유하는 96웰 포착 플레이트에서 수집하였다. 용출된 단백질을 라이소자임을 단백질 표준물로 하는 BCA 분석법을 사용하여 정량하였다.
가용성 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 결합제의 미드스케일 발현 및 정제:
발현을 위해, His6 태그가 이어지는 선별된 클론(들)을 pET9d (EMD Biosciences (San Diego, CA)) 벡터 내로 클로닝하고, 대장균 BL21 (DE3) pLysS 세포에서 발현시켰다. 20 ㎖의 접종원 배양물 (단일 플레이팅 콜로니로부터 생성됨)을 사용하여, 50 ㎍/㎖ 카르베니실린 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 1 ℓ의 LB 배지에 접종하였다. 배양물을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 성장시켰다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토사이드 (IPTG)로의 유도 후, 배양물을 4시간 동안 30℃에서 성장시키고, 4℃에서 30분 동안의 ≥ 10,000 g에서의 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 울트라-투락스(Ultra-turrax) 균질화기 (IKA works)를 사용하여 25 ㎖의 용해 완충제 (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1×컴플리트™ 프로티에이스 억제제 칵테일-EDTA 프리 (Roche), 1 mM PMSF, pH 7.4)에 재현탁시켰다. 모델 M-110S 미세유동화기(Microfluidizer) (Microfluidics)를 사용하여 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 세포 용해가 달성되었다. 가용성 분획을 4℃에서 30분 동안 23,300 g에서의 원심분리에 의해 분리하였다. 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 정화하였다. 정화된 용해물을 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4로 예비-평형화된 히스트랩(HisTrap) 칼럼 (GE) 상에 로딩하였다. 그후, 칼럼을 25 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4, 이어서 20 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 25 mM 이미다졸 pH 7.4, 이어서 35 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM 이미다졸 pH 7.4로 세정하였다. 단백질을 15 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸 pH 7.4로 용출시키고, 분획을 A280에서의 흡광도를 기초로 풀링하고, 1× PBS, 50 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 8.5 또는 50 mM NaOAc; 150 mM NaCl; pH4.5에 대해 투석하였다. 0.22 ㎛에서의 여과에 의해 임의의 침전물을 제거하였다.
EGFR 결합 클론의 PEG화
말레이미드 화학을 통해 클론의 C-버전에 대해 2배 과량의 PEG-40-kDa (NOF Corporation)를 사용함으로써 EGFR 결합 클론-PEG40 분자가 제조되었다. 실온에서 2.5시간 동안 반응을 진행시켰다. 양이온 교환 크로마토그래피 (SP-HiTrap; GE)에 의해 클론-PEG-40으로부터 유리 PEG-40이 분리되었다. 반응 혼합물을 20 mM NaH2PO4, pH 6.7으로 1:10 희석하고, 평형 완충제 (20 mM NaH2PO4, 10 mM NaCl, pH 6.7)로 예비-평형화된 SP-하이트랩(HiTrap) 칼럼에 적용하고, 평형 완충제로 세정하고, 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 6.7로 용출시켰다. 용출된 분획들을 SDS-PAGE 분석을 기초로 풀링하였다. SP-풀링 용출물을 G25 크로마토그래피 (GE)를 통해 PBS 내로 완충제 교환하였다.
말레이미드 화학을 통해 PEG-20-kDa (NOF Corporation)에 대해 2배 과량의 정제된 클론-C를 사용함으로써 PEG20-EGFR 결합 클론-PEG20이 제조되었다. 실온에서 1시간 동안 반응을 진행시켰다. 20 mM NaH2PO4, 10 mM NaCl, pH 6.7 완충제에서의 SEC 크로마토그래피 (Superose 6; GE)에 의해 PEG20-클론-PEG20으로부터 PEG화되지 않은 단백질이 분리되었다. PEG20-클론-PEG20을 함유하는 분획들을 풀링하고, 추가로 정제하여, 모노-PEG화 클론을 제거하였다. 이는 양이온 교환 크로마토그래피 (SP; GE)에 의해 달성되었다. SP-하이트랩 칼럼을 완충제 A (20 mM NaH2PO4, 10 mM NaCl, pH 6.7)로 예비-평형화시키고, SEC 용출물을 적용한 후, 칼럼을 완충제 A로 세정하고, 5 칼럼 부피에 걸친, 그리고 추가로 5 칼럼 부피에 대해 유지된 0-10％ 완충제 B (20 mM NaH2PO4, 1.0 M NaCl, pH 6.7)를 러닝(running)시켰다. 50％ 완충제 B로 용출시킴으로써 PEG20-클론-PEG20을 SP-칼럼으로부터 용출시켰다. A280에 의해 분획들을 풀링하고, G25 크로마토그래피 (GE)에 의해 PBS 내로 완충제 교환하였다.
가용성 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질의 비아코어 분석:
비아코어 3000 또는 T100 바이오센서 (GE Healthcare (Piscataway, NJ))를 사용하여 표적에 대한 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 결합 단백질의 결합 동역학을 측정하였다. 항-인간 항체 (GE Healthcare (Piscataway, NJ))를 제조사의 설명서에 따라 바이오센서 CM5 칩의 유동 세포 1 및 2 (Fc1 및 Fc2) 상에 직접 고정시켰다. 동역학 분석은 Fc2 상의 항-인간 IgG에 대한 EGFR-Fc (R&D Systems (Minneapolis, MN)) 또는 사내에서 생성된 말단절단 EGFR 525-Fc의 포획에 이어서, Fc1 및 Fc2 상에 용액 내의 클론을 주입하는 것을 수반하였다. 3M MgCl2의 2회의 연속적인 주입에 의해 항-인간 항체 표면이 재생되었다. 각각의 농도에서 센소그램(Sensorgram)을 수득하였고, 제조사의 프로그램인 비아이밸류에이션(Biaevaluation) 또는 비아코어 T100 소프트웨어를 사용하여 평가하여, 속도 상수 ka (kon) 및 kd (koff)를 결정하였다. 속도 상수의 비율 koff/kon으로부터 해리 상수 KD를 계산하였다. 전형적으로, 러닝 완충제 HBS-EP (10 mM 헤페스(Hepes), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05％ 계면활성제 P20) 내에 희석된 일련의 농도 (0 μM 내지 2 μM)의 정제된 클론을 항-인간 IgG로 포획된 인간 EGFR-Fc 융합 단백질에의 결합에 대해 평가하였다.
또다른 관련된 패밀리 구성원 예컨대 HER2 또는 HER3에 결합하는 것을 결정하는 실험을 위해, 재조합 엑토도메인-Fc 융합물을 상기 기술된 바와 같이 항-인간 IgG 항체를 사용하여 포획하였다. 블랭크(blank) 기준 유동 세포 1에 대해 관찰된 결합을 차감함으로써 인간 EGFR, 또는 또다른 관련된 패밀리 구성원 예컨대 HER2 또는 HER3에의 특이적 결합을 계산하였다. 관련되지 않은 수용체인 VEGFR2-Fc가 추가적인 비-특이적 결합 기준물로서의 기능을 하였다. EGFR 결합 클론을 HBS-EP (10 mM 헤페스, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05％ 계면활성제 P20)에서 10 μM로 희석하고, 25℃에서 20 ㎕/분으로 5분 동안 유동 세포 상에 주입하고, 10분에 걸쳐 해리를 관찰하였다.
시차 주사 열량측정법:
미드스케일 클론의 시차 주사 열량측정법 (DSC) 분석을 수행하여, 열 안정성을 결정하였다. 적합한 클론의 1 ㎎/㎖ 용액을 3 atm 압력 하에 1℃/분의 속도로 온도를 5℃에서 95℃로 상승시킴으로써 N-DSC II 열량계 (Calorimetry Sciences Corp)에서 스캐닝하였다. 오진(Orgin) 소프트웨어 (OrginLab Corp)를 사용하는 베스트-핏(best fit)을 사용하여 적합한 완충제의 대조군 실행과 비교하여 데이터를 분석하였다.
크기 배제 크로마토그래피:
A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 = 280 nm, 방출 = 350 nm)로 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템 상의 4.6 mm × 30 cm의 TSKgel Super SW2000 칼럼 (TOSOH Biosciences, LLC)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 유속 100 ㎕/분의 100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 6.8의 완충제가 사용되었다. 약 100 ㎍/㎖ 농도의 샘플 (각각 0.1 내지 1 ㎍)을 따로 주입하였다. 젤 여과 표준물 (Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA))을 분자량 검정에 사용하였다.
클론의 SEC MALLS 분석:
100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨 pH 6.8의 이동상을 유속 0.6 ㎖/분으로 적용하여, 수퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 워터스(Waters) 2487 UV 검출기가 장착된 워터스 브리즈(Breeze) HPLC 시스템 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 샘플을 이동상으로 약 1.0 ㎎/㎖으로 희석하고, 50 ㎕를 주입하였다. 미니돈(miniDAWN) 광 산란 검출기 (Wyatt Technology Corporation) 및 UV 검출기 뒤에 인-라인(in-line)으로 부설된 옵티랩(Optilab) DSP 시차 굴절계 (Wyatt Technology Corporation)를 사용하여 다각 레이저 광 산란 (MALLS) 분석을 수행하였다. 아스트라(Astra) V 버젼 5.1.9.1 소프트웨어 (Wyatt Technologies Corporation)을 사용하여 광 산란 데이터를 분석하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 클론의 농도를 계산하기 위해, 아미노산 서열을 기초로 하는 이론적인 몰 소멸 계수가 사용되었다. 굴절률에 의한 농도 결정을 위해, 0.185 ㎖/g의 추정 비 굴절률 증분 (dn/dc)이 사용되었다.
MALDI TOF 질량 분광법:
보이저(Voyager) DE PRO 질량 분광계 (Applied Biosystems)를 사용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분광법 (도 14)에 의해 EGFR 결합 클론을 분석하였다. 샘플을 0.1％ TFA로 약 1.0 ㎎/㎖로 희석하였다. 약 12 ㎕의 샘플을 C4 집팁(ZipTip) (Millipore Corporation) 상에 로딩하고, 0.1％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 세정하여, 염 및 오염물을 제거하였다. 샘플을 2 ㎕의 시나핀산(Sinapinic Acid) 매트릭스 (70％ 아세토니트릴, 0.1％ TFA 내의 10 ㎎/㎖)를 사용하여 집팁으로부터 표적 플레이트 상으로 직접 용출시켰다. 공지된 질량의 2가지 단백질을 사용하여 장치의 표준화를 수행하였다: 시나핀산 내의 최종 농도 5 μM로 제조되고 플레이트 상에 점적된 사이토크롬(Cytochrome) C (12361.96 Da) 및 아포마이오글로빈(Apomyoglobin) (16952.27 Da). 하기의 장치 설정으로 스펙트럼을 취득하였다: 가속 전압 25000 V, 그리드(Grid) 전압 91 ％, 가이드 와이어(Guide Wire) 0.1 ％, 추출 지연 시간 400 nsec, 레이저 강도 3824. 기준선 수정 및 필터 폭 값 9의 가우스(Gaussian) 스무드(Smooth) 알고리즘을 적용함으로써 미처리(Raw) 스펙트럼을 데이터 익스플로러(Data Explorer) v. 4.5 (Applied Biosystems)에서 프로세싱하였다.
3H-티미딘 세포 증식 분석법
세포를 웰 당 2,500개의 세포로 96웰 미량역가 플레이트 내에 플레이팅하였다. PBS 내에 용해된 화합물을 24시간 후에 첨가하고, 배양물을 추가로 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4 uCi/㎖ [3H] 티미딘 (Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, United Kingdom))으로 3시간 동안 펄싱(pulsing)하고, 트립신처리하고, 유니필터(UniFilter)-96, GF/B 플레이트 (Perkin-Elmer (Boston, MA)) 상에 수확하였다. 탑카운트(TopCount) NXT (Packard (Meriden, CT)) 상에서의 섬광 카운팅에 의해 DNA 내로의 혼입을 측정하였다. 미처리 대조군 세포에 비해 세포 증식을 50％ 만큼 억제하는데 필요한 약물 농도인 IC50으로 결과가 표현된다. 데이터는 삼중 웰의 평균이고, SE가 지시된다.
수용성 테트라졸륨 염 증식 분석법
세포를 페놀 레드 없이 완전 배지에 파종하고, 상기 기술된 바와 같이 EGFR 결합 클론으로 처리하였다. 처리 기간 말기에, 10 ㎕/웰의 WST-8 시약 (Dojindo Molecular Technologies (Gaithersburg MD))을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 3시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMAX Plus) (Molecular Devices (Sunnyvale, CA)) 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독함으로써 포르마잔 염료의 축적을 정량하였다.
세포내 웨스턴 분석법
A431 표피양 암종 또는 FaDu 두경부 암종 세포에 대해 24,000개의 세포/웰로 폴리-D-라이신이 코팅된 미량역가 플레이트 (Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 세포를 파종하고, 하룻밤 동안 부착되도록 하였다. 세포를 세정한 후, 24시간 동안 무혈청 배지에서 인큐베이션하였다. 그후, 클론들의 일련의 희석물을 세포에 적용하고, 4시간 동안 인큐베이션한 후, 100 ng/ml EGF로 10분 동안 자극하였다. 자극 후, 세포를 3.7％ 포름알데하이드를 함유하는 PBS에서 20분 동안 고정시키고 나서, 0.1％ 트리톤-X-100을 함유하는 PBS에서 15분 동안 투과성이게 하였다. 세포를 1시간 동안 오디세이(Odyssey) 차단제에서 차단하고, 항체와 함께 인큐베이션하여, 타이로신 1068 상에서 인산화된 EGFR (Cell Signaling (Beverly, MA)) 및 액틴 (Sigma (St. Louis, MO)) 또는 타이로신 202/트레오닌 204 상에서 인산화된 ERK (MAP 카이네이스) 및 총 ERK (Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA))를 검출하였다. 0.1％ 트윈-20을 함유하는 PBS에서 3회 세정한 후, 2차 항체를 첨가하였다 (Invitrogen (Carlsbad, CA) 또는 Rockland (Gilbertsville, PA)). 세포를 0.1％ 트윈-20을 함유하는 PBS에서 3회 세정하고, 리-코르(Li-Cor) 오디세이 적외선 영상화 시스템 (Li-Cor Biosciences (Lincoln, Nebraska)) 상에서 영상화하였다. 각각의 클론을 삼중으로 분석하였고, 최대 신호 -(빼기) 배경값의 억제 백분율의 선형 회귀 분석으로부터 IC50 값을 계산하였다.
EGFR 항체 차단에 의한 에피토프 지도작성
A431 세포를 폴리-D-라이신이 코팅된 미량역가 플레이트 내로 24,000개의 세포/웰로 파종하고, 하룻밤 동안 부착되도록 하였다. 다음날, 각각의 웰을 저온 PBS로 1회 세정하고, 세포를 다양한 농도의 클론과 함께 1시간 동안 4℃에서 예비-인큐베이션하였다. 결합되지 않은 단백질을 저온 PBS로 세정하여 제거하고, 결합된 단백질을 4℃에서 1시간 동안 PBS (pH = 8.0) 내의 1 mM BS3로 처리함으로써 수용체에 가교시켰다. 플레이트의 내용물을 쏟아버리고, 웰 당 50 ㎕의 50 mM 트리스-HCl (pH = 7.5)를 첨가하고 15분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 가교 반응을 켄칭(quenching)시켰다. 플레이트를 PBS + 0.1％ 트윈-20으로 1회 세정하고, 20분 동안 PBS + 3.7％ 포름알데하이드에서 고정시켰다. 플레이트를 오디세이 차단제로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 오디세이 차단제 내의 1:100 또는 1:50 희석된 다양한 1차 항체를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, TOPRO3 대비염색제 1:3000과 함께 오디세이 차단제 + 0.2％ 트윈-20에 1:800 희석된 2차 항체를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, 리-코르 오디세이 적외선 영상화 시스템 상에서 160 uM 해상도로 영상화하였다.
DiFi 세포 내의 총 EGFR 포스포타이로신 수준의 결정을 위한 ELISA 분석법
미량역가 플레이트의 각각의 웰에 1×105개의 DiFi 세포를 플레이팅하고 이들을 하룻밤 동안 부착시킴으로써 EGF-자극 EGFR 인산화의 억제를 결정하였다. 다음날, 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 세포를 16시간 동안 고갈시켰다. EGFR 결합 클론 또는 대조군 항체를 세포와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 20 ng/㎖의 EGF로 10분 동안 자극하고, HNTG [프로티에이스 억제제인 AEBSF, 아프로티닌, 류펩틴, 베스타틴, 펩스타틴-A 및 E64를 함유하는 50 mM 헤페스, 150 mM NaCl, 0.5％ 트리톤-X-100, 8％ 글리세롤, 2 mM Na3PO4, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA]에서 세포 용해물을 제조하였다. 용해물을 EGF 수용체 (Cell Signaling (Beverly, MA))의 인간 세포외 도메인에 대해 특이적인 1차 항체로 코팅된 포획 플레이트로 옮겼다. 검출 항체를 양고추냉이 과산화효소에 접합된 마우스 모노클로날 항-포스포타이로신 항체 (4G10, Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY))로 교체하였다. 발색 기질인 테트라메틸벤지딘을 사용하여, 450 nm에서 분광광도계에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 분석법에서, 샘플을 삼중으로 테스트하였고, 배경값을 차감하고 총 최대 신호의 억제 백분율을 계산함으로써 IC50 값이 결정되었다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> TARGETED THERAPEUTICS BASED ON ENGINEERED PROTEINS THAT BIND EGFR <130> COTH-523-WO1 <140> PCT/US2009/000830 <141> 2009-02-10 <150> 61/065,955 <151> 2008-02-14 <160> 264 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Arg Ala 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Claims (23)

  1. (i) 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; (ii) 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 변경된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프를 가지며, (iii) 10-4 M 미만의 해리 상수로 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하는 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, Fn3 도메인이 10-6 M 미만의 해리 상수로 인간 EGFR에 결합하는 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 루프 BC 및 루프 FG가 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fn3 도메인이 열번째 제III형 피브로넥틴 도메인 (10Fn3)인 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 10Fn3 도메인이
    (i) 서열 207-231 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    (ii) 서열 207-231 중 어느 하나에 대해 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시알킬렌 모이어티, 인간 혈청 알부민 결합 단백질, 시알산, 인간 혈청 알부민, IgG, IgG 결합 단백질, 트랜스페린, 및 Fc 단편으로부터 선택된 하나 이상의 약동학 (PK) 모이어티(moiety)를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, PK 모이어티가 폴리옥시알킬렌 모이어티이고, 상기 폴리옥시알킬렌 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜인 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서, PK 모이어티와 Fn3 도메인이 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당, 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 작동가능하게 연결된 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, PK 모이어티와 Fn3 도메인이 서열 232-235의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 통해 작동가능하게 연결된 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모이어티; 리포칼린의 유도체; 테트라넥틴의 유도체; 아비머(avimer); 안키린의 유도체; 및 제2 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인으로부터 선택된 제2 도메인을 추가로 포함하고, 이때 제2 도메인이 인간 단백질에 결합하고, 제2 Fn3 도메인이 (i) 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 및 루프 FG를 포함하고; (ii) 인간 Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 아미노산 서열이 무작위화된 루프 BC, DE 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프를 가지며, (iii) 인간 Fn3 도메인에 의해 결합되지 않는 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 제2 도메인이 제2 Fn3 도메인이고, 이때 제2 Fn3 도메인이 10-4 M 미만의 해리 상수로 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제2 도메인이 제2 Fn3 도메인이고, 이때 제2 Fn3 도메인이 열번째 제III형 피브로넥틴 도메인 (10Fn3)인 폴리펩티드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인에 의해 결합되는 인간 단백질이 IGF-IR, EGFR, 또는 VEGFR2로부터 선택되는 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 제2 10Fn3 도메인이
    (i) 서열 2-231 및 236 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    (ii) 서열 2-231 및 236 중 어느 하나에 대해 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Fn3 도메인과 제2 도메인이 하나 이상의 디술피드 결합, 펩티드 결합, 폴리펩티드, 중합체성 당, 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 작동가능하게 연결된 폴리펩티드.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-알파) 또는 표피 성장 인자 (EGF)가 EGFR에 결합하는 것을 억제하고, 세포-기반 분석법에서 IC50 미만의 농도에서 인간 EGFR을 활성화시키지 않는 폴리펩티드.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 EGFR에의 결합에 대해 항-EGFR 항체와 경쟁하는 폴리펩티드.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 10 μM 미만의 IC50으로 EGFR의 전체적인 EGF-자극 포스포타이로신 활성화를 억제하는 폴리펩티드.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 10 μM 미만의 IC50으로 ERK 인산화를 억제하는 폴리펩티드.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 10 μM 미만의 IC50으로 AKT 인산화를 억제하는 폴리펩티드.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 이상의 T-세포 에피토프가 제거되도록 탈면역화된 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fn3 도메인이 a) 인간 Fn3 도메인 코딩 서열과 상이한 후보 열번째 제III형 피브로넥틴 (Fn3) 도메인 서열을 각각 포함하는 후보 RNA 분자들의 집단을 생산하고, 이때 상기 RNA 분자들이 각각 상기 후보 Fn3 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 번역 개시 서열 및 시작 코돈을 포함하고, 각각 3' 말단에서 핵산-푸로마이신 링커(linker)에 작동가능하게 연결된 단계; b) 상기 후보 Fn3 도메인 코딩 서열들을 시험관 내에서 번역시켜 후보 RNA-Fn3 융합물들의 집단을 생산하는 단계; c) 후보 RNA-Fn3 융합물들의 상기 집단을 EGFR과 접촉시키는 단계; 및 d) 단백질 부분이 EGFR에 대한 상기 인간 Fn3의 결합 친화력 또는 특이성에 비해 변경된 EGFR에 대한 결합 친화력 또는 특이성을 갖는 RNA-Fn3 융합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 선별된 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하고, 이때 조성물에 내독소가 본질적으로 없는 제약상 허용가능한 조성물.
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