CN110709106A - 放射性标记的生物分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及放射性标记的生物分子和用放射性卤素原子进行生物分子的放射性标记的方法，该方法最小化了由于体内脱卤导致的放射性卤素的损失，保留了生物分子的生物学活性，最大化了在癌细胞中的放射性保留，最小化了体内给药后放射性在正常组织中的保留。一些这样的放射性标记的生物分子包含代替放射性卤素的放射性金属原子，或者在包含放射性金属原子外还包含放射性卤素。该生物分子对特定类型的细胞具有亲和力，并且可以特异性结合特定细胞，如癌细胞。相关的生物分子包括抗体、单克隆抗体、抗体片段、肽、其他蛋白质、纳米颗粒和适体。

Description

放射性标记的生物分子及其应用
发明领域
本发明涉及可用于放射性标记生物分子的化合物及其前体、以及放射性标记的生物分子。该化合物可以有效地保留来自在细胞中被内化的生物分子的放射性，从而使这样的化合物可用于疾病尤其是癌症的诊断和治疗。
背景技术
放射性碘化是放射性标记生物分子的最简单方法之一。碘的几种放射性同位素可用于癌症的成像和靶向放疗。碘的放射性同位素以碱性溶液的形式提供，碘以-1的氧化态(I-；碘化物)存在。生物分子放射性碘化的标准方法需要将碘氧化为+1氧化态，以便亲电取代生物分子(例如抗体，其他蛋白质和肽)中存在的酪氨酸氨基酸。如此放射性碘标记的单克隆抗体(mAb)和肽的挑战包括内化、脱碘后它们在体内对细胞内蛋白水解的不稳定性，并且由于这两个过程的结果，肿瘤细胞的放射性丧失。广泛认识到，在内化之后，放射性碘标记的抗体和肽在细胞内被蛋白水解降解(这可能是由于与受体和某些抗原的结合而发生)，并成为被膜氨基酸转运蛋白有效地从细胞输出的放射性碘酪氨酸。释放的放射性碘酪氨酸被组织中发现的脱碘酶所脱碘，游离的放射性碘会重新分布并累积在具有碘化钠同向转运体表达的器官中，尤其是甲状腺、胃和唾液腺。因此，保留在肿瘤中的放射性标记的量减少，并且正常组织中放射性的吸收随之增加。
抗体的缺点之一是它们在血流中的半衰期长，导致全身性给药后背景水平高，因此肿瘤与背景的比例低。而且，常规抗体在实体瘤中的扩散相当缓慢，这阻止了它们均匀地到达并结合到整个肿瘤块中的受体/抗原上。
尽管在本领域中已经鉴定了一些化合物，但是它们不稳定且难以大量生产。因此，需要可用于放射性标记生物分子的改进的人造化合物(prosthetic compounds)，以用于靶向放射治疗和成像应用。
此外，由于抗体的尺寸，抗体进入肿瘤细胞、特别是脑转移瘤的吸收率低，这是由于血脑屏障施加的递送限制而对脑中的肿瘤特别成问题的。本发明通过能够被肿瘤细胞吸收和保留的组合物解决了与癌症(包括转移到脑部的癌症)治疗有关的问题，同时减少正常组织(尤其是肾脏)吸收的放射性标记的量。
发明概述
本发明涉及用放射性卤素原子对生物分子(也称为大分子)进行放射性标记的方法，化合物和组合物，其方式使体内由于脱卤作用而导致的放射性卤素的损失最小化、保持生物分子的生物学活性、使在诸如癌细胞等患病细胞中的保留最大化、且在体内施用后使放射性在正常组织中的保留最小化。生物分子对特定类型的细胞具有亲和力。即，生物分子可以特异性结合特定细胞，如癌细胞。本发明的组合物包括放射性标记的生物分子。这样的生物分子包括抗体、单克隆抗体、抗体片段、肽、其他蛋白质、纳米颗粒和适体。用于本发明目的的生物分子的这样的实例包括双抗体、scFv片段、DARPin、基于纤连蛋白III型的支架、亲和体、VHH分子(也称为单域抗体片段(sdAb)和纳米抗体)、核酸或蛋白质适体和纳米颗粒。另外，在本发明的实践中可以使用较大的分子，例如＞50kDa的蛋白质，包括抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和F(ab’)2片段。另外，尺寸小于50nm的纳米颗粒可以用于本发明的实践中。
本发明的方法利用对放射性标记有效的人造化合物。这样，本公开提供了这样的放射性标记化合物(在本文中称为“人造化合物”)、以及提供这种人造化合物的前体(在本文中称为“放射性卤素前体”)。本公开进一步提供了包含这样的人造化合物/自由基和一种或多种大分子的放射性标记的大分子(例如，生物分子)。在一些这样的实施方式中，这些放射性标记的大分子是靶向放疗剂。本发明的人造化合物和放射性标记的化合物可用于例如疾病诊断和靶向放射治疗。
在本公开的一个方面中，提供了由式1表示的人造化合物或放射性卤素前体形式的化合物：
其中：
X是CH或N；
L1和L3独立地选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链和聚乙二醇(PEG)链；
MMCM是大分子偶联部分；
L2是取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链，或包含至少三个氧原子的聚乙二醇(PEG)链，其中L2任选地包含刷状缘酶可裂解的肽；
CG选自胍；PO3H；SO3H；一种或多种带电的D-或L-氨基酸，如精氨酸、膦酰基/磺基苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸；亲水性碳水化合物部分；聚乙二醇(PEG)链；Z-胍(在本文中也称为“胍基-Z”)；
Z是(CH2)n；
n大于1；
m是0到4(当X＝CH)或0到3(当X＝N)；且
Y是烷基金属部分(在放射性卤素前体中)或放射性卤素(在人造化合物中)，其中放射性卤素选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、211At，或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在某些优选的实施方式中，m＝1。
在一些实施方式中，Y是烷基金属部分(当所述化合物为放射性卤素前体)，选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)。在其他实施方式中，Y是放射性卤素(当所述化合物是人造化合物)，选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和211At。
在一些实施方式中，MMCM为活性酯或(Gly)m，其中m是1或更大。在一些实施方式中，MMCM选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、四氟苯酚(TFP)酯、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基。一个示例性的MMCM是Gly-Gly-Gly。
在一些实施方式中，L2是(CH2)p，其中p＝1至6或其中p＝2至6。在一些实施方式中，当存在于L2内时，任选的刷状缘酶可裂解的肽选自Gly-Lys、Gly-Tyr和Gly-Phe-Lys。
在某些实施方式中，所述化合物(人造化合物或放射性卤素前体)由式1a的以下结构表示：
在某些实施方式中，所述化合物包含N-琥珀酰亚胺基3-胍基甲基-5-[131I]碘苯甲酸酯(异-[131I]SGMIB)、或N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹-5-胍基苯甲酸甲酯(异-[211At]SAGMB)。
在本发明的另一个方面中，本公开提供了由式2表示的人造化合物或放射性卤素前体形式的化合物：
MC-Cm-L4-Cm-T
式2，
其中：
MC是多齿金属螯合部分；
Cm是硫脲、酰胺或硫醚；
L4选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链(任选地在一个或两个末端上具有NH、CO或S)、以及聚乙二醇(PEG)链；且
T是本文公开的化合物(人造化合物或放射性卤素前体)(例如根据式1、如式1A)，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施方式中，MC是大环结构。在某些示例性的人造化合物中，MC选自DOTA、TETA、NOTP、和NOTA。在一些实施方式中，MC是无环多齿配体。在某些示例性的人造化合物中，MC选自EDTA、EDTMP、和DTPA。
在某些实施方式中，Y是烷基金属部分(当所述化合物是放射性卤素前体)。放射性卤素前体中的烷基金属部分例如选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)。这样的前体，如本文所述，可用于生产本文公开的人造化合物和放射性标记的生物分子。在其他实施方式中，Y是放射性卤素(当所述化合物是人造化合物)，如75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I或211At。
本公开进一步提供了放射性标记的生物分子，其包含与生物分子连接的本文所公开的人造化合物，并且还提供了中间体，其包含与生物分子连接的本文所公开的放射性卤素前体，其可以反应形成放射性标记的生物分子。
所述生物分子可以变化。在某些实施方式中，所述生物分子选自抗体、抗体片段、VHH分子、适体或其变体。在某些实施方式中，所述生物分子是VHH。在特定实施方式中，VHH靶向HER2。在一些实施方式中，VHH包含选自SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。
本公开进一步提供了药物组合物，其包含本公开的放射性标记的生物分子以及药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。本公开的另一方面提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的个体施用有效量的本公开的放射性标记的生物分子和/或有效量的本公开的药物组合物。
附图简要说明
为了提供对本公开的实施方式的理解，参考附图，其不一定按比例绘制。附图仅是示例性的，不应将其理解为以限制本公开。
图1提供了(A)[211At]SAGMB-5F7 VHH、(B)[131I]SGMIB-5F7 VHH、(C)异-[211At]SAGMB-5F7 VHH、和(D)异-[131I]SGMIB-5F7 VHH的非还原SDS-PAGE/磷光成像图，左泳道的分子量标准用于比较；
图2提供了用表达HER2的BT474M1乳腺癌细胞进行的饱和结合测定的结果，其中，5F7 VHH用(A)[131I]SGMIB、(B)异-[131I]SGMIB、(C)[211At]SAGMB和(D)异-[211At]SAGMB标记；
图3提供了体外在BT474M1细胞中[211At]SAGMIB-5F7 VHH和异-[211At]SAGMB-5F7VHH的内化的图，图3A描绘了与细胞相关(内化+表面结合)的总放射性，图3B描绘了内化的放射性；
图4提供了体外在BT474M1细胞中[131I]SGMIB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-5F7 VHH的内化的图，图4A描绘了与细胞相关(内化+表面结合)的总放射性，图4B描绘了内化的放射性；
图5描述了[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[211At]SAGMB-5F7 VHH在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的生物分布，并比较了其在肿瘤中的摄取，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图6描绘了[131I]SGMIB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-5F7 VHH在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的生物分布：比较了其在肿瘤中的摄取，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图7描绘了[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7 VHH在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的生物分布：比较了其在肾中的摄取，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图8描绘了[131I]SGMIB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-5F7 VHH在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的生物分布：比较了其在肾中的摄取，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图9提供了[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[211At]SAGMB-5F7 VHH在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的甲状腺(图9A)和胃(图9B)中的摄取数据，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图10提供了[131I]SGMIB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中的甲状腺(图9A)和胃(图9B)中的摄取数据，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图11描绘了在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中，由[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[211At]SAGMB-5F7 VHH的生物分布获得的肿瘤与组织之比，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；且
图12描绘了在携带BT474M1异种移植物的SCID小鼠中，由[131I]SGMIB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-5F7的生物分布获得的肿瘤与组织之比，数据自施用[131I]SGMIB-5F7/[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-57/异-[211At]SAGMB-5F7 VHH串后通过配对标记研究获得；
图13是提供[211At]SAGMB-5F7 VHH和[131I]SGMIB-5F7 VHH在具有皮下B474M1人乳腺癌异种移植物的SCID小鼠中的配对标记生物分布的表；和
图14是提供异-[211At]SAGMB-5F7 VHH和异-[131I]SGMIB-5F7 VHH在具有皮下B474M1人乳腺癌异种移植物的SCID小鼠中的配对标记生物分布的表。
发明详述
本公开将参考其示例性实施方式在下文中更全面地进行描述。对这些示例性实施方式进行描述以使本公开完备和完整，并能够向本领域技术人员完全地展示本公开的范围。实际上，本公开可以以许多不同的形式实施，不应看作仅限于本文所述实施方式；并且，提供这些实施方式使得本公开可以满足法律上的要求。在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数形式，除非上下文中另有明确规定。
提供了用于诊断和治疗包括癌症在内的疾病的化合物、组合物和方法。通常，本公开的化合物包含连接至大分子(例如用作靶向部分的生物分子(提供靶向放疗剂))的放射性标记的人造化合物/自由基或放射性标记的人造基团(prosthetic group)。这样，本公开内容包括放射性标记的人造化合物和自由基本身，以及具有连接于其上的这样的放射性标记的人造化合物/自由基的大分子(在本文的一些实施方式中被称为“放射性标记的生物分子”或“靶向放疗剂”)。
本公开内容还包括含有烷基金属部分(在本文中称为“放射性卤素前体”)的这样的化合物和自由基(单独和/或与生物分子组合)，可以从该化合物和自由基产生人造基团和/或靶向放疗剂。有利地，在一些实施方式中，这样的前体的制备允许制备包含较大放射性卤素(例如大于18F，包括但不限于75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I和211At)的人造化合物以及靶向放疗剂。
标记的人造化合物/自由基或放射性卤素前体(单独或连接于大分子)除放射性卤素或其前体之外，通常还包括带电基团(CG)和大分子偶合部分(MMCM)。如将在下面更详细地描述的，这些组成部分中的每一个可以与一个或多个可裂解的(或不可裂解的)接头相关联。在一些实施方式中，靶向放疗剂包含生物分子(靶向部分)、放射性标记的人造基团或模板，以及任选地螯合剂(大环或无环的)。
本文所述的放射性标记的化合物、尤其是放射性标记的生物分子及其使用方法，导致靶细胞内放射性的吸收更大，内化后靶细胞中放射性的保留更高，而正常细胞中放射性的吸收更少；例如，甲状腺和肾脏对放射性的吸收较少。本发明的靶向放疗能够将放射性核素选择性地递送至恶性细胞群。靶向放疗的一个优势是可以选择一种具有与预期临床应用的限制条件最匹配的性质的放射性核素。作为一个实例，对于中枢神经系统(CNS)肿瘤，将有利地选择具有使正常CNS组织的放射最小化的组织范围的放射。
本文提供的化合物(例如，放射性卤素前体、人造化合物、中间体和靶向放疗剂)通过使用标记技术增强放射性核素——特别是(在某些实施方式中)放射性卤素——在靶标患病细胞(例如癌细胞)中的保留的方法制备，所述标记技术在细胞内蛋白水解后产生带电的分解代谢物，其不能穿过溶酶体或细胞膜并且抗胞吐作用。本发明的化合物包含带电的分解代谢物，其中带有标记的分子部分对溶酶体降解呈惰性，并且在蛋白水解后被截留在细胞内。
本公开的内容涵盖的某些人造化合物及其前体(即，放射性卤素前体)包括式1的那些及其衍生物和变体。
Figure BDA0002296007960000091
本发明包括具有通式1的一般结构的人造化合物/自由基及其前体(称为“I类化合物”)，其包含均(X＝CH)或杂(X＝N)芳环，该芳环上连接有：大分子偶联部分(MMCM)，用于偶联人造化合物/自由基或前体与大分子；放射性卤素或放射性卤素前体(Y)；和一个或多个带电的取代基/基团(CG)。这些组成部分中的每一个都可以通过接头(L1、L2、L3)连接到芳环上，或者可以直接键合到芳环上(即，其中L1和/或L2和/或L3是键)。式1中所示的这些组成部分的每一个将在下面进一步详细描述。
在一些实施方式中，Y是放射性卤素(当式1表示放射性标记的人造化合物/自由基)。这样的放射性卤素可选自18F、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At。有利地，所述放射性卤素在一些实施方式中大于18F。在某些实施方式中，所述放射性卤素Y选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At。在某些实施方式中，所述放射性卤素Y选自75Br、76Br、77Br和211At。在一个特定的实施方式中，所述放射性卤素Y是211At。
在其他实施方式中，Y是烷基金属部分(当式1表示放射性卤素前体/自由基)。示例性的烷基金属部分包括但不限于三烷基金属前体，包括三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)、和三甲基甲硅烷基(SiMe3)。
Y可以直接与芳环键合(L3＝直接键)，或者可以通过接头(L3)键合至芳环。L3可以是例如间隔物，如取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链、或短聚乙二醇(PEG)链(1-10个乙二醇单元)。
带电基团(CG)通常存在于本公开的人造基团中，即，m为1或更大。通常，m为1；但是，一个以上的CG可以连接到环上，因此m＝2，m＝3，并且(当X＝CH)，m可以是4。当一个以上的CG连接到环上时，每个这样的CG(和对应的L2)可以相同或不同。在某些实施方式中，如下文所引用(如式2所示)，另一个部分可以连接至式1的环，并且，当这种另外的部分带电荷时，m可以为0(即，在一些实施方式中，另外的部分可以有效地充当“带电基团”)。
带电基团通常是在内部细胞环境的生理条件下带电的基团。在一些实施方式中，带电基团(CG)包含胍、PO3H基团或SO3H基团。在一些实施方式中，CG是含有多于一个碳的胍基烷基。在一些实施方式中，CG是胍基亲水基团(如含氨基或羟基的基团)和/或烷氧基羰基胍基。在其他实施方式中，CG包含一种或多种带电的D-氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和/或膦酰基/磺基苯丙氨酸。在另外的实施方式中，CG包含亲水性碳水化合物部分。在一些实施方式中，化合物可包含一个、两个或三个CG部分(和任选的相应的接头基团L2)以增加癌细胞中的细胞内捕获。
CG可以直接与芳环键合(L2＝直接键)，或者可以通过接头(L2)键合至芳环。L2例如可以是间隔物，如取代或未取代的烷基链(例如，简单的取代或未取代的烷基链如亚甲基)、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链、至少三个氧的PEG链、或任何含有刷状缘酶可裂解的肽(例如Gly-Lys，Gly-Tyr或Gly-Phe-Lys)的前述物质。应当注意，在某些实施方式中，当CG为胍且L2为未取代的烷基链时，所述未取代的烷基链包含两个或更多个碳原子。
在本发明的一些实施方式中，可代谢的间隔物或可裂解的接头L2(例如，刷状缘酶可裂解的接头)位于CG与芳环之间。使用这些制剂，可以避免增加肾脏中放射性的吸收和保留，这是因为在肾脏中，CG部分被裂解，从而消除电荷并允许放射性物质(现在为中性或较少带电)从肾脏中的肾小管细胞逸出，然后迅速排泄到尿液中。尽管以前曾使用过带放射性的刷状缘酶可裂解的接头，但它们并没有以这种方式使用而形成“电荷开关”，其中标记试剂在肿瘤中带电，因此得以保留，但在肾脏中却失去了电荷，因此被清除。
这样的接头包括：靶向跨膜肽酶β(meprinβ，是一种在肾刷状缘膜中表达的金属蛋白酶)的接头序列(Jodal等人(2015)PLoS One Apr 9；10(4)：e0123443)；通过赖氨酸的ε-氨基与抗体片段连接的C端赖氨酸，或C端(N(ε)-氨基-1,6-己烷-双乙烯基砜)赖氨酸，其通过利用肾刷状缘酶的赖氨酸特异性羧肽酶活性而减少了肾脏的摄取，所述肾刷状缘酶在被近端小管细胞吸收之前将放射性标记的肽接头裂解(Li等人，(2002)Bioconjug Chem 13(5)：985-995)；L-酪氨酸O-甲基，L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺，N-Boc-L-赖氨酸(Akizawa等人(2013)Bioconjugate Chem 24：291-299)；甘氨酰赖氨酸(Arano等人(1999)CancerResearch 59：128-134)；所有这些通过引用并入本文。
在一些实施方式中，MMCM是活性酯。活性酯在本文中定义为可以在温和条件下、即不会导致大分子/生物分子(例如，肽或蛋白质)生物学功能丧失的条件下，与存在于大分子/生物分子上的胺基偶联的酯。示例性的这样的MMCM基团包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或四氟苯酚(TFP)酯、异硫氰酸酯基、或马来酰亚胺基。这种MMCM通常导致蛋白质或肽上胺基的随机(非位点特异性)标记。在其他实施方式中，MMCM提供使用酶分选酶进行的位点特异性偶联，这导致仅偶联至一个位点(蛋白质的N端或C端)。在该情况下，MMCM是例如三肽GlyGlyGly。
MMCM可以直接与芳环键合(L1＝直接键)，或者可以通过接头(L1)键合至芳环。L1可以是例如间隔物，如取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链、或短聚乙二醇(PEG)链(1-10个乙二醇单元)。
这三个部分(-L1-MMCM、-L2-CG、和-L3-Y)在芳环上的位置可以变化。当X为CH时，这三个部分可以位于芳环的任何位置。在一些这样的实施方式中，-L2-CG和-L3-Y部分分别相对于-L1-MMCM部分(在1位)位于3和4位(或分别在4和3位)。在一些这样的实施方式中，-L2-CG和-L3-Y部分相对于-L1-MMCM部分位于3和5位，使得芳环在1、3和5位包含所引部分。在X为N的情况下，这三个部分可以放置在环的其余五个位置中的任何一个上，例如包括但不限于环的2、4和6位。
如下所述，在本发明的用于标记靶向分子的式1范围内的某些人造化合物和放射性卤素前体包括式1A化合物及其衍生物和变体。如图所示，在式1A中，X为CH(即，芳环是苯环)，L2为亚甲基，并且三个部分(-L1-MMCM、-L3-Y、和–CH2-CG)存在于芳环的1、3和5位。
Figure BDA0002296007960000121
本发明还包括具有如下所示的式2的一般结构的化合物(称为“II类化合物”)。
MC-Cm-L4-Cm-T
式2：II类化合物的一般结构
这样的化合物包括多齿金属螯合部分(MC)、在L4的两端具有偶联部分(Cm)的接头(L4)、以及放射性卤代模板或放射性卤素前体模板(T)。T可以是例如如上所述的式1的化合物或式1A的化合物(含有MMCM的化合物)。在一些实施方式中，T为人造化合物/自由基，并且在一些实施方式中，T为放射性卤素前体化合物/自由基。在一些这样的实施方式中，如上所述，m＝0，其中式2的“MC-Cm-L4-Cm”部分提供了以上式1中的L2-CG部分的所需功能(即，MC-Cm-L4-Cm取代基是足够的“带电基团”)。在其他这样的实施方式中，m＝1、2或3，使得“T”的芳环具有至少四个取代基，即L1-MMCM、L3-Y、L2-CG、和Cm-L4-Cm-MC，并且可以任选地包含一个或多个另外的L2-CG取代基。
L4可以与上面对L1和L3的定义相同。这样，L4可以是直接键或可以是间隔物，如取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链、或短聚乙二醇(PEG)链(1-10个乙二醇单元)。L4再次如上所定义，但在一个或两个末端具有NH、CO(羰基)或S(硫醚)。
Cm可以是例如硫脲、酰胺或硫醚。例如，在一些实施方式中，Cm为硫脲(例如，当螯合部分和T中的偶联官能团为异硫氰酸酯时)、酰胺(当螯合部分和T中的偶联官能团为NHS或TFP活性酯或酰基卤时)或硫醚(当螯合部分和T中的偶联官能团为马来酰亚胺时)。
T通常是含有MMCM的放射性标记的部分或放射性卤素前体，大分子可通过MMCM与化合物偶联。如上所述，在一些实施方式中，T可以是式1的化合物/自由基或式1A的化合物/自由基。在其他实施方式中，可以使用其他放射性卤素模板(T)，包括但不限于异-SGMIB，如Choi等人(2014)Nucl Med Biol 41(10)：802-812中所公开的，其通过引用并入本文；SIPC，如Reist等人(1997)Nucl Med Biol 24(7)：639-648中所公开的，该文献通过引用并入本文；或SDMB，如美国专利5,302,700中所公开的，该专利以引用方式并入本文。
MC可以是任意多齿部分，并且可以是环状或无环的。MC的组成可以变化。MC可以与具有稳定(非放射性)或放射性形式的金属不络合(缺少金属)或络合，优选三价金属(M+3)、如镥、钇、铟、锕、或镓并且MC通过使用存在于MC上的游离COOH基团之一或通过MC上包括MC主链碳之一的其他位置与接头连接。可与MC络合的某些特定放射性金属包括但不限于选自177Lu、64Cu、111In、90Y、225Ac、213Bi、212Pb、212Bi、67Ga、68Ga、89Zr、和227Th的放射性金属。应当注意，该列表不是穷举的，尽管这些示例性的放射性金属是三价的，但是根据本发明可以使用的某些MC可以结合其他价态的金属，并且这些MC和放射性金属也包括在本文中。
在一些实施方式中，与MC关联的放射性金属的包含可以消除对分子上其他地方的放射性原子的需求(例如，当式2的T＝式1/1a的部分时，为“Y”)。这样，在式2化合物中，“T”可以包括或可以不包括放射性原子(例如，卤素)。在一些实施方式中，T包含如上式1/1a中所示的部分，其中“Y”基团是非放射性卤素(例如，非放射性溴或碘)。在其他实施方式中，提供式2的化合物，其既包含放射性卤素(例如，当式2的T＝式1/1a的部分时，为“Y”)又包含放射性金属(与MC缔合，例如上面提到的放射性金属)。在某些特定的实施方式中，这样的策略将允许例如将相同的人造剂(prosthetic agent)用于多种同位素。在某些具体实例中，式2的化合物具有低能β发射体(例如131I)加上高能β发射体(例如90Y)；或α发射体(例如225Ac)金属和β发射体卤素(例如131I)；或α发射体卤素(例如211At)和β发射体放射性金属(例如177Lu)。
在一些实施方式中，MC是大环配体，其由含有8个或更多个原子的环组成，带有至少3个带负电的取代基，如羧基或膦酸酯基。适合作为MC基团的示例性大环配体包括1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)，1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)和1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三(亚甲基膦酸)(NOTP)。在其他实施方式中，MC是MeO-DOTA，如Gali等人在AnticancerResearch(2001)，21(4A)，2785-2792)中公开的，其通过引用并入本文。
II类化合物的实例在下面的式2A中示出，其中MC是包含DOTA的大环配体，并且其中放射性卤代模板T是与式1相对应的部分。
Figure BDA0002296007960000141
式2A中的左方括号意在表示对MC(DOTA)上与Cm基团键合的特定位点没有限制，即，Cm可以在其上的不同位点与DOTA键合。类似地，式2A中的右方括号意在表示对“T”环上与Cm基团键合的特定位点没有限制，即，Cm可以在环上的不同位点与T键合。再次，如上所述，CG-L2可以存在或可以不存在。在一些实施方式中，式2A中的T的苯环包含四个取代基(包括连接的MC、L2-MMCM、L3-Y和L2-CG)。在其他实施方式中，式2A中的T的苯环包含三个取代基(包括连接的MC、L2-MMCM、和L3-Y)。当连接的MC带电时，即，它可以代替提供“L2-CG”取代基的所需功能时，后者的实施方式是特别相关的。
在一些实施方式中，MC是无环配体，其由含有6个或更多个原子的链组成，带有至少3个带负电的取代基，如羧基或膦酸酯基。适合作为MC基团的示例性无环配体包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四亚甲基膦酸(EDTMP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。II类化合物的实例在下面的式2B中示出，其中MC是包含DTPA的无环配体，并且其中放射性卤代模板T是与式1相对应的部分。
Figure BDA0002296007960000151
如以上针对式2A所引用的，式2B中的左方括号意在表示对MC(DTPA)上与Cm基团键合的特定位点没有限制，即，Cm可以在其上的不同位点与DTPA键合。类似地，式2B中的右方括号意在表示对“T”环上与Cm基团键合的特定位点没有限制，即，Cm可以在环上的不同位点与T键合。再次，如上所述，CG-L2可以存在或可以不存在。在一些实施方式中，式2B中的T的苯环包含四个取代基(包括连接的MC、L2-MMCM、L3-Y和L2-CG)。在其他实施方式中，式2A中的T的苯环包含三个取代基(包括连接的MC、L2-MMCM、和L3-Y)。当连接的MC带电时，即，它可以代替提供“L2-CG”取代基的所需功能时，后者的实施方式是特别相关的。
在一些具体的实施方式中，提供式2的化合物，其中MC＝DOTA，L4＝-NH(CH2)6NH-，T＝3-碘-5-琥珀酰亚胺基氧基羰基-苯甲酰基，Cm＝酰胺，MMCM＝N-羟基琥珀酰亚胺酯，一种含马来酰亚胺的部分，或(Gly)n，用于使用分选酶进行位点特异性偶联(请参见上式)。
应当注意，包含MMCM的以上式可以用连接的大分子(例如生物分子)进一步官能化，因此，在一些实施方式中，涵盖本文上面提供的任何式的化合物，其还包含经由MMCM配位的大分子(例如生物分子)。因此，本公开内容涵盖中间体(包含放射性配体前体和生物分子)和放射性标记的生物分子(包含人造基团和生物分子)，两者均可以包含或可以不包含金属螯合部分。
本公开进一步提供了合成本文所述的人造化合物和放射性标记的生物分子的方法。在一些实施方式中，所述方法通常包括制备根据式1的化合物，其中Y＝烷基金属放射性卤素前体。在某些实施方式中，所述方法通常包括制备根据式2的化合物，其中Y＝烷基金属放射性卤素前体。在一些实施方式中，采用这样的前体允许制备包含较大的放射性“Y”基团(例如大于18F，包括但不限于75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I和211At)的人造化合物和放射性标记的生物分子。在一些实施方式中，当Y为烷基金属放射性卤素前体的形式时，大分子可与MMCM配位；然后随后的反应提供产物，其中Y为所需放射性卤素原子的形式。
定义：
“Cm-Cn烷基”本身或在如Cm-Cn卤代烷基、Cm-Cn烷基羰基、Cm-Cn烷基胺等的复合表达式中表示具有指定碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如C1-C4烷基是指具有1-4个碳原子的烷基。C1-C6烷基具有相应的含义，还包括戊基和己基的所有直链和支链异构体。用于本发明的优选的烷基是C1-C6烷基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基，特别是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基和异丁基。通常优选甲基和异丙基。烷基可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的取代基取代，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(＝O)-烷基、-O-C(＝O)-芳基、-O-C(＝O)-环烷基、-C(＝O)OH和-C(＝O)O-烷基。除非另有说明，否则通常优选烷基未被取代。
“C2-Cn烯基”表示含有至少一个碳-碳双键且具有指定碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如C2-C4烯基是指具有2-4个碳原子的烯基；C2-C6烯基是指具有2至6个碳原子的烯基。非限制性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基和己烯基。烯基可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的取代基取代，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(＝O)-烷基、-O-C(＝O)-芳基、-O-C(＝O)-环烷基、-C(＝O)OH和-C(＝O)O-烷基。除非另有说明，否则通常优选烯基未被取代。
“C2-Cn炔基”表示含有至少一个碳-碳三键且具有指定碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如C2-C4炔基是指具有2-4个碳原子的炔基；C2-C6炔基是指具有2至6个碳原子的炔基。非限制性烯基包括乙炔基、丙炔基、2-丁炔基和3-甲基丁炔基、戊炔基和己炔基。炔基可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的取代基取代，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(O)-烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(O)OH和-C(O)O-烷基。除非另有说明，否则通常优选炔基未被取代。
本文所用的术语“Cm-Cn卤代烷基”表示其中至少一个C原子被卤素(例如，Cm-Cn卤代烷基可包含1-3个卤素原子)取代的Cm-Cn烷基，优选碘、溴或氟。典型的卤代烷基是C1-C2卤代烷基，其中卤代适当地代表碘。示例性的卤代烷基包括碘甲基、二碘甲基和三碘甲基。如本文所用，仅卤素中的一种可以是放射性的。
本文所用的术语“Cm-Cn羟烷基”表示其中至少一个C原子被一个羟基取代的Cm-Cn烷基。典型的Cm-Cn羟烷基是其中一个碳原子被一个羟基取代的Cm-Cn烷基。示例性的羟烷基包括羟甲基和羟乙基。
如本文所用，术语“Cm-Cn亚烷基”表示具有所示碳原子数的直链或支链二价烷基。用于本发明的优选的Cm-Cn亚烷基是C1-C3亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)-和-CH(CH(CH3)2)-。
“Cm-Cn烷氧基”表示基团Cm-Cn烷基-O-，其中Cm-Cn烷基如上所定义。特别令人感兴趣的是C1-C4烷氧基，其包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、正丁氧基、仲丁氧基和异丁氧基。通常优选甲氧基和异丙氧基。C1-C6烷氧基具有相应的含义，还扩展包括戊氧基和己氧基的所有直链和支链异构体。
术语“Me”是指甲基，“MeO”是指甲氧基。术语“氨基”表示基团-NH2。术语“卤代”表示卤素基团，如氟、氯、溴、碘或砹。通常，卤素基团是碘、溴或砹。术语“芳基”代表芳环，例如苯基、联苯基或萘基。
术语“杂环烷基”表示含有1-4个独立地选自O、S和N的杂原子的稳定的饱和单环3-12元环。在一个实施方式中，稳定的饱和单环3-12元环包含4个N杂原子。在第二个实施方式中，稳定的饱和单环3-12元环含有2个独立地选自O、S和N的杂原子。在第三实施方式中，稳定的饱和单环3-12元环包含3个独立地选自O、S和N的杂原子。杂环烷基可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的取代基取代，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(O)-烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(O)OH和-C(O)O-烷基。除非另有说明，否则通常优选杂环烷基未被取代。
术语“杂芳基”表示含有1-4个独立地选自O、S和N的杂原子的稳定的芳环。在优选的实施方式中，可用于本公开的杂芳基部分具有6个环原子。在本发明的一个实施方式中，稳定的芳环系统包含一个为N的杂原子。
术语“氨基Cm-Cn烷基”表示被氨基取代的上述定义的Cm-Cn烷基，即烷基部分的一个氢原子被NH2-基团取代。通常，“氨基Cm-Cn烷基”是氨基C1-C6烷基。
术语“氨基Cm-Cn烷基羰基”表示上述定义的Cm-Cn烷基羰基，其中的烷基部分的一个氢原子被NH2-基团取代。通常，“氨基Cm-Cn烷基羰基”是氨基C1-C6烷基羰基。氨基Cm-Cn烷基羰基的实例包括但不限于甘氨酰基：C(＝O)CH2NH2、丙氨酰基：C(＝O)CH(NH2)CH3、缬氨酰基：C＝OCH(NH2)CH(CH3)2、亮氨酰基：C(＝O)CH(NH2)(CH2)3CH3、异亮氨酰基：C(＝O)CH(NH2)CH(CH3)(CH2CH3)和正亮氨酰基：C(＝O)CH(NH2)(CH2)3CH3等。该定义不限于天然存在的氨基酸。
相关术语应根据上面提供的定义和技术领域中的常用用法进行相应解释。
如本文所用，术语“(＝O)”在连接至碳原子时形成羰基部分。应该注意的是，当一个原子的价态允许时，该原子只能带有一个氧代基团。
术语“单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯”是指基团：
术语“硫代单磷酸酯、硫代二磷酸酯和硫代三磷酸酯”是指基团：
Figure BDA0002296007960000192
如本文所用，在定义中使用的任何分子部分上的基团位置可以在该部分上的任何位置，只要它是化学稳定的即可。当存在的任何变量在任何部分中出现不止一次时，每个定义都是独立的。
无论何时在本文中使用，短语“式1的化合物”、“式1A的化合物”、“式2的化合物”或“本发明的化合物”或类似短语意在包括式1的化合物和式1的化合物的亚组、式2的化合物和式2的化合物的亚组，包括可能的立体化学异构体形式，及其药学上可接受的盐和溶剂合物。
术语“溶剂合物”涵盖式1和2的化合物及其盐所能够形成的任何药学上可接受的溶剂合物。这种溶剂合物是例如水合物、醇化物，如乙醇化物、丙醇化物等，尤其是水合物。
通常，本申请中使用的化合物名称是使用ChemDraw Professional 16.0生成的。此外，若结构或结构的部分的立体化学未用例如粗或虚线指示，则该结构或结构的部分应被理解为涵盖其全部立体异构体。
还可以选择接头以促进各个部分与核心结构的结合。例如，如以下关于人造化合物的优选合成途径所更详细地讨论的，代表性的接头是具有1-6个碳原子的双官能烷基链(例如-CH2-、-C2H4-、-C3H6-等)，其中一个碳原子可以被环状(烃环)基或杂环(杂环)基取代。代表性的杂环基在杂环中具有至少一个氮原子。因此，这样的杂环基的具体实例是二嗪基、二唑基、三嗪基、三唑基、四嗪基和四唑基。这些和其他杂环基、或其他环状基可任选地稠合至另一个环状或杂环基、或另外稠合至本身为稠环系统一部分的另一个环状或杂环基(例如，三唑基可以与8元环状或杂环基稠合，而8元环状或杂环基本身与两个6元环稠合，就像三唑基(或其他氮原子取代的杂环烃基)与二苯并偶氮基稠合的情况一样)。因此，包含三个或更多个稠合环(例如烃环、杂环和这些环的组合)的接头是可能的。代表性的带电基团接头L2是具有1-6个碳原子的二价取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、或取代或未取代的炔基链。通常，L1、L2、L3和/或L4可以是(或可以包含)具有1至6个碳原子的取代或未取代的二价烷基，其中一个或多个碳原子可被杂原子如NH、O或S取代和/或被其替代，或可被另一具有1至8个碳原子的直链、支链或环状的烷基(例如导致形成支链烷基)取代或替代。例如，烷基的一个碳原子可以被取代以提供羰基(C═O)，并且相邻的碳原子被NH取代，从而形成肽/酰胺键-(C═O)-NH-。因此，代表性的接头L1、L2、L3和L4可以包括具有一个或多个这样的肽键、-NH-键、-(C＝O)-键和/或环状-C6H4-键的二价烷基，所述二价烷基包括结合到烷基链中的任何两个、三个或四个这样的键的组合。另外，在L1、L2和/或L3为二价烷基的情况下，可以在一对或多对相邻的碳原子之间形成碳-碳双键和/或碳-碳三键，以提供二价的、不饱和的(例如，烯类的)烷基。
选择合适的生物分子标记方法需要仔细考虑分子与生物环境相互作用后的命运。对于放射性碘化的蛋白质和肽而言，规避如通常参与甲状腺激素代谢的脱碘酶的作用是一个重要的问题。试剂如N-琥珀酰亚胺基3-[131I]碘苯甲酸酯(SIB)所产生的蛋白质在放射性标记所处位点的酪氨酸结构不同的基础上，不会在体内发生明显的脱碘。但是，当标记的蛋白质或肽与细胞表面受体或抗原结合后经历细胞内化时，则取决于其细胞间途径，即使使用SIB标记，也会从目标细胞中大量损失标记。
在一些实施方式中，本发明的靶向放疗方法可以利用放射性卤素，其发射的放射在组织中的范围小于15mm。这些包括α发射体如211At、β发射体如131I和俄歇电子发射体如77Br、123I和125I等。本发明的诊断成像方法利用组织中的范围大于5mm的放射，从而可以通过利用如75Br、76Br、124I等放射性卤素的正电子发射断层摄影术(PET)，利用如123I、131I和77Br等放射性卤素的单光子发射计算机断层摄影(SPECT)，或可以使用上述任何放射性卤素进行的术中成像在体外检测到放射。参见例如，美国专利号5,302,700，在此通过引用纳入本文。特别地，131I发射最大组织范围为2.3mm的低能β粒子。Stein等(2003)Cancer Res.63:111-118，其通过引用纳入本文。本发明的治疗方法利用1)相同的放射性卤素来进行靶向放疗和诊断成像(例如131I、123I、77Br等)或2)相同元素的不同放射性卤素来进行靶向放疗和诊断成像(例如，124I和131I；123I和131I；77Br和76Br；77Br和75Br；等)。在一些实施方式中(例如，使用式2的化合物)，可以使用结合至分子的金属螯合部分的其他放射性金属。
可以与上述放射性标记的人造化合物偶联的代表性生物分子包括与细胞表面受体、抗原或转运蛋白特异性结合的任何分子。代表性的细胞表面抗原或受体包括那些被细胞内化的抗原或受体。生物分子可以在几秒钟、几分钟、几小时或几天内被细胞内化。优选的生物分子被快速内化，即，大多数生物分子在数分钟至数小时后被内化。当生物分子以10-6M或更小、优选10-8M-1或更小的亲和常数(KD)结合时，认为该生物分子特异性结合。
生物分子可以是与细胞表面抗原、受体或转运蛋白特异性结合的抗体、抗体片段或合成肽。抗体包括单克隆抗体(mAb)、抗体片段包括VHH分子(也称为单域抗体片段(sdAb)或纳米抗体)。在一个优选的实施方式中，生物分子是内化抗体或抗体片段。与细胞表面抗原特异性结合并被细胞内化的任何抗体都是内化抗体。该抗体可以是任何种类的免疫球蛋白，即IgG、IgA、IgD、IgE或IgM，并且可以通过对哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物、人或其他合适的物种(包括单峰驼的物种)进行免疫而获得。该抗体可以是多克隆的，即从用细胞表面抗原或其片段免疫的动物的血清中获得。该抗体也可以是单克隆的，即通过使用细胞膜或表面配体或抗原或其片段对哺乳动物进行免疫接种，将免疫哺乳动物的淋巴或脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以及分离特定的杂交瘤克隆而形成，如本领域中已知的。该抗体也可以是重组抗体，例如通过重组DNA方法产生的嵌合或种间抗体。优选的内化抗体是人源化抗体，其包含人免疫球蛋白恒定区和鼠可变区，所述鼠可变区具有结合细胞表面抗原的特异性(参见，例如，Reist等，1997)。如果使用抗体片段，则该片段应能够与细胞表面抗原特异性结合。该片段可以包含例如免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分和免疫球蛋白重链可变区的至少一部分。生物分子也可以是与细胞表面抗原特异性结合的合成多肽。例如，生物分子可以是包含免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分和免疫球蛋白重链可变区的至少一部分的合成多肽，如美国专利号5,260,203中所述或本领域中其他已知的。
标记的mAb的许多已知分子靶标是内化抗原和受体。B细胞淋巴瘤(Press等，1994；Hansen等，1996)、T细胞白血病(Geissler等，1991)和神经母细胞瘤细胞(Novak-Hofer等，1994)均具有快速内化的抗原。内化受体已被用于将mAb靶向肿瘤。这些包括野生型表皮生长因子受体(EGFR；神经胶质瘤和鳞状细胞癌；Brady等，1992；Baselga等，1994)、p185 c-erbB-2癌基因产物、HER2(乳腺癌和卵巢癌；De Santes等，1992；Xu等，1997)和转铁蛋白受体(神经胶质瘤和其他肿瘤；Laske等，1997)。确实，已经有人提出，实际上任何与细胞表面抗原结合的单克隆抗体都可以发生内化作用(Mattes等，1994；Sharkey等，1997a)。
放射免疫疗法中mAb内化的优点是，如果放射性能长时间被捕获在靶细胞上，则有可能增加递送到细胞核的放射吸收剂量。放射剂量学计算表明，即使在多细胞范围的β-发射体131I上，将衰变部位从细胞膜转移到细胞质囊泡也可能使细胞核接收到的放射剂量增加两倍，从而可能增加治疗效果(Daghighian等，1996)。另一方面，mAb内化的缺点是此事件使mAb暴露于其他分解代谢过程，从而导致肿瘤细胞释放放射性，降低对癌细胞的放射剂量并增加对人体正常组织的放射剂量。
被细胞内化的抗原或受体最终可能定位于内体或溶酶体内。靶向部分或内化部分是与靶向的患病细胞如癌细胞结合的部分，并且在与细胞表面受体、转运蛋白、细胞表面发现的抗原如跨膜受体、细胞外生长因子等结合后被内化。以这种方式，本发明的化合物可以针对任何患病细胞或肿瘤细胞群体。因此，它可以广泛地用于靶向任何癌症、肿瘤或恶性肿瘤的生长。本发明的化合物可以靶向人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、其肿瘤特异性突变EGFRvIII、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGFA/B、EGFR(HER1/ERBB1)、HER2(ERBB2/neu)、ALK、Ax1、CD20、CD30、CD38、CD47、CD52、CDK4、CDK6、PD-1、PD-L1、KIT、VEGFR1/2/3、BAFF、HDAC、蛋白酶体、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-6、IL-6R、IL-1β、EGFR(HER1/ERBB1)、MEK、ROS1、BRAF、ABL、RANKL、B4GALNT1(GD2)、SLAMF7、(CS1/CD319/CRACC)、mTOR、BTK、P13Kδ、PDGFR、PDGFRα、PDGFRβ、CTLA4、PARP、HDAC、FGFR1-3、RAF、RET、JAK1/2、JAK3、Smoothened、MEK、BCL2、PTCH、PIGF、EMP2、CSF-1R、LYPD3、等。例如参见Abramson,R.(2017)《癌症靶向治疗概述》，My Cancer Genome，可在万维网“mycancergenome”网站上的“癌症靶向治疗概述”部分找到。
在一些实施方式中，靶向部分可以选自抗HER2 VHH序列，如SEQ ID NO：1-5中列出的那些、以及其保留序列结合特异性的片段和变体。即，本发明包括放射性标记的VHH结构域的片段、类似物、突变体、变体和衍生物。这些寡克隆VHH能够靶向HER2受体上的一系列不同表位。一些VHH不与曲妥珠单抗(trastuzumab)竞争与HER2的结合。在一些实施方式中，本文提供的VHH序列的片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物与SEQ ID NO：1-5中的至少一个具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。参见表1。
在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸取代，其中一个氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基取代并且几乎没有或基本上没有影响多肽的功能、活性或其他生物学特性。如果氨基酸序列和核酸序列在整个长度上具有100％的序列同一性，则它们是完全相同的。
如本文所用，其中序列被定义为与参考序列“至少X％相同”，例如“与SEQ ID NO：2至少95％相同的多肽”，应当理解，除非另有说明，否则“X％相同”是指绝对同一性百分比。术语“绝对同一性百分比”是指通过将相同氨基酸或核酸记为1而将任何取代记为0而确定的序列同一性的百分比，而与错配氨基酸或核酸的相似性无关。在典型的序列比对中，两个序列的“绝对同一性百分比”表示为氨基酸或核酸“同一性”的百分比。在两个序列的最佳比对需要在一个或两个序列中插入一个缺口的情况下，为了确定同一性百分比，将一个序列中与其他序列中的缺口对齐的氨基酸残基计为错配。缺口可以是内部的或外部的，即截断。绝对同一性百分比可以容易地使用例如Clustal W程序，版本1.8，1999年6月，使用默认参数来确定(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res 22：4673-4680)。
如所指出的，本发明的放射性标记的生物分子可以靶向任何患病或恶性细胞群。在某些情况下，可能优选使用小生物分子。脑转移瘤是已经从体内其他器官的原发性肿瘤扩散到大脑的癌细胞。转移性肿瘤是大脑中最常见的肿块病变之一。估计所有癌症患者中有24-45％患有脑转移瘤。肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌和肾癌通常会扩散到大脑。脑转移瘤与生存不良和高死亡率有关。改善用于转移性脑肿瘤的疗法是本发明的一方面。
乳腺癌的脑转移瘤的计算孔径小于直径10nm。(Mittapali等(2017)Cancer Res77(2)：238-246)。因此，需要小分子有效地靶向和治疗转移性脑肿瘤。为了用于转移性脑肿瘤的诊断和治疗，本发明的靶向生物分子是小分子，包括但不限于亲和体、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、适体和VHH分子(也称为单域抗体片段(sdAb)或纳米抗体)，在本文中统称为小生物分子。其他“小分子”骨架的特征在于质量/尺寸，例如尺寸小于10nm或小于25kDa。如所指出的，这些小生物分子被设计为结合癌细胞的一部分。例如，可以制备VHH以特异性结合癌细胞上的受体，如人表皮生长因子受体2(HER2)或上面列出的任何其他受体。例如参见，美国专利号9,234,028；9,309,515；8,524,244；9,234,065；Liu等(2012)JTransl.Med.10:148；Gijs等(2016)Pharmaceuticals(Basel)9(2):29；Moosavian等(2015)Iran J.Basic Med.Sci.18(6):576-586；Mahlknecht等(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.110:8170-8175；
由于它们的体积小，VHH、适体和其他小生物分子在整个实体瘤中有效地扩散和分布，并且由于它们对靶抗原的高结合特异性和亲和力，可以观察到小生物分子的高肿瘤吸收。重要的是，它们在血液中的半衰期明显短于全长抗体或较大的靶向蛋白，从而允许肾脏快速清除小生物分子的未结合部分，从而在给药后不久导致更高的肿瘤与正常组织之比。通过从免疫骆驼或美洲驼中克隆并通过噬菌体展示淘选来容易地以纳摩尔至皮摩尔的亲和力产生VHH。此外，VHH或sdAb稳定且易于使用工业级方法和合格的细菌、酵母或哺乳动物细胞大量生产。与其他基于小蛋白的靶向载体相比，VHH在稳定性、溶解性、表达产量、多聚体构建以及识别隐藏或罕见表位的能力方面通常具有明显的优势。参见美国专利号：6,248,516；6,300,064；6,846,634；6,846,634；6,696,245；9,243,065；7,696,320；所有这些通过引用并入本文。
适体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子。适体可以是核酸分子(DNA、RNA、XNA)，并且由寡核苷酸、肽分子的短链组成，所述肽分子由一个或多个短可变肽结构域组成。适体提供了易于通过化学合成产生的分子识别特性，具有所需的存储特性，并且在治疗应用中几乎没有免疫原性。参见，Keefe等(2010)Nature Reviews Drug Discovery 9：537-550；Ellington和Szostak(1990)Nature 346：818-822；Tuerk和Gold(1990)Science 249：505-510；Kulbachinskiy,A.V.(2007)Biochemistry 72:1505-1518；所有这些通过引用并入本文。
如本文所用，在对象内的放射的“(计算的平均)有效剂量”是指身体的所有指定组织和器官中的等效剂量的组织加权总和。它考虑了放射的类型以及所放射的每个器官或组织的性质。它是国际放射防护委员会(ICRP)设计的国际放射防护系统中放射防护剂量限制的中心量。有效剂量的SI单位是西弗特(Sv)，是1焦耳/千克(J/kg)。有效剂量在1991年的ICRP剂量系统中取代了以前的“等效有效剂量”。对于使用放射性药物的程序，有效剂量通常以每单位注射活性表示，即以mSv/MBq表示。然后，针对单个患者的有效剂量将取决于以MBq表示的放射性药物的注射活性，以及以mSv/MBq表示的计算的平均有效剂量。
放射性药物的有效剂量是使用2004年获得FDA批准的
Figure BDA0002296007960000251
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软件计算的。
Figure BDA0002296007960000253
个人计算机代码执行放射性药物的剂量计算和动力学建模(OLINDA/EXM代表器官水平内部剂量评估/指数建模)。通过全身给药的放射性药物计算出对人体不同器官的放射剂量，并对用户提供的生物动力学数据进行回归分析，以支持核医学药物的此类计算。这些计算用于对在核医学的诊断和治疗应用中使用此类药物进行风险/收益评估。该技术为成人、儿童、孕妇和其他人采用了几种标准的人体模型，这些模型在内部剂量界已被广泛接受和使用。该计算对制药行业开发者、核医学专业人士、教育者、监管者、研究人员以及其他研究放射性药物给患者或研究对象时应提供的可接受放射剂量的人很有用。
计算的有效剂量取决于所选的标准人体模型和所选的排尿膀胱模型。本文提供的值已使用成年女性模型和1小时的排尿膀胱间隔进行了计算。
因此，在某些实施方式中，通过将本公开的放射性标记的小生物分子即适体、VHH或其功能性片段等给药至有此需要的对象来实现癌症的预防和/或治疗，其特征在于：在对象中，小分子的计算的平均有效剂量介于0.001和0.05mSv/MBq之间，例如但不限于计算的平均有效剂量为0.02至0.05mSv/MBq，更优选为0.02至0.04mSv/MBq，最优选为0.03至0.05mSv/MBq。
因此，每次给药施加于患者的放射性剂量必须足够高以使其有效，但必须低于将导致剂量限制毒性(DLT)的剂量。对于包含放射性标记的抗体、例如131碘的药物组合物，必须确定在治疗环境中不得超过的最大耐受剂量(MTD)。
根据适合于预防和/或治疗要预防或治疗的疾病或病症的治疗方案，施用本文所设想的蛋白质和肽(以下统称为生物分子)和/或包含它们的组合物。临床医生通常将能够确定合适的治疗方案。通常，治疗方案将包括以一种或多种药学有效量或剂量施用一种或多种小生物分子，如VHH序列或多肽，或一种或多种包含它们的组合物。
所需剂量可以方便地以单剂量或以适当的间隔施用的分开剂量(也可以再次分为子剂量)存在。给药方案可以包括长期(即至少两周，例如几个月或几年)或每日治疗。特别地，给药方案可以在每天一次至每年一次之间变化，例如在每天一次至每十二个月一次之间变化，例如但不限于每周一次。因此，取决于所需的治疗持续时间和效果，本公开的药物小生物分子组合物可以在数天、数周或数月内一次或几次给药，并且间歇地给药，例如每天给药，并且以不同的剂量给药。本文公开的小生物分子组合物的给药量取决于癌症或其他待治疗疾病的性质。为了在避免DLT的同时实现向癌症的有效放射剂量递送，可能优选多次给药。然而，放射性标记的材料通常以间隔4至24周，优选间隔8至20周的间隔给药。本领域技术人员知道如何将给药分为两次或更多次应用，这些应用可以彼此紧接着或以其他预定间隔范围应用，例如1天到1周。
特别地，本公开的生物分子可以与其他药物活性化合物或原理结合使用，这些化合物或原理可以或可以用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和紊乱，因此可能获得或可能没有协同作用。这样的化合物和原理的实例以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生是清楚的。
在本发明的上下文中，“与……结合”、“联合疗法”或“联合治疗”是指将放射性标记的生物分子(例如VHH、适体等，如本文所公开的)与一种或多种其他药物活性化合物或原理一起以一种方案对患者施用，该方案中患者可以从这种组合的有益效果中受益。特别地，两种治疗在接近的时间内被施用于患者。在一个优选的实施方式中，两种治疗均在四周(28天)内施用于患者。更优选地，两种治疗均在两周(14天)内进行，更优选在一周(7天)内进行。在一个优选的实施方式中，两种治疗在两或三天内进行。在另一个优选的实施方式中，两种治疗在同一天，即24小时内进行。在另一个实施方式中，两种治疗在四个小时或两个小时或一个小时内进行。在另一个实施方式中，两种治疗平行地、即同时施用，或者两种施用在时间上重叠。
在特定的非限制性实施方式中，本发明的放射性标记的生物分子与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段一起施用。因此，在这些特定的非限制性实施方式中，将具有放射性标记的生物分子的靶向放疗与具有一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段的常规免疫治疗组合。在进一步的特定实施方式中，将放射性标记的生物分子用于与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段的联合疗法或联合治疗方法，例如但不限于曲妥珠单抗
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和/或帕妥珠单抗
Figure BDA0002296007960000272
的联合治疗。
例如，可以同时输注放射性标记的生物分子和一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段，例如但不限于曲妥珠单抗
Figure BDA0002296007960000281
和/或帕妥珠单抗
Figure BDA0002296007960000282
或者输注可以在时间上重叠。如果两种药物同时给药，则可以将它们配制成一种药物制剂，也可以在即将从两种不同药物制剂给药之前将它们混合在一起，例如溶解或稀释到一种输注溶液中。在另一个实施方式中，两种药物分开给药，即，作为两种独立的药物组合物。在一个优选的实施方式中，两种治疗的给药方式是使患者体内的肿瘤细胞同时暴露于有效量的细胞毒性药物和放射。在另一个优选的实施方式中，有效量的本发明的放射性标记的生物分子和一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段(例如但不限于曲妥珠单抗
Figure BDA0002296007960000283
和/或帕妥珠单抗
Figure BDA0002296007960000284
)同时存在于肿瘤部位。本发明还涵盖其他试剂的用途，所述试剂除了定义的组合外还被给药。例如，这可以是一种或多种其他化疗剂。它也可以是一种或多种药物，用于预防、抑制或改善所给任何其他药物的不良副作用。例如，可施用刺激白细胞增殖的细胞因子以减轻白细胞减少症或中性粒细胞减少症的作用。
根据另一方面，提供了本文所设想的特异性结合感兴趣的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶分子的放射性标记生物分子的用途，用于制备用于预防和/或治疗涉及所述肿瘤特异性或癌细胞特异性靶分子的至少一种癌症相关疾病和/或病症的药物。因此，本申请提供了与肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标特异性结合的生物分子，例如以上所述的那些，用于预防和/或治疗涉及所述肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的至少一种癌症相关疾病和/或病症。在特定实施方式中，还提供了预防和/或治疗至少一种癌症相关疾病和/或病症的方法，其包括向有需要的对象施用药学有效量的一种或多种生物分子，包括VHH序列或其功能性片段、多肽、适体等，和/或本文设想的药物组合物。
用本文所述的放射性标记的生物分子治疗的对象或患者可以是任何温血动物，但是尤其是哺乳动物，更特别地，是患有癌症相关疾病和/或其他疾病病症或有患癌症相关疾病和/或其他疾病病症风险的人类。本文所述的生物分子即VHH序列或其功能性片段、适体、多肽等以及包含它们的组合物的功效可以使用本身已知的任何合适的体外测定法、基于细胞的测定法、体内测定法和/或动物模型、或其任何组合来测试，取决于所涉及的具体疾病或病症。本领域技术人员将清楚合适的测定法和动物模型。
根据所涉及的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标，本领域技术人员通常将能够选择合适的体外测定法、细胞测定法或动物模型以测试本文所述的生物分子与肿瘤特异性或癌细胞特异性分子的结合；以及针对一种或多种癌症相关疾病和病症的治疗和/或预防作用。
因此，提供了包含或基本上由至少一种放射性标记的生物分子或其功能性片段组成的生物分子，其用作药物，更特别地，用于治疗与疾病或病症有关的癌症、包括实体瘤的方法。
在特定的实施方式中，本文设想的放射性标记的生物分子用于治疗和/或预防癌症和赘生性疾病。癌症或赘生性疾病的实例包括但不限于纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮内肉瘤、淋巴管内肉瘤、淋巴管内膜上皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、间皮瘤、风湿性关节炎、伊温食道癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管瘤体、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波济肉瘤。本文设想的生物分子也可以用于治疗多种增生性疾病。增生性疾病的例子包括造血肿瘤疾病和细胞增生性和/或分化性疾病，例如但不限于上皮增生、硬化性腺病和小导管乳头状瘤；肿瘤，例如间质性肿瘤，如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤，以及上皮性肿瘤，如大导管乳头状瘤；乳腺癌，包括原位(非侵入性)癌，包括原位导管癌(包括佩吉特病)和原位小叶癌，以及浸润性(浸润)癌，包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、髓样癌、胶体(粘液性)癌、肾小管癌和浸润性乳头状癌，各种恶性肿瘤，男性乳房发育癌，支气管癌，包括副肿瘤综合征，细支气管肺泡癌，神经内分泌肿瘤，例如支气管类癌，其他肿瘤和转移性肿瘤；胸膜病变，包括炎症性胸腔积液，非炎症性胸膜积液，气胸和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维瘤(胸膜纤维瘤)，恶性间皮瘤，非肿瘤性息肉，腺瘤，家族性综合征，结直肠癌，结直肠癌，结节性增生，腺瘤和恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肿瘤，结肠上皮肿瘤，浆液性肿瘤，粘液性肿瘤，子宫内膜样肿瘤，透明细胞腺癌，囊腺纤维瘤，布伦纳瘤，表面上皮瘤；生殖细胞肿瘤，例如成熟的(良性)畸胎瘤，单皮畸胎瘤，未成熟恶性畸胎瘤，消化不良，皮内窦瘤，绒毛膜癌；性索-间质肿瘤，例如，颗粒-鞘膜细胞瘤，彗形纤维瘤，雄性母细胞瘤，丘细胞瘤和性腺母细胞瘤；和转移性肿瘤，例如克鲁肯伯格肿瘤。
在给药用所要求的人造化合物标记的生物分子后，放射成像可以通过标准放射学方法进行，例如包括用伽马相机(放射线照相术)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)扫描身体(例如参见Bradwell等，Immunology Today 6：163-170，1985)。对于体内使用，与生物分子偶联的标记的人造化合物应以诊断或治疗上可接受的量给予。治疗上可接受的量是当以一种或多种剂量给予时产生期望的治疗效果(例如肿瘤缩小)且具有临床治疗可接受的毒性水平的量。这样的给药量将引起足够的放射以被吸收在肿瘤细胞内，从而例如通过破坏其DNA来破坏这些细胞。这样的给药量优选应当对邻近和远处的健康细胞造成最小的损害。
可以基于组合物的具体质量、患者的症状、年龄和体重、所治疗的特定疾病的进展以及其他相关因素来确定特定组合物的剂量和施用组合物的方式。如果组合物包含抗体，则组合物的有效剂量在约5μg至约50μg/kg患者体重，约50μg至约5mg/kg的范围内，约100μg至约500μg/kg患者体重和约200至约250μg/kg的范围内。放射性的诊断学上可接受的量是允许根据诊断需要从标记的生物分子中检测放射性的量，其毒性水平为诊断可接受。
以下提供各种实施方式。
实施方式1：式I表示的化合物(包含人造化合物和放射性卤素前体)：
其中：
X是CH或N；
L1和L3独立地选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链和聚乙二醇(PEG)链；
MMCM是大分子偶联部分；
L2是取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链，或包括至少三个氧原子的聚乙二醇(PEG)链，其中L2任选地包含刷状缘酶可裂解的肽；
CG选自胍、PO3H、SO3H、一个或多个带电D-氨基酸、精氨酸、膦酰基/磺基苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亲水性碳水化合物部分、聚乙二醇(PEG)链、和胍基-Z；
Z是(CH2)n；
n大于1；和
Y是烷基金属放射性卤素前体或选自18F、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At的放射性卤素，或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
实施方式2：实施方式1所述的化合物，其中Y是烷基金属放射性卤素前体，选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)。
实施方式3：实施方式1所述的化合物，其中Y是选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At的放射性卤素。
实施方式4：实施方式1-3中任一项所述的化合物，其中MMCM是活性酯或(Gly)m，其中m是1或更大。
实施方式5：如实施方式1-3中任一项所述的化合物，其中MMCM选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、四氟苯酚(TFP)酯、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基。
实施方式6：如实施方式1-3中任一项所述的化合物，其中MMCM是Gly-Gly-Gly。
实施方式7：如实施方式1-6中任一项所述的化合物，其中L2是(CH2)p，其中p＝1到6。
实施方式8：如实施方式1-7中任一项所述的化合物，其中任选的刷状缘酶可裂解的肽选自Gly-Lys、Gly-Tyr和Gly-Phe-Lys。
实施方式9：如实施方式1-8中任一项所述的化合物，其用以下结构表示：
Figure BDA0002296007960000321
实施方式10：实施方式9所述的化合物，其中化合物是N-琥珀酰亚胺基3-胍基甲基-5-[131I]碘苯甲酸酯、或N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹-5-胍基苯甲酸甲酯。
实施方式11：放射性标记的生物分子或中间体，其包含与生物分子连接的实施方式1-10中任一项所述的化合物。
实施方式12：实施方式11所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子选自抗体、抗体片段、VHH分子、适体或其变体。
实施方式13：实施方式11或12所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述标记的生物分子是VHH。
实施方式14：实施方式13所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH靶向HER2。
实施方式15：实施方式14所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH包含选自SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。
实施方式16：药物组合物，(当化合物是人造化合物的形式)其包含实施方式11-15中任一项所述的放射性标记的生物分子以及药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
实施方式17：式2表示的化合物(包含人造化合物和放射性卤素前体)：
MC-Cm-L4-Cm-T
式2，
其中：
MC是多齿金属螯合部分；
Cm是硫脲、酰胺或硫醚；
L4选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链(任选地在一个或两个末端上具有NH、CO或S)、以及聚乙二醇(PEG)链；且
T是实施方式1-10中任一项所述的化合物，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
实施方式18：实施方式17所述的化合物，其中MC是大环结构。
实施方式19：实施方式17所述的化合物，其中MC选自DOTA、TETA、NOTP、和NOTA。
实施方式20：实施方式17所述的化合物，其中MC是无环多齿配体。
实施方式21：实施方式17所述的化合物，其中MC选自EDTA、EDTMP、和DTPA。
实施方式22：实施方式17-21中任一项所述的化合物，还包含与MC缔合的金属。
实施方式23：实施方式21所述的化合物，其中金属是选自177Lu、64Cu、111In、90Y、225Ac、213Bi、212Pb、212Bi、67Ga、68Ga、89Zr、和227Th的放射性金属。
实施方式24：实施方式17-23中任一项所述的化合物，其中Y是烷基金属部分(且所述化合物是放射性卤素前体)。
实施方式25：实施方式24所述的化合物，其中烷基金属部分选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)。
实施方式26：实施方式17-23中任一项所述的化合物，其中Y是放射性卤素，如75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、或211At(且所述化合物是人造化合物)。
实施方式27：放射性标记的生物分子或中间体，其包含与生物分子连接的实施方式17-26中任一项所述的化合物。
实施方式28：实施方式27所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子选自抗体、抗体片段、VHH分子和适体。
实施方式29：实施方式27所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述标记的生物分子是VHH。
实施方式30：实施方式29所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH靶向HER2。
实施方式31：实施方式30所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH包含选自SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。
实施方式32：药物组合物，(当化合物是人造化合物)其包含实施方式27-31中任一项所述的放射性标记的生物分子以及药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
实施方式33：一种癌症的治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效量的实施方式11-15或27-31中任一项所述的放射性标记的生物分子或有效量的权利要求或实施方式16或32中所述的药物组合物。
本公开包括两种、三种、四种或更多种上述实施方式的任何结合、和两个、三个、四个或更多个本文所阐述的特征或元素的结合，无论这些特征或元素是否在本文的特定实施方式中明确结合。
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实验
实施例1：SIB-Arg
Figure BDA0002296007960000351
方案1：SIB-Arg标准品的合成方法
Figure BDA0002296007960000352
方案2：SIB-Arg锡前体的合成方法
Figure BDA0002296007960000353
方案3：放射性卤代SIB-Arg的合成方法
将D-精氨酸在0.1M碳酸钠缓冲液(pH 8.5)中的溶液(174.2mg；1mmol在3.5ml中)逐渐添加到双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-碘间苯二甲酸酯(486.2mg；1mmol)在四氢呋喃(THF；5.0ml)中的溶液。在室温下搅拌混合物，并通过薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程。溶剂蒸发后，对粗物质进行反相半制备高效液相色谱(HPLC)。按照相同的步骤，1mmol(524mg)双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)5-(三甲基甲锡烷基)间苯二甲酸酯与1mmol D-精氨酸偶联。在标准条件下将锡前体放射性卤代，纯化后与大分子偶联。
实施例2：Arg-Gly-Tyr-PEG-SIB
以下方案4-6中显示了一个分子，该分子包含带有胍基的氨基酸精氨酸，刷状缘酶可裂解的接头二肽GlyTyr，并通过PEG接头连接到SIB部分(Arg-Gly-Tyr-PEG-SIB)。该分子的放射性标记形式，例如，Arg-Gly-Tyr-PEG-[131I]SIB，是使用标准的碘代脱甲锡烷基化反应从相应的锡前体获得的。
Figure BDA0002296007960000361
方案4：Arg-Gly-Tyr-PEG-SIB标准品的合成
Figure BDA0002296007960000362
方案5：Arg-Gly-Tyr-PEG-SIB锡前体的合成
Figure BDA0002296007960000363
方案6：放射性卤代Arg-Gly-Tyr-PEG-SIB的合成
N-乙酰精氨酰基-甘氨酰基酪氨酸是通过固相肽合成法合成的，并与PEG二胺偶联(n＝2-4)。或者，可以将PEG二胺固定在三苯甲基氯树脂上，并且可以将三个氨基酸依次连接。在THF和0.1M碳酸钠缓冲液(pH 8.5)的混合物中，将所得的肽衍生物(1mmol)与双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-碘间苯二甲酸酯(486.2mg；1mmol)反应。通过反相HPLC追踪反应进程，并且在完成后，通过反相半制备HPLC分离产物。通过用双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-(三甲基甲锡烷基)间苯二甲酸酯取代双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-碘间苯二甲酸酯，用类似的方法合成锡前体。锡前体经过放射性卤化和纯化，以便使用标准条件与大分子偶联。
实施例3：DOTA-PEG-SIB
方案7中显示了DOTA-PEG-SIB的合成方案。可以使用相同的方法来合成其锡前体。锡前体可以在标准条件下用放射性碘标记；存在于碘和锡衍生物中的DOTA部分均可与非放射性镥络合。与SIB-DOTA(Vaidyanathan等(2012)Bioorg.Med.Chem.20(24)：6929-6939)不同，DOTA大环中的所有四个COOH基团均可与金属离子络合，而PEG接头取代了疏水的6-碳烷基链。同样，并且重要的是，接头可以包括刷状缘酶可裂解的氨基酸序列。
Figure BDA0002296007960000371
方案7：DOTA-PEG-SIB的合成
将在DMF(0.5mL)中的5-(叔丁氧基)-5-氧代-4-(4,7,10-三(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)戊酸(DOTAGA四叔丁基酯；30mg，43μmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(13.8mg，120μmol)，N-Boc-2-{2-[2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙胺(35mg，120μmol)，和EDC(18.6mg，120μmol)的混合物在20℃下搅拌过夜。然后通过半制备反相HPLC纯化，得到三叔丁基2,2',2”-(10-(2,2,24,24-四甲基-4,18,22-三氧代-3,8,11,14,23-五氧杂-5,17-重氮二十五烷-21-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯，为油状物(16mg，16μmol，39％收率)。LRMS(LCMS-ESI)m/z：975.7(M+H)+。向上述产物(16mg，16μmol)中加入三氟乙酸(300μl)，所得溶液在20℃下搅拌过夜。蒸发TFA，得到2,2',2”-(10-(1-氨基-16-羧基-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六烷-16-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸，为油状物(10mg，15.4μmol，产率96％)。LRMS(LCMS-ESI)m/z：651.3(M+H)+。通过使一当量的每种试剂以及一当量的N，N-二异丙基乙胺在DMF中反应，将上述产物与双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-碘间苯二甲酸酯偶联。通过反相HPLC纯化产物，并与大分子偶联，随后用放射性金属如177Lu标记。
实施例4：预偶联-概念
先前的例子说明了一些方法，包括首先合成放射性卤代的分子(从锡或其他烷基金属前体)，然后将放射性标记的分子偶联到大分子上。另一种方法是首先使放射性卤素的前体与大分子反应，然后对该蛋白质-前体偶联物进行放射性标记。第二种方法称为预偶联，其具有几个潜在的优点，包括减少合成时间(对放射性很重要)和提高总产率。预偶联替代方案由于其化学差异，是放射性金属标记而非放射性卤素标记的通用方法，首先将含锡前体分子与大分子偶联。然后可以将这种衍生的大分子放射性卤代，其中该过程优选在低于6.5的pH下进行。在方案8中使用方案7中所示的试剂(与非放射性镥络合)说明了该方法。
Figure BDA0002296007960000391
方案8：Lu-DOTA-PEG-SIB锡前体与蛋白质的预偶联以及合成偶联物的放射性卤化
可替代地，具有未络合的DOTA部分的碘代衍生物可以用于用放射性金属例如177Lu标记。例如，对于177Lu，将177LuCl3(2Ci/ml，0.05M HCl中10μl)用0.15M乙酸铵缓冲液稀释，并与100-1000μg的DOTA-PEG-SIB反应，当反应完成时，通过标准尺寸排阻色谱法进行纯化。
此外，具有未络合的DOTA部分的锡衍生物可以与大分子偶联，然后可以用放射性金属和放射性卤素标记。
实施例5：预偶联-实验方法
DOTAGA衍生物2,2',2”-(10-(1-氨基-16-羧基-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六烷-16-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸按照与上述碘代衍生物中所述的相同的步骤与双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-(三甲基甲锡烷基)间苯二甲酸酯偶联。然后将其与非放射性镥络合。为此，在10ml的0.4M乙酸盐缓冲液(pH 5.2)中，用5当量的LuCl3处理50μmol锡衍生物。通过反相HPLC追踪反应进程，并且通过反相半制备HPLC纯化镥络合物。然后将络合物偶联至大分子。为此，将大分子在0.2M碳酸钠缓冲液(pH 8.5)中的溶液(10nmol/ml)添加到人造剂在DMSO中的溶液(25mM；5μl，125nmol)中，并将混合物在20℃下孵育1小时。分离得到的大分子-人造基团偶联物，同时通过具有适当分子量截断值(例如，对于VHH为10kDa)的VivaSpin超滤单元(GE医疗公司(GE Healthcare))过滤，将缓冲液换为0.2M乙酸盐(pH 5.5)然后将经修饰的大分子在pH为5的条件下进行放射性卤代。
实施例6：放射性碘化前用载体碘对大分子进行预碘化
在上述策略中(预偶联烷基金属人造剂，然后进行放射性卤化)，特别是对于放射性碘化的一个缺点是，除了用于放射性标记的预期位点(即带有烷基金属基团的部分)之外，存在于大分子中的组成酪氨酸残基也可以被放射性碘化。将放射性碘放在酪氨酸上的问题是，由于内源性脱碘酶的作用，放射性一旦在体内就会脱落，而不会被大分子定位在癌细胞上。尽管可以通过在较低的pH值(4-5)下进行放射性碘化来使其最小化，但仍不能完全避免。避免此潜在问题的一种方法是，在对大分子进行放射性碘化之前，首先将非放射性碘引入到这些酪氨酸残基上。在这些相同的内源性脱碘酶的介导下，组成酪氨酸残基上的非放射性碘很可能会被去除，从而恢复原来的酪氨酸结构，并保持大分子对预定靶标的亲和力。蛋白质的非放射性碘化可以简单地通过在氧化剂(如氯胺-T)存在下用过量的碘化钠处理蛋白质来实现。
作为该方法的一个实例，在室温下，将pH 7.4的0.5M磷酸钠缓冲液中的VHH蛋白与分别为15当量的碘化钠和氯胺-T反应5-10分钟。通过添加亚硫酸氢钠(2摩尔当量的氯胺-T)淬灭反应。碘化蛋白质通过凝胶过滤或超滤纯化。
实施例7：
针对CNS疾病的靶向放疗。治疗中枢神经系统(CNS)癌症的一种有吸引力的策略是靶向放疗，其使用如本发明的小生物分子的载体将放射性核素选择性地递送至恶性细胞群。靶向放疗的一个优势是，人们可以选择一种与预期临床应用的限制条件最匹配的放射性核素，这对于中枢神经系统肿瘤意味着选择具有使正常中枢神经系统组织的辐射最小化的组织范围的放射。例如，肿瘤性脑膜炎(NM)表现为CSF中的游离癌细胞和隔室壁上的片状沉积物。放射剂量学计算表明，发出短程放射的放射性核素是通过最大程度地增加对肿瘤细胞的放射剂量沉积，同时最小化对脊髓的剂量，最适合治疗NM。
VHH分子。VHH分子也被称为单域抗体片段(sdAb)或纳米抗体，源自单峰驼(Camelidae)，是天然抗体的最小抗原结合片段，分子量(～15kDa)比完整mAb小一个数量级。与人工亲和抗体(Affibody)骨架不同，通过从免疫骆驼或美洲驼中克隆并通过噬菌体展示淘选来容易地以纳摩尔至皮摩尔的亲和力产生VHH。与其他基于小蛋白的靶向载体相比，VHH在热和化学稳定性、免疫原性低、溶解性、表达产量、多聚体构建以及识别隐藏或罕见表位的能力方面通常具有明显的优势。目前，单体形式和多聚体形式的VHH正作为包括炎症在内的多种疾病的治疗剂进行临床评估。一组抗HER2 VHH已用多种放射性核素标记，包括99mTc、68Ga、18F、131I、和177Lu。这些放射性标记的VHH在3-6％ID/g的范围内显示出最高的肿瘤吸收，并且从肾脏以外的所有正常组织中被迅速清除。本发明提供了更有效的放射性标记的生物分子，其将显示出显著更高的肿瘤吸收，在包括肾脏在内的正常组织中的较低蓄积，改善的放射性标记效率，并用于靶向内化受体，例如HER2和HER1。
α粒子发射体：CNS肿瘤靶向放疗的基本原理。β发射体如131I就像当前CNS肿瘤治疗中使用的外部射束辐射一样，是能量转移低的辐射。另一方面，α粒子具有较高的线性能量转移(LET)放射，其杀死癌细胞的能力不会受到缺氧、剂量率效应或细胞周期位置的影响，从而增强了它们对CNS肿瘤的靶向放疗的吸引力。与低LET放射的情况不同，抗性机制并不限制α粒子的有效性，因为细胞修复由α粒子诱导的DNA双链断裂的能力有限，这也已被证明可以通过凋亡机制杀死肿瘤细胞。组织中的α粒子范围仅为50-80μm，仅相当于几个细胞直径，它们应最适合破坏CSF中的游离漂浮肿瘤细胞、脊髓上的薄片肿瘤以及颅内转移瘤，同时最大程度地减少与肿瘤相邻的正常CNS组织的辐射。因此，本发明包括β和α发射体。
实施例8：放射性标记的异-SAGMB和异-SGMIB作为用于表达HER-2的癌症的靶向放疗的人造剂
1.导言
人表皮生长因子受体2(HER2)在患有多种类型癌症的一部分患者中过表达，包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌和卵巢癌。高达20-30％的乳腺癌过表达HER2，并且HER2表达已显示出更具侵略性的表型，包括转移至中枢神经系统(CNS)的可能性更大。此外，据报道接受抗-HER2单克隆抗体(mAb)曲妥珠单抗治疗的患者脑转移和软脑膜癌的发生率更高。曲妥珠单抗经常通过控制许多患者的全身性疾病而延长生存期；然而，这增加了CNS病变的机会，但曲妥珠单抗却由于递送不良而对此无效，这是由于这种大蛋白的血脑屏障不可渗透性。
HER2阳性CNS疾病患者的预后很差；因此，迫切需要在不损害神经功能(可能是包括常规放疗在内的非特异性治疗的不幸的副作用)的情况下更有效的治疗方法。用于提高癌症治疗特异性的一种有吸引力的方法是靶向放疗，其中使用mAb或其他载体将细胞毒性放射性核素选择性地递送至癌细胞。在CNS内的疾病中，α粒子(组织范围只有少数几个细胞直径(50-80μm)的放射)可能是有利的，因为它可以使正常组织的交叉辐射最小化。而且，α粒子具有较高的相对生物学有效性，每个细胞仅需进行几次遍历即可达到破坏目的。
作为α粒子治疗HER2阳性癌症治疗潜力的初步研究，将曲妥珠单抗用7.2小时半衰期α发射体211At标记，并在体外评估了其对3种表达HER2的人乳腺癌细胞系的细胞毒性。211At标记的曲妥珠单抗的相对生物学有效性比常规外部射束疗法高约10倍，每个细胞仅结合几个211At原子，即可显著降低存活率。在HER2阳性乳腺癌脑膜炎模型中进行了后续研究，以评估鞘内注射211At标记的曲妥珠单抗的单次治疗的疗效。观察到一些长期幸存者的中位生存期显著延长。然而，即使直接注射到鞘内腔室中，组织病理学分析也显示神经轴突的区域已在某些动物中逃脱了治疗。完整的mAb不适合与短寿命的α发射体(例如211At)组合使用，因为它们的大尺寸会阻碍均质递送，并且在静脉内应用中会导致正常组织清除缓慢。
为了克服这些限制，已经开发了多种较小的靶向HER2的蛋白质，包括重组片段(例如双抗体和微型抗体)和较小的骨架(例如亲和抗体)。另一个有吸引力的靶向放疗平台(衍生自单峰驼的仅重链抗体，称为单域抗体片段(sdAb))，仅重链抗体(VHH)或纳米抗体的可变区的分子量为12-15kDa。这些VHH可以相对廉价地产生，具有nM到pM的亲和力，高的热和化学稳定性以及低免疫原性。而且，由于它们的体积小，它们可以从血液和正常组织中被迅速清除并有效地穿透肿瘤，这些特性对于211At这样的短寿命的α发射体特别有利。最后，在动物模型和最近的临床成像试验中，已经产生了几种对HER2具有高度亲和力的VHH，并报道它们靶向HER2阳性癌症。
评估了试剂N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹-4-胍基苯甲酸甲酯([211At]SAGMB)以及新的残留试剂N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹-5-胍基苯甲酸甲酯(异-[211At]SAGMB)的用于用211At标记5F7 VHH的潜在效用。同时，评估了用β-粒子发射体131I标记的类似试剂N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-[131I]碘苯甲酸酯([131I]SGMIB)和N-琥珀酰亚胺基3-胍基甲基-5-[131I]碘苯甲酸酯(异-[131I]SGMIB)的潜在效用。在表达HER2的乳腺癌细胞和异种移植物中评估了四种残留试剂的肿瘤靶向特性。
2.材料和方法
2.1.概述
除另有说明外，所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。从珀金埃尔默生命与分析科学公司(Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences)(美国马萨诸塞州波士顿)获得在0.1N NaOH中的[131I]碘化钠(44.4TBq/mmol)。在杜克大学(DukeUniversity)CS-30回旋加速器上通过209Bi(α，2n)211At反应用28MeV的α粒子轰击天然铋金属靶生产砹-211。如前所述，通过干馏从目标物中分离出砹-211，将其截留在PEEK或PTFE管中，最后用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)的甲醇溶液(0.2mg/mL)萃取。如前所述合成了琥珀酰亚胺基4/5-((1，2-二(叔丁氧基羰基)胍基)甲基)-3-碘苯甲酸酯(Boc2-SGMIB/异-SGMIB)及其相应的锡前体(Boc2-SGMTB/异-SGMTB)。使用配备了126型可编程溶剂模块的BeckmanGold HPLC系统、166NM型可变波长检测器和ScanRam RadioTLC扫描仪/HPLC检测器组合来执行高效液相色谱(HPLC)。使用Laura软件(LabLogic)获取和处理HPLC数据。使用4.6×250mm Partisil硅胶柱(10μm；奥特奇公司(Alltech)，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德)进行正相HPLC，以1mL/min的流速以等度模式用0.2％乙酸在75:25己烷:乙酸乙酯(v/v)中的混合物洗脱。用于凝胶过滤的一次性PD 10脱盐柱购自GE医疗公司(美国新泽西州皮斯卡特维)。使用硅胶浸渍的玻璃纤维板(颇尔公司(Pall Corporation)，美国纽约州东山)，以pH 7.4的PBS为流动相，进行即时薄层色谱(ITLC)。使用上述TLC扫描仪或通过将薄片切成小条并在自动伽马计数器中计数来对已显影的薄片进行放射性分析。使用LKB 1282(芬兰瓦尔克拉克)或Perkin Elmer Wizard II(美国康涅狄格州谢尔顿)自动伽玛计数器评估各种样品中的放射性水平。
2.2.抗HER2 5F7 VHH分子
抗HER2 5F7 VHH分子是从Ablynx NV(比利时根特)获得的礼物，该分子选自衍生自美洲驼的噬菌体文库，该噬菌体文库已用SKBR3人乳腺癌细胞进行了免疫。其生产、纯化和表征如前所述(参见Pruszynski M，Koumarianou E，Vaidyanathan G，Revets H，Devoogdt N，Lahoutte T等《用放射性碘标记的抗HER2纳米抗体靶向乳腺癌》，Nucl MedBiol 2013；40：52-9，通过引用并入本文)，只是省去了甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(GGC)C-末端尾巴，从而得到纯单体制剂。
2.3.细胞和细胞培养条件
细胞培养试剂购自英杰公司(Invitrogen)(美国纽约州格兰德岛)。BT474M1人乳腺癌细胞在含有10％胎牛血清(FCS)、链霉素(100μg/mL)和青霉素(100IU/mL)的DMEM/F12培养基(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州)中生长。在37℃的5％CO2湿润培养箱中培养细胞。
2.4.[131I]SGMIB和异-[131I]SGMIB的合成
在大多数实验中，[131I]SGMIB和异-[131I]SGMIB如先前报道的那样，通过使用叔丁基氢过氧化物(TBHP)作为氧化剂且使用氯仿作为溶剂对相应的锡前体进行放射性碘代脱甲锡烷基化来合成。参见Vaidyanathan G，Zalutsky MR.N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-[*I]碘苯甲酸酯的合成：一种用于标记内化的蛋白质和多肽的放射性碘标记剂。Nature Prot2007；2：282-6和Choi J，Vaidyanathan G，Koumarianou E，McDougald D，Pruszynski M，Osada T等，N-琥珀酰亚胺基胍基甲基碘苯甲酸酯蛋白质放射性卤化剂：异构取代对放射性标记和靶细胞残留的影响。Nucl Med Biol 2014；41：802-12，它们通过引用并入本文。在最近的实验中，NCS被用作氧化剂，反应在甲醇中进行。为此，将NCS在甲醇(0.2mg/mL；100μL)、乙酸(1μL)和[131I]碘化物(1-2μL；37-74MBq)中的溶液依次加入到装有50μg所需锡前体的半微量玻璃小瓶中，使反应在20℃下进行15分钟，同时不时搅动小瓶。大部分溶剂用氩气流蒸发，残留物在乙酸乙酯和水(分别为200μL)之间分配。分离乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，并蒸发乙酸乙酯。残留的放射性在HPLC流动相(200μL)中被重构，并注入到正相色谱柱中。分离和脱保护的程序如下所述，用于[211At]SAGMB和异-[211At]SAGMB。
2.5.[211At]SAGMB和异-[211At]SAGMB的合成
将NCS/甲醇(30-56MBq)中的砹-211加入装有200μg所需锡前体的小瓶中，然后加入10μL乙酸。将反应混合物在20℃孵育30分钟，并用温和的氩气流蒸发掉甲醇。将残留的混合物重新溶解于20μL(75:25)己烷/乙酸乙酯中，并注入正相HPLC柱中。分离出包含Boc2-异-[211At]SAGMB或Boc2-[211At]SAGMB的HPLC馏分(tR＝～25分钟)，并将其中的溶剂在氩气流下蒸发20分钟。通过在20℃下用100μL三氟乙酸(TFA)处理10分钟来除去Boc保护基。为确保完全除去TFA，将乙酸乙酯的添加(50μL)和蒸发过程进行了3次。然后将残留的放射性原样用于5F7 VHH标记。
2.6. 5F7 VHH的放射性标记
如先前报道的，用[131I]SGMIB或异-[131I]SGMIB进行5F7 VHH的碘131标记。参见Choi J，Vaidyanathan G，Koumarianou E，McDougald D，Pruszynski M，Osada T等，N-琥珀酰亚胺基胍基甲基碘苯甲酸酯蛋白质放射性卤化剂：异构取代对放射性标记和靶细胞残留的影响。Nucl Med Biol 2014；41：802-12，其通过引用并入本文。对于211At标记，将5F7 VHH在0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中的溶液(50μL,2mg/mL)添加到含有[211At]SAGMB或异-[211At]SAGMB活性的小瓶中，并将混合物在20℃下孵育20分钟。标记的5F7 VHH通过在PD-10色谱柱上的凝胶过滤进行纯化，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗脱。使用前，用人血清白蛋白预处理PD-10色谱柱，以最大程度地减少非特异性结合。
2.7.质量控制程序
通过ITLC和SDS-PAGE对每种131I和211At标记的5F7制备物进行评估，以分别确定蛋白质相关的放射性以及聚集体和多聚体种类的存在。对于ITLC，将pH 7.4的PBS用作流动相；使用该系统，完整的蛋白质保留在原点(Rf＝0)，并且较低分子量的放射性物质以Rf值为0.7-0.8迁移。如前所述，在非还原条件下进行SDS-PAGE和磷光成像。通过Lindmo方法，使用涂有HER2细胞外域的磁珠或作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)，确定标记的5F7 VHH偶联物的免疫反应性分数。简而言之，将标记的5F7(～5ng)的等分试样与浓度加倍的HER2和BSA双包被的珠子一起孵育，并计算出外推至无限量HER2过量的特异性结合，将其作为免疫反应分数。
2.8.放射性标记的5F7偶联物的结合亲和力
将BT474M1乳腺癌细胞以8×104细胞/孔的密度铺在24孔板中，并在37℃下孵育24小时。然后使细胞在4℃下适应30分钟，然后添加浓度递增的放射性标记的5F7偶联物(0.1–100nM)。然后将细胞在4℃下孵育2小时，去除含有未结合放射性的培养基，并用冷PBS洗涤细胞两次。最后，通过在37℃下用1N NaOH(0.5mL)处理10分钟来溶解细胞。使用自动伽玛计数器对细胞相关的放射性进行计数。为了确定非特异性结合，除了将100倍过量的曲妥珠单抗也加入到孵育培养基中之外，如上进行平行测定。使用GraphPad Prism软件拟合数据以确定Kd值。
2.9.内化试验
使用BT474M1乳腺癌细胞，以配对标记的形式进行内化和细胞处理试验。以3mL培养基中以每孔8×105细胞的密度将细胞铺在6孔板中，并在37℃过夜孵育后，升至4℃，孵育30分钟。移除培养基，并补充新鲜的、分别含有5nmol的[211At]SAGMB-5F7加[131I]SGMIB-5F7或异-[211At]SAGMB-5F7加异-[131I]SGMIB-5F7的培养基，并将细胞在4℃下进一步孵育1小时。去除含有未结合放射性的细胞培养上清液，并加入37℃的新鲜培养基。如前所述，在37℃下孵育1、2、4、6和24小时后，确定在细胞膜上内化或释放到细胞培养上清液中的初始细胞结合放射性的分数。为了确定非特异性吸收，除了将100倍摩尔过量的曲妥珠单抗也加入到孔中之外，如上进行平行实验。
2.10.配对标记生物分布实验
按照杜克大学机构动物护理和使用委员会(Duke University InstitutionalAnimal Care and Use Committee)制定的准则进行动物实验。如先前所述(参见Pruszynski M，Koumarianou E，Vaidyanathan G，Revets H，Devoogdt N，Lahoutte T等，通过N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-碘苯甲酸酯放射性标记提高抗HER2纳米抗体的肿瘤靶向性，J Nucl Med 2014；55：650-6，其通过引用并入本文)，在SCID小鼠中建立了皮下BT474M1肿瘤异种移植物，并且当肿瘤达到约350-500mm3的体积时，进行了两个配对标记的生物分布研究。5只小鼠的组接受每个标记分子约185kBq的尾静脉注射。在第一个实验中，施用了[211At]SAGMB-5F7(178MBq/mg)和[131I]SGMIB-5F7(174MBq/mg)，在第二个中，注射了异-[211At]SAGMB-5F7(85MBq/mg)和异-[131I]SGMIB-5F7(89MBq/mg)。以这种方式，可以直接比较两种异构体构型中211At对131I的替代对肿瘤靶向和体内稳定性的影响。注射后1小时、2小时、4小时和21小时评估生物分布；在第二项研究中还包括了14小时的额外时间点。收集血液和尿液，并用过量的异氟烷杀死小鼠。分离肿瘤和正常组织，印迹干燥，并与血液和尿液一起称重。使用自动伽玛计数器对所有组织样品和5％注射标准品的131I和211At活性进行计数，并计算出每个器官和每克组织的注射剂量百分比(％ID)。
2.11.统计学分析
数据表示为平均值±标准差。使用Microsoft Office Excel程序，通过配对的双尾斯氏t检验，分析了共同孵育(体外)或共同给药(体内)的标记偶联物的行为差异的统计学显著性，未共同孵育或共同给药的标记偶联物的行为差异则通过未配对的斯氏t检验进行了测试。P值<0.05的差异被认为具有统计学显著性。
3.结果
3.1.放射性标记
方案9提供了合成四种放射性卤代5F7 VHH偶联物的方案。
Figure BDA0002296007960000481
方案9：用[211At]SAGMB/异-[211At]SAGMB进行211At标记、或用[*I]SGMIB/异-[*I]SGMIB进行放射性碘标记的5F7 VHH分子的合成
在相同条件下，合成异-[211At]SAGMB-Boc2的放射化学产率为66.8±2.4％(n＝7)，而合成[211At]SAGMB-Boc2的放射化学产率为62.6±2.3％(n＝6)。尽管两种产率的差异很小，但具有统计学显著性(P<0.05)。[211At]SAGMB-Boc2的合成的放射化学产率与以前报道的当使用TBHP作为氧化剂且使用氯仿作为溶剂时的放射化学产率相似。在本文报道的大多数实验中，使用TBHP作为氧化剂合成了[131I]SGMIB和异-[131I]SGMIB；然而，在一些研究中，使用NCS作为氧化剂、甲醇作为溶剂合成了[131I]SGMIB和异-[131I]SGMIB，所得放射化学产率分别为69.2±4.2％(n＝4)和84.0±4.5％(n＝2)，大大高于使用TBHP和氯仿获得的放射化学产率。
通过与[211At]SAGMB和异-[211At]SAGMB反应来完成用211At标记5F7 VHH，这是通过用TFA处理Boc2-[211At]SAGMB和Boc2-异-[211At]SAGMB获得的。当在相同条件下进行操作时，异-[211At]SAGMB(39.5±6.8％；n＝5)和[211At]SAGMB(38.4±15.6％；n＝6)与5F7的偶联效率相似(P>0.05)。用[131I]SGMIB和异-[131I]SGMIB标记5F7的偶联效率分别为28.9±13.0％(n＝6)和33.1±7.1％(n＝6)。通过ITLC分析获得的异-[211At]SAGMB-5F7、[211At]SAGMB-5F7、异-[131I]SGMIB-5F7和[131I]SGMIB-5F7的放射化学纯度分别为98.9％、97.8％、98.6％和98.4％。如图1所示，在非还原条件下进行的SDS-PAGE表明，单个条带中4种放射性卤代5F7偶联物的放射性超过98％，分子量约为15kDa，相当于VHH单体的分子量。
3.2.免疫反应性分数和结合亲和力
为了确定标记5F7 VHH是否会破坏HER2结合，使用HER2的胞外域作为分子靶标，以配对标记的形式确定免疫反应性分数。异-[211At]SAGMB-5F7、[211At]SAGMB-5F7/异-[131I]SGMIB-5F7和[131I]SGMIB-5F7的免疫反应性分数分别确定为81.3±0.9％，83.5±1.1％，81.8±1.4％和84.5±0.8％，这表明5F7 VHH保留了相似程度的免疫反应性，而与所用的人造剂无关。对于四个标记的偶联物，从表达HER2的BT474M1人乳腺癌细胞上进行的饱和结合测定获得的解离常数(Kd)值＜5nM(图2)。图2的数据是基于将细胞(8×104)与浓度递增的标记的VHH偶联物一起孵育和如本文所述确定的与细胞相关的特定放射性而提供的。使用GraphPad Prism软件生成图并计算Kd值。但是，与[211At]SAGMB-5F7(4.5±0.4nM)相比，异-[211At]SAGMB-5F7(3.0±0.1nM)的亲和力结合明显更高(P<0.05)。异-[131I]SGMIB-5F7和[131I]SGMIB-5F7的Kd值分别为1.3±0.2nM和2.4±0.2nM，再次表明异构型偶联物的亲和力结合更高。131I标记的偶联物比其相应的211At标记的5F7对应物具有明显更高的结合亲和力(P<0.05)。
3.3.内化测定
使用表达HER2的BT474M1细胞进行配对标记内化测定，以确定[211At]SAGMB-5F7和异-[211I]SAGMB-5F7(图3)和[131I]SGMIB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7(图4)在体外对放射性的细胞内捕获程度。图3所示的数据是基于从两个不同的实验中获得的两种标记的5F7版本生成的。如图3所示，[211At]SAGMB-5F7与细胞相关(膜结合+内化)并被内化的初始结合放射活性的百分比在24小时内几乎保持恒定，此时观察到分别为77.4±0.8％和67.2±1.1％的值。通常，改变人造剂的性质不会影响HER2阳性癌细胞中放射性的残留。例如，在6小时时，异-[211At]SAGMB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7的初始结合放射性分别有69.5±1.2％和73.2±1.7％保留在细胞内区室中。但是，与[131I]SGMIB-5F7和[211At]SAGMB-5F7的行为不同，异-[131I]SGMIB-5F7的细胞内放射性水平(49.0±3.6％)和异-[211At]SAGMB-5F7的细胞内放射性水平(48.4±5.5％)在24小时时比1-6小时时明显降低(P<0.05)。
3.4.生物分布研究
在具有皮下BT474M1乳腺癌异种移植物的SCID小鼠中进行了两对标记实验，以将[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7的组织分布与其131I标记的对应物进行直接比较。表1和表2分别总结了在21小时期间获得的结果，对应于211At衰减的大约三个半衰期。注射后1-4小时[211At]SAGMB-5F7的肿瘤吸收保持在15-16％ID/g，然后在21小时下降至9.49±1.22％ID/g(图5)。对于共同给药的[131I]SGMIB-5F7，观察到相似的肿瘤吸收值(图6)，除了在21小时时放射性碘标记的偶联物的值约高20％(11.8±1.5％ID/g；P＜0.05)。在第二个实验中，与放射性碘标记的对应物相比，观察到了关于异-[211At]SAGMB-5F7肿瘤吸收的相似趋势。然而，在所有时间点，异-[211At]SAGMB-5F7的肿瘤蓄积几乎比[211At]SAGMB-5F7的肿瘤蓄积高50％(图5)，在4小时达到23.4±2.2％ID/g的峰值(差异显著，P<0.05，但在21小时的未配对t检验除外)。同样，在所有时间点，异-[131I]SGMIB-5F7的肿瘤吸收显著高于[131I]SGMIB-5F7的肿瘤吸收(图6)。除肾脏外，四种5F7放射性偶联物的正常组织吸收率较低，特别是对于异-[211At]SAGMB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7。在肾脏中，异偶联物的活性水平显著低于相应的非异偶联物的活性水平(通过未配对t检验，P<0.05)(图7和8)，而211At标记的偶联物的差异不明显。由于211At标记的化合物预期具有较低的碳-卤素键强度，因此与已知的隔离游离砹化物和碘化物的组织甲状腺和胃中的活性水平进行比较，可以阐明这些偶联物的相对体内稳定性。注射四种5F7 VHH偶联物后，甲状腺和胃中211At和131I活性的吸收分别总结在图9和10中。两种211At标记的5F7偶联物的甲状腺和胃蓄积均显著高于其131I标记的共同给药的对应物。然而，与[211At]SAGMB-5F7相比，异-[211At]SAGMB-5F7的甲状腺和胃活动水平低约两倍，这表明异-[211At]SAGMB-5F7在体内的脱砹程度较低。
如图11所示，在所有组织中，异-[211At]SAGMB-5F7的肿瘤与正常组织之比均显著高于[211At]SAGMB-5F7。例如，与[211At]SAGMB-5F7的7.31±1.26、32±4、7.11±1.47和0.67±0.08相比，异-[211At]SAGMB-5F7在4小时时的肿瘤与肝、肿瘤与血液、肿瘤与脾和肿瘤与肾之比分别为18±4、63±13、21±3和1.50±0.25。同样，在所有组织中，异-[131I]SGMIB-5F7的肿瘤与正常组织之比均显著高于[131I]SGMIB-5F7(图12)。最后，放射性碘标记的5F7VHH偶联物的肿瘤与正常组织之比明显高于相应的211At标记的5F7 VHH偶联物。
4.讨论
在本研究中，使用两种相关的人造剂[211At]SAGMB和异-[211At]SAGMB成功地用α粒子发射体放射性卤素211At标记了抗HER2 5F7 VHH，它们设计为在受体介导的内化作用后，通过产生带正电荷的标记分解代谢物，将放射性核素捕获在表达HER2的癌细胞中。211At标记的曲妥珠单抗在体外和体内在隔室条件下均已证明211Atα粒子对表达HER2的乳腺癌细胞具有高细胞毒性。尽管211At对于靶向放射治疗具有许多潜在优势，但它的α粒子的组织范围短和其7.2小时半衰期的结合令我们需要制定策略，以快速地从正常组织中清除，以实现向癌细胞的均匀且延长的递送。实现此目标的大多数方法都使用小分子，例如mAb片段；但是，与完整mAb的情况不同，211At标记的mAb片段在甲状腺和胃中的摄取量很高，表明体内释放了游离的211At。在HER2靶向空间内，使用N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹苯甲酸(SAB)标记的亲和体(7kDa)观察到了这种行为，其胃和甲状腺水平比相应的125I标记的构建体高25-55倍。抗HER2双抗体也已使用N-琥珀酰亚胺基N-(4-[211At]砹苯乙基琥珀酸酯(SAPS))进行了211At标记，尽管获得了一些令人鼓舞的治疗反应，但未报道211At标记的双抗体的生物分布结果。
在尝试开发最佳的211At标记抗HER2构建体时，重要的是不仅要考虑上述体内稳定性问题，而且在结合和内化标记分子后如何最大化癌细胞中放射性截留的程度和持续时间很重要。另外，必须选择一种蛋白形式，该蛋白形式可以在治疗相关水平上快速靶向肿瘤，而不会在正常组织中延长停留时间。用抗-HER2 VHH SGMIB偶联物获得的优异结果为当前研究提供了动力，该研究评估了胍基甲基取代的人造基团在用211At标记5F7 VHH方面的潜在用途。在携带BT474M1异种移植物和两种构建体的SGMIB小鼠中在SGMIB标记后评估了具有(参见Pruszynski M，Koumarianou E，Vaidyanathan G，Revets H，Devoogdt N，LahoutteT等，通过N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-碘苯甲酸酯放射性标记提高抗HER2纳米抗体的肿瘤靶向性，J Nucl Med 2014；55：650-6，在此引用作为参考)或不具有(参见VaidyanathanG，McDougald D，Choi J.，Koumarianou E，Weitzel D，Osada T等，通过免疫PET对18F标记的抗HER2纳米抗体偶联物进行HER2受体表达成像的临床前评估.J Nucl Med 2016；57：967-73)GGC尾巴的5F7 VHH，注射后2小时肿瘤吸收达到峰值，表明该VHH的定位动力学与211At的7.2小时半衰期兼容。因为没有GGC尾巴的版本以纯单体形式存在(相对地，5F7-GGC以单体和二聚体的混合物形式存在)(参见Pruszynski M，Koumarianou E，Vaidyanathan G，Revets H，Devoogdt N，Lahoutte T等，通过N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-碘苯甲酸酯放射性标记提高抗HER2纳米抗体的肿瘤靶向性，J Nucl Med 2014；55：650-6，其通过引用并入本文)，并且表现出明显更高的肿瘤定位性，因此选择无尾的5F7构建体用于这些实验。
由于砹原子比碘原子的尺寸更大，所以位阻可能是211At标记的一个更为重要的因素。基于观察到的与[131I]SGMIB相比、异-[131I]SGMIB显著更高的放射性碘化和蛋白偶联产率，对异-[211At]SAGMB(1,3,5-异构体)和[211At]SAGMB(1,3,4-异构体)进行了标记5F7 VHH的评估。尽管异-[211At]SAGMB的放射性标记和VHH偶联产率比[211At]SAGMB的高，但这些差异并不显著。这些人造基团以及其放射性碘标记的对应物的偶联导致单体产物具有出色的免疫反应性和亲和力(<5nM)，可与过表达HER2的BT474M1乳腺癌细胞结合。[131I]SGMIB-5F7的结果与先前报道的[131I]SGMIB-5F7-GGC构建物非常一致。参见Pruszynski M，Koumarianou E，Vaidyanathan G，Revets H，Devoogdt N，Lahoutte T等,通过N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-碘苯甲酸酯放射性标记提高抗HER2纳米抗体对肿瘤的靶向性.J NuclMed 2014；55：650-6，其通过引用并入本文。对于这两种异构体，对211At标记的5F7偶联物的亲和力约为相应的131I标记的5F7 VHH偶联物的亲和力的一半。尽管不受任何作用机制的束缚，但据信砹原子的较大尺寸和/或211Atα粒子的放射分解作用可能会降低结合亲和力。尽管如此，异-[211At]SAGMB-5F7(3.0±0.1nM)和[211At]SAGMB-5F7(4.5±0.4nM)的结合亲和力应与其用作靶向放射治疗剂相容。
结合放射性标记的受体靶向蛋白并对其进行细胞加工后，最大限度地增加癌细胞中放射性核素的俘获应提高靶向放射治疗的有效性。用曲妥珠单抗和5F7 VHH进行的内化分析表明，用[*I]SGMIB或异-[*I]SGMIB标记这些靶向HER2的蛋白质可导致长达6小时的类似程度的放射性碘的细胞捕获；然而，在24小时时，异-[*I]SGMIB偶联物的总细胞相关和内化活性明显较低。参见Choi J，Vaidyanathan G，Koumarianou E，McDougald D，PruszynskiM，Osada T等，N-琥珀酰亚胺基胍基甲基碘苯甲酸酯蛋白质放射性卤化剂：异构取代对放射性标记和靶细胞残留的影响。Nucl Med Biol 2014；41：802-12，其通过引用并入本文。尽管这些结果表明，异-[*I]SGMIB的残留能力不如[*I]SGMIB的残留能力长，但对于211At来说，由于其7.2小时的半衰期，这可能并不是一个明显的缺点。在BT474M1乳腺癌细胞上进行配对标记实验可以直接比较异-[211At]SAGMB-5F7和[211At]SAGMB-5F7与放射性碘标记的对应物的细胞相关活性和细胞内活性。我们的结果表明，砹对碘的取代对1,3,4-和1,3,5-异构体的残留量均无影响；但是，对于后者，在24小时时，异-[211At]SAGMB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7均观察到细胞内捕获的显著减少。尽管导致这种现象的机理尚不清楚，但对于1,3,5-异构体来说，似乎更高的分解代谢速率和/或标记的分解代谢物的逸出可能起作用。尽管如此，即使使用异-[211At]SAGMB-5F7，初始结合的放射性的48.4±5.5％仍在24小时时内化，这令人鼓舞，因为此时超过90％的211At原子会衰变。
这项研究的主要重点是对211At标记的5F7 VHH偶联物的评估，据我们所知，这是评估该有前途的α发射体标记VHH分子的首次尝试。这些试剂之一的[211At]SAGMB已成功用于标记与表皮生长因子受体的突变形式反应的内化完整mAb L8A4。但是，必须谨慎地将结果从一种蛋白质构建体外推到另一种蛋白质构建体。例如，已显示Nε-(3-[131I]碘苯甲酰基)-Lys5-Nα-马来酰亚胺基-Gly1-GEEEK(131I-IB-Mal-D-GEEEK)是标记完整mAb L8A4的极好试剂，但在肿瘤吸收方面没有优势，而在标记5F7 VHH方面却没有肾脏吸收方面的明显缺点。重要的是，在携带源自同一BT474M1细胞系的异种移植物的SCID小鼠中进行的配对标记生物分布研究中，在用[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7进行内化分析中观察到的在表达HER2的BT474M1癌细胞中高且长时间的放射性保留得以重复。用这些211At标记的5F7偶联物观察到的肿瘤蓄积量比另一种以99mTc、177Lu、68Ga和18F标记的靶向HER2的VHH 2Rs15d以及以各种放射性核素(包括211At)标记的HER2特异性亲和体所报道的肿瘤蓄积量高两倍至三倍。
关于异构体替代模式影响肿瘤活性水平的可能性，在所有时间点上，与[131I]SGMIB-5F7和[211At]SAGMB-5F7相比，异-[131I]SGMIB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7表现出显著且出乎意料的约1.5倍的肿瘤递送优势。但是，这似乎不能反映残留能力的差异，因为直到最后一个时间点，在体外内化试验中，两种异构体均观察到相似程度的细胞内捕获。关于211At和131I标记的VHH偶联物的体内行为差异，HER2阳性BT474M1异种移植物中[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7的定位在早期与共同给药的131I标记类似物的定位相当，但在21小时时降低了约20％。这可能反映了体内稳定性中卤素依赖性的差异，最可能的原因是砹的脱卤速率更高，这与砹的C-X键强度较低相一致。这也得到了甲状腺和胃中的211At水平高于131I这一发现的支持，其中，已知对于这两种异构体，甲状腺和胃组织会隔离游离的放射性卤化物。但是，注射[211At]SAGMB-5F7后甲状腺和胃中的活性水平分别为0.4-0.6％和1.0-2.3％ID，而异-[211At]SAGMB-5F7的活性水平分别为0.2-0.3％和0.6-1.7％ID，这表明异-[211At]SAGMB-5F偶联物的脱砹程度较低。同样，注射异-[131I]SGMIB-5F7后的胃和甲状腺放射性水平低于[131I]SGMIB-5F7，表明这些放射性卤代的sdAb偶联物的体内稳定性存在意想不到的异构体依赖性差异。但是，[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7在甲状腺和胃中吸收211At的程度均低于使用多种不同方法标记的多种低分子量蛋白质的报道水平。即使来自[211At]SAGMB-5F7和异-[211At]SAGMB-5F7的211At[砹化物]的损失相对较低，也可以增加正常组织的毒性，这与使用211At标记的抗体进行的临床研究一样，使用封闭剂可以显著降低这种情况。
放射性碘标记偶联物的肿瘤与正常组织之比通常比砹化版本更高，这大概反映了碘代版本的体内稳定性更高。出乎意料的是，当使用异-人造剂标记5F7 VHH时，两种放射性核素的肿瘤与正常组织之比均明显更高。如表1和2所示，这不仅反映了肿瘤吸收方面的一些优点，而且还反映了正常组织中活性水平明显降低，尤其是131I标记的偶联物。此行为的可能解释是质量效应，其中需要一定质量的VHH分子以阻止正常器官(如肝脾和肺)非特异性吸收标记的VHH。参见Xavier C，Vaneycken I，D’Huyvetter M，Heemskerk J，KeyaertsM，Vincke C等，用于癌症的HER2受体表达的iPET成像的68Ga-NOTA-抗-HER2纳米抗体的合成，临床前验证，剂量测定和毒性。JNucl Med 2013；54：776-784，其通过引用并入本文。这可能是相关的，因为[211At]SAGMB-5F7加上[131I]SGMIB-5F7生物分布实验是以2.1μg的5F7VHH总剂量进行的，而在异-[211At]SAGMB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7研究中，共施用了4.3μg的5F7总剂量。但是，这可能不是一个因素，因为在当前研究中的VHH总剂量为2.1μg时观察到的[131I]SGMIB-5F7的生物分布与之前报道的[131I]SGMIB-5F7在5F7总剂量分别为4.3和6.8μg时的生物分布非常相似。参见Vaidyanathan G，McDougald D，Choi J.，KoumarianouE，Weitzel D，Osada T等通过免疫PET对18F标记的抗HER2纳米抗体偶联物进行HER2受体表达成像的临床前评估。J Nucl Med 2016；57：967-73，其通过引用并入本文。此外，对于抗HER2 VHH 2Rs15d，用0.1和1μg的剂量的68Ga标记后，在两种剂量之间观察到明显的质量依赖性定位差异，但在1和10μg的剂量之间没有观察到差异，这涵盖了本研究中使用的剂量。
两种具有相同放射性卤素的异构体在生物学行为上观察到的差异是出乎意料的，特别是鉴于先前在同一动物模型中比较了异-[125I]SGMIB-曲妥珠单抗和[131I]SGMIB-曲妥珠单抗时观察到的组织分布相似性。参见Choi J.等，Nucl Med Biol 2014；41：802-12，其通过引用并入本文。但是，VHH分子的大小比完整mAb小约10倍，这可能导致其更迅速地降解为足够小的物质，从而易于与脱碘酶和其他可能导致脱卤的酶、例如细胞色素P450接触。与[131I]SGMIB-5F7相比，异-[125I]SGMIB-5F7的代谢稳定性更高，这可以通过两种偶联物的分解代谢差异以及标记的分解代谢物对体内脱碘的敏感性来解释。如最近的综述所总结的，放射性碘化化合物在设计上的细微差异可导致脱碘率增加。与此一致，间碘苄基胍(异-SGMIB的结构元素)的脱碘作用小于邻碘苄基胍(SGMIB的结构元素)的脱碘作用。计划进行研究以评估由异-SGMIB-VHH和SGMIB-VHH偶联物生成的标记分解代谢物的化学性质，以更好地理解导致其体内行为差异的机理。
使用VHH分子作为靶向放射治疗平台的潜在问题是肾脏中放射性的高蓄积和长期保留，这可能导致剂量限制肾毒性。在放射性金属如177Lu)以及一些残留的放射性卤化剂如131I-IB-Mal-D-GEEEK中，已经观察到这种行为。例如，当使用131I-IB-Mal-D-GEEEK标记5F7-GGC时，从注射后1至8小时肾脏水平大于150％ID/g，在24小时肾脏水平约为100％ID/g。相反，在当前研究中评估的所有四种放射性卤代5F7偶联物中，初始肾脏放射性水平较高(60-100％ID/g)，但以约为1-2小时的肾脏清除半衰期迅速下降。出人意料的是，在所有时间点，131I和211At标记的异偶联物的肾脏放射性水平均显著低于其相应的1,3,4-异构体偶联物所观察到的水平，并且肾脏保留的差异随时间增加。例如，注射异-[131I]SGMIB-5F7后21小时观察到的肾脏放射性水平比[131I]SGMIB-5F7低4倍以上。还观察到肾脏活性水平的放射性核素依赖性差异，尽管程度小于给定放射性核素的两种异构体之间的差异。矛盾的是，注射异-[211At]SAGMB-5F7后的肾脏放射性水平高于共同给药的异-[131I]SGMIB-5F7的水平，而注射[211At]SAGMB-5F7后的肾放射性水平低于共同给药的[131I]SGMIB-5F7的水平。四种5F7 VHH放射性偶联物在肾脏吸收和保留方面的差异目前尚无法解释，考虑到酰化剂在物理性质(如极性和亲水性，这可能影响肾脏保留)上的相似性的相似性，这是出乎意料的。此外，先前的研究表明，用[131I]SGMIB和[211At]SAGMB标记的完整mAb L8A4与用[131I]SGMIB和异-[125I]SGMIB标记的曲妥珠单抗的肾脏吸收值之间无显著差异。尽管导致其较低的肾脏放射性水平的机制尚不清楚，异-[211At]SAGMB和异-[131I]SGMIB偶联物是选择的试剂，可最大程度地减少5F7和可能的其他VHH对肾脏的辐射吸收剂量。如果需要进一步降低肾脏放疗剂量，则已证明至少可以通过与血浆扩张剂Gelofusin共输注177Lu标记的VHH偶联物来实现。
总之，证明了抗HER2 5F7 VHH可以以合理的产率用211At标记，并且标记后具有优异的亲和力和免疫反应性。在临床前模型中使用[211At]SAGMB-5F7进行的研究表明，肿瘤靶向性高且持续时间长，并且正常组织清除迅速，而用异-[211At]SAGMB-5F7则观察到更有利的观察结果。此外，与[131I]SGMIB-5F7相比，异-[131I]SGMIB-5F7具有显著改善的肿瘤靶向性。综上所述，我们的结果表明，异-[211At]SAGMB-5F7和异-[131I]SGMIB-5F7需要作为发射α粒子和β粒子的靶向放射治疗剂进行进一步评估，以治疗表达HER2的恶性肿瘤。
在本发明的实践中有用的靶向HER2的VHH序列包括SEQ ID NO：1-5中列出的那些。
SEQ ID NO：1
免疫球蛋白重链可变区，部分[单峰驼(Camelus dromedarius)]
DVQLVESGGGSVQGAAGGSLRLSCAASDITYSTDCMGWFRQAPGKEREGVATINNGRAITYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLRPKDTAIYYCAARLRAGYCYPADYSMDYWGKGTQVTVSS
SEQ ID NO：2
免疫球蛋白重链可变区，部分[单峰驼(Camelus dromedarius)]
DVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIYSTYCMGWFRQAPGKEREGVAAINDVGGSVYYADSVKGRFTISQDIAQDTMYLQMNDLTPENTVTYTCAALRCLSDSDPDTRVHMYYDWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：3
免疫球蛋白重链可变区，部分[单峰驼(Camelus dromedarius)]
DVQLEESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTYSSACMGWFRQGPGKEREAVADVNTGGRRTYYADSVKGRFTISQDNTKDMRYLQMNNLKPEDTATYYCATGPRRRDYGLGPCDYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：4
免疫球蛋白重链可变区，部分[单峰驼(Camelus dromedarius)]
EVQLEESGGGLVQPGGSLTLSCAASGYTFTNCAAGWYRQAPGKECELVASIFSGNRTNYADSVKGRFTISRDNTKDIVYLQMNSLKPEDTTVYYCDARTPCWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：5
免疫球蛋白重链可变区，部分[单峰驼(Camelus dromedarius)]
EVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTFLQLLHGWFRQAPGKEREVVARFNTDINKTFYLESVKGRFTLSQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAASRPDSTCDYFAYRGQGTQVTVSS
本说明书中涉及的所有专利申请和出版物指示本发明涉及领域技术人员的水平。所有出版物、专利或专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物或专利申请具体和单独地通过引用纳入本文那样。虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于实施方式的范围。
序列表
<110> 杜克大学
<120> 放射性标记的生物分子及其应用
<130> C102494 1010WO (0005.0)
<150> 62/478,754
<151> 2017-03-30
<150> 62/500,692
<151> 2017-05-30
<150> 62/529,532
<151> 2017-07-07
<150> 62/583,134
<151> 2017-11-08
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 单峰驼
<220>
<221> 免疫球蛋白重链可变区，部分
<222> (1)..(127)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ile Thr Tyr Ser
20 25 30
Thr Asp Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Thr Ile Asn Asn Gly Arg Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Lys Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Arg Ala Gly Tyr Cys Tyr Pro Ala Asp Tyr
100 105 110
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 单峰驼
<220>
<221> 免疫球蛋白重链可变区，部分
<222> (1)..(127)
<400> 2
Asp Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Tyr Ser Thr Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Asp Val Gly Gly Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ile Ala Gln Asp Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asp Leu Thr Pro Glu Asn Thr Val Thr Tyr Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Arg Cys Leu Ser Asp Ser Asp Pro Asp Thr Arg Val His
100 105 110
Met Tyr Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 单峰驼
<220>
<221> 免疫球蛋白重链可变区，部分
<222> (1)..(125)
<400> 3
Asp Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Ala
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Thr Gly Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Thr Lys Asp Met Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Pro Arg Arg Arg Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Cys Asp Tyr
100 105 110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
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<212> PRT
<213> 单峰驼
<220>
<221> 免疫球蛋白重链可变区，部分
<222> (1)..(112)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Cys
20 25 30
Ala Ala Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Phe Ser Gly Asn Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asp Ile Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ala Arg Thr Pro Cys Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 单峰驼
<220>
<221> 免疫球蛋白重链可变区，部分
<222> (1)..(121)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Gln Leu
20 25 30
Leu His Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Arg Phe Asn Thr Asp Ile Asn Lys Thr Phe Tyr Leu Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Pro Asp Ser Thr Cys Asp Tyr Phe Ala Tyr Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (33)

1.式I表示的人造化合物或放射性卤素前体形式的化合物：
Figure FDA0002296007950000011
其中：
X是CH或N；
L1和L3独立地选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链和聚乙二醇(PEG)链；
MMCM是大分子偶联部分；
L2是取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链，或包括至少三个氧原子的聚乙二醇(PEG)链，其中L2任选地包含刷状缘酶可裂解的肽；
CG选自胍；PO3H；SO3H；一个或多个选自精氨酸、膦酰基/磺基苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸的带电D-或L-氨基酸；亲水性碳水化合物部分；聚乙二醇(PEG)链；和Z-胍；
Z是(CH2)n；
n大于1；
m是0到3；且
Y是烷基金属部分或选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At的放射性卤素，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为放射性卤素前体，Y是选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)的烷基金属部分。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为人造化合物，Y是选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At的放射性卤素。
4.如权利要求1所述的化合物，其中MMCM是活性酯或(Gly)m，其中m是1或更大。
5.如权利要求1所述的化合物，其中MMCM选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、四氟苯酚(TFP)酯、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基。
6.如权利要求1所述的化合物，其中MMCM是Gly-Gly-Gly。
7.如权利要求1所述的化合物，其中L2是(CH2)p，其中p＝1到6。
8.如权利要求1所述的化合物，其中任选的刷状缘酶可裂解的肽选自Gly-Lys、Gly-Tyr和Gly-Phe-Lys。
9.如权利要求1的化合物，其由以下结构表示：
Figure FDA0002296007950000021
10.如权利要求9所述的的化合物，其中化合物包括N-琥珀酰亚胺基3-胍基甲基-5-[131I]碘苯甲酸酯、或N-琥珀酰亚胺基3-[211At]砹-5-胍基苯甲酸甲酯。
11.放射性标记的生物分子或中间体，其包含与生物分子连接的权利要求1所述的化合物。
12.如权利要求11所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子选自抗体、抗体片段、VHH分子、适体或其变体。
13.如权利要求11所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子是VHH。
14.如权利要求13所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH靶向HER2。
15.如权利要求14所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH包含选自SEQID NO:1-5所示的氨基酸序列。
16.一种药物组合物，其包含权利要求11所述的放射性标记的生物分子以及药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
17.式2表示的人造化合物或放射性卤素前体形式的化合物：
MC-Cm-L4-Cm-T
式2，
其中：
MC是多齿金属螯合部分；
Cm是硫脲、酰胺或硫醚；
L4选自键、取代或未取代的烷基链、取代或未取代的烯基链、取代或未取代的炔基链(任选地在一个或两个末端上具有NH、CO或S)、以及聚乙二醇(PEG)链；
T是权利要求1-10中任一项所述的化合物，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
18.如权利要求17所述的化合物，其中MC是大环结构。
19.如权利要求17所述的化合物，其中MC选自DOTA、TETA、NOTP、和NOTA。
20.如权利要求17所述的化合物，其中MC是无环多齿配体。
21.如权利要求17所述的化合物，其中MC选自EDTA、EDTMP、和DTPA。
22.如权利要求17所述的化合物，其中所述化合物为放射性卤素前体，Y是选自三甲基甲锡烷基(SnMe3)、三正丁基甲锡烷基(SnBu3)和三甲基甲硅烷基(SiMe3)的烷基金属部分。
23.如权利要求17所述的化合物，其中所述化合物为人造化合物，Y是选自75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I、131I、和211At的放射性卤素。
24.如权利要求17所述的化合物，其进一步包含与MC缔合的金属。
25.如权利要求24所述的化合物，其中金属是选自177Lu、64Cu、111In、90Y、225Ac、213Bi、212Pb、212Bi、67Ga、68Ga、89Zr、和227Th的放射性金属。
26.放射性标记的生物分子或中间体，其包含与生物分子连接的权利要求17所述的化合物。
27.如权利要求26所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子选自抗体、抗体片段、VHH分子和适体。
28.如权利要求26所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述生物分子是VHH。
29.如权利要求28所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH靶向HER2。
30.如权利要求29所述的放射性标记的生物分子或中间体，其中所述VHH包含选自SEQID NO:1-5所示的氨基酸序列。
31.一种药物组合物，其包含权利要求26所述的放射性标记的生物分子以及药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
32.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的个体施用有效量的权利要求11所述的放射性标记的生物分子。
33.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的个体施用有效量的权利要求26所述的放射性标记的生物分子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020242948A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 Duke University 18f-radiolabeled biomolecules
US20230002293A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 Duke University Radiohalogen prosthetic moieties and radiolabeled biomolecules
JP2024518097A (ja) * 2021-05-14 2024-04-24 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 刷子縁膜酵素切断可能リンカーを持つ葉酸受容体標的コンジュゲート並びにガンのイメージング及び治療における使用方法
CA3230848A1 (en) * 2021-09-01 2023-03-09 Duke University Reagents for site-specific labeling of proteins with radiohalogens, and methods of making and using the same
WO2023230488A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Cereius, Inc. Her2-binding agents and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007120251A2 (en) * 2005-12-22 2007-10-25 Duke University Stabilized compositions and methods for radiolabeling pharmaceuticals with alpha-particle emitters
WO2014179715A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Duke University Prosthetic compounds for labeling internalizing biomolecules
US20160030606A1 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Vrije Universiteit Brussel Radio-labelled antibody fragments for use in the prevention and/or treatment of cancer

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5302700A (en) 1988-05-23 1994-04-12 Duke University Radiohalogenation conjugate technology
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
WO2009102421A2 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind egfr
CN103282394B (zh) 2011-01-12 2015-07-01 三菱丽阳株式会社 活性能量线固化性树脂组合物、微细凹凸结构体及微细凹凸结构体的制造方法
KR101279584B1 (ko) 2011-06-24 2013-06-28 대한민국 (식품의약품안전처장) Ｅｒｂｂ2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007120251A2 (en) * 2005-12-22 2007-10-25 Duke University Stabilized compositions and methods for radiolabeling pharmaceuticals with alpha-particle emitters
US20090304585A1 (en) * 2005-12-22 2009-12-10 Duke University Stabilized Compositions and Methods for Radiolabeling Pharmaceuticals with Alpha-Particle Emitters
WO2014179715A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Duke University Prosthetic compounds for labeling internalizing biomolecules
US20160074541A1 (en) * 2013-05-02 2016-03-17 Duke University Prosthetic Compounds for Labeling Internalizing Biomolecules
US20160030606A1 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Vrije Universiteit Brussel Radio-labelled antibody fragments for use in the prevention and/or treatment of cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. VAIDYANATHAN等: "SIB-DOTA: A trifunctional prosthetic group potentially amenable for multi-modal labeling that enhances tumor uptake of internalizing monoclonal antibodies", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
HIROMICHI AKIZAWA等: "Renal Brush Border Enzyme-Cleavable Linkages for Low Renal Radioactivity Levels of Radiolabeled Antibody Fragments", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
JAEYEON CHOI等: "N-Succinimidyl guanidinomethyl iodobenzoate protein radiohalogenation agents: Influence of isomeric substitution on radiolabeling and target cell residualization", 《NUCLEAR MEDICINE AND BIOLOGY》 *

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Publication number Publication date
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