CN117460528A - 抗cldn18.2抗体缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开在本文中提供了抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与放射性核素的缀合物、含有其的药物组合物及其在成像、患者筛选、治疗过程监测和功效评价中的用途。

Description

抗CLDN18.2抗体缀合物
发明领域
本发明涉及核医学，并且特别是放射性标记的CLDN18.2抗体缀合物的制备和应用。
背景技术
在世界范围内，胃癌的发病率和死亡率分别排在第五位和第三位。在中国，胃癌的发病率排名第二。目前，作为靶向人表皮生长因子受体2(HER2)的单克隆抗体的曲妥珠单抗(trastuzumab)是晚期胃癌一线治疗中唯一具有生存益处的药物。近年来，虽然靶向HER2的新药(抗体-药物缀合物、双特异性抗体、小分子抑制剂等)喜报频传，但仍无法摆脱HER2阳性胃癌患者比例低(仅10-12％)、大部分患者在一年内出现耐药性并且耐药性后缺乏精准和有效的靶向药物的尴尬局面。因此，探索胃癌治疗的新靶点是突破晚期胃癌治疗瓶颈的关键。
2016年的FAST研究通过针对靶向CLDN18.2的单克隆抗体IMAB362的一系列实验，验证了胃癌的“新星”靶点Claudin18.2(claudin 18剪接变异体2，CLDN18.2)。然而，到目前为止，还没有关于抗CLDN18.2核素探针的报道发表。
利用现代分子成像技术全面、无创、实时和动态的特点，开发具有高特异性的分子探对CLDN18.2的诊断具有重要意义。因此，对新型抗CLDN18.2核素探针和治疗药物存在重大需求。
发明内容
在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述(the)”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
在一个方面，本公开提供了一种抗CLDN18.2抗体缀合物，其包含与放射性核素缀合的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性核素包含治疗性放射性核素或诊断性放射性核素。
在一些实施例中，所述治疗性放射性核素选自由以下组成的群组：111In、111mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、199Au和211Pb。
在一些实施例中，所述诊断性放射性核素选自由以下组成的群组：18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111ln、123l、124l、125l、131l、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154"1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194lr、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。
在一些实施例中，所述诊断性放射性核素可通过正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)检测。
在一些实施例中，所述放射性核素选自由以下组成的群组：64Cu、67Cu、89Zr、124I、86Y、90Y、111In、123/131I、177Lu、11C、14C、41Ca、67Ga、68Ga、13N、15O、44Sc、18F、99mTc和90mTc。
在一些实施例中，所述放射性核素是124I或123I或131I。
在一些实施例中，所述放射性核素是64Cu、67Cu或89Zr。
在一些实施例中，所述64Cu、67Cu或89Zr经由螯合剂标记至所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述螯合剂包含三个或更多个用于螯合的原子，其中每个原子选自由氮、硫、氧和磷组成的群组。
在一些实施例中，所述螯合剂包含DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为TRITA)；1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为TETA)；和1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为HETA)、乙二胺四乙酸(本文缩写为EDTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。
在一些实施例中，所述放射性核素是64Cu或67Cu并且所述螯合剂包含TETA、NOTA、NODA或NODGA，或者其中所述放射性核素是89Zr并且所述螯合剂包含DFO。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含重链HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中：
所述HCDR1序列包含GYNMN(SEQ ID NO:1)或TYFIGVG(SEQ ID NO:13)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述HCDR2序列包含X1IDPYYX2X3TX4YNQKFX5G(SEQ ID NO:32)，或HIWWNDNKYYNTALKS(SEQ ID NO:15)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述HCDR3序列包含X6X7X8GNAFDY(SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY(SEQ ID NO:17)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR1序列包含KSSQX9LX10NX11GNX12KNYLT(SEQ ID NO:34)或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR2序列包含WASTRX13S(SEQ ID NO:35)或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR3序列包含QNDYX14X15PX16T(SEQ ID NO:36)或其至少80％序列同一性的同源序列；
其中X1是N或Y或H，X2是G或V，X3是A或G或T，X4是R或T或S，X5是K或R，X6是S或M，X7是Y或F，X8是Y或H，X9是S或N，X10是L或F，X11是S或N，X12是Q或L，X13是E或K，X14是S或Y，X15是F或Y，并且X16是F或L。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:3序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:7序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:8序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:9序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:11序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:10序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:13序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:15序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:17序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:12序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:19序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:21序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:14序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:16序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3；或者
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:20序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3。
在一些实施例中，所述重链可变区进一步包含重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4中的一者或多者，并且/或者所述轻链可变区进一步包含轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的一者或多者，其中：
所述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17FT(SEQ ID NO:54)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包含WVX18QAPGQGLEWX19G(SEQ ID NO:55)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR3序列包含RVTX20TIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:56)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包含WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21NC(SEQ ID NO:58)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:59)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包含GVPDRFX22GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:60)或其至少80％序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包含FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:61)或其至少80％序列同一性的同源序列，
其中X17是T或S，X18是R或K，X19是M或I，X20是M或L，X21是I或M，并且X22是S或T。
在一些实施例中，所述HFR1包含选自由SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63组成的群组的序列，
所述HFR2包含选自由SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65组成的群组的序列，
所述HFR3包含选自由SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67组成的群组的序列，
所述HFR4包含SEQ ID NO:57序列，
所述LFR1包含选自由SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69组成的群组的序列，
所述LFR2包含SEQ ID NO:59序列，
所述LFR3包含选自由SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71组成的群组的序列，并且
所述LFR4包含SEQ ID NO:61序列。
在一些实施例中，所述重链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47，以及它们具有至少80％序列同一性但仍保留与CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
在一些实施例中，所述轻链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48，以及它们具有至少80％序列同一性但仍保留与CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
在一些实施例中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:23序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:25序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:29序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26或28序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:37序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:38序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:39序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:40序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:41序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:43序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:45序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46序列；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:47序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48序列。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留与人CLDN18.2的特异性结合亲和力。
在一些实施例中，所述取代或修饰中的至少一者在所述CDR序列的一个或多个中，和/或在所述VH或VL序列的非CDR区的一个或多个中。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区、任选地人Ig的恒定区或任选地人IgG的恒定区。
在一些实施例中，所述恒定区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
在一些实施例中，所述人IgG1的恒定区包含SEQ ID NO:49，或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一些实施例中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是双特异抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双特异抗体(ds双特异抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双特异抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的抗体缀合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在一些实施例中，放射化学纯度为至少95％(例如97％、98％、99％)。
在另一方面，本公开提供了一种获取受试者中感兴趣部位图像的方法，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者的所述感兴趣部位经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者中来自放射性核素的可检测信号；
d)生成所述可检测信号的图像，从而获得所述受试者中所述感兴趣部位的图像。
在一些实施例中，所述感兴趣部位是表达或怀疑表达claudin 18.2的部位。
在一些实施例中，所述感兴趣部位患有或怀疑患有肿瘤。
在另一方面，本公开提供了一种以无创方式检测或可视化受试者中claudin 18.2表达的方法，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定或可视化所述受试者的所述感兴趣部位中的claudin18.2表达。
在一些实施例中，所述方法进一步包含向被识别为在所述感兴趣部位具有claudin18.2表达的受试者施用治疗有效量的抗claudin 18.2疗法。
在一些实施例中，所述方法进一步包含基于所识别的可检测信号确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的分布。
在一些实施例中，所述方法进一步包含确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的异质性。
在一些实施例中，所述感兴趣部位是肿瘤。
在另一方面，本公开提供了一种以无创方式监测受试者的治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展的方法，其中所述受试者已接受一个治疗期的治疗，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定所述受试者的感兴趣部位中的治疗后claudin18.2表达；
e)将治疗后claudin18.2表达水平或分布分别与在所述治疗期之前从所述受试者获得的基线claudin18.2表达水平或分布进行比较以确定所述受试者中claudin18.2表达水平或分布的治疗后变化；以及
f)基于步骤(e)中确定的变化确定治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展。
在一些实施例中，基线claudin18.2表达水平或分布使用类似方法确定。
在一些实施例中，基线claudin18.2表达水平或分布在治疗期之前(即治疗前)通过向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT，识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号，并基于所识别的可检测信号确定所述受试者的感兴趣部位中基线claudin18.2表达来确定。在一些实施例中，用于确定基线claudin 18.2表达的感兴趣部位与用于确定治疗后claudin 18.2表达的感兴趣部位相同或至少相当。
在一些实施例中，claudin 18.2表达水平或扩散的增加表明治疗功效降低、对治疗的反应性降低或存在抗性或存在复发。
在一些实施例中，所述受试者患有癌症。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者中的CLDN18.2相关疾病或病症的方法，包含向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的所述抗CLDN18.2抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物。
在一些实施例中，所述疾病或病症是癌症，任选地是表达CLDN18.2的癌症。
在一些实施例中，所述受试者被识别为患有表达CLDN18.2的癌症。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物或本文提供的组合物。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文提供的第一抗CLDN18.2抗体缀合物和本文提供的第二抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述第一抗CLDN18.2抗体缀合物包含诊断性放射性核素，并且所述第二抗CLDN18.2抗体缀合物包含治疗性放射性核素。
在一些实施例中，所述试剂盒用于本文提供的方法。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物或本文提供的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于本文提供的获得受试者中感兴趣部位图像的方法，或用于本文提供的以无创方式检测或可视化受试者中claudin 18.2表达的方法，或用于本文提供的以无创方式监测受试者的治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展的方法，其中所述抗CLDN18.2抗体缀合物包含诊断性放射性核素。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物或本文提供的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于本文提供的治疗有此需要的受试者的CLDN18.2相关疾病或病症的方法，其中所述抗CLDN18.2抗体缀合物包含治疗性放射性核素。
在另一方面，本公开提供了一种制备本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与用124I、123I或131I标记的碘化物在酶促或化学氧化剂的存在下反应。
在一些实施例中，所述化学氧化剂是N-溴代琥珀酰亚胺、氯甘脲(Iodogen)或氯胺-T。
在另一方面，本公开提供了一种制备本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与螯合剂缀合以获得螯合剂-抗体缀合物，并使所述螯合剂-抗体缀合物与64Cu或89Zr反应。
在一些实施例中，所述螯合剂包含DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、TRITA(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；和HETA(1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NETA({4-[2-(双-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N′,N″,三(2-巯基乙基)1,4,7-三氮杂环壬烷)、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧基乙基)次膦酸])、CP256,PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、多肟及其衍生物。
附图说明
图1显示了124I-18B10探针的放射性标记率和放射化学纯度：A)纯化后的放射化学纯度；B)纯化后的放射化学纯度；C)在PBS中1小时后的放射化学纯度；D)在PBS中48小时后的放射化学纯度。
图2显示了124I-18B10及其对照组在MKN45-CLND18.2高/MKN45细胞中的摄取。
图3显示了124I-18B10在正常昆明小鼠中的生物分布。
图4显示了本发明实例5中124I-18B10及其对照组和18F-FDG在CLDN18.2阳性/阴性PDX模型中的Micro-PET成像比较。
图5A-B是柱状图，其使用表位作图显示了嵌合抗体与突变的hCLDN 18.2变异体的结合信号。当E56突变为Q时，18B10-C的结合完全丧失。这一变化也适用于IMAB362和其他嵌合抗体，除了59A9-C以外。其他氨基酸如A42、N45也在一定程度上促进了IMAB362和其他抗体的结合，但对18B10-C来说并非如此。
图6显示了124I-18B10在PDX小鼠中的生物分布。
图7显示了源自前五名患者图像的124I-18B10在患者中的生物分布。
图8显示了124I-18B10在患者卵巢病变中的累积。
具体实施方式
以下对本公开的描述仅打算说明本公开的各种实施例。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本公开范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，这些等效实施例将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文所用，在本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a/an)”、“所述(the)”和类似术语应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或与上下文明显相悖。
如本文所用，术语“抗体”包括与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物的轻链分为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的主干由经由二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合结构域的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani的惯例来定义或识别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人，《分子生物学杂志》十二月5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；N.R.Whitelegg等人，《蛋白质工程(ProteinEngineering)》,v13(12),819-824(2000)；Chothia,C.等人，《自然(Nature)》十二月21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人，《美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)》,Bethesda,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc等人，《发育和比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-PauleLefranc等人，《免疫组学研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-PauleLefranc,《B细胞的分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。三个CDR插入于称为框架区(FR)的侧翼片段之间，所述框架区比CDR更高度保守，并形成支撑高变环的支架。所述重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。将若干主要抗体类别划分为子类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施例中，本文提供的抗体涵盖任何其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个CDR的抗体片段，或任何其他与抗原结合但不包含完整的原生抗体结构的抗体部分形成的抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双特异抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双特异抗体(ds双特异抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双特异抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施例中，抗原结合片段可以包含来自特定人抗体的一个或多个CDR。
关于抗体的“Fab”是指抗体的单价抗原结合片段，其由单条轻链(可变区和恒定区)通过二硫键与单条重链的可变区和第一恒定区结合而成。Fab可以通过在接近铰链区的重链之间二硫键的N端的残基处木瓜蛋白酶消化抗体来获得。
“Fab'”是指包括部分铰链区的Fab片段，其可以通过在接近铰链区的重链之间二硫键的C端的残基处胃蛋白酶消化抗体来获得，并且因此在铰链区的少量残基(包括一个或多个半胱氨酸)中与Fab不同。
“F(ab')2”是指包含两条轻链和两条重链的一部分的Fab'的二聚体。
关于抗体的“Fc”是指由经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合的第一重链的第二和第三恒定区组成的抗体部分。IgG和IgM Fc区含有三个重链恒定区(每条链中的第二、第三和第四重链恒定区)。其可以通过木瓜蛋白酶消化抗体获得。抗体的Fc部分负责各种效应功能，如ADCC、ADCP和CDC，但不在抗原结合中起作用。
关于抗体的“Fv”是指最小的带有完整抗原结合位点的抗体片段。Fv片段由结合于单条重链的可变区的单条轻链的可变区组成。“dsFv”是指二硫键稳定化Fv片段，其中在单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的键联是二硫键。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区和重链可变区直接或经由肽连接子序列相互连接组成的工程化抗体(Huston JS等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadSci USA)》,85:5879(1988))。“scFv二聚体”是指包含具有连接子的两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施例中，“scFv二聚体”是包含与另一个VH-VL部分二聚化的VH-VL(通过肽连接子连接)的二价双特异抗体或二价ScFv(BsFv)，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配位并形成两个结合位点，它们可以靶向相同的抗原(或表位)或不同的抗原(或表位)。在其他实施例中，“scFv二聚体”是双特异性双特异抗体，其包含VH1-VL2(由肽连接子连接)与VL1-VH2(也由肽连接子连接)结合，使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接至抗体Fc区的scFv组成的工程化抗体。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”、“纳米抗体”或“HCAb”是指含有两个VH结构域且不含轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫方法杂志(J ImmunolMethods.)》十二月10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(JBiotechnol.)》六月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初是从骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰驼和美洲驼)获得的。尽管没有轻链，但是骆驼化抗体具有真正的抗原结合库(Hamers-Casterman C.等人，《自然》六月3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人《骆驼科的重链抗体；进化创新案例(Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation)》《免疫遗传学(Immunogenetics.)》四月；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等人《免疫学(Immunology.)》五月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表由适应性免疫反应产生的最小的已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人，《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》十一月；21(13):3490-8.Epub 2007年六月15日(2007))。“双特异抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在单条多肽链(VH-VL或VL-VH)中与VL结构域连接的VH结构域(参见例如，Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》七月15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。因为连接子太短，所以同一条链上的两个结构域无法配对，因此，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向相同的不同抗原(或表位)。
“结构域抗体”是指仅含重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些实施例中，两个或更多个VH结构域通过肽连接子共价接合以形成二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可靶向相同或不同的抗原。
在某些实施例中，“(dsFv)2”包含三个肽链：两个VH部分通过肽连接子连接并且通过二硫桥与两个VL部分结合。
在某些实施例中，“双特异性ds双特异抗体”包含经由VH1与VL1之间的二硫桥与VL1-VH2(由肽连接子连接)结合的VH1-VL2(也由肽连接子连接)。
在某些实施例中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv'”包含三个肽链：VH1-VH2部分，其中重链由肽连接子(例如，长的柔性连接子)结合并经由二硫桥分别与VL1和VL2部分配对。每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如本文所用，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包含来源于非人类动物的CDR、来源于人类的FR区，和当适用时，来源于人类的恒定区。在某些实施例中，人源化CLDN18.2抗体的可变区框架的氨基酸残基被替换以进行序列优化。在某些实施例中，人源化CLDN18.2抗体链的可变区框架序列与相应的人可变区框架序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性。
如本文所用，术语“嵌合”是指重链和/或轻链的一部分来源于一个物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的物种的抗体或抗原结合片段。在一说明性实例中，嵌合抗体可以包含来源于人类的恒定区和来源于非人类物种(如小鼠)的可变区。
术语“生殖系序列”是指编码可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与所有其他已知的由生殖系免疫球蛋白可变区序列编码的可变区氨基酸序列相比，所述序列与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定氨基酸序列同一性。生殖系序列也可以指与所有其他评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的可变区氨基酸序列或子序列。生殖系序列可以是仅框架区、仅互补决定区、框架和互补决定区、可变区段(如上文所定义)或包含可变区的序列或子序列的其他组合。序列同一性可以使用本文所述的方法确定，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域中已知的另一种联配算法比对两个序列。生殖系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。例如，可以通过可公开获得的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)和V-base确定生殖系序列。
如本文所用，“抗CLDN18.2抗体”或“抗CLDN18.2抗体”是指能够以足够亲和力特异性结合CLDN18.2(例如人或非人CLDN18.2)例如以提供诊断和/或治疗用途的抗体。
如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即抗体)或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。
如本文所用，术语“特异性结合(specific binding/specifically binds)”是指两个分子之间例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。在某些实施例中，本文提供的抗体或抗原结合片段以≤10-6M(例如，≤5x10-7 M、≤2x10-7 M、≤10-7M、≤5x10-8 M、≤2x10-8 M、≤10-8M、≤5x10-9 M、≤4x10-9 M、≤3x10-9 M、≤2x10-9 M或≤10-9M)的结合亲和力(KD)特异性结合人和/或非人CLDN18.2。本文使用的KD是指解离速率相对于缔合速率的比率(koff/kon)，其可通过使用所属领域中已知的任何常规方法来确定，所述方法包括但不限于表面等离激元共振方法、微尺度热泳方法、HPLC-MS方法和流式细胞测量术(如FACS)方法。在某些实施例中，KD值可以通过使用流式细胞术法适当地确定。可以使用各种免疫分析格式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可用于确定特异性免疫反应的免疫分析格式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,《使用抗体，实验室手册(Using Antibodies,A LaboratoryManual》(1998))。通常，特异性或选择性结合反应将产生至少两倍于背景信号，更通常是至少10至100倍于背景信号的信号。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大对应性之后，与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列中的氨基酸(或核酸)残基的百分比。可以例如使用公开可用的工具实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的的比对，该工具如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人，《分子生物学杂志》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸综述(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所网站上获得，还参见Higgins D.G.等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人，《生物信息学》(Bioinformatics)(英国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可自定义适于比对的参数，例如通过选择合适算法进行。在某些实施例中，不相同的残基位置可以通过保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会基本上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，百分比或类似性程度可以向上调整以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方式对于本领域技术人员来说是众所周知的。参见例如，Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，其通过引用并入本文。
如本文所用，“同源序列(homologue sequence)”和“同源序列(homologoussequence)”可互换使用，并且是指任选比对时与另一序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的多核苷酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
“分离”的物质已通过人工方式自天然状态改变。如果“分离”的组合物或物质存在于自然界中，则所述组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境移出，或这两种情况都有。例如，天然地存在于活动物体内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但如果相同多核苷酸或多肽与其天然状态的共存材料充分地分离，由此以实质上纯的状态存在，那么所述多核苷酸或多肽是“分离”的。经分离的“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，且是指经分离核酸分子的序列。在某些实施例中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指具有至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的纯度的抗体或抗原结合片段，该纯度通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱方法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定。
如本文所用，“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或抗原结合片段将两个分子(例如人CLDN18.2和抗CLDN18.2抗体)之间的结合相互作用抑制到任何可检测程度的能力。在某些实施例中，阻断两个分子之间结合的抗体或抗原结合片段将两个分子之间的结合相互作用抑制至少50％。在某些实施例中，这种抑制可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种试剂如放射性核素的连接。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非注明时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖、活力或转移活性的降低。例如，抗肿瘤活性可以通过在治疗期间出现的异常细胞的生长速率下降或肿瘤大小稳定或减小，或与未治疗的对照相比由于治疗而导致的更长生存来显示。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型评估此类活性，所述模型包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)模型和本领域已知研究抗肿瘤活性的其他已知模型。
如本文所用，病症的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病症，减缓病症的发作或发展速率，降低罹患病症的风险，预防或延迟与病症相关的症状的发展，减少或结束与病症相关的症状，引起病症的完全或部分消退，治愈病症或其某一组合。
术语“CLDN18.2”是指源自哺乳动物，如灵长类动物(例如人类、猴)和啮齿动物(例如小鼠)的Claudin-18剪接变异体2。在某些实施例中，CLDN18.2是人CLDN18.2。人CLDN18.2的示例性序列包括人CLDN18.2蛋白(NCBI参考序列号NP_001002026.1或SEQ ID NO:30)。CLDN18.2的示例性序列包括小鼠(Mus musculus，mice)CLDN18.2蛋白(NCBI参考序列号NP_001181852.1)、食蟹猴(Macaca fascicularis(crab-eating macaque)CLDN18.2蛋白(NCBI参考序列号XP_015300615.1)。CLDN18.2在癌细胞中表达。在一个实施例中，所述CLDN18.2在癌细胞表面上表达。
术语“CLDN18.1”是指源自哺乳动物如灵长类动物(例如人、猴)和啮齿动物(例如小鼠)的Claudin-18剪接变异体1。在某些实施例中，CLDN18.1是人CLDN18.1。人CLDN18.1的示例性序列包括人CLDN18.1蛋白(NCBI参考序列号NP_057453.1或SEQ ID NO:31)、小鼠CLDN18.2蛋白(NCBI参考序列号NP_001181851.1)、食蟹猴CLDN18.2蛋白(NCBI参考序列号XP_005545920.1)。
如本文所用，“CLDN18.2相关”疾病或病症是指由CLDN18.2的表达或活性增加或减少引起、恶化或以其他方式相关的任何疾病或病症。在一些实施例中，CLDN18.2相关病症是例如癌症。
如本文所用，“癌症”是指以恶性细胞生长或赘生物、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学病症，并且包括实体瘤和非实体癌(例如恶性血液病)如白血病。如本文所用，“实体瘤”是指赘生性和/或恶性细胞的实体块。
术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与包含制剂的其他成分在化学上和/或物理上相容，并与接受者在生理上相容。
本文提及“约”某个值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。一般而言，术语“约”是指变量的指示值以及在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内(以较大者为准)的变量的所有值。如果在时间段(年、月、周、天等)的上下文中使用术语“约”，则术语“约”意指该时间段加上或减去下一个从属时间段的一个量(例如，约1年意指11-13个月；约6个月意指6个月加或减1周；约1周意指6-8天；等等)，或在指示值的10％以内，以较大者为准。
抗CLDN18.2抗体缀合物
本公开提供抗CLDN18.2抗体放射性核素缀合物。
Claudin-18(CLDN18)分子(Genbank登录号：剪接变异体1(CLDN18A1或CLDN18.1)：NP_057453、NM_016369和剪接变异体2(CLDN18A2或CLDN18.2)：NM_001002026、NP_001002026)是完整的跨膜蛋白，分子量为约27.9/27.72kD。CLDN18蛋白位于上皮和内皮的紧密连接(tight junction)内，其在邻近细胞之间组织膜内粒子的互连股的网络。CLDN18和闭合蛋白(occludin)是紧密连接中最主要的跨膜蛋白组分。归因于其强细胞间粘合特性，这些紧密连接蛋白质产生初级障壁以防止和控制溶质的细胞旁运输，并且还限制膜脂质和蛋白质的横向扩散以维持细胞极性。
CLDN18显示出几种不同的构象，这些构象可以被抗体选择性地处理(参见SahinU,Koslowski M,Dhaene K等人，Claudin-18剪接变异体2是一种适用于治疗性抗体开发的泛癌靶标[J].《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》2008,14(23):7624-7634)。CLDN18-构象-1具有作为跨膜结构域(TM)的所有四个疏水区域，并且形成了两个细胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围；环2被疏水区3和4包围)，如对绝大多数CLDN家族成员所述。第二构象(CLDN18-构象-2)暗示，如针对PMP22所描述，第二和第三疏水结构域并不完全穿过质膜，使得第一和第四跨膜结构域之间的部分(环D3)为胞外的。第三构象(CLDN18-构象-3)展示具有由第一和第四疏水区包围的两个内部疏水区的大型胞外结构域。由于环D3中的经典N-糖基化位点，CLDN-18拓扑变异体CLDN18拓扑-2和CLDN18拓扑-3具有额外的胞外N-糖基化位点。
CLDN18具有两种不同剪接变异体，其存在于小鼠和人类两者中。剪接变异体CLDN18.1和CLDN18.2在包含第一TM和loop1的N端的前21个氨基酸上不同，而C端的蛋白质序列相同(参见Niimi T,Nagashima K,Ward J M,等人，作为一种新型的T/EBP/NKX2.1同源结构域转录因子的下游靶基因的Claudin-18通过可变剪接编码肺和胃特异性亚型[J].《分子和细胞生物学(Molecular and cellular biology)》,2001,21(21):7380-7390)。
CLDN18.1在正常肺和胃上皮细胞上选择性表达，而CLDN18.2仅在胃细胞上表达。最重要的是，CLDN18.2表达限于胃上皮的分化的短寿命细胞，而没有胃干细胞区域。使用灵敏的RT-PCR，在任何其他正常人体器官中都无法检测到这两种变异体。然而，它们在几种癌症类型中高度表达，包括胃肿瘤、食道肿瘤、胰腺肿瘤和肺肿瘤以及人类癌细胞系(参见Matsuda Y,Semba S,Ueda J等人，胃癌侵袭前沿的胃和肠claudin表达[J].《癌症科学(Cancer science)》,2007,98(7):1014-1019)。
不希望受限于任何理论，据信CLDN18.2的分子和功能特征使其成为基于抗体的癌症诊断和治疗的非常有趣的靶标。这些包括(i)大多数与毒性相关的正常组织中缺乏CLDN18，(ii)CLDN18.2变异体表达限制为可有可无的细胞群，作为可以由胃的靶阴性干细胞补充的分化的胃细胞，(iii)正常细胞和肿瘤细胞之间的潜在差异糖基化，以及(iv)不同构象拓扑结构的存在。
已经发现，CLDN18蛋白的分子量在肿瘤和邻近的正常组织之间有所不同。在健康组织中观察到较高分子量的CLDN18蛋白，通过用脱糖基化化合物PNGase F处理正常组织裂解物，可以将该高分子量降低到与肿瘤中观察到的相同的分子量。这表明与正常组织相对物相比，CLDN18在肿瘤中的N-糖基化程度较低。经典的N-糖基化基序在CLDN18分子的环D3结构域内的氨基酸残基116处。分子量的差异和推断的结构差异可能代表了抗体结合的改变表位。
此外，CLDN18作为紧密连接蛋白也可能有助于良好的诊断特异性和良好的治疗的治疗窗。由于肿瘤细胞表达CLDN，但通常不会通过在正常上皮组织中发现的CLDN的同型和异型结合形成经典的紧密连接，因此它们可能有相当多的适于细胞外抗体结合和免疫治疗的游离CLDN库。健康上皮中CLDN的结合表位可能在紧密连接内被屏蔽而无法与抗体结合。
本公开提供抗CLDN18.2抗体缀合物，其包含与放射性核素缀合的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
i.放射性核素
放射性核素是特征在于能够经历放射性衰变的不稳定核的试剂。在本公开中有用的放射性核素包括伽马发射器、正电子发射器、俄歇电子发射器、X射线发射器和荧光发射器。放射性核素可以是治疗性的或诊断性的。
在某些实施例中，放射性核素是治疗性的。由短程高LET发射(如贝塔、阿尔法和俄歇电子)衰变的放射性核素具有高度细胞毒性，并且因此可用于标记为放射治疗目的而设计的物质。治疗性放射性核素可以具有在20至6,000keV范围内的衰变能量，例如对于俄歇发射器，衰变能量在60至200keV范围内，对于贝塔发射器，衰变能量在100-2,500keV范围内，并且对于阿尔法发射器，衰变能量在4,000-6,000keV范围内。本领域的技术人员可以根据包括放射性核素半衰期、发射粒子的能量、发射粒子可以传播的最大范围、足够的浓度和癌细胞对放射性核素的延长保留等在内的因素，选择合适的治疗性放射性核素以用于本文提供的抗体缀合物。
治疗性放射性核素的实例包括但不限于111In、111mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、199Au和211Pb。
随着俄歇发射粒子显著衰变的其他治疗性放射性核素的实例包括：Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。
随着α粒子的产生显著衰变的其他附加放射性核素的实例包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。
其他潜在的治疗性放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
在某些实施例中，放射性核素是诊断性的。
诊断性放射性核素可用作成像剂。成像剂可以指示放射性核素及其粘附物在动物或人类受试者的细胞或组织中或在体外条件下的细胞或组织中的位置。在某些实施例中，放射性核素是可以在体内施用后以非无创方式从外部检测到的那些。用于诊断用途的放射性核素如成像剂优选具有相对低的细胞毒性，但会随着适合成像的发射而衰减。具有诊断用途的放射性核素可以包括例如18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111ln、123l、124l、125l、131l、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154"1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194lr、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。根据本公开的实施例，可用作诊断剂的顺磁性离子包括但不限于过渡金属和镧系金属(例如，原子序数为6至9、21-29、42、43、44或57-71的金属)的离子。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu离子。
在某些实施例中，放射性核素是放射性金属离子、发射伽马的放射性卤素和发射正电子的放射性非金属。在某些实施例中，放射性核素可通过正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)检测。例如，随伽马发射衰变的放射性核素适用于平面和单光子计算机发射断层扫描(SPECT)成像，而随正电子(β)发射和湮灭光子衰变的放射性核素适用于正电子发射断层扫描(PET)。可通过如PET或SPECT成像技术检测的诊断性放射性核素标记物包括例如但不限于64Cu、67Cu、89Zr、124I、86Y、90Y、111In、123/131I、177Lu、11C、14C、41Ca、67Ga、68Ga、13N、15O、44Sc、18F、99mTc、90mTc等。
如本文所用，术语“正电子发射断层扫描(PET)”是指在医学领域中用于使靶组织或器官或活动可视化的核成像技术。PET测量来自放射性核素缀合示踪分子的正电子发射后连续产生的两个湮灭光子，该示踪分子被选择用于在生物化学水平上标记体内的特定功能。PET提供生物功能的分子成像而不是解剖结构。PET允许通过生成其他成像技术无法获得的人体许多功能的图片来对患者进行检查。在将短寿命的正电子发射放射性示踪剂注射到受试者后，它可以根据与稳定相对物相关的生理途径在体内分布。当示踪剂是专门针对感兴趣靶标的靶向分子时，该示踪剂允许对表达此类靶标的组织或器官进行可视化。
如本文所用，术语“SPECT”是指“单光子发射计算机断层扫描”，它是一种使用伽马射线的核医学断层扫描成像技术。它类似于使用伽马相机的传统核医学平面成像，并且能够提供真实的3D信息。该信息通常以穿过患者的横截面切片的形式呈现，但可以根据需要自由重定格式或操作。成像需要将伽马发射放射性核素或其缀合物注射到受试者中。
制备放射性核素缀合的抗体和抗原结合片段的方法是本领域已知的。一般来说，金属放射性核素和非金属放射性核素的方法不同。金属放射性核素的缀合通常需要螯合剂进行缀合，这对于非金属放射性核素可能不是必需的。
将金属放射性核素与抗体缀合的方法是本领域已知的，例如，经由合适的螯合剂缀合(参见，WO94/11026；《当前免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》第1和2卷,Coligen等人编辑，Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991))。
如本文所用，术语“螯合剂”是指能够以两个或更多个键结合金属的化学结构。螯合剂可以具有一个或多个可以结合金属离子的螯合基团。例如，螯合剂可以包含至少一个适合与金属离子配位的杂原子，并从水溶液中隔离金属离子。
在一些实施例中，所述螯合剂包含三个或更多个用于螯合的原子，其中每个原子选自由氮、硫、氧和磷组成的群组。
可以根据本公开使用的螯合剂的实例包括但不限于DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、TRITA(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；和HETA(1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NETA({4-[2-(双-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N′,N″,三(2-巯基乙基)1,4,7-三氮杂环壬烷)、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧基乙基)次膦酸])、CP256,PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、多肟及其衍生物。
在一些实施例中，本文提供的抗体缀合物包含经由螯合剂与本文提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段缀合的金属放射性核素。本领域技术人员可以基于本领域已知的知识选择放射性核素的合适螯合剂，例如，如Price E.W等人，《化学会评论(Chem.Soc.Rev.)》2014,43,260-290所述。
在一些实施例中，金属放射性核素可以是64Cu、67Cu、89Zr、86Y、90Y、111In、177Lu、67Ga、44Sc或99mTc。在一些实施例中，放射性核素是64Cu、67Cu或89Zr。在一些实施例中，所述64Cu、67Cu或89Zr经由螯合剂标记至所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，螯合剂进一步包含用于缀合抗体的反应性官能团。螯合物可以直接连接至抗体或肽，例如如美国专利号4,824,659所公开的，该专利通过引用以其整体并入本文。此类反应性基团允许螯合剂与抗体的一个或多个氨基酸残基(例如游离半胱氨酸、赖氨酸等)中的官能团反应。反应性基团的实例包括马来酰亚胺、氨基苄基、N-羟基琥珀酰亚胺酯等。
在某些实施例中，螯合剂通过双官能连接子试剂与本文提供的抗体或其抗原结合片段缀合。此类双官能连接子的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(如己二亚氨二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(如双-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)、双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPRH、SBAP、SIA、SIAB、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSG(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。那些连接子试剂是可商购的(例如，来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,U.S.A,参见第467-498页,2003-2004，《应用手册和目录(Applications Handbook and Catalog)》)。
在一些实施例中，放射性核素是64Cu或67Cu，并且螯合剂包含TETA、NOTA、NODA或NODGA。在一些实施例中，放射性核素是89Zr并且螯合剂包含DFO。
在一些实施例中，放射性核素是非金属的。在一些实施例中，放射性核素包含放射性卤素。在一些实施例中，所述放射性核素是124I或123I或131I。制备放射性碘化抗体的方法是本领域已知的，参见例如Grassi,J.等人(1987)《放射性碘化和其他标记技术(Radioiodination and Other Labeling Techniques)》，《实验药理学手册》(Handbook ofExperimental Pharmacology),91-141,Eclelman,W.C.等人，《癌症研究(CancerResearch)》,40,3036-3042,1998，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，124I或123I或131I被标记到抗体或其抗原结合片段的至少一个苯基羟基上。
在某些实施例中，在如Na124I的放射性碘存在下，抗体或其抗原结合片段通过亲电取代成酪氨酸残基而被直接碘化。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段通过预标记化合物或能够键后标记的化合物如用于肽的Bolton和Hunter试剂的共价键间接碘化。
在一些实施例中，124I或123I或131I在氧化剂存在下被标记至抗体或其抗原结合片段。可以使用任何合适的氧化剂，包括化学氧化剂和酶促氧化剂。示例性氧化剂包括但不限于N-溴代琥珀酰亚胺、氯胺T、氯气或乳过氧化物酶。
在一些实施例中，124I或123I或131I通过N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)反应标记至抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，本文提供的抗体缀合物可以进一步与纳米颗粒缀合。例如，纳米颗粒可在治疗应用中用作药物载体，当与本发明的CLDN18.2特异性抗体或片段缀合时，其递送对在细胞表面过表达CLDN18.2的癌细胞的化疗剂、放疗剂、毒素或任何其他本领域已知的细胞毒性剂或抗癌剂。
在一些实施例中，本文提供的抗体缀合物可进一步与药物缀合(例如，在赖氨酸残基的ε氨基处)，并且载体可并入额外的治疗剂或诊断剂。
i.抗体序列
在某些实施例中，本文提供的抗体缀合物包含抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中
所述HCDR1序列包含GYNMN(SEQ ID NO:1)或TYFIGVG(SEQ ID NO:13)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
HCDR2序列包含X1IDPYYX2X3TX4YNQKFX5G(SEQ ID NO:32)，或HIWWNDNKYYNTALKS(SEQ ID NO:15)，或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列；
所述HCDR3序列包含X6X7X8GNAFDY(SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY(SEQ ID NO:17)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
LCDR1序列包含KSSQX9LX10NX11GNX12KNYLT(SEQ ID NO:34)或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列；
LCDR2序列包含WASTRX13S(SEQ ID NO:35)或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR3序列包含QNDYX14X15PX16T(SEQ ID NO:36)或其至少80％序列同一性的同源序列；
其中X1是N或Y或H，X2是G或V，X3是A或G或T，X4是R或T或S，X5是K或R，X6是S或M，X7是Y或F，X8是Y或H，X9是S或N，X10是L或F，X11是S或N，X12是Q或L，X13是E或K，X14是S或Y，X15是F或Y，并且X16是F或L。
在某些实施例中，本文提供的抗体缀合物包含抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含：
a)HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13的序列，
b)HCDR2包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQID NO:19和SEQ ID NO:22的序列，并且
c)HCDR3包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21的序列，并且/或者
包含以下的轻链可变区：
d)LCDR1包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:20的序列，
e)LCDR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:16的序列，并且
f)LCDR3包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18的序列。
在某些实施例中，重链可变区选自由以下组成的群组：
a)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:3序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:7序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:9序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:11序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:13序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:15序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:17序列的HCDR3；
e)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:19序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:21序列的HCDR3；和
f)重链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3。
在某些实施例中，轻链可变区选自由以下组成的群组：
a)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:8序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:10序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:12序列的LCDR3；
e)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:14序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:16序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3；和
f)轻链可变区，其包含了包含SEQ ID NO:20序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3。
在某些实施例中，在本文提供的抗体缀合物中：
a)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:3序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
b)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:7序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:8序列的LCDR3；
c)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:9序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:11序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:10序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
d)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:13序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:15序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:17序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:12序列的LCDR3；
e)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:19序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:21序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:14序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:16序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3；或者
f)重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:20序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3。
在某些实施例中，本文提供的抗体缀合物包含CLDN18.2抗体7C12、11F12、26G6、59A9、18B10和12E9的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。
如本文所用，“7C12”是指具有SEQ ID NO:37的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文所用，“11F12”是指具有SEQ ID NO:39的重链可变区和SEQ ID NO:40的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文所用，“26G6”是指具有SEQ ID NO:41的重链可变区和SEQ ID NO:42的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文所用，“59A9”是指具有SEQ ID NO:43的重链可变区和SEQ ID NO:44的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文所用，“18B10”是指具有SEQ ID NO:45的重链可变区和SEQ ID NO:46的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文所用，“12E9”是指具有SEQ ID NO:47的重链可变区和SEQ ID NO:48的轻链可变区的小鼠抗体。
表1显示了这些CLDN18.2抗体的CDR序列。重链和轻链可变区序列还提供于下表2中。
表1.CLDN18.2抗体CDR区的序列
/>
表2.小鼠/嵌合抗体VH/VL的序列
/>
本文提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体为使用重组方法在体外而非在动物中制备的抗体。
已知CDR负责抗原结合，然而，已发现并非所有6个CDR都一定是必不可少的或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰抗CLDN18.2抗体7C12、11F12、26G6、59A9、18B10或12E9中的1、2或3个CDR(对应于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:22中的任一个)，但基本上保留对CLDN18.2的特异性结合亲和力。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含抗CLDN18.2抗体7C12、11F12、26G6、59A9、18B10或12E9之一的重链CDR3序列。在某些实施例中，本文提供的抗体缀合物包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并且因此被认为与抗原接触最多并为抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。还认为重链CDR3是迄今为止就长度、氨基酸组成和构象而言由多种多样化机制导致的最多样化的抗原结合位点的CDR(Tonegawa S.《自然》.302:575-81)。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.《免疫学(Immunity)》13:37-45)以及期望的抗原结合亲和力(Schier R等，《分子生物学杂志》263:551-67)。
在一些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含全部或部分重链可变结构域和/或全部或部分轻链可变结构域。在一个实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段为由全部或部分本文提供的重链可变结构域组成的单结构域抗体。本领域可获得此类单结构域抗体的更多信息(参见例如，美国专利号6,248,516)。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含合适的框架区(FR)序列，只要抗体及其抗原结合片段可以特异性结合CLDN18.2。表1中提供的CDR序列获自小鼠抗体，但它们可以使用本领域已知的合适方法如重组技术移植到任何合适物种如小鼠、人、大鼠、兔等的任何合适的FR序列。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段因其在人类中的免疫原性降低是合乎需要的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人CDR序列被移植到人或实质上人FR序列。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过用非人(如鼠)CDR基因替换人免疫球蛋白基因中的相应人CDR基因来进行(参见例如，Jones等人(1986)《自然》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学》(Science)239:1534-1536)。
可使用本领域中已知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域以实现此目的。在一说明性实例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知人可变结构域生殖系序列的数据库筛选或BLAST非人(例如啮齿动物)抗体可变结构域序列，并且最接近于非人查询序列的人序列被识别并用作移植非人CDR序列的人类支架(参见例如Sims等人，(1993)《免疫学杂志(J.Immunol.)》151:2296；Chothia等人(1987)《分子生物学杂志》196:901)。可替代地，源自所有人类抗体的共有序列的框架可用于移植非人CDR(参见例如，Carter等人(1992)《美国国家科学院院刊》，89:4285；Presta等人(1993)《免疫学杂志》，151:2623)。
在某些实施例中，本文提供的人源化抗体缀合物由除了非人的CDR序列之外的基本上所有的人序列构成。在一些实施例中，可变区FR和恒定区(如果存在恒定区)则完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人类FR序列和人类恒定区序列可以来源于不同的人类免疫球蛋白基因，例如来源于一种人类抗体的FR序列，以及来源于另一人类抗体的恒定区。在一些实施例中，人源化抗体或抗原结合片段包含人重/轻链FR1-4。
在一些实施例中，来源于人的FR区可以包含与其来源的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人FR的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的相应残基取代。在某些实施例中，这可能是合乎需要的，以使人源化抗体或其片段紧密地接近非人亲本抗体结构，以减少或避免免疫原性和/或改善或保留结合活性或结合亲和力。
在某些实施例中，本文提供的人源化抗体缀合物在每个人FR序列中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或在重链或轻链可变结构域的所有FR中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施例中，此类氨基酸残基的变化可以仅存在于重链FR区，仅存在于轻链FR区，或存在于两条链中。在某些实施例中，一个或多个氨基酸残基被突变，例如回复突变为在得到CDR序列的非人亲本抗体(例如在小鼠框架区中)中发现的相应残基。合适的突变位置可由技术人员按照本领域中已知的原则选择。例如，可以选择突变位置，其中：1)人生殖系序列框架中的残基是稀有的(例如在人可变区序列中少于20％或少于10％)；2)该位置紧邻人生殖系链一级序列中3个CDR中的一个或多个，因为它可能与CDR中的残基相互作用；或者3)在3维模型中，该位置接近CDR，并且因此与CDR中的氨基酸相互作用的概率可以良好。所选位置的残基可以突变回亲本抗体中的相应残基，或突变为既不是人生殖系序列中的相应残基也不是亲本抗体中的相应残基的残基，而是人序列的典型残基，即在与人生殖系序列属于同一亚组的已知人类序列中的该位置更频繁地出现的残基(参见美国专利号5,693,762)。
在某些实施例中，本公开的人源化轻链和重链在人类中基本上是非免疫原性的并且保持与针对CLDN18.2的亲本抗体基本上相同或甚至更高的亲和力。
在某些实施例中，本文提供的其人源化抗体缀合物包含人生殖系框架序列VK/4-1的一个或多个轻链FR序列，和/或人生殖系框架序列VH/1-46的一个或多个重链FR序列，其中没有或没有回复突变。如果需要，可以将回复突变引入人生殖系框架序列中。在某些实施例中，人源化抗体18B10可以在重链框架序列VH/1-46中含一个或多个选自由以下组成的群组的回复突变：R71I、T73K、T28S、M69L、R38K和M48I，均基于Kabat编号。人源化抗体18B10可以在轻链框架序列VK/4-1中含一个或多个选自由以下组成的群组的回复突变：S63T和I21M，均基于Kabat编号。
在某些实施例中，在本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中，抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47及其具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对CLDN18.2、特别是人CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施例中，在本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中，抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48，及其具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对CLDN18.2、特别是人CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含：
包含SEQ ID NO:25序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:27序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:28序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:29序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26或28序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:37序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:38序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:39序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:40序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:41序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:42序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:43序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:44序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:45序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:46序列的轻链可变区；或者
包含SEQ ID NO:47序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物进一步包含重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4中的一种或多种，和/或轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的一种或多种，其中：
所述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17FT(SEQ ID NO:54)或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列，
所述HFR2包含WVX18QAPGQGLEWX19G(SEQ ID NO:55)或其至少80％(或至少90％)序列同一性的同源序列，
所述HFR3序列包含RVTX20TIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:56)或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列，
所述HFR4包含WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21NC(SEQ ID NO:58)或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列，
所述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:59)或其至少80％(或至少85％、90％)序列同一性的同源序列，
所述LFR3包含GVPDRFX22GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:60)或其至少80％(或至少85％、90％、95％)序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包含FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:61)或其至少80％(或至少90％)序列同一性的同源序列，
其中X17是T或S，X18是R或K，X19是M或I，X20是M或L，X21是I或M，并且X22是S或T。
在某些实施例中，HFR1包含选自由SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63组成的群组的序列，HFR2包含选自由SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65组成的群组的序列，HFR3包含选自由SEQID NO:66和SEQ ID NO:67组成的群组的序列，HFR4包含SEQ ID NO:57的序列，LFR1包含选自由SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69组成的群组的序列，LFR2包含SEQ ID NO:59的序列，LFR3包含选自由SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71组成的群组的序列，并且LFR4包含SEQ IDNO:61的序列。
表3-1.人源化CLDN18.2抗体18B10的框架(FR)序列
表3-2说明了人源化18B10抗体的可变区序列。
表3-2.人源化18B10的序列
在某些实施例中，本文提供的人源化抗体可以包含与人IgG1同种型的恒定区融合的重链可变区和与人κ链的恒定区融合的轻链可变区。
本文提供的人源化抗CLDN18.2抗体缀合物保留了对表达CLDN18.2的细胞的特异性结合亲和力，并且在该方面与亲本抗体至少相当或甚至更好。本文提供的人源化抗体还可以保留它们与表达CLDN18.2的细胞(如NUGC4细胞、SNU-620细胞、SNU-601细胞或KATOIII细胞)的功能相互作用，因为所有抗体都可以通过ADCC、CDC和通过在肿瘤细胞表面交联靶标诱导的细胞凋亡的诱导以及增殖的直接抑制来介导细胞杀灭。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体及其片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地人Ig的恒定区，或任选地人IgG的恒定区。在一些实施例中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施例中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施例中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体及其片段进一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段包含IgG1同种型的恒定区。在某些实施例中，人IgG1的恒定区包含SEQ ID NO:49，或具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
IgG1同种型的恒定区可以诱导效应子功能，如ADCC或CDC。本文提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段的效应子功能可导致对表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性。效应子功能可以使用各种测定来评估，如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定，以及上述用于确定ADCC或CDC的任何测定。
本发明人惊奇地发现，本文提供的抗CLDN18.2抗体及其片段对人CLDN18.2中表达细胞系(例如NUGC4细胞)、低表达细胞系(例如SNU-620、SNU-601和KATOIII细胞)具有高亲和力。这与现有的抗体如IMAB362不同，所述IMAB362未能显示与人CLDN18.2低表达细胞的特异性或相当的结合。嵌合IgG1抗体IMAB362是由Ganymed Pharmaceuticals AG开发的抗人CLDN18.2抗体，具有美国专利申请US2009169547A1中公开的氨基酸序列(IMB362的重链和轻链可变区序列在本文中作为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73包括)和CAS号1496553-00-4。IMAB362识别CLDN18.2的第一个胞外结构域(ECD1)，并且不与任何其他claudin家族成员结合，包括密切相关的Claudin18剪接变异体1(CLDN18.1)。
NUGC4细胞是从癌症患者的胃旁淋巴结建立的细胞系(参见Akiyama S等人，《日本手术杂志(Jpn J Surg.)》1988年七月；18(4):438-46)。NUGC4细胞系可从JCRB细胞库以登录号JCRB0834获得。
SNU-601细胞和SNU-620细胞都是由首尔国立大学(SNU)从癌症患者的腹水中建立的人胃癌细胞系(KU JL等人，《癌症研究治疗(Cancer Res Treat.)》2005年2月；37(1):1-19；Park等人，《癌症国际杂志(Int J Cancer.)》1997年2月7日；70(4):443-449)。SNU-601细胞和SNU-620细胞可从韩国细胞系库获得，登录号分别为00601和00620。
KATO III细胞是源自胃癌患者转移部位的细胞系(参见Sekiguchi M等人《日本实验医学杂志(Jpn.J.Exp.Med.)》48:61-68,1978)。KATO III细胞系可从ATCC以登录号ATCCHTB-103获得。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物以不超过2.5nM(或不超过2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4nM)的KD值特异性结合表达人CLDN18.2的细胞(例如NUGC4细胞系或KATOIII细胞系)，如通过KinExA测定测量的。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物以不超过IMAB362的Kd值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％的Kd值特异性结合表达人CLDN18.2的细胞，如通过KinExA测定测量的。在某些实施例中，KD值是用NUGC4细胞、KATOIII细胞、SNU-601细胞、SNU-620细胞或其相当细胞确定的，该相当细胞的人CLDN18.2蛋白表达水平与NUGC4细胞、KATOIII细胞、SNU-601细胞或SNU-620细胞的人CLDN18.2蛋白表达水平相当或不超过NUGC4细胞、KATOIII细胞、SNU-601细胞或SNU-620细胞的人CLDN18.2蛋白表达水平。在某些实施例中，KD值是用人CLDN18.2高表达细胞系或人CLDN18.2中表达细胞系确定的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物与表达人CLDN18.2(或小鼠CLDN18.2)细胞的结合的EC50值不超过70μg/ml(或不超过65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μg/ml)，如通过流式细胞术测定测量的。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物以不超过IMAB362的EC50值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、1％或0.1％的EC50值特异性结合表达人CLDN18.2的细胞，如通过流式细胞术测定测量的。在某些实施例中，EC50是用NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系、SNU-620细胞系或其相当细胞确定的，该相当细胞的人CLDN18.2蛋白表达水平与NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系或SNU-620细胞系的人CLDN18.2蛋白表达水平相当或不超过NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系或SNU-620细胞系的人CLDN18.2蛋白表达水平，例如人CLDN18.2低表达细胞系或人CLDN18.2中表达细胞系。在某些实施例中，EC50是用人CLDN18.2高表达细胞系确定的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物与人CLDN18.2高表达细胞系或人CLDN18.2中表达细胞系的结合的EC50值不超过5、4、3或2μg/ml。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物与NUGC4细胞结合的EC50值不超过70μg/ml(或不超过65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μg/ml)，如通过流式细胞术测定测量的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物不与CLDN18.1(例如人CLDN18.1或小鼠CLDN18.1)结合。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物能够以不超过1.5μg/ml的EC50值特异性结合小鼠CLDN18.2(例如表达小鼠CLDN18.2的细胞)，如通过流式细胞术测量的。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物以0.1μg/ml-1.5μg/ml(例如0.1μg/ml-1.2μg/ml、0.2μg/ml-1μg/ml、0.5μg/ml-1μg/ml、0.6μg/ml-1μg/ml、0.6μg/ml-0.8μg/ml或0.67μg/ml)的EC50结合小鼠CLDN18.2，如通过流式细胞术测量的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体和本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物能够在表达不同水平的人CLDN18.2的细胞中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或CDC活性。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上结合的抗体并随后导致靶细胞裂解。靶细胞的裂解是细胞外的，需要直接的细胞间接触，并且不涉及补体。ADCC可以被视为直接诱导不同程度的即刻肿瘤破坏的机制，其导致抗原呈递和诱导肿瘤导向的T细胞反应。ADCC的体内诱导被认为会导致肿瘤导向的T细胞反应和宿主衍生的抗体反应。
进行ADCC的方法是本领域已知的。通常，靶细胞如表达CLDN18.2的细胞与一系列浓度的抗CLDN18.2抗体一起温育，并且在洗涤后，加入效应细胞如表达Fc受体的细胞以使ADCC发生。在靶细胞与效应细胞混合后数小时的某一时间点确定细胞毒性或细胞活力以量化ADCC的水平。细胞毒性可以通过从裂解的靶细胞中释放标记物(例如，放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白质如乳酸脱氢酶(LDH))来检测。在另一个实施例中，细胞活力使用萤火素酶报告基因通过代谢活性细胞的指示物(如ATP)来确定(参见例如Crouch,S.P.等人(1993)《免疫方法杂志》160,81-8)，该基因产生与培养物中活细胞数量成比例的发光信号(即ADCC报告基因测定)。效应细胞的实例是NK细胞、PBMC或表达FcγRIII的细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是另一种细胞杀伤方法，可以通过抗体在补体存在下裂解靶标来指导。IgM是补体激活最有效的同种型。IgG1和IgG3在经由经典的补体激活途径指导CDC方面也都非常有效。在这个级联中，抗原-抗体复合物的形成导致揭开与同源抗原复合的参与的抗体分子如IgG分子(Clq是补体C1的三个亚组分之一)的CH2结构域上紧邻的多个Clq结合位点。这些揭开的Clq结合位点将先前低亲和力的Clq-IgG相互作用转化为高亲合力的相互作用，这引发了涉及一系列其他补体蛋白的级联事件，并导致效应细胞趋化/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。补体级联以膜攻击复合物(MAC)的形成结束，该复合物在细胞膜上产生促进水和溶质自由进出细胞的孔。
CDC活性可以通过类似于如上所论述的ADCC活性的方法来确定，除了不使用效应细胞，需要存在源自人血清的补体之外。简而言之，将抗体样品在测定培养基中连续稀释，并在人血清补体存在下与表达CLDN18.2的靶细胞一起温育。温育后，细胞毒性或细胞活力由裂解的靶细胞释放标记物或代谢活性细胞的指示物(如ATP)确定。可以使用测定代谢活性细胞中的ATP的CellTiter-Glo试剂，并且可以通过使用合适的读取器测量发光强度来量化细胞裂解的程度。
在某些实施例中，ADCC或CDC经由本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物诱导的细胞死亡可以通过膜完整性的丧失来确定，该丧失通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等人，《细胞技术(Cytotechnology)》17:1-11(1995))的摄取评价，或者可以相对于未处理细胞评估7AAD。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物能够以不超过1μg/ml(或不超过0.9、0.8、0.7、0.6、0.5μg/ml)的EC50值在表达人CLDN18.2的细胞上诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，如通过细胞毒性测定测量的。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体及其片段能够以不超过IMAB362的EC50值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％的EC50值在表达人CLDN18.2的细胞上诱导CDC，如通过细胞毒性测定测量的。在某些实施例中，CDC是用人CLDN18.2中表达细胞系或人CLDN18.2高表达细胞系确定的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物能够以不超过2μg/ml(或不超过1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1μg/ml)的EC50值在表达人CLDN18.2的细胞上诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，如通过ADCC报告基因测定测量的。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物以不超过IMAB362的EC50值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的EC50值或以IMAB362的总ADCC能力的至少120％、150％、180％或200％的总ADCC能力(例如，由在抗体浓度与ADCC活性水平的图中观察到的最大ADCC活性水平表示)在表达人CLDN18.2的细胞上诱导ADCC，如通过ADCC报告基因测定测量的。在某些实施例中，ADCC是用NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系、SNU-620细胞系或其相当细胞确定的，该相当细胞的人CLDN18.2蛋白表达水平与NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系或SNU-620细胞系的人CLDN18.2蛋白表达水平相当或不超过NUGC4细胞系、KATOIII细胞系、SNU-601细胞系或SNU-620细胞系的人CLDN18.2蛋白表达水平，例如人CLDN18.2中表达细胞系或人CLDN18.2低表达细胞系。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物能够以不超过2μg/ml(或不超过1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1μg/ml)的EC50值在NUGC4细胞上诱导ADCC，如通过ADCC报告基因测定测量的。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物与在具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的人CLDN18.2的位置D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79和R80处包含至少一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个)氨基酸残基的表位结合。
如本文所用，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。表位可以包括直接接触抗体的特定氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。本领域技术人员将认识到，无需过度实验即可通过确定抗体与本公开的抗体(例如杂交瘤/嵌合或人源化抗体7C12、11F12、26G6、59A9、18B10和本文提供的任何嵌合和人源化变异体)是否竞争结合CLDN18.2抗原多肽来确定二者是否结合相同或重叠或相邻的表位。
如本文所用，关于两种抗原结合蛋白(例如抗体)的术语“竞争结合”是指一种抗原结合蛋白阻断或减少另一种抗原结合蛋白与抗原(例如人/小鼠CLDN18.2)的结合，如通过竞争性结合测定确定。竞争性结合测定在所属领域中众所周知，包括例如直接或间接放射免疫测定(RIA)、直接或间接酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定(参见例如Stahli等人，1983，《酶学方法》9:242-253)。通常，此类测定涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或带有抗原的细胞、未标记的测试抗体和标记的参考抗体。竞争性抑制通过确定在测试抗体存在下结合于固体表面或细胞的标记物的量来测量。通常测试抗体过量存在。如果两种抗体竞争结合于CLDN18.2，则两种抗体结合于同一或重叠表位，或足够接近于由另一抗体结合的表位的邻近表位以发生位阻。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将测试抗体与共同抗原的特异性结合抑制(例如，降低)至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或更多。
在某些实施例中，表位或抗体结合的表位中的氨基酸残基可以通过突变抗原中的特定残基，即CLDN18.2来确定。如果抗体以相对于其与野生型CLDN18.2的结合显著降低的水平结合具有突变的氨基酸残基(例如突变为丙氨酸)的突变体CLDN18.2，则这将表明突变残基直接参与抗体与CLDN18.2抗原的结合，或者当它与抗原结合时与抗体非常接近。此类突变残基被认为在表位内，并且抗体被认为与包含该残基的表位特异性结合。如本文所用，结合水平显著降低意指，相对于抗体与野生型CLDN18.2之间的结合，抗体与突变体CLDN18.2之间的结合亲和力(例如EC50、Kd或结合能力)降低大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。此类结合测量可以使用本领域已知和本文公开的任何合适方法进行，例如但不限于KinExA测定和流式细胞术。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物对其中野生型CLDN18.2中的残基被丙氨酸取代的突变体CLDN18.2表现出显著较低的结合，并且该残基选自由以下组成的群组：人CLDN18.2的D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79和R80。在某些实施例中，残基是E56。在某些实施例中，残基选自由以下组成的群组：W30、L49、W50、R55和E56。在某些实施例中，残基选自由以下组成的群组：T41、N45、Y46、R51、F60、E62和R80。在某些实施例中，残基选自由以下组成的群组：D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76和V79。
在某些实施例中，相对于抗体与野生型CLDN18.2之间的结合，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物对包含人CLDN18.2的E56A的突变体CLDN18.2表现出至少80％、90％、95％或99％或更多的结合降低。
在某些实施例中，相对于抗体与野生型CLDN18.2之间的结合，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物对包含一个或多个突变残基的突变体CLDN18.2表现出至少50％、60％、70％、80％或90％的结合降低，该残基选自由以下组成的群组：人CLDN18.2的W30A、L49A、W50A、R55A和E56A。
在某些实施例中，相对于抗体与野生型CLDN18.2之间的结合，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物对包含一个或多个突变残基的突变体CLDN18.2表现出至少30％、35％、40％、45％或50％的结合降低，该残基选自由以下组成的群组：人CLDN18.2的D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76和V79。
在某些实施例中，相对于抗体与野生型CLDN18.2之间的结合，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物对包含一个或多个突变残基的突变体CLDN18.2表现出至少10％、15％、20％、25％或30％的结合降低，该残基选自由以下组成的群组：人CLDN18.2的T41A、N45A、Y46A、R51A、F60A、E62A和R80A。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物不结合A42和/或N45。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体、其抗原结合片段和抗CLDN18.2抗体缀合物能够结合本文提供的表位，并在人CLDN18.2中表达细胞系或人CLDN18.2低表达细胞系中诱导ADCC或CDC活性。
ii.抗体变异体
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段还涵盖本文提供的抗体序列的各种类型的变异体。
在某些实施例中，变异体包含表1中提供的1、2或3个CDR序列中的、一个或多个FR序列中的、本文提供的重链或轻链可变区序列中的和/或恒定区(例如Fc区)中的一个或多个修饰或取代。此类抗体变异体保留其亲本抗体对CLDN18.2的特异性结合亲和力，但具有由修饰或取代赋予的一种或多种所需特性。例如，抗体变异体可以具有提高的抗原结合亲和力、提高的糖基化模式、降低的糖基化风险、降低的脱氨基作用、降低或增加的效应子功能、提高的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合的相容性(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)，仅举几例。
可以使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085)筛选亲本抗体序列，以识别合适的或优选的残基进行修饰或取代。简而言之，可以识别靶残基(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，并产生修饰的抗体并筛选其感兴趣的特性。如果在特定氨基酸位置的取代显示出感兴趣的功能变化，则所述位置可以被识别为进行修饰或取代的潜在残基。可以通过用不同类型的残基(例如，半胱氨酸残基、带正电的残基等)取代来进一步评估潜在的残基。
a)亲和力变异体
亲和力变异体保持亲本抗体的CLDN18.2特异性结合亲和力，或甚至具有优于亲本抗体的提高的CLDN18.2特异性结合亲和力。所属领域中已知的各种方法可用于实现此目的。例如，可以使用噬菌体展示技术生成和表达抗体变异体(如Fab或scFv变异体)文库，然后筛选其与人CLDN18.2的结合亲和力。又例如，计算机软件可用于虚拟模拟抗体与人CLDN18.2的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。此类残基可避免进行取代以便防止结合亲和力的降低，或作为取代的目标以实现较强结合。
在某些实施例中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的取代中的至少一个(或全部)包含保守取代。关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有类似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间，在具有中性亲水侧链的残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间，在具有酸性侧链的残基(例如，Asp、Glu)之间，在具有碱性侧链的氨基酸(例如，His、Lys和Arg)之间，或在具有芳族侧链的残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。
在某些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变异体包含在一个或多个CDR序列和/或FR序列中总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施例中，抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段包含1、2或3个CDR序列，其与表1中列出的一种或多种CDR序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且同时以类似或甚至高于其亲本抗体的水平保持与CLDN18.2的结合亲和力。
在某些实施例中，抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段包含一个或多个可变区序列，该序列与SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48的一种或多种可变区序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且同时以类似或甚至高于其亲本抗体的水平保持与CLDN18.2的结合亲和力。在一些实施例中，在选自SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:29以及SEQID NO:37至SEQ ID NO:48的序列中总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。
b)糖基化变异体
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变异体，其可以被获得以增加或降低抗体或抗原结合片段的糖基化程度。如本文所用，术语“糖基化”是指将聚糖如岩藻糖、木糖、甘露糖或GlcNAc磷酸丝氨酸聚糖连接到蛋白质、脂质或其他有机分子上的酶促过程。根据与聚糖连接的碳，糖基化可分为五类，包括：N-连接糖基化、O-连接糖基化、磷酸-糖基化、C-连接糖基化和糖基磷脂酰肌醇化。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接型是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)的侧链的连接。O-连接型糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见地与丝氨酸或苏氨酸的连接。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段涵盖具有改善的效应子功能的糖基化变异体，如ADCC或CDC。
在某些实施例中，本文提供的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。术语“无岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化的”是指连接至抗体的N-聚糖上的核心岩藻糖减少或消除。人IgG抗体的大多数聚糖称为G0、G1和G2，它们是复杂的双触角分子，其中核心岩藻糖残基带有零个、一个或两个末端半乳糖。
可以使用本领域已知的方法制备无岩藻糖基化抗体变异体，例如，描述于US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。
在某些实施例中，抗体糖基化变异体在抗体Fc中CH2区的Asn297位点是无岩藻糖基化的。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即294位和300位之间。
在某些实施例中，抗体糖基化变异体可以通过例如去除天然糖基化位点(例如通过N297A取代)来获得，使得N-连接糖基化位点的三肽序列或O-连接糖基化位点的丝氨酸或苏氨酸残基不再存在于抗体或Fc序列中。可替代地，在某些实施例中，抗体糖基化变异体可通过在宿主细胞系中产生抗体而获得，该宿主细胞系在将所选糖基团添加至抗体中成熟核心碳水化合物结构方面存在缺陷。
c)半胱氨酸工程化变异体
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化变异体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基为不是二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化变异体可用于通过例如马来酰亚胺或卤代乙酰基在工程化半胱氨酸位点处与例如细胞毒性和/或成像化合物、标记物或放射性同位素等缀合。用于对工程化抗体或抗原结合片段引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域已知的，参见例如WO2006/034488。
d)Fc变异体
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖Fc变异体，其在其Fc区和/或铰链区包含一个或多个氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含恒定区，该恒定区包含一个或多个相对于野生型恒定区赋予增加的CDC或ADCC的氨基酸残基取代或修饰。Fc区的CH2结构域中的某些氨基酸残基可以被取代以提供增强的ADCC活性，例如通过增强Fc结构域对FcγRIIIA的亲和力来提供增强的ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法已在本领域中描述，参见例如Shields RL.等人，《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2001.276(9):6591-604；Idusogie EE.等人，《免疫学杂志》2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人，《免疫学杂志》1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.等人，《免疫学杂志》2001,166(4):2571-5；Lazar GA.等人，《美国科学院院报(PNAS)》,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.等人，《分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)》,2007,6:3009-3018；Richards JO,.等人，《分子癌症治疗学》2008,7(8):2517-27；Shields R.L.等人，《生物化学杂志》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等人，《生物化学杂志》,2003,278:3466-3473。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含一个或多个氨基酸取代，其例如通过改善或减少Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)来改变补体依赖性细胞毒性(CDC)(参见例如，WO99/51642；Duncan&Winter《自然》322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351，其涉及Fc区变异体的其他实例)。
在某些实施例中，本文提供的抗体或其抗原结合片段的恒定区包含一个或多个相对于SEQ ID NO:49(即野生型序列)的氨基酸残基取代，其选自由以下组成的群组：L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L或其任意组合。在某些实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:51的序列。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物包含一个或多个氨基酸取代，其改善与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。此类变异体可具有延长的药物动力学半衰期，因为其在酸性pH下与FcRn结合，使其避免在溶酶体中降解，并且接着转位并从细胞释放出来。工程化抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域众所周知的，参见例如Vaughn,D.等人，《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等人，《抗体工程化(Antibody Engineering)》，第1卷，第27章：工程化Fc区以改善PK(Engineering of the Fc region for improved PK),由Springer出版,2010；Yeung,Y.等人，《癌症研究》,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等人，《免疫学杂志》，176:346-356(2006)。
iii.抗原结合片段
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物还可包含抗CLDN18.2抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是所属领域中已知的，并且可以基于本文提供的抗CLDN18.2抗体产生，所述抗体包括例如CDR序列如表1中所示的示范性抗体和其不同变异体(如亲和力变异体、糖基化变异体、Fc变异体、半胱氨酸工程改造的变异体等)。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗原结合片段是双特异抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双特异抗体(ds双特异抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双特异抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
各种技术可用于产生此类抗原结合片段。示例性方法包括完整抗体的酶促消化(参见例如Morimoto等人，《生物化学与生物物理方法杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)》24:107-117(1992)；和Brennan等人，《科学》,229:81(1985))，通过宿主细胞如大肠杆菌进行重组表达(例如，对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)，从上文论述的噬菌体展示文库中筛选(例如，对于ScFv)，以及将两个Fab'-SH片段化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。生产抗体片段的其他技术对熟练的从业者来说将是显而易见的。
在某些实施例中，抗原结合片段是scFv。scFv的产生描述于例如WO93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。scFv可以在氨基或羧基末端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如，《抗体工程化》Borrebaeck编辑)。
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物中的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价。如本文所用，术语“价”是指在给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。任何大于二价的分子被视为多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点都对与相同抗原或相同表位的结合具有特异性，则二价分子可以是单特异性的。在某些实施例中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可以是单特异性的。在某些实施例中，在二价或多价抗原结合部分中，第一价结合位点和第二价结合位点在结构上相同(即具有相同序列)或在结构上不同(即尽管具有相同特异性但具有不同序列)。
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，则二价也可以是双特异性的。这也适用于多价分子。例如，当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性的，而第三结合位点对第二抗原(或表位)具有特异性时，则三价分子可以是双特异性的。
双特异性抗体
在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物是双特异性的。如本文所用，术语“双特异性”涵盖具有多于两种特异性的分子和具有多于两种特异性的分子，即多特异性。在某些实施例中，本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段能够特异性结合CLDN18.2的第一和第二表位，或能够特异性结合CLDN18.2和第二抗原。在某些实施例中，CLDN18.2的第一表位和第二表位彼此不同或不重叠。在某些实施例中，双特异性抗体及其抗原结合片段可以同时与第一表位和第二表位结合。在某些实施例中，第二抗原不同于CLDN18.2。
在某些实施例中，第二抗原包含肿瘤抗原。如本文所用，“肿瘤抗原”是指肿瘤特异性抗原(例如为肿瘤细胞所特有且通常不在非肿瘤细胞上发现的那些)、肿瘤相关抗原(例如在肿瘤和非肿瘤细胞中均发现但在肿瘤细胞中不同表达)和肿瘤新抗原(例如，由于改变蛋白质序列或在两个不相关序列之间产生融合蛋白的体细胞突变而在癌细胞中表达的那些)。
制备方法
在另一方面，本公开提供了一种制备本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与用124I、123I或131I标记的碘化物在酶促或化学氧化剂的存在下反应。
在一些实施例中，化学氧化剂是N-溴代琥珀酰亚胺、氯甘脲或氯胺-T。
在另一方面，本公开提供了一种制备本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与螯合剂缀合以获得螯合剂-抗体缀合物，以及使螯合剂-抗体缀合物与金属放射性核素如64Cu或89Zr反应。
在一些实施例中，所述螯合剂包含DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、TRITA(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；和HETA(1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NETA({4-[2-(双-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N′,N″,三(2-巯基乙基)1,4,7-三氮杂环壬烷)、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧基乙基)次膦酸])、CP256,PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、多肟及其衍生物。
药物组合物
本公开进一步提供了包含抗CLDN18.2抗体缀合物和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施例中，本文提供的药物组合物适用于肠胃外施用，例如适用于推注、静脉内注射或肿瘤内注射。在某些实施例中，药物组合物为单位剂量可注射形式。
用于本文公开的药物组合物的药学上可接受的载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、掩蔽剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其他组分或其各种组合。
合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。适合抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在包含如本文提供的抗体或抗原结合片段和缀合物的组合物中包含一种或多种抗氧化剂如蛋氨酸，降低抗体或抗原结合片段的氧化。此氧化减少将防止或减少结合亲和力的损失，由此提高抗体稳定性并使储存寿命最大化。因此，在某些实施例中，提供了包含一种或多种本文公开的抗体缀合物和一种或多种抗氧化剂如蛋氨酸的组合物。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如水性媒介物如氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或葡萄糖和乳酸林格注射液，非水性媒介物如植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲液如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)，掩蔽剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇，聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。适合的赋形剂可包括例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。适合的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
在某些实施例中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括准备好用于注射的无菌和/或无热原质溶液；准备好临在使用之前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉末，包括皮下片剂；准备好用于注射的无菌悬浮液；准备好临在使用之前与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品；和无菌和/或无热原质乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施例中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。
在某些实施例中，通过将本文公开的抗体或抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备无菌的冻干粉末。溶剂可含有提高粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性的赋形剂或其他药理学组分。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适合的试剂。溶剂可含有缓冲液，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲液，在一个实施例中，pH值为约中性。随后无菌过滤溶液，接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需制剂。在一个实施例中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶可以含单剂量或多剂量的抗CLDN18.2抗体缀合物或其组合物。用少量高于一个剂量或一组剂量所需的量(例如，约10％)过量填充小瓶是可以接受的以促进准确的样品提取和准确的给药。冻干粉末可以在适当的条件下储存，如在约4℃至室温。
用注射用水重构冻干粉提供了用于肠胃外施用的制剂。在一个实施例中，为了重构，将无菌和/或无热原质水或其他合适的液体载体添加到冻干粉中。精确量取决于给定的所选疗法，并且可以凭经验确定。
治疗和诊断CLDN18.2相关病症的方法
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物可用于诊断或治疗CLDN18.2相关病症的方法。在某些实施例中，CLDN18.2相关病症是癌症。在某些实施例中，CLDN18.2相关病症是表达CLDN18.2的癌症。
在某些实施例中，癌症选自胃癌、肺癌、支气管癌、骨癌、肝癌和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤和腺癌。
癌症的实例包括但不限于非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、蕈样真菌病、默克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、经典霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B-细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞源性肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常、原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
如本文所用，“表达CLDN18.2的癌症”是指涉及表达CLDN18.2的癌细胞的任何癌症或肿瘤。表达CLDN18.2的癌症的实例包括胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道类癌瘤、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌、阑尾癌；前列腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移，例如胃癌转移如克鲁肯伯格肿瘤、腹膜转移和淋巴结转移。
在某些实施例中，表达CLDN18.2的癌症可以是腺癌，例如晚期腺癌。在某些实施例中，癌症选自胃、食道、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。在某些实施例中，表达CLDN18.2的癌症包含胃癌，食道癌、特别是食管下端癌，食管-胃结合部癌和胃食管癌。
检测、可视化、诊断、分期和监测CLDN18.2相关病症的方法
本文提供的抗体缀合物可用于检测CLDN18.2表达，特别是以无创方式进行体内检测。
本文提供的抗体缀合物还可用于可视化、诊断、分期和监测CLDN18.2相关病症。在某些实施例中，CLDN18.2相关病症是癌症。在某些实施例中，CLDN18.2相关病症是表达CLDN18.2的癌症。
本文提供的抗体放射性核素缀合物可体内使用以提供关于(i)CLDN18.2的表达，(ii)CLDN18.2的分布和(iii)CLDN18.2的表达或分布的变化的信息。与目前可用的CLDN18.2诊断方法如免疫组织化学(IHC)相比，本文提供的抗体放射性核素缀合物在无创治疗、可量化全身评估以及多个时间点的重复给药和评估方面具有优势。
本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物可以与体内核成像模式一起使用，以使受试者身体的形貌内的靶细胞可视化。除了诊断与CLDN18.2表达相关的癌症外，本文提供的抗CLDN18.2抗体放射性核素缀合物还可用于根据本文提供的方法分期和监测癌症进展。
可根据本文描述的方法使用的合适的体内核成像方法包括但不限于正电子发射断层扫描(PET)、PET/CT组合成像仪和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。
在一个方面，本公开提供了一种获取受试者中感兴趣部位的图像的方法，该方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者的所述感兴趣部位经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者中来自放射性核素的可检测信号；
d)生成所述可检测信号的图像，从而获得所述受试者中所述感兴趣部位的图像。
在一些实施例中，所述感兴趣部位是表达或怀疑表达claudin 18.2的部位。
在一些实施例中，所述感兴趣部位患有或怀疑患有肿瘤。在一些实施例中，感兴趣部位可以是全身、躯干、头部或四肢。
在另一方面，本公开提供了一种以无创方式检测或可视化受试者中claudin 18.2表达的方法，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定或可视化所述受试者的所述感兴趣部位中的claudin18.2表达。
在一些实施例中，本文提供的CLDN18.2抗体缀合物可以静脉内注射到受试者中。在注射后某个时间段后，可以通过PET扫描受试者。
在某些实施例中，该方法还包含使受试者经历X射线计算机断层扫描(CT)，以获得所研究的身体部位的切片的图像。在某些实施例中，可以获得CT和PET的合并图像以显示CLDN18.2在身体参考框架顶部的表达和分布。
在一些实施例中，所述方法进一步包含向被识别为在所述感兴趣部位具有claudin18.2表达的受试者施用治疗有效量的抗claudin 18.2疗法。
抗claudin 18.2疗法可以是任何靶向CLDN18.2的治疗剂，包括但不限于抗CLDN18.2抗体、抗CLDN18.2抗体-药物缀合物、靶向CLDN18.2的小分子化合物、靶向CLDN18.2的核酸或靶向CLDN18.2的细胞疗法。
在一些实施例中，所述方法进一步包含基于所识别的可检测信号确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的分布。
在一些实施例中，所述方法进一步包含确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的异质性。
在一些实施例中，所述感兴趣部位是肿瘤。
在另一方面，本公开提供了一种以无创方式监测受试者的治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展的方法，其中所述受试者已接受一个治疗期的治疗，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定所述受试者的感兴趣部位中的治疗后claudin18.2表达；
e)将治疗后claudin18.2表达水平或分布分别与在所述治疗期之前从所述受试者获得的基线claudin18.2表达水平或分布进行比较以确定所述受试者中claudin18.2表达水平或分布的治疗后变化；以及
f)基于步骤(e)中确定的变化确定治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展。
在一些实施例中，基线claudin18.2表达水平或分布使用类似方法确定。
在一些实施例中，基线claudin18.2表达水平或分布在治疗期之前(即治疗前)通过向所述受试者施用有效量的本文提供的所述抗体缀合物和/或本文提供的所述药物组合物；以及使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT，识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号，并基于所识别的可检测信号确定所述受试者的感兴趣部位中基线claudin18.2表达来确定。
在一些实施例中，claudin 18.2表达水平或扩散的增加表明治疗功效降低、对治疗的反应性降低或存在抗性或存在复发。在一些实施例中，转移可以通过claudin 18.2表达扩散到claudin 18.2表达先前不可检测的部位来指示。
在一些实施例中，所述受试者患有癌症。
在一些实施例中，用于确定基线claudin 18.2表达的感兴趣部位与用于确定治疗后claudin 18.2表达的感兴趣部位相同或至少相当。当感兴趣部位与另一个感兴趣部位属于相同类型的组织或位于相同的病变内时，它们是可比的。
在一些实施例中，用于确定基线claudin 18.2表达的感兴趣部位也可以不同于用于确定治疗后claudin 18.2表达的感兴趣部位。
治疗方法
在另一方面，提供了治疗受试者中将受益于调节CLDN18.2活性的疾病或病症的方法，该方法包含将治疗有效量的本文提供的CLDN18.2抗体缀合物和/或药物组合物施用于有此需要的受试者。
在某些实施例中，疾病或病症是CLDN18.2相关疾病或病症。在一些实施例中，CLDN18.2相关疾病或病状为癌症。在一些实施例中，CLDN18.2相关疾病或病症是表达CLDN18.2的癌症。
在某些实施例中，CLDN18.2抗体缀合物包含治疗性放射性核素。
在某些实施例中，治疗性放射性核素选自由以下组成的群组：111In、111mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、199Au和211Pb。
在某些实施例中，治疗性放射性核素选自由以下组成的群组：131I、177Lu、153Sm、223Ra、89Sr、90Y、213Bi、212Pb、166Ho。
本文提供的CLDN18.2抗体缀合物的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、当前药物、健康状况和交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展程度。如由这些和其他情况或要求所指示，所属领域的一般技术人员(例如，医生或兽医)可按比例减少或增加剂量。本文公开的CLDN18.2抗体缀合物可以通过本领域已知的任何途径施用，例如肠胃外(例如，皮下、腹膜内、包括静脉内输注在内的静脉内、肌内或皮内注射)。
在一些实施例中，该方法进一步包含向受试者施用治疗有效量的本文提供的CLDN18.2抗体缀合物。
在某些实施例中，受试者被识别为具有表达CLDN18.2的癌细胞。CLDN18.2在癌细胞上的存在和/或表达水平可以通过本领域已知的各种方法来确定，如定量荧光细胞术、免疫组织化学(IHC)、qPCR、逆转录酶PCR、微阵列、SAGE、FISH等。还可以基于本文提供的方法确定受试者中CLDN18.2的存在和/或表达水平。
在某些实施例中，已使用本文提供的方法将受试者诊断为患有表达CLDN18.2的癌症。
在某些实施例中，已经使用本文提供的包含本文提供的诊断性放射性核素的抗体缀合物将受试者诊断为患有表达CLDN18.2的癌症。
在一些实施例中，本文公开的CLDN18.2抗体缀合物可单独施用或与一种或多种另外的治疗手段或药剂组合施用。例如，本文公开的CLDN18.2抗体缀合物可以与第二治疗剂组合施用，例如化疗剂、抗癌药、放射疗法、免疫疗法、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、姑息治疗、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)或一种或多种止吐药或其他针对化疗引起的并发症的治疗。
在这些实施例的某些中，本文公开的CLDN18.2抗体缀合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用，并且在这些实施例的某些中，CLDN18.2抗体缀合物和另外的治疗剂可以是作为相同药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的CLDN18.2抗体缀合物不必与该药剂同时施用或在与该药剂相同的组合物中施用。本文使用短语“组合”时，在另一种药剂之前或之后施用的CLDN18.2抗体缀合物被视为与该药剂“组合”施用，即使CLDN18.2抗体缀合物和第二药剂经由不同途径施用。在可能的情况下，与本文公开的抗体或抗原结合片段组合施用的另外的治疗剂根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表施用，或根据《医师案头参考(Physicians'Desk Reference)》2003(《医师案头参考》，第57版；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))或本领域众所周知的方案施用。
试剂盒
在另一方面，本公开提供了包含本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物或本文提供的组合物的试剂盒。
在一些实施例中，试剂盒可用于检测受试者中CLDN18.2的存在或量或分布，或可用于本文提供的诊断方法。
在一些实施例中，试剂盒可用于治疗受试者中表达CLDN18.2的癌症，或可用于本文提供的治疗方法。
在一些实施例中，试剂盒包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含本文提供的第一抗CLDN18.2抗体缀合物，所述第一抗CLDN18.2抗体缀合物包含本文公开的治疗性放射性核素，所述第二组合物包含本文提供的第二抗CLDN18.2抗体缀合物，所述第二抗CLDN18.2抗体缀合物包含本文公开的诊断性放射性核素。在一些实施例中，治疗性放射性核素选自由以下组成的群组：111In、111mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、199Au和211Pb，并且/或者诊断性放射性核素选自由以下组成的群组：18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111ln、123l、124l、125l、131l、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154"1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194lr、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。在一些实施例中，第一抗CLDN18.2抗体和第二抗CLDN18.2抗体相同或不同。在一些实施例中，第一和第二抗CLDN18.2抗体均包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:19序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:21序列的HCDR3，该轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:14序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:16序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3。
在一些实施例中，试剂盒用于本文提供的方法中。
在一些实施例中，本公开提供了包含本文提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂的试剂盒。该试剂盒可用于治疗、预防和/或改善CLDN18.2相关疾病。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物或本文提供的组合物在制备用于本文提供的方法的药物或诊断产品中的用途。
在某些实施例中，试剂盒可以进一步包含能够通过一些其他途径递送试剂盒组分的装置，例如，用于如肠胃外递送的应用的注射器是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。在某些实施例中，本文提供的抗CLDN18.2抗体缀合物可以预填充注射器或自动注射笔的形式提供，所述预填充注射器或自动注射笔含有抗体的无菌、液体制剂或冻干制剂(例如，Kivitz等人，《临床治疗(Clin.Ther.)》2006,28:1619-29)。
试剂盒组分可以包装在一起或分成两个或更多个容器。在一些实施例中，容器可以是含适合重构的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可以含有一种或多种适用于重构和/或稀释其他试剂的缓冲液。可以使用的其他容器包括但不限于袋、托盘、盒、管等。试剂盒组件可以在容器内无菌包装和保持。可以包括的另一个组件是该试剂盒的使用说明。
实例
虽然本公开已经参照特定实施例(其中一些是优选实施例)具体地显示和描述，但本领域的技术人员应理解，可以在其中进行形式和细节上的各种改变而不背离如本文公开的本公开的精神和范围。
实例1介绍
一系列研究表明，CLDN18.2作为胃癌靶向治疗的新靶标具有广阔的应用前景。以精准治疗为目标，如何最大化潜在受益者以及如何快速和全面地评价CLDN18.2阳性胃癌患者的分子病理特征是亟待解决的问题。
解决问题意味着对CLDN18.2的检测技术提出了更高的要求。然而，CLDN18.2的检测仍然存在很多局限性。
(1)单一检测方法。目前，商业抗体仅用于组织石蜡切片、冰冻组织切片免疫组织化学(IHC)检测。由于辨别力差和灵敏度低，他们无法区分CLDN18.2或CLDN18.1(Claudin18的另一种剪接变异体)，因为CLDN18.2和CLDN18.1的氨基酸序列高度同源(91％的氨基酸序列是相同的)。
(2)检测方法是侵入性的。单一的检测方式导致CLDN18.2检测样本仅限于组织切片，并且样本采集具有侵入性且繁琐，对患者的要求较高。
(3)检测样本异质性：晚期胃癌异质性显著。我们发现CLDN18.2的组织表达空间和强度可能存在异质性，并且其组织和液体活检样本可能存在异质性。晚期患者常规病理分子诊断样本以内镜活检样本为主，组织含量较少且采样部位有限；因此，由于CLDN18.2表达的异质性，单个内镜组织样本检测可能会错过一些潜在的受益者。
(4)静态试验结果：研究表明，在药物治疗之前和之后，靶标表达强度和空间分布，肿瘤组织免疫微环境状态存在显著差异，影响后续治疗功效。由于采样和检测方法的限制，难以支持CLDN18.2动态监测的探索。因此，针对这些问题，最佳解决方案是探索和整合CLDN18.2无创、全面、实时动态检测技术以实现对所有病灶的全面评价，和结合疗效总结潜在受益者特征，并指导诊断和治疗。
因此，利用现代分子成像技术全面、无创、实时和动态的特点，开发高特异性的分子探针对CLDN18.2的诊断和后续免疫检查点抗体反应的评价具有重要意义。虽然聚焦HER2阳性胃癌的核素分子探针很多，并且技术相对成熟，但目前国内外对CLDN18.2核素探针的报道仍属空白。本发明以CLDN18.2靶向单克隆抗体18B10为例，使用下一代核素124I/64Cu/89Zr标记18B10抗体，并且体内研究表明其在CLDN18.2高表达肿瘤中具有显著的高摄取，这表明核素标记的18B10抗体作为靶向CLDN18.2的特异性探针是一种潜在的肿瘤免疫治疗筛选、治疗过程监测和功效评价的成像剂。
本发明至少部分提供了标记CLDN18.2靶向单克隆抗体(以18B10为例)的新一代核素124I/64Cu/89Zr及其制备方法和应用。
本发明构思如下：124I(T1/2＝4.2d)、64Cu(T1/2＝12.7h)、89Zr(T1/2＝78.4h)是新型固体靶PET核素，临床应用前景广泛。与18F(T1/2＝110分钟)和11C(T1/2＝20.4分钟)相比，124I/64Cu/89Zr的半衰期相对长，有利于放射性核素的长期成像研究和运输，并且肝摄取低，有利于检测肝病变。仅与抗原分子上的一个表位(抗原决定簇)结合的单克隆抗体可用作研究抗原结构和功能并阐明机制的分子探针。使用核素标记的单克隆抗体容易确定生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在体内的位置和分布。
为了实现本发明的目的，在第一方面，本发明提供了一种新一代核素标记的CLDN18.2靶向单克隆抗体，其为放射性核素124I/64Cu/89Zr标记的CLDN18.2靶向单克隆抗体。
在第二方面，本发明提供了一种124I/64Cu/89Zr-CLDN18.2靶向单克隆抗体(以18B10为例)的制备方法。NBS法将124I标记至单克隆抗体分子结构中苯基羟基基团的邻对位，该方法包括：将0.5-1.5mL 0.1M pH7.2 PB缓冲液、0.5-10mg 18B10和6-120μg N-溴代琥珀酰亚胺加至0.5-1.0mL 25-90KBq/μL Na124I溶液中，并在37℃培养60秒，然后加入0.05-0.2mL 10％人血清白蛋白终止反应；最终反应溶液通过PD-10柱纯化以得到目标产物。
64Cu/89Zr标记的CLDN18.2靶向单克隆抗体采用双官能螯合剂实现(以18B10为例)：向浓度为2-5mg/mL的18B10溶液中加入相当于6摩尔单克隆抗体的DFO，并且用去离子0.1M碳酸氢钠溶液调节反应体系pH值至8.5；通过在4-37℃反应4-24小时得到DFO-18B10。将15μg-2mg标记前体加入0.1-1.0mL 0.1M pH 5.5的乙酸钠溶液中，然后加入25-100MBq新鲜64Cu/89Zr溶液，并将pH值调至7.0；将温度控制在40℃，持续30分钟；最终反应溶液通过PD-10柱纯化以得到目标产物。
当标记率大于95％并通过PD-10柱纯化后，目标产物的放射化学纯度为98.76％。
使用前，先用0.01M pH 7.4PBS溶液平衡PD-10柱，每次加入5mL PBS，以重力流速干燥柱，重复5次；然后用0.01M pH 7.4PBS溶液纯化目标产物。
124I-18B10的体外稳定性分析表明，它可以在0.01M pH 7.4PBS溶液中于25℃保持良好的稳定性48小时，并且放射化学纯度为97.89±0.05％。
在第三方面，本发明提供了124I/64Cu/89Zr-CLDN18.2靶向单克隆抗体(以18B10为例)在制备靶向CLDN18.2的肿瘤成像剂和治疗药物中的应用。
在第四方面，本发明提供了124I/64Cu/89Zr-CLDN18.2靶向单克隆抗体(以18B10为例)在制备PET/CT分子成像探针中的应用。
在第五方面，本发明提供了一种靶向CLDN18.2的肿瘤显像剂，其包含核素标记的CLDN18.2靶向单克隆抗体。
新一代核素标记单克隆抗体(124I-18B10)可特异性结合肿瘤细胞表面上的CLDN18.2；正常小鼠除血液外无特异性器官和组织分布；在携带PDX的小鼠的PET成像研究中，18F-FDG摄取在CLDN18.2阳性和CLDN18.2阴性荷瘤模型中都非常低，如图4所示。124I-18B10在CLDN18.2阳性的携带PDX的小鼠中的分布随时间动态变化：60小时的肿瘤部位摄取信号较2小时显著增加；在120小时时，心脏血池中的摄取信号消失，并且仅能观察到肿瘤中的信号。在CLDN18.2阴性的携带PDX的小鼠中，124I-18B10在肿瘤部位没有特异性积累，并且在CLDN18.2阳性的携带PDX的小鼠中，124I-IgG没有特异性积累。这些结果表明124I-18B10探针在CLDN18.2阳性肿瘤中特异性积累，并且具有高灵敏度和特异性的特点。其未来可用作成像剂以无创检测患者肿瘤中CLDN18.2的表达。
总之，本发明至少具有以下优点和有益效果：本发明提供的新型PET分子探针124I/64Cu/89Zr-CLDN18.2靶向单克隆抗体具有稳定的特性，良好的成像效果，高亲和力，和对CLDN18.2的功能活性，并且有望用于实时和无创监测全身病变中CLDN18.2的表达，监测同一病变和不同病变中CLDN18.2表达的异质性，以及观察治疗期间CLDN18.2表达的变化，以便筛选患者，监测疗效，预警耐药性和/或复发和转移，并实现靶向肿瘤药物的个体化和精准治疗。
在本发明中，使用下一代PET核素124I/64Cu/89Zr，这可实现对单克隆抗体的标记，并且对单克隆抗体的活性影响很小；此外，肝非特异性摄取低，这有利于肝病变的检测；并且全身背景低，这具有良好的肿瘤与非肿瘤比例并且有利于肿瘤病变的观察。
实例2靶向CLDN18.2的新一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)的制备
研究中使用的CLDN18.2靶向单克隆抗体18B10由迈博斯生物医药(苏州)有限公司(MabSpace Biosciences(Suzhou)Co.,Ltd.)提供，其与人和小鼠CLDN18.2均有交叉反应，并且可在小鼠中测试以进行临床前研究。PD-10预装凝胶柱购自GE(美国)。
通过NBS反应制备124I-18B10：将0.8mL 0.1M pH 7.2PB缓冲液、0.1mL(29.2mg/mL)18B10单克隆抗体溶液(用H2O制备)和36μg NBS依次加入到1.0mL 59.2KBq/μL Na124I溶液中，并在37℃培养60秒，然后加入0.1mL 10％人血清白蛋白终止反应；最终反应溶液通过PD-10柱纯化以得到目标产物。
使用前，先用0.01M pH 7.4PBS溶液平衡PD-10柱，每次加入5mL PBS，以重力流速干燥柱，重复5次；然后用0.01M pH 7.4PBS溶液纯化目标产物。
Radio-TLC和Radio-HPLC用于确定放射性标记率和放射化学纯度。Radio-TLC检测：将2μL放射性为37-74kBq(1-2μCi)的游离Na124I和纯化的124I-18B10加入到20μL饱和EDTA中。将上述溶液2μL从新华1号滤纸底部1cm处滴下并置于生理盐水显影系统中。完全显影后，取出滤纸并干燥以用于Radio-TLC检测。Radio-HPLC检测：将放射性为37-74kBq(1-2μCi)的2μL游离Na124I和纯化的124I-18B10稀释到50μL 0.01M pH 7.4PBS中以用于Radio-HPLC分析。分析条件：Agilent Bio SEC-3凝胶过滤/体积排阻色谱柱，流速1mL/min，流动相0.01M pH 7.4PBS。
目标产物124I-18B10的放射性标记率和放射化学纯度分别为97.94％和98.76％。目标产物124I-18B10在PBS中48小时后放射化学纯度保持在约98％(图1)。
实例3靶向CLDN18.2的新一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)的摄取
通过将CLDN18.2转染至MKN45细胞并筛选，获得了高CLDN18.2表达的MKN45-CLDN18.2高细胞系。MKN45细胞用作阴性对照细胞。将接种细胞在24孔板中均匀培养过夜以使其完全贴壁。第二天，加入1mCi 124I-18B10或124I-hIgG，并分别培养10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。在阻断组中加入0.5mg/孔冷前体18B10以阻断摄取信号。培养后，用PBS洗涤细胞三次，并收集裂解物。用γ计数器检测和分析摄取信号。
结果(图2)表明，MKN45-CLDN18.2高细胞在10分钟时显示出随时间增加的高124I-18B10摄取率。当加入冷前体进行阻断时，摄取率显著下降，这表明摄取信号是CLDN18.2特异性的。MKN45-CLDN18.2高细胞对124I-hIgG的摄取和MKN45细胞对124I-18B10的摄取均低。
实例4靶向CLDN18.2的新一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)在正常小鼠中的生物分布
经由尾静脉将124I-18B10(0.74MBq,200μL)注射到正常昆明小鼠中。注射后2小时、24小时、60小时、120小时分离小鼠的心、肝、肺、肾、脾、胃、骨、肌肉、大肠、小肠、脑、血液和其他器官和组织。研磨后，通过γ计数器检测和分析摄取信号，并得到124I-18B10探针的ID％/g。
在正常小鼠中(图3)，血液摄取在所有时间点都是最高的。除血液外，2小时时肝、肾、肺、脾的摄取高于其他器官和组织的摄取。所有器官的摄取随着时间的推移而减少。与血液相比，其他器官的摄取往往较低。
实例5靶向CLDN18.2的新一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)在携带PDX肿瘤的小鼠中的PET成像
通过免疫组织化学(IHC)方法，选择CLDN18.2阳性PDX(阳性强度3+)和CLDN18.2阴性PDX进行接种。将所有肿瘤组织皮下注射到裸鼠右下肢。当PDX肿瘤直径为0.8cm时，将荷瘤小鼠分组。将CLDN18.2阳性的携带PDX的小鼠分为三组：18F-FDG组、124I-18B10组和124I-hIgG组。这三组分别经由尾静脉注射18F-FDG、18.5MBq 124I-18B10和18.5MBq 124I-hIgG。CLDN18.2阴性的携带PDX肿瘤的小鼠也分为相同的三组。在注射后2小时、60小时和120小时，用异氟醚(2％异氟醚-30％氧气/空气)麻醉动物，并在Micro PET/CT上进行成像。
18F-FDG摄取在CLDN18.2阳性和CLDN18.2阴性荷瘤模型中都非常低，如图4所示。124I-18B10在CLDN18.2阳性的携带PDX的小鼠中的分布随时间动态变化：在2小时时，在心脏血池和CLDN18.2阳性肿瘤部位检测到摄取信号；在60小时时，心脏血池中的摄取信号显著减少，而在肿瘤中摄取信号增加；在120小时时，心脏血池中的摄取信号消失，并且仅能观察到肿瘤中的信号。124I-18B10在CLDN18.2阴性的携带PDX的小鼠的所有组织和肿瘤中在不同时间点的摄取信号非常相似，这说明在CLDN18.2阴性肿瘤中没有特异性积累。作为阴性对照，在每个时间点，发现124I-IgG在CLDN18.2阳性的携带PDX的小鼠中的摄取信号在心脏血池中而不是在肿瘤中高。这些结果表明124I-18B10探针在CLDN18.2阳性肿瘤中特异性积累，并且在长时间(120小时)成像后仍有显著信号。其具有高灵敏度和特异性的特点，并且未来可用作成像剂以无创检测患者肿瘤中CLDN18.2的表达。
本发明提供的新一代核素124I/64Cu/89Zr标记的CLDN18.2靶向单克隆抗体具有稳定的特性，良好的成像效果，高亲和力，和对CLDN18.2的功能活性，并且有利于CLDN18.2阳性肿瘤病变的诊断和准确分期。临床前动物研究证实，其具有成为应用前景良好的靶向CLDN18.2成像剂的潜力。
实例6：经由定点诱变对与CLDN18.1不同的CLDN18.2氨基酸进行选定抗体的表位作图
1.人CLDN18.2-mRFP和人CLDN18.1-mRFP构建体的生成
编码人CLDN18.1(氨基酸1-261，SEQ ID NO:31)-mRFP1(氨基酸1-225)和人CLDN18.2(氨基酸1-261，SEQ ID NO:30)-mRFP1(氨基酸1-225)的cDNA在体外合成(SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:53分别是氨基酸序列)。然后按照制造商的说明，使用Syno组装混合试剂(Synbio)通过同源重组方法将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)载体中。使用凯杰(QIAGEN)Plasmid Mega Kit(凯杰)纯化质粒。
根据人CLDN18.1和CLDN18.2的序列(Genbank登录号：剪接变异体1(CLDN18.1)：NP_057453，NM_016369，和剪接变异体2(CLDN18.2)：NM_001002026，NP_001002026)，8个不同的氨基酸位于28-70之间，这可能是与人CLDN18.2而非CLDN18.1特异性结合的决定因素。使用上面产生的野生型人CLDN18.2-mRFP质粒作为模板，用引物产生整合序列的两个片段。使用引物通过重叠PCR扩增在指定位置处单个氨基酸变为人CLDN18.1的氨基酸的人CLDN18.2-mRFP变异体。特定突变位于Q29M、N37D、A42S、N45Q、Q47E、E56Q、G65P和L69I。使用引物通过重叠PCR扩增在指定位置处单个氨基酸改变的人CLDN18.1-mRFP变异体。特定突变位于M29Q、D37N、S42A、Q45N、E47Q、Q56E、P65G、I69L。然后通过同源重组的方法将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)载体中。通过对单个阳性克隆进行测序来识别和确认人CLDN18.2-mRFP变异体。
随后，将这些突变体和野生型人CLDN18.2-mRFP或人CLDN18.1-mRFP的质粒转染到HEK293细胞系中。首先，将5×106个HEK293细胞以60％～80％的比率接种到60mm培养皿中进行转染。将400μl 1×HBS中的10μg DNA和10μl 25kDa线性PEI转染试剂(溶解在1×HBS中，1mg/ml原液)混合以达到1:2.5的DNA/PEI比率。接下来将混合物逐滴添加到HEK293细胞培养物中。6-8小时后，用完全DMEM替换转染的细胞过夜。在转染后24小时，收集细胞用于使用嵌合抗体进行FACS分析。
人CLDN18.1的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
人CLDN18.1-mRFP1的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)：
MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYVMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA
人CLDN18.2的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
人CLDN18.2-mRFP1的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)：
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYVMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA
2.CLDN18.2嵌合抗体与位点突变的HEK293-CLDN18.2或HEK293-CLDN18.1细胞的结合
将转染的HEK293-CLDN18.2或HEK293-CLDN18.1细胞以105/孔、100μl/孔的密度重悬于含2％ BSA的PBS中。细胞用FACS洗涤缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤3次，并且每孔与100μl/孔10μg/ml嵌合抗体和IMAB362在4℃下一起温育30分钟。接下来，细胞用FACS洗涤缓冲液洗涤3次，并与100μl/孔山羊抗hIgG(H+L)-FITC(1:200稀释)在4℃下一起温育另外30分钟。最后，细胞用FACS洗涤缓冲液洗涤3次，并通过流式细胞术分析。为了分析与CLDN18.2转染细胞的结合，RFP阳性细胞用于控制门控。
IMAB362按照US2009169547A1中公开的序列表达。选择并扩增具有最高信号的单细胞克隆用于细胞库。
IMAB362的重链可变区(SEQ ID NO:72)
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSWRGNSFDYWGQGTTLTVSS
IMAB362的轻链可变区(SEQ ID NO:73)
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
计算这些嵌合抗体与突变的CLDN18.2变异体的结合信号相对于野生型的百分比并总结在表4中。如图5A-5B所示，当E56突变为Q时，18B10-C(即与人IgG1恒定区融合的18B10的嵌合抗体)的结合完全丧失。这种变化也适用于IMAB362和其他嵌合抗体，但59A9-C除外。此外，我们发现其他氨基酸如A42、N45在一定程度上也有助于IMAB362和其他抗体的结合，但对于18B10-C则不然。
表4
实例7：人源化抗体的产生和表征
1.人源化抗体的产生、表达和纯化
18B10
人生殖系框架序列VK/4-1的轻链和VH/1-46的重链分别用于CDR移植。
重链(HC)变异体1、2和3分别通过将三个CDR直接移植到生殖系序列(18B10 HC生殖系，SEQ ID NO:23)，以及HC变异体1(Hu18B10_Ha,SEQ ID NO:25)的R71I、T73K回复突变，HC变异体2(Hu18B10_Hb,SEQ ID NO:27)的R71I、T73K、T28S、M69L回复突变和HC变异体3(Hu18B10_Hc,SEQ ID NO:29)的R71I、T73K、T28S、M69L、R38K、M48I回复突变来获得。
(1)18B10 HC的生殖系序列：
VH/1-46(18B10-生殖系，SEQ ID NO:23)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPS GGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH/1-46变异体1(Hu18B10_Ha,SEQ ID NO:25)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTMTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS
VH/1-46变异体2(Hu18B10_Hb,SEQ ID NO:27)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS
VH/1-46变异体3(Hu18B10_Hc,SEQ ID NO:29)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVKQAPGQGLEWIGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS
轻链(LC)变异体1和2分别通过将三个CDR直接移植到生殖系序列(18B10 LC生殖系，SEQ ID NO:24)，以及变异体1(Hu18B10_La,SEQ ID NO:26)和LC变异体2(Hu18B10_Lb,SEQ ID NO:28)的S63T、I21M没有回复突变来获得。
(2)18B10 LC的生殖系序列：
VK/4-1(18B10 LC生殖系，SEQ ID NO:24)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
VK/4-1变异体1(Hu18B10_La,SEQ ID NO:26)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNLKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGGGTKVEIK
VK/4-1变异体2(Hu18B10_Lb,SEQ ID NO:28)
上述重链可变区和轻链可变区的组合产生以下人源化18B10抗体：18B10-HaLa(具有SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:26的VL)、18B10-HbLa(具有SEQ ID NO:27的VH和SEQ IDNO:26的VL)、18B10-HcLa(具有SEQ ID NO:29的VH和SEQ ID NO:26的VL)、18B10-HaLb(具有SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:28的VL)、18B10-HbLb(具有SEQ ID NO:27的VH和SEQ IDNO:28的VL)、18B10-HcLb(具有SEQ ID NO:29的VH和SEQ ID NO:28的VL)。
将18B10的重链和轻链的人源化变异体连接到人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区，如下所示：
人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:49)：
人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:50)：
合成上述重链和轻链cDNA的可变区，并与人IgG1和人κ的恒定区融合。将所选抗体基因的重链和轻链克隆到表达载体中，并使用来自凯杰的Plasmid Maxiprep System制备大规模DNA。根据制造商的方案，使用来自英杰公司(Invitrogen)的ExpiFectamineTM CHO试剂进行转染。当细胞活力为约60％时收集上清液。通过0.22um过滤囊过滤细胞培养上清液以去除细胞碎片。将上清液加载到预平衡的蛋白A亲和柱上。然后用平衡缓冲液(PBS)洗涤柱内的蛋白A树脂，并使用25mM柠檬酸盐(pH 3.5)洗脱抗体。用1M Tris-碱(pH 9.0)将pH调节至约6.0-7.0。内毒素控制在1EU/mg以下。然后通过SDS-PAGE和SEC-HPLC表征纯化的抗体。
2.与人和小鼠CLDN18.2的结合
将对数期HEK293-CLDN18.2和NUGC4细胞重新悬浮在PBS中。使用FACS洗涤缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤3次细胞后，将100μl/孔稀释的400nM至0.002nM范围的人源化抗体加入每个孔中，以在4℃下温育30分钟。再次，使用FACS洗涤缓冲液洗涤细胞3次，然后与100μl/孔山羊抗mIgG-FITC(1:400稀释)在4℃下一起温育另外30分钟。在使用FACS洗涤缓冲液进行最后3次洗涤后，通过流式细胞术分析细胞。
所有的人源化抗体变异体都与嵌合抗体进行了头对头测试，以筛选出最好的。所有变异体都完全保留了它们的结合。接下来，测试只有一个回复突变的18B10-HaLa与HEK293-小鼠CLDN18.2细胞的结合。18B10-HaLa与小鼠CLDN18.2的结合能力比IMAB362更强，并且MFI更高，这表明18B10-HaLa对小鼠具有良好的交叉反应性。
3.KinExA对人源化CLDN18.2抗体的亲和力分析
通过KinExA头对头地评价18B10-HaLa和IMAB362与表达CLDN18.2的细胞的结合亲和力。按照KinExA 4000(Sapidyne Instruments Inc.)的说明，用30μg山羊抗人IgG Fc抗体包被200mg PMMA硬珠(Sapidyne，#440176)2小时，然后用10mg/ml BSA阻断1小时。在对数期收集两种胃细胞系NUGC4和KATOIII(ATCC，Cat#HTB-103)，并与0.2nM 18B10-HaLa或IMAB362混合。使用0.2nM 18B10-HaLa或IMAB362将细胞-抗体混合物稀释2倍，并在室温下温育3小时。游离抗体的量随稀释度增加。这些游离抗体被山羊抗人IgG Fc包被的珠捕获，随后用1μg/ml Alexa Fluor 647-抗人IgG标记以用于读数。
每种抗体的结合亲和力总结在表5中。18B10-HaLa与NUGC4细胞和KATOIII结合的Kd为约0.3nM，超过IMAB362的8倍。这与上述FACS结合结果一致。
表5.CLDN18.2抗体对胃细胞系的Kd
Kd(nM) 18B10-HaLa IMAB362
NUGC4 0.303 2.58
KATOIII 0.315 ND
4.HEK293-CLDN18.2细胞的CDC测定
在CDC活性测定中，18B10-HaLa与IMAB362进行了头对头测试。18B10-HaLa的CDC活性超过IMAB362的20倍。18B10-HaLa依赖性特异性细胞杀伤百分比在0.3μg/ml浓度下达到86％，而IMAB362在相同浓度下无细胞杀伤。
5.对MKN45-CLDN18.2细胞的结合和细胞毒性作用
细胞结合测定与上述相同。18B10的所有人源化变异体以与嵌合18B10相当的亲和力与细胞结合。选择只有一个回复突变的18B10-HaLa用于进一步的ADCC活性研究。
使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176细胞作为效应细胞和MKN45-CLDN18.2细胞作为靶细胞测试ADCC活性。18B10-HaLa具有比IMAB362低得多的EC50(0.05μg/ml)，与嵌合18B10的EC50一致。
6.对NUGC4细胞的结合和细胞毒性作用
细胞结合和ADCC测定与上述相同。与IMAB362相比，18B10-HaLa显示出更好的ADCC效力(EC50约0.59μg/ml)。
7.使用NUGC4作为靶细胞和PBMC作为效应细胞的ADCC测定
将对数期NUGC4细胞重悬于含10％ FBS的RPMI1640中。将细胞以每孔1×104个细胞预接种到96孔U底板中。将抗CLDN18.2抗体和IMAB362在含10％ FBS的RPMI1640中梯度稀释，并以200至0.2μg/ml的最终浓度添加到上述板中，并在37℃下温育30分钟。将来自妙顺(上海)生物科技有限公司(Miao Shun(Shanghai)Biological&Technology Co.,Ltd)的冷冻PBMC从液氮中取出，并立即放入37℃水浴中。离心后，将细胞重悬于RPMI1640加10％ FBS中，并以每孔40×104个细胞接种到上述96孔U底板中。然后将板置于37℃的温育箱中5小时。
温育后，将板平衡至22℃。使用Promega CytoTox-ONE均质膜完整性测定试剂盒(G7892)或CytoTox非放射性细胞毒性测定(G1780)检测LDH。按照制造商的说明添加裂解液、试剂和终止溶液后，在560nm的激发波长和590nm的发射波长(G7892)或490nm或492nm(G1780)的吸光度下测量荧光。
18B10-HaLa显示出比IMAB362好得多的ADCC效力。由于未拟合至回归曲线，EC50可能无法准确计算。
8.使用人CLDN18.2上的定点诱变对所选抗体进行表位作图
使用相同方法和人CLDN18.2-mRFP质粒，将如下所列的人CLDN18.2 28-80之间的42个氨基酸一次替换为丙氨酸。使用引物通过重叠PCR扩增这些变异体。特定突变是Q28A、Q29A、W30A、S31A、T32A、Q33A、D34A、L35A、Y36A、N37A、N38A、V40A、T41A、V43A、F44A、N45A、Y46A、Q47A、L49A、W50A、R51A、S52A、V54A、R55A、E56A、E56A、S57A、S58A、F60A、T61A、E62A、R64A、Y66A、F67A、T68A、L69A、L70A、L72A、M75A、L76A、Q77A、V79A、R80A。然后按照制造商的说明，使用Syno组装混合试剂(Synbio)通过同源重组方法将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)载体中。使用凯杰Plasmid Mega Kit(凯杰)纯化质粒。
随后，将这些突变体和野生型CLDN18.2-mRFP的质粒转染到HEK293细胞中。转染后24小时通过流式细胞术分析细胞。
当W30、L49、W50、E56突变为A时，18B10-HaLa的结合完全丧失(结合百分比<10％)，这表明这4个氨基酸对于其与人CLDN18.2的结合至关重要。尤其是E56是构成结合表位的最重要的氨基酸。除了这4个关键氨基酸之外，其他几种氨基酸在被丙氨酸取代后也会影响结合(结合百分比在10％和25％之间)，如R51、F60、E62、R80。59A9-C与位点突变的CLDN18.2的结合仅部分依赖于E56(结合百分比为约22％)。与野生型相比，突变的CLDN18.2与抗体的结合百分比总结在表6中。
表6
/>
实例8靶向CLDN18.2的下一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)在PDX小鼠中的生物分布
将124I-18B10(0.74MBq，每组200μL)注射到通过将来自胃癌患者的肿瘤组织经由尾静脉移植入严重免疫缺陷小鼠(NSG)小鼠形成的患者来源异种移植物(PDX)模型(证实claudin 18.2过表达，北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤科提供)中。生物分布实验分为2组，包括试验组和阻断组，试验组中含在PDX小鼠中的124I-18B10，阻断组中共添加124I-18B10与未标记的18B10(200mg/小鼠)。注射后240小时分离小鼠的心、肝、肺、肾、脾、胃、骨、肌肉、大肠、小肠、脑和肿瘤。研磨后，通过γ计数器检测和分析摄取信号，并得到124I-18B10探针的ID％/g。
在PDX小鼠(图6)中，与其他组相比，124I-18B10在肿瘤中的摄取最高。由于来自未标记的18B10的竞争，阻断组在正常组织和肿瘤组织中的摄取均显著降低。结果显示124I-18B10集中在肿瘤细胞上，这支持其在疾病诊断中的应用。
实例9靶向CLDN18.2的下一代核素标记单克隆抗体(以124I-18B10为例)在患者中的作图
在一项研究性临床研究中，使诊断为表达claudin 18.2的癌症的患者在124I-18B10PET/CT成像之前或之后1周内经历124I-18B10 PET/CT扫描和18F-FDG PET/CT(每位患者11.1-18.5MBq，通过静脉注射)。对于124I-18B10 PET成像，通过在124I-18B10施用之前3天和之后7天服用卢戈氏碘化钾(每次十滴，每天3次)阻断患者的甲状腺。在施用124I-18B10后2小时、24小时、72小时、96小时，使用Siemens Biograph mCT Flow 64扫描仪(德国埃尔兰根(Erlangen))获得124I-18B10 PET/CT扫描。从头到脚或大腿上部分别在2小时、24小时、48小时、72小时以0.8mm/s、0.5mm/s、0.4mm/s、0.3mm/s和0.2mm/s的扫描速度采集PET图像，并使用有序子集最大期望值法进行重建。
124I-18B10在患者中的生物分布源自前五名患者的图像(图7)。患者的甲状腺被充分阻塞。示踪剂在注射后集中在血液中并随着时间的推移而降低，并且在脾和肝中的浓度随着时间的推移而增加。脾在24小时、48小时和72小时成为最活跃的器官。肾中也有示踪剂摄取，并且脑、肺和骨中的摄取低。正常胃壁未见明显示踪剂摄取。此外，图8显示124I-18B10在患者的卵巢病变中积累，这是转移到卵巢的表达claudin 18.2的癌症。与18F-FDG PET/CT结果相比，来自124I-18B10 PET/CT 24h和124I-18B10 PET/CT 48的结果显示，124I-18B10在卵巢病变中表达claudin 18.2的癌组织中的摄取较高(18F-FDG PET/CT SUVmax:3(左)，2.9(右)；124I-18B10 PET/CT 24h SUVmax:25.1(左)，22.2(右)；124I-18B10PET/CT 48hSUVmax:12.5(左)，17.6(右))。
序列表
<110> 苏州创胜医药集团有限公司
<120> 抗CLDN18.2抗体缀合物
<130> 063694-8008CN01
<150> PCT/CN2021/076910
<151> 2021-02-19
<150> PCT/CN2022/074750
<151> 2022-01-28
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
Gly Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 2
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> 小鼠
<400> 6
Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Tyr Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 9
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<213> 小鼠
<400> 8
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
His Ile Asp Pro Tyr Tyr Val Thr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 10
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
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<213> 小鼠
<400> 11
Ser Phe Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr
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<213> 小鼠
<400> 12
Gln Asn Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 7
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Thr Tyr Phe Ile Gly Val Gly
1 5
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<211> 17
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<213> 小鼠
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu
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Thr
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<212> PRT
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His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser
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<213> 小鼠
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Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser
1 5
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<213> 小鼠
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Met Gly Ser Gly Ala Trp Phe Thr Tyr
1 5
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<211> 9
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Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<213> 小鼠
<400> 19
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Asn Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 21
Met Tyr His Gly Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 17
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<213> 小鼠
<400> 22
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> 人类
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 24
<211> 95
<212> PRT
<213> 人类
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Asn Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr His Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr His Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr His Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 261
<212> PRT
<213> 人类
<400> 30
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 31
<211> 261
<212> PRT
<213> 人类
<400> 31
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be Asn, Tyr or His
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be Ala, Gly or Thr.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa can be Arg, Thr or Ser.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
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<400> 32
Xaa Ile Asp Pro Tyr Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be Ser or Met.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be Tyr or Phe.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be Tyr or His.
<400> 33
Xaa Xaa Xaa Gly Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be Ser or Asn.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be Leu or Phe.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be Ser or Asn.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be Gln or Leu.
<400> 34
Lys Ser Ser Gln Xaa Leu Xaa Asn Xaa Gly Asn Xaa Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Glu or Lys.
<400> 35
Trp Ala Ser Thr Arg Xaa Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_faeture
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be Ser or Tyr.
<220>
<221> misc_faeture
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Phe or Tyr.
<220>
<221> misc_faeture
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be Phe or Leu.
<400> 36
Gln Asn Asp Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
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<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 39
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 39
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 41
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Val Thr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 43
Gln Ile Thr Gln Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Phe Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Gly Ser Gly Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 44
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 45
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr His Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 47
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 50
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 51
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 52
<211> 486
<212> PRT
<213> 人类
<400> 52
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe
260 265 270
Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
275 280 285
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
290 295 300
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
305 310 315 320
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
325 330 335
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
340 345 350
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
355 360 365
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
370 375 380
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
385 390 395 400
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
405 410 415
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
420 425 430
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val
435 440 445
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
450 455 460
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
465 470 475 480
Arg His Ser Thr Gly Ala
485
<210> 53
<211> 486
<212> PRT
<213> 人类
<400> 53
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe
260 265 270
Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
275 280 285
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
290 295 300
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
305 310 315 320
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
325 330 335
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
340 345 350
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
355 360 365
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
370 375 380
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
385 390 395 400
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
405 410 415
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
420 425 430
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val
435 440 445
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
450 455 460
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
465 470 475 480
Arg His Ser Thr Gly Ala
485
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa can be Thr or Ser.
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_faeture
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be Arg or Lys.
<220>
<221> misc_faeture
<222> (13)..(13)
<223> Xaa can be Met or IIe.
<400> 55
Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be Met or Leu.
<400> 56
Arg Val Thr Xaa Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类
<400> 57
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa can be Ile or Met.
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Xaa Asn Cys
20
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类
<400> 59
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 60
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be Ser or Thr.
<400> 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 61
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> 人类
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 63
<211> 30
<212> PRT
<213> 人类
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 人类
<400> 64
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 人类
<400> 65
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 66
Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 67
Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> 人类
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> 人类
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys
20
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 70
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 71
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 72
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys

Claims (50)

1.一种抗CLDN18.2抗体缀合物，其包含与放射性核素缀合的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性核素包含治疗性放射性核素或诊断性放射性核素。
2.所述抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述治疗性放射性核素选自由以下组成的群组：111In、111mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、199Au和211Pb。
3.所述抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述诊断性放射性核素选自由以下组成的群组：18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111ln、123l、124l、125l、131l、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154"1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194lr、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。
4.所述抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述诊断性放射性核素可通过正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)检测。
5.所述抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的群组：64Cu、67Cu、89Zr、124I、86Y、90Y、111In、123/131I、177Lu、11C、14C、41Ca、67Ga、68Ga、13N、15O、44Sc、18F、99mTc和90mTc。
6.根据权利要求2所述的抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述放射性核素是124I或123I或131I。
7.根据权利要求2所述的抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述放射性核素是64Cu、67Cu或89Zr。
8.根据权利要求6所述的抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述64Cu、67Cu或89Zr经由螯合剂与所述抗体或其抗原结合片段标记。
9.根据权利要求7所述的抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述螯合剂包含三个或更多个用于螯合的原子，其中每个原子选自由氮、硫、氧和磷组成的群组。
10.根据权利要求9所述的抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述螯合剂包含DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为TRITA)；1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为TETA)；和
1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸(本文缩写为HETA)、乙二胺四乙酸(本文缩写为EDTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。
11.根据权利要求10所述的抗体缀合物，其中所述放射性核素是64Cu或67Cu并且所述螯合剂包含TETA、NOTA、NODA或NODGA，或者其中所述放射性核素是89Zr并且所述螯合剂包含DFO。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含重链HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中：
所述HCDR1序列包含GYNMN(SEQ ID NO:1)或TYFIGVG(SEQ ID NO:13)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述HCDR2序列包含X1IDPYYX2X3TX4YNQKFX5G(SEQ ID NO:32)，或HIWWNDNKYYNTALKS(SEQ ID NO:15)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述HCDR3序列包含X6X7X8GNAFDY(SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY(SEQ ID NO:17)，或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR1序列包含KSSQX9LX10NX11GNX12KNYLT(SEQ ID NO:34)或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR2序列包含WASTRX13S(SEQ ID NO:35)或其至少80％序列同一性的同源序列；
所述LCDR3序列包含QNDYX14X15PX16T(SEQ ID NO:36)或其至少80％序列同一性的同源序列；
其中X1是N或Y或H，X2是G或V，X3是A或G或T，X4是R或T或S，X5是K或R，X6是S或M，X7是Y或F，X8是Y或H，X9是S或N，X10是L或F，X11是S或N，X12是Q或L，X13是E或K，X14是S或Y，X15是F或Y，并且X16是F或L。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:3序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:7序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:8序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:9序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:11序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:10序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:13序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:15序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:17序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:2序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:12序列的LCDR3；
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:19序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:21序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:14序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:16序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3；或者
重链可变区包含了包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:5序列的HCDR3；并且轻链可变区包含了包含SEQ ID NO:20序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:4序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6序列的LCDR3。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述重链可变区进一步包含重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4中的一者或多者，并且/或者所述轻链可变区进一步包含轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的一者或多者，其中：
所述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17FT(SEQ ID NO:54)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包含WVX18QAPGQGLEWX19G(SEQ ID NO:55)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR3序列包含RVTX20TIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:56)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包含WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21NC(SEQ ID NO:58)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:59)或其至少80％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包含GVPDRFX22GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:60)或其至少80％序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包含FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:61)或其至少80％序列同一性的同源序列，
其中X17是T或S，X18是R或K，X19是M或I，X20是M或L，X21是I或M，并且X22是S或T。
15.根据权利要求14所述的抗体缀合物，其中：
所述HFR1包含选自由SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63组成的群组的序列，所述HFR2包含选自由SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65组成的群组的序列，所述HFR3包含选自由SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67组成的群组的序列，所述HFR4包含SEQ ID NO:57序列，
所述LFR1包含选自由SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69组成的群组的序列，所述LFR2包含SEQ ID NO:59序列，
所述LFR3包含选自由SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71组成的群组的序列，并且
所述LFR4包含SEQ ID NO:61序列。
16.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述重链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47，并且它们具有至少80％序列同一性但仍保留与CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述轻链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48，并且它们具有至少80％序列同一性但仍保留与CLDN18.2的特异性结合亲和力的同源序列。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中：
包含SEQ ID NO:23序列的所述重链可变区和包含SEQ ID NO:24序列的所述轻链可变区；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:25序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:29序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26或28序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:37序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:38序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:39序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:40序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:41序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:43序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44序列；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:45序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46序列；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:47序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48序列。
19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留与人CLDN18.2的特异性结合亲和力。
20.根据权利要求19所述的抗体缀合物，其中所述取代或修饰中的至少一者在所述CDR序列的一个或多个中，和/或在所述VH或VL序列的非CDR区的一个或多个中。
21.根据权利要求12至20中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区、任选地人Ig的恒定区或任选地人IgG的恒定区。
22.根据权利要求21所述的抗体缀合物，其中所述恒定区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
23.根据权利要求22所述的抗体缀合物，其中所述人IgG1的恒定区包含SEQ ID NO:49，或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
24.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是人源化的。
25.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，其中所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是双特异抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双特异抗体(ds双特异抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双特异抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
26.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体缀合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中放射化学纯度为至少95％(例如97％、98％、99％)。
28.一种获取受试者中感兴趣部位图像的方法，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至25中任一权利要求所述的抗体缀合物和/或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的药物组合物；以及
b)使所述受试者的所述感兴趣部位经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者中来自放射性核素的可检测信号；
d)生成所述可检测信号的图像，从而获得所述受试者中所述感兴趣部位的图像。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述感兴趣部位是表达或怀疑表达claudin18.2的部位。
30.根据权利要求28至29中任一权利要求所述的方法，其中所述感兴趣部位患有或怀疑患有肿瘤。
31.一种以无创方式检测或可视化受试者中claudin 18.2表达的方法，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至25中任一权利要求所述的抗体缀合物和/或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定或可视化所述受试者的所述感兴趣部位中的claudin18.2表达。
32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包含向被识别为在所述感兴趣部位具有claudin18.2表达的受试者施用治疗有效量的抗claudin 18.2疗法。
33.根据权利要求31所述的方法，其进一步包含基于所识别的可检测信号确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的分布。
34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包含确定在所述受试者的所述感兴趣部位中claudin18.2表达的异质性。
35.根据权利要求31至34中任一权利要求所述的方法，其中所述感兴趣部位是肿瘤。
36.一种以无创方式监测受试者的治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展的方法，其中所述受试者已接受一个治疗期的治疗，所述方法包含以下步骤：
a)向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至25中任一权利要求所述的抗体缀合物和/或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的药物组合物；以及
b)使所述受试者经历正电子发射断层扫描(PET)或SPECT；
c)识别所述受试者的感兴趣部位中来自放射性核素的可检测信号；
d)基于所识别的可检测信号确定所述受试者的感兴趣部位中的治疗后claudin18.2表达；
e)将治疗后claudin18.2表达水平或分布分别与在所述治疗期之前从所述受试者获得的基线claudin18.2表达水平或分布进行比较以确定所述受试者中claudin18.2表达水平或分布的治疗后变化；以及
f)基于步骤(e)中确定的变化确定治疗功效、对治疗的反应性或抗性或复发或转移的发展。
37.根据权利要求36所述的方法，其中claudin 18.2表达水平或扩散的增加表明治疗功效降低、对治疗的反应性降低或存在抗性或存在复发。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
39.一种治疗有此需要的受试者中的CLDN18.2相关疾病或病症的方法，包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至25中任一权利要求所述的抗CLDN18.2抗体缀合物和/或根据权利要求26至27所述的药物组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，任选地是表达CLDN18.2的癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者被识别为患有表达CLDN18.2的癌症。
42.一种试剂盒，其包含根据前述权利要求1至25中任一权利要求所述的抗CLDN18.2抗体缀合物或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的组合物。
43.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至25中任一权利要求所述的第一抗CLDN18.2抗体缀合物和根据权利要求1至25中任一权利要求所述的第二抗CLDN18.2抗体缀合物，其中所述第一抗CLDN18.2抗体缀合物包含诊断性放射性核素，并且所述第二抗CLDN18.2抗体缀合物包含治疗性放射性核素。
44.根据权利要求42或43所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于根据权利要求28至41中任一权利要求所述的方法。
45.一种根据前述权利要求1至25中任一权利要求所述的抗CLDN18.2抗体缀合物或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的组合物在制备用于根据权利要求28至38中任一权利要求所述的方法的药物中的用途，其中所述抗CLDN18.2抗体缀合物包含诊断性放射性核素。
46.一种根据前述权利要求1至25中任一权利要求所述的抗CLDN18.2抗体缀合物或根据权利要求26至27中任一权利要求所述的组合物在制备用于根据权利要求39至41中任一权利要求所述的方法的药物中的用途，其中所述抗CLDN18.2抗体缀合物包含治疗性放射性核素。
47.一种制备根据权利要求6所述的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与用124I、123I或131I标记的碘化物在酶促或化学氧化剂的存在下反应。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述化学氧化剂是N-溴代琥珀酰亚胺、氯甘脲(Iodogen)或氯胺-T。
49.一种制备根据权利要求7至10中任一权利要求所述的抗CLDN18.2抗体缀合物的方法，包含使抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与螯合剂缀合以获得螯合剂-抗体缀合物，并使所述螯合剂-抗体缀合物与64Cu或89Zr反应。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述螯合剂包含DFO(去铁胺)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(NR-二亚乙基三胺五乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-乙酸)、TRITA(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸)；和HETA(1,5,9,13-四氮杂环十六烷-N,N',N",N'"-四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NETA({4-[2-(双-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N′,N″,三(2-巯基乙基)1,4,7-三氮杂环壬烷)、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧基乙基)次膦酸])、CP256,PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、多肟及其衍生物。
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