JP2024505963A - 抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌を治療、予防、及び診断するために有効な方法及びツールの開発に関する。具体的には、本発明は、改善された特性、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により低減された凝集能及び低減された疎水性を有する抗ｏｘＭＩＦ抗体にコンジュゲートした放射性同位体（抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲート）、並びに抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲートを使用する工程を含む、癌を治療、予防、及び診断する方法に関する。

Description

本発明は、癌を治療、予防、及び診断するために有効な方法及びツールの開発に関する。具体的には、本発明は、改善された特性、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により低減された凝集能及び低減された疎水性を有する抗ｏｘＭＩＦ抗体にコンジュゲートした放射性同位体（抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲート）、並びに抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲートを使用する工程を含む、癌を治療、予防、及び診断する方法に関する。
放射線免疫療法（ＲＩＴ）による癌の治療は、標的化した腫瘍細胞を選択的に破壊する目的で、モノクローナル抗体などの特異的癌細胞ベクターに結合された放射性同位体「弾」を患者に注射する工程を含む。放射性崩壊中、光子、電子又は更に重い粒子が放出され、それらの軌道に沿って細胞を損傷又は死滅させる。放射線免疫療法（ＲＩＴ）は、依然として癌治療のための比較的新しいモダリティであり、ベータ放出放射性ヌクレオチドを開始して使用される。ここ１０年の間に、放射性同位体のＲＩＴ器具は、市販のルテチウム－１７７（１７７Ｌｕ）、組織において０．７ｍｍの範囲及び６．７日の長い物理的半減期の中間エネルギーベータ放射体（ベータｍａｘ ０．１３ ＭｅＶ）の付加によって強化された。１７７Ｌｕは、特にソマトスタチン受容体結合放射性標識ペプチドの治療臨床試験において有望な結果を示した。その放射性ランタニド化学により、１７７Ｌｕは、主に肝胆道経路を介して排出される残存する放射性同位体である（Ｐｈａｅｔｏｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。近年の実験は、アルファ放射体が腫瘍細胞を破壊するのに有効であることも証明した。それらは、血液由来癌及び微小転移腫瘍（癌細胞は、典型的には体中に存在する）の治療に特に魅力的であると考えられる。アルファ－免疫療法の使用の別の可能性のある領域は、高用量の化学療法又は外科手術後に残りうる少数の癌細胞の処置である。しかしながら、放射性免疫療法の適用は、主に血液悪性腫瘍に関する。固形腫瘍ＲＩＴの治療効果は、不十分な腫瘍浸潤がＲＩＴの効果を制限する重要な因子である場合、放射性免疫コンジュゲート（ＲＩＣ）の不十分な浸透によって制限されることが多い（Ｈｕａｎｇ Ｃ－Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
抗体は、選択された腫瘍の放射性画像のための癌ベクターとして使用される。これは、腫瘍に特異的な抗体に結合された「診断プローブ」として、放射能同位体を患者に注射する工程を含む。注射後、患者に、非侵襲性の神経画像技術、例えばＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを行い、腫瘍の局在及び疾患進行をモニタリングした。８９Ｚｒは、その半減期、タンパク質コンジュゲーションのための生化学的特徴、及び利用可能性により、ＰＥＴに最適な核種であると考えられる（Ｗａｒｒａｍ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃａｒｔｅｒ Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
ＲＩＴ又は放射性画像は、抗体に連結した所望の特性を有する放射性核種を含む構築物である、いわゆる放射性免疫コンジュゲートを、癌患者に投与することによって実施される。通常、抗体への放射性核種の連結は、キレート剤によって行われる。体内では、抗体は、相当する抗原を発現する疾患組織に放射性核種を運ぶであろう。ＲＩＴ及び放射性画像は、腫瘍組織において特異的発現を示すが、正常組織においては発現がないか最小の発現である腫瘍特異的標的を必要とする。
サイトカインマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、早くも１９６６年には記載されている（Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｒ．，１９６６；Ｂｌｏｏｍ Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ，Ｂ．，１９６６）。しかしながら、ＭＩＦは、構成的に発現され、細胞質に貯蔵され、健常な対象の循環中に存在するため、他のサイトカイン及びケモカインとは著しく異なる。このタンパク質の遍在性に起因して、ＭＩＦは、治療的介入には不適切な標的と考えられうる。しかしながら、ＭＩＦは、還元型ＭＩＦ（ｒｅｄＭＩＦ）及び酸化型ＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）と称される２つの免疫学的に別個の立体構造的なアイソフォームで存在する（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＲｅｄＭＩＦは、健康及び疾患対象において大量に発現され、ＭＩＦの潜在型の酵素原形態を反映する、ＭＩＦの大量に発現されるアイソフォームであることがわかった（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１８）。対比して、ｏｘＭＩＦは、腫瘍組織、具体的にはｏｘＭＩＦの高い腫瘍特異性を示す結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌を有する患者由来の腫瘍組織（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）において検出されうる疾患関連のアイソフォームであるようである。ｏｘＭＩＦは、腫瘍特異的標的としての要求を満たすようであるが、いくつかの事実により、ｏｘＭＩＦは明らかな標的にはならなかった。ｏｘＭＩＦは、正確に特徴付けられず、ｏｘＭＩＦの疾患関連生成の分子メカニズムは、依然として不明確であり、ｏｘＭＩＦは細胞表面受容体とは考えられない。
ｏｘＭＩＦを標的とする抗体は、癌のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効性を示した（Ｈｕｓｓａｉｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ｏｘＭＩＦ特異的抗体（イマルマブ）は、許容可能な安全性プロフィール、申し分のない組織浸透及び第１相臨床試験における抗腫瘍活性の適応を示した。しかしながら、ｍＣＲＣを有する患者における、標準治療と比較したイマルマブ＋５－フルオロウラシル／ロイコボリン又はパニツムマブを調べる第ＩＩａ相組合せ試験は、データ安全性モニタリング委員会による全体のベネフィット－リスク評価に基づき、早期に中断された（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．２０２０）。
Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５）は、マウスの膵臓腫瘍モデルにおける放射線標識した抗ｏｘＭＩＦ抗体の蓄積を報告している。
国際公開第２０１９／２３４２４１ Ａ１号において、放射性同位体によって標識されうる抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が開示されている。
国際公開第２００９／０８６９２０ Ａ１号において、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｂａｘ６９（イマルマブ）が記載されている。
タンパク質凝集、具体的には、抗体凝集は、タンパク質発現、精製及び保存を含むバイオプロセスのいくつかの段階で頻繁に観察される。抗体凝集は、治療用タンパク質製造工程の全収率に影響し、治療用抗体の安定性及び免疫原性に寄与しうる。したがって、抗体のタンパク質凝集は、それらの発生性に重大な問題であり続け、抗体産生における重要な関心事のままである。抗体凝集は、単量体－単量体会合後、核生成及び凝集体増殖をもたらす、そのドメインの疎水性パッチ及び部分的なアンフォールディングによって誘発されうる。抗体及び抗体ベースのタンパク質の凝集傾向は、外部実験条件によって影響されうるが、それらは、それらの配列及び構造によって決定される潜在的な抗体特性に強く依存する。
抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質の凝集耐性又は凝集傾向は、通常、そこに含有される多くの凝集傾向ドメイン（複数可）によって、及び（存在する場合）周辺ドメインとのその相互作用の強度によって制限される。抗体の定常ドメインは、一般に、凝集せず、大きく変化しない。したがって、凝集能及び安定性に関して抗体の最も弱いドメインは、一般に、可変ドメインであると考えられる（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００３）。これに関して、凝集傾向のＶＨ又はＶＬドメインの、他の安定な組換え抗体産物への組み込みは、これらの一般に望ましくない特性を新しい組換え設計に付与することが多い。したがって、可変ドメインを凝集耐性であるように操作することは、その可変ドメインを含むタンパク質全体を凝集耐性にする可能性が最も高い。可変ドメインの凝集を低減させるための様々な戦略、例えば、凝集耐性タンパク質の合理的設計、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植、可変ドメインへのジスルフィド結合の導入、又は表面に暴露された疎水性パッチの除去が提案されている。しかしながら、これらの方法は、それらが結合特性、例えば親和性又は特異性を変更することが多いため不都合を示し、それらが特定の知識を必要とするために一般に適応可能ではなく、困難であることが多く、免疫原性エピトープを導入しうる。
タンパク質の更に固有の特性、例えば疎水性も、抗体可溶性に重要な役割を果たす。表面疎水性によるこれらの治療用タンパク質の低い可溶性は、製剤開発をより困難にすることが示されており、ｉｎ ｖｉｖｏでの不十分な生体内分布、望ましくない薬物動態挙動及び免疫原性をもたらしうる。したがって、候補モノクローナル抗体の全体的な表面疎水性を減少させることは、精製及び投与レジメンに関して利益及びコスト削減を提供しうる。
ＲＩＴ及び放射性画像化で更なる努力がなされたが、臨床試験において使用されるモノクローナル抗体の数の増加にもかかわらず、具体的には、腫瘍関連抗原に高度に選択的に結合する抗体を含む、癌治療及び診断において有効な治療効果を提供する改善された放射線免疫療法及び画像化の継続的な要求がある。
本発明の目的は、高度に選択的な腫瘍結合特性を有する放射性免疫コンジュゲートを提供することである。
この目的は、本発明の主題によって解決される。ｏｘＭＩＦは、腫瘍特異的標的としての要求を満たすようであるが、いくつかの事実により、ｏｘＭＩＦは放射性免疫療法の明らかな標的にはならない。ｏｘＭＩＦは、正確に特徴付けられてはおらず、ｏｘＭＩＦの疾患関連生成の分子メカニズムは依然として不明確なままであり、ｏｘＭＩＦは細胞表面受容体とは考えられない。
これにもかかわらず、驚くべきことに、放射性標識された抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片（抗ｏｘＭＩＦ放射性免疫コンジュゲート）は、放射線免疫療法で使用される場合、そのｏｘＭＩＦ特異性により高度に選択的であり、放射性同位体の存在により高度に細胞傷害性であることが示された。
放射性免疫コンジュゲートは、放射線画像化で使用した場合、そのｏｘＭＩＦ特異性及び適切な放射性核種により、腫瘍組織において容易に検出することもできる。
放射性免疫コンジュゲートは、そのｏｘＭＩＦ特異性により高度に選択性でもあり、セラノスティックアプローチで使用される場合、放射性核種による診断及び治療を可能にする。放射性核種及び抗ｏｘＭＩＦ抗体の組合せは、驚くべきことに、放射性標識した抗ｏｘＭＩＦ抗体が、関連する生体内分布、腫瘍取込み及び効果を有することを示しており、マウスモデルにおいてすでに証明されている。したがって、本発明の放射性免疫コンジュゲートは、癌治療に非常に有効であり、腫瘍検出及び診断にも非常に有用である。
本発明は、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を含む、放射性免疫コンジュゲート（ＲＩＣ）を開示する。
本発明は、特に、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を含む放射性免疫コンジュゲート（ＲＩＣ）であって、以下：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号３２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号３２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号２９及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙの少なくとも１つ、及び１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号３２及び配列番号２９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、放射性免疫コンジュゲートを提供する。
抗ｏｘＭＩＦ抗体の関連する生殖系列ＶＬ配列は、フレームワーク１の位置Ｄ１、Ｍ４、Ｓ１０及びＬ１１に高い可変性を有しうる。
特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、したがって、位置Ｄ１、Ｍ４、Ｓ１０、及びＬ１１の更なる置換に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号３２を含む軽鎖可変ドメインを更に含みうる。
関連する生殖系列ＶＨ配列は、以下の位置：Ｅ１、Ｓ７４及びＴ７７に高い可変性を有しうる。
更なる特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、したがって、位置Ｅ１、Ｓ７４、及びＴ７７の更なる置換に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号２９を含む重鎖可変ドメインを更に含みうる。
本発明の代替的な実施形態によれば、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を含む放射性免疫コンジュゲート（ＲＩＣ）であって、以下：
（ａ）配列番号３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、３６位にチロシンを含み、アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つをさらに含む抗ｏｘＭＩＦ抗体軽鎖可変ドメイン、並びに
（ｂ）配列番号２９及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙを更に含む重鎖可変ドメイン
を含む、放射性免疫コンジュゲートが本明細書中で提供される。
更に他の実施形態によれば、放射性免疫コンジュゲートは、アミノ酸置換Ｗ９３Ｆを有する軽鎖可変ドメイン及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む重鎖可変ドメインを含有する。
本発明の特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、直接標識されるか、又は非環式、単環式、大環式二機能性キレート剤、特に、キレート基及び機能性／反応性リンカーを含むｐ－ＳＣＮ－ｂｎ－ＤＯＴＡ、ｐ－ＮＨ２－Ｂｎ－ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ－ＮＨＳ及びｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミンから選択されるキレート剤を使用して標識される。
特定の実施形態によれば、放射性免疫コンジュゲートは、キレート基、具体的には、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片をキレート剤にカップリングすることから生じるキレート基、特に、ＤＯＴＡ、６配位キレート剤、例えばデフェロキサミンＢ（ＣＡＳ Ｎｏ．７０－５１－９）、及び８配位キレート剤、例えばＤＦＯ誘導ＤＦＯ＊又はその類似体を含有する酸素、例えばｏｘｏＤＦＯ＊から選択されるキレート基を含む。
具体的には、ＤＦＯは、以下の構造：
でありうる。
具体的には、ＴＦＯ＊は、以下の構造：
でありうる。
本発明によれば、治療適用に有用な任意のアルファ又はベータ放出放射性同位体は、抗ｏｘＭＩＦ抗体に連結されてもよく、具体的には、それは、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｔｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、２２７Ｔｈ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２２７Ｔｈであってもよく、具体的には、放射性同位体は、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃである。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるように、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ｌ３２８、又はＰ３２９のいずれか１つに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号３７を有する野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含む、放射性免疫コンジュゲートが提供され、前記放射性免疫コンジュゲートは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合の減少を示す。
更に特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートは、位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３５のいずれか１つに１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含む、配列番号３７の野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、前記放射性免疫コンジュゲートは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、ヒトＦｃＲｎに対する親和性の低減を示す。
具体的には、放射性免疫コンジュゲートは、配列番号３８を含み、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、ヒトＦｃＲｎに対する親和性の低減を示す。
特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートは、配列番号３１、３３、３４、３５、及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
更に特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートは、配列番号３７、３８、３９、及び４０のいずれか１つと組み合わせて、配列番号２９及び３４；配列番号３０及び３３、配列番号３０及び３４、配列番号３１及び３４、配列番号３１及び３６、又は配列番号３１及び３３を含む。
より具体的には、本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートは、限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＧ融合タンパク質、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、ディアボディ、ディアボディ融合タンパク質、Ｆａｂ、Ｆａｂ融合タンパク質、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｃａｂ、Ｆｃａｂ融合タンパク質、２つ以上の単鎖抗体の融合タンパク質、ミニボディ、及び小免疫タンパク質（ＳＩＰ）フォーマットでありうる。
一実施形態によれば、本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートは、医薬の調製における使用のためである。
特定の実施形態において、場合により、医薬担体又はアジュバントと共に本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
具体的には、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
さらなる実施形態によれば、医薬組成物は、癌を患う対象の治療、具体的には、腫瘍、具体的には、血液癌又は固形腫瘍の治療における、より具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、及び肺癌の治療への使用のためである。
本発明の一態様は、本明細書に列挙した疾患又は症状のいずれか１つの治療のための方法における、本発明の有効量の医薬組成物の使用に関する。
本発明の実施形態は、他の治療と組み合わせたか又は他の治療に加えた、本発明の放射性免疫コンジュゲートの使用に関する。
本発明の一実施形態において、他の治療は、化学療法、モノクローナル抗体療法、外科手術、放射線療法、及び／又は光線力学療法から選択される。
一実施形態によれば、本明細書に記載の放射線免疫コンジュゲートは、対象の癌細胞におけるｏｘＭＩＦレベルの検出又は決定のために使用され、具体的には、検出は、対象の試料中、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。潜在患者の群は、次いで、ｏｘＭＩＦレベルによる階級化によってサブグループ（層、ブロック）に分けられ、それぞれの層は患者集団の特定のセクションを表す。
具体的には、放射性免疫コンジュゲートは、対象における癌診断のために使用される。
一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで癌を診断するための方法であって、放射性免疫コンジュゲートが、対象の試料中で腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するため、又は対象において腫瘍細胞若しくは腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで検出するために使用される、方法が本明細書で提供される。前記試料は、例えば生検からの、例えば血液試料、組織試料でありうる。
本明細書では、癌を診断するための方法であって、放射性免疫コンジュゲートが、対象において、又は対象の試料中でｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を検出するために使用される、方法が更に提供される。
更なる実施形態は、本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートを含む診断キットに関する。
代替の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートの産生のためのキットであって、２つ以上のバイアルを含み、１つのバイアルが、抗ｏｘＭＩＦ抗体に結合したキレート剤を含むコンジュゲートを含有し、２つ目のバイアルが、具体的には６７Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃから選択される放射性同位体を含有する。具体的には、１つ又は複数のバイアルの内容物は、凍結乾燥されるか又は溶液中にある、キットが提供される。より具体的には、キットは、本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートを調製する説明書を含有するマニュアルを更に含む。
本明細書中で、本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲート又は前記放射性免疫コンジュゲートを含む医薬組成物を使用して癌を治療するための方法が更に提供される。
本明細書に記載の放射性免疫コンジュゲートの組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸が更に提供される。
更なる実施形態において、発現ベクターは、放射性免疫コンジュゲートの組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子（複数可）を含む。
更なる実施形態において、本明細書に記載のｏｘＭＩＦ抗体の核酸を含有する宿主細胞又は本明細書に記載の核酸分子（複数可）を含む発現ベクターが提供される。
更なる実施形態において、放射性免疫コンジュゲートを産生するための方法であって、宿主細胞においてｏｘＭＩＦ抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を発現させる工程、及び放射性同位体によって前記抗体又は抗原結合断片を更に標識する工程を含む方法が提供される。
ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の純度及び完全性解析を示す図である；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ０００８非還元；３：Ｃ０００８還元；４：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）非還元；５：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８非還元；７：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８還元。 ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の純度及び完全性解析を示す図である；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ０００８非還元；３：Ｃ０００８還元；４：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）非還元；５：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８非還元；７：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８還元。 ＩＴＬＣによって決定されたＣ０００８に移植したＤＯＴＡ分子の数の決定を示す図である：ＤＯＴＡコンジュゲート抗体に対して２倍（レーン６）、４倍（レーン７）、６倍（レーン８）又は８倍（レーン９）過剰な１１１／１１５Ｉｎで、トレーサー量の放射能インジウム（１１１Ｉｎ）と安定なインジウム（１１５Ｉｎ）の混合物とインキュベートしたＤＯＴＡ－Ｃ０００８のＩＴＬＣ分離。 ＩＴＬＣ及びオートラジオグラフィーによる放射線標識したＣ０００８の解析を示す図である。Ａ：放射線標識したＣ０００８のＩＴＬＣ（レーン３：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８との１１７Ｌｕ標識反応；レーン４：Ｃ０００８との１１７Ｌｕ標識反応）；Ｂ：ＩＴＬＣフィルムのオートラジオグラム、レーン３（ＤＴＰＡ付加後の１１７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８；ピーク１は、遊離１１７Ｌｕ－ＤＴＰＡを反映し、ピーク２は、１１７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８を反映する）。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性（オートラジオグラフィー）を示す図である：７日間、マウス血漿中でインキュベートした１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８のオートラジオグラム；１：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８誘導体及び遊離１７７Ｌｕ；２：１１７Ｌｕ－Ｃ０００８。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す図である：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１及びレーン１０：分子量標準；レーン２：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８；レーン３：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（Ｔ０）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中Ｔ０時間）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中１日）；レーン７：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中２日）；レーン８：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中３日）；レーン９：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中７日）。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す図である：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１及びレーン１０：分子量標準；レーン２：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８；レーン３：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（Ｔ０）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中Ｔ０時間）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中１日）；レーン７：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中２日）；レーン８：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中３日）；レーン９：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中７日）。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃにおけるＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の生体内分布を示す図である：皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、Ａ：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ）又はＢ：治療なしの注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた（スケールバーはＡ及びＢに適用）；Ｃ：デジタル画像解析によって定量されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃにおけるＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の生体内分布を示す図である：皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、Ａ：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ）又はＢ：治療なしの注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた（スケールバーはＡ及びＢに適用）；Ｃ：デジタル画像解析によって定量されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃにおけるＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の生体内分布を示す図である：皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、Ａ：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ）又はＢ：治療なしの注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた（スケールバーはＡ及びＢに適用）；Ｃ：デジタル画像解析によって定量されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持。 新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として５×ＰＢＳＴを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。 新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として５×ＰＢＳＴを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。 新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として５×ＰＢＳＴを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。 固定化したＭＩＦへの新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（ＫＤ決定）を示す図である。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。 ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計した抗体の差次的結合を示す図である。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。 対照抗体Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の改善された産生を示す図である。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸透を示す図である。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間後で撮られた；Ｂ：デジタル画像解析によって定量したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ 標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持。Ｃ：デジタル画像解析によって定量したＣ０００８と比較したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持の比較。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸透を示す図である。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間後で撮られた；Ｂ：デジタル画像解析によって定量したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ 標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持。Ｃ：デジタル画像解析によって定量したＣ０００８と比較したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持の比較。 皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸透を示す図である。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間後で撮られた；Ｂ：デジタル画像解析によって定量したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ 標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持。Ｃ：デジタル画像解析によって定量したＣ０００８と比較したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持の比較。 ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の純度及び完全性解析を示す図である；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ００８３非還元；３：Ｃ００８３還元；５：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３非還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３還元。 ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の純度及び完全性解析を示す図である；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ００８３非還元；３：Ｃ００８３還元；５：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３非還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３還元。 ＩＴＬＣによって決定されたＣ００８３に移植したＤＯＴＡ分子の数の決定を示す図である：ＤＯＴＡコンジュゲート抗体の量と比例して２倍（レーン１）、４倍（レーン２）、６倍（レーン３）又は８倍（レーン４）過剰な１７７／１７５Ｌｕで、０．０４Ｎ ＨＣｌ中トレーサー量の放射能１７７Ｌｕと安定なルテチウム（１７５Ｌｕ）の混合物とインキュベートしたＤＯＴＡ－Ｃ００８３のＩＴＬＣ分離。 ＩＴＬＣ及びオートラジオグラフィーによる放射線標識した１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の解析を示す図である。ＩＴＬＣフィルムのオートラジオグラム（ＤＴＰＡ付加後の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３；ピーク１／２は、遊離１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ及び１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３誘導体を反映する、ピーク３は１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３を反映する）。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性（オートラジオグラフィー）を示す図である：７日間、マウス血漿中でインキュベートした１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３のオートラジオグラム；１：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３誘導体及び遊離１７７Ｌｕ；２：１１７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す図である：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１：分子量標準；レーン２：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（Ｔ０）；レーン３：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中Ｔ０時間）；レーン４：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中１日）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中３日）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中７日）。 １７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す図である：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１：分子量標準；レーン２：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（Ｔ０）；レーン３：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中Ｔ０時間）；レーン４：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中１日）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中３日）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中７日）。 アミノ酸配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列 新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の溶出プロフィールの比較（Ｂ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８並びにそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較。 固定化したｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（ＫＤ決定）を示す図である。抗ｏｘＭＩＦ抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８を参照抗体として使用した。 ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体の差次的結合を示す図である。Ｃ０００８を参照抗体として、アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。 ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ＭＩＦ－／－細胞への新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す図である。新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１５及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）並びに対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧ；生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。 ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ＭＩＦ－／－細胞への新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す図である。新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１５及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）並びに対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧ；生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。 レポーターアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣエフェクター機能を示す図である。ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した、ＦｃγＲＩＩＩＡを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ。平均及びＳＥＭを示す（ｎ＝２）。 皮下ＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持を示す図である。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体Ｃ０１１５（上のパネル）及びＣ０００８（下のパネル）の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；（Ｂ）デジタル画像解析によって定量されたＣ０１１５及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。 皮下ＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持を示す図である。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体Ｃ０１１５（上のパネル）及びＣ０００８（下のパネル）の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；（Ｂ）デジタル画像解析によって定量されたＣ０１１５及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。 皮下ＣＴ２６又はＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＰＥＴ／ＣＴ画像化によって、ＤＦＯ＊にコンジュゲートし、８９Ｚｒによって放射線標識した、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の腫瘍浸透及び保持を示す図である。マウスのＰＥＴ及びＣＴ画像は、マウス当たり約１０ＭＢｑで投与した８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊標識した抗体の注射後４日、７日及び１０日で撮られた；マウスの代表的なデジタル縦断面図を示し、白い矢印は腫瘍をマークする。
他に指定又は定義しない限り、本明細書中で使用する全ての用語は、当技術分野において通常の意味を有し、当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（４ｔｈ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）；Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘｉ”，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，（２０１７）、及びＭｕｒｐｈｙ ＆ Ｗｅａｖｅｒ，“Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（９ｔｈ Ｅｄ．，又はより最新版），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｉｎｃ，２０１７を参照する。
請求項の主題は、具体的には、人工産物又はそのような人工産物を用いるか若しくは産生する方法に関し、それは天然（野生型）産物の変異体でありうる。天然の構造に対してある程度の配列同一性がありうるが、本発明の材料、方法及び使用、例えば具体的には、単離核酸配列、アミノ酸配列、融合構築物、発現構築物、形質転換された宿主細胞及び改変タンパク質を指すものは、「人工」又は合成であり、したがって「自然の法則」の結果として考えられないことが十分に理解される。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「を有する（ｈａｖｅ）」及び「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、同義的に使用することができ、広い定義として理解されるべきであり、更なる成員又は部品又は要素を可能にする。「からなる」は、構成している定義特性の更なる要素を伴わない最も閉じた定義と解釈される。したがって、「を含んでいる」はより広義であり、「からなる」の定義を含有する。
「約」という用語は、本明細書中で使用する場合、同じ値又は所与の値の＋／－５％異なる値を指す。
本明細書中及び請求項中で使用される場合、単数形、例えば「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数を包含する。
本明細書中で使用する場合、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の自然発生のアミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる：
「中性」アミノ酸を、各々の３文字コード及び１文字コード並びに極性と併せて、以下に示す：アラニン（Ａｌａ、Ａ；無極性、中性）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ；極性、中性）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ；無極性、中性）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ；極性、中性）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ；無極性、中性）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ；無極性、中性）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ；無極性、中性）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ；無極性、中性）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ；無極性、中性）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ；無極性、中性）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ；極性、中性）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ；極性、中性）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ；無極性、中性）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ；極性、中性）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ；無極性、中性）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ；極性、正（１０％）中性（９０％））。
「正に」帯電したアミノ酸は：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ；極性、正）、及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ；極性、正）である。
「負に」帯電したアミノ酸は：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ；極性、負）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ；極性、負）である。
「免疫コンジュゲート」という用語は、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片と第２の部分のコンジュゲートを指し、「放射性免疫コンジュゲート」という用語は、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片と放射性同位体（放射性核種）のコンジュゲートを指す。
放射性同位体は、限定はされないが、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｔｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、２２７Ｔｈ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２２７Ｔｈを含む、ベータ線、アルファ線又は陽電子放出放射性核種であってもよく、具体的には、放射性同位体は、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃである。
有用なアルファ波放出放射性核種は、限定はされないが、１４９Ｔｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ及び２２５Ａｃでありうる。
特に有用なベータ波トランスミッターは１７７Ｌｕである。
陽電子放出又はベータプラス崩壊（β＋崩壊）は、ベータ崩壊と呼ばれる放射能崩壊のサブタイプであり、放射性核種の原子核内の陽子が中性子へと変換され、陽性子及び電子ニュートリノ（Ｖｅ）を放出する。陽性子を放出する放射性核種は、陽電子放出層撮影（ＰＥＴ）で使用される。
特に有用な陽電子放出体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、又は８９Ｚｒであり、具体的には、それは８９Ｚｒである、
タンパク質又はペプチドへの直接又は間接的なコンジュゲーションを可能にする、十分な複合体形成能を有する任意の型のリンカー及び官能基が使用されうる。放射性同位体を抗体に接着するためのそのようなリンカーの例は、文献（例えば、Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ Ｍ．Ｗ．，２００８；Ｌｉｕ Ｓ．，２００８、Ｚｅｇｌｉｓ＆Ｌｅｗｉｓ ２０１１）に記載されている。本発明の放射性核種は、好ましくは、直接か又は二機能性キレート剤を使用することによるかのいずれかで抗ｏｘＭＩＦ抗体にコンジュゲートされる。これらは、環状型、直鎖型又は分岐型キレート剤でありうる。骨格窒素に接着した酸性（例えば、カルボキシアルキル）基を有する直鎖型、環状型又は分岐型ポリアザアルカン骨格を含む、ポリアミノポリ酸型キレート剤を特に参照しうる。
一部の有用な非限定的な例は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、及び１，４，７，１０－テトラ－アザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラ酢酸、ｃａ－ＤＴＰＡ、ｉｂｃａ－ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ－ＤＴＰＡ、ｌｙｓ－ＤＴＰＡ、ビニルＤＴＰＡ、ｇｌｕ－ＤＴＰＡ、ｐ－ＳＣＮ－ｂｎ－ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステル、デフェロキサミンＢ若しくはその誘導体のような環状キレート剤若しくはその二機能性キレート剤；又はｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＴＰＡ、ＨＯＰＯ及びＣＨＸ－Ａ’’－ＤＴＰＡ、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＭＰ、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＭＰ、Ｎ２Ｓ２、Ｎ３Ｓ、ＨＥＤＰのような直鎖型キレート剤若しくはその二機能性キレート剤である。更に好適なキレート剤の例は、ＤＯＴＡ誘導体、例えばｐ－イソチオシアネートベンジル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸（ｐ－ＳＣＮ－Ｂｚ－ＤＯＴＡ）及びＤＴＰＡ誘導体、例えばｐ－イソチオシアネートベンジル－ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｐ－ＳＣＮ－Ｂｚ－ＤＴＰＡ）を含み、１つ目は環状型キレート剤であり、後者は直鎖型キレート剤である。
デフェロキサミン（デスフェリオキサミン、ＤＦＯ）及びその誘導体の更なる例は、限定はされないが、ｐ－ＮＣＳ－Ｂｚ－ＤＦＯ、ＤＦＯＳｑ、ＤＦＯ＊、ｏｘｏＤＦＯ＊、ＤＦＯ＊Ｓｑ、ＤＦＯ＊－ＮＣＳ、ＤＦＯ＊ｐＰｈｅ－ＮＣＳを含む。
精製は、非コンジュゲートキレート剤の除去に続けてもよく、放射性核種とのキレート剤抗体コンジュゲートの反応後、精製を実施し、非コンジュゲート放射性核種を除去することができる。或いは、キレート剤及び放射性核種がまず組み合わされ、続いて抗体にコンジュゲートされうる。
放射線標識手順は、放射線標識が行われる前にキレート剤が抗体にコンジュゲートされる場合、より便利でありうる。抗体に接着したキレート剤を使用する放射線標識したコンジュゲートを調製する原理は、例えばＬｉｕ Ｓ．，２００８に広く記載されている。
放射性免疫コンジュゲートの抗体又は抗原結合断片は、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を含む。そのような抗体は、Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１２によって記載されている。抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ＭＩＦの生体機能に関連する、チオールタンパク質酸化還元酵素の高度に保存された触媒モチーフ（５７Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ６０、配列番号４４）を含むＭＩＦ内のβシート構造に特異的である（Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ｏｘＭＩＦに特異的なＣＤＲは、本明細書に記載される。
イマルマブ（Ｃ０００８）ＣＤＲは、配列番号７～１２を含む。
或いは、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する更なる抗体のＣＤＲは、具体的には、配列番号１～６（Ｂａｘ８）、又は配列番号１３～１８（Ｂａｘ７４）、又は配列番号１９～２４（Ｂａｘ９４）、又は配列番号２２、２３、２４、２６、２７及び２１（ＢａｘＡ１０）、又は配列番号７～１２、配列番号１～６、配列番号１３～１８、又は配列番号１９～２４、又は配列番号２２、２３、２４、２６、２７及び２１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％の配列同一性を有する任意の配列を含む。
低減された凝集傾向及び／又は疎水性は、任意の凝集及び／又は高度に疎水性の界面が放射性免疫コンジュゲートの非特異的接着、したがって放射性核種の非腫瘍組織への接着を引き起こすため、特に、放射性免疫コンジュゲートの場合に重要である。
特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、可変重鎖及び軽鎖ドメインにおける標的アミノ酸置換により、前記アミノ酸置換を欠損する非改変抗体と比較して低減された凝集傾向及び低減された疎水性を示す。
凝集能の低減及び低減された疎水性は、本明細書に記載の抗体の可変ドメイン内の選択された位置のアミノ酸置換による。
抗体凝集のレベルは、マススペクトロメトリー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光遮蔽（ＬＯ）、動的画像粒子解析（ＤＩＰ Ａ）技術、例えばマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）、及びコールターカウンター（ＣＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を包含する様々な公知の技術を使用して測定されうる。
低減された疎水性及び低減された凝集能は、本明細書中で使用する場合、配列番号２９（ＶＨ）、及び配列番号３２（ＶＬ）及び配列番号３７（ＣＨ１～ＣＨ３）、配列番号４１（ＣＬ）を含むイマルマブの表面疎水性及び凝集能と比較した、放射性免疫コンジュゲートの本発明の抗体の表面疎水性の低減及び低減された凝集能を指す。Ｃ０００８の配列は、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＩＮＮ Ｌｉｓｔ １１１（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，２０１４）で公表されたイマルマブの配列を含有するが、Ｃ末端リジンを欠く。測定は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又はアフィニティーキャプチャー自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ，Ｅｓｔｅｐ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）を包含するが、これらに限定されない様々な公知の技術を使用して実施されうる。
一実施形態において、低減された凝集能、及び低減された疎水性を有する放射性免疫コンジュゲートのｏｘＭＩＦ抗体は、具体的には、
－ 配列番号３２を参照し、Ｋａｂａｔ付番に従うアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つを有する軽鎖可変ドメイン、又は
－ ３６位に天然チロシン及び更にアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、及び／又はＷ９３Ｆの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む配列番号３２に対して少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、又は
－ 配列番号２９を含む重鎖可変ドメインとの組合せ、又は
－ 配列番号２９を参照し、Ｋａｂａｔ付番に従うアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメインとの組合せ、又は
－ 少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性の配列番号２９を含み、アミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙの少なくとも１つを更に含む重鎖可変ドメイン
を含む。
代替の実施形態において、配列番号３２を含む軽鎖可変ドメインは、３６位の天然チロシンが保存され、更に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸が、Ｍ３０位、Ｆ４９位、Ａ５１位、Ｐ８０位、Ｗ９３位で置換されるという条件で、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのアミノ酸置換を有する。
更なる実施形態において、放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体は、低減された凝集能、及び低減された疎水性を有し、具体的には、
－ 配列番号２９及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙ又はアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及びＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
－ １つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号２９を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙを、場合によりＬ５Ｑと組み合わせて更に含む重鎖可変ドメイン
を含む。
軽鎖の３６位の天然チロシンは未改変のままであり、抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合特性を保存する。前記アミノ酸位置における任意の改変は、不要な損なわれた結合特性を生じうる。
本明細書中に記載の放射性免疫コンジュゲートは、具体的には、以下のアミノ酸置換の組合せの１つを有する軽鎖可変ドメインを含む：配列番号３２のアミノ酸付番を参照して、Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、及びＷ９３Ｆ；Ｆ４９Ｙ，Ａ５１Ｇ、及びＷ９３Ｆ；Ｆ４９Ｙ及びＡ５１Ｇ。
本発明の放射性免疫コンジュゲートは、以下の可変軽鎖及び重鎖ドメインの組合せを含みうる：
配列番号３３及び配列番号３０
配列番号３４及び配列番号２９
配列番号３４及び配列番号３０
配列番号３４及び配列番号３１
配列番号３５及び配列番号２９
配列番号３５及び配列番号３０，３１
配列番号３６及び配列番号２９
配列番号３６及び配列番号３０，３１
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、以下の配列の組合せのいずれか１つを含む：
配列番号３７、３０、３３、及び４１
配列番号３７、３１、３３、及び４１
配列番号３７、２９、３４、及び４１
配列番号３７、３０、３４、及び４１
配列番号３７、３１、３４、及び４１
配列番号３７、２９、３５、及び４１
配列番号３７、３０、３５、及び４１
配列番号３７、３１、３５、及び４１
配列番号３７、２９、３６、及び４１
配列番号３７、３０、３６、及び４１又は
配列番号３７、３１、３６、及び４１
特定の実施形態において、本放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体は、重鎖定常領域、具体的にはＣＨ２領域の選択された位置のアミノ酸置換により、Ｆｃγ受容体担持細胞への結合の減少を示す（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩヘの結合の減少）。
本明細書中で使用する場合、「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体又はリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学イベントを意味する。エフェクター機能は、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣを包含する。
本明細書中で使用する場合、「エフェクター細胞」は、１つ又は複数のＦｃ受容体を発現し、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、限定はされないが、単球、マイクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞が挙げられ、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを包含する任意の生物由来でありうる。本発明によれば、本明細書中に記載される抗ｏｘＭＩＦ抗体は、重鎖定常領域、具体的にはＦｃ領域において選択された位置でのアミノ酸置換により、サイレンシングされたエフェクター機能を有する。低減された補体及びＦｃγＲ媒介活性による、これらの抗体の減少された又はサイレンシングされたエフェクター機能は、低減又は消失された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を包含しうる。
「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」（又は断片結晶性領域）という用語は、本明細書中で使用される場合、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１ドメイン）を除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、及び一部の場合においては、ヒンジの一部を指す。Ｆｃ領域は、抗体のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖：Ａ鎖及びＢ鎖の第２及び第３の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質断片から構成される。第２及び第３の定常ドメインは、それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとして公知である。ＣＨ２ドメインは、Ａ鎖のＣＨ２ドメイン配列及びＢ鎖のＣＨ２ドメイン配列を含む。ＣＨ３ドメインは、Ａ鎖のＣＨ３ドメイン配列及びＢ鎖のＣＨ３ドメイン配列を含む。本明細書中で使用される場合、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域又はその一部を含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＥＵ付番指標に従い、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで伸びる。ＣＨ２ドメイン配列はユニークであり、別のドメイン配列と厳密には対合しない。むしろ、２つのＮ結合型分岐状炭水化物鎖が無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン配列の間に挟まれる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域配列中においてＣ末端残基からＣＨ２ドメイン配列の鎖を含む（すなわち、ＥＵ付番指標に従い、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７まで）。
「機能性Ｆｃ領域」は、天然のＦｃ領域の「エフェクター機能」を持つ。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）等を含む。そのようなエフェクター機能は、通常、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合されるＦｃ領域を必要とし、当技術分野で公知の、及び本明細書中で開示される様々なアッセイを使用して評価されうる。
「天然のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に対して同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域及び天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域並びにその自然発生の変異体を含む。
「変異体Ｆｃ領域」は、「１つ又は複数のアミノ酸置換」によって天然のＦｃ領域配列のものとは異なるアミノ酸配列を含む。変異体Ｆｃ領域配列は、天然のＦｃ領域配列又は親ポリエペプチドのＦｃ領域配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然のＦｃ領域配列又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列において、約１から約２０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約１７アミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態において、本明細書中の変異体Ｆｃ領域配列は、天然のＦｃ領域配列及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％の同一性を持つ。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、ＥＵ付番指標に従って、ＩｇＧ１と関連してＥ２３３位、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｇ２３６位、Ｇ２３７位、Ｐ２３８位、Ｄ２６５位、Ｓ２６７位、Ｈ２６８位、Ｎ２９７位、Ｓ２９８位、Ｔ２９９位、Ｅ３１８位、Ｌ３２８位、Ｐ３２９位、Ａ３３０位、Ｐ３３１位のいずれか１つにおいてである。これらのサイレンシング突然変異は、しかしながら、ＥＵ付番指標に従って相当する位置に野生型ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃへも導入されうる。
減少された又はサイレンシングされたＦｃを生じるＦｃ領域の改変は、当技術分野において公知であり、Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｋ．，２０１９ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０２０に記載される。
代替の実施形態において、アミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインにおけるＬ２３４Ｆ、Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ｙ２９６Ｆ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ及びＣＨ３ドメインにおけるＲ３５５Ｑ、Ｋ４０９Ｒ、Ｑ４１９Ｅ、Ｐ４４５Ｌのいずれか１つ又は全ての位置にある。
具体的には、本明細書中に記載されるＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、アミノ酸置換又は欠失の以下の組合せの１つ又は複数を含み、アグリコシル化抗体をもたらす：
ｉ）Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＥ３１８、具体的にはＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＥ３１８Ａ；
ｉｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｉｉｉ）Ｓ２２８、Ｌ２３５、具体的にはＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ；
ｉｖ）Ｇ２３６、Ｌ３２８、具体的にはＧ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ；
ｖ）Ｓ２９８、Ｔ２９９、具体的にはＳ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ；
ｖｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ；
ｖｉｉ）Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｓ２６７、具体的にはＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｓ２６７Ｋ；
ｉｘ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３２９、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；
ｘ）Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ；
ｘｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、具体的にはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ；
ｘｉｉ）Ｄ２６５、具体的にはＤ２６５Ａ；
ｘｉｉｉ）Ｇ２３７、具体的にはＧ２３７Ａ；
ｘｉｖ）Ｅ３１８、具体的にはＥ３１８Ａ；
ｘｖ）Ｅ２３３、具体的にはＥ２３３Ｐ、
ｘｖｉ）Ｇ２３６、Ｌ３２８、具体的にはＧ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ；
ｘｖｉｉ）Ｌ２３５、具体的にはＬ２３５Ｅ；
ｘｖｉｉｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ｑ、Ｌ２３５Ｆ、Ｐ３３１Ｓ；
ｘｉｘ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ
ｘｘ）Ｎ２９７、具体的にはＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ又はＮ２９７Ｇ。
グリコシル化、Ｏ－及びＮ－グリコシル化は、Ａｂの翻訳後修飾であり、環境因子、例えばストレス又は疾患、サイトカイン活性、及び自然免疫シグナル伝達受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体を含む、Ｂ細胞刺激の範囲によって制御されうる。親抗体のグリコシル化パターンは、当技術分野で周知の方法によって改変されうる。具体的には、Ｏ結合型グリコシル化部位は、ＣＨ２及びヒンジ領域に位置する。
「アグリコシル化」という用語は、Ｆｃ領域がグリコシル化されていないことを示す。ＩｇＧアイソタイプの全てのヒト定常領域は、２９７位のアスパラギン残基においてグリコシル化されることが公知であり、Ｎグリコシル化モチーフ、アスパラギン２９７－Ｘ２９８－セリン２９９又はスレオニン２９９の一部を形成し、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸の残基である。グリカンは、七糖のコア及び可変伸長、例えば、フコース、ガラクトース、及び／又はシアル酸を有する。本発明の抗体は、したがって、酵素的な手段によってグリコシル化又は脱グリコシル化されない別のアミノ酸を有するそのような定常領域におけるアスパラギン２９７の置換によってアグリコシル化されうる。任意の他のアミノ酸残基を使用することができるが、アラニンが最も好ましい。或いは、アスパラギン２９７におけるグリコシル化は、モチーフの他の残基の１つを変更することによって、例えば、残基２９８をプロリンにより、又は残基２９９をセリン又はスレオニン以外の任意のアミノ酸により置換することによって防ぐことができる。この部位特異的変異誘発を実施するための技術は、当業者に周知であり、例えば、市販の部位特異的変異誘発キットを使用して実施されうる。
「サイレンシングされたＦｃ」という用語は、任意のＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲｌｌａＲ、ＦｃｙＲｌｌｂ、ＦｃｙＲｌｌｌａＦ、ＦｃｙＲｌｌｌａＶ、及びＦｃｙＲＩａ受容体、並びに補体因子Ｃ１ｑタンパク質ヘの抗体の結合を低減又は除去する改変されたグリカンを生じるアミノ酸置換又はグリコシルパターンの改変により、そのエフェクター機能が低減又は除去される抗体のＦｃ領域を指す。エフェクター機能の低減又は除去を生じるこの結合のそのような低減又は除去は、典型的には、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域によって媒介される。
ＦｃγＲ結合、例えば、ＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲｌｌａＲ、ＦｃｙＲｌｌｂ、ＦｃｙＲｌｌｌａＦ、ＦｃｙＲｌｌｌａＶ、及びＦｃｙＲＩａ受容体のいずれか１つ及び補体因子Ｃ１ｑタンパク質が完全に廃止される場合、「Ｆｃ ｎｕｌｌ」という用語が本明細書中で使用されうる。
大部分のＦｃサイレンシングは、突然変異を組み合わせることによって達成されうる。Ｌ２３４及びＬ２３５、これらの残基はヒンジ領域付近に位置し、アラニンによって置換されるとＦｃｙＲ結合が低減する。例として、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５ＡのＰ３２９Ｇとの組合せは、全てのアイソフォームについてＦｃｙＲ相互作用のほぼ完全な阻害をもたらしうる。
大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＦｃｙＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチド又は天然のＦｃ領域配列を含むポリペプチドと比較してＦｃｙＲ結合活性及びＣ１ｑ結合活性が減少されたものである。一部の実施形態において、大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＦｃｙＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチド又は天然のＦｃ領域配列を含むポリペプチドと比較して、大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性も有する。減少された又は検出できないＦｃｙＲへの結合を示す、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチドよりも低い親和性を有する全てのＦｃｙＲに結合しうる。ＦｃｙＲへの減少した結合を示すそのような変異体は、ＦｃｙＲへのわずかな又は感知できるほどではない結合を有しうる。特定の一実施形態において、変異体は、例えば、平衡乗数の変化によって測定した場合、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～２０％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～１０％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～５％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～１％の結合を示す。
サイレンシングされた補体活性を有する本明細書中に記載される抗体は、細胞ベースのＣＤＣアッセイ、及びすなわち、ＳＰＲ又はＥＬＩＳＡによって決定された、低減されたか又は消失されたＣ１ｑへの結合によって決定されうる。
減少したか又はサイレンシングされたＣＤＣ活性は、参照、すなわち、未改変の、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも１．５倍、具体的には、少なくとも２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、より具体的には、少なくとも１０倍下方制御されることが決定される。
減少したＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性は、参照抗体、すなわち、未改変の、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、より具体的には、少なくとも１０倍減少されることが決定された。
野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、減少されたＦｃγＲ結合を示す放射性免疫コンジュゲート抗体部分のＦｃドメインは、具体的には、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、若しくは７つ、又はそれ以上のアミノ酸置換、より具体的には、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｇ２３６位、Ｇ２３７位、Ｎ２９７位、Ｌ３２８位又はＰ３２９位のいずれか１つにおいて１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含み、より具体的には、Ｌ２３４位及びＬ２３５位において置換を含む、野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（配列番号３７）のＦｃ変異体ドメインを含みうる。
より具体的には、抗ｏｘＭＩＦ抗体部分は、具体的にはＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである、Ｌ２３４位及びＬ２３５位におけるアミノ酸置換を含む、野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（配列番号３７）のＦｃ変異体ドメインを含む。
更なる態様において、Ｆｃ変異体を含む放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体によるＦｃγＲ結合の低減又は下方制御は、野生型Ｆｃ領域を含む抗ｏｘＭＩＦ抗体で観察された値の０、２．５、５、１０、２０、５０又は７５％までの低減である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ＦｃγＲ結合の低減／枯渇を確認するために実施されうる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠損することを確認するために実施されうる。そのようなアッセイは、限定はされないが、ＦｃγＲを特異的に発現する細胞でのＳＰＲ結合研究又はＦＡＣＳを含みうる。
さらなる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、以下の配列組合せのいずれか１つを含む：
配列番号３８、３０、３３、及び４１、
配列番号３８、３１、３３、及び４１、
配列番号３８、２９、３４、及び４１、
配列番号３８、３０、３４、及び４１、
配列番号３８、３１、３４、及び４１、
配列番号３８、２９、３５、及び４１、
配列番号３８、３０、３５、及び４１、
配列番号３８、３１、３５、及び４１、
配列番号３８、２９、３６、及び４１、
配列番号３８、３０、３６、及び４１、又は
配列番号３８、３１、３６、及び４１。
特定の実施形態において、本放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体は、重鎖定常領域における選択された位置でのアミノ酸置換によるＮｅｏｎａｔａｌ受容体（ＦｃＲｎ）への低減された結合を示す。
ＦｃＲｎは、内皮細胞によって発現され、ピノサイトーシスにより血流からの可溶性ＩｇＧを含む血清成分を内部移行させる。ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合は、ｐＨ依存性であり；エンドソーム構成成分内の酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を可能にする。細胞表面にリサイクルした後、生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．２）でＩｇＧはＦｃＲｎから解離し、血液循環に放出し戻され、それによりリソソーム分解から保護され、ＩｇＧの延長された半減期をもたらす。放射性免疫コンジュゲートのＦｃＲｎへの減少された結合は、循環において低減された半減期、及びより早いｉｎ ｖｉｖｏクリアランスをもたらす。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定は、当技術分野で公知の方法を使用しても実施されうる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２００６を参照）。
野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、減少されたＦｃＲｎ結合を示す放射性免疫コンジュゲート抗体部分のＦｃドメインは、好ましくは、低減されたＦｃγＲ結合を示すＦｃ変異体ドメイン（配列番号３８）を含み、放射性免疫コンジュゲートのＦｃ部分は、Ｉ２５３位、Ｈ３１０位、及びＨ４３５位のいずれか１つにおいて、１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を更に含みうる。
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、以下の配列組合せのいずれか１つを含む：
配列番号３９、３０、３３、及び４１、
配列番号３９、３１、３３、及び４１、
配列番号３９、２９、３４、及び４１、
配列番号３９、３０、３４、及び４１、
配列番号３９、３１、３４、及び４１、
配列番号３９、２９、３５、及び４１、
配列番号３９、３０、３５、及び４１、
配列番号３９、３１、３５、及び４１、
配列番号３９、２９、３６、及び４１、
配列番号３９、３０、３６、及び４１、
配列番号３９、３１、３６、及び４１。
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、以下の配列組合せのいずれか１つを含む：
配列番号４０、３０、３３、及び４１、
配列番号４０、３１、３３、及び４１、
配列番号４０、２９、３４、及び４１、
配列番号４０、３０、３４、及び４１、
配列番号４０、３１、３４、及び４１、
配列番号４０、２９、３５、及び４１、
配列番号４０、３０、３５、及び４１、
配列番号４０、３１、３５、及び４１、
配列番号４０、２９、３６、及び４１、
配列番号４０、３０、３６、及び４１、又は
配列番号４０、３１、３６、及び４１。
本明細書中に記載される抗体のｏｘＭＩＦ結合部位は、ＭＩＦの酸化形態に、即ち動物、具体的には哺乳動物ｏｘＭＩＦ、例えば、限定はされないがマウス、ラット、サル及びヒト、具体的にはヒトｏｘＭＩＦに特異的であるが、還元型ＭＩＦの実質的な交差反応性を示さない。ｏｘＭＩＦは、癌患者の腫瘍組織において、特異的に且つ優勢に検出されうるＭＩＦの疾患関連の構造アイソフォームである。一実施形態において、ヒト化又はヒト抗ｏｘＭＩＦ結合部位は、本明細書中に記載するヒト化若しくはヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域、例えば、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６に含まれるＣＤＲ及び本明細書中に記載するヒト化若しくはヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域、例えば配列番号２９、３０、又は３１を含む。
放射性免疫コンジュゲートのｏｘＭＩＦ結合特異性は、ｏｘＭＩＦへの選択的結合を決定するために適切な任意のアッセイ、例えば、ｏｘＭＩＦへの結合に関して、未標識及び非特異的対照抗体、例えば未標識イマルマブに対する任意の競合アッセイによって決定されうる。
本明細書中の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、リンカー配列を有するか、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインからなるか、若しくはそれらを含むポリペプチド又はタンパク質を包含する。上記用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体等の多特異性抗体、及びそれらが、所望の抗原結合活性を示す限り、即ちｏｘＭＩＦに結合する抗体断片を含むがこれらに限定されない各種抗体構造を包含する。用語は、融合タンパク質、例えば免疫毒素との融合体又は抗体コンジュゲート、例えばｏｘＭＩＦに結合する抗体薬コンジュゲートも包含する。抗体は、Ｆｃ領域が、第２の異なる抗原結合部位を含有するＦｃａｂ（商標）によって置換された、ＩｇＧ構造を有する全長抗体フォーマットも包含する。
抗体ドメインは、天然の構造であるか又は変異誘発若しくは誘導体化によって改変され、例えば、抗原結合特性又は任意の他の特性、例えば安定性若しくは機能特性、例えばＦｃ受容体、例えばＦｃＲｎ及び／又はＦｃガンマ受容体への結合を改変し、好ましくは、改変はＦｃガンマ受容体及び／又はＦｃＲｎへの結合を低減する。ポリペプチド配列は、ループ配列によって結合された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ－バレル構造を含む場合に、抗体ドメインであるとみなされる。
「抗体」という用語は、それらの抗原結合誘導体及び断片を包含することが理解されよう。誘導体は、本発明の１つ又は複数の抗体ドメイン又は抗体及び／又は本発明の抗体の任意のドメインが、他の抗体又は抗体型式等の１つ又は複数の他の結合タンパク質の任意の位置で融合されうる融合タンパク質の任意の組合せ、例えば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、更にはリガンド、スキャフォールドタンパク質、酵素、標識、毒素等を含む結合構造である。
「抗体」という用語は、標的抗原ｏｘＭＩＦに対して結合特性を示すポリペプチド又はタンパク質について特に言及する。
「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原を結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；線状抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートの抗体断片は、ヒンジ領域によって、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインに融合される。
更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する、即ち、ＶＬドメインと一緒に集合することが可能であるか、又はＶＬドメインの特徴を有する、即ち、機能性抗原結合部位に対してＶＨドメインと一緒に集合することが可能であり、それにより、完全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
本明細書中で言及された抗体断片は、抗原結合領域、例えば、Ｆｃａｂ（商標）又はサイレンシングされたＦｃ領域が第２の異なる抗原結合部位を含有するＦｃａｂ（商標）によって置換されたＩｇＧ構造を有する全長抗体フォーマットを含有する１つ又は複数の構造ループ領域を含む、サイレンシングされたＦｃドメインも包含しうる。
「機能性変異体」又は「機能的に活性な変異体」という用語は、自然発生の対立遺伝子変異体、並びに突然変異体又は任意の他の非自然発生の変異体も包含する。当技術分野で公知のように、対立遺伝子変異体（又は相同体とも呼ばれる）は、核酸又はポリペプチドの生物機能を基本的に変更しない１つ若しくは複数のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる核酸又はペプチドの代替形態である。具体的には、機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加、又はこれらの組合せを含んでもよく、その置換、欠失及び／又は付加は保存的改変であり、抗原結合特性を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以下、又はまでのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存改変であり、抗体の機能を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能的に活性な変異体は、１５個まで、好ましくは１０個又は５個までのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存的改変であり、抗体の機能を変更しない。
機能性変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列における配列変更、例えば１つ又は複数の点突然変異によって得られ、ここで、配列変更は、本発明の組合せ中で使用される場合、未変更のポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更は、（保存）置換、付加、欠失、突然変異及び挿入を包含しうるが、これらに限定されない。
保存置換は、それらの側鎖及び化学特性と関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、無電荷極性側鎖、小側鎖、大側鎖等を有するアミノ酸である。そのような保存的置換は、例えば、ロイシンのイソロイシン、グルタミン酸のアスパラギン酸、セリンのシステイン等でありうる。
非保存的置換は、それらの側鎖及び化学特性に関連しないアミノ酸内で起こるもの、例えば、限定はされないが、プロリン若しくはバリンのアラニン、又はフェニルアラニンのシステイン、セリン若しくはバリンのフェニルアラニン等である。
点突然変異は、種々のアミノ酸に関して１つ又は複数の単一（不連続）アミノ酸或いは二重アミノ酸の置換又は交換、欠失又は挿入における、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。好ましい点突然変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸を指す。これら２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる。
本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂ断片又はＦａｂ」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。本発明の抗体は、少なくとも１つのＦａｂ断片を含むことができ、ここで、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換される。可変領域又は定常領域のいずれかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片はまた、「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成物が可能であり、本発明の抗体に含まれる。Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換することができ、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で下記の順序：ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬを有してもよく、上記リンカーは、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、具体的には、３２個～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。上記単鎖Ｆａｂ断片ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されうる。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化されうる。
Ｆｖ断片は、抗原結合活性において機能を有する免疫グロブリン分子の最小単位である。「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、短いリンカーペプチド又はジスルフィド結合によって結合された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン、並びに可溶性のためにセリン若しくはスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と結合するか、又はその逆のいずれかでありうる。単鎖可変断片は、定常Ｆｃ領域を欠損する。ｓｃＦｖは、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、オリジナルの免疫グロブリンの特異性を保持する。
「Ｎ末端」という用語は、Ｎ－末端の最終アミノ酸を意味する。
「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最終アミノ酸を意味する。
「ミニボディ」という用語は、ＣＨ３ドメインを介して連結される単鎖Ｆｖ断片（単鎖Ｆｖ－ＣＨ３）の対から構成される抗体を指す。具体的には、ミニボディは、約７５ｋＤａである。
「ディアボディ」という用語は、小さなペプチドリンカーによって結合される重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）領域からなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の非共有結合的二量体を指す。ディアボディの別の形態は、２つのｓｃＦＶ断片が互いに共有結合的に連結される単鎖（ＦＶ）２である。更に、内部リンカーを用いて、各鎖における遺伝子をタンデムに連結させることによって、４つのＶＨ及びＶＬドメインは、タンデムに発現されて、単鎖ディアボディ（ｓｃＤｂ）としてフォールディングさせることができ、これはまた、二重特異性抗体産生にとって有効な戦略である。更に、組換え可変ドメインをＦｃ領域又はＣＨ３ドメインに融合させること（ｓｃＤｂ－Ｆｃ及びｓｃＤＢ－ＣＨ３、ディアボディ－ＣＨ３）により、最終産物の結合価は二倍となりうる。サイズの増加はまた、血清中のディアボディの半減期を延長させることができる。具体的には、ディアボディ－ＣＨ３は、約１２５ｋＤａを有する。
特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体は、例えば、親和性タグ、溶解度増強タグ及びモニタリングタグであるが、これらに限定されない、精製及び／又は検出用の１つ又は複数のタグを含みうる。
具体的には、親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、抗体用のペプチド基質、キチン結合ドメイン、ＲＮＡ分解酵素Ｓペプチド、プロテインＡ、β－ガラクトシダーゼ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、及びｃ－Ｍｙｃタグからなる群から選択され、具体的には、タグは、４つ又は複数のＨを含むＨｉｓタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグである。
「融合される」又は「結合される」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
「リンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチドリンカーを指し、２、３、４、５、６、７又はそれ以上のアミノ酸長、好ましくは２アミノ酸長～１０アミノ酸長、より好ましくは３アミノ酸長～５アミノ酸長を有するアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
「免疫グロブリン」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィドで結合されている２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。重鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、軽鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結される本質的に２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインからなる。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに帰属させてもよく、それらのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に更に分類されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属されうる。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来するのに対して、重鎖及び／又は軽鎖の残部が、異なる供給源又は種に由来する、通常は組換えＤＮＡ技法によって調製される抗体を指す。キメラ抗体は、ウサギ又はマウスの可変領域と、ヒト定常領域とを含みうる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生する方法は、従来の組換えＤＮＡに関与し、遺伝子トランスフェクション技法が当該技術分野で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト供給源に由来する抗体、又は他のヒト抗体コード配列のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有する。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。「ヒト抗体」という用語はまた、本明細書中で使用する場合、例えば、「クラススイッチング」、即ちＦｃ部分の変化又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への変化、及び／又はＩＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において修飾されるかかる抗体を含む。本発明によって包含されるヒト化抗体の他の形態は、例えばＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、新たな特性を発するように、定常領域が元の抗体の定常領域から更に修飾又は変更されている抗体である。
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＨＥＫ細胞、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離される抗体、或いは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体等の、組換え手段によって調製、発現、創出又は単離されるヒト抗体全てを包含すると意図される。組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列配列に由来し、且つそれらに関連する一方で、天然ではｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体レパートリー内に存在しない可能性がある配列である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１に記載されるようなサブグループである。
「抗原」という用語は、本明細書中で「標的」又は「標的抗原」という用語と交換可能に使用される場合、抗体結合部位によって認識される全標的分子又はかかる分子の断片を指す。具体的には、抗原の下部構造、一般的に、免疫学的に関連性のある「エピトープ」、例えばＢ－細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープと称される抗原、例えば、ポリペプチド又は炭水化物構造は、かかる結合部位によって認識されうる。
「エピトープ」という用語は、本明細書中で使用する場合、特に、特異的な結合パートナーを完全に構成しうるか、又は本発明の抗体型式の結合部位に対する特異的な結合パートナーの一部でありうる分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質若しくは無機物質又はそれらの誘導体及びそれらの任意の組合せで構成されうる。エピトープが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質等のペプチド構造に含まれる場合、エピトープは通常、少なくとも３アミノ酸、具体的には５アミノ酸～４０アミノ酸、及び具体的には１０アミノ酸以下、具体的には４アミノ酸～１０アミノ酸を含む。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造的エピトープのいずれかでありうる。線状エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。線状エピトープは、近接しうるか、又は重複しうる。立体構造的エピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって一緒にまとめられたアミノ酸又は炭水化物で構成され、アミノ酸は、線状配列において、必ずしも互いに隣接するとは限らない。かかるｏｘＭＩＦエピトープは、ｏｘＭＩＦの中心領域内に位置する配列ＥＰＣＡＬＣＳ（配列番号４５）でありうる。
「抗原結合ドメイン」又は「結合ドメイン」又は「結合部位」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、また抗原の一部又は全てに相補的な区域を含む抗原結合部分の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分にのみ結合する場合があり、その特定の部分は、エピトープと称される。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
「結合部位」という用語は、本発明の抗体に関して本明細書中で使用する場合、抗原と結合相互作用が可能な分子構造を指す。通常、結合部位は、各種抗原に結合機能を付与する様々な構造を有する特異的な領域である、本明細書中で「ＣＤＲ結合部位」とも称される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。様々な構造は、抗体の天然レパートリー、例えば、マウス又はヒトレパートリーに由来しうるか、或いは例えば突然変異誘発によって、具体的には無作為化技法によって、組換え的に又は合成的に産生されうる。これらには、突然変異誘発されたＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に、抗体のＣＤＲループ、例えばＶＬ及び／又はＶＨ抗体ドメインのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ループが包含される。本明細書により使用される場合の抗体型式は通常、それぞれが抗原に特異的な１つ又は複数のＣＤＲ結合部位を含む。
「特異的な」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子の異種集団において目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。本明細書中では、結合反応は、少なくともｏｘＭＩＦ抗原との反応である。したがって、指定条件、例えば、イムノアッセイ条件下で、特定の標的に特異的に結合する抗体は、試料中に存在する他の分子に、著しい量では結合せず、具体的には、その抗体は、還元型ＭＩＦへの実質的な交差反応性を示さない。
特異的な結合部位は通常、他の標的と交差反応しない。依然として、特異的な結合部位は、標的の１つ又は複数のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合しうるか、又は他の関連標的抗原、例えば、相同体若しくは類似体に対して交差反応でありうる。
特異的な結合は、結合が、選択に応じて、標的同一性、高、中若しくは低の親和性又はアビディティに関して選択されることを意味する。選択的な結合は通常、ｏｘＭＩＦ等の標的抗原に対する結合定数又は結合動態が、標的抗原ではない抗原に対する結合定数又は結合動態と比較して、少なくとも１０倍異なり、好ましくは、その差が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成される。
「価」という用語は、本出願内で使用する場合、抗体分子における指定数の結合部位の存在を意味する。抗体の結合価は、個々の抗体分子が結合できる、抗原決定因子の数を指す。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗体分子における、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表す。
抗体価（抗原結合部位の数）が大きくなると、それが結合することができる抗原の量が多くなる。
「一価」という用語は、抗体の結合部位に関して本明細書中で使用する場合、標的抗原に対して向けられた唯一の結合部位を含む分子を指す。
本発明の抗体は、ｏｘＭＩＦを特異的に結合する一価、二価、四価又は多価の結合部位を含むと理解される。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域それぞれを指す。概して、自然四鎖抗体は、ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは概して、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関連して、本明細書中で交換可能に使用される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて様々である。抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかどうかを、当業者は日常的に決定することができる。
Ｋａｂａｔは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する付番システムを規定した。当業者は、「Ｋａｂａｔ付番」のこのシステムを、配列自体を超えるいかなる実験データに頼らずに、任意の可変領域配列に一義的に帰属させることができる。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準」Ｋａｂａｔ付番配列との、抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより、所与の抗体について決定されうる。本明細書中で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」によって記載される付番システムを指す。別記しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の付番への言及は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う。定常領域の付番は、ＥＵ付番指標に従う。
ＣＤＲはまた、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、これらは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、簡易ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。別記されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中では上述のＫａｂａｔらに従って付番される。
本明細書中で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）の配列同一性」は、最大のパーセントの配列同一性を達成するように、必要に応じて、配列を整列させて、ギャップを導入した後の、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義され、配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮しない。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
本発明によれば、可変又は定常領域配列の配列同一性は、本明細書中に記載する各々の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％である。％での詳述により、純粋に算術的に、アミノ酸又は核酸はもはや全体数として特定されなくてもよい。例として、同一性の算出は、１．５アミノ酸が同一であるか又は非同一であるという結果をもたらすであろう。この場合、値は端数を切り上げられ、核酸及びアミノ酸は常に整数として与えられる。
本明細書中で使用される場合、「対象」又は「患者」又は「個体」という用語は、哺乳動物を指す。哺乳動物として、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体又は対象はヒトであり、最も好ましくは、ヒトは、腫瘍中の悪性細胞を含む、異常細胞を有すると考えられる。
「単離核酸」は、その天然環境の構成成分と分離された核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を包含するが、核酸分子は、染色体外で、又はその天然染色体位置とは異なる染色体位置で存在する。
「抗ｏｘＭＩＦをコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター中にかかる核酸分子を包含する、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子、及び宿主細胞における１つ又は複数の位置で存在するかかる核酸分子を指す。
「実質的な交差反応なし」は、分子（例えば、抗体）が、特に当該標的抗原と比較した場合に、分子（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）の実際の標的抗原とは異なる抗原、具体的には還元型ＭＩＦを認識しないか、又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に、約１０％未満～約５％未満結合しうるか、又は約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％、又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量で、実際の標的抗原とは異なる抗原を結合しうる。結合は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって決定されうる。
本発明の抗体の組換え産生は、好ましくは、例えば、抗体型式をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物又はベクターを包含する発現系を含む。
「発現系」という用語は、動作可能な連結で所望のコード配列及び制御配列を含有する核酸分子を指し、その結果、これらの配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされるタンパク質を産生することが可能である。形質転換を達成するためには、発現系は、ベクター上に含まれうるが、続いて、関連ＤＮＡは、宿主染色体に組み込まれうる。或いは、発現系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳に使用することができる。
本明細書中で使用する「発現ベクター」は、適切な宿主生物におけるクローニングされる組換えヌクレオチド配列の、即ち組換え遺伝子の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、更に、宿主細胞における自己複製のための起源又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又はゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写終結因子を通常含み、これらの構成成分は、動作可能に一緒に連結される。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、自己複製ヌクレオチド配列及びゲノム組み込みヌクレオチド配列を包含する。
具体的には、上記用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）、例えば本発明の抗体型式をコードするヌクレオチド配列が、宿主を形質転換するように宿主細胞に導入され、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進しうるビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
ベクターは通常、外来遺伝子が挿入される伝播性物質のＤＮＡを含む。ＤＮＡの一方のセグメントを、ＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を包含する。
「カセット」は、規定の制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを指す。カセット制限部位は、適正なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するよう設計されている。概して、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位で挿入され、続いて、ベクターによって伝播性ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞へ運搬される。発現ベクター等のＤＮＡが挿入又は付加されたＤＮＡのセグメント又は配列はまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれうる。ベクターの一般的なタイプはプラスミドであり、これは概して、更なる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二重鎖ＤＮＡの自己完結式分子であり、適切な宿主細胞に容易に導入されうる。本発明のベクターは多くの場合、コードＤＮＡ及び発現制御配列、例えば、プロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１つ又は複数の制限部位を有する。コードＤＮＡは、本発明の抗体型式等の特定のポリペプチド又はタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、調節するか、又は他の場合には媒介するか、若しくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じか、又は異なる生物由来であってもよい。本発明の組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニング若しくは発現用の１つ又は複数の複製系、宿主における選択用の１つ又は複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ又は複数の発現カセットを包含する。
例えば、本発明の要素を提供又コードするＤＮＡ配列、及び／又は目的のタンパク質、プロモーター、終結因子及び更なる配列をそれぞれライゲーションして、組み込み又は宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載される。
宿主細胞は、具体的には、本発明によるベクター等の発現構築物でトランスフェクトされた細胞、組換え細胞又は細胞株と理解される。
「宿主細胞株」という用語は、本明細書中で使用する場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の樹立されたクローンを指す。宿主細胞株という用語は、本発明の組換え抗体型式等のポリペプチドを産生するように内因性又は組換え遺伝子を発現するのに使用される場合の細胞株を指す。
「産生宿主細胞」又は「産生細胞」は、産生プロセスの産物である本発明の組換え抗体型式を得るように、バイオリアクターにおける培養のための使用準備済の細胞の細胞株又は培養物であると一般的に理解される。本発明による宿主細胞型は、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。
「組換え」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば、具体的には組換えベクター又は組換え宿主細胞において取り込まれた異種配列を用いた「遺伝子操作によって調製されること」又は「遺伝子操作の結果」を意味する。
抗体は、任意の既知の十分に樹立された発現系及び組換え細胞培養偽術を使用して、例えば、細菌宿主（原核生物系）又は酵母、真菌、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物系における発現によって産生されうる。本発明の抗体分子は、ヤギ、植物又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を有し、且つマウス抗体産生を欠損している操作されたマウス株であるトランスジェニックマウス等のトランスジェニック生物において産生されうる。抗体はまた、化学合成によって産生されてもよい。
特定の実施形態によれば、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ハイブリドーマ及びジャーカットからなる群から選択される細胞の産生細胞株である。より具体的には、宿主細胞はＣＨＯ細胞から得られる。
本発明の宿主細胞は、具体的には、例えば、血清に代わるものとして、血漿タンパク質、ホルモン及び成長因子等の他の構成成分を含む無血清培養物中で培養又は維持される。
宿主細胞は、樹立されて、適応されて、無血清下で、任意選択により、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で完全に培養される場合に最も好ましい。
本明細書中に記載される放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収されうる。
「医薬製剤」という用語は、調製物中に含有される有効成分の生物活性が有効であるのを可能にするような形態で存在し、製剤が投与される対象にとって受け入れられないほど毒性である更なる構成成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって無毒性である有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリシン若しくはヒスチジンなどのアミノ酸、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを包含することが好適である。薬学的に許容可能な物質の更なる例は、湿潤剤、又は少量の、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝液等の補助物質であり、これらは、抗体の寿命又は有効性を高める。
本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する」若しくは「治療すること」又は「療法」は、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の経過中に実施されうる。治療の所望の効果として、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的若しくは間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の向上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるのに、又は疾患の進行を減速させるのに使用される。
本発明の放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体及びそれを含む医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、診断剤又は予防剤と組み合わせて投与されうる。更なる治療剤として、治療されるべき疾患に応じて、他の抗癌剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、化学療法剤、ステロイド、又はチェックポイント阻害剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、及びリポソームで存在しうる。様々な他の送達系も公知であり、本明細書中に記載される放射性免疫コンジュゲートを投与するために使用され、例えばリポソーム、微粒子、微小カプセル中への封入、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７を参照）でありうる。
癌の治療、予防若しくは管理又は癌の診断に有効であろう本発明の放射性免疫コンジュゲート組成物の量は、標準的な研究技術によって決定されうる。例えば、癌の治療、予防若しくは管理又は癌の診断に有効であろう組成物の投与量は、組成物を、動物モデル、例えば本明細書中に開示の動物モデル又は当業者に公知の動物モデルへと投与することによって決定されうる。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを場合により用いて最適な投与量の範囲を同定してもよい。好ましい有効量の選択は、当業者に公知のいくつかの因子の検討に基づいて当業者によって決定されうる（例えば、臨床試験により）。そのような因子は、治療又は予防される疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態及び投与される医薬組成物の正確性を反映する当業者に公知の他の因子を含む。製剤中に用いられる正確な用量は、投与の経路、及び癌の重症度にも依存し、医師の判断及び個々の患者の状況によって決定されるはずである。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から推定されうる。
特定の実施形態において、放射性免疫コンジュゲートの治療有効量は、約２５ｍＣｉ～２５０ｍＣｉ、５０ｍＣｉ～２００ｍＣｉ、７５ｍＣｉ～１７５ｍＣｉ、又は１００ｍＣｉ～１５０ｍＣｉの範囲である。
放射性免疫コンジュゲートは、公知の化学療法剤と組み合わせて投与されうる。化学療法剤の例としては、限定はされないが、ＢＣＮＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、パクリタキセル、テモゾミド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、アルトレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、フルオロウラシル、シタラビン、アザシチジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタン及びアミフォスチンが挙げられる。
好ましい製剤は、投与及び治療適用の意図した様式に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能な溶液又は注入可能な溶液の形態であり、例えば、ヒトの受動免疫のために使用されるものと類似の組成物である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、皮内、静脈内、皮下、硬膜外、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、放射性免疫コンジュゲートは、静脈内注入又は注射によって投与される。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変わるであろう。
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に放射性免疫コンジュゲートを投与することが望ましいことがあり；これは、例えば、限定ではなく、注射による、カテーテルの手段による、座薬による、又は移植による外科手術中の局所注射によって達成され、前記移植は、膜、例えばサイラスティック膜、又はファイバーを含む、多孔体、非多孔体、又はゲル状物質である。
さらに別の実施形態において、放射性免疫コンジュゲート又は放射性免疫コンジュゲートを含む任意の組成物は、制御された放出システムで送達されうる。一実施形態において、ポンプが使用されうる。別の実施形態において、ポリマー物質が使用されうる。さらに別の実施形態において、制御された放出システムは治療標的、例えば脳付近に置かれ、したがって、全身用量の一部のみが必要である。
放射性免疫コンジュゲートは、１回投与されうるが、より好ましくは、複数回投与される。
本発明は、ＭＩＦ関連症状、具体的には、（過剰）増殖性疾患の治療を必要とする対象の治療及び診断のための、放射性免疫コンジュゲートを含む組成物にも関する。一部の実施形態において、治療を必要とする対象はヒトである。
「癌」という用語は、本明細書中で使用する場合、増殖性疾患、具体的には、非固形癌及び固形癌を指す。癌の例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。より具体的には、そのような癌の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫／神経膠腫（例えば、退形成星状細胞腫、多形神経膠芽腫、退形成乏突起膠腫、退形成乏突起星状細胞腫）、ユーイング肉腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、黒色腫、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（例えば、頭頚部、食道、及び口腔）、結腸直腸腺癌、甲状腺髄様癌、乳頭様甲状腺癌、星状細胞腫、神経芽細胞腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び悪性精上皮癌が挙げられ、上記の癌の任意の難治性バージョン、又は上記の癌の１つ若しくは複数の組合せを含む。
本発明の放射性免疫コンジュゲートによって治療及び／又は診断されうる癌疾患又は癌などの過剰増殖性障害は、任意の組織又は臓器に関与し、脳癌、肺癌、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部癌、頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸結腸癌、食道癌、婦人科癌、鼻咽頭癌、又は甲状腺癌、黒色腫、リンパ腫、白血病又は多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。特に、本発明の放射性免疫コンジュゲートは、卵巣、膵臓、大腸及び肺の癌、並びに血液腫瘍の治療及び／又は診断に有用である。
特定の実施形態において、癌疾患の治療及び／又は診断、具体的には、固形腫瘍の治療に非常に好適な放射性免疫コンジュゲートの抗体は、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、
ｉ）以下の可変ドメイン：
（ａ）配列番号３２及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つ、又は１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号３２の機能性変異体を含み、３６位に保存されたチロシン、及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ）配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｃ）配列番号２９及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ、又は１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号２９を含み、アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つを更に含む配列番号２９の機能性変異体を含む重鎖可変ドメイン
の１つを含む。
更に、別の好ましい態様において、放射性免疫コンジュゲートの抗ｏｘＭＩＦ抗体は、例えば、Ｆｃのアラニンスキャンによって同定されうる、ＦｃγＲ結合を低減させる改変を含む。具体的には、それは、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｇ２３６位、Ｇ２３７位、Ｎ２９７位、Ｌ３２８位又はＰ３２９位のいずれか１つに１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含む、配列番号３７を有する野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、前記放射性免疫コンジュゲートが、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、減少されたＦｃγＲ結合を示す。さらなる実施形態において、放射性免疫コンジュゲートは、Ｉ２５３位、Ｈ３１０位、Ｈ４３５位のいずれか１つに１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含む、低減されたＦｃγＲ結合（配列番号３８）を有するＦｃ変異体ドメインを含み、前記放射性免疫コンジュゲートは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、ヒトＦｃＲｎに対する低減された親和性を示す。
本発明の放射性免疫コンジュゲートは、診断剤又は検出可能剤として使用されうる。本発明の放射性免疫コンジュゲートは、例えば特定の治療の有効性を決定する臨床検査手順の一部として癌の発生又は進行をモニタリング又は予後判定するために有用でありうる。更に、そのような放射性免疫コンジュゲートは、癌症状の発生又は進行をモニタリング又は予後判定するために有用でありうる。
別の実施形態において、本発明の放射性免疫コンジュゲートの初期投与後、癌細胞は画像化され、癌細胞の相対量及び数が任意の利用可能な手段によって決定されうる。本発明は、癌を検出し及び／又は患者の器官又は身体の領域における癌細胞への治療剤の効果を評価する診断方法を含む。
本方法は、治療前後に、検出可能な量の放射性同位体にコンジュゲートされた抗ｏｘＭＩＦ抗体を含む組成物の患者への投与を含む。治療剤の投与に続いて、追加量の検出可能な抗ｏｘＭＩＦ抗体が投与され、治療後に残存する癌細胞の相対量が決定されうる。治療前後の画像の比較は、治療の有効性を評価する手段として使用され、治療後に画像化された癌細胞の数の減少が有効な治療レジメンの指標である。
本明細書中で使用される場合、「検出可能な量」という用語は、腫瘍中の１つ又は複数の悪性癌細胞への標識された抗体の結合の検出を可能にするのに十分である、患者に投与される、ｏｘＭＩＦに結合する、放射性免疫コンジュゲートの量を指す。本明細書中で使用される場合、「画像化有効量」という用語は、腫瘍中の１つ又は複数の悪性癌細胞への抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合の画像化を可能にするのに十分である、患者に投与される、放射性免疫コンジュゲートの量を指す。
本発明の方法は、腫瘍中の悪性細胞を含む、異常細胞をｉｎ ｖｉｖｏで同定及び定量するために使用される、非侵襲性の画像化技術、例えば、陽電子放出層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などのガンマ画像化と組み合わせた、本発明の放射性免疫コンジュゲートを含む。「ｉｎ ｖｉｖｏ画像化」という用語は、上記の放射性免疫コンジュゲートの検出を可能にする任意の方法を指す。ガンマ画像化のため、腫瘍又は調べられる領域から放出された放射線が測定され、全結合としてか、又は１つの組織における全結合が、同じｉｎ ｖｉｖｏ画像化手順中に同じ対象の別の組織又は身体全体における全結合に対して正規化される（例えばそれにより割られる）比として表される。ｉｎ ｖｉｖｏでの全結合は、大過剰の未標識と共に、同一量の標識された化合物、そうでなければ化学的に同一の化合物の第２の注射による補正の必要なく、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化技術によって、腫瘍又は組織において検出される全シグナルとして規定される。
ｉｎ ｖｉｖｏ画像化のため、利用可能な検出装置の型は、所与の標識の選択の主要な因子である。例えば、放射能同位体は、本明細書に記載の方法でのｉｎ ｖｉｖｏ画像化に特に好適である。使用される装置の型は、放射性同位体の選択をガイドするであろう。例えば、選択された放射性同位体は、所与の型の装置によって検出可能な減衰の型を持たなければならない。別の考慮は、放射性同位体の半減期と関連する。半減期は、標的による最大取り込みの時間にまだ検出可能であるように十分に長いが、宿主が有害な放射線を維持しないように充分に短くなければならない。放射性標識された放射性免疫コンジュゲートは、適切な波長の放射されたガンマ照射が検出される、ガンマ画像化を使用して検出されうる。ガンマ画像化の方法としては、限定はされないが、陽電子放出層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を含む。好ましくは、ＳＰＥＣＴ検出では、選択された放射性標識は特定の放射を欠くが、多くの光子を産生する。ＰＥＴ検出では、放射性標識は、ＰＥＴカメラによって検出される陽電子放出層撮影である。
本発明において、放射性免疫コンジュゲートは、腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ検出及び画像化に有用である。これらの化合物は、非侵襲性の画像化技術、例えば陽電子放出層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）又はチェレンコフ光画像化（ＣＬＩ）と組み合わせて使用される。この発明により、免疫コンジュゲートは、任意の許容可能な放射性同位体によって標識（複合体化）されうる。
さらなる実施形態によれば、放射性免疫コンジュゲートは、前記対象へと放射性免疫コンジュゲートを投与すること及びｉｎ ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴ及びＰＥＴ画像化によって放射性免疫コンジュゲートを検出することを含む、癌細胞、腫瘍微小環境又はそれを必要とする対象における腫瘍の細胞の局在を決定するために使用される。
さらなる実施形態によれば、放射性免疫コンジュゲートは、対象へと放射性免疫コンジュゲートを投与すること及びｉｎ ｖｉｖｏ ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化によって放射性免疫コンジュゲートを検出することを含む、１つ又は複数の癌細胞、腫瘍微小環境又は前記対象の器官又は組織の細胞を画像化するために使用される。
さらなる実施形態によれば、放射性免疫コンジュゲートは、対象へと放射性免疫コンジュゲートを投与すること及びｉｎ ｖｉｖｏ ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化によって放射性免疫コンジュゲートを検出することを含む、前記対象の癌細胞、腫瘍微小環境、器官又は組織の細胞でのｏｘＭＩＦの決定及び（相対）定量のために使用される。
通常、放射性免疫コンジュゲートの投与量は、患者の年齢、症状、性別及び疾患の程度、禁忌、もしあれば、併用治療及び当業者によって調整される他の変数などの条件によって変わるであろう。投与量は、治療投与のための約２５ｍＣｉ～２５０ｍＣｉの範囲から変わってもよく、放射線用量は、診断目的のため、０．５～１０ｍＣｉの範囲、例えば約１～５ｍＣｉでありうる。個々の投与量は、当業者によって決定されうる。
患者への投与は、局所的又は全身であってもよく、静脈内、動脈内、髄腔内（髄液を介して）、頭蓋内等で達成される。投与は、検査下の身体の部位に応じて皮内又は腔内であってもよい。
放射性免疫コンジュゲートが異常細胞と結合するのに十分な時間、例えば約３０分～４８時間、又は７２時間、又はより長く経過した後、検査下にある対象の領域は、通常の画像化技術、例えばＳＰＥＣＴ、プラナーシンチレーション画像化、ＰＥＴ、及び新しい画像化技術によっても調べられる。正確なプロトコールは、上記のように、患者に特異的な因子に応じて、並びに検査下の身体の部位、投与の方法、及び使用した標識の型に応じて必然的に変わるであろう；特定の手順の決定は、当業者には日常的である。腫瘍画像化のため、好ましくは、結合した放射性免疫コンジュゲートの量（全又は特異的結合）が測定され、化学療法治療後に腫瘍に結合した放射性免疫コンジュゲートの量と比較される（比として）。
別の実施形態において、本発明の放射性免疫コンジュゲートは、原発性腫瘍部位の末端の組織及び体液を使用することによる診断及び予後予測のために使用されうる（並びに、原発性腫瘍の組織及び体液及び／又は腫瘍周辺の組織及び体液を使用する方法）。本発明の放射性免疫コンジュゲートを使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用する生体試料におけるｏｘＭＩＦレベルをアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１，９７６－９８５；及びＪａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５，３０８７－３０９６を参照）。
より更なる実施形態において、本発明は、上記の免疫検出及び画像化方法による使用のための、免疫検出と画像化キットの両方を含む、診断キットを提供する。
本発明は、下記の項目も更に包含する：
１．組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を含む放射性免疫コンジュゲートであって、
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号３２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号３２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号２９及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号３２及び配列番号２９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、放射性免疫コンジュゲート。
２．軽鎖可変ドメインがアミノ酸置換Ｗ９３Ｆを含み、重鎖可変領域がアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む、項目１の放射性免疫コンジュゲート。
３．放射性同位体が、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｔｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、２２７Ｔｈ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、及び２２７Ｔｈからなる群から選択され、具体的には、放射性同位体が、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される、項目１又は２の放射性免疫コンジュゲート。
４．位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ｌ３２８、又はＰ３２９のいずれか１つに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号３７を有する野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、Ｆｃγ受容体、具体的にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩに対する減少された結合を示す、項目１又は２の放射性免疫コンジュゲート。
５．位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３５のいずれか１つに１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、ヒトＦｃＲｎに対する低減された親和性を示す、項目１～４のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
６．配列番号３１、３３、３４、３５、及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１～５のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
７．配列番号３７、３８、３９、及び４０のいずれか１つと組み合わせて、配列番号２９及び３４；配列番号３０及び３３、配列番号３０及び３４、配列番号３１及び３４、配列番号３１及び３６、又は配列番号３１及び３３を含む、項目１～５のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
８．ＩｇＧ、ＩｇＧ融合タンパク質、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、ディアボディ、ディアボディ融合タンパク質、Ｆａｂ、Ｆａｂ融合タンパク質、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｃａｂ、Ｆｃａｂ融合タンパク質、２つ以上の単鎖抗体の融合タンパク質、ミニボディ、小免疫タンパク質（ＳＩＰ）フォーマット、並びにナノボディ及びナノボディ融合タンパク質からなる群から選択される、項目１～７のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
９．ＤＯＴＡ及びデフェロキサミンＢ（ＤＦＯ）及びＤＦＯ＊の群から選択される、キレート基を更に含む、項目１～８のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
１０．医薬の調製における使用のための、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート。
１１．場合により医薬担体又はアジュバントと共に、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートを含む医薬組成物。
１２．静脈内投与のために製剤化される、項目１１の医薬組成物。
１３．癌を患う患者の治療、具体的には、腫瘍、具体的には、血液癌又は固形腫瘍の治療における、より具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、及び肺癌の治療への使用のためである、項目１１又は１２の医薬組成物。
１４．項目１～８のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートの、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸。
１５．項目１４の核酸分子（複数可）を含む発現ベクター。
１６．項目１２若しくは１３の核酸又は項目１３の発現ベクターを含有する宿主細胞。
１７．項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートを産生するための方法であって、宿主細胞において抗ｏｘＭＩＦ抗体をコードする核酸を発現させる工程、及び放射性同位体によって前記抗体を更に標識する工程を含む方法。
１８．対象の癌においてｏｘＭＩＦレベルの検出のための、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートの使用。
１９．対象における癌の診断のための、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートの使用。
２０．癌をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するための方法であって、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートが、試料中の腫瘍細胞を検出するために使用される、方法。
２１．癌をｉｎ ｖｉｖｏで診断するための方法であって、項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートが、対象において腫瘍細胞を検出するために使用される、方法。
２２．項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲートの産生のためのキットであって、２つ以上のバイアルを含み、１つのバイアルが、抗ｏｘＭＩＦ抗体に結合したキレート剤を含むコンジュゲートを含有し、２つ目のバイアルが、具体的には１７７Ｌｕ及び８９Ｚｒから選択される放射性同位体を含有する、キット。
２３．１つ又はいくつかのバイアルの内容物が凍結乾燥されるか又は溶液中にある、項目２１のキット。
２４．項目１～９のいずれか一項の放射性免疫コンジュゲート、又は項目１１若しくは１２の医薬組成物を使用して癌を治療するための方法。
本明細書中に記載される実施例は、本発明の例示であり、それを限定することを意図しない。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、多くの改変及びバリエーションが本明細書中に記載及び例示される技術に行われうる。したがって、実施例が例示のみであり、本発明の範囲を限定しないことが理解されるはずである。
実施例１：１７７Ｌｕ－Ｃ０００８放射性免疫コンジュゲートの生成
材料及び方法：Ｃ０００８は、ＨＥＰＥＳ ０．３Ｍ ｐＨ９中、１：２０のモル比でＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡとインキュベートした。標識する混合物は、３７℃で２時間撹拌した。反応後、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（再生セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して、３０００ｇで、０．９％ＮａＣｌ中での、複数回の遠心分離により過剰なＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡが除去された。コンジュゲートは、ＳＥ－ＨＰＬＣによって調べられ、精製の最後に化学的純度を評価した。ＳＥ－ＨＰＬＣは、流速０．６ｍＬ／分でアルギニンを含有するリン酸緩衝液によって溶出する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムで実施した。更に、ＤＯＴＡ－０００８の純度及び完全性は、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（４～１５％直線勾配ポリアクリルアミドゲル；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。
抗体当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数は、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４の方法、及びＩｎｓｔａｎｔ Ｔｈｉｎ－Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＴＬＣ）を使用することによって決定した。少量のＤＯＴＡコンジュゲート抗体は、ＤＯＴＡコンジュゲート抗体の量と比較して、２倍、４倍、６倍、及び８倍過剰な１１１／１１５Ｉｎで、トレーサー量の放射能１１１Ｉｎと安定インジウム（１１５Ｉｎ）の混合物とインキュベートした（標識条件は表１に示す）。未消費のインジウムを、次いで、過剰なＥＤＴＡと複合体化させ、不溶性水酸化インジウムの形成及び抗体へのインジウムの非特異的接着を防いだ。解析のため、１μＬの放射能溶液をＩＴＬＣストリップに置き、ｐＨ５で０．１Ｍのクエン酸緩衝液によって溶出した。ＴＬＣプレートのオートラジオグラフィーは、積算値によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬを使用して蛍光面（ＴｙｐｈｏｏｎＩＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ヘの暴露後に得られた。ＤＯＴＡ－０００８当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数は、標識効率及び溶液中に添加された１１１／１１５Ｉｎイオンに対するタンパク質のモル比から推定した。
ＤＯＴＡ－Ｃ０００８を１５ｍＣｉ／ｍｇ（５５５ＭＢｑ／ｍｇ）の比放射能の１７７Ｌｕによって放射線標識するため、０．０４Ｎ ＨＣｌ（ＩＴＧ社 Ｇｅｒｍａｎｙ）中４５００μＣｉ（１６６．５ＭＢｑ）の塩化１７７Ｌｕ及び１２μＬの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．４を３００μｇのＤＯＴＡ－Ｃ０００８に添加した。反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした後、放射線標識したコンジュゲートを、更に５分間、１ｍＭ ＤＴＰＡ（最終濃度）とインキュベートし、過剰な１７７Ｌｕと複合させた。キレート効率は、ＤＴＰＡ添加後に０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５中に溶出するＩＴＬＣ及び積算値によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬを使用するＴＬＣプレート（ＴｙｐｈｏｏｎＩＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）のオートラジオグラフィーによって評価した。
結果：ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡとの抗体Ｃ０００８のインキュベーション及びその後の精製により、ＳＥ－ＨＰＬＣ（図１Ａ）及びＳＤＳ ＰＡＧＥ（図１Ｂ）によって示されるように、高化学純度のＤＯＴＡ－Ｃ０００８コンジュゲートをもたらした。生じたＤＯＴＡ－Ｃ０００８コンジュゲートは、抗体当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数について解析し、ＩＴＬＣからの結果を図２に示す。抗体当たり平均約５．８個のＤＯＴＡ分子が、選択された条件下で得られた。ＤＯＴＡ－Ｃ０００８コンジュゲートは、次いで、ルテチウム－１７７によってうまく標識され、生じる放射性免疫コンジュゲートは、ＩＴＬＣ（図３Ａ）及びオートラジオグラフィー（図３Ｂ）によって決定されたように、全体的な放射化学的純度９７．５％で、１６ｍＣｉ／ｍｇ（５９２ＭＢｑ／ｍｇ）の比放射能を示した。
結論：抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を１７７Ｌｕによって放射線標識する有効な方法を詳述した。生じた放射性免疫コンジュゲートは、十分な純度及び比放射能を示した。
図１は、ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の純度及び強度解析を示す；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ０００８非還元；３：Ｃ０００８還元；４：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）非還元；５：濃縮したＣ０００８（標識バッチ）還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８非還元；７：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８還元。
図２は、ＩＴＬＣによって決定されたＣ０００８に移植したＤＯＴＡ分子の数の決定を示す：ＤＯＴＡコンジュゲート抗体の量に比例して２倍（レーン６）、４倍（レーン７）、６倍（レーン８）又は８倍（レーン９）過剰な１１１／１１５Ｉｎで、トレーサー量の放射能インジウム（１１１Ｉｎ）と安定なインジウム（１１５Ｉｎ）の混合物とインキュベートしたＤＯＴＡ－Ｃ０００８のＩＴＬＣ分離。
図３は、ＩＴＬＣ及びオートラジオグラフィーによる放射線標識したＣ０００８の解析を示す：Ａ：放射線標識したＣ０００８のＩＴＬＣ（レーン３：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８との１１７Ｌｕ標識反応；レーン４：Ｃ０００８との１１７Ｌｕ標識反応）；Ｂ：ＩＴＬＣフィルムのオートラジオグラフィー、レーン３（ＤＴＰＡ付加後の１１７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８；ピーク１は、遊離１１７Ｌｕ－ＤＴＰＡを反映し、ピーク２は、１１７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８を反映する）。
実施例２：製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の安定性
材料及び方法：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の溶液を調製し、安定性試験に好適な、最終濃度７００μｇ／ｍＬにした。１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８溶液の特徴は、表２に示す。
４℃で保存した製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８を、異なる時点で、ＩＴＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによって解析した。放射化学的純度は、経時的に放射免疫コンジュゲートからの放射能放出のパーセンテージを定量するため、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５でのＩＴＬＣ溶出によって決定した。ＳＥ－ＨＰＬＣは、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで、アルギニンを含有するリン酸緩衝液によって溶出するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００、１０／３００ＧＬカラムで実施し、凝集及び夾雑を決定した（すなわち、１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ又は１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ）。クロマトグラフィープロフィールは、Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ１５０ＴＲフローシンチレーションアナライザーによって獲得した。
更に、放射性免疫コンジュゲートの放射能は、ガンマ計数によって測定し、製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の可溶性についての情報を得た。この目的のため、製剤緩衝液中１／２０希釈から直接、５μｌを計数した。
結果：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８溶液のＩＴＬＣ解析は、経時的に放射性免疫コンジュゲートから放射能の放出がほとんどないことを明らかにした。７日後、放射線標識した抗体の溶液は、最高９６．２５％の放射純度を示した。放射線標識した抗体は、製剤緩衝液中４℃で保存した場合（表３）、初期結合放射能の約１．２％を放出した（表２）。１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８は、２１．６分で溶出し、その夾雑物（１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ及び１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ誘導体）は３２．８分で溶出した。０日目から３日目までＨＭＷ凝集のわずかな増加があったが、３日目以降、更なる凝集は検出されなかった（表５）。７日後、投与溶液は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって９３％無傷の抗体を示した。ＳＥ－ＨＰＬＣの結果は、ＩＴＬＣの結果と一致した。経時的にモニターされた放射能は、ルテチウム－１７７の理論的な放射性崩壊と十分一致していた（表４の括弧内の値）。
結論：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８は、ＩＴＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによって試験した場合、７日まで、製剤緩衝液中で安定であった。
実施例３：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の安定性
材料及び方法：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性は、３７℃で、新しいマウス血漿（ヘパリンリチウムチューブによって調製）を使用して評価した。血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の濃度は、７０μｇ／ｍＬであった。血漿中での安定性は、ＩＴＬＣ（０．１Ｍクエン酸 ｐＨ５で溶出）、オートラジオグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって０日目、１日目、２日目、３日目及び７日目に評価した。
結果：３７℃で、マウス血漿中でのインキュベーションの７日後、放射線標識抗体の溶液は、約８０％の放射純度を示し、初期結合放射能の約２０％の放出に相当する（表６）。放出された放射能は、ＩＴＬＣの結果によって示された１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８誘導体及び遊離１７７Ｌｕに相当した（図４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（図５）は、血漿中でインキュベートした場合、放射線標識抗体の顕著な分解を示さなかった。更に、１７７Ｌｕの他の血漿タンパク質へのトランスキレートは観察されなかった（図５）。
結論：血漿中の安定性結果は、３７℃で、７日後に放出された約２０％の１７７Ｌｕ活性が許容された。安定性試験中に観察された、わずかな、小さい放射能産物は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８誘導体及び遊離１７７Ｌｕにほとんど相当するようである。以下に示すように、新しく設計した分子Ｃ００８３の疎水性の低減は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３と比較した生じる１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３放射性免疫コンジュゲートの大きく増強された血漿安定性を生じた。
図４は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性（オートラジオグラフィー）を示す：７日間、マウス血漿中でインキュベートした１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８のオートラジオグラム；１：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８誘導体及び遊離１７７Ｌｕ；２：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８。
図５は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の血漿安定性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１及びレーン１０：分子量標準；レーン２：ＤＯＴＡ－Ｃ０００８；レーン３：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（Ｔ０）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中Ｔ０時間）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中１日）；レーン７：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中２日）；レーン８：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中３日）；レーン９：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８（血漿中７日）
実施例４：ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣ０００８の生体内分布
材料及び方法：Ｃ０００８の生体内分布を、同系大腸癌細胞株ＣＴ２６の皮下腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて調べた。１０匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、ＰＢＳ中３×１０５個のＣＴ２６細胞の皮下注射を片側に受けた（１００μｌ／動物）。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ３に達すると、マウスは、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の単回静脈内投与を受けた。２匹のマウスを、未処置の「無シグナル」対照として使用した。
Ｃ０００８は、製造業者の説明書に従ってＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット－高ＭＷを使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識Ｃ０００８のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１時間、６～８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間での標識Ｃ０００８の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した。画像解析を実施し、腫瘍における抗体の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を定量した（ＲＦＵ＝ＲＦＵ腫瘍面積－ＲＦＵバックグラウンド／ｍｍ２＊腫瘍面積）。
結果：図６Ａは、静脈内投与したＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の、２４ｈがピークの顕著な腫瘍内分布及び７日までの腫瘍保持を示す。未処置の対照マウスではシグナルは検出されなかった（図６Ｂ）。
結論：生体内分布研究は、放射性医薬品としてのｏｘＭＩＦ抗体の適合を示唆する。
図６は、皮下ＣＴ２６腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃにおけるＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８の生体内分布を示す：皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、Ａ：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ）又はＢ：治療なしの注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた（スケールバーはＡ及びＢに適用）；Ｃ：デジタル画像解析によって定量されたＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。
実施例５
新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集傾向及び低減された疎水性
材料及び方法：疎水性及び凝集を評価するため、新しく設計した抗体を、２つの異なるＳＥＣカラム及びランニング緩衝液条件を使用するゲル濾過（ＳＥＣ）によって、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって解析し、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較した。
ＳＥＣのため、試料を、０．０２％Ｔｗｅｅｎを含む５×リン酸緩衝生理食塩水（５×ＰＢＳＴ）中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌの試料を０．７５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、２２℃で、５×ＰＢＳＴ中で実施した。タンパク質ピークは、２１４ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析した。更に、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、２２℃で、１×ＰＢＳ中で実施した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。結果は、メインピークの保持容量（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けした。
ＨＩＣ解析のため、全ての試料を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９を使用して、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。抗体の高度に精製された試料を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム上に独立してロードした。５０μｌの試料を注入し、カラム流速を２２℃で１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。ピークの分離は、０～１００％Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容量（ＣＶ）で実行した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析した。結果は、各ピークについて、最大ピークでのＶｒ（ｍｌ）で報告する。
結果：対照抗体Ｃ０００８は、サイズ排除カラムの総容量（約２４ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、約１８ｍｌ Ｅｎｒｉｃｈ６５０）に近い保持容量を示し、それはヒトＩｇＧで予測されるよりもはるかに小さい分子量に相当する（図７Ａ及びＢ）。異常に長い保持は、主に、固定相表面との疎水性相互作用による。更に、高保持容量には、Ｃ０００８では、顕著な量のＩｇＧ二量体及び凝集体が存在した。全ての新しく設計した抗体は、低減された保持容量（Ｖｒ）を示し、カラムとの相互作用の低減、したがって分子の疎水性の低減を実証した（表８、図７Ａ及びＢ）。Ｃ００８３及びＣ００９０は、最低の保持容量（表８、図７Ｂ）を示し、分子量標準と比較した場合、Ｖｒは単量体ヒトＩｇＧの分子量に相当した。更に、抗体二量体及び凝集体は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０の試料中で著しく低減された（図７Ａ及びＢ）。特にＣ００８３及びＣ００９０は、単一の単量体ピークのみを示した。
ＨＩＣカラム保持容量を使用して、抗体は、最少から最大（最低から最高の保持容量）の疎水性ＩｇＧまで順位付けし（図７Ｃ、表９）、結果はＳＥＣ解析からのデータを確証した。新しく設計した抗体Ｃ００８３（保持容量１２．３７）は、最小の疎水性であるが、対照抗体Ｃ０００８（保持容量１４．９２ｍｌ）は、最大の疎水性を示した。
結論：最適化が、低減された疎水性及び凝集特性を有する、改善された抗ｏｘＭＩＦ抗体をもたらす、ＳＥＣ及びＨＩＣ解析から明らかである。
図７は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）移動相として５×ＰＢＳＴを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム上での、Ｃ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。
実施例６：固定化されたＭＩＦへの新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合（ＫＤ測定）
材料及び方法：ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加した。最後に、結合された抗体を、プロテインＬ－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、ＯＤを４５０ｎＭで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する４パラメーターフィットによって決定した（２つの実験の平均が示される）。
結果及び結論：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する新しく設計した抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図８に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合の参照として使用した。結合曲線及びＫＤを表す算出したＥＣ５０値は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７６、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０が、Ｃ０００８（ＥＣ５００．７ｎＭ）と比較して、ｏｘＭＩＦへのそれらの親和性を保持したことを明確に示した（ＥＣ５０範囲０．５～１．６ｎＭ、アッセイの変動性内である）（図３Ａ）。Ｃ００７７は、Ｃ００７６と比較してＶＬにおける点突然変異（Ｙ３６Ｆ）により、ｏｘＭＩＦへの親和性が５分の１に減少したが（図８）、Ｃ００７７の疎水性は、著しく減少した（図７Ａ）。
図８は、固定化されたＭＩＦに対する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（ＫＤ決定）を示す。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。
実施例７：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の差次的結合
材料及び方法：抗ｏｘＭＩＦ抗体を、１５ｎＭの濃度で、４℃で終夜マイクロプレートに固定化した。ブロッキングした後、ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌのｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代理ＮＴＢ－ＭＩＦ（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とインキュベートした。捕捉したｏｘＭＩＦは、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートによって検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって染色し、発色反応を３０％Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。ＯＤを４５０ｎＭで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、２つ又は３つの実験の平均が示される。
結果及び結論：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対する新しく設計した抗体の結合は、図９に示される。結果は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７６、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しないことを明確に示し、したがって、低減された疎水性及び凝集を有する抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別するそれらの能力を保持する。新しく設計した抗体は、抗体Ｃ０００８と比較して類似のＯＤを示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図９）。Ｃ００７７は、Ｃ００７６と比較してＶＬにおける点突然変異（Ｙ３６Ｆ）によりｏｘＭＩＦへの結合が著しく低減されたことを示した（図９）。Ｃ００７７は、明らかに低減した疎水性を示す（図７Ａ）が、結合特性は維持できなかった。
図９は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗体の差次的結合を示す。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。
実施例８：新しく設計した抗体Ｃ００８３の改善された産生
発現収率を比較するため、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ０００８は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）における一過性発現により産生された。簡潔に述べると、５０～２００ｍｌの指数関数的に増加するＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して一過的にトランスフェクトし、製造業者の説明書「標準プロトコール」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に従って、加湿したインキュベーター内で、３７℃で８日間培養した。細胞を遠心分離によって除去し、上澄み液を、４０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２で１：１に希釈した。希釈した上澄み液を、０．２μｍで濾過し、室温でＮＧＣ ＱＵＥＳＴ １０クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に適用した。カラムは、１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２によって洗浄し、抗体は、１０カラム容量の１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５中に溶出した。抗体は、すぐにｐＨ５に中和し、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ Ｐ－６脱塩カートリッジによって１×ＰＢＳ ｐＨ７．２中で調製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離装置（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ技術及びそれらのそれぞれの吸光係数を使用して決定した。Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａ及び中和後の精製抗体の量（それぞれの抗体の最終収率）を細胞培養容積によって割り、結果の値は、本明細書中では抗体力価（ｍｇ／Ｌ）と呼ばれる。
結果：Ｃ０００８と比較して、Ｃ００８３の３つの個々の産生は、新しく設計した抗体Ｃ００８３が顕著に高レベル（独立ｔ検定、ｐ＝０．０３）で産生されたことを明確に示した（図１０）。
結論：著しく高い抗体力価は、Ｃ０００８と比較して、低減された疎水性及び凝集傾向に関して抗体を最適化した後に得られた（１１７ｍｇ／Ｌ Ｃ００８３対９３ｍｇ／ｍＬ Ｃ０００８）。
図１０は、対照抗体Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の改善された産生を示す。
実施例９：ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の生体内分布
材料及び方法：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の生体内分布は、同系大腸癌モデルＣＴ２６の皮下腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて調べた。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、ＰＢＳ中３×１０５個のＣＴ２６細胞の皮下注射を片側に受けた（１００μｌ／動物）。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の単回静脈内投与を受けた。
Ｃ００８３は、製造業者の説明書に従ってＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット－高ＭＷを使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識抗体のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１時間、６～８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間での標識抗体の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した。画像解析を実施し、腫瘍における抗体の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を定量した（ＲＦＵ＝ＲＦＵ腫瘍面積－ＲＦＵバックグラウンド／ｍｍ２＊腫瘍面積）。
結果：静脈内投与したＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ００８３（図１１Ａ～Ｂ）の、２４ｈがピークの顕著な腫瘍内分布及び７日までの腫瘍保持を決定した。
結論：結果は、Ｃ００８３が、Ｃ０００８と比較して、改善された腫瘍浸透及び保持特性を有することを明確に実証した（図６Ａ／図１１Ｃ）。更に、生体内分布研究は、放射性免疫コンジュゲートとしての適用のためのＣ００８３の好適性を示唆する。
図１１は、皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、Ｃ０００８と比較した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸透を示す。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；Ｂ：デジタル画像解析によって定量したＣ００８３の腫瘍浸透及び保持。Ｃ：デジタル画像解析によって定量したＣ０００８と比較したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の腫瘍浸透及び保持の比較。
実施例１０：新しく設計したＣ００８３の１７７Ｌｕ－放射性免疫コンジュゲートの生成
材料及び方法：Ｃ００８３は、０．０６Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９中、１：１０のモル比でＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡとインキュベートした。標識した混合物は、３７℃で２時間撹拌した。反応後、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（再生セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して、３０００ｇで、０．９％ＮａＣｌ中での、複数回の遠心分離により過剰なＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡが除去された。コンジュゲートは、ＳＥ－ＨＰＬＣによって調べられ、精製の最後に化学的純度を評価した。ＳＥ－ＨＰＬＣは、流速０．６ｍＬ／分でアルギニンを含有するリン酸緩衝液によって溶出する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラムで実施した。更に、ＤＯＴＡ－００８３の純度及び完全性は、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（４～１５％直線勾配ポリアクリルアミドゲル；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。
抗体当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数は、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４の方法、及びＩｎｓｔａｎｔ Ｔｈｉｎ－Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＴＬＣ）を使用することによって決定した。少量のＤＯＴＡコンジュゲート抗体は、ＤＯＴＡ抗体の量と比較して、２倍、４倍、６倍、及び８倍過剰な１７５／１７７Ｌｕで、トレーサー量の放射能１７７Ｌｕと安定ルテチウム（１７５Ｌｕ）の混合物とインキュベートした（表１１）。未消費のルテチウムを、次いで、過剰なＥＤＴＡと複合体化させ、不溶性水酸化ルテチウムの形成及び抗体へのルテチウムの非特異的接着を防いだ。解析のため、１μＬの放射能溶液をＩＴＬＣストリップに置き、ｐＨ５で０．１Ｍのクエン酸緩衝液によって溶出した。ＴＬＣプレートのオートラジオグラフィーは、積算値によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬを使用して蛍光面（Ｔｙｐｈｏｏｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ヘの暴露後に得られた。ＤＯＴＡ－００８３当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数は、標識効率及び溶液中に添加された１７５／１７７Ｌｕイオンに対するタンパク質のモル比から推定した。
ＤＯＴＡ－Ｃ００８３を２７５ＭＢｑ／ｍｇの比放射能の１７７Ｌｕによって放射線標識するため、０．０４Ｎ ＨＣｌ（ＩＴＧ社 Ｇｅｒｍａｎｙ）中８１．４ＭＢｑの塩化１７７Ｌｕ及び２０μＬの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．４を３００μｇのＤＯＴＡ－Ｃ０００８に添加した。反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした後、放射線標識したコンジュゲートを、更に５分間、１ｍＭ ＤＴＰＡ（最終濃度）とインキュベートし、過剰な１７７Ｌｕと複合させた。キレート効率は、ＤＴＰＡ添加後に０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５中に溶出するＩＴＬＣ及び積算値によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬを使用するＴＬＣプレート（ＴｙｐｈｏｏｎＩＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社）のオートラジオグラフィーによって評価した。
結果：ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡとのＣ００８３のインキュベーション及びその後の精製により、ＳＥ－ＨＰＬＣ（図１２Ａ）及びＳＤＳ ＰＡＧＥ（図１２Ｂ）によって示されるように、高化学純度約９７％のＤＯＴＡ－Ｃ００８３コンジュゲートをもたらした。生じたＤＯＴＡ－Ｃ００８３コンジュゲートは、抗体当たりに接着したＤＯＴＡ分子の数について解析し、ＩＴＬＣからの結果を図１３に示す。抗体当たり平均約１個のＤＯＴＡ分子が、選択された条件下で得られた。ＤＯＴＡ－Ｃ００８３コンジュゲートは、次いで、ルテチウム－１７７によってうまく標識され、生じる放射性免疫コンジュゲートは、ＩＴＬＣ及びオートラジオグラフィーによって決定された場合、全体的な放射化学的純度９７．８％で、７．５ｍＣｉ／ｍｇ（２７７ＭＢｑ／ｍｇ）の比放射能を示した（図１４）。
結論：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３を１７７Ｌｕによって放射線標識する有効な方法を確立した。生じた放射性免疫コンジュゲートは、Ｃ０００８と比較して、優れた純度及び比放射能を示した。更に、そのｎａｋｅｄ抗体（Ｃ００８３）のように、ＤＯＴＡ－Ｃ００８３コンジュゲートは、ＳＥＣ解析によって決定された、Ｃ０００８と比較して低減された疎水性を示した（図１２Ａ 保持時間１９．１分対図１Ａ 保持時間２０．８分）。
図１２は、ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の純度及び完全性解析を示す；Ａ：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３ ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィール（λ＝２８０ｎｍ）。Ｂ：クマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥ：１：分子量標準；２：Ｃ００８３非還元；３：Ｃ００８３還元；５：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３非還元；６：ＤＯＴＡ－Ｃ００８３還元。
図１３は、ＩＴＬＣによって決定されたＣ００８３に移植したＤＯＴＡ分子の数の決定を示す図である：ＤＯＴＡ－抗体の量と比例して２倍（レーン１）、４倍（レーン２）、６倍（レーン３）又は８倍（レーン４）過剰な１７７／１７５Ｌｕで、０．０４Ｎ ＨＣｌ中トレーサー量の放射能１７７Ｌｕと安定なルテチウム（１７５Ｌｕ）の混合物とインキュベートしたＣ００８３－ＤＯＴＡのＩＴＬＣ分離。
図１４は、ＩＴＬＣ及びオートラジオグラフィーによる放射線標識した１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の解析を示す。ＩＴＬＣフィルムのオートラジオグラム（ＤＴＰＡ付加後の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３；ピーク１／２は、遊離１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ及び１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３誘導体を反映する、ピーク３は１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３を反映する）。
実施例１１：製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の安定性
材料及び方法：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の溶液を調製し、安定性試験のために好適な、最終濃度２００μｇ／ｍＬにした。１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３溶液の特徴は、表１２に示す。
４℃で保存した製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３を、異なる時点で、ＩＴＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによって解析した。放射化学的純度は、経時的に放射性免疫コンジュゲートからの放射能放出のパーセンテージを定量するため、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５でのＩＴＬＣ溶出によって決定した。ＳＥ－ＨＰＬＣは、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで、アルギニンを含有するリン酸緩衝液によって溶出するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００，１０／３００ＧＬカラムで実施し、凝集及び夾雑を決定した（すなわち、１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ又は１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ）。クロマトグラフィープロフィールは、Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ１５０ＴＲフローシンチレーションアナライザーによって獲得した。
更に、放射性免疫コンジュゲートの放射能は、ガンマ計数によって測定し、製剤緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の可溶性についての情報を得た。この目的のため、製剤緩衝液中１／２０希釈から直接、５μｌを計数した。
結果：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３のＩＴＬＣ解析は、経時的に放射性免疫コンジュゲートから放射能の放出がほとんどないことを明らかにした。７日後、放射線標識した抗体の溶液は、９４％の放射純度を示した。放射線標識した抗体は、製剤緩衝液中４℃で保存した場合（表１３）、初期結合放射能の約４％を放出した（表１３）。１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３は、１９．１分で溶出し、その夾雑物（１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ及び１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ誘導体）は２８．６分で溶出した。０日目から７日目までＬＭＷ種のわずかな増加があったが、凝集の増加は検出されなかった（表１５）。７日後、投与溶液は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって９３％無傷の抗体を示した。したがって、ＳＥ－ＨＰＬＣの結果は、ＩＴＬＣの結果に依存した。経時的にモニターされた放射能は、ルテチウム－１７７の理論的な放射性崩壊と十分一致していた（表１４の括弧内の値）。
結論：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－コンジュゲートは、ＩＴＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによって試験した場合、７日まで、製剤緩衝液中で安定であった。
実施例１２：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－Ｃ００８３の安定性
材料及び方法：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性は、３７℃で、新しいマウス血漿（ヘパリンリチウムチューブによって調製）を使用して評価した。血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。血漿中での安定性は、ＩＴＬＣ（０．１Ｍクエン酸 ｐＨ５で溶出）、オートラジオグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって０日目、１日目、２日目、３日目及び７日目に評価した。
結果：３７℃で、マウス血漿中でのインキュベーションの７日後、放射能抗体の溶液は、約９６％の放射純度を示し、初期結合放射能の１％のみの放出に相当する（表１６）。放出された放射能は、ＩＴＬＣの結果によって示された１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３誘導体及び遊離１７７Ｌｕに相当した（図１５）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析は、血漿中でインキュベートした場合、放射線標識した抗体の顕著な分解を示さなかった（図１６）。更に、１７７Ｌｕの他の血漿タンパク質へのトランスキレートは観察されなかった（図１６）。
結論：血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の安定性は優れており、３７℃で、７日後に１％のみの１７７Ｌｕ活性が放出され、分解産物は存在しなかった。新しく設計した分子Ｃ００８３の疎水性の低減は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８と比較して、生じる１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３放射性免疫コンジュゲートの大きく増強された血漿安定性ももたらした（それぞれ、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３及び１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ０００８の７日後の初期結合放射能の１％及び２０％放出（実施例３））。
図１５は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性（オートラジオグラフィー）を示す：７日間、マウス血漿中でインキュベートした１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３のオートラジオグラム；１：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３誘導体及び遊離１７７Ｌｕ；２：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３。
図１６は、１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３の血漿安定性を示す（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）：マウス血漿中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３による還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（左：クマシー染色；右：オートラジオグラフィー）。レーン１：分子量標準；レーン２：緩衝液中の１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（Ｔ０）；レーン３：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中Ｔ０時間）；レーン４：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中１日）；レーン５：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中３日）；レーン６：１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｃ００８３（血漿中７日）。
実施例１３：Ｆｃサイレンシングを有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集特性及び低減された疎水性
疎水性及び凝集を評価するため、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８を、ＳＥＣカラムを使用するゲル濾過（ＳＥＣ）によって、及び対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８及びＦｃサイレンシングしていないそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって解析した。
ＳＥＣのため、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、室温で、１×ＰＢＳ中で実施した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。結果は、メインピークの保持容積（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けした。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）解析のため、全ての試料を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９を使用して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。抗体の高度に精製された試料（約１００μｇ）を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム上に独立してロードした。１００μｌの試料を注入し、カラム流速を２２℃で１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。ピークの分離は、０～１００％Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容積（ＣＶ）で実行した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。
結果：対照抗体Ｃ０００８は、サイズ排除カラムの総容量（約１５ｍｌ Ｅｎｒｉｃｈ ６５０）に近い保持容量を示し、それはヒトＩｇＧで予測されるよりもはるかに小さい分子量に相当する（図１８Ａ）。異常に長い保持は、主に、固定相表面との疎水性相互作用による。更に、高保持容量には、Ｃ０００８では、顕著な量のＩｇＧ二量体及び凝集体が存在した。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、分子量標準と比較した場合、単量体ヒトＩｇＧの分子量に相当する保持容量を示した（表１７、図１８Ａ）。更に、抗体二量体及び凝集は、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の試料中では著しく低減された（図１８Ａ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８のＦｃサイレンシング突然変異は、それぞれ、ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較して、それらのＳＥＣプロフィールを変更しなかった（図１８Ａ、及び実施例６からの図７Ｂ）。
ＨＩＣカラム保持容量は、疎水性の測定であり、低保持容量の抗体は、高保持容量の抗体よりも低疎水性である（図１８Ｂ）。新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、非常に高い疎水性を示す対照抗体Ｃ０００８（保持容量約２１ｍｌ）と比較して、低疎水性であることが示された（保持容量１５～１６ｍｌ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８のＦｃサイレンシング突然変異は、それぞれ、ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較して、それらのＨＩＣプロフィールを変更しなかった。
結論：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体が、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、改善された生化学特性、具体的には、低減された疎水性、及び凝集傾向を有することは、ＳＥＣ及びＨＩＣ解析から明らかである。
図１８は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計したＦｃサイレンシングされたＣ０１１５及びＣ０１１８の溶出プロフィールの比較（Ｂ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでのＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８並びにそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較。
実施例１４：固定化されたＭＩＦへの、ＤＦＯ＊へのコンジュゲーションあり及びなしの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の結合（ＫＤ決定）。
ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、ＤＦＯ＊コンジュゲーション（実施例１９に記載のＤＦＯ＊コンジュゲーション）あり及びなしの抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加した。最後に、結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。異なる実験からのデータが組み合わされる場合、データは、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する４パラメーターフィットによって決定した（２つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される）。
結果及び結論：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する、新しく設計した抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図１９に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合の参照として使用した。結合曲線及びＫＤを表す算出したＥＣ５０値は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８が、Ｃ０００８と比較して、ｏｘＭＩＦへのそれらの低ナノモルの親和性を保持したことを明確に示した（図１９Ａ、表１８）。更に、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８のＤＦＯ＊コンジュゲーションは、それらの親和性を変えなかった（図１９Ｂ）。これは、非コンジュゲート抗体によって得られたデータ、並びに、すなわちＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体によって得られたデータが、放射性免疫コンジュゲート、例えばＤＦＯ＊－Ｚｒ８９標識抗体へと直接変換されうる。
図１９は、固定化されたｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（ＫＤ決定）を示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８を参照抗体として使用した。
実施例１５：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の差次的結合
材料及び方法：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、Ｃ０１１５及びＣ０１１８の結合を実施例８に記載のように解析した。
結果及び結論：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の結合は、図２０に示される。結果は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しないことを明確に示した。Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、参照抗体Ｃ０００８と非常に類似したＯＤを示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。アイソタイプＩｇＧでは、結合は観察されなかった。したがって、低減された疎水性及び凝集並びにＦｃサイレンシングを有する新しく設計した抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別するそれらの能力を保持した。
図２０は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体の差次的結合を示す。Ｃ０００８を参照抗体として、アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。
実施例１６：Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞への、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の低減された非特異的結合
Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞株は、Ａ２７８０卵巣癌細胞株におけるヒトＭＩＦ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって生成した。手短に言えば、標的遺伝子配列を解析し、標的部位は、ＧｅｎＣＲＩＳＰＲ（商標）システムの標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計する通常の決まりに従って位置した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＭＩＦ遺伝子の５’領域（ＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧ、配列番号４８）を特異的に認識するように設計し、ｇＲＮＡ配列はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼを含有するＰＸ４５９（ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターにクローニングした。Ａ２７８０細胞は、エレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクトされ、限界希釈によって９６ウェルプレートにプレートし、同系単一クローンを生成した。内因性ＭＩＦ遺伝子が効果的に変異された同系単一クローンは、結果としてＭＩＦタンパク質の発現の低減（又は除去）を生じ、サンガーシークエンシングスクリーニングによって同定された。最終クローンは、ヒトＭＩＦ遺伝子の開始コドン後＋２の位置に１０ｂｐの欠失を示した。Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞株における内因性ヒトＭＩＦタンパク質の不在は、ポリクローナル抗ヒトＭＩＦ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって確認した。
Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ＃２５－０５６－Ｃ１）によって剥がし、染色緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）によって洗浄し、９６ウェルのＵ底プレートにウェル当たり２×１０５個の細胞をプレートした。細胞を、固定可能な生死判定色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＰＢＳ中で１：２０００希釈）によって４℃で２０分間染色し、染色緩衝液によって洗浄した。細胞を、５０μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、５０μｌの段階希釈の新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ Ｆｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８又はそれぞれ、それらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０、又は対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８若しくはアイソタイプＩｇＧ（最終濃度３７ｎＭ～９．４ｎＭ）を添加した。４℃で４０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、１００μｌの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、１：１００希釈）中に再懸濁した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ－Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で獲得した。
データは、ＦｌｏｗＪｏによって解析し、生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで抗体濃度に対してプロットした。
結果及び結論：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１８及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）は、それらのＧｅｏＭｅａｎがアイソタイプＩｇＧ陰性対照のものに非常に近いため、Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞に結合しないことが図２１Ａ及びＢから明らかである。反対に、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、Ａ２７８０ＭＩＦ－／－細胞に顕著な結合を示したが、それらはＭＩＦを発現しないことが分かった。したがって、疎水性の低減は、Ａ２７８０ＭＩＦ－／－への、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の非特異的結合の強い低減又は除去をもたらしたが、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８は、その疎水性により細胞表面に非特異的に結合する。
図２１は、ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ＭＩＦ－／－細胞への新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す。新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１５及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）並びに対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧによるＡ２７８０ＭＩＦ－／－細胞の染色；生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。
実施例１７：レポーターアッセイによって決定された新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣエフェクター機能
上記のように、Ｆｃ部分の点突然変異、すなわちＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａにより抗体のＡＤＣＣ能を減少させる努力がなされた。標的結合抗体のＦｃ部分が、エフェクター細胞の細胞表面上のＦｃ受容体に結合する場合、２つの細胞型の複数の架橋が生じ、ＡＤＣＣの経路活性化をもたらし、機能性Ｆｃ関連有害事象を防ぐ標的中和抗体に望まれない。
エフェクター細胞として、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ受容体、Ｖ１５８（高親和性アロタイプ）を安定に発現する操作したジャーカット細胞、及びホタルルシフェラーゼのＮＦＡＴ応答エレメント駆動発現を使用して、抗体の生物学的ＡＤＣＣ活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されたルシフェラーゼにより定量した。
ＡＤＣＣレポーターアッセイは、基本的に製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＃Ｇ７０１０）によって推奨されるように実施した。
高応答性の標的細胞を生成するため、ＨＣＴ１１６細胞を、ｈｕＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってトランスフェクトし、ジェネテシンによって選択し、ＦＡＣＳによってソートして膜係留単量体ヒトＭＩＦを安定に発現する細胞株（ＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ）を生成し、即ちＭＩＦは、ｏｘＭＩＦエピトープが抗ｏｘＭＩＦ抗体に接近可能である単量体タンパク質として提示される（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。この細胞株は、細胞表面でのｏｘＭＩＦの提示の増加を示し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のための感度のよいツールである。
手短に言えば、１００μｌのアッセイ培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ及び４％低ＩｇＧ ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ１６４０培地）中の１×１０４個の細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を９６ウェル平底白色プレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ２で終夜接着させた。翌日、培地を、２５μｌの新しいアッセイ培地と交換した。２５μｌの段階希釈のサイレンシングされたＦｃを有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８又はそれらの親抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０（最終濃度０．０１～１００ｎＭ）及び２５μｌの新しく融解したエフェクター細胞（高応答性遺伝子型Ｖ１５８のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体エフェクター細胞）を、約６：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートに添加した。加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、アッセイプレートを室温に平衡化し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加した。Ｔｅｃａｎマルチプレートリーダーを使用して、１０～２０分のインキュベーション後に発光（ＲＬＵ）を測定した（０．５ｓ積算時間）。
結果：Ｆｃサイレンシング突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてエフェクター細胞のいずれの活性化も示さなかったが、ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体、Ｃ００８３及びＣ００９０は、エフェクター細胞の強いＦｃｙＲＩＩＩＡ媒介活性化を誘導したことが、図２２から証明された。
結論：Ｆｃサイレンシング突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を持つ新しく設計した変異体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、レポーターバイオアッセイにおいてＡＤＣＣのいずれの開始も示さなかった。したがって、それらは、強く低減されたＡＤＣＣエフェクター機能を示した。
図２２は、レポーターアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣエフェクター機能を示す。ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した、ＦｃｙＲＩＩＩＡを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ。平均及びＳＥＭを示す（ｎ＝２）。
実施例１８：ＨＣＴ１１６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスヌードマウスにおける新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び対照抗体Ｃ０００８の生体内分布
材料及び方法：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の生体内分布は、ヒト大腸腺腫細胞株ＨＣＴ１１６異種移植マウスモデルにおける参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８とのｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ比較で調べた。雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスは、全注射容積１００μｌの５０％ＰＢＳ及び５０％マトリゲル中５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞の皮下注射を片側に受けた。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１１５及びＣ０００８の単回静脈内投与を受けた。
Ｃ０１１５及びＣ０００８は、製造業者の説明書に従ってＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット－高ＭＷを使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識抗体のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１、６～８、２４、４８、７２、９６、１６８時間での標識抗体の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した。画像解析を実施し、腫瘍における抗体の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を定量した（ＲＦＵ／面積＝ＲＦＵ腫瘍面積／ｍｍ２腫瘍面積－ＲＦＵバックグラウンド／ｍｍ２バックグラウンド面積）。
結果及び結論：図２３は、７日までの腫瘍保持により、それぞれ、静脈内投与したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１１５及びＣ０００８の、顕著な腫瘍内分布を示す。約２４時間でピークを示した参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の腫瘍取り込みは７日にわたり強く増強及び増加されることが、図２３Ａ及び定量画像解析（図２３Ｂ）から明らかである。したがって、生体内分布研究は、放射性免疫コンジュゲートとしての適用のため、Ｃ０００８と比較してＣ０１１５の優位性を示唆した。
図２３は、皮下ＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦＦｃサイレンシング抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持を示す。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体Ｃ０１１５（上のパネル）及びＣ０００８（下のパネル）の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；（Ｂ）デジタル画像解析によって定量されたＣ０１１５及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。
実施例１９：ＣＴ２６又はＨＣＴ１１６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃ又はＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、ＤＦＯ＊にコンジュゲートし、８９Ｚｒによって放射線標識した、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の生体内分布
材料及び方法：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１５及び８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１８の生体内分布は、ヒト大腸腺腫細胞株ＨＣＴ１１６異種移植及びマウス大腸腺腫細胞株ＣＴ２６同系移植マウスモデルを使用することによって調べた。
抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、二機能性キレート剤ＤＦＯ＊－ＮＣＳ（ＡＢＸ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ＧｍｂＨ）とコンジュゲートした。抗体の緩衝液は、０．９％ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９（５．０ｍｇ／ｍＬ）へと交換した。その後、抗体を、ＤＭＳＯ中３モル当量（過剰）のＤＦＯ＊－ＮＣＳ（１ｍｇ／ｍＬ）と、３７℃で４５分反応させた。反応後、抗体は、ＨｉＴｒａｐカラム（脱塩カラム、ＧＥ１７－１４０８－０１、５ｍｌ）で精製した。精製中、緩衝液は、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＤＰＢＳへと交換した。
ＤＦＯ＊－Ａｂの放射線標識は、８９Ｚｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）によって実施した。まず、およそ１００ＭＢｑの８９Ｚｒ（１Ｍシュウ酸中）を、１８０μｌの２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３溶液と混合し、室温（ＲＴ）で３分間反応させた。８９Ｚｒ溶液を、１ｍｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）によってｐＨ７に中和し、２ｍｇのＤＦＯ＊－抗体を混合物に添加し、室温で６０分反応させた。放射線標識抗体は、遠心分離フィルターによって精製し、緩衝液を、５０ｍＭアルギニンを含む０．０１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ６．５に交換した。放射線化学純度（ＲＣＰ）は、溶出液として０．０５Ｍ ＤＴＰＡを使用するｉＴＬＣ、並びにＵＶ検出器（２８０ｎｍ）、Ｐｏｓｉｒａｍ ｒａｄｉｏｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｌａｂｌｏｇｉｃ社）、サイズ排除カラムＳＥＣ－２０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、３０℃に設定）、及び移動相として０．１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を有する放射性－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ社 ｉｎｆｉｎｉｔｙＩＩ、１２６０）により、放射線標識後に直接解析した。
雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスは、全注射容積１００μｌの５０％ＰＢＳ及び５０％マトリゲル中５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞の皮下注射を片側に受けた。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、１００μｌのＰＢＳ中３×１０５個のＣＴ２６細胞の皮下注射を片側に受けた。個々の腫瘍容積が１５０～２５０ｍｍ３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、１０～１１ＭＢｑの８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１５及び８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１８抗体の単回静脈内投与を受けた。放射能用量は、相互検定投与量キャリブレーター（ＶＤＣ－４０５、Ｖｅｅｎｓｔｒａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）により、投与前後にシリンジを測定することによって決定した。
動物は、イソフルランによって麻酔し、ＢｉｏＰＥＴ小動物ＰＥＴ／ＣＴ（Ｓｅｄｅｃａｌ社、Ｍａｄｒｉｄ Ｓｐａｉｎ）による注射の４日、７日又は１０日後に全身ＰＥＴスキャン（６０分）を実施した後、解剖参照のためＣＴ画像を得た。画像は、ＣＴベースの減衰補正を有する２ＤＯＳＥＭアルゴリズムによって再構築した。画像解析は、ＰＭＯＤソフトウェアによって実施した（ｖ３．７、ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
結果及び結論：両抗体は、うまくＤＦＯ＊改変され、ｏｘＭＩＦに対するそれらの親和性を保持した（図１９Ｂ）。８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１５は、およそ８０％の放射線化学収率で合成し、１９．７ＭＢｑ／ｍｇの比放射能を算出した。注射した放射能は、１１．０±０．５ＭＢｑ（平均±ＳＤ，ｎ＝６）であり、注射した質量は、０．５６±０．０３ｍｇ（平均±ＳＤ、ｎ＝６）であった。８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊－Ｃ０１１８は、およそ７２％の放射線化学収率で合成し、５４．０ＭＢｑ／ｍｇの比放射能を算出した。注射した放射能は、１１．０±０．２ＭＢｑ（平均±ＳＤ，ｎ＝６）であり、注射した質量は、０．２０±０．０１ｍｇ（平均±ＳＤ、ｎ＝６）であった。新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は両方とも、両動物モデルの腫瘍に蓄積し、少なくとも１０日間腫瘍に保持されることは、図２４から明らかである。したがって、生体内分布研究は、診断用放射性免疫コンジュゲートとしての適用のため、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の好適性を示唆した。
図２４は、皮下ＣＴ２６又はＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＰＥＴ／ＣＴ画像化によって、ＤＦＯ＊にコンジュゲートし、８９Ｚｒによって放射線標識した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の腫瘍浸透及び保持を示す。マウスのＰＥＴ及びＣＴ画像は、マウス当たり約１０ＭＢｑで投与した８９Ｚｒ－ＤＦＯ＊標識抗体の注射後４日、７日及び１０日で撮られた；マウスの代表的なデジタル縦断面図を示し、白い矢印は腫瘍をマークする。
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Claims (23)

  1. 組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を含む放射性免疫コンジュゲートであって、
    （ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号３２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
    （ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号３２を含み、
    － ３６位に保存されたチロシン、及び
    － アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
    （ｂ１）配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン；又は
    （ｂ２）配列番号２９及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
    （ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号２９を含む重鎖可変ドメイン
    を含み、
    ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
    前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号３２及び配列番号２９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、放射性免疫コンジュゲート。
  2. 軽鎖可変ドメインがアミノ酸置換Ｗ９３Ｆを含み、重鎖可変領域がアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む、請求項１に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  3. 放射性同位体が、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｔｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、２２７Ｔｈ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、及び２２７Ｔｈからなる群から選択され、具体的には、放射性同位体は、６７Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  4. 位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ｌ３２８、又はＰ３２９のいずれか１つに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号３７を有する野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合の減少を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  5. 位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３５のいずれか１つに１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ１定常ドメインのＦｃ変異体ドメインを含み、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む放射性免疫コンジュゲートと比較して、ヒトＦｃＲｎに対する親和性の低減を示す、請求項１～４のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  6. 配列番号３１、３３、３４、３５、及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  7. 配列番号３７、３８、３９、及び４０のいずれか１つと組み合わせて、配列番号２９及び３４；配列番号３０及び３３、配列番号３０及び３４、配列番号３１及び３４、配列番号３１及び３６、又は配列番号３１及び３３を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  8. ＩｇＧ、ＩｇＧ融合タンパク質、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、ディアボディ、ディアボディ融合タンパク質、Ｆａｂ、Ｆａｂ融合タンパク質、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｃａｂ、Ｆｃａｂ融合タンパク質、２つ以上の単鎖抗体の融合タンパク質、ミニボディ、及び小免疫タンパク質（ＳＩＰ）フォーマットからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  9. 具体的には、ＤＯＴＡ、デフェロキサミンＢ（ＤＦＯ）及びＤＦＯ＊の群から選択される、キレート基を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  10. 医薬の調製における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  11. 場合により医薬担体又はアジュバントと共に、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートを含み、具体的には、静脈内投与のために製剤化される、医薬組成物。
  12. 癌を患う患者の治療、具体的には、腫瘍、具体的には、血液癌又は固形腫瘍の治療における、より具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、及び肺癌の治療への使用のための、請求項１０若しくは１１に記載の医薬組成物又は請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート。
  13. 請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートの、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む発現ベクター。
  15. 請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
  16. 請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートを産生するための方法であって、宿主細胞において抗ｏｘＭＩＦ抗体をコードする核酸を発現する工程、及び放射性同位体によって前記抗体を更に標識する工程を含む方法。
  17. 対象の癌におけるｏｘＭＩＦレベルの検出のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートの使用。
  18. 対象における癌の診断のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートの使用。
  19. 対象における癌をｉｎ ｖｉｖｏで診断するための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートが、腫瘍細胞を検出するために使用される、方法。
  20. 癌をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートが、試料中の腫瘍細胞を検出するために使用される、方法。
  21. 請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲートの産生のためのキットであって、２つ以上のバイアルを含み、１つのバイアルが、抗ｏｘＭＩＦ抗体に結合したキレート剤を含むコンジュゲートを含有し、２つ目のバイアルが、具体的には１７７Ｌｕ及び８９Ｚｒから選択される放射性同位体を含有し、１つ又はいくつかのバイアルの内容物が、場合により凍結乾燥されるか又は溶液中にある、キット。
  22. １つ又はいくつかのバイアルの内容物が凍結乾燥されるか又は溶液中にある、請求項２１に記載のキット。
  23. 請求項１～９のいずれか一項に記載の放射性免疫コンジュゲート、又は請求項１１に記載の医薬組成物を使用して癌を治療するための方法。
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