KR20240050375A - 감소된 응집 가능성과 감소된 소수성을 갖는 개선된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 선택된 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성과 같은 개선된 특성을 갖는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체, 및 oxMIF 관련 질환의 치료에서의 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

감소된 응집 가능성과 감소된 소수성을 갖는 개선된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체
본 발명은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 선택된 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성과 같은 개선된 특성을 갖는 Fc 침묵형(silenced) 항-oxMIF 항체, 및 oxMIF 관련 질환의 치료에서의 그들의 용도에 관한 것이다.
사이토카인 대식세포 이동 억제 인자(MIF)는 1966년 초에 기재되었다(David, J.R., 1966; Bloom B.R. and Bennet, B., 1966). MIF의 생화학적 특성과 생리학적 역할은 그의 클로닝 및 재조합 발현에 따라 밝혀졌다(Bernhagen et al., 1993; Bernhagen et al., 1994). 이제, MIF가 선천성 면역의 중추적인 조절자로서 염증 반응과 암에서 중심적인 역할을 한다는 것은 충분히 허용되고 있다. MIF는 TNF(Calandra et al., 1994), 산화질소(Bernhagen et al., 1994) 및 프로스타글란딘 E2(Mitchell et al., 1999; Sampey et al., 2001)와 같은 다른 전염증 매개체의 생산을 촉진한다. 가장 눈에 띄는 특성 중 하나는 글루코코르티코이드(GC)의 면역 억제 효과를 무효화하는 능력이다. 시험관내에서, MIF는 단핵구(TNF, IL-1, IL-6 및 IL-8)(Calandra et al., 1995) 및 T 세포(Bacher et al., 1996)에서 사이토카인 분비의 GC 유도 억제를 방해하고, 섬유아세포에서 TNF 유도 아라키돈산 방출의 덱사메타손 억제를 무시한다(Mitchell et al., 1999). 생체내 연구는, MIF가 덱사메타손으로 치료된 내독소증 마우스의 사망률을 증가시킴을 나타냈다(Calandra et al., 1995). MIF 혈청 수준의 상향 조절과 질환과의 연관성에 대한 가장 상세한 데이터는 중증 패혈증(severe sepsis) 환자에서 기재되었다(Emonts et al., 2007; Bozza et al., 2004; Sprong et al., 2007). 혈장 MIF 수준은 질환 중증도 및 쇼크 상태와 상관관계가 있으며, 생존 환자보다 사망한 환자에서 상당히 더 높았다. MIF 농도는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 및 코티솔의 혈장 농도 상승과 유의하게 상관관계가 있었다. 환자에서 MIF 수준의 상승이 또한 수많은 염증성 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)(Onodera et al., 1999; Morand et al., 2002), 크론병(Crohn's disease)(de Jong et al., 2001), 건선(psoriasis)(Shimizu et al., 2001) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)(Niino et al., 2000; Rinta et al., 2008)에 대해 결정되었다.
MIF는 또한 p53 의존성 세포 사멸을 억제하고 단핵구와 대식세포의 생존을 자극하여 염증 과정의 유지에 기여한다(Mitchell et al., 2002).
염증이 여러 유형의 암과 밀접하게 관련되어 있음을 시사하는 증거가 늘어나고 있다. 감염과 손상을 방어하도록 설계된 염증 경로는 종양 성장과 전이를 촉진하는 환경을 촉진할 수 있다(Conroy et al., 2010). 따라서, 염증은 종양 발생의 핵심 동인인 것으로 시사되며, 많은 암이 감염이나 만성 염증의 결과로 발생한다(Bucala and Donnelly, 2007; Conroy et al., 2010; Karin, 2009). 또한, 종양 미세환경의 염증 특성이 혈관신생 및 세포외 매트릭스(ECM)의 파괴를 촉진하고, 이는 결국 종양 세포의 생존, 증식 및 이동에 기여한다는 것이 잘 확립되어 있다(Coussens and Werb, 2002; Hagemann and Balkwill, 2005; Hagemann et al., 2007; Kessenbrock et al., 2010). MIF는 췌장, 유방, 전립선, 결장, 뇌, 피부 및 폐 유래 종양과 같은 다양한 인간 신생물에서 상향 조절되는 것으로 나타났다(Bando et al., 2002; Chen et al., 2010; Kamimura et al., 2000; Meyer-Siegler and Hudson, 1996; Shimizu et al., 1999; Takahashi et al., 1998; Winner et al., 2007). 여러 연구는 MIF 발현이 종양 공격성 및 전이 가능성과 밀접한 상관관계가 있으며, 이는 MIF가 질환 중증도 및 세포 생존에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다고 보고한다(Rendon et al., 2009). 최근 데이터는 세포외 MIF가 세포내 MIF에 비해 더 공격적인 종양 표현형에 기여할 수 있음을 시사한다(Verjans et al., 2009). MIF는 종양 성장, 혈관신생, 침습성 및 전이를 선호하는 미세환경에 기여한다. MIF는 전염증 기능 외에도 p53의 억제(Hudson et al., 1999; Mitchell and Bucala, 2000) 및 중앙 키나제 ERK1/2(Mitchell et al., 1999) 및 AKT(Lue et al., 2007)의 활성화를 포함한 항아폽토시스 및 증식 촉진 효과를 발휘한다. MIF는 또한 HIF-1α(Winner et al., 2007)를 안정화하고 VEGF 및 IL-8(Ren et al., 2004)과 같은 혈관신생 촉진 인자의 상향 조절에 의해 신생 혈관신생(Coleman et al., 2008) 및 종양 혈관 형성을 촉진하는 혈관신생 촉진 인자로 기재되었다. MIF는 또한 케모카인으로 작용하며, 케모카인 수용체 CXCR2 및 CXCR4를 통해 종양 환경 내에서 염증 세포 모집에 기여할 것으로 예상된다(Bernhagen et al., 2007; Rendon et al., 2007).
그러나, MIF는 건강한 대상체의 순환에서 구성적으로 발현되고 존재하기 때문에 다른 사이토카인 및 케모카인과는 현저히 다르다. 미리 형성된 MIF는 대식세포, T-세포, 및 시상하부-뇌하수체-부신 축을 포함한 신체 내 기타 여러 세포의 세포질 풀에 저장되어 새로운 합성 없이 자극시 신속한 방출을 허용한다(Bernhagen et al., 1993; Bacher et al., 1997; Fingerle-Rowson et al., 2003).　
이 단백질의 유비쿼터스 특성으로 인해, MIF는 치료적 개입에 부적절한 표적으로 간주될 수 있다. 그러나, MIF는 환원된 MIF(redMIF)와 산화된 MIF(oxMIF)라고 지칭되는 두 개의 면역학적으로 별개의 구조적 이소형으로 발생한다(Thiele M. et al., 2015). RedMIF는 세포질과 임의의 대상체의 순환에서 발견될 수 있는 MIF의 풍부하게 발현되는 이소형인 것으로 밝혀졌다. RedMIF는 잠재적 비활성 저장 형태를 나타내는 것으로 보인다(Schinagl. A. et al., 2018).
대조적으로, oxMIF는 종양 조직, 구체적으로 oxMIF의 높은 종양 특이성을 요약하는 결장직장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 폐암(lung cancer) 환자의 종양 조직(Schinagl. A. et al., 2016)뿐만 아니라 염증성 질환 환자의 순환 및 염증 조직에서(Thiele et al., 2015) 검출될 수 있는 생리학적 관련성 및 질환 관련 이소형인 것으로 보인다.　
상기 언급된 oxMIF 양성 적응증과 같이 암을 치료하기 위한 성공적인 약물 표적의 수는 제한되어 있다. 예를 들어, 300개 이상의 잠재적인 면역-종양학 표적이 기재되어 있지만, 많은 임상 연구는 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체에 초점을 맞추고 있다(Tang J., et al. 2018). 따라서, 과학계 및 의료계는 예후가 좋지 않은 암 환자의 치료 옵션을 늘리기 위해 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 잠재적인 약물을 간절히 기다리고 있다.
또한, 염증성 질환을 표적으로 하는 약물에 대한 수요도 높다. 글루코코르티코이드(GC)는 일상적인 임상 실습에서 가장 중요하고 자주 사용되는 부류의 항염증성 약물이다(Schacke et al., 2002). GC의 유용성은 주로 염증 세포의 모집을 감소시키고 전염증성 사이토카인 및 매개체 합성을 억제하여 여러 수준에서 염증 캐스케이드를 효과적으로 차단하는 능력과 관련이 있다(Barnes et al., 2003). 경구 GC 사용의 유병률은 일반 인구의 0.5%, 55세 이상 인구의 1.4%로 추정되었다(Ramsey-Goldman, 2002; Walsh et al., 1996). GC는 분명히 유익한 것으로 간주되지만, 상당한 용량 의존적이고 종종 돌이킬 수 없는 부작용이 인식되어 사용이 제한된다(Pisu et al., 2005). 가장 우려되는 부작용으로는 고혈압(hypertension), 비만(obesity), 골다공증(osteoporosis), 근육병증(myopathy), 부종(oedema) 및 면역 손상(immune compromise)이 있다. 죽상경화증(atherosclerosis)과 관련된 조기 사망은 RA 및 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)를 포함한 염증성 질환에서도 점점 더 인식되고 있다(Wallberg-Jonsson et al., 2005; del Rincon et al., 2001; Solomon et al., 2003; El-Magadmi et al., 2004; Manzi et al., 1999). GC의 상당한 독성 부담은 염증성 질환에 대한 GC의 작용을 촉진하고 용량감소를 가능하게 하는 요법의 개발을 필요로 한다. 그러나, 이는 GC 민감도를 조절하는 인자에 대한 설명을 필요로 한다. 2000년대 초, 사이토카인 대식세포 이동 억제 인자(MIF)와 GC 사이의 독특한 관계가 밝혀져 MIF가 GC 민감도를 조절할 수 있는 후보 인자로 식별되었다(Aeberli et al., 2006).
oxMIF를 표적으로 하는 항체는 염증과 암의 시험관내 및 생체내 모델에서 효능을 보였다(Hussain F. et al., 2013; Schinagl. A. et al., 2016; Thiele et al., 2015).
WO2019/234241A1은 항-oxMIF/항-CD3 이중특이적 항체(bispecific antibody)를 개시한다.
WO2009/086920A1은 항-oxMIF 항체 Bax69(이말루맙)를 기재한다.
단백질 응집, 구체적으로 항체 응집은 단백질 발현, 정제 및 저장을 포함한 여러 단계의 생물공정에서 자주 관찰된다. 항체 응집은 치료용 단백질 제조 공정의 전반적인 수율에 영향을 미칠 수 있으며, 치료용 항체의 안정성 및 면역원성에 기여할 수 있다.
따라서, 항체의 단백질 응집은 개발 가능성에 있어서 계속 중요한 문제가 되고 있으며 항체 생산에서 주요 관심 분야로 남아 있다. 항체 응집은 도메인의 부분적인 전개에 의해 촉발될 수 있으며, 단량체-단량체 결합에 이어 핵 형성 및 응집체 성장으로 이어진다. 항체와 항체 기반 단백질의 응집 성향은 외부 실험 조건의 영향을 받을 수 있지만, 그들은 서열과 구조에 의해 결정되는 고유 항체 특성에 크게 의존한다.　
예를 들어, 응집에 대한 저항성은 천연 상태를 안정화(즉, 전개에 저항)하거나 단백질의 전개 상태 또는 부분적으로 접힌 상태의 응집 성향을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 천연 상태를 안정화할 때의 단점은 단백질이 전개될 환경에 노출될 가능성이 높다는 것이다. 일반적으로, 단백질이 변성되거나 전개되면, 일반적으로 단백질 내부에서 분자내 접촉을 매개하는 아미노산 잔기가 노출된다. 이러한 노출은 종종 단백질이 분자 간 접촉을 형성하고 응집하기 쉽게 만든다. 전개에 저항하는 단백질과 대조적으로, 전개되었을 때 응집되는 경향이 감소된 단백질은 이러한 환경에 노출 후 단순히 생리활성 비응집 상태로 재접힐 것이다.
항체 및 이의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질의 응집 저항성 또는 응집 성향은 일반적으로 그 안에 함유된 가장 응집하기 쉬운 도메인(들) 및 주변 도메인(존재하는 경우)과의 그의 상호 작용 강도에 의해 제한된다.
이는 해당 도메인이 일단 전개되면 재접힘이 불가능한 경우 동일한 단백질 또는 다른 단백질 중 다른 도메인과 상호 작용하여 응집체를 형성할 수 있기 때문이다. 항체의 불변 도메인은 일반적으로 응집되지 않으며 크게 변하지 않는다. 따라서, 응집 가능성 및 안정성과 관련하여 항체의 가장 약한 도메인은 일반적으로 가변 도메인(예: 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인(VL), Ewert S. et al., 2003)으로 간주된다. 이와 관련하여, 응집하기 쉬운 VH 또는 VL 도메인을 달리 안정한 재조합 항체 산물에 혼입하면 종종 새로운 재조합 설계에 이러한 일반적으로 바람직하지 않은 특성을 부여한다. 따라서, 가변 도메인을 응집 저항성이도록 조작하면 해당 가변 도메인을 포함할 수 있는 전체 단백질을 응집 저항성으로 만들 가능성이 높다. 가변 도메인의 응집을 감소시키기 위한 다양한 전략, 예를 들어, 응집 저항성 단백질의 합리적 설계, 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅 또는 이황화 결합의 가변 도메인으로의 도입이 제안되었다. 응집 저항성 단백질의 합리적 설계는 일반적으로 인실리코 분석을 사용하여 단백질의 응집 성향에 대한 점 돌연변이의 효과를 예측하는 것을 포함한다. 그러나, 이 접근법에는 몇 가지 어려움이 있다. 예를 들어, 단순히 전개될 단백질의 응집을 감소시킬 가능성이 있는 돌연변이를 식별하는 것만으로는 충분하지 않다. 오히려, 돌연변이는 접힌 단백질의 응집을 증가시키지 않아야 하거나 접힌 단백질의 기능, 특히 항체의 경우 친화도 또는 특이성과 같은 결합 특성에 영향을 미치지 않아야 한다. 또한, 합리적인 설계는 개선하고자 하는 특정 단백질에 대한 상세한 구조 분석을 필요로 하고, 따라서 철저하게 특성화되지 않은 단백질과 함께 사용하기 어렵고, 다양한 상이한 단백질에 쉽게 적용할 수 없다. CDR 그래프팅은 한 가변 도메인의 CDR을 또 다른 가변 도메인의 프레임워크 영역(FR)에 이식하는 것을 포함한다. 이 전략은 항-EGP-2 scFv를 안정화시키는 데 유용한 것으로 나타났다(Willuda J. et al., 1999). 이 접근법의 단점은 CDR 그래프팅 후 발생할 수 있는 친화도의 감소를 포함한다. 이러한 친화도 손실은 FR에 돌연변이를 도입함으로써 극복할 수 있지만, 이러한 돌연변이는 단백질에서 면역원성 에피토프(epitope)를 생성하여 치료 관점에서 단백질을 바람직하지 않게 만들 수 있다. 또한, CDR 그래프팅은 일반적으로 그래프팅에 대한 적합성을 평가하기 위해 공여체 및 수용체 가변 도메인의 결정 구조 또는 상동성 모델링의 분석을 필요로 한다. 이러한 접근법은 힘들고 전문 지식을 필요로 한다. 또한, 각 가변 도메인이 상이한 구조를 갖기 때문에, 상기 방법은 다양한 분자에 걸쳐 쉽게 적용되지 않는다. 가변 도메인에 이황화 결합을 도입하는 방법과 관련하여, 결합은 단백질이 올바르게 재접히는 데 도움이 될 수 있지만, 가변 도메인에 강성을 도입하기도 한다. 이러한 강성은 항원에 대한 항체의 친화도를 감소시킬 수 있다. 또한, 모든 가변 도메인이 친화도의 손실 없이 또는 면역원성 에피토프를 도입하지 않고 이황화 결합 형성에 필요한 시스테인 잔기의 도입을 지원할 수 있는 것은 아니다. 또한, 높은 단백질 농도하에 이황화 결합이 형성되면 단백질 응집으로 이어져 결합의 임의의 잠재적인 긍정적 효과를 무효화할 수 있다.
그러나, 응집 성향의 감소는 발현 역가의 증가를 동반하는 것으로 나타났으며, 이는 단백질 응집을 감소시키는 것이 개발 과정 전반에 걸쳐 유익하며 임상 연구에 대한 보다 효율적인 경로로 이어질 수 있음을 보여준다. 치료용 단백질의 경우, 응집체는 환자의 유해한 면역 반응에 대한 중요한 위험 요소이며, 다양한 메커니즘을 통해 형성될 수 있다. 응집을 제어하면 단백질 안정성, 제조 가능성, 마모율, 안전성, 제형, 역가, 면역원성 및 용해도를 향상시킬 수 있다(Wei Li et al., 2016; Van der Kant R. et al., 2017).
소수성과 같은 단백질의 추가 고유 특성도 항체 용해도에 중요한 역할을 한다. 표면 소수성으로 인한 이러한 치료용 단백질의 낮은 용해도는 제형 개발을 더 어렵게 만들고 생체내에서 불량한 생체분포, 바람직하지 않은 약동학 거동 및 면역원성으로 이어질 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 후보 모노클로날 항체의 전체 표면 소수성을 감소시키면 정제 및 투여 섭생과 관련된 이점과 비용 절감을 제공할 수 있다.
특정 치료 목적에 맞게 항체 이펙터 기능을 조절하는 것도 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 구체적으로, FcγR을 통한 강력한 면역 이펙터 기능과 보체 상호 작용이 때때로 항체 메커니즘에 해로울 수 있으므로 Fc-null 또는 Fc 침묵형 항체는 Fc 이펙터 기능을 무력화하는 전략일 수 있다. 마찬가지로, 약동학을 조절하기 위해 IgG 항체의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합을 조절하는 것도 악명이 높아졌다.　
문헌[Strohl W.R. et al. (2012)]은 IgG 동형의 FcγR 매개 활성을 증가시키거나 감소시키는 항체 Fc 조작을 기재한다.
WO2017/178493A1은 Fc 침묵을 위한 변형된 CH1-CH3 도메인을 포함하는 TIM-3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 3)을 표적으로 하는 항체를 기재한다. 감소된 응집 가능성, 감소된 소수성 및 Fc 침묵의 조합은 항체 특성을 매우 유리하게 만들 것이다. 당해 기술 분야에는 소수성이 감소된 oxMIF에 대한 Fc 침묵형 및 응집 저항성 항체에 대한 여전히 충족되지 않은 요구가 존재한다.　
본 발명의 목적은 침묵된 Fc를 가지며 감소된 응집 성향 및 소수성을 갖는 oxMIF를 표적으로 하는 개선된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.　
이 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.
본 발명은
하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형(glycosylation modification)이 있는 서열번호 1(CH2-CH3) 또는, 대안으로서, 서열번호 44(CH1-CH3)를 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역, 및 다음 가변 도메인:
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는　
(a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는　
(b2) 서열번호 3 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
여기서, 아미노산 위치가 카바트(Kabat)에 따라 넘버링(numbering)되고,
상기 변이체 Fc 영역이 야생형 IgG1 Fc 영역에 비해 감소된 FcγR 결합을 나타내고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 아미노산 치환이 결여된 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 비해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개시한다.
구체적으로, 재조합 항-oxMIF 항체는 서열번호 2를 참조하여 아미노산 치환 W93F를 포함한다.
구체적으로, 재조합 항-oxMIF 항체는 서열번호 3을 참조하여 아미노산 치환 W97Y를 포함한다.
추가의 구체적인 구현예에 따르면, 재조합 항-oxMIF 항체는 아미노산 치환 W93F 및 W97Y를 포함한다.
본원에 기재된 특정 구현예에 따르면, Fc 영역의 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따라 서열번호 1의 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, D265, S267, H268, N297, S298, T299, E318, L328, P329, A330, P331 중 어느 하나에 있다.
대안적인 구현예에 따르면, Fc 영역은 비글리코실화(aglycosylating)된다.
보다 구체적으로, Fc 영역의 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따라 서열번호 1의 위치 L234 및 L235, 구체적으로 L234A 및 L235A에 있다.
본원에 구체적으로 제공된 것은 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 43 및 85로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체이다.
보다 구체적으로, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는
i.) 서열번호 3 및 6,
ii.) 서열번호 9 및 6,
iii.) 서열번호 4 및 6,
iv.) 서열번호 4 및 8,
v.) 서열번호 4 및 5, 또는
vi.) 서열번호 43, 및 서열번호 5, 6, 7 또는 8 중 하나의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
구현예에 따르면, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 서열번호 14의 CH1 내지 CH3 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항-oxMIF 항체는 서열번호 15 및 16 또는 17로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 구현예에 따르면, 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형을 갖는 서열번호 1을 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역을 포함하고,
서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
서열번호 74 또는 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열, 및　
서열번호 75로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열 및　
서열번호 76 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
서열번호 77 또는 84로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함하고,
단, 서열번호 74와 서열번호 77은 함께 포함되지 않는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
대안적인 구현예에서, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는
서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
서열번호 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열, 및　
서열번호 75로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열 및　
서열번호 76 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
서열번호 77 또는 84로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함한다.　
대안적인 구현예에서, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는
서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
서열번호 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열, 및　
서열번호 75로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열 및　
서열번호 76 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
서열번호 84로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함한다.
대안적인 구현예에서, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는
서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
서열번호 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열 및　
서열번호 75 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 76 또는 84로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
서열번호 85로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 서열번호 1의 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, I253, D265, S267, H268, N297, S298, T299, H310, E318, L328, P329, A330, P331, H435 중 어느 하나에 아미노산 치환을 갖고, 구체적으로 아미노산 치환은 EU 넘버링 지수에 따라 위치 L234 및 L235, 구체적으로 위치 L234, L235, H310 및 H435, 및/또는 비글리코실화되는 Fc 영역에 있다.
본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 CH2 및 CH3 항체 도메인을 함유하는 임의의 포맷일 수 있으며, 구체적으로 이는 단일특이적, 이중특이적 항체(예: 크로스맵), scFv-Fc, (scFv)2-Fc(두 개의 scFv 단편이 하나의 암에 포함된다), scFv/scFv-Fc(즉, 각 암은 scFv 단편을 포함한다), Fab/scFv-Fc, Fab/(scFv)2-Fc, Fab/Fab-scFv-Fc, Fab/Fab-crossFab-Fc, Fab/crossFab-Fc, IgG-scFv 및 IgG-(scFv)2로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.　
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 CD3 또는 히스타민-석시닐-글리신(HSG)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 추가로 포함하는 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 고형 종양의 치료 또는 검출에 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 항체는 제1 단계에서 대상체에게 투여되고 HSG 합텐은 제2 단계에서 투여되며, 상기 HSG 합텐은 항체에 결합하고 방사성 핵종으로 표지된다.
또한, 의약(medicament)의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 Fc 침묵형 항체가 본원에 제공된다.　
본 발명의 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 항체를 임의로 약제학적 담체 또는 보조제(adjuvant)와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.
구체적으로, 본 조성물은 10 내지 250mg/ml의 본 발명의 항체를 포함하며, 구체적으로 > 50mg/ml를 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다.
본원에 제공된 바와 같이, 약제학적 조성물은 단독 물질로서 투여하기 위한 것이거나, 바람직하게는 항바이러스성 물질, 항암 물질, 항염증성 물질 및 항생 물질로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 활성 물질을 포함하는 추가의 약제학적 조성물과의 병용 제형으로서 투여하기 위한 것이다.
추가의 구현예에서, 염증성 질환, 감염성 질환을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 천식(asthma), 혈관염(vasculitis), 관절염(arthritis), 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 내독성 쇼크(endotoxic shock), 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome), 후천성 호흡 곤란 증후군(acquired respiratory distress syndrome), 사구체신염(glomerulonephritis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 복막염(peritonitis), 신염(nephritis), NASH(비알코올성 지방증 간염(nonalcoholic steatosis hepatitis)), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 급성 및 만성 췌장염(acute and chronic pancreatitis), 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes), IgA 신장병증(nephropathy), 간질성 방광염(interstitial cystitis), COVID 후 증후군(post COVID syndrome) 및 건선(psoriasis)의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
대안적인 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 과증식성 장애 또는 암을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreas cancer), 위암(gastric cancer) 및 폐암(lung cancer)의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 항체를 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산이 추가로 본원에 제공된다.
또한, 본원에 기재된 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터(expression vector)가 본원에 제공된다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포가 제공된다.
숙주 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 제조하는 방법이 추가로 제공된다.
숙주 세포에서 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 제조하는 방법이 추가로 본원에 제공된다.
도 1: 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일. (A) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 Enrich 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역) 및 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 모체 항체(C0083 및 C0090, Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교; (B) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 Enrich 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 용출 프로파일의 비교; (C) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118 및 그들의 모체 항체 C0083 및 C0090(Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교.
도 2: 고정된 oxMIF에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 결합 곡선(KD 결정). 항-oxMIF 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었으며, C0008은 참조 항체로 사용되었다. EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식으로 결정되었다(두 실험의 평균 +/- SEM이 표시됨).
도 3: 새로 설계된 항체의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합. C0008은 참조 항체로서, 동형 IgG가 음성 대조군으로 사용되었다. 2 내지 3회 실험의 평균 +/- SEM이 표시된다.
도 4: 리포터 검정으로 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 이펙터 기능. (A-B) 항-oxMIF 대조군 항체 C0008(B) 또는 wt Fc를 포함하는 그들의 모체 항-oxMIF 항체 C0083 및 C0090(A)와 비교하여 FcγRIIIa(V: 높은 반응자 유전자형, F: 낮은 반응자 유전자형) 및 HCT116-pMIF(A) 또는 A2780-pMIF(B) 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및/또는 C0118을 사용한 ADCC 리포터 생물검정; (C) wt Fc를 포함하는 그들의 모체 항체 C0083 및 C0090(A)와 비교하여 FcγRIIa 및 HCT116-pMIF 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및/또는 C0118을 사용한 ADCP 리포터 생물검정. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
도 5: 보체 의존성 세포 독성 생물검정으로 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115의 강하게 감소된 CDC 활성. wt Fc를 갖는 모체 항-oxMIF 항체 C0083 및 IgG4 음성 대조군으로 니볼루맙과 비교하여 BRC를 보체 공급원으로 사용하고 HCT116-HiBiT-pMIF를 표적 세포로 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115를 사용한 CDC 생물검정. 데이터(적절한 경우)는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
도 6: PBMC 매개 세포 독성 생물검정으로 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 ADCC 활성. 항-oxMIF 대조군 항체 C0008 또는 wt Fc를 갖는 C0115의 모체 항-oxMIF 항체(C0083)와 비교하여 PBMC를 이펙터 세포로, HCT116-HiBiT-pMIF를 표적 세포로 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115(A) 및 C0118(B)을 사용한 ADCC 생물검정. 두 명의 건강한 공여체의 PBMC를 사용하는 2회 반복의 평균 및 SEM이 표시된다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다.
도 7: FACS로 결정된 A2780 MIF-/- 세포에서 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 비특이적 결합. 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0118과 그의 모체 항체 C0090(A) 및 C0115와 그의 모체 항체 C0083(B) 및 대조군 항체 C0008뿐만 아니라 음성 대조군으로서 동형 IgG에 의한 A2780 MIF-/- 세포의 염색; 생존 세포의 GeoMean(AF488에 대한 평균 형광 강도)을 항체 농도에 대해 플롯팅한다.
도 8: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115는 참조 항체 C0008에 비해 인간 PBMC로부터 강하게 감소된 사이토카인 방출을 보여준다. Fc 침묵 돌연변이를 보유하는 항-oxMIF 항체 C0115와 참조 항체 C0008을 인간 PBMC와 함께 밤새 배양하고, 상청액을 인간 MCP-1(A), 인간 IL-6(B) 및 인간 TNF-α(C)에 대해 LegendPlex 세포 계측 비드 검정(BioLegend)으로 분석했다. 사이토카인 농도(pg/ml)에 대한 평균 +/- SEM이 3개의 상이한 PBMC 공여체로부터 표시된다.
도 9: 피하 HCT116 종양을 보유하는 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의한 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115 및 참조 항체 C0008의 종양 침투 및 체류. (A) 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 C0115(상단 패널) 및 C0008(하단 패널) 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영했고; (B) 디지털 이미지 분석으로 정량화된 C0115 및 C0008의 종양 침투 및 체류. 3마리 마우스의 평균을 표시한다.
도 10: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115는 콜라겐 II 유도 DBA/1j 마우스 관절염 모델에서 질환 중증도를 개선한다. C0115(20mg/ml), 표준 치료 코르티코스테로이드 약물로서 고용량 덱사메타손(0.3mg/kg) 또는 비히클로 치료시 마우스 관절염 모델에서 누적 질환 점수(A)와 발 두께(B)를 평가했다.　 평균 ± SEM이 표시된다. 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔(Fischer)의 LSD 테스트가 GraphPad Prism V 9.4에서 통계 분석을 위해 사용되었다(*p<0.05; **p< 0.01; ***p< 0.001).
도 11: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115는 신독성 혈청(NTS) 유도 래트 사구체신염 모델에서 질환 중증도를 개선한다. 혈뇨(시험지봉 테스트)(A), 단백뇨(B) 및 사구체 대식세포 침윤은 항-oxMIF 항체 C0115, 동형 대조군 IgG1 또는 비히클로 질환에 걸린 래트의 치료시 래트 사구체신염 모델에서 평가했다. 평균 ± SEM이 표시되고, 일반 일원 ANOVA에 이어 다중 테스트를 위한 던넷(Dunnett) 보정이 GraphPad Prism V 9.4에서 통계 분석을 위해 사용되었다(*p<0.05; **p< 0.01; ***p< 0.001).
도 12: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(bsMab) C0132(Fab/scFv-Fc) 및 C0133(Fab/Fab-scFv-Fc)의 개략도.　
도 13: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 고정된 oxMIF에 대한 결합 곡선. 결합된 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었으며, C0008은 oxMIF에 대한 2가 결합을 위한 참조 항체로 사용되었다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SEM이 표시됨).
도 14: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합. C0008은 참조 항-oxMIF 항체로서 사용되었다. 3회 반복의 평균 및 SEM이 표시된다.
도 15: 피하 동종 이식된 CT26 종양을 보유하는 마우스의 적외선 생체내 이미징으로 평가된 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 종양 침투 및 체류. 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 주사 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간 후에 촬영했다.
도 16: (A) HSG 합텐 IMP288의 구조. (B) 177Lu-IMP288 펩티드 단독의 이동 프로파일과 비교할 때 bsMab와 함께 배양시 177Lu-IMP288의 이동 프로파일의 변화에 기초하여 iTLC로 평가된 177Lu-IMP288 펩티드에 대한 bsMab C0132 및 C0133의 결합.　　
도 17: Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132를 갖는 Balb/c 마우스에서 동종 이식된 CT26 뮤린 결장직장 암종의 PRAIT를 보여준다. C0132를 -3일째에 투여하고, 3일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. (A) 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%), 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행했다; ** p<0.01 대 177Lu-IMP288; (B) 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선(생존 %), (C) 0일째에 측정된 체중 대비 체중(%).　　
도 18: Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0133을 갖는 Balb/c 마우스에서 동종 이식된 CT26 뮤린 결장직장 암종의 PRAIT를 보여준다. C0133을 -3일째에 투여하고, 3일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. 이 도면은 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%)을 보여준다. 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행했다; *** p<0.01 대 177Lu-IMP288.
도 19: CT26 뮤린 결장직장 암종 세포가 동종 이식된 Balb/c 마우스에서 PRAIT 접근법을 사용한 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132의 효능. C0132를 2.5mg/ml로, -5일째에 5mg/ml 투여하고, 5일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했으며; 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행했다; *** p<0.01 대 177Lu-IMP288. (A) 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%), (B) 카플란-마이어 생존 곡선(생존 %).　
도 20 CFPAC-1 췌장 선암종 세포가 이종 이식된 Balb/c 누드 마우스에서 PRAIT 접근법을 사용한 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132의 효능. C0132를 5mg/ml로 -5일째에 투여하고, 5일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%); 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10개). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행했다; ** p<0.01 대 비히클.　
도 21 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115는 단일 제제로서 또는 GC와 병용하여 DBA/1j 마우스에서 콜라겐 II 유도 관절염의 질환 중증도를 개선한다. 누적 질환 점수는 C0115(20 mg/kg) 단독 또는 저용량 0.1mg/kg의 덱사메타손("Dexa")과 병용, 표준 치료 코르티코스테로이드 약물로서 저용량(0.1mg/kg) 및 고용량(0.3mg/kg)의 덱사메타손("Dexa") 또는 비히클 대조군으로 치료시 마우스 관절염 모델에서 평가했다. 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트가 GraphPad Prism V9.4에서 통계 분석에 사용되었다(*p<0.05; **p<0.01).
도 22 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115는 단일 제제로서 및 GC와 병용하여 대장염의 T 세포 전달 마우스 모델에서 질환 중증도를 개선한다. 실험 종료시, 83일째의 체중 변화(A)와 누적 대변 점수(B)는 C0115(10mg/kg; 단독 또는 저용량의 0.01mg/kg의 덱사메타손("덱사")과 병용), 표준 치료 코르티코스테로이드 약물로서 저용량(0.01mg/kg) 및 고용량(0.1mg/kg)의 덱사메타손("Dexa") 또는 비히클 대조군 치료시 평가했다. 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트가 GraphPad Prism V9.4(*p<0.05; **p<0.01)에서 통계 분석에 사용되었다.
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 당업자에게 명백할 당업계에서의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (4th Ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Krebs et al., "Lewin's Genes XI", Jones & Bartlett Learning, (2017), and Murphy & Weaver, "Janeway's Immunobiology" (9th Ed., 또는 최신 버전), Taylor & Francis Inc, 2017]을 참조한다.
청구범위의 주제는 구체적으로 인공 제품 또는 이러한 인공 제품을 사용하거나 생산하는 방법을 지칭하며, 이는 천연(야생형) 제품의 변이체일 수 있다. 천연 구조에 대한 어느 정도의 서열 동일성이 있을 수 있지만, 본 발명의 재료, 방법 및 용도는, 예를 들어, 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 융합 작제물, 발현 작제물, 형질전환된 숙주 세포 및 변형된 단백질을 참조하여, "인공" 또는 합성이며, 따라서 "자연의 법칙"의 결과로 간주되지 않는다는 것이 잘 이해되고 있다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "함유하다(contain)", "가지다(have)" 및 "포함하다(include)"는 동의어로 사용될 수 있으며, 추가 구성원 또는 부분 또는 요소를 허용하는 개방형 정의로 이해해야 한다. "구성하는"은 구성하는 정의 기능의 추가 요소 없이 가장 가까운 정의로서 간주된다. 따라서, "포함하는"은 더 광범위하며, "구성하는" 정의를 함유한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 동일한 값 또는 주어진 값의 +/-5% 만큼 다른 값을 지칭한다.
본원 및 청구범위에 사용된 단수형, 예를 들어, "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명백하게 명시하지 않는 한 복수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산은 61개의 삼중항 코돈에 의해 인코딩된 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이러한 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 나눌 수 있다:
"중성" 아미노산은 각각의 세 문자 및 한 문자 코드와 극성과 함께 아래에 제시되어 있다: 알라닌(Ala, A; 비극성, 중성), 아스파라긴(Asn, N; 극성, 중성), 시스테인(Cys, C; 비극성, 중성), 글루타민(Gln, Q; 극성, 중성), 글리신(Gly, G.; 비극성, 중성), 이소류신(Ile, I; 비극성, 중성), 류신(Leu, L; 비극성, 중성), 메티오닌(Met, M; 비극성, 중성), 페닐알라닌(Phe, F; 비극성, 중성), 프롤린(Pro, P; 비극성, 중성), 세린(Ser, S; 극성, 중성), 트레오닌(Thr, T; 극성, 중성), 트립토판(Trp, W; 비극성, 중성), 티로신(Tyr, Y; 극성, 중성), 발린(Val, V; 비극성, 중성) 및 히스티딘(His, H; 극성, 양성(10%) 중성(90%)).
"양으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다: 아르기닌(Arg, R; 극성, 양성) 및 리신(Lys, K; 극성, 양성).
"음으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다: 아스파르트산(Asp, D; 극성, 음성) 및 글루탐산(Glu, E; 극성, 음성).
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 oxMIF를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하고, 상기 아미노산 치환이 결여된 변형되지 않은 항체에 비해 가변 중쇄 및 경쇄 도메인에서 표적화된 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 성향 및 감소된 소수성을 나타낸다.
응집 가능성의 감소는 본원에 기재된 항체의 가변 도메인 내의 선택된 위치에서의 아미노산 치환으로 인한 것이다.　
항체 응집 수준은 질량 분석법, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 동적 광 산란(DLS), 광 차폐(LO), 동적 이미징 입자 분석(DIP A) 기술, 예를 들어, 미세 흐름 이미징(MFI), 및 쿨터 카운터(CC), 시차 주사 형광측정법(DSF)을 포함한 다양한 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 감소된 소수성 및 감소된 응집 가능성은 본원에 개시된 바와 같이 서열번호 44 및 2, 3을 포함하는 항체 C0008과 같은 참조 항체와 비교하여 새로 설계된 항체의 표면 소수성의 감소 및 감소된 응집 가능성을 지칭한다. C0008의 서열은 제안된 INN 목록 111(WHO Drug Information, Vol. 28, No. 2, 2014)에 공개된 이말루맙의 서열을 함유하지만, C-말단 리신이 결여되어 있다. 측정은 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 또는 친화도 포획 자기 상호 작용 나노입자 분광법(AC-SINS, Estep P. et al., 2015)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 감소된 응집성 및 감소된 소수성을 갖는 본 발명의 oxMIF 항체는 구체적으로 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 함께 또는 카바트의 넘버링에 따라 위치 L5 또는 W97, 구체적으로 L5Q 또는 W97Y에 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하고 위치 L5 또는 W97, 구체적으로 L5Q 또는 W97Y에 하나 또는 둘 모두의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 중쇄 가변 도메인과 함께 카바트 넘버링에 따라 위치 M30, F49, A51, P80, W93, 구체적으로 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는 위치 36에 티로신을 포함하고, 또한 위치 M30, F49, A51, P80, W93, 구체적으로 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2와 적어도 95%, 구체적으로 적어도 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인은 1, 2, 3, 4, 5개의 아미노산 치환을 가지며, 단 위치 36의 티로신은 보존되고, 또한 아미노산 중 적어도 하나는 위치 M30, F49, A51, P80, W93에서 치환된다.　
특정 구현예에 따르면, 아미노산 W93은 F, Y 또는 H로 대체된다.
추가의 구현예에서, 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는 본 발명의 항-oxMIF 항체는 구체적으로 서열번호 3 및 위치 W97, 구체적으로 W97Y에 아미노산 치환, 또는 L5, 구체적으로 L5Q에 아미노산 치환, 또는 아미노산 치환 L5Q 및 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하고, 임의로 L5Q와 함께 아미노산 치환 W97Y를 추가로 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.　
특정 구현예에 따르면, 아미노산 W97은 F, Y 또는 H로 대체된다.
대안적인 구현예에서, 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인은 1, 2, 3, 4, 5개의 아미노산 치환을 가지며, 또한 아미노산 중 적어도 하나는 위치 L5 및 W93에서 치환된다.
바람직한 구현예에서, 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는 본 발명의 항-oxMIF 항체는 구체적으로 위치 W93 및 W97에 아미노산 치환을 포함한다.
경쇄의 위치 36에 있는 티로신은 구체적으로 본원에 기재된 항체의 결합 특성을 보존하기 위해 변형되지 않은 상태로 유지된다. 상기 아미노산 위치에서의 임의의 변형은 원치 않는 결합 특성의 손상을 초래할 수 있다.
구체적으로, 가변 경쇄 도메인은 서열번호 5를 함유하고, 가변 중쇄 도메인은 서열번호 3, 4, 9 또는 43 중 임의의 하나 이상을 함유한다.
구체적으로, 가변 경쇄 도메인은 서열번호 6을 함유하고, 가변 중쇄 도메인은 서열번호 3, 4, 9 또는 43 중 임의의 하나 이상이다.
구체적으로, 가변 경쇄 도메인은 서열번호 7을 함유하고, 가변 중쇄 도메인은 서열번호 3, 4, 9 또는 43 중 임의의 하나 이상이다.
구체적으로, 가변 경쇄 도메인은 서열번호 8을 함유하고, 가변 중쇄 도메인은 서열번호 3, 4, 9 또는 43 중 임의의 하나 이상이다.
추가의 구현예에서, 항-oxMIF 항체는 상기 열거된 가변 경쇄 및 중쇄 도메인 중 어느 하나와 함께 서열번호 14 및 18을 포함한다.
Fc 감마 수용체(FcγR)는 막 결합 표면 수용체, 비정형 세포내 수용체 및 세포질 당단백질을 포함하는 잘 기재된 단백질 계열이다. FcγR은 체액성 및 선천성 면역을 조절하고, 이는 감염(infection)에 대한 적절한 반응 및 만성 염증(chronic inflammation) 또는 자가 면역 질환(auto-immune disease)의 예방에 필수적이다. 막 결합 수용체는, 예를 들어, FcγRlla, FcγRllb-, FcγRllla 및 FcγRIa 수용체이다. 항체는 FcγR과의 상호 작용을 통해 면역 반응을 조절할 수 있다.
선천성 면역 이펙터 세포에서, 활성화 및 억제성 FcγR은 면역 복합체에 의한 세포 활성화에 대한 역치를 설정한다. FcγR에 의해 조절되는 이펙터 반응의 중요한 예는 식세포 작용, ADCC 및 염증 매개체의 방출이다. 수지상 세포(DC)에서, 쌍을 이룬 FcγR 발현은 세포 성숙과 항원 제시를 조절하여 세포 면역 반응을 간접적으로 제어한다. B 세포에서, 억제성 FcγRIIB는 체액성 내성 유지에 필수적이다. 이는 클래스 전환 메모리 B 세포, 형질모세포 또는 혈장 세포의 수준에서 후기 체크포인트 역할을 한다. 또한, FcγRIIB는 혈장 세포 항상성 및 생존을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 항체-FcγR 상호 작용은 활성화 및 억제성 FcγR(예: 사이토카인)의 발현 수준에 영향을 미치거나 항체-FcγR 상호 작용(예: 차등 항체 글리코실화)의 친화도를 변경하는 다양한 요인에 의해 영향을 받는다. 특정 글리코실화 패턴에 따라, IgG 분자는 전염증성 또는 항염증 활성을 강화할 수 있다. 중요하게는, 항체 글리코실화는 면역 반응 중에 조절된다.
비정형 FcγR은 신생아 Fc 수용체(FcRn) 및 세포질 당단백질, 예를 들어, 보체 인자 C1q 단백질이다. FcRn은 내피 세포에 의해 발현되고, 이는 음세포증(pinocytosis)에 의해 혈류로부터 용해성 IgG를 포함한 혈청 성분을 내재화한다. FcRn에 대한 IgG 결합은 pH 의존적이며, 엔도솜 구획 내부의 산성 pH(pH 6.0)는 IgG가 FcRn에 결합할 수 있도록 한다. 세포 표면으로 다시 재활용된 후, IgG는 생리학적 pH(약 pH 7.2)에서 FcRn으로부터 해리되고 혈액 순환으로 다시 방출되어 리소좀 분해로부터 보호되어 IgG의 반감기 연장을 초래한다. 따라서, FcRn은 순환에서 IgG와 알부민을 유지하는 역할을 하는 트랜스사이토시스 수용체의 재활용 기능을 한다. FcRn 결합과 관련하여 감소되거나 침묵된 Fc를 초래하는 Fc 영역의 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌(Kenanova V. et al., 2005 및 Pyzik M. et al., 2019)에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "이펙터 기능"이란 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호 작용으로부터 발생하는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "이펙터 세포"란 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 이펙터 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 T 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본원에 개시된 항-oxMIF 항체는 중쇄 불변 영역, 구체적으로 Fc 영역의 선택된 위치에서 아미노산 치환으로 인해 침묵된 이펙터 기능을 갖는다. 감소된 보체- 및 FcγR 매개 활성으로 인한 이러한 항체의 감소되거나 침묵된 이펙터 기능은 감소되거나 폐지된 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 포함할 수 있다.　
본원에 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"(또는 단편 결정화 가능 영역)은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(CH1 도메인)을 제외한 항체의 불변 영역 및 일부 경우에 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역은 항체의 C 말단 영역을 지칭한다. Fc 영역은 항체의 두 중쇄인 쇄 A 및 쇄 B의 두 번째 및 세 번째 불변 도메인으로부터 유래된 두 개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. 두 번째 및 세 번째 불변 도메인은 각각 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 공지되어 있다. CH2 도메인은 쇄 A의 CH2 도메인 서열과 쇄 B의 CH2 도메인 서열을 포함한다. CH3 도메인은 쇄 A의 CH3 도메인 서열과 쇄 B의 CH3 도메인 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, Fc 영역은 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
인간 IgG Fc 영역 서열의 "CH2 도메인"은 일반적으로 EU 넘버링에 따라 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 확장된다. CH2 도메인 서열은 또 다른 도메인 서열과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-연결 분지형 탄수화물 쇄가 온전한 천연 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 서열 사이에 삽입된다.　
"CH3 도메인"은 Fc 영역 서열에서 C-말단 잔기의 CH2 도메인 서열로의 스트레치(즉, EU 넘버링에 따라 IgG의 약 아미노산 잔기 341로부터 약 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.　
"기능적 Fc 영역"은 "이펙터 기능"과 천연 Fc 영역의 FcRn 결합을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1 q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 요구하며, 당업계에 공지되어 있고 본원에 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역 및 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역뿐만 아니라 이의 천연 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 "하나 이상의 아미노산 치환"에 의해 천연 Fc 영역 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 변이체 Fc 영역 서열은 천연 Fc 영역 서열 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 Fc 영역 서열 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역 서열에서 약 1 내지 약 20개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 17개의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원의 변이체 Fc 영역 서열은 천연 Fc 영역 서열 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역 서열과 적어도 약 80%의 동일성을 보유하며, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90%의 동일성을 가지며, 더욱 바람직하게는 이와 적어도 약 95%의 동일성을 갖는다.　
특정 구현예에서, 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따른 IgG1을 참조하여 위치 E233, L234, L235, G236, I253, G237, P238, D265, S267, H268, N297, S298, T299, H310, E318, L328, P329, A330, P331 및 H435 중 어느 하나에 있다.　
이펙터 기능과 관련하여 감소되거나 침묵된 Fc를 초래하는 Fc 영역의 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(Saunders K., 2019 및 Liu R. et al., 2020)에 기재되어 있다.
대안적인 구현예에서, 아미노산 치환은 CH2 도메인의 위치 L234F, H268Q, K274Q, Y296F, A327G, A330S, P331S 및 CH3 도메인의 R355Q, K409R, Q419E, P445L 중 어느 하나 또는 전부에 위치한다.
구체적으로, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 다음 아미노산 치환 또는 결실의 조합 중 하나 이상을 포함한다:
i) L235, G237 및 E318, 구체적으로 L235A, G237A 및 E318A;
ii) L234, L235, 구체적으로 L234A, L235A;
iii) S228, L235, 구체적으로 S228P, L235E;
iv) G236, L328, 구체적으로 G236R, L328R;
v) S298, T299, 구체적으로 S298G, T299A;
vi) L234, L235, P331, 구체적으로 L234F, L235E, P331S;
vii) H268, V309, A330, P331, 구체적으로 H268Q, V309L, A330S, P331S;
viii) E233, L234, L235, G236, S267, 구체적으로 E233P, L234V, L235A, G236del, S267K;
ix) L234, L235, P329, 구체적으로 L234A, L235A, P329G;
x) V234, G237, P238, H268, A330, P331, 구체적으로 V234A, G237A, P238S, H268A, A330S, P331S;
xi) L234, L235, D265, 구체적으로 L234F, L235E, D265A;
xii) D265, 구체적으로 D265A;
xiii) G237, 구체적으로 G237A;
xiv) E318, 구체적으로 E318A;
xv) E233, 구체적으로 E233P,
xvi) G236, L328, 구체적으로 G236R, L328R;
xvii) L235, 구체적으로 L235E;
xviii) L234, L235, P331, 구체적으로 L234Q, L235F, P331S;
xix) L234, L235, G237, P238, H268, A330, P331, 구체적으로 L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S, P331S.
xx) N297, 구체적으로 비글리코실화 항체로 이어지는 N297A, N297Q 또는 N297G.
글리코실화, 즉 O- 및 N-글리코실화는 Abs의 번역 후 변형이며, 이는 스트레스 또는 질환, 사이토카인 활성, 및 선천성 면역 신호전달 수용체, 예를 들어, 톨 유사 수용체와 같은 환경 요인을 포함하는 다양한 B 세포 자극에 의해 조절될 수 있다. 모체 항체의 글리코실화 패턴은 당업계에 익히 공지된 방법으로 변형될 수 있다. 구체적으로, O-연결 글리코실화 부위는 CH2 및 힌지 영역에 위치한다.
추가의 구현예에서, 아미노산 치환은 CH2 도메인의 위치 I253 및 H310 및 CH3 도메인의 H435 중 어느 하나 또는 모두에 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 다음 아미노산 치환의 조합 중 하나 이상을 포함한다:
i) I253A
ii) H310A
iii) H435, 구체적으로 H435A, H345Q 또는 H435R
iv) I253A 및 H310A
v) I253A 및 H310A와 H435Q, H435A 및 H435R 중 하나
vi) H310A와 H435Q, H435A 및 H435R 중 하나
그러나, 본원에 기재된 CH 도메인에서의 침묵 및 추가 돌연변이는 EU 넘버링에 따라 상응하는 위치에서 야생형 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc에 도입될 수도 있다.
용어 "비글리코실화된"은 Fc 영역이 글리코실화되지 않음을 나타낸다. IgG 동형의 모든 인간 불변 영역은 위치 297의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화되는 것으로 공지되어 있으며, 이는 N-글리코실화 모티프 아스파라긴 297-X 298-세린 299 또는 트레오닌 299의 일부를 구성하며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이다. 글리칸은 헵타사카라이드 코어와 푸코스, 갈락토스 및/또는 시알산과 같은 가변 확장부를 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 불변 영역에서 아스파라긴 297을 효소적 수단에 의해 글리코실화 또는 탈글리코실화될 수 없는 또 다른 아미노산으로 대체함으로써 비글리코실화될 수 있다. 임의의 다른 아미노산 잔기가 잠재적으로 사용될 수 있지만, 알라닌이 가장 바람직하다. 대안적으로, 아스파라긴 297에서의 글리코실화는 모티프의 다른 잔기 중 하나를 변경함으로써, 예를 들어, 잔기 298을 프롤린으로 대체하거나 잔기 299를 세린 또는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산으로 대체함으로써 방지될 수 있다. 이러한 부위 지시된 돌연변이유발을 수행하는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 시판되는 부위 지시된 돌연변이유발 키트를 사용하여 수행될 수 있다.　
용어 "침묵형 Fc"는 이펙터 기능 및/또는 FcRn 결합이 아미노산 치환 또는 글리코실화 패턴의 변형으로 인해 감소되거나 제거되어 임의의 FcγR, 예를 들어, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb FcγRIIIaF, FcγRIIIaV, 및 FcγRIa 및/또는 FcRn 수용체 및 보체 인자 C1 q 단백질에 대한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형된 글리칸을 초래하는 항체의 Fc 영역을 지칭한다. 이 결합의 이러한 감소 또는 제거는 전형적으로 야생형 IgG Fc 영역에 의해 매개되는 이펙터 기능 및/또는 FcRn 결합의 감소 또는 제거를 초래한다.　
FcγR 결합, 예를 들어, 하나의 임의의 FcγRIIa, FcγRII FcγRIIIa, 및 FcγRIa 및/또는 FcRn 수용체와 보체 인자 C1 q 단백질에 대한 결합이 완전히 폐지된 경우, 용어 "Fc null"이 본원에 사용될 수 있다.
상당한 정도의 Fc 침묵은 돌연변이 L234와 L235를 결합함으로써 달성될 수 있고, 이러한 잔기는 힌지 영역에 가깝게 위치하고 알라닌으로 치환될 때 FcγR 결합을 감소시킨다. 예를 들어, L234A 및 L235A와 P329G의 조합은 모든 FcγR 이소형에 대한 FcγR 상호 작용의 거의 완전한 억제로 이어질 수 있다.
크게 감소되거나, 침묵되거나, 무시할 수 있거나 제거된 FcγR 결합 친화도 및 C1q 결합 친화도를 갖는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모체 폴리펩티드 또는 천연 Fc 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 감소된 FcγR 결합 활성 및 C1q 결합 활성을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 크게 감소되거나, 침묵되거나, 무시할 수 있거나 제거된 FcR 결합 친화도 및 C1q 결합 친화도를 갖는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 모체 폴리펩티드 또는 천연 Fc 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 크게 감소되거나 침묵되거나 무시할 수 있거나 제거된 ADCC, ADCP 및 CDC 활성을 갖는다. FcγR에 대한 감소되거나 검출되지 않는 결합을 나타내는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모체 폴리펩티드보다 낮은 친화도로 모든 FcγR에 결합할 수 있다. FcγR에 대한 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는 FcγR에 대한 인식 가능한 결합을 거의 또는 전혀 보유하지 않을 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 변이체는, 예를 들어, 평형 상수의 변화에 의해 측정된 바와 같이, 천연 IgG Fc 영역에 비해 FcγR에 대한 0 내지 20% 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 천연 IgG Fc 영역과 비교하여 FcγR에 대한 0-10% 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 천연 IgG Fc 영역과 비교하여 FcγR에 대한 0-5% 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 천연 IgG Fc 영역과 비교하여 FcγR에 대한 0-1% 결합을 나타낸다.
침묵된 보체 활성을 갖는 본원에 기재된 항체는 세포 기반 CDC 검정에 의해 결정될 수 있으며, C1q에 대한 감소되거나 폐지된 결합은 즉, SPR 또는 ELISA로 결정된다.　
감소되거나 침묵된 CDC 활성은 참조, 즉 변형되지 않은 야생형 항체, 예를 들어, C0008에 비해 적어도 1.5배, 구체적으로 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 더욱 구체적으로 적어도 10배 하향조절되는 것으로 결정된다.
감소된 ADCC 또는 ADCP 활성은 참조 항체, 즉 변형되지 않은 야생형 항체, 예를 들어, C0008에 비해 효능이 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 더욱 구체적으로 적어도 10배 감소된 것으로 결정된다.
특정 구현예에서, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역의 선택된 위치에서의 아미노산 치환으로 인해 FcRn에 대한 감소된 결합을 나타낸다. FcRn에 대한 본 발명의 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체의 감소된 결합은 순환에서의 감소된 반감기와 보다 빠른 생체내 제거를 유도한다. FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(참조: 예를 들어, Petkova, S.B. et al., 2006).　
야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 비해 감소된 FcRn 결합을 나타내는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 Fc 도메인은 바람직하게는 위치 I253, H310 및 H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있다.　
감소된 FcRn 결합(즉, 친화도)은 참조 항체, 즉 변형되지 않은 야생형 항체, 예를 들어, C0008에 비해 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 더욱 구체적으로 적어도 10배 감소된 결합(즉, 친화도)인 것으로 결정된다.
추가 구현예에서, 훨씬 더 큰 정도의 Fc 침묵은 아미노산 위치 L234, L235, H310 및 H435에서 돌연변이를 결합함으로써 달성될 수 있다. 이러한 잔기는 Fc 영역에 위치하며 FcγR 상호 작용의 거의 완전한 억제를 유도할 수 있다.
구체적으로, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 카바트, IMGT 및 문헌(MacCallum RM et al., 1996(CONTACT))에 따라 정의된 바와 같은 표 1A에 나열된 CDR 중 임의의 하나 이상을 포함한다:
oxMIF 결합 특이성은 oxMIF에 대한 선택적 결합을 결정하는 데 적합한 임의의 검정, 예를 들어, oxMIF에 대한 결합과 관련하여 이말루맙과 같은 대조군 항체에 대한 임의의 경쟁 검정 또는 당업계에 공지되고 본원에 개시된 바와 같은 다양한 검정에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않는 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는 항체 도메인으로 구성되거나 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 이 용어는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 및 그들이 목적하는 항원 결합 활성, 즉 oxMIF에 대한 결합을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 이 용어는 또한 융합 단백질, 예를 들어, 면역독소와의 융합체 또는 항체 접합체, 예를 들어, oxMIF에 결합하는 항체 약물 접합체를 포함한다.
항체 도메인은 천연 구조이거나, 예를 들어, 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예를 들어, 안정성 또는 기능적 특성, 예를 들어, FcRn 및/또는 Fc-감마 수용체와 같은 Fc 수용체에 대한 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩티드 서열은 루프 서열로 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타 가닥으로 이루어진 베타-배럴 구조를 포함하는 경우 항체 도메인으로 간주된다.　
용어 "항체"는 항원 결합 유도체, 변이체 및 이의 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 유도체 또는 변이체는 본 발명의 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 본 발명의 항체의 임의의 도메인이 하나 이상의 다른 단백질, 예를 들어, 다른 항체 또는 항체 포맷, 예를 들어, CDR 루프, 수용체 폴리펩티드뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 표지, 독소 등을 포함하는 결합 구조의 임의의 위치에서 융합될 수 있는 융합 단백질의 임의의 조합이다.　
용어 "항체"는 특히 표적 항원 oxMIF에 대한 결합 특성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.　
용어 "항체 단편, 항원 결합 단편, 항원 결합 변이체 또는 항체 변이체"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 항원 결합 부분과 항체 단편 또는 변이체로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하고 본원에 기재된 바와 같은 변이체 Fc 영역을 추가로 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항원 부분의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, 단일 쇄 항체 분자(예: scFvs) 디아바디, 교차 Fab 단편; 선형 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따르면, 항체 단편 또는 변이체는 힌지 영역 및/또는 링커(예: (scFv)-Fc, (scFv)2-Fc, scFv/scFv-Fc, Fab/scFv-Fc, Fab/(scFv)2-Fc, Fab/Fab-scFv-Fc, Fab/Fab-crossFab-Fc, IgG-scFv 및 IgG-(scFv)2)에 의해 침묵된 Fc-부분 또는 침묵된 Fc-도메인에 융합된다.
또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특성, 즉 VL 도메인과 함께 조립할 수 있는 특성 또는 VL 도메인의 특성, 즉 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위에 조립할 수 있어 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 언급된 항체 단편은 또한 FcabTM과 같은 항원 결합 영역을 함유하는 하나 이상의 구조적 루프 영역을 포함하는 침묵된 Fc 도메인 또는 침묵된 Fc 영역이 두 번째 별개의 항원 결합 부위를 함유하는 FcabTM으로 대체된 IgG 구조를 갖는 전장 항체 포맷을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Fab 단편 또는 Fab"는 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 본 발명의 항체는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함할 수 있고, 여기서 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "교차-Fab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로 지칭된다. 크로스오버 Fab 분자의 두 가지 상이한 쇄 조성물이 가능하며, 본 발명의 항체에 포함된다: Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 교환될 수 있으며, 즉 크로스오버 Fab 분자는 펩티드 쇄를 포함한다. 본 발명에 따르면, Fab는 힌지 영역에 의해 침묵된 Fc-부분 또는 침묵된 Fc-도메인에 융합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Fab 암"은 힌지 영역에 의해 침묵된 Fc 부분 또는 침묵된 Fc 도메인에 융합된 Fab 단편을 지칭한다.
"( scFv )2"는 약 50킬로달톤의 단일 펩티드 쇄 상의 상이한 항체 또는 동일한 항체의 두 개의 단일 쇄 가변 단편(scFv), 또는 4개 또는 2개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질인 인공 모노클로날 항체를 지칭한다.　
"bs(scFv)2"는 약 50킬로달톤의 단일 펩티드 쇄 상의 상이한 표적 항체를 갖는 항체의 두 개의 단일 쇄 가변 단편(scFv), 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질인 인공 모노클로날 항체를 지칭한다.
용어 "기능적 변이체" 또는 "기능적 활성 변이체"는 또한 천연 대립 유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 기타 비천연 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체 또는 상동체로서 지칭되기도 하는 것은 본질적으로 핵산 또는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 변경하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 것으로 특성화되는 핵산 또는 펩티드의 대안적인 형태이다. 구체적으로, 기능적 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 첨가 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이 치환, 결실 및/또는 첨가는 보존적 변형이며 항원 결합 특성을 변경하지 않는다. 구체적으로, 본원에 기재된 기능적 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하며, 이는 보존적 변형이고 항체의 기능을 변경하지 않는다. 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 기능적 활성 변이체는 최대 15개, 바람직하게는 최대 10개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하며, 이는 보존적 변형이고 항체의 기능을 변경하지 않는다.
기능적 변이체는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 변경, 예를 들어, 하나 이상의 점 돌연변이에 의해 수득될 수 있으며, 여기서 서열 변경은 본 발명과 함께 사용될 때 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 향상시킨다. 이러한 서열 변경은 (보존적) 치환, 첨가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 보존적 치환은 측쇄 및 화학적 특성이 관련된 아미노산 계열 내에서 발생하는 것들이다. 이러한 계열의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산이다.
점 돌연변이는 특히 하나 이상의 개별 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해 또는 치환으로 인한 아미노산의 교환에 의해 조작되지 않은 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드의 조작으로 이해된다.
특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 항체는 친화도 태그, 용해도 향상 태그 및 모니터링 태그와 같지만, 이에 제한되지 않는 정제 및/또는 검출을 위한 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다.
구체적으로, 친화도 태그는 폴리-히스티딘 태그, 폴리-아르기닌 태그, 항체용 펩티드 기질, 키틴 결합 도메인, RNAse S 펩티드, 단백질 A, β-갈락토시다제, FLAG 태그, Strep II 태그, 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP) 태그, 칼모둘린 결합 펩티드(CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, HA 태그 및 c-Myc 태그로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구체적으로 태그는 헥사히스티딘 태그와 같이 하나 이상의 H를 포함하는 His 태그이다.
"융합된" 또는 "연결된"이란 구성 요소(예: Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)가 직접 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 펩티드 링커를 지칭하며, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 3 내지 5개의 아미노산 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.　
용어 "면역글로불린"은 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합된 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 구성된 약 15만 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역이라고도 불리는 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역이라고도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. IgG 부류의 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 두 개의 Fab 분자와 Fc 도메인으로 구성된다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)라고 불리는 다섯 가지 유형 중 하나에 할당될 수 있으며, 이중 일부는 하위 유형, 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 카파(κ)와 람다(λ)라는 두 가지 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄가 일반적으로 재조합 DNA 기술로 제조된 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 토끼 또는 뮤린 가변 영역과 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 세그먼트와 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 세그먼트를 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 종래의 재조합 DNA를 포함하며, 유전자 형질감염 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다(Morrison, S.L., et al., 1984).
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체 인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 이러한 인간 항체의 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다. 키메라 및 인간화 항체에 대해 또한 언급된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또한, 예를 들어, "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변경 또는 돌연변이(예: IgG1에서 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이로)에 의해 불변 영역에서 변형된 이러한 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, HEK 세포, NS0 또는 CHO 세포로부터 또는 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 유전자도입된 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열에서 파생되고 관련되지만 생체내 인간 항체 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"인간 컨센서스 프레임워크 "는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위 그룹으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 하위 그룹은 문헌(Kabat et al., 1991)에 기재된 바와 같은 하위 그룹이다.　
"인간화" 항체는 비인간 HVR의 아미노산 잔기 및 인간화를 거친 인간 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예: CDR)은 비인간 항체의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 구체적으로, 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변경되어, 즉 감소되거나 폐지된 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 새로운 특성을 생성하는 인간화 항체의 형태가 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "이중특이적"은 적어도 oxMIF 항원 및, 예를 들어, CD3 또는 HSG 항원과 같지만 이에 제한되지 않는 추가 항원과의 결합 반응을 지칭한다. 이중특이적 항체는 구체적으로 특정 결합 특성을 갖는 적어도 두 개의 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 두 개의 상이한 표적 항원, oxMIF 및 추가 항원은 항체에 의해 인식된다. 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 2개의 결합 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 결합 부위는 상이한 항원, 예를 들어, CD3 또는 HSG 및 oxMIF에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가의 예시적인 이중특이적 포맷은 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 결합 부위는 oxMIF에 결합하고, 하나 이상의 결합 부위는 하나 이상의 상이한 항원, 예를 들어, CD3 또는 HSG에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 "이중특이적 항체"는 두 개의 상이한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같이 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있지만, 여전히 침묵된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 이종이량체는 CH3 변이체 쌍을 운반하는 조작된 Fc 단편이 우선적으로 동종이량체보다는 이종이량체를 형성하도록 각 도메인 상에 상이한 돌연변이를 갖는, CH3 도메인 계면에 대한 변형을 통해 조작될 수 있다(Ha J-H. et al., 2016). 이중특이적 항체 포맷의 예는 문헌[Spiess C. et al., 2015, and Brinkmann U. and Kontermann R.E., 2017]에 기재된 바와 같이 이중특이적 IgG(BsIgG), 추가 항원 결합 모이어티가 부착된 IgG, BsAb 단편, 이중특이적 융합 단백질, BsAb 접합체, 하이브리드 bsIgG, 변형된 Fc 융합 단백질, 부착된 IgGs-HC 융합체, 부착된 IgGs-LC 융합체, 부착된 IgGs-HC & LC 융합체, Fc 융합체, CH3 융합체, F(ab')2 융합체, CH1/CL, 변형된 IgG, Fc-변형 IgG, 디아바디 등일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 이중특이적 항체 또는 항체 단편을 포함하는 대안적인 구현예에서, 용어 "IgG - scFv"는 단일특이적 면역글로불린 G(IgG)에 하나의 scFv를 융합함으로써 이중특이성을 위해 조작된 이중특이적 항체의 일종을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 이중특이적 항체는 Fc 침묵된다, 즉 그들은 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형을 갖는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG의 특이성은 oxMIF에 대한 것일 수 있고, scFv의 특이성은 CD3 또는 HSG에 대한 것이거나 그 반대의 경우일 수 있다. 또한, 경쇄 또는 중쇄 중 하나의 아미노 말단 또는 C 말단에 scFv가 부착될 수 있으며, 이는 다양한 유형의 IgG-scFv 이중특이적 항체(BsAb)의 생산으로 이어진다: (i) 전장 IgG HC 중 하나의 C 말단에 연결된 scFv인 IgG(H)-scFv; (ii) scFv가 HC N-말단에 연결되어 있다는 점을 제외하면 IgG(H)-scFv와 동일한 scFv-(H)IgG; (iii) IgG(L)-scFv 또는 (iv) 각각 IgG(L)-scFv 또는 scFv-(L)IgG를 형성하는 IgG 경쇄의 C 또는 N-말단에 연결된 scFv인 scFv-(L)IgG. 구체적으로, IgG-scFv는 165kDa 내지 185kDa 범위 내이며, 구체적으로 약 175kDa이다.
대안적인 구현예에 따르면, 디아바디와 같은 재조합 가변 도메인을 침묵형 Fc 영역(예: scDb-Fc)에 융합하면 원자가를 상당히 증가시킬 수 있다. 증가된 크기는 또한 혈청 내 디아바디의 반감기를 연장할 수 있다.　
용어 "디아바디"는 작은 펩티드 링커로 연결된 중쇄 가변(VH) 영역과 경쇄 가변(VL) 영역으로 구성되는 단일 쇄 Fv(scFv) 단편의 비공유 이량체를 지칭한다. 또 다른 형태의 디아바디는 두 개의 scFv 단편이 서로 공유 결합되어 있는 단일 쇄 (Fv)2이다. 또한, 각 쇄의 유전자를 내부 링커로 텐덤 연결함으로써, 4개의 VH 및 VL 도메인은 탠덤으로 발현되고 단일 쇄 디아바디(scDb)로 접힐 수 있으며, 이는 또한 이중특이적 항체 생산을 위한 효과적인 전략이다. 구체적으로, 디아바디-CH3은 약 125kDa이다.
특정 구현예에서, 용어 Fab/bs(scFv)2-Fc는 bs(scFv)2로 대체되는 하나의 Fab 암을 갖는 IgG이고 두 번째 IgG 암이 보존되어 있는 이중특이적 항체를 지칭한다.
특정 구현예에서, 용어 Fab/scFv-Fc는 scFv로 대체된 하나의 Fab 암을 갖는 IgG이고 두 번째 IgG 암이 보존되어 있는 이중특이적 항체를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같고 도 12에 개략적으로 도시된 바와 같은 항체 C0132는 Fab/scFv-Fc의 비제한적인 예로서 작용한다.
특정 구현예에서, 용어 Fab/Fab-scFv-Fc는 Fab-scFv로 대체된 하나의 Fab 암을 갖는 IgG이고, 두 번째 IgG 암이 보존되어 있는 이중특이적 항체를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같고 도 12에 개략적으로 도시된 바와 같은 항체 C0133은 Fab/Fab-scFv-Fc의 비제한적인 예로서 작용한다.
용어 "CrossMab"(여기서, Mab는 모노클로날 항체를 지칭함)는 독립적 모체 항체로부터 유래된 이중특이적 Abs의 한 포맷이다. 중쇄 미스페어링은 놉-인투-홀(knobs-into-holes; KIH) 방법을 적용함으로써 회피된다. 이중특이적 항체가 항체 도메인 교환으로 생산되는 반면, 하나의 Fab 암의 가변 도메인 또는 불변 도메인(CL 및 CH1)이 경쇄와 중쇄 사이에서 교환되므로 경쇄 미페어링이 회피된다. 이 "크로스오버"는 항원 결합 친화도를 유지하고, 경쇄 미스페어링을 피하기 위해 두 개의 상이한 암을 또한 보존한다. CrossMab의 예는 상이한 영역에서 교환된 Fab, VH-VL 및 CH1-CL일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. CrossMAb Fab에서, 전체 VH-CH1 및 VL-CL 영역이 교환되고, CrossMAb VH-VL 포맷에서 VH 및 VL 영역만 교환되며, CrossMAb 　CH1-CL1 포맷에서 이중특이적 항체의 CH1 및 CL 영역이 교환된다. 구체적으로, CrossMab은 약 150kDa이다.
본 발명의 oxMIF 항체는, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 CD3γ(감마) 쇄, CD3δ(델타) 쇄 및 CD3ε(엡실론) 쇄를 포함하는 CD3의 추가 에피토프, 구체적으로 인간 CD3의 에피토프를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 고정된 항-CD3 항체와 같은 T 세포 상의 CD3의 클러스터링은 T 세포 수용체의 결합과 유사하지만 클론-전형적 특이성과는 무관한 T 세포 활성화로 이어진다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 CD3 결합 도메인은 인간 CD3과 강력한 CD3 결합 친화도를 나타낼 뿐만 아니라 각각의 시노몰구스 원숭이 CD3 단백질과 우수한 교차 반응성을 나타낸다. 일부 경우에, 항체의 CD3 결합 도메인은 시노몰구스 원숭이의 CD3과 교차 반응성이다. 하나의 구현예에서, 항-CD3 결합 부위는 본원에 기재된 항-CD3 결합 도메인의 하나 이상(예: 3개 모두)의 경쇄 상보성 결정 영역 및/또는 본원에 기재된 항-CD3 결합 도메인의 하나 이상(예: 3개 모두)의 중쇄 상보성 결정 영역, 예를 들어, 하나 이상, 예를 들어, 3개 모두의 LC CDR 및 하나 이상, 예를 들어, 3개 모두의 HC CDR을 포함하는 항-CD3 결합 도메인을 포함한다.　
추가 구현예에 따르면, 항체는 이펙터 T 세포, NK-세포 또는 대식세포에서 발현되는 하나 이상의 항원, 구체적으로 CD3, ADAM17, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11a, CD11b, CD14, CD16, CD16b, CD25, CD28, CD30, CD32a, CD40, CD 40L, CD44, CD45, CD56, CD57, CD64, CD69, CD74, CD89, CD90, CD137, CD177, CEAECAM6, CEACAM8, HLA-DR 알파-쇄, KIR, LSECtin 또는 SLC44A2 중 하나 이상 또는 하나 이상의 합텐 항원, 즉 HSG를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 추가 결합 부위를 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 모수네투주맙, 파소툭시주맙, 시비사타맙, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙 또는 포랄루맙의 CD3 가변 결합 도메인 중 하나 이상을 추가로 포함하는 이중특이적 항체이다.　
특정 구현예에 따르면, 항-CD3 결합 부위는 무로모납-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙(TRX4), 테플리주맙(MGA031), 비실리주맙(누비온), 솔리토맙, 블리나투모맙, 파소툭시주맙, 시비사타맙, 모수네투주맙, SP34, X35, VIT3, BMA030(BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 및 WT-31 및, 적용 가능한 경우, 이의 임의의 인간화 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
구체적으로, 항-CD3 가변 영역의 하나 이상의 CDR 또는 무로모납, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙, 솔리토맙, 블리나투모맙, 파소툭시주맙, 시비사타맙, 모수네투주맙의 CDR 서열의 임의의 것과 적어도 70%, 구체적으로 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 포함하거나 갖는 CDR이 본 발명에 따른 CD3 결합 도메인으로 사용될 수 있다.
CD3에 결합하는 상기 특정 CDR은 다음과 같다:
[표 1B]
[표 2]
보다 구체적으로, 이중특이적 항-oxMIF/항-CD3 항체는 상기 나열된 각 CDR 서열에 0, 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.
추가 구체적인 구현예는 항-oxMIF/항-CD3 bs(scFv)2를 지칭하고, 여기서 상응하는 가변 중쇄 영역(VH) 및 상응하는 가변 경쇄 영역(VL) 영역이 N-말단으로부터 C-말단으로 VH(oxMIF)-VL(oxMIF)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(oxMIF)-VL(oxMIF) 또는 VH(CD3)-VL(CD3)-VL(oxMIF)-VH(oxMIF) 순서로 배열된다. 본 발명에 따르면, bs(scFv)2는 힌지 영역에 의해 침묵된 Fc-부분 또는 침묵된 Fc-도메인에 융합된다.
추가 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체는 HSG(히스타민-석시닐-글리신) 합텐을 특이적으로 추가로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 항-HSG 결합 부위는 마우스(m) 항-HSG 항체 679(m679) 및, 적용 가능한 경우, 이의 임의의 인간화(hz) 유도체로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
이러한 이중특이적 항-oxMIF 항체는 아래 표 3 및 4에 열거된 바와 같은 CDR을 포함하는 HSG를 특이적으로 인식하는 결합 부위를 포함할 수 있다(hz 항-HSG 항체 679(hz679) 서열은 US 2009/0240037 A1에서 유래됨).
[표 3]
[표 4]
보다 구체적으로, 이중특이적 항-oxMIF/항-HSG 항체는 상기 나열된 각 CDR 서열에 0, 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.
추가의 구체적인 구현예는 항-oxMIF/항-HSG bs(scFv)2를 지칭하고, 여기서 상응하는 가변 중쇄 영역(VH) 및 상응하는 가변 경쇄 영역(VL) 영역은 N-말단으로부터 C-말단으로 VH(oxMIF)-VL(oxMIF)-VH(HSG)-VL(HSG), VH(HSG)-VL(HSG)-VH(oxMIF)-VL(oxMIF) 또는 VH(HSG)-VL(HSG)-VL(oxMIF)-VH(oxMIF) 순서로 배열된다. 본 발명에 따르면, bs(scFv)2는 힌지 영역에 의해 침묵된 Fc-부분 또는 침묵된 Fc-도메인에 융합된다.
추가 구현예에서, 상기 항체는 구체적으로 이중특이적 IgG, CD3 또는 HSG 결합 부위가 부착된 IgG, BsAb 단편, 이중특이적 융합 단백질, BsAb 접합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된 Fc 침묵형 이중특이적 항체이다.
고형 종양에서 직접 방사성 표지 항체의 느린 혈액 제거와 지연된 종양 흡수는 건강한 조직과 장기에 지속적으로 높은 방사선 선량 노출을 일으킨다. 생체내 사전표적화된 방사선 면역요법(PRAIT)은 이러한 제한을 극복할 수 있도록 하지만, PRAIT를 위한 bsMab 포맷의 선택 및 설계는 여전히 어려운 과제이다. PRAIT는 직접 방사성 표지된 항체 또는 항체 단편과 비교하여 증가된 흡수 선량을 종양에 전달함으로써 치료 지수(종양 대 정상 조직 비율)를 개선하는 것을 목표로 한다. PRAIT는 HSG와 종양 표적에 대한 bsMab를 투여하고, 며칠 후 방사성 표지된 2가 HSG 합텐을 투여함을 포함한다. 이 기술을 사용하면, 상당량의 bsMab가 종양에 축적되어 순환에서 대량으로 제거되고, 방사성 표지된 2가 HSG 합텐은 종양에 축적된 bsMAb에 결합하는 반면, 결합되지 않은 방사성 HSG 합텐은 수 시간 내에 신장을 통해 순환에서 제거된다. 따라서, 방사능에 대한 정상 장기의 노출을 최소화할 수 있다(US2005/0025709, Sharkey RM et al., 2005, Rossi EA et al., Karacay H. et al, 2005).
표적화 방사성 핵종 요법의 경우, 예를 들어, 방사성 핵종으로 HSG 합텐 IMP288(US2005/0025709에 개시된 바와 같음) 및 177Lu가 사용될 수 있다. IMP288은 두 리신 잔기가 ε-아미노그룹을 통해 HSG 모이어티로 유도체화되는 DOTA-접합된 D-Tyr-D-Lys-D-Glu-D-Lys-NH2 테트라펩티드이다.　
용어 "표적" 또는 "표적 항원"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "항원"은 전체 표적 분자 또는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 이러한 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 일반적으로 "에피토프", 예를 들어, 면역학적으로 관련되는 B 세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로서 지칭되는 항원의 하위 구조, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 특히 본 발명의 항체 포맷의 결합 부위에 대한 특정 결합 파트너를 완전히 구성하거나 특정 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭할 것이다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 이의 유도체 및 이의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드 구조, 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 포함된 경우, 이는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산, 구체적으로 5 내지 40개의 아미노산, 구체적으로 10개 미만의 아미노산, 구체적으로 4 내지 10개의 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 1차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나 중첩될 수 있다. 구조적 에피토프는 폴리펩티드를 접어서 3차 구조를 형성함으로써 함께 결합된 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며, 아미노산은 선형 서열에서 반드시 서로 인접할 필요는 없다. 이러한 oxMIF 에피토프는 oxMIF의 중앙 영역 내에 위치한 서열 EPCALCS(서열번호 42)일 수 있다.　
용어 "항원 결합 도메인" 또는 "결합 도메인" 또는 "결합 부위"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 모이티의 일부를 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분은 에피토프라고 한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역이라고도 함)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본 발명의 항체와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "결합 부위"는 항원과 결합 상호 작용할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 전형적으로, 결합 부위는 본원에서 "CDR 결합 부위"라고 지칭되기도 하는 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치하며, 이는 다양한 항원에 결합 기능을 부여하는 다양한 구조를 갖는 특정 영역이다. 다양한 구조는 항체의 천연 레퍼토리, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 레퍼토리로부터 유래될 수 있거나, 예를 들어, 돌연변이유발에 의해, 구체적으로 무작위화 기술에 의해 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 이들은 돌연변이유발 CDR 영역, 가변 항체 도메인의 루프 영역, 특히 항체의 CDR 루프, 예를 들어, 임의의 VL 및/또는 VH 항체 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 루프를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 항체 포맷은 전형적으로 하나 이상의 CDR 결합 부위를 포함하며, 각각은 항원에 특이적이다.
본원에 기재된 항체의 oxMIF 결합 부위는 산화된 형태의 MIF, 즉 동물, 구체적으로 마우스, 래트, 원숭이 및 인간과 같지만, 이에 제한되지 않은 포유류 oxMIF, 구체적으로 인간 oxMIF에 대해 특이적이지만 환원된 MIF에 대한 실질적인 교차 반응성을 나타내지 않는다. oxMIF는 염증성 질환을 갖는 대상체의 순환 및 암 환자의 종양 조직에서 특이적으로 주로 검출될 수 있는 MIF의 질환 관련 구조적 이소형이다. 하나의 구현예에서, 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 부위는 본원에 기재된 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 도메인의 하나 이상(예: 3개 모두)의 경쇄 상보성 결정 영역, 예를 들어, 서열번호 2, 5, 6, 7 또는 8에 포함된 CDR 및/또는 본원에 기재된 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 도메인의 하나 이상(예: 3개 모두)의 중쇄 상보성 결정 영역, 예를 들어, 서열번호 3, 4, 9 또는 43을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "특이적"은 이종 분자 집단에서 관심 있는 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 본원에서, 결합 반응은 적어도 oxMIF 항원과 함께 이루어진다. 따라서, 지정된 조건, 예를 들어, 면역검정 조건하에, 그의 특정 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 샘플에 존재하는 다른 분자에 상당량으로 결합하지 않으며, 구체적으로 이는 환원된 MIF에 대해 실질적인 교차 반응성을 나타내지 않는다.　
특정 결합 부위는 전형적으로 다른 표적과 교차 반응성이 아니다. 여전히, 특정 결합 부위는 표적의 하나 이상의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합할 수 있거나 다른 관련 표적 항원, 예를 들어, 상동체 또는 유사체에 교차 반응성일 수 있다.
특이적 결합은 결합이 선택된 바와 같이 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화도 또는 결합력 측면에서 선택적임을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 oxMIF와 같은 표적 항원에 대한 결합 상수 또는 결합 동역학이 표적 항원이 아닌 항원에 대한 결합 상수 또는 결합 동역학에 비해 적어도 10배 상이하고, 바람직하게는 차이가 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 1000배인 경우에 달성된다.　
본 출원 내에서 사용된 용어 "원자가"는 항체 분자에 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항체 분자에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
항체의 결합 부위와 관련하여 본원에 사용된 용어 "1가"는 표적 항원에 대해 지시된 하나의 결합 부위만을 포함하는 분자를 지칭한다. 따라서, 용어 "원자가"는 항원의 동일하거나 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 동일한 표적 항원에 대해 지시되는 결합 부위의 수로 이해된다.　
본 발명의 항체는 oxMIF에 특이적으로 결합하는 1가, 2가, 4가 또는 다가 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.　
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변성 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고 서열 변동성이고/이거나 항원 인식에 관여한다(Kabat et al., 1991). 초가변성 영역(HVR)은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되기도 하며, 이러한 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부와 관련하여 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 감안하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
카바트는 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의했다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 영역 서열에 이러한 "카바트 넘버링" 시스템을 명확하게 할당할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 항체 서열의 상동성 영역에서 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat et al., 1983, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 카바트 넘버링 시스템에 따른다. 불변 영역의 넘버링은 EU 넘버링 지수에 따른다.
CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약식-CDR 또는 a-CDR이라고 하는 CDR의 영역 내에 함유되어 있다. 달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인의 HVR 잔기 및 기타 잔기(예: FR 잔기)는 문헌(Kabat et al., 상기)에 따라 본원에서 넘버링된다. CDR 결정은 또한 IMGT에 따라 수행될 수 있다(Lefranc MP. 1997). IMGT에는 프레임워크 영역(FR-IMGT라고 명명됨)과 CDR(CDR-IMGT라고 명명됨)에 대한 자체 정의가 있다. IMGT 넘버링 방법은 생식계열 V 서열 정렬을 기반으로 1에서 128까지 연속적으로 잔기를 계수한다.
CDR(또는 SDR)은 문헌[MacCallum RM et al., 1996]에 따라 추가로 결정될 수 있다. 여기에서, 항원 접촉 잔기를 분석하고, 단백질 데이터 뱅크로부터 이용 가능한 항체 Fv 및 Fab 결정 구조에서 부위 형상을 결합한다. 각 항체 잔기에 대해 항원 접촉 성향이 제시되어 관찰된 항원 접촉을 기반으로 CDR에 대한 정의가 제안되도록 한다. 접촉은 결합 부위 내 중앙에 위치된 CDR 잔기에서 더 일반적이며; 일부 덜 중심적인 CDR 잔기는 큰 항원에 의해서만 접촉된다. CDR 내의 비접촉 잔기는 "표준" 형태를 정의하는 데 중요한 것으로 초티아 및 동료들(Chothia C et al., 1987)에 의해 식별된 잔기와 일치한다.
"점 돌연변이"는 특히 상이한 아미노산에 대한 아미노산의 하나 이상의 단일(비연속적) 또는 이중선의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 비조작된 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드의 조작으로 이해된다. 바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이와 관련하여, 아미노산은 61개의 삼중항 코돈에 의해 인코딩된 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이러한 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 아미노산으로 나눌 수 있다.
본원에서 식별된 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트( % ) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.　
본 발명에 따르면, 가변 또는 불변 영역 서열의 서열 동일성은 본원에 기재된 각각의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%이다.
"대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예: 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예: 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된 " 핵산"은 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산을 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외로 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항- oxMIF 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포 중 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
"실질적인 교차 반응성 없음"은 분자(예: 항체)가 특히 그 표적 항원과 비교될 때 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원(예: 표적 항원과 밀접하게 관련된 항원), 구체적으로 감소된 MIF를 인식하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합할 수 있거나, 또는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 대해 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만으로 구성되는 양으로 실제 표적 항원과 상이한 상기 항원에 결합할 수 있고, 바람직하게는 약 2%, 1% 또는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 실제 표적 항원과 상이한 항원에 결합할 수 있다. 결합은 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명과 같지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체의 재조합 생산은 바람직하게는, 예를 들어, 항체 포맷을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 작제물 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템을 이용한다.
용어 "발현 시스템"은 이러한 서열로 형질전환되거나 형질감염된 숙주가 인코딩된 단백질을 생산할 수 있도록 목적하는 코딩 서열과 제어 서열을 작동 가능한 연결로 함유하는 핵산 분자를 지칭한다. 형질전환을 수행하기 위해, 발현 시스템은 벡터에 포함될 수 있지만, 관련 DNA는 이어서 또한 숙주 염색체에 통합될 수 있다. 대안적으로, 발현 시스템은 시험관내 전사/번역에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적절한 숙주 유기체에서 그들의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로 정의된다. 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 추가로 일반적으로 숙주 세포 또는 게놈 통합 부위에서의 자율 복제를 위한 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커(예: 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 포함하며, 이 구성 요소는 함께 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체적으로, 상기 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자), 예를 들어, 본 발명의 항체 포맷을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에 도입되어 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예: 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다. 플라스미드는 본 발명의 바람직한 벡터이다.
벡터는 전형적으로 외부 DNA가 삽입된 전염성 제제의 DNA를 포함한다. DNA의 한 세그먼트를 DNA의 또 다른 세그먼트에 삽입하는 일반적인 방법은 제한 부위라고 불리는 특정 부위(뉴클레오티드의 특정 그룹)에서 DNA를 절단하는 제한 효소라고 불리는 효소의 사용을 포함한다.　
"카세트"는 정의된 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 발현 산물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외부 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입된 다음, 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 벡터에 의해 운반된다. 발현 벡터와 같이 DNA가 삽입되거나 첨가된 DNA의 세그먼트 또는 서열은 또한 "DNA 작제물"이라고 지칭될 수 있다. 일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 일반적으로 추가 (외부) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적절한 숙주 세포에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자체 함유된 분자이다. 본 발명의 벡터는 종종 코딩 DNA 및 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터 DNA를 함유하며, 외부 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 코딩 DNA는 본 발명의 항체 포맷과 같은 특정 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시, 조절 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA와 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서의 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어, 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
DNA 서열을 결찰시키는, 예를 들어, 본 발명의 인자 및/또는 관심 단백질, 프로모터, 종결자 및 추가 서열을 각각 제공하거나 코딩하고, 통합 또는 숙주 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터에 삽입하는 데 사용되는 절차는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Sambrook et al, 2012)에 기재되어 있다.
숙주 세포는 구체적으로 본 발명에 따른 벡터와 같은 발현 작제물로 형질감염된 세포, 재조합 세포 또는 세포주로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 용어 숙주 세포주는 본 발명의 재조합 항체 포맷과 같은 폴리펩티드를 생성하기 위해 내인성 또는 재조합 유전자를 발현하는 데 사용되는 세포주를 지칭한다.　
"생산 숙주 세포" 또는 "생산 세포"는 일반적으로 생산 공정의 생성물인 본 발명의 재조합 항체 포맷을 수득하기 위해 생물 반응기에서 배양할 준비가 된 세포주 또는 세포 배양물인 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 숙주 세포 유형은 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.　
본원에 사용된 용어 "재조합"은 "유전공학에 의해 제조된" 또는 "유전공학의 결과", 예를 들어, 구체적으로 재조합 벡터 또는 재조합 숙주 세포에 혼입된 이종 서열을 사용함을 의미한다.
본 발명의 항체는 임의의 공지되고 익히 확립된 발현 시스템 및 재조합 세포 배양 기술을 사용하여, 예를 들어, 박테리아 숙주(원핵 시스템) 또는 진핵 시스템, 예를 들어, 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 항체 분자는 유전자도입 유기체, 예를 들어, 염소, 식물 또는 유전자도입 마우스, 인간 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 갖고 마우스 항체 생산이 결핍된 조작된 마우스 균주에서 생산될 수 있다. 항체는 또한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.　
특정 구현예에 따르면, 숙주 세포는 CHO, PerC6, CAP, HEK, HeLa, NS0, SP2/0, 하이브리도마 및 Jurkat으로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포의 생산 세포주이다. 보다 구체적으로, 숙주 세포는 CHO 세포로부터 수득된다.
본 발명의 숙주 세포는, 예를 들어, 혈청에 대한 대안으로서 다른 구성 요소, 예를 들어, 혈장 단백질, 호르몬 및 성장 인자를 포함하는 무혈청 배양물에서 특이적으로 배양되거나 유지된다.
숙주 세포는 무혈청 조건하에, 그리고 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩티드가 없는 배지에서 확립되고, 적응되고 완전히 배양될 때 가장 바람직하다.　
본 발명의 항-oxMIF 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
용어 "약제학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태로 존재하며, 제형이 투여되는 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 구성 요소를 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 무독성인 약제학적 제형 중의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 일부 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 히스티딘, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합이다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 물질의 추가 예는 항체의 유통 기한 또는 효과를 향상시키는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 치료되는 개체의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 예후 개선을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본 발명의 항-oxMIF 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 진단제 또는 예방제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 치료 치료될 질환에 따라 다른 항신생물제, 항종양제, 항혈관신생제 및 화학요법제, 스테로이드 또는 체크포인트 억제제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어, 액체 용액(예: 주사 가능한 용액 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜 및 좌제일 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 인간의 수동적 면역화에 사용된 것들과 유사한 조성물과 같이 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 투여(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 항체의 최적화되고 유리한 특성으로 인해, 고용량의 항체 조성물이 투여될 수 있다. 구체적으로, 조성물은 약 10 내지 250mg/ml의 항체, 구체적으로 25 내지 100mg/ml, 구체적으로 ≥ 50mg/ml를 포함한다.
항-oxMIF 항체는 1회 투여될 수 있고, 보다 바람직하게는 여러 번 투여될 수 있다. 예를 들어, 항체는 매일 3회 내지 6개월 이상 마다 1회 투여될 수 있다. 투여는 매일 3회, 매일 2회, 매일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 매주 1회, 2주에 1회, 매월 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회 및 6개월에 1회와 같은 일정으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 MIF 관련 상태, 구체적으로 면역학적 질환, 예를 들어, 염증성 질환 및 과증식성 장애에 대한 치료가 필요한 대상체의 치료를 위한 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 인간이다.　
본원에 사용된 용어 "암"은 증식성 질환, 구체적으로 고형 암, 예를 들어, 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreas cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma; SCC)(예: 두경부, 식도 및 구강), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma), 신장암(kidney cancer), 갑상선 수질암(medullary thyroid cancer), 유듀 갑상선암(papillary thyroid cancer), 성상세포 종양(astrocytic tumor), 신경모세포종(neuroblastoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 위암(gastric cancer), 및 임의의 상기 암의 난치성 버전을 포함한 악성 정상피종(malignant seminoma), 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 지칭한다.
본 발명의 항-oxMIF 항체에 의해 치료될 수 있는 과증식성 장애, 예를 들어, 암성 질환 또는 암은 임의의 조직 또는 장기를 포함할 수 있고, 뇌암, 폐암, 편평 세포암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 두부암, 경부암, 간암, 신장암, 난소암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 부인과암, 비인두암 또는 갑상선암, 흑색종, 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 항-oxMIF 항체는 난소, 췌장, 결장 및 폐의 암종을 치료하는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 암성 질환의 치료, 구체적으로 고형 종양의 치료에 매우 적합한 항체는
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는　
(a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는　
(b2) 서열번호 3 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 침묵된 Fc 및 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는 재조합 항-oxMIF 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 항-oxMIF/항-CD3 항체 또는 이중특이적 항-oxMIF/항-HSG 항체이고,
여기서, 아미노산 위치는 카바트에 따라 넘버링되고,
상기 변이체 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역에 비해 감소된 FcγR 결합을 나타내고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 치환이 결여된 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 항체에 비해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 치료적 유효량의 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함한 대상체에서 염증성 질환, 예를 들어, 혈관염, 관절염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 후천성 호흡 곤란 증후군, 사구체신염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 복막염, 신염, 아토피성 피부염, 천식, 결막염, 발열, 말라리아, NASH(비알코올성 지방증 간염), 다발성 경화증, 급성 및 만성 췌장염, 제1형 당뇨병, IgA 신장병증, 간질성 방광염, COVID 후 증후군, 건선, 사구체신염, 염증성 장 질환, 신염 및 복막염, 전신 홍반성 루푸스(SLE - 루푸스 신염 포함), 천식, 류마티스 관절염(RA) 및 염증성 장 질환(IBD)을 치료하기 위한 방법을 포함한다.
특정 구현예에서, 염증성 또는 감염성 질환의 치료에 매우 적합한 항체는 다음 가변 도메인:
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는　
(a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는　
(b2) 서열번호 3 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 침묵된 Fc 및 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
여기서, 아미노산 위치는 카바트에 따라 넘버링되고,
상기 변이체 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역에 비해 감소된 FcγR 결합을 나타내고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 치환이 결여된 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 항체에 비해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는다.
추가 구체적인 구현예에서, 염증성 또는 감염성 질환의 치료에 매우 적합한 항체는 또한 억제 수용체 FcgRIIB에 대해 증가된 우선적인 결합을 갖거나 초 알파 2,6-N-연결 시알릴화를 갖는 본원에 기재된 재조합 항-oxMIF 항체이다.
본 발명은 다음 구현예를 추가로 포함한다:
1. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형이 있는 서열번호 1을 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역, 및
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는　
(a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는　
(b2) 서열번호 3 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합으로서,
상기 아미노산 위치가 카바트에 따라 넘버링되고,
상기 변이체 Fc 영역이 야생형 IgG1 Fc 영역에 비해 감소된 FcγR 결합을 나타내고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 아미노산 치환이 결여된 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 항체에 비해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 아미노산 치환 W93F 및/또는 W97Y를 포함하는, 재조합 항-oxMIF 항체.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 아미노산 치환이 EU 넘버링에 따른 서열번호 1의 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, D265, S267, H268, N297, S298, T299, E318, L328, P329, A330, P331 중 어느 하나에 있는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 Fc 영역이 비글리코실화되는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 아미노산 치환이 위치 L234 및 L235, 구체적으로 L234A 및 L235A에 있는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
6. 구현예 1에 있어서, 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 43으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
7. 구현예 1에 있어서,
i.) 서열번호 3 및 6,
ii.) 서열번호 9 및 6,
iii.) 서열번호 4 및 6,
iv.) 서열번호 4 및 8,　
v.) 서열번호 4 및 5, 또는
vi.) 서열번호 43, 및 서열번호 5, 6, 7 또는 8 중 어느 하나를 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
8. 구현예 7에 있어서, 서열번호 14를 추가로 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
9. 구현예 1에 있어서, 서열번호 15, 및 16 또는 17로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
10. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형이 있는 서열번호 1을 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역을 포함하는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
서열번호 74 또는 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열, 및　
서열번호 75로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열 및　
서열번호 76 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
서열번호 77 또는 84로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함하고,
단, 서열번호 74와 서열번호 77은 함께 포함되지 않는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 아미노산 치환이 서열번호 1의 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, I253, D265, S267, H268, N297, S298, T299, H310, E318, L328, P329, A330, P331, H435 중 어느 하나에 있고, 구체적으로 상기 아미노산 치환이 EU 넘버링 지수에 따라 위치 L234 및 L235, 구체적으로 위치 L234, L235, H310 및 H435에 있고/있거나 상기 Fc 영역이 비글리코실화되는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 이중특이적 항체(즉, 크로스맵), scFv-Fc, (scFv)2-Fc, scFv/scFv-Fc, Fab/scFv-Fc, Fab/(scFv)2-Fc, Fab/Fab-scFv-Fc, Fab/Fab-crossFab-Fc, IgG-scFv 및 IgG-(scFv)2로 구성되는 그룹으로부터 선택된, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항체가 CD3 또는 히스타민-석시닐-글리신(HSG)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 추가로 포함하는 이중특이적 항체인, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
14. 항목 13에 있어서, 상기 항체가 제1 단계에서 대상체에게 투여되고, HSG 합텐이 제2 단계에서 투여되며, 상기 HSG 합텐이 항체에 결합하고 방사성 핵종으로 표지되는, 고형 종양의 치료 또는 검출에 사용하기 위한, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
15. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 의약의 제조에 사용하기 위한, Fc 침묵형 항체.
16. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예의 항체를 임의로 약제학적 담체 또는 보조제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
17. 구현예 16에 있어서, 상기 조성물이 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예의 항체 10 내지 250mg/ml, 구체적으로 > 50mg/ml를 포함하는, 약제학적 조성물.
18. 구현예 16 또는 17에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 피하 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
19. 구현예 16 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조성물이 단독 물질로서 투여하기 위한 것이거나, 바람직하게는 항바이러성 물질, 항암 물질, 항염증성 물질 및 항생 물질로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 활성 물질을 포함하는 추가의 약제학적 조성물과 함께 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
20. 구현예 16 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 염증성 질환, 감염성 질환을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 천식, 혈관염, 관절염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 후천성 호흡 곤란 증후군, 사구체신염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 복막염, 신염, NASH(비알코올성 지방증 간염), 다발성 경화증, 급성 및 만성 췌장염, 제1형 당뇨병, IgA 신장병증, 간질성 방광염, COVID 후 증후군 및 건선의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
21. 구현예 16 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 과증식성 장애 또는 암을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 결장직장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 위암 및 폐암의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
22. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
23. 구현예 22의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
24. 구현예 22의 핵산 또는 구현예 23의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
25. 구현예 24의 숙주 세포를 배양하고 상기 항체를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예의 항체를 제조하는 방법.
실시예
본원에 기재된 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 이에 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재되고 예시된 기술에 많은 수정 및 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 실시예는 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예 1: 실시예 섹션 내에 사용된 항-oxMIF 항체(표 5A) 및 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(표 5B)의 변이체 ID, 서열 조합 및 서열.
[표 5A]
[표 5B]
실시예 2: 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 성향 감소 및 감소된 소수성
소수성 및 응집을 평가하기 위해, 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118을 대조군 항-oxMIF 항체 C0008 및 Fc 침묵이 없는 모체 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 두 개의 상이한 SEC 컬럼 및 작동 완충 조건을 사용하는 겔 여과(SEC)에 의해 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 분석하였다.
SEC의 경우, 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS)에서 1mg/ml로 희석하고, 100μl 샘플을 1.25ml/분의 유속으로 Enrich 650(Bio-Rad) 겔 여과 컬럼에 적용했다. 분리 및 평형은 실온에서 1xPBS로 수행했다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 ChromLab 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석했다. 결과는 주요 피크에 대한 체류 용적(Vr, ml)으로 보고되며, 응집체의 존재는 수동으로 순위를 매겼다.　
소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 분석을 위해, 모든 샘플을 50mM 인산염과 0.75M 황산암모늄, pH 6.9를 사용하여 최종 농도 1mg/ml로 희석시켰다. 고도로 정제된 항체 샘플(약 100μg)을 1ml HiTrap 부틸 HP 컬럼에 독립적으로 로딩했다. 100μl 샘플을 주입하고, 컬럼 유속을 22℃에서 1ml/분으로 유지시켰다. 피크의 분리는 0-100%B(완충액 B: 50mM 인산염, 20% 이소프로판올; pH7.0)의 20-컬럼 용적(CV) 구배에 걸쳐 수행되었다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 ChromLab 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석했다.
결과: 대조군 항체 C0008은 크기 배제 컬럼의 공극 용적(약 16 내지 18ml Enrich 650)에 가까운 체류 용적을 입증했으며, 이는 인간 IgG에 대해 예상된 것보다 훨씬 더 작은 분자량에 상응한다(도 1A 및 B). 비정상적으로 긴 체류는 주로 고정상 표면과의 소수성 상호 작용에 기인했다. 또한, 높은 체류 용적에, 상당량의 IgG 이량체 및 응집체가 C0008에 대해 존재했다. 새로 설계된 모든 항체는 감소된 체류 용적(Vr)을 나타냈고, 이는 컬럼과의 상호 작용이 감소하여 분자의 소수성이 감소했음을 입증한다(표 6, 도 1A 및 B). 새로 설계된 항체 C0115와 C0118은 분자량 표준과 비교했을 때 단량체성 인간 IgG의 분자량에 상응하는 체류 용적(표 6, 도 1B)을 나타냈다. 추가로, 항체 이량체 및 응집은 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 샘플에서 현저히 감소되었다(도 1B). 신규 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 Fc 침묵 돌연변이는 각각 wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083 및 C0090와 비교하여 SEC 프로파일을 변경하지 않았다.
HIC 컬럼 체류 용적은 소수성의 척도이며, 여기서 낮은 체류 용적을 갖는 항체는 높은 체류 용적을 갖는 항체보다 덜 소수성이다(도 1C). 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118은 매우 높은 소수성을 나타내는 대조군 항체 C0008(체류 용적 약 21ml)에 비해 덜 소수성인 것으로 입증되었다(체류 용적 15 내지 16ml). 신규 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 Fc 침묵 돌연변이는 각각 wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 HIC 프로파일을 변경하지 않았다.
결론: SEC 및 HIC 분석으로부터, 새로 설계된 항체가 대조군 항-oxMIF 항체 C0008과 비교하여 개선된 생화학적 특성, 특히 감소된 소수성 및 응집 성향을 갖는다는 것이 분명하다.
[표 6]
도 1은 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. (A) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 Enrich 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역) 및 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 모체 항체(C0083 및 C0090, Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교; (B) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 Enrich 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역) 및 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 용출 프로파일의 비교; (C) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역) 및 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118 및 그들의 모체 항체 C0083 및 C0090(Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교.
실시예 3: 고정된 MIF에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 결합(KD 결정)
1μg/ml로 PBS에서 희석된 재조합 인간 MIF를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에 고정시켰다(문헌(Thiele et al., 2015)에 따라 MIF를 oxMIF로 형질전환시킴). 차단 후, 항-oxMIF 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가했다. 마지막으로, 염소 항-인간 IgG (Fc)-HRP 접합체와 테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로 사용하여 결합된 항체를 검출시켰다. 발색 반응은 3M H2SO4를 사용하여 중지시키고, OD를 450nm에서 측정했다. 상이한 실험의 데이터는 각 실험의 항-oxMIF 항체 C0008의 최대 OD(=100%)로 정규화되었고, EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 4-매개변수 적합에 의해 결정되었다(두 실험의 평균 +/- SEM이 표시됨).　
결과 및 결론: 고정된 MIF(oxMIF)에 대한 새로 설계된 항체의 결합은 광범위한 농도에 걸쳐 측정되었으며, 생성되는 결합 곡선은 도 2에 예시되어 있다. 항-oxMIF 항체 C0008은 oxMIF 결합에 대한 참조로 사용되었다. 겉보기 KD를 나타내는 결합 곡선 및 계산된 EC50 　값은 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118이 C0008과 비교하여 oxMIF에 대한 낮은 나노몰 친화도를 유지했음을 명확하게 보여주었다(도 2, 표 7).　
도 2는 고정된 oxMIF에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 결합 곡선을 보여준다(KD 결정). 항-oxMIF 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었으며, C0008은 참조 항체로서 사용되었다. EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 의해 결정되었다(두 실험의 평균 +/- SEM이 표시됨).
[표 7]
실시예 4: oxMIF 대 redMIF에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 차등 결합.
항-oxMIF 항체와 인간 IgG 동형 대조군을 4℃에서 밤새 15nM의 농도로 마이크로플레이트에 고정시켰다. 차단 후, 웰을 50ng/ml의 redMIF 또는 oxMIF 대리 NTB-MIF와 함께 배양했다(Schinagl et al., 2018). 포획된 oxMIF를 폴리클로날 토끼 항-MIF 항체와 염소 항-토끼 IgG-HRP로 검출시켰다. 플레이트를 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 염색시키고, 30% H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 중지시켰다. OD는 450nm에서 측정했다. 상이한 실험의 데이터는 각 실험의 항-oxMIF 항체 C0008의 최대 OD(=100%)로 정규화되었으며, 2 내지 3개 실험의 평균 +/- SEM이 표시된다.
결과 및 결론: 가용성 oxMIF 및 redMIF에 대한 새로 설계된 항체의 결합은 도 3에 예시되어 있다. 결과는 새로 설계된 항체 C0115와 C0118이 oxMIF에는 강한 결합을 입증했지만, redMIF에는 결합하지 않았음을 분명히 보여주었다. 새로 설계된 항체는 참조 항체 C0008과 매우 유사한 OD를 보였고, 이는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 것으로 기재되었다(Thiele et al., 2015). 동형 IgG에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 따라서, 감소된 소수성 및 응집과 Fc 침묵을 갖는 새로 설계된 항체는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 능력을 유지했다.
도 3은 oxMIF 대 redMIF에 대한 새로 설계된 항체의 차등 결합을 보여준다. C0008은 참조 항체로서 사용되었고, 동형 IgG는 음성 대조군으로 사용되었다. 2 내지 3회 실험의 평균 +/- SEM이 표시된다.
실시예 5: 리포터 검정에 의해 결정된 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 이펙터 기능.
상기 기재된 바와 같이, Fc 부분, 즉 L234A/L235A의 점 돌연변이에 의해 항체의 ADCC 및 ADCP 잠재력을 감소시키려는 노력이 이루어질 수 있다. 표적 결합 항체의 Fc 부분이 또한 이펙터 세포의 세포 표면에서 Fc 수용체에 결합하면, 두 세포 유형의 다중 가교결합이 발생하여 ADCC 또는 ADCP의 경로 활성화로 이어지며, 이는 기능적 Fc 관련 부작용을 방지하기 위한 표적 중화 항체에는 바람직하지 않다.　
ADCC를 규명하기 위해 인간 FcγRIIIa V158(고친화도 유전자형)을 안정적으로 발현하거나 ADCP를 규명하기 위해 인간 FcγRIIa-H131과 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 구동하는 NFAT 반응 요소를 안정적으로 발현하는 이펙터 세포로서 조작된 Jurkat 세포를 사용하면, 이펙터 세포에서 NF-AT 경로 활성화의 결과로 생성된 루시퍼라제를 통해 항체 생물학적 활성이 정량화된다.
ADCC 또는 ADCP 리포터 검정은 본질적으로 제조업체(Promega #G7010 & #G9991)에 의해 권장되는 바와 같이 수행되었다.
매우 반응성인 표적 세포를 생성하기 위해, HCT116 및 A2780 세포를 huMIF-pDisplay 플라스미드(Invitrogen)로 형질감염시키고, 제네티신으로 선택한 후 FACS로 분류하여 막 고정 단량체성 인간 MIF(HCT116-pMIF 또는 A2780-pMIF)를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성했다, 즉 MIF는 oxMIF 에피토프가 항-oxMIF 항체에 접근할 수 있는 단량체성 단백질로서 표시된다(Schinagl et al., Biochemistry 2018). 이러한 세포주는 세포 표면에서 oxMIF의 증가된 제시를 나타내고, 따라서 시험관내 분석에 더 민감한 도구이다. 간단히 말해, 100μl 배양 배지(Pen/Strept/L-글루타민 및 4% 낮은 IgG FBS가 보충된 RPMI 1640 배지) 중 1x104 세포/웰의 HCT116-pMIF(도 4 A 및 C) 또는 A2780-pMIF(도 4 B) 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 정치시켰다. 다음 날, 배양 배지를 제거하고, 25μl의 신선한 배양 배지로 교체했다. 침묵된 Fc를 갖는 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118 또는 그들의 모체 항체 C0083, C0090 및 wt Fc(최종 농도 0.01-100nM)를 갖는 대조군 항체 C0008의 연속 희석액 25μl 및 25μl의 Jurkat 이펙터 세포(도 4 A -B, 고반응자 유전자형 V158의 FcγRIIIa 수용체 이펙터 세포; 도 4 C, FcγRIIa 수용체 이펙터 세포)를 약 6:1의 이펙터 대 표적 세포 비율로 첨가하고, 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 6시간 동안 항체 및 이펙터 세포와 함께 배양했다. 마지막으로, 검정 플레이트를 실온으로 평형화시키고 75μl의 Bio-Glo 루시퍼라제 시약을 첨가했다. Tecan 멀티플레이트 판독기를 사용하여 10 내지 20분 배양 후 발광(RLU)을 측정했다(통합 시간 0.5초). 데이터(적절한 경우)는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
결과: 도 4 A-C로부터, Fc 침묵 돌연변이를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118은 ADCC(도 4 A -B) 또는 ADCP(도 4 C) 리포터 검정에서 리포터 세포의 임의의 활성화를 보이지 않은 반면, 대조군 항체 C0008(도 4 B)과 wt Fc를 갖는 그들의 모체 항체인 C0083 및 C0090(도 4 A)은 이펙터 세포의 강한 FcγRIIIa-(ADCC, 도 4 A -B) 또는 FcγRIIa-(ADCP, 도 4 C) 매개 활성화를 유도했음이 분명하다.　　
결론: Fc 침묵 돌연변이(L234A/L235A)를 보유하는 새로 설계된 변이체 C0115 및 C0118은 리포터 생물검정에서 ADCC 또는 ADCP의 임의의 개시를 나타내지 않았다. 따라서, 그들은 강하게 감소된 ADCC 및 ADCP 이펙터 기능을 나타낸다.
도 4는 리포터 검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 이펙터 기능을 보여준다. (A-B) 항-oxMIF 대조군 항체 C0008(B) 또는 wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083 및 C0090(A)와 비교하여 FcγRIIIa 및 HCT116-pMIF(A) 또는 A2780-pMIF(B) 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및/또는 C0118을 사용한 ADCC 리포터 생물검정; (C) wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 FcγRIIa 및 HCT116-pMIF 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및/C0118을 사용한 ADCP 리포터 생물검정. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
실시예 6: 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정으로 결정된 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115의 강하게 감소된 CDC 기능.
이 검정은 새로 설계된 항-oxMIF 항체에 의해 유도된 항체 구동 보체 의존성 세포독성(CDC)으로 인해 용해된 세포를 결정하기 위해 수행되었다. 세포독성은 LgBiT(LargeBiT)와 후리마진(기질)을 함유하는 비용해성 검출 시약을 사용하여 표적 세포로부터 HiBiT 태깅된 단백질의 방출을 정량화하는 HiBiT 검출 검정(Promega)으로 측정했다. HiBiT와 LgBiT는 기능적 NanoBiT® 효소로 자발적으로 조립되고 기질의 존재하에 정량화 가능한 발광 신호를 방출한다.
매우 반응성인 리포터 표적 세포를 생성하기 위해, HCT116 세포를 HaloTag-HiBiT 플라스미드(Promega #CS1956B17)로 형질감염시키고, 블라스티시딘으로 선택하고 FACS에 의해 세포 풀로서 분류했다. 그런 다음, 안정한 HiBiT 발현 세포 풀을 huMIF-pDisplay 플라스미드(Invitrogen)로 형질감염시키고, 제네티신으로 선택하고, FACS로 분류하여 세포내 HiBiT와 막 고정 단량체성 인간 MIF(HCT116-HiBiT-pMIF)를 안정하게 발현하는 세포 풀을 생성했다, 즉 MIF는 oxMIF 에피토프가 항-oxMIF 항체에 접근 가능한 단량체성 단백질로서 표시된다(Schinagl et al., Biochemistry 2018). 이러한 세포주는 세포 표면에서 oxMIF의 증가된 제시를 나타내며, 따라서 시험관내 분석에 더 민감한 도구이다.
간단히 말해, 100μl 배양 배지(Pen/Strept/L-글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지) 중 1x104 세포/웰의 HCT116-HiBiT-pMIF 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 정치시켰다. 다음 날, 배양 배지를 제거하고, 50μl의 무혈청 RPMI 1640 및 무혈청 RPMI 1640(최종 농도 1-100nM) 중의 침묵된 Fc를 갖는 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 또는 wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083 및 니볼루맙(인간 IgG4, 음성 대조군)의 연속 희석액 50μl를 첨가했다. 항체를 37℃에서 30분 동안 세포와 함께 배양 후, 50μl의 아기 토끼 보체(BRC, 세달레인, 검정 직전에 무혈청 RPMI에서 1:10 희석됨)를 플레이트에 첨가했다. 보체를 첨가한 후, 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 다음 날, 10μl의 Nano-Glo HiBiT 세포외 검출 시약(Promega #N2421)을 첨가하고, 3분 후 Tecan 플레이트 판독기에서 발광 신호(RLU, 통합 시간 0.1초)를 측정했다. 데이터(적절한 경우)는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
결과 및 결론: 도 5는 Fc 침묵 돌연변이(L234A/L235A)를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115는 임의의 CDC 활성을 유도하지 않았으며, 측정된 신호가 음성 대조군(니볼루맙, IgG4)보다 훨씬 더 낮았다는 것을 명확하게 보여준다. 이와 대조적으로, wt Fc를 갖는 모체 항체 C0083은 인간 IgG1에 대해 예상된 바와 같이 HCT116-pMIF 세포의 보체 의존성 세포 용해를 보여주었다. 따라서, Fc 침묵(L234A/L235A) 돌연변이를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115는 강하게 감소된 CDC 활성을 나타낸다.
도 5는 보체 의존성 세포 독성 생물검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115의 강하게 감소된 CDC 활성을 보여준다. BRC를 보체 공급원으로 사용하고 HCT116-pMIF를 표적 세포로 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115를 사용한 CDC 생물검정은 wt Fc를 갖는 그의 모체 항-oxMIF 항체 C0083 및 IgG4 음성 대조군으로서 니볼루맙과 비교했다. 데이터(적절한 경우)는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SD가 표시됨).
실시예 7: PBMC 세포 용해 생물검정에 의해 결정된 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 ADCC 기능.
이 검정은 새로 설계된 항-oxMIF 항체에 의해 유도된 항체 의존성 세포독성(ADCC)으로 인한 세포 용해를 결정하기 위해 수행되었다. 세포독성은 LgBiT(LargeBiT)와 후리마진(기질)을 함유하는 비용해성 검출 시약을 사용하여 표적 세포로부터 HiBiT 태깅된 단백질의 방출을 정량화하는 HiBiT 검출 검정(Promega)으로 측정했다. HiBiT와 LgBiT는 기능적 NanoBiT® 효소로 자발적으로 조립되고 기질의 존재하에 정량화 가능한 발광 신호를 방출한다.
HCT116-HiBiT-pMIF 리포터 표적 세포가 실시예 6에 기재된 바와 같이 생성되었다.
간단히 말해, 50μl 배양 배지(Pen/Strept/L-글루타민과 5% 초저 IgG FBS(Thermo Scientific)가 보충된 RPMI 1640 배지) 중 1x104 세포/웰의 HCT116-HiBiT-pMIF 표적 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 정치시켰다. 다음 날, 배양 배지(최종 농도 0.01-100 nM) 중의 침묵된 Fc를 갖는 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118 또는 CO115의 모체 항체(wt Fc를 갖는 C0083) 및/또는 wt Fc를 갖는 참조 항체 C0008의 연속 희석액 50μl 및 두 명의 건강한 공여체로부터의 인간 PBMC 이펙터 세포(4x105 세포/웰; 이펙터 대 표적 세포 비율 40:1) 50μl를 플레이트에 첨가했다. 항체와 PBMC를 첨가한 후, 플레이트는 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 다음 날, 10μl의 Nano-Glo HiBiT 세포외 검출 시약(Promega #N2421)을 첨가하고, 3분 후 Tecan 플레이트 판독기에서 발광 신호(RLU, 통합 시간 0.1초)를 측정했다.
결과 및 결론: 도 6으로부터, Fc 침묵(L234A/L235A) 돌연변이를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118은 임의의 또는 강하게 감소된 ADCC 활성을 나타내지 않았음이 명백하다. 대조적으로, C0115의 모체 항체(C0083, wt Fc 포함)와 wt Fc를 포함하는 대조군 항-oxMIF 항체 C0008은 인간 IgG1에 대해 예상된 바와 같이, HCT116-HiBiT-pMIF 세포의 항체 의존성 세포 용해를 나타냈다. 따라서, Fc 침묵(L234A/L235A) 돌연변이를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115는 강하게 감소된 ADCC 활성을 나타낸다.
도 6은 PBMC 매개 세포 독성 생물검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115 및 C0118의 강하게 감소된 ADCC 활성을 보여준다. PBMC를 이펙터 세포로, HCT116-HiBiT-pMIF를 표적 세포로 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵형 항체 C0115(A) 및 C0118(B)을 사용한 ADCC 생물검정은 항-oxMIF 대조군 항체 C0008(B) 및 C0115의 모체 항-oxMIF 항체, 즉 wt Fc를 갖는 C0083(A)과 비교했다. 두 명의 건강한 공여체의 PBMC를 사용한 2회 반복의 평균 및 SEM이 표시된다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다.
실시예 8: A2780 MIF-/- 세포에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 감소된 비특이적 결합.
재료 및 방법. A2780 MIF-/- 세포주는 A2780 난소 암종 세포주에서 인간 MIF 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성시켰다. 간단히 말해서, GenCRISPRTM 시스템용 표적화 유도 RNA(gRNA)를 설계하는 일반적인 규칙에 따라 표적 유전자 서열을 분석하고, 표적 부위를 위치시켰다. 가이드 RNA(gRNA)를 MIF 유전자(TTGGTGTTTACGATGAACATCGG, 서열번호 40)의 5' 영역을 특이적으로 인식하도록 설계하고, gRNA 서열을 에스. 피요게네스(S. pyogenes) Cas9(SpCas9) 뉴클레아제를 함유하는 PX459(addgene) 벡터에 클로닝했다. A2780 세포를 전기천공으로 일시적으로 형질감염시키고, 제한 희석에 의해 96웰 플레이트에 플레이팅하여 동질성 단일 클론을 생성했다. 내인성 MIF 유전자가 효율적으로 돌연변이되어 MIF 단백질의 발현의 결과적 감소(또는 제거)를 초래하는 동질성 단일 클론은 생어 서열분석 스크리닝(Sanger sequencing screening)을 통해 식별하였다. 최종 클론은 인간 MIF 유전자의 시작 코돈 뒤 위치 +2에서 10bp의 결실을 나타냈다. A2780 MIF-/- 세포주에서 내인성 인간 MIF 단백질의 부재는 폴리클로날 항-인간 MIF 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다.　
A2780 MIF-/- 　세포를 세포 스트리퍼(Corning, Cat# 25-056-Cl)로 분리하고, 염색 완충액(PBS +5% BSA)으로 세척하고, 웰당 2x105 세포로 96웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅했다. 세포를 4℃에서 20분 동안 고정 가능한 생존력 염료 eFluor780(ThermoFisher, PBS에서 1:2000 희석)으로 염색하고, 염색 완충액으로 세척했다. 세포를 50μl의 염색 완충액에 재현탁시키고, 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118 또는 각각 그들의 모체 항체 C0083 및 C0090 또는 대조군 항-oxMIF 항체 C0008 또는 동형 IgG(최종 농도 37nM 내지 9.4nM)의 연속 희석액 50μl를 첨가했다. 4℃에서 40분 동안 배양 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 100μl의 2차 항체(염소 항-인간 IgG (H+L)-AlexaFluor 488, 1:100 희석됨)에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고, PBS+2% BSA에 재현탁시키고 CytoFlex-S 유세포 분석기(Beckman Coulter)에서 획득했다.　
데이터를 FlowJo(BD)로 분석하고 생존 세포의 GeoMean(AF488 채널의 평균 형광 강도)을 GraphPad Prism에서 항체 농도에 대해 플롯팅했다.
결과 및 결론: 도 7 A 및 B로부터, 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0118과 그의 모체 항체 C0090(A)뿐만 아니라 C0118과 그의 모체 항체 C0083(B)은 Geo 평균이 동형 IgG 음성 대조군의 Geo 평균에 매우 근접하기 때문에 A2780 MIF-/- 세포에 결합하지 않는다는 것이 분명하다. 대조적으로, 항-oxMIF 항체 C0008은 MIF를 발현하지 않는 것으로 입증되었지만, A2780 MIF-/- 세포에 대한 유의한 결합을 나타냈다. 따라서, 소수성의 감소는 A2780 MIF-/-에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 비특이적 결합의 강한 감소 또는 제거를 초래한 반면, 항-oxMIF 대조군 항체 C0008은 소수성 특성으로 인해 세포 표면에 비특이적으로 결합한다.
도 7은 FACS에 의해 결정된 A2780 MIF-/- 세포에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 비특이적 결합을 보여준다. 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0118과 그의 모체 항체 C0090(A) 및 C0115와 그의 모체 항체 C0083(B) 및 대조군 항체 C0008뿐만 아니라 음성 대조군으로서 동형 IgG에 의한 A2780 MIF-/- 세포의 염색; 생존 세포의 GeoMean(AF488 채널의 평균 형광 강도)을 항체 농도에 대해 플롯팅한다.
실시예 9: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115에 의한 인간 PBMC로부터 강하게 감소된 비특이적 사이토카인 방출.
사이토카인 방출 증후군(CRS)은 감염과 같은 다양한 요인에 의해 유발될 수 있는 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 한 형태이다. CRS는 일부 모노클로날 항체 약물의 부작용으로도 공지되어 있다. CRS는 B 세포, T 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함한 많은 수의 백혈구가 활성화될 때 발생하고, 다른 것들 중에서 IL-6, IFN-γ, IL-8, MCP-1과 같은 염증성 사이토카인을 방출하고, 이는 병원성 염증의 양성 피드백 루프에서 더 많은 백혈구를 활성화한다. 이 과정은, 제대로 조절되지 않으면 전신성 과염증, 저혈압 쇼크 및 다기관 부전으로 인해 생명을 위협할 수 있다. 따라서, 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115는 시험관내 검정에서 PMBC로부터 염증성 사이토카인을 방출할 가능성에 대해 평가했다.　
재료 및 방법: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 항-oxMIF 참조 항체 C0008을 96웰 플레이트에서 5% 초저 IgG 혈청이 보충된 150μl의 RPMI1640 배지에서 3개의 건강한 공여체의 새로 해동된 PBMC(웰당 4-5x105 세포)와 함께 또는 배지만으로 70nM, 7nM, 0.7nM, 0.07nM에서 배양했다. 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2 에서 밤새 배양 후, 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 제거된 상청액을 96웰 V-바닥 플레이트(BioLegend)로 옮겼다. 상청액은 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 MCP-1, 인간 IL-6 및 인간 TNF-α에 대해 BioLegend LegendPlex 유세포분석 비드 검정으로 분석했다. 측정은 96웰 플레이트 로더(Beckman Coulter)가 장착된 CytoFlex-S 세포 분석기에서 수행했다. 비드 분류 채널은 APC(레이저 638nm로부터 여기, 밴드 패스 필터 660/10nm)인 반면, 리포터 채널은 PE(황색 레이저 561nm로부터 여기, 밴드 패스 필터 585/42nm)였다. 데이터는 LegendPlex 분석 소프트웨어(BioLegend)를 사용하여 분석하고, 그래프는 GraphPad Prism으로 생성했다. 평균 +/- SEM은 3명의 상이한 PMBC 공여체로부터 표시된다.
결과 및 결론: 도 8로부터, 가변 영역에 제조 가능성 돌연변이 및 Fc 침묵 돌연변이(L234A/L235A)를 보유하는 새로 설계된 항체 C0115는 최대 70nM의 농도에서 PBMC로부터 MCP-1, IL-6 및 TNF-α의 검출할 수 없거나 미량 방출을 나타냈음이 명백하다. 참조 항-oxMIF 항체 C0008은 소수성으로 인한 더 높은 응집 성향 및 비특이적 결합에 따라 최고 농도(70nM)에서 MCP-1, IL-6 및 TNF-α의 상당한 방출을 유도했다. 항체 치료제의 응집은 비록 미미하더라도 면역 세포에서 사이토카인 방출을 강하게 강화시키는 것으로 공지되어 있다.
도 8은 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115가 참조 항체 C0008와 비교하여 인간 PBMC로부터 강하게 감소된 사이토카인 방출을 나타낸다는 것을 예시한다. Fc 침묵 돌연변이를 보유하는 항-oxMIF 항체 C0115와 참조 항-oxMIF 항체 C0008을 광범위한 농도 범위(70nM, 7nM, 0.7nM, 0.07nM)에서 인간 PBMC와 함께 밤새 배양하고, 상청액을 인간 MCP-1(A), 인간 IL-6(B) 및 인간 TNF-α(C)에 대해 LegendPlex 유세포분석 비드 검정(BioLegend)으로 분석했다. 사이토카인 농도(pg/ml)에 대한 평균 +/- SEM은 3개의 상이한 PMBC 공여체로부터 표시된다.
실시예 10: 이종 이식된 인간 HCT116 결장 암종 종양을 보유하는 Balb/c 누드 마우스에서 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 대조군 항체 C0008의 생체분포.　
재료 및 방법: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115의 생체분포를 인간 결장암 세포 HCT116의 피하 종양을 보유하는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 참조 항-oxMIF 항체 C0008과 비교하여 조사했다. 암컷 Balb/c 누드 마우스는 50% PBS 및 50% 마트리겔 중 5x106 HCT116 세포의 일방적 피하 주사액을 총 주사 용적 100μl로 투여했다. 개별 종양 용적이 150-300mm3에 도달하면, 마우스를 치료 그룹에 할당하고, 5mg/kg IRDye 800CW 표지 C0115 또는 C0008의 단일 정맥내 용량을 투여했다.　
C0115 및 C0008은 제조업체의 지침에 따라 IRDye 800CW 단백질 표지화 키트(LI-COR Biosciences의 높은 MW)를 사용하여 IRDye 800CW로 표지화했다. 표지화 과정 후, 마우스에 표지된 항체의 주사 전에, IRDye 800CW 표지된 항체의 단백질 농도와 표지화 효율을 나노드롭 기술을 사용하여 결정하고, 표지화 후 단백질 농도에 따라 마우스에게 투여했다. 생체내 이미징은 다음 시점에 표지된 항체의 투여시 LI-COR Pearl® Trilogy 이미징 장치로 수행했다: 투여 후 1시간, 6-8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간. 이미지 분석을 수행하여 종양 내 항체의 상대적 형광 강도(RFU)를 정량화했다(RFU/면적= RFU 종양 면적/mm²종양 면적 - RFU 배경/mm²배경 면적).
결과 및 결론: 도 9는 각각 정맥내 투여된 IRDye 800CW 표지 C0115와 C0008의 유의한 종양내 분포를 최대 7일 종양 체류와 함께 보여준다. 도 9 (A)와 정량적 이미지 분석(도 9 (B))으로부터, 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115의 종양 흡수가 약 24시간에 피크를 나타내는 참조 항-oxMIF 항체 C0008과 비교하여 7일에 걸쳐 강하게 향상되고 증가되었음이 명백하다.　
도 9는 피하 HCT116 종양을 보유하는 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의해 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115와 참조 항체 C0008의 종양 침투 및 체류를 보여준다. (A) 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 C0115(상단 패널) 및 C0008(하단 패널) 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영하였고; (B) 디지털 이미지 분석에 의해 정량화된 C0115 및 C0008의 종양 침투 및 체류. 3마리 마우스의 평균이 표시된다.
실시예 11:
[표 8]
실시예 12: 콜라겐-II 유도 관절염(CIA) 마우스 모델에서 C0115 항체의 효능.
재료 및 방법: 8 내지 9주령(체중 범위: 18 내지 20g)의 DBA/1j(Harlan Laboratories, Italy) 수컷 마우스를 본 연구에서 사용했다. 소 II형 콜라겐(CII; Chondrex, USA)을 4℃에서 밤새 부드럽게 교반하면서 0.05M 아세트산에 2mg/ml로 용해시켰다. CFA(완전 프로인트 보조제)는 IFA(불완전 프로인트 보조제, Sigma Aldrich, Milano, Italy)에 2mg/ml 농도로 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Ra(Difco, Detroit, MI)를 첨가하여 제조했다. 주사 전에 CII를 동일한 용적의 CFA로 유화시켰다. CIA를 유도하기 위해, 마우스의 꼬리 기저부에 CII와 CFA를 함유하는 수득된 에멀젼 100μl(100μg/마우스)를 피내 주사했다. 21일째에, IFA 중 100μl의 CII(100μg/마우스)의 두 번째 부스터를 투여했다. 질환의 발병시(관절염 점수 범위 1 내지 2 사이), 마우스를 20일 동안 주 2회(i.p.) 비히클, 동형 대조군 IgG1(40mg/kg), C0115(20mg/kg)로 치료하거나 표준 치료 약물로서 덱사메타손의 매일 주사액(0.3mg/kg)을 투여했다. 치료 종료시, 동물을 안락사시키고 혈액을 채취하고, 조직(앞발과 뒷발)을 수확했다. 일주일에 두 번 체중과 발 두께(두께 게이지를 사용하여 네 발 모두)를 모니터링하여 관절염의 임상적 중증도를 평가했다. 각 마우스에 대한 발 두께 지수는 치료에 걸쳐 4개의 개별 발에 대한 두께의 합의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산함으로써 결정했다. 각 마우스의 네 발에 대해 0 내지 4 범위의 관절염 점수는 다음과 같이 평가된다: 0= 관절염의 징후 없음; 1= 발 또는 한 발가락의 부종 및/또는 발적; 2= 2개 관절의 침범; 3= 2개 초과 관절의 침범; 4= 전체 발 및 발가락의 심한 관절염으로, 마우스당 최대 점수는 12이다. 치료 기간에 걸쳐 개별 마우스에 대한 점수를 합산하여 각 마우스에 대한 누적 질환 점수를 계산했다. 계산은 GraphPad Prism으로 수행되었으며, 통계 분석에는 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트가 사용되었다.　
결과 및 결론: 도 10은 20mg/kg의 C0115로의 치료가 비히클 치료 그룹에 비해 질환 점수(A)와 발 부종(B)의 상당한 개선을 초래했음을 나타낸다. 이러한 효과(특히 발 두께의 감소)는 고용량의 표준 치료 코르티코스테로이드 약물 덱사메타손(0.3mg/kg)에 의한 치료와 비슷했다. 동형 대조군(IgG) 치료 그룹은 감소된 질환 점수를 초래하지 않았다. 모든 치료 그룹은 질환 과정 동안 유사한 체중 변화를 보였다.　
도 10은 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115가 콜라겐 II 유도 DBA/1j 마우스 관절염 모델에서 질환 중증도를 개선한다는 것을 보여준다. C0115(20mg/ml), 표준 치료 코르티코스테로이드 약물로서 고용량 덱사메타손(0.3mg/kg) 또는 비히클로 치료시 마우스 관절염 모델에서 누적 질환 점수(A) 및 발 두께(B)를 평가했다. GraphPad Prism V 9.4에서 통계 분석에는 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트가 사용되었다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001).
실시예 13: 사구체 신염(GN) 래트 모델에서 C0115 항체의 효능.
재료 및 방법: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115의 효능은 WKY 래트의 NTN에서 평가했다. 이 모델은 대식세포 침윤, 피브린 침착 및 조직 파괴와 함께 질환의 급속한 발병을 보인다(Tam FWK. et al., 1999). 이 모델의 시간 경과 및 형태는 인간의 초승달 사구체신염과 매우 유사하다. 이 모델은 매우 견고하며, 모든 동물은 신독성 혈청(NTS)의 주입에 의한 유도 후 신염이 발생한다. 사구체 신염은 WKY 수컷 래트(체중 범위: 190-220g)에 토끼 항-래트 NTS(신독성 혈청) 100μl를 정맥내 주사하여 유도했다. NTS 주사 후 4일째 및 6일째에, 동물을 비히클, 동형 대조군 IgG1 또는 C0115(30mg/kg)로 치료했다(i.p.). 0일째(기준선), 4일째(질환 발병) 및 7일째(치료 후)에 소변을 채취했다. 연구 종료시(8일째), 동물을 안락사시키고, 혈액뿐만 아니라 조직(신장, 간, 비장 및 폐)을 채취했다. 질환의 중증도를 평가하기 위해, 조직학적 분석(초승달 계수; ED-1 대식세포 염색, 래트 및 토끼 IgG 침착) 및 생화학적 분석(단백뇨 및 혈뇨)을 수행했다. GraphPad Prism V 9.4에서 통계 분석에는 일반 일원 ANOVA에 이어 다중 테스트를 위한 던넷 보정이 사용되었다(*p<0.05, **p<0.01; ***p<0.001, ****p<0.0001).
결과 및 결론 : C0115(30mg/kg)에 의한 치료는 질환을 상당히 개선시켰고, 이는 비히클 치료 그룹과 비교하여 감소된 혈뇨, 단백뇨 및 사구체 대식세포 침윤에 의해 입증되었다(도 11). 동형 대조군 IgG에 의한 치료는 비히클 그룹과 비교할 때 혈뇨를 감소시키지 못했다.　
도 11은 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115가 신독성 혈청(NTS) 유도 래트 사구체신염 모델에서 질환 중증도를 개선한다는 것을 보여준다. 항-oxMIF 항체 C0115, 동형 대조군 IgG1 또는 비히클에 의한 질환에 걸린 래트의 치료시 래트 사구체신염 모델에서 소변의 혈뇨(시험지봉)(A), 단백뇨(B) 및 사구체 대식세포 침윤(C)을 평가했다. 평균 ± SEM이 표시되어 있으며, GraphPad Prism V 9.4에서 통계 분석에는 일반 일원 ANOVA에 이어 다중 테스트를 위한 던넷 보정이 사용되었다(*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001).　
실시예 14: oxMIF에 대한 이중특이적 항체(bsMab) C0132 및 C0133(항-oxMIF x 항-HSG)의 결합.
재료 및 방법: 1μg/ml로 PBS에서 희석된 재조합 인간 MIF를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에 고정시켰다[문헌(Thiele et al., 2015)에 따라 MIF를 oxMIF로 형질전환시킴). 차단 후, 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, ELISA를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행했다.　
결과 및 결론: 고정된 MIF(oxMIF)에 대한 C0132 및 C0133 항체의 결합은 광범위한 농도에 걸쳐 측정되었으며, 생성되는 결합 곡선은 도 13에 예시되어 있다. 항-oxMIF 항체 C0008은 2가 oxMIF 결합을 위한 참조 항체로 사용되었다. 결합 곡선과 계산된 EC50 　값은 두 개의 항-oxMIF 암을 갖는 bsMab C0133이 C0008과 유사한 친화도(EC50 = 242pM(C0133), 158pM(C0008))로 oxMIF에 결합하는 반면, 하나의 항-oxMIF 암만을 갖는 bsMab C0132는 생존력 효과의 손실로 인해 더 높은 EC50 값(2508pM)으로 oxMIF에 결합한다는 것을 명확하게 보여주었다.　
도 12: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(bsMab) C0132(Fab/scFv-Fc) 및 C0133(Fab/Fab-scFv-Fc)의 개략도.
도 13은 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 고정된 oxMIF에 대한 결합 곡선을 보여준다. 결합된 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었으며, C0008은 oxMIF에 대한 2가 결합을 위한 참조 항체로 사용되었다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 S자형 4-매개변수 방정식에 적합화했다(2회 반복의 평균 +/- SEM이 표시됨).
실시예 15: C0132 및 C0133 항-oxMIF x 항-HSG bsMab의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합.
재료 및 방법: 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133, 참조 항-oxMIF mAb C0008, 및 인간 IgG1 동형 대조군을 4℃에서 밤새 마이크로플레이트에 고정시켰다(oxMIF 2가 항체의 경우 15nM, oxMIF 1가 항체의 경우 30nM). 차단 후, 웰을 50ng/ml(약 1,3nM)의 redMIF 또는 oxMIF 대리 NTB-MIF와 함께 배양했다(Schinagl et al., 2018). 포획된 oxMIF를 폴리클로날 토끼 항-MIF 항체 및 염소 항-토끼 IgG-HRP로 검출했다. 플레이트는 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 염색하고, 30% H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 중지시켰다. OD는 450nm에서 측정했다.　
결과 및 결론: 가용성 oxMIF 및 redMIF에 대한 C0132와 C0133의 결합은 도 14에 예시되어 있다. 결과는 C0132 및 C0133이 모두 oxMIF에 대한 강한 결합을 입증했지만 redMIF에는 결합하지 않음을 분명히 보여주었다. 새로 설계된 항체는 참조 항체 C0008과 매우 유사한 OD 값을 보였고, 이는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 것으로 기재되었다(Thiele et al., 2015). 동형 IgG에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 따라서, 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133은 oxMIF와 redMIF를 구별하는 능력을 유지했다.
도 14: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합을 보여준다. C0008은 참조 항-oxMIF 항체로서 사용되었다. 3개 반복의 평균 및 SEM이 표시된다.
실시예 16: 동계 CT26 결장 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 생체분포.
재료 및 방법: 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 생체분포를 마우스 결장 암종 CT26 세포주의 피하 종양을 보유하는 암컷 Balb/c 마우스에서 조사했다. 암컷 Balb/c 마우스는 총 주입 용적 100μl로 PBS 중 3x106 CT26 세포의 일방적 피하 주사액을 투여했다. 개별 종양 용적 150-300mm3에 도달시, 마우스를 치료 그룹에 할당하고, 5mg/kg의 IRDye 800CW 표지 C0132 또는 C0133의 단일 정맥내 용량을 투여하거나 치료하지 않았다(대조군).　
C0132와 C0133은 제조업체의 지침에 따라 IRDye 800CW 단백질 표지화 키트(LI-COR Biosciences의 높은 MW)를 사용하여 IRDye 800CW로 표지했다. 표지화 공정 후 및 표지된 항체를 마우스에 주사하기 전에, IRDye 800CW 표지 항체의 단백질 농도와 표지화 효율을 나노드롭 기술을 사용하여 결정하고, 마우스는 표지화 후 단백질 농도를 기준으로 하여 투여했다. 생체내 이미징은 다음 시점에 표지된 항체를 투여시 785nm 여기 및 820nm 방출 파장에서 수행된 LI-COR Pearl® Trilogy 이미징 장치에서 수행되었다: 투여 후 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간.　
결과 및 결론: 도 15는 최대 7일 종양 체류와 함께 각각 정맥내 투여된 IRDye 800CW 표지 C0132 및 C0133의 상당한 종양내 분포를 보여준다. 도 15로부터, 주사 1시간 후 및 이후 모든 이미징 시점에, 종양에서 관찰된 적외선 신호가 배경의 신호를 초과했고, 이는 종양에서 항체의 우선적인 축적을 나타낸다는 것이 명백하다.　
도 15는 피하 동종 이식된 CT26 종양을 보유하는 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의해 평가된 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132 및 C0133의 종양 침투 및 체류를 보여준다. 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 주사 후 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영했다.　
실시예 17: Balb/c 마우스의 동계 CT26 결장암 마우스 모델에서 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(bsMab) C0132 및 C0133과 177Lu 표지된 IMP288을 사용한 사전표적화 방사선 면역요법(PRAIT).
본 실시예에서, 새로 설계된 Fc 침묵형 이중특이적 항-oxMIF x 항-HSG 항체 C0132 및 C0133의 효능을 HSG 합텐 IMP288(US2005/0025709에 기재된 바와 같음) 및 방사성 핵종으로서 177Lu와 함께 PRAIT 접근법을 사용하여 평가했다. IMP288은 두 리신 잔기가 ε-아미노그룹을 통해 HSG 모이어티로 유도체화되는 DOTA-접합 D-Tyr-D-Lys-D-Glu-D-Lys-NH2 테트라펩티드이다(도 16A). IMP288의 DOTA 킬레이트 그룹은 구체적으로 177Lu를 포함한 방사성 금속과 함께 사용하도록 설계된다.　
재료 및 방법: 사전-RAIT의 생체내 효능은 피하 CT26 뮤린 결장직장 암종 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서 평가했다.　
IMP288(Genepep, France)은 95% 이상의 방사화학적 순도(RCP)를 나타내면서 약 220MBq/nmol의 비활성에서 177Lu로 표지되었다. 간단히 말해, IMP288을 멸균수로 최종 농도 1mM(1.45mg/ml)로 희석했다. 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액(500mM, pH 5.5)에서 IMP288 스톡 용액의 1/10 희석을 수행했다. 0.04N HCl 중 5mCi(185MBq)의 177LuCl3(EndolucinBeta®), ITG, Germany)을 방사성 표지 바이알에 넣은 후, 40μl의 MES 완충액(250mM, pH 5.5)과 0.84nmol의 희석된 IMP288 용액(8.4μl)을 첨가했다. 반응 혼합물을 95℃에서 15분 동안 배양했다. 그 후, 5μl의 디에틸렌펜타-디아민테트라아세트산 나트륨 염(DTPA-Na) 10mM으로 복합체 비통합 177Lu에 첨가하고, 용액을 0.9%NaCl/10g/L 아스코르베이트/0.05% m/v BSA에서 370MBq/mL로 희석시켰다. 킬레이트화 효율 및 C0132 및 C0133에 대한 결합은 즉석 박층 크로마토그래피(iTLC, Agilent Technology, SGI001)로 분석했다. 간단히 말해, 220MBq/nmol 및 0.084nmol의 IMP288에 상응하는 1.68nmol/ml의 177Lu-IMP288 용액 50μl를 각 bsMab의 10배 몰 과량(0.84nmol)과 혼합했다. 각 반응물은 37℃에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양했다. 177Lu-IMP288 용액뿐만 아니라 177Lu-IMP288-bsMab 용액을 iTLC 스트립에 적용하고, 0.15M 암모늄 아세테이트(pH 5.5):MeOH의 1:1(v/v) 용액으로 용출을 수행했다. 용출 후, iTLC 플레이트를 인 스크린(MS, BAS-IP, Fujifilm 2025)에 노출시키고, Typhoon IP(Amersham) 및 관련 소프트웨어 ImageQuant TL 버전 8.2를 사용하여 드러냈다.　
CT26 뮤린 결장직장 암종(ATCC-CRL-2638) 세포를 37℃/5% CO2에서 10% 열 불활성화된 FBS와 2mM 글루타민이 보충된 RPMI1640 배지에서 확장시켰다. CT26 세포의 현탁액을 멸균 PBS에서 10 x 106 　생존 세포/mL로 제조했다. Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 100μL의 PBS에 현탁된 1x106 CT26 세포를 피하 주사했다. 종양의 용적이 50-100mm3에 도달하면(접종 후 약 7-9일) 마우스를 그룹당 10마리의 마우스의 치료 그룹으로 무작위화했다. 항체(C0132 또는 C0133)는 무작위화 당일(-3일째)에 5mg/kg으로 정맥내 주사했다. 177Lu-IMP288을 이중특이적 mAb 주사 3일 후(0일째) 10:1의 bsMAb/HSGIMP288 합텐의 몰 비(각각 18.5MBq에 상응하는 약 4nmol/kg C0132 bsMAb 또는 약 3nmol/kg C0133 bsMab)로 정맥내 경로로 투여했다. 또한, 대조군은 임의의 사전 치료 없이 0일째에 37MBq의 177Lu-IMP288 또는 비히클을 투여했다. 종양 용적 및 체중은 21일까지 또는 마우스가 1000mm3 종양 용적의 인간 종점에 도달할 때까지 2 내지 3일마다 측정하고, 생존 백분율을 결정했다. 각 치료 그룹의 상대적 종양 용적(0일째 종양 용적 = 100%), 상대적 체중(0일째 체중 = 100%), 및 카플란-마이어 생존 곡선(생존 백분율)을 GraphPrism 소프트웨어를 사용하여 시간에 대해 플롯팅했다. 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4으로 수행했다.
결과 및 결론: 도 16 B는 177Lu-IMP288 및 177Lu-IMP288-bsMab에 대한 iTLC 프로파일을 보여준다. 도 16 B에서 입증된 바와 같이, 177Lu-IMP288에 대한 이동 프로파일의 변화는 bsMab C0132 및 C0133과 배양 후 관찰되었으며, 이는 177Lu-IMP288이 bsMab에 의해 결합되었음을 확인한다. 두 bsMab는 ImageQuant TL 버전 8.2에 의해 밝혀진 픽셀 강도로부터 계산된 177Lu-IMP288 펩티드의 >94%에 결합했다.
도 17 A -B에서 입증된 바와 같이, 5mg/kg의 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132와 18.5MBq의 IMP288을 사용한 PRAIT는 21일의 전체 모니터링 기간 동안(100% 생존, 도 17 B) 지속하는 강력하고 유의미한 종양 성장 억제(도 17 A)를 초래했다. 통계 분석(다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA; ** p<0.01)은 8일째에만 수행하여 C0132/177Lu-IMP288-치료 그룹과 177Lu-IMP288 그룹을 비교했는데, 이는 8일째 이후 과도한 종양 성장으로 인해 비히클 그룹 동물의 거의 절반이 희생되어야 했기 때문이다. 또한, 도 17 C는 C0132를 사용한 PRAIT가 전체 모니터링 기간(21일) 동안 임의의 상당한 체중 감소를 일으키지 않았기 때문에 내약성이 우수했다는 것을 보여준다. 도 18로부터 명백한 바와 같이, 5mg/kg의 bsMab C0133과 18.5MBq의 IMP288을 사용한 PRAIT는 강력하고 유의미한 종양 성장 억제를 초래했다. 통계 분석(다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA; ** p<0.001)은 8일째에만 수행하여 C0133/177Lu-IMP288-치료 그룹과 177Lu-IMP288 그룹을 비교했는데, 이는 8일째 이후 과도한 종양 성장으로 인해 비히클 그룹 동물의 거의 절반이 희생되어야 했기 때문이다. 결과는 강력한 PRAIT로서 방사성 표지된 HSG 합텐과 함께 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab의 잠재력을 강조한다고 요약된다.
도 16: 177Lu-IMP288 펩티드 단독의 이동 프로파일과 비교할 때 bsMab와 배양시 177Lu-IMP288의 이동 프로파일 변화에 기초하여 iTLC로 평가된 177Lu-IMP288 펩티드에 대한 bsMab C0132 및 C0133의 HSG 합텐 IMP288 (A) 및 (B) 결합의 구조를 보여준다.　　
도 17은 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132를 갖는 Balb/c 마우스에서 동종이식된 CT26 뮤린 결장직장 암종의 PRAIT를 보여준다. C0132를 -3일째에 투여하고, 3일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. (A) 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%); 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA을 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행하였다; ** p<0.01 대 177Lu-IMP288; (B) 카플란-마이어 생존 곡선(생존 %), (C) 0일째에 측정된 체중에 대한 체중(%).　　
도 18은 Fc 침묵형 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0133을 갖는 Balb/c 마우스에서 동종이식된 CT26 뮤린 결장직장 암종의 PRAIT를 보여준다. C0133을 -3일째에 투여하고, 3일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. 이 도면은 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%)을 보여준다. 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행하였다; *** p<0.01 대 177Lu-IMP288.
실시예 18: Balb/c 마우스의 동계 CT26 결장암 마우스 모델에서 C0132 적용 5일 후 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(bsMab) C0132 및 177Lu 표지 IMP288을 사용하는 사전표적화 방사선 면역요법(PRAIT)
본 실시예에서, 새로 설계된 Fc 침묵형 이중특이적 항-oxMIF x 항-HSG 항체 C0132의 효능을 HSG 합텐 IMP288(US2005/0025709에 기재된 바와 같음) 및 방사성 핵종으로서 177Lu와 함께 PRAIT 접근법을 사용하여 평가했다.　
재료 및 방법: 피하 CT26 뮤린 결장직장 암종 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서 RRAIT의 생체내 효능을 평가했다. 연구는 약간의 변형으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해, Balb/c 마우스(Balb/c ByJ, Janvier Labs, France)의 오른쪽 옆구리에 100μL의 PBS에 현탁된 1x106 CT26 세포를 피하 주사했다. 종양 성장은 접종 후 7일째까지 육안 관찰과 촉진을 통해 제어했다. 생체내 치료 연구는 종양 크기가 3개 치료 그룹(그룹당 10마리 마우스)의 경우 약 100-200mm3에, 1개 대조군(그룹당 10마리 마우스)의 경우 약 400-500mm3에 도달하면 시작했다. BsMab C0132는 2.5mg/ml 및 5mg/ml의 두 가지 용량으로 i.v. 주사한 반면, 177Lu-표지 IMP288은 C0132 투여(0일째) 5일 후(대 실시예 16에서는 3일 후) i.v. 주사했다. C0132/방사성 표지 HSG IMP288 합텐의 몰 비율은 10/1로 일정하게 유지되었고(실시예 16에서와 동일), 이는 177Lu-표지 IMP288이 각각 2nmol/kg(9.3MBq) 및 4nmol/kg(18.5MBq)으로 투여되었음을 의미한다. 대조군은 마우스에게 bsMab에 의한 임의의 사전 치료 없이 0일째에 8nmol/kg(37MBq)의 177Lu-IMP288이 투여된 하나의 코호트로 구성되었다. 투여 후 21일 동안 동물의 체중과 종양 용적을 2 내지 3일마다 평가했다. 종양 용적은 디지털 캘리퍼로 종양의 길이, 너비 및 깊이를 측정하여 결정했다. 종양 용적은 다음 화학식을 사용하여 계산했다: 종양 용적 = (길이 x 너비 x 깊이) x 0.5. 마우스는 21일까지 또는 마우스가 소정의 실험 종점: 종양 용적 > 1500mm3 또는 체중 감소 > 20%에 도달할 때까지 모니터링하였다. 각 치료 그룹의 상대적 종양 용적(0일째 종양 용적 = 100%) 및 카플란-마이어 생존 곡선(생존 백분율)은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 시간에 대해 플롯팅했다. 통계 분석(다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)은 8일째 및 10일째에만 GraphPad Prism을 사용하여 수행하여 2개의 C0132 치료 그룹 각각과 대조군(177Lu-IMP288 단독, bsMab 없음)을 비교하였는데, 이는 11일째 후 대조군(177Lu-IMP288, bsMab 없음)의 동물은 과도한 종양 성장으로 인해 안락사시켜야 했기 때문이다.
결과 및 결론: 도 19로부터, 2.5 및 5mg/ml의 C0132에 의한 사전 표적화 요법은 상당한 종양 퇴행(도 19 A) 및 생존 이점(도 19 B)을 초래했다. C0132를 5mg/ml로 투여한 경우 최대 21일의 모니터링을 지속하는 최고 생존(100%)을 달성할 수 있었다.　
도 19는 CT26 뮤린 결장직장 암종 세포가 동종이식된 마우스에서 PRAIT 접근법을 사용하여 Balb/c에서 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132의 효능을 보여준다. C0132를 2.5mg/ml, -5일째에 5mg/ml 투여한 후, 5일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. (A) 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%), 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10개). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행하였다; *** p<0.001 대 177Lu-IMP288; (B) 카플란-마이어 생존 곡선(생존 %).　
실시예 19: Balb/c 누드 마우스의 이종이식 CFPAC-1 췌장암 마우스 모델에서 C0132 적용 5일 후 항-oxMIF x 항-HSG 이중특이적 항체(bsMab) C0132 및 177Lu-표지 IMP288을 사용한 사전 표적화 방사선 면역요법(PRAIT).　
본 실시예에서, 새로 설계된 Fc 침묵형 이중특이적 항-oxMIF x 항-HSG 항체 C0132의 효능은 췌장암의 이종이식 모델에서 HSG 합텐 IMP288(US2005/0025709에 기재된 바와 같음) 및 방사성 핵종으로서 177Lu와 함께 PRAIT 접근법을 사용하여 평가했다.
재료 및 방법: PRAIT의 생체내 효능은 피하 CFPAC-1 관 췌장 선암종 종양을 보유하는 Balb/c 누드 마우스에서 평가했다. 연구는 본질적으로 약간의 변형으로 실시예 16 및 17에 기재된 바와 같이 수행하였다. 인간 췌장관 선암종 세포인 CFPAC-1은 ATCC(Cat# CRL-1918)에서 제공했다. 세포는 10% FBS와 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양했다. CFPAC-1 세포의 현탁액을 멸균 PBS에서 50 x 106 세포/mL로 제조했다. Balb/c 누드 마우스(Balb/c ByAnNRj-Foxn1nu / nu)의 우측 옆구리에 100μL의 PBS에 현탁된 5x106 CFPAC-1 세포를 피하 주사했다. 접종 후 4일째까지 육안 관찰과 촉진을 통해 종양 성장을 제어했다. 생체내 치료 연구는 종양 크기가 치료 그룹(그룹당 10마리 마우스)의 경우 약 150-300mm3, 두 대조군(그룹당 10마리 마우스)의 경우 약 350-500mm3에 도달했을 때 시작했다. 치료 그룹은 먼저 5mg/kg(-5일째) 용량의 BsMAb C0132를 투여받았다. 5일 후(0일째), 방사성 표지 IMP288은 BsMAb/HSG 합텐 IMP288의 고정된 몰 비율 10:1을 사용하여 제공하였고, 이는 177Lu-표지 HSG 합텐 IMP288이 각각 4nmol/kg(18.5MBq)으로 투여되었음을 의미한다. 대조군은 마우스가 8nmol/kg(37MBq)의 177Lu-IMP288을 투여받았지만 BsMAb는 투여되지 않은 1개 코호트와 마우스가 177Lu-IMP288의 희석에 사용되는 비히클만을 투여받은 1개 코호트로 구성되었다. 투여 후 28일 동안, 동물의 체중과 종양 용적을 2 내지 3일마다 평가했다. 종양 용적은 디지털 캘리퍼로 종양의 길이, 너비 및 깊이를 측정하여 결정했다. 종양 용적은 다음 화학식을 사용하여 계산했다: 종양 용적 = (길이 x 너비 x 깊이) x 0.5. 마우스는 28일까지 또는 마우스가 소정의 실험 종점: 종양 용적 > 1500mm3 또는 체중 감소 > 20%에 도달할 때까지 모니터링하였다. 각 치료 그룹의 상대적 종양 용적(0일째 종양 용적 = 100%)은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 시간에 대해 플롯팅했다. 통계 분석(다중 테스트을 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA; **p<0.01)은 14일째에만 GraphPad Prism V9.4에서 수행하여 C0132 치료 그룹과 비히클 그룹을 비교했다.
결과 및 결론: 도 20으로부터, 5mg/ml의 C0132로의 사전 표적화 요법이 상당한 종양 퇴행을 초래했음이 명백하다(도 20).　
도 20은 CFPAC-1 췌장 선암종 세포가 이종이식된 Balb/c 누드 마우스에서 PRAIT 접근법을 사용하여 항-oxMIF x 항-HSG bsMab C0132의 효능을 보여준다. C0132를 -5일째에 5mg/ml로 투여하고, 5일 후(0일째)에 177Lu-IMP288을 투여했다. 0일째에 측정된 종양 용적의 종양 용적(%); 평균 ± SEM이 표시된다(n= 최대 10). 통계 분석은 다중 테스트를 위한 던넷 보정과 함께 일반 일원 ANOVA를 사용하여 GraphPad Prism V9.4에서 수행하였다: ** p<0.01 대 비히클.
실시예 20: 유형 II 콜라겐 유도 관절염(CIA)의 마우스 모델에서 글루코코르티코이드(GC)와 조합된 C0115 항체의 효능.
글루코코르티코이드(예: 덱사메타손)는 인간 환자의 류마티스 질환을 조절하기 위한 장기 요법으로 일반적으로 사용되지만 다양한 부작용과 관련되는 강력한 면역 억제제이다. 본 실시예에서, C0115의 효능은 단독 치료로서 또는 덱사메타손과 병용하여 평가되었다.　　
재료 및 방법: 8 내지 9주령(체중 범위: 18-20g)의 DBA/1j(Harlan Laboratories, Italy) 수컷 마우스를 이 연구에 사용했다. 소 II형 콜라겐(CII; Chondrex, USA)을 4℃에서 밤새 부드럽게 교반하여 0.05M 아세트산에 2mg/ml로 용해시켰다. CFA(완전 프로인트 보조제)는 IFA(불완전 프로인트 보조제, Sigma Aldrich, Milano, Italy)에 2mg/ml 농도로 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Ra(Difco, Detroit, MI)를 첨가하여 제조했다. 주사 전에, CII를 동일 용적의 CFA로 유화시켰다. CIA를 유도하기 위해, 마우스의 꼬리 기저부에 CII와 CFA를 함유하는 수득된 에멀젼 100μl(100μg/마우스)를 피내 주사했다. 21일째에, IFA 중 100μl의 CII(100μg/마우스)의 두 번째 부스터를 투여했다. 질환 발병시, 마우스를 20일 동안 비히클, C0115(20mg/kg) 단독 또는 저용량의 덱사메타손(0.1 mg/kg)의 매일 주사액과 함께 주 2회(i.p.) 치료했다. 대조군 마우스는 표준 치료 약물로서 고용량의 덱사메타손(0.3mg/kg)의 매일 주사액을 투여했다. 치료 종료시, 동물을 안락사시키고 혈액을 채취하고, 조직(앞발과 뒷발)을 추가 조직학적 분석을 위해 채취했다. 일주일에 두 번 체중과 발 두께(두께 게이지를 사용하여 네 발 모두)를 모니터링하여 관절염의 임상적 중증도를 평가했다. 각 마우스의 네 발에 대해 0 내지 4 범위의 관절염 점수를 다음과 같이 평가했다: 0= 관절염 징후 없음; 1= 발 또는 한 발가락의 부종 및/또는 발적; 2= 2개 관절의 침범, 3= 2개 초과 관절의 침범; 4= 전체 발 및 발가락의 심한 관절염으로, 마우스당 최대 점수는 12이다. 치료 기간 동안 개별 마우스에 대한 점수를 합산하여 각 마우스에 대한 누적 질환 점수를 계산했다. 통계 분석은 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트를 사용하여 GraphPad Prism에서 수행했다.　
결과 및 결론: 도 21은 C0115(20mg/kg)로의 치료가 비히클 치료 그룹에 비해 누적 질환 점수로 표시되는 임상적 관절염 징후의 유의미한 개선을 초래했음을 나타낸다. 또한, C0115(20mg/kg)와 저용량의 덱사메타손(0.1mg/kg)의 병용 치료는 단일 제제로서의 치료와 비교하여 임상적 관절염 징후의 추가 개선을 초래하였고, 고용량의 덱사메타손(0.3mg/kg)의 효능과 비슷하다.　
실시예 21: 대장염의 T 세포 전달 마우스 모델에서 C0115 항체 및 글루코코르티코이드(GC)와 병용의 효능.
본 실시예에서, 단일 제제로서 또는 저용량의 덱사메타손과 병용하여 C0115 항체의 효능을 만성 장 염증 동안 평가했다.　
재료 및 방법: 8 내지 9주령(체중 범위: 18-20g)의 BALB/c 및 C.B-17 SCID(Envigo, San Pietro al Natisone, Udine, Italy) 암컷 마우스를 이 연구에 사용했다.
대장염을 유도하기 위해, BALB/c 마우스의 CD4+CD25- T 세포를 CB-17 SCID 마우스(B 세포와 T 세포 결여)에 이식했다. 간단히 말해, Balb/C 마우스로부터 단리된 비장 세포를 4μg/ml의 콘칸나발린 A로 시험관내 자극시켰다. T 세포는 CD4+ CD25- 세포의 자기 선택에 의해 단리시키고, 세포 제제를 FACS Calibur(BD Bioscience, Heidelberg, German) 및 CellQuest 소프트웨어를 사용한 유세포 분석법에 의해 순도 제어(CD4+CD25- 게이트에서 생존 가능한 T 세포의 >95%)를 위해 생존력 염료(7-악티노마이신-D), FITC 접합 항-마우스 CD4-항체(BD, Heidelberg, Germany) 및 APC 접합 항-마우스 CD25-항체(BD, Heidelberg, Germany)로 염색했다. 단리된 CD4+CD25- T 세포를 0.2ml 식염수의 최종 용적에 500,000개 세포의 농도로 CB-17 SCID 마우스에 i.p. 주사했다. T 세포 전달 1주일 후, 마우스를 83일 동안 비히클, 단일 제제로서 또는 저용량의 덱사메타손(0.01 mg/kg)의 매일 주사액과 조합하여 C0115(10mg/kg)로 치료했다(주 2회; i.p.). 대조군 마우스는 표준 치료 약물로서 고용량의 덱사메타손(0.1mg/kg)의 매일 주사액을 투여했다. 치료 종료시, 추가 분석을 위해 혈액, 대변 및 결장 조직을 채취했다. 대장염의 임상적 중증도는 체중 변화와 대변 일관성을 주기적으로 모니터링하여 평가했다. 각 마우스에 대한 누적 대변 점수는 매일 대변 점수를 합산하여 결정했다(0= 잘 형성된 펠렛; 1= 부드러운 대변; 2= 설사). 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트가 GraphPad Prism V9.4에서 통계 분석에 사용되었다.　
결과 및 결론: 도 22는 C0115(10mg/kg)에 의한 치료가 질환 중증도의 상당한 개선을 초래했고, 이는 비히클 치료 그룹과 비교하여 누적 대변 점수(A)의 상당한 감소로 입증되었고, 고용량의 덱사메타손(0.1 mg/kg)과 비슷하다는 것을 나타낸다. 10mg/kg의 C0115와 저용량의 덱사메타손(0.01mg/kg)의 병용 치료는 질환 중증도를 추가로 개선시켰으며, 이는 누적 대변 점수의 추가 상당한 감소로 입증되었다. 놀랍게도, 10mg/kg의 C0115와 저용량의 덱사메타손(0.01mg/kg)의 병용 치료는 비히클 치료 그룹 및 표준 치료 코르티코스테로이드 약물 덱사메타손에 의한 치료와 비교하여 치료 종료시(83일째) 상당한 체중 증가로 평가되는 대장염의 추가 개선을 초래했다.
도 22는 새로 설계된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체 C0115가 단일 제제로서 및 GC와 병용하여 대장염 모델 T 세포 전달 마우스에서 질환 중증도를 개선한다는 것을 보여준다. 실험 종료시 D83의 체중 변화(A)와 누적 대변 점수(B)는 C0115(10mg/kg) 단독 또는 저용량 0.01mg/kg의 덱사메타손과의 병용, 표준 치료 코르티코스테로이드 약물로서 저용량(0.01mg/kg) 및 고용량(0.1mg/kg)의 덱사메타손에 의한 치료 또는 비히클 대조군 치료시 평가했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, 통계 분석은 일반 일원 ANOVA에 이어 피셔의 LSD 테스트를 사용하여 수행했다(*p<0.05; **p<0.01).　
실시예 22: 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 성향 및 감소된 소수성 및 그들의 결합 고정된 oxMIF의 체류(KD 추정)
[표 9]
소수성 및 응집을 평가하기 위해, 새로 설계된 항체를 겔 여과(SEC)에 의해 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)로 분석하여 대조군 항-oxMIF 항체 C0008과 일대일 비교한다.　
SEC의 경우, 항체를 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS)에서 1mg/ml로 희석시키고, 100μl 샘플을 1.25ml/분의 유속으로 Enrich 650(Bio-Rad) 겔 여과 컬럼에 적용한다. 분리 및 평형화는 실온에서 1xPBS로 수행된다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 ChromLab 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석한다. 결과는 주요 피크에 대한 체류 용적(Vr, ml)으로 보고되며, 응집체의 존재는 수동으로 순위가 매겨진다.　
HIC 분석을 위해, 항체는 50mM 인산염과 0.75M 황산암모늄, pH 6.8을 사용하여 최종 농도 1mg/ml로 희석한다. 각 항체 1mg을 1ml 로딩 루프를 사용하여 1ml HiTrap 부틸 HP 컬럼에 주입하고, 컬럼 유속을 실온에서 1ml/분으로 유지시킨다. 피크의 분리는 완충액 B(50mM 인산염, 20% 이소프로판올, pH 7.0)의 0-100%로부터 20-컬럼 용적(CV) 구배에 걸쳐 수행한다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 Unicorn 에뮬레이션 소프트웨어 패키지(GE Healthcare)를 사용하여 분석한다. 결과는 각 피크에 대해 피크 최대치에서 Vr(ml)로 보고된다.
oxMIF에 대한 결합(겉보기 친화도)을 평가하기 위해, 새로 설계된 항체를 ELISA로 분석한다. 간단히 말해, 1μg/ml로 PBS에서 희석된 재조합 인간 MIF를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에 고정시킨다(문헌(Thiele et al., 2015)에 따라 MIF를 oxMIF로 형질전환시킴). 차단 후, 항-oxMIF 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가한다. 마지막으로, 결합된 항체를 염소 항-인간 IgG (Fc)-HRP 접합체와 테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로서 사용하여 검출한다. 발색 반응은 3M H2SO4로 중지시키고, OD는 450nm에서 측정한다. 겉보기 친화도(KD)를 나타내는 EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 4-매개변수 적합에 의해 결정된다.
참고문헌

Claims (18)

  1. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형(glycosylation modification)이 있는 서열번호 1을 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역, 및 다음 가변 도메인:
    (a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는　
    (a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
    - 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
    (b1) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는　
    (b2) 서열번호 3 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
    (b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fc 침묵형(silenced) 항-oxMIF 항체로서,
    아미노산 위치가 카바트(Kabat)에 따라 넘버링(numbering)되고,
    상기 변이체 Fc 영역이 야생형 IgG1 Fc 영역에 비해 감소된 FcγR 결합을 나타내고,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 아미노산 치환이 결여된 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 비해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인이 아미노산 치환 W93F를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 아미노산 치환 W97Y를 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 43 및 85로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.　
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    i.) 서열번호 3 및 6,
    ii.) 서열번호 9 및 6,
    iii.) 서열번호 4 및 6,
    iv.) 서열번호 4 및 8,　
    v.) 서열번호 4 및 5, 또는
    vi.) 서열번호 43, 및 서열번호 5, 6, 7 또는 8 중 어느 하나를 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 14를 추가로 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 15, 및 16 또는 17로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  7. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 글리코실화 변형이 있는 서열번호 1을 포함하는 야생형 인간 IgG의 변이체 Fc 영역을 포함하는 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체로서,
    서열번호 72 또는 78로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 및　
    서열번호 73, 79, 80 또는 81로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및
    서열번호 74 또는 82로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열, 및　
    서열번호 75로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열 및　
    서열번호 76 또는 83으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및　
    서열번호 77 또는 84로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열을 포함하고,
    단, 서열번호 74와 서열번호 77은 함께 포함되지 않는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  8. 　제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 서열번호 1의 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, I253, D265, S267, H268, N297, S298, T299, H310, E318, L328, P329, A330, P331, H435 중 어느 하나에 있고, 구체적으로 상기 아미노산 치환이 EU 넘버링 지수에 따라 위치 L234 및 L235, 구체적으로 위치 L234, L235, H310 및 H435에 있고/있거나 Fc 영역이 비글리코실화(aglycosylating)되는, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체(bispecific antibody), scFv-Fc, (scFv)2-Fc, scFv/scFv-Fc, Fab/scFv-Fc, Fab/(scFv)2-Fc, Fab/Fab-scFv-Fc, Fab/Fab-crossFab-Fc, Fab/crossFab-Fc, IgG-scFv 및 IgG-(scFv)2로 구성되는 그룹으로부터 선택된, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 구체적으로 CD3 또는 히스타민-석시닐-글리신(HSG)의 에피토프(epitope)를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 추가로 포함하는 이중특이적 항체인, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체가 제1 단계에서 대상체에게 투여되고, HSG 합텐이 제2 단계에서 투여되며, 상기 HSG 합텐이 항체에 결합되고 방사성 핵종으로 표지되는, 고형 종양의 치료 또는 검출에 사용하기 위한, Fc 침묵형 항-oxMIF 항체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의약(medicament)의 제조에 사용하기 위한, Fc 침묵형 항체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 임의로 약제학적 담체 또는 보조제(adjuvant)와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 피하 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조성물이 단독 물질로서 투여하기 위한 것이거나, 바람직하게는 항바이러성 물질, 항암 물질, 항염증성 물질 및 항생 물질로 구성되는 그룹으로부터 선택된 추가 활성 물질과 함께 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  16. 　　제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 질환, 감염성 질환을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 천식(asthma), 혈관염(vasculitis), 관절염(arthritis), 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 내독성 쇼크(endotoxic shock), 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome), 후천성 호흡 곤란 증후군(acquired respiratory distress syndrome), 사구체신염(glomerulonephritis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 복막염(peritonitis), 신염(nephritis), NASH(비알코올성 지방증 간염(nonalcoholic steatosis hepatitis)), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 급성 및 만성 췌장염(acute and chronic pancreatitis), 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes), IgA 신장병증(nephropathy), 간질성 방광염(interstitial cystitis), COVID 후 증후군(post COVID syndrome) 및 건선(psoriasis)의 치료에 사용하기 위한, 또는 과증식성 장애 또는 암을 앓고 있는 환자의 치료, 구체적으로 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreas cancer), 위암(gastric cancer) 및 폐암(lung cancer)의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산.
  18. 제17항의 핵산을 포함하는 발현 벡터(expression vector).
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