JP2024505673A - 電荷対を有する二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

電荷対を有する二重特異性抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

CH1及びCLの境界面において導入された電荷対を、単独で、又はVH及びVLの境界面における他の電荷対と組み合わせて有する遺伝子操作された二重特異性抗体が記載される。抗CD47/抗CLDN18.2及び抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体並びにその抗原結合断片も記載される。二重特異性抗体をコードする核酸、二重特異性抗体を含む組成物、及び二重特異性抗体を産生する方法、並びにがん及び/若しくは付随する合併症等の疾患を処置又は予防するために二重特異性抗体を使用する方法も記載される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年2月5日に出願された米国仮出願第63/146,334号及び2021年8月20日に出願された米国仮出願第63/260,463号に基づく優先権を主張する。それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、重鎖と軽鎖との間の境界面において設計された電荷残基を含む、遺伝子操作された二重特異性抗体に関する。本発明は、電荷対、電荷対を含有する二重特異性抗体、二重特異性抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、及び二重特異性抗体を含む組成物に関する。二重特異性抗体及び産生中のそれらの主不純物の物理的特性を識別することができる電荷対設計をスクリーニング及び使用する方法、二重特異性抗体を作製する方法、並びにがん及び/若しくは付随する合併症を含む疾患を処置するために二重特異性抗体を使用する方法も提供される。
電子的に提出した配列表への言及
本出願は、ファイル名「065799.35WO1 Sequence Listing」及び作成日2021年12月10日で80kbのサイズを有するアスキーフォーマットの配列表として、EFS-Webを介して電子的に提出される配列表を含む。EFS-Webを介して提出される配列表は明細書の一部であり、本明細書に参照により完全に組み込まれる。
抗体(免疫グロブリン)は、細菌及びウイルス等の外来物に対する身体の防御における免疫系の機能において重要な役割を果たす、天然に存在するタンパク質である。抗体は、それらの天然構造において、それぞれが同一の重鎖(HC)及び同一の軽鎖(LC)を含有する、2つのアームからなるY型タンパク質として存在する。重鎖は、N末端からC末端へVH、CH1、CH2及びCH3の順序で配置される1つの可変領域(VH)及び3つの定常領域(それぞれCH1、CH2及びCH3)を含有し、軽鎖は、N末端からC末端へVL及びCLの順序で配置される1つの可変領域(VL)及び1つの定常領域(CL)を含有する。各アームにおける重鎖及び軽鎖の会合は、通常、「対形成」と呼ばれ、これはVH、CH1、VL、及びCLを伴う。VH及びVLは、互いに物理的に相互作用して、その抗原に対する抗体の結合ドメインを形成するため、Y型抗体は、2つの同一の結合ドメインを有し、同じ抗原に対して各アーム上に1つの結合ドメインがあり、したがって二価であり、単一特異的であり、これはモノクローナル抗体(mAb)の典型的な特徴である。
抗体構造の部分として、CH1及びCLも互いに物理的に相互作用し、これは、物理的接触だけでなく、それぞれCH1及びCL上の2つの天然システインの遊離チオール基によって形成される鎖間ジスルフィド結合(「ジスルフィド架橋」とも呼ばれる)も伴う。鎖間ジスルフィド結合は、各アーム上で重鎖及び軽鎖によって形成される全体的構造を安定化するのに役立つ。さらに、鎖内ジスルフィド結合も、天然抗体構造の部分として形成される。重鎖のC末端(CH2及びCH3)は、しっかり固定した構造を形成し、これは天然抗体の二価性に重要である。
モノクローナル抗体(mAb)は、抗原へのそれらの高い親和性結合、インビボでの長い半減期、天然に生じる安定した構造、薬物標的に対して免疫系を活性化する能力、及び多くの他の側面に起因して、優れたタンパク質療法プラットフォームとなっている。しかし、療法戦略が、2つの別個の抗原、例えば1つの抗体で同じがん細胞上の2つの腫瘍特異抗原を標的化することを必要とする場合、mAbは目的にかなうことができない。そのような状況下では、同じ細胞上の2つの異なる抗原を標的化するために、一方のアームが第1の抗原に結合し、他方のアームが第2の抗原に結合する二重特異性抗体が作製される。それぞれの抗原結合について一価性があるが、同じ細胞上の両抗原への結合は、各抗原に対する二価性の喪失により喪失した結合力を埋め合わせることができる。二重特異性抗体は、両抗原を発現する細胞に対して、抗原のうちの1つのみを発現する細胞に対するよりも高い結合を有するため、mAbと比較した場合、増加した選択性を提供する。これは、正常細胞又は組織が2つの抗原のうちの1つを発現する場合、安全性の懸念を減らす上で特に重要である。二重特異性抗体は、2つの異なる細胞表面抗原又は可溶性リガンド/タンパク質に結合する場合、2つの経路を同時に標的化することができ、このことは、mAbに対するもう1つの利点である。1つの細胞上の1つ抗原及び第2の細胞上の別の抗原に結合する二重特異性抗体は、2つの細胞を結び付け、治療ゴールを達成するために意図した生物学的効果を誘発する細胞エンゲージャー(例えば、T細胞エンゲージャー)として使用することができる。
二重特異性抗体が2つのmAbから作製される場合、生成物は、各アームが固有の重鎖及び固有の軽鎖を有する、2つのmAbにそれぞれ由来する2つの異なるアームを含有するであろう。製造プロセス中の産生細胞における二重特異性抗体の発現は、4つの異なるタンパク質、すなわち2つの異なる重鎖及び2つの異なる軽鎖の発現を必要とする。ゴールは、産生中に二重特異性抗体の各アーム上に対応するLCとの各HC対を有することであるが、誤対形成(一方のアームのLCが、他方のアームのHCと対形成する)が通常起こり、望ましくない生成物を生じ、これにより、意図した二重特異性抗体生成物を産生及び単離することが困難になる。二重特異性抗体の製造側面を改良するために、いくつかのアプローチが用いられている。一例は、タンパク質工学を通じて共通の軽鎖を同定することである。しかし、タンパク質工学で使用されるドメイン交換及び多くの突然変異は、天然抗体構造を著しく変化させる可能性があり、このことは、凝集の危険性を増加させ、且つ/又は安定性を低減し得る。
T細胞エンゲージャーは、少なくとも2つの結合ドメインからなる多重特異性抗体又は抗原結合断片であり、一方のドメインはがん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原(TAA)に結合し、他方のドメインはT細胞表面分子への結合によってT細胞を活性化する。様々なT細胞結合ドメインが活性化構成要素として使用されてきたが、抗CD3結合ドメインはT細胞エンゲージャーとして広く使用されてきた。抗CD3二重特異性抗体は、腫瘍細胞にT細胞を動員してがん死滅を促進するためのT細胞係合免疫治療剤として使用されている。
1つの一般的な態様では、本発明は、
a.第1の重鎖、H1、
b.第2の重鎖、H2、
c.第1の軽鎖、L1、及び
d.第2の軽鎖、L2
を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片であって、
H1及びL1は、第1の抗原、好ましくはヒト由来の第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合ドメインを含む第1のアームを形成し、
H2及びL2は、第2の抗原、好ましくはヒト由来の第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む第2のアームを形成し、
(a)H1及びH2はそれぞれ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH1領域を含み、
(b)L1及びL2はそれぞれ、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖のCL領域を含み、
H1L1及びH2L2はそれぞれ、以下のアミノ酸置換:
(1)それぞれH1のCH1におけるG166D/E及びL1のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるG166K/R及びL2のCLにおけるS114D/E、
(2)それぞれH1のCH1におけるT187D/E及びL1のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるT187K/R及びL2のCLにおけるD/N170D/E、
(3)それぞれH1のCH1におけるS131D/E及びL1のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるS131K/R及びL2のCLにおけるP119D/E、
(4)それぞれH1のCH1におけるA129D/E及びL1のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるA129K/R及びL2のCLにおけるS121D/E、
(5)それぞれH2のCH1におけるG166D/E及びL2のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるG166K/R及びL1のCLにおけるS114D/E、
(6)それぞれH2のCH1におけるT187D/E及びL2のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるT187K/R及びL1のCLにおけるD/N170D/E、
(7)それぞれH2のCH1におけるS131D/E及びL2のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるS131K/R及びL1のCLにおけるP119D/E、又は
(8)それぞれH2のCH1におけるA129D/E及びL2のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるA129K/R及びL1のCLにおけるS121D/E
からなる群から選択される電荷対を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。
ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、VH領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、CH1領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、Fc領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの軽鎖L1及びL2はそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、VL領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの軽鎖L1及びL2はそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、CL領域は、異なるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、H1及びH2は、ヘテロ二量体を形成する。
ある特定の実施形態では、負電荷を持つアミノ酸(D又はE)は、H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129で導入され(上記のようにL1のCLにおける対応する位置で導入される正電荷を持つアミノ酸と共に)、正電荷を持つアミノ酸(K又はR)は、H2のCH1における対応する残基で導入され(上記のようにL2のCLにおける対応する位置で導入される負電荷を持つアミノ酸と共に)、H1のVH領域及びL1のVL領域は、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域は、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有するか、又は正電荷を持つアミノ酸(K又はR)は、H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129で導入され(上記のようにL1のCLにおける対応する位置で導入される負電荷を持つアミノ酸と共に)、負電荷を持つアミノ酸(D又はE)は、H2のCH1における対応する残基で導入され(上記のようにL2のCLにおける対応する位置で導入される正電荷を持つアミノ酸と共に)、H1のVH領域及びL1のVL領域は、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域は、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有する。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、CH1について配列番号17、18、19、又は20、及びCLについて配列番号21又は22のアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む2つのアームのうちの1つのCH1及びCL領域を含み、CH1及びCL領域におけるアミノ酸置換は、
(1)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(2)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(3)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるV209C及びC214X、又は
(4)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるV209C及びC214X
から選択され、Xは、S、A又はGから選択される。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、抗CD47抗体若しくは抗原結合断片アーム並びに抗TAA抗体若しくはその抗原結合断片アームを含み、CD47及びTAAは、同じ細胞上に発現され、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、CD47及びTAA、好ましくはヒトCD47及びTAAの両方への特異的な結合が可能である。単離された抗CD47抗体又はその抗原結合断片は、例えば、配列番号23、28、24及び29のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含むことができる。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、CD47、好ましくはヒトCD47に特異的に結合する第1の抗原結合ドメイン、及びクローディン18.2(CLDN18.2)、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、抗CD47抗原結合ドメインは、
(1)それぞれ配列番号1、27、2及び29、
(2)それぞれ配列番号1、28、2及び29、
(3)それぞれ配列番号1、27、2及び30、
(4)それぞれ配列番号1、28、2及び30、
(5)それぞれ配列番号1、31、2及び33、
(6)それぞれ配列番号1、32、2及び33、
(7)それぞれ配列番号1、31、2及び34、
(8)それぞれ配列番号1、32、2及び34、
(9)それぞれ配列番号1、35、2及び37、
(10)それぞれ配列番号1、36、2及び37、
(11)それぞれ配列番号1、35、2及び38、
(12)それぞれ配列番号1、36、2及び38、
(13)それぞれ配列番号1、39、2及び41、
(14)それぞれ配列番号1、40、2及び41、
(15)それぞれ配列番号1、39、2及び42、
(16)それぞれ配列番号1、40、2及び42、
(17)それぞれ配列番号1、43、2及び45、
(18)それぞれ配列番号1、44、2及び45、
(19)それぞれ配列番号1、43、2及び46、
(20)それぞれ配列番号1、44、2及び46、
(21)それぞれ配列番号1、47、2及び49、
(22)それぞれ配列番号1、48、2及び49、
(23)それぞれ配列番号1、47、2及び50、
(24)それぞれ配列番号1、48、2及び50、
(25)それぞれ配列番号1、51、2及び53、
(26)それぞれ配列番号1、52、2及び53、
(27)それぞれ配列番号1、51、2及び54、
(28)それぞれ配列番号1、52、2及び54、
(29)それぞれ配列番号1、55、2及び57、
(30)それぞれ配列番号1、56、2及び57、
(31)それぞれ配列番号1、55、2及び58、
(32)それぞれ配列番号1、56、2及び58、
(33)それぞれ配列番号23、27、24及び29、
(34)それぞれ配列番号23、28、24及び29、
(35)それぞれ配列番号23、27、24及び30、
(36)それぞれ配列番号23、28、24及び30、
(37)それぞれ配列番号25、31、26及び33、
(38)それぞれ配列番号25、32、26及び33、
(39)それぞれ配列番号25、31、26及び34、
(40)それぞれ配列番号25、32、26及び34、
(41)それぞれ配列番号23、35、24及び37、
(42)それぞれ配列番号23、36、24及び37、
(43)それぞれ配列番号23、35、24及び38、
(44)それぞれ配列番号23、36、24及び38、
(45)それぞれ配列番号25、39、26及び41、
(46)それぞれ配列番号25、40、26及び41、
(47)それぞれ配列番号25、39、26及び42、
(48)それぞれ配列番号25、40、26及び42、
(49)それぞれ配列番号23、43、24及び45、
(50)それぞれ配列番号23、44、24及び45、
(51)それぞれ配列番号23、43、24及び46、
(52)それぞれ配列番号23、44、24及び46、
(53)それぞれ配列番号25、47、26及び49、
(54)それぞれ配列番号25、48、26及び49、
(55)それぞれ配列番号25、47、26及び50、
(56)それぞれ配列番号25、48、26及び50、
(57)それぞれ配列番号23、51、24及び53、
(58)それぞれ配列番号23、52、24及び53、
(59)それぞれ配列番号23、51、24及び54、
(60)それぞれ配列番号23、52、24及び54、
(61)それぞれ配列番号25、55、26及び57、
(62)それぞれ配列番号25、56、26及び57、
(63)それぞれ配列番号25、55、26及び58、又は
(64)それぞれ配列番号25、56、26及び58
のアミノ酸配列を含むVH、CH1、VL、及びCLを含む。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体であり、第1の抗原結合ドメインは、VH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインは、VH、CH1、VL、及びCLを含み、これらは、
(1)それぞれ配列番号1、28、2、29、3、63、4及び64、
(2)それぞれ配列番号1、36、2、37、3、67、4及び68、
(3)それぞれ配列番号1、44、2、45、3、71、4及び72、
(4)それぞれ配列番号1、52、2、53、3、73、4及び74、
(5)それぞれ配列番号1、31、2、34、3、65、4及び66、
(6)それぞれ配列番号1、39、2、42、3、69、4及び70、
(7)それぞれ配列番号1、47、2、50、3、75、4及び76、
(8)それぞれ配列番号1、55、2、58、3、77、4及び78、
(9)それぞれ配列番号23、28、24、29、59、63、60及び64、
(10)それぞれ配列番号23、36、24、37、59、67、60及び68、
(11)それぞれ配列番号23、44、24、45、59、71、60及び72、
(12)それぞれ配列番号23、52、24、53、59、73、60及び74、
(13)それぞれ配列番号25、31、26、34、61、65、62及び66、
(14)それぞれ配列番号25、39、26、42、61、69、62及び70、
(15)それぞれ配列番号25、47、26、50、61、75、62及び76、又は
(16)それぞれ配列番号25、55、26、58、61、77、62及び78
のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、抗免疫細胞モジュレーター(ICM)抗体又はその抗原結合断片アームを含み、ICM、好ましくはヒトICMへの特異的な結合が可能である。ICMは、例えば、CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3、及び他の細胞表面免疫調節分子からなる群から選択され得る。
ある特定の実施形態では、抗ICM抗体又はその抗原結合断片は、抗CD3抗体又はその抗原結合断片であり、CD3、好ましくはヒトCD3への特異的な結合が可能である。単離された抗CD3抗体又はその抗原結合断片は、例えば、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み得る。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体であり、第1の抗原結合ドメインは、CD3、好ましくはヒトCD3に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインは、DLL3、好ましくはヒトDLL3に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体であり、第1の抗原結合ドメインは、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインは、配列番号13、14、15及び16のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含む。
本明細書に開示される本発明の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸も提供される。
本明細書に開示される本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターも提供される。
本明細書に開示される本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞も提供される。
ある特定の実施形態では、本発明の単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
がん細胞のマクロファージ媒介性食作用を活性化することによって、それを必要とする対象において、両方ともがん細胞表面上に発現されるCD47及びTAA(例えば、CLDN18.2)を標的化する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。
T細胞を係合することによって、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現されるDLL3を標的化する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。
マクロファージ媒介性食作用のCD47阻止誘導性活性化又はCD3媒介性T細胞活性化を使用することを含む、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現される1つ又は2つの抗原を標的化する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供される。がんは、任意の液状又は固形がんであり得るが、例えば、以下に限定されないが、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍から選択され得る。
本発明の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する条件下で培養するステップ、及び二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞又は培養物から回収するステップを含む方法も提供される。
本発明の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得るステップを含む方法も提供される。
前述の概要、及び本出願の好ましい実施形態についての以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれるとより理解されるであろう。しかし、本出願は、図面に示される厳密な実施形態には限定されないことが理解されるべきである。
図1は、mAb 1アーム及びmAb 2アームを有する二重特異性抗体(bsAb)の概略構造を示す。両アームは、異なる重鎖VH及び軽鎖VL領域を有する;例を示す目的で、二重特異性抗体の重鎖(HC)及び軽鎖(LC)は、それぞれIgG1及びカッパの骨格上にある。ヘテロ二量体形成を促進するために、ノブ・イン・ザ・ホール(Knob in the hole)(KiH)突然変異が、両HCのCH3領域に導入される。さらに、鎖間ジスルフィド結合の形成を促進してヘテロ二量体を安定化するために、システイン残基が、2つのCH3領域のそれぞれにそれぞれ導入された。H1及びL1は、それぞれmAb 1アームの重鎖及び軽鎖であり、H2及びL2は、それぞれmAb 2アームの重鎖及び軽鎖である。 図2A～2Fは、様々な抗体構成要素の配列を示す。図2Aは、ヒトIgG1(配列番号17)、IgG2(配列番号18)、IgG3(配列番号19)、及びIgG4(配列番号20)のCH1領域のアラインメントを示す。図2Bは、ヒトカッパ(配列番号21)及びラムダ(配列番号22)軽鎖のCL領域のアラインメントを示す。図2C～2Dは、抗CD47 mAb(VH:配列番号1、VL:配列番号2)及び抗CLDN18.2 mAb(VH:配列番号3、VL:配列番号4)のVH(図2C)及びVL(図2D)配列を示す。図2E～2Fは、抗CD3 mAb(VH:配列番号5、VL:配列番号6)及び抗DLL3 mAb(VH:配列番号7、VL:配列番号8)のVH(図2E)及びVL(図2F)配列を示す。Kabat法によって決定されるCDR領域は、強調表示される。*は、既知のアレル変異の部位を表す。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図２－３の続き。 図２－４の続き。 図２－５の続き。 図3A～3Qは、標準的トランスフェクション比を用いた様々な電荷対を用いて構築した二重特異性抗体の分析を示す。図3A～3Bは、指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料を用いたブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図3C～3Nは、指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたか、又は二重特異性抗体構築物についての主不純物標準をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料のCEX-HPLC(高速液体クロマトグラフィーにおける陽イオン交換クロマトグラフィー)分析を示す。図3O～3Qは、指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料の液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)の分析を示す。WT、図1に示されるように抗CD47(mAb 1アーム)及び抗CLDN18.2(mAb 2アーム)アームを有する二重特異性抗体;その他の二重特異性抗体は、表3に記載されるようにWT構築物に改変を含有する。それぞれの二重特異性構築物についての主不純物標準を生成し、その二重特異性抗体と共にCEX-HPLCで分析した:抗CD47こぶ(knob)ホモ二量体/半分子、二重特異性抗体設計の抗CD47 HC及びLCをトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料;抗CLDN18.2くぼみ(hole)ホモ二量体/半分子、二重特異性抗体設計の抗CLDN18.2 HC及びLCをトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料;2X抗CD47 LCミスマッチ(2X抗CD47 LCとも呼ばれる)、二重特異性抗体設計の抗CD47 HC及びLC並びに抗CLDN18.2 HCをトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料;2X抗CLDN18.2 LCミスマッチ(2X抗CLDN18.2 LCとも呼ばれる)、二重特異性抗体設計の抗CLDN18.2 HC及びLC並びに抗CD47 HCをトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料。 図３－１の続き。 図３－２の続き。 図３－３の続き。 図３－４の続き。 図３－５の続き。 図３－６の続き。 図３－７の続き。 図３－８の続き。 図３－９の続き。 図4A～4Lは、トランスフェクションのための偏ったDNA比を用いた様々な「EK」電荷対を用いて構築した二重特異性抗体の分析を示す。図4Aは、指定の二重特異性抗体構築物を偏ったDNA比でトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料を用いたブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図4Bは、プロテインA精製した試料のCEX-HPLC分析を示す。図4C～4Dは、偏ったDNA比を用いて指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料のLC/MS分析を示す。図4E～4Fは、直線的pH勾配を使用した、指定のプロテインA精製した二重特異性抗体試料のCEX-FPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィーにおける陽イオン交換クロマトグラフィー)分析を示す。図4Gは、図4E～4Fにおける様々なピークからの試料のブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図4H～4Lは、図4E～4FにおけるCEX-FPLCクロマトグラフィーからのピークのLC/MS分析を示す。 図４－１の続き。 図４－２の続き。 図４－３の続き。 図４－４の続き。 図４－５の続き。 図４－６の続き。 図４－７の続き。 図４－８の続き。 図5A～5Fは、トランスフェクションのための標準的DNA比を用いた様々な「KE」電荷対を用いて構築した二重特異性抗体の分析を示す。図5Aは、直線的pH勾配を使用した、指定のプロテインA精製した二重特異性抗体試料のCEX-FPLC分析を示す。図5Bは、図5Aにおける様々なピークからの試料のブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図5C～5Fは、図5AにおけるCEX-FPLCクロマトグラフィーからのピークのLC/MS分析を示す。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 図５－３の続き。 図6A～6Fは、「EK」電荷対を有する二重特異性抗体の段階的CEX-FPLC精製及び分析を示す。様々な二重特異性抗体構築物を偏ったDNA比でトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料を、CEX-FPLCで分析し、最適化した段階的精製法を使用して、各二重特異性抗体を精製した(図6A)。図6Aにおける段階的CEX-FPLCの各ピークからの試料を、二重特異性活性についてブリッジングELISAアッセイで分析し(図6B)、さらに、各ピークの純度を、LC/MSを使用して分析した(図6C～6F)。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 図６－３の続き。 図7A～7Kは、様々な「ekEK」又は「keKE」電荷対を用いて構築した二重特異性抗体の分析を示す。図7Aは、指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料を用いたブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図7B～7Iは、指定の二重特異性抗体構築物又はそれらのそれぞれの主不純物標準をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料のCEX-HPLC分析を示す。図7J～7Kは、指定の二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料のLC/MS分析を示す。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 図７－３の続き。 図７－４の続き。 図７－５の続き。 図７－６の続き。 図8A～8Lは、「ekEK」又は「keKE」電荷対を有する指定のプロテインA精製した二重特異性抗体のCEX-FPLC分析、並びに各ピークのブリッジングELISA及びLC/MSアッセイの結果を示す。図8A及び8Gは、直線的pH勾配を使用した、それぞれ「ekEK」及び「keKE」二重特異性抗体のCEX-FPLC分析を示す。図8B及び8Hは、それぞれ図8A及び8Gにおける様々なピークからの試料のブリッジングELISAアッセイの結果を示す。図8C～8Fは、図8AにおけるCEX-FPLCクロマトグラフィーからのピークのLC/MS分析を示す。図8I～8Lは、図8GにおけるCEX-FPLCクロマトグラフィーからのピークのLC/MS分析を示す。 図８－１の続き。 図８－２の続き。 図８－３の続き。 図８－４の続き。 図８－５の続き。 図８－６の続き。 図８－７の続き。 図9A～9Jは、電荷対を有する指定のプロテインA精製した二重特異性抗体の段階的CEX-FPLC精製、並びに各ピークのブリッジングELISA及びLC/MSアッセイの結果を示す。様々な二重特異性抗体構築物をトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞の培地からプロテインA精製した試料を、CEX-FPLCで分析し、最適化した段階的精製法を使用して、各二重特異性抗体を精製した(図9A及び9E)。図9A及び9Eにおける段階的CEX-FPLCの各収集可能ピークからの試料を、二重特異性活性についてブリッジングELISAアッセイで分析し(図9B及び9F)、さらに、各ピークの純度を、LC/MSを使用して分析した(図9C～9D及び9G～9J)。 図９－１の続き。 図９－２の続き。 図９－３の続き。 図９－４の続き。 図９－５の続き。 図９－６の続き。 図10A～10Cは、様々な分析法を使用した、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体bsAb_33の純度を示す。図10Aは、比較のためのいくつかの不純物標準を伴う、精製されたbsAb_33のHIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)HPLC分析である;図10Bは、比較のためのいくつかの不純物標準を伴う、精製されたbsAb_33の強陽イオン交換(SCX)HPLC分析である;図10Cは、精製されたbsAb_33のSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)HPLC分析である。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。 図11A～11Bは、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体bsAb_33を使用したアッセイの結果を示す。図11Aは、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体bsAb_33によるSHP-77細胞(DLL3を発現する)及びJurkat細胞(CD3を発現する)の架橋を示す。図11Bは、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体bsAb_33によって媒介される、SHP-77細胞(DLL3を発現する)の存在下でのレポーターJurkat細胞(CD3を発現する)の活性化を示す。抗DLL3遮断mAbは、bsAb_33の抗DLL3アームのmAbバージョンである;抗CD3遮断mAbは、bsAb_33の抗CD3アームのmAbバージョンである。
様々な刊行物、文献及び特許が背景技術及び本明細書の全体を通して引用又は記載され、これらの参照文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、法令(act)、材料、デバイス、物品等についての議論は、本発明に関する背景を提供することを目的とする。このような議論は、これらの事項のいずれか又は全てが、開示されるか又は特許請求される任意の発明に関して先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関与する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に示す意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、別途この文脈で明確に示されていない限り、複数の対象を含むことに留意すべきである。
別途記載されていない限り、任意の数値、例えば、本明細書に記載の濃度又は濃度範囲は、全ての例で、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。よって、数値は、通常は、記載された値の±10%を含む。例えば、1mg/mLの濃度は、0.9mg/mL～1.1mg/mLを含む。同様に、1%～10%(w/v)の濃度範囲は、0.9%(w/v)～11%(w/v)を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈が別途明確に示していない限り、そのような範囲内の整数及びその値の分数を含む、可能性のある全ての下位範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明確に含む。
別途示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の中のあらゆる要素を指すものと理解されるべきである。当業者であれば、慣用の実験を超えるものを使用することなく、本明細書に記載の本発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、用語「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含む(includes)」、「含むこと(including)」、「有する(has)」、「有すること(having)」、「含有する(contains)」若しくは「含有すること(containing)」、又はその任意の他の変形は、記載された整数又は整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数の群の除外を意味するものではないことが理解され、非排他的又はオープンエンドであることを意図するものである。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、これらの要素のみに必ずしも限定されるものではなく、明示的に列挙されていないか又はこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、明示的にその逆が述べられていない限り、「又は(or)」は、包括的な又はを指し、排他的な又はを指すものではない。例えば、条件A又はBは、以下のうちのいずれか1つによって満たされる:Aが真であり(又は存在し)Bが偽である(又は存在しない);Aが偽であり(又は存在しない)Bが真である(又は存在する);及びAとBの両方が真である(又は存在する)。
本明細書で使用する場合、複数の記載された要素間の接続的用語「及び/又は」は、個々の選択肢及び組み合わせた選択肢の両方を包含するものと理解される。例えば、2つの要素が「及び/又は」により接続される場合、第1の選択肢は、第2の要素なしでの第1の要素の適用性を指す。第2の選択肢は、第1の要素なしでの第2の要素の適用性を指す。第3の選択肢は、第1及び第2の要素の一緒の適用性を指す。これらの選択肢のいずれか1つは、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、本明細書で使用される用語「及び/又は」の要件を満たす。この選択肢の2つ以上の同時適用も、この意味に含まれると理解され、したがって、用語「及び/又は」の要件を満たす。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される用語「からなる(consists of)」、又はその変形、例えば、「からなる(consist of)」若しくは「からなる(consisting of)」は、任意の記載された整数又は整数の群の包含を示すが、さらなる整数又は整数の群を特定の方法、構造、又は組成物に追加することはできない。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される、用語「から本質的になる(consists essentially of)」、又はその変形、例えば、「から本質的になる(consist essentially of)」若しくは「から本質的になる(consisting essentially of)」は、任意の記載された整数又は整数の群の包含、及び特定の方法、構造又は組成物の基本的な又は新規な特性を実質的に変えない任意の記載された整数又は整数の群の任意選択の包含を示す。M.P.E.P.§2111.03を参照のこと。
本明細書で使用する場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等、より好ましくはヒトが挙げられる。
用語「右」、「左」、「下」、及び「上」は、言及される図面中の方向を示す。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴に言及する場合に本明細書で使用する用語「約(about)」、「およそ(approximately)」、「全般的に(generally)」、「実質的に(substantially)」等の用語は、記載された寸法/特徴が、厳密な境界又はパラメータではなく、当業者に理解されるように、機能的に同じか又は同様のそれらの軽微な変化を除外するものではないことも理解されるべきである。少なくとも、数値パラメータを含むこのような言及は、当技術分野で許容される数学的及び工業的原理(例えば、丸め誤差、測定誤差又は他の系統誤差、製作公差等)を使用した場合に最下位桁を変化させないばらつきを含む。
本明細書で使用する場合、明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される、用語「異なる重鎖」又は「異なる軽鎖」は、互いに同一でない配列を有する重鎖又は軽鎖を示す。
2つ以上の核酸又はポリペプチド配列(例えば、二重特異性抗体、抗CD3抗体、抗DLL3抗体、抗CD47抗体、抗CLDN18.2抗体、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体、抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体、DLL3ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド、CD3ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド、CD47ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド、並びにCLDN18.2ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド)の文脈における、用語「同一の」又は「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用するか又は目視検査によって測定して最大一致となるように比較及び整列された場合に、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを特定のパーセンテージで有する、2つ以上の配列又は部分配列を指す。
配列比較では、通常は、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムによって、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントが計算される。
比較のために最適な配列アラインメントは、例えば、Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:443(1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson及びLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータ上での実行によって、又は目視検査(全般的に、Current Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業、(1995補遺)(Ausubel)を参照のこと)によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、Altschulら(1990)J. Mol. Biol. 215:403～410頁及びAltschulら(1997)Nucleic Acids Res. 25:3389～3402頁にそれぞれ記載される、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、ある正の値の閾値スコアTと一致するか又はそれを満たすかのいずれかである、クエリー配列中の長さWの短いワードを特定することによって、高スコア配列対(HSP)を特定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、上掲)。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。
累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM(一致する残基の対に関するリワードスコア;常に0より大きい)及びN(ミスマッチの残基に関するペナルティスコア;常に0より小さい)を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降するか;累積スコアが1つ以上の負のスコアリングの残基アラインメントの蓄積のために、0以下になるか;又はいずれかの配列の末端に達するかした場合、それぞれの方向でのワードヒットの伸長が停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、ワード長(W)を11、期待値(E)を10、M=5、N=-4、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、ワード長(W)を3、期待値(E)を10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff及びHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915頁(1989)を参照のこと)をデフォルトとして使用する。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析も実施する(例えば、Karlin及びAltschul、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873～5787頁(1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する最小和確率(P(N))である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、その核酸は参照配列と類似すると考えられる。
2つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。よって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、2つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸分子」、「ヌクレオチド」又は「核酸」と同義であり、あらゆるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは修飾されていないRNA若しくはDNA又は修飾されたRNA若しくはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖DNA及び二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合であるDNA、一本鎖RNA及び二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合であるRNA、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合であり得るDNA及びRNAを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、RNA若しくはDNA又はRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。また、ポリヌクレオチドという用語は、1つ以上の修飾された塩基を含むDNA又はRNA、及び安定性若しくは他の理由のために骨格が修飾されたDNA又はRNAも含む。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシン等の異常塩基が含まれる。DNA及びRNAには様々な修飾を施すことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然に一般に見られるような化学的に、酵素により、又は代謝により修飾された形態のポリヌクレオチド、並びに、ウイルス及び細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学的形態を含む。また「ポリヌクレオチド」は、比較的短い核酸鎖(しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる)も含む。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、別の核酸セグメントが、そのセグメントの複製又は発現をもたらすように作動可能に挿入可能である、レプリコンである。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、任意のタイプの細胞、例えば初代細胞、培養細胞、又は細胞株から得た細胞等であり得る。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子がトランスフェクトされた細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、このようなトランスフェクトされた細胞の子孫である細胞、又は子孫である可能性がある細胞である。細胞の子孫は、親細胞と同一であることもあるし、或いは例えば核酸分子を宿主細胞のゲノムに組み込む際又は継代の際に突然変異が生じたり環境の影響を受けることにより、同一でないこともある。
本明細書中で使用される用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、RNAへの遺伝子の転写を含む。またこの用語は、RNAから1つ以上のポリペプチドへの翻訳も含み、さらに、全ての自然発生する転写後修飾及び翻訳後修飾も包含する。発現した二重特異性抗体は、宿主細胞の細胞質内にあったり、細胞培養の増殖培地等の細胞外環境中に入ったり、又は細胞膜に固定されるものもある。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸で構成される分子を指し、当業者がタンパク質として認識することができるものである。本明細書では、アミノ酸残基を表す従来の1文字若しくは3文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸からなるポリマーを指すために交換可能に用いられる。ポリマーは直鎖状であっても分岐状であってもよいし、修飾されたアミノ酸を含んでもよいし、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。またこの用語は、天然に若しくは介入(例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化等)又は任意の他の操作若しくは修飾(例えば標識化成分とのコンジュゲーション等)により修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。またこの定義には、例えばアミノ酸の1つ以上の類似体(例えば非天然アミノ酸等を含む)並びに当分野において公知である他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。
本明細書に記載されるペプチド配列は、慣例に従って記載されるため、ペプチドのN末端領域は左側に、C末端領域は右側になっている。アミノ酸の異性体型が公知であるが、特にそうでないと明記しない限り、アミノ酸のL-型が記載される。
本明細書で使用される場合、用語「CD47」は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する複数回膜貫通型受容体を指し、複数の細胞プロセス、例えば、細胞遊走、接着、及びT細胞機能に関与することが示されている。インテグリン関連タンパク質(IAP)、卵巣がん抗原(OA3)、Rh関連抗原、及びMER6としても知られるCD47は、もともとヒト卵巣がん上の腫瘍抗原として同定され、その後、血液腫瘍及び固形腫瘍の両方を含む複数のヒト腫瘍タイプで発現されることが示された。CD47と、マクロファージ上に発現される阻害性タンパク質であるシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPα)との相互作用は、CD47発現細胞の食作用を防止する。さらに、CD47は、実質的に全ての非悪性細胞上で低レベルで発現される。用語「ヒトCD47」は、ヒトに由来するCD47を指す。ヒトCD47の例示的なアミノ酸配列は、GenBank受託番号NP_001768.1に表される。
本明細書で使用される場合、用語「CLDN18.2」は、膜貫通型タンパク質のクローディンファミリーに属する、クローディン18バリアント2、クローディン18.2、クローディン-18.2又はクローディン-18a2.1を指す。CLDN18.2は、胃において上皮細胞の表面上に特異的に発現され(Niimi et al., Mol Cell Biol. 2001; 21:7380-7390)、上皮細胞間のタイトジャンクションの主な構造的成分の1つとなる(Sahin et al., Physiol Rev. 2013; 93:525-569)。用語「ヒトCLDN18.2」は、ヒトに由来するCLDN18.2を指す。ヒトCLDN18.2の例示的なアミノ酸配列は、GenBank受託番号AAL15637.1に表される。
本明細書に記載される場合、用語「DLL3」は、デルタ様3又はデルタ様タンパク質3としても知られるデルタ様カノニカルNotchリガンド3(DLL3)を指し、これは発生初期の間の体節分節に必要である(Dunwoodie et al., Development 129:1795-806 (2002))。哺乳動物NotchファミリーリガンドであるDLL1、DLL4、JAG1、及びJAG2の全てがNotch受容体シグナル伝達をin transで活性化するのとは異なり(Ntziachristos et al., Cancer Cell 25(3):318-34 (2014))、DLL3は主としてゴルジ体に局在し、Notchシグナル伝達を活性化することはできない(Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16 (2011)及びGeffers et al., J Cell Biol 178(3):465-76 (2007))。正常発生の間に、DLL3は、Notch及びDLL1と相互作用することによって、シス作用性及びトランス作用性の両方のNotch経路の活性化を阻害する(Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16(2011))。DLL3は、脳を除く成体正常組織には通常は存在しないか、又は非常に低レベルでしか存在しないが、肺がん、精巣がん、神経膠腫及び黒色腫の試料では過剰発現される(Uhlen et al., Science 357(6352): eaan2507 (2017))。さらに、DLL3は、小細胞肺がん(SCLC)及び大細胞神経内分泌がん(LCNEC)腫瘍細胞の表面で検出可能であり(Saunders et al., Sci Transl Med 7(302):302ra136 (2015)及びSharma et al., Cancer Res 77(14):3931-41 (2017))、このことからDLL3はがん療法のためのモノクローナル抗体の有望な標的となる。したがって、抗DLL3モノクローナル抗体を、DLL3を発現する腫瘍細胞を特異的に標的化するために使用して、抗がん治療剤として役立てられる可能性があると考えられる。用語「ヒトDLL3」は、ヒトに由来するDLL3を指す。ヒトDLL3の例示的なアミノ酸配列は、GenBank受託番号NP_058637.1に表される。
本明細書に記載される場合、用語「CD3」は、T細胞受容体(TCR)に対する共受容体として機能するマルチサブユニットタンパク質複合体である分化抗原群3を指す(Dong et al., Nature 573(7775):546-552 (2019))。標的細胞の表面上のペプチド-MHC(pMHC)へのTCRの結合は、TCR-CD3複合体のクラスター化を誘導し、CD3のζ鎖によって媒介される細胞内シグナル伝達を活性化する(Annu Rev Immunol. 27:591-619 (2009))。CD3はT細胞の活性化のために必要であり、例えば、CAR-T細胞等の治療剤による、及びCD3ベースのT細胞エンゲージャーによるそのpMHC非依存的な活性化は、T細胞を動員して腫瘍細胞を死滅させるのに非常に有効である(Brown and Mackall, Nat Rev Immunol 19(2):73-74 (2019)及びClynes and Desjarlais, Annu Rev Med 70:437-450 (2019))。ヒトCD3イプシロンサブユニットの例示的なアミノ酸配列は、GenBank受託番号NP_000724.1に表される。
「腫瘍関連抗原(TAA)」は、本明細書に記載される場合、正常組織よりも腫瘍においてより高いレベルで存在する、任意の細胞表面ペプチド及び/若しくは抗原、又は細胞表面ペプチド及び/若しくは抗原の組み合わせ、並びにその翻訳後修飾部分(例えば、グリコシル化)を指す。腫瘍において特異的に存在する一部の腫瘍関連抗原は、腫瘍特異抗原(TSA)としても知られる。腫瘍関連抗原の例には、腫瘍ウイルスによってコードされるウイルスタンパク質;変異した腫瘍性タンパク質又は腫瘍抑制因子;腫瘍細胞の表面及び/又は内部で過剰発現される正常タンパク質;細胞表面タンパク質の翻訳後修飾;その発現が通常は発生段階に限られ、成体組織では発現されないがん胎児性タンパク質、並びにその発現が非必須組織に限られる細胞型特異的タンパク質がある。
「免疫細胞モジュレーター(ICM)」は、本明細書に記載される場合、免疫細胞の表面に発現されて免疫細胞の機能を調節する、任意の細胞表面分子、例えばタンパク質を指す。ICMには刺激性分子及び抑制性分子が含まれる。刺激性ICMは、ある特定の特徴を有する特異的抗体又は抗原結合断片が刺激性ICMに特異的に結合する場合に、免疫細胞の活性化を媒介することができる。抑制性ICMは、リガンド/相互作用パートナーによる結合を受けると免疫細胞の活性を抑制し、これは免疫細胞の活性化を導くある特定の特徴を有する特異的抗体又は抗原結合断片によって遮断され得る。これらの免疫細胞は、T細胞、NK細胞、マクロファージ、又は免疫系の他の種類の細胞であり得る。ICMの例には、CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、及びB7-H3が含まれるが、これらには限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「完全な遮断」又は「完全な阻止」は、標的抗原結合ドメイン(例えば、モノクローナル若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合断片)への標的抗原(例えば、ICM、例えば、CD3)の結合の完全な阻害を指す。標的抗原結合の完全な阻害は、標的抗原結合ドメインへの標的抗原の結合がないこと(例えば、0%の結合)を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「部分的な遮断」又は「部分的な阻止」は、標的抗原結合ドメイン(例えば、モノクローナル若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合断片)への標的抗原(例えば、ICM、例えば、CD3)の結合の不完全な阻害を指す。標的抗原結合の不完全な阻害は、標的抗原結合ドメインへの標的抗原の少なくとも一部の結合(例えば、1%から99%の結合)があることを意味する。
抗体及び二重特異性抗体
本発明は、全般的に、コグネイト鎖の対形成の選好性を改良するため、並びに/又は陽イオン交換クロマトグラフィーを使用した精製を容易にするために二重特異性抗体自体及び誤対形成した不純物の物理的特性を改変及び識別するための、各アームにおけるCH1及びCL境界面に電荷突然変異を含む単離された二重特異性抗体に関する。
2つの異なる重鎖(HC)及び軽鎖(LC)で形成される二重特異性抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖の誤った対形成の傾向のために産生することが困難であり、その結果、製造プロセスにおいて排除することが困難な望ましくない生成物の産生をもたらす;たとえ誤対形成からの望ましくない生成物を精製中に排除できたとしても、誤対形成は、意図した二重特異性抗体生成物の産生効率を低下させる。ワンアーム戦略(one arm strategy)における「移動された鎖間ジスルフィド結合」(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年12月3日に出願されたPCT/US2020/063066)を電荷対と組み合わせ、同時にFc領域にノブ・イン・ザ・ホール及びジスルフィド結合形成システイン突然変異を導入することによって、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、従来の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、改善された効率及び精製の容易さを伴って産生することができる。抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体及び抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体を含むがこれらに限定されない、このような二重特異性抗体の産生は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を共発現させることによって実施することができる。
本発明は、全般的に、電荷対、又は電荷対の組み合わせ、又は電荷対の、第2のアーム上における天然の鎖間ジスルフィド結合を維持しながら1つのアーム上における移動された鎖間ジスルフィド結合との組み合わせを有する、単離された二重特異性抗体に関する。特に、本発明は、全般的に、同じがん細胞上に発現される2つの抗原、一方ががん細胞上にあり他方が可溶性リガンドとしての2つの抗原、又は一方ががん細胞上にあり他方が免疫細胞等の異なる細胞上にある2つの抗原に対する二重特異性抗体、二重特異性抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、及び二重特異性抗体を含む組成物に関する。二重特異性抗体を作製する方法、及びがんを含む疾患を処置するために二重特異性抗体を使用する方法も提供される。本発明の二重特異性抗体は、両抗原に対する高い親和性結合、両抗原に対する高い特異性、エフェクター媒介性腫瘍細胞溶解を誘導する能力、1つ又は2つの抗原を発現する細胞に対する補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性食作用(ADPC)、及び/又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を刺激する能力、コンジュゲートされた薬物の動員を媒介する能力、並びに単独若しくは他の抗がん療法と組み合わせて投与した場合に、対象及び動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害する能力を含むがこれらに限定されない、1つ以上の望ましい機能的特性を有する。本発明の二重特異性抗体は、両アームが同じ細胞上の2つの異なる抗原に結合し、複数の生物学的効果を媒介するものであり得る。2つのアームのうちの1つは、遮断されてマクロファージ媒介性食作用を誘導することができる、CD47であり得る。本発明の二重特異性抗体はまた、一方のアームががん細胞上の抗原に結合し、他方のアームがT細胞に結合してT細胞依存性がん細胞死滅を媒介する、T細胞エンゲージャー等の免疫細胞エンゲージャーであり得る。二重特異性抗体の各アームのCH1及びCL領域に導入された反対の電荷を持つアミノ酸は、各重鎖のその対応する軽鎖との正しいコグネイト対形成(H1L1及びH2L2)を強化することができる。反対の電荷を持つ対は、二重特異性抗体、及び産生プロセス中に細胞によって発現される潜在的不純物の物理的特性をよりよく識別し、意図した二重特異性抗体の精製及び産生を容易にすることができる。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、広義の意味で使用され、免疫グロブリン又は抗体分子を含み、モノクローナル若しくはポリクローナルである、ヒトの、ヒト化された、複合体の及びキメラの抗体及び抗体断片を含む。一般的に、抗体は、特定の抗原への結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体構造は周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて5つの主要なクラス(すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM)に割り当てることができる。IgA及びIgGは、アイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4にさらに細分類される。したがって、本発明の抗体は、5つの主要なクラス又は対応するサブクラスのいずれかのものであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、2つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ及びラムダのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、カッパ又はラムダ軽鎖定常ドメインを含有し得る。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含む。重鎖及び軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域から構成される抗原結合領域を含み、その軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれが3つのドメイン(すなわち、相補性決定領域1～3;CDR1、CDR2、及びCDR3)を含む。軽鎖可変領域のドメインは、代わりに、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3と称され、重鎖可変領域のドメインは、代わりに、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3と称される。
抗体のアミノ酸残基の番号付けのためにいくつかのシステムが使用される。Kabat番号付け法は、抗体の可変領域に基づいたスキームである(Elvin A. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991))。EU番号付けシステムは、定常ドメイン(CH1、ヒンジ、及びFcの一部を含む)で広く使用されている(Elvin A. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991))。
本明細書で使用する場合、用語「単離(された)抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えばDLL3に特異的に結合する単離された抗体は、DLL3に結合しない抗体を実質的に含まず、CD3に特異的に結合する単離された抗体は、CD3に結合しない抗体を実質的に含まず、CD3及びDLL3に特異的に結合する二重特異性抗体は、CD3及びDLL3に結合しない抗体を実質的に含まない)。さらに、単離された抗体は他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る天然に存在する可能性のある突然変異を除いて、同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技法、単一リンパ球遺伝子クローニング技法によって、又は組換えDNA法によって、作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるB細胞を含むハイブリドーマによって産生させることができる。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、ジスルフィド安定化Fv断片(dsFv)、(dsFv)2、二重特異性dsFv(dsFv-dsFv')、ジスルフィド安定化ダイアボディ(dsダイアボディ)、単鎖抗体分子(scFv)、単一ドメイン抗体(sdab)、scFv二量体(二価のダイアボディ)、1つ以上のCDRを含む抗体の一部から形成された多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片等の、抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合するのと同じ抗原に結合することが可能である。特定の実施形態によれば、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のFdセグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合断片は、Fab及びF(ab')を含む。
本明細書で使用する場合、用語「単鎖抗体」は、約15～約20アミノ酸の短いペプチドによって連結した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野の従来の単鎖抗体を指す。本明細書で使用する場合、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか又は重鎖可変領域のみを含む、この分野の従来の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体又は当技術分野で公知の任意の技法を使用して作製されるヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、その断片、並びに/又は少なくとも1つのヒト重鎖及び/若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ヒト化抗体」は、抗体の抗原結合特性は保持されるが、ヒトの身体におけるその抗原性は低下するように、ヒト抗体のものに対する配列相同性を増加させるよう改変されている、非ヒト抗体を指す。
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つ以上の生物種に由来する抗体を指す。軽鎖と重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物のうちの1種(例えば、マウス、ラット、ウサギ等)に由来する抗体の可変領域に対応する場合が多く、一方、定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、哺乳動物の別の種(例えば、ヒト)に由来する抗体の配列に対応する。
本明細書で使用する場合、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、この複数のうち第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第1のエピトープに対する結合特異性を有し、この複数のうち第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第2のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質(又は多量体タンパク質の同じサブユニット)上にある。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、重複しているか又は実質的に重複している。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、重複していないか又は実質的に重複していない。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質(又は多量体タンパク質の異なるサブユニット)上にある。一実施形態では、多重特異性抗体は、第3、第4、又は第5の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、又は四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用する場合、用語「二重特異性抗体」は、たった2つのエピトープ又は2つの抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第2のエピトープに対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列とによって特徴付けられる。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質(又は多量体タンパク質の同じサブユニット)上にある。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、重複しているか又は実質的に重複している。一実施形態では、第1及び第2のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質(又は多量体タンパク質の異なるサブユニット)上にある。一実施形態では、二重特異性抗体は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第2のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体、又はその断片、及び第2のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体、又はその断片を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第1のエピトープに対する結合特異性を有するscFv、又はその断片、及び第2のエピトープに対する結合特異性を有するscFv、又はその断片を含む。
本明細書で使用される場合、用語「電荷対」は、一方が正電荷を有し、他方が負電荷を有するアミノ酸の一対を指し、これは、二重特異性抗体の第1のアームの重鎖CH1領域及び軽鎖CL領域における天然のアミノ酸残基をそれぞれ置換することによって導入することができ、同時に、二重特異性抗体の第2のアームの軽鎖CL領域及び重鎖CH1領域における天然のアミノ酸残基をそれぞれ置換することによって、正電荷及び負電荷アミノ酸の同じ対を導入することができる。或いは、正電荷及び負電荷アミノ酸を、二重特異性抗体の第1のアームの重鎖のVH領域及び軽鎖のVL領域のそれぞれにアミノ酸置換によって導入することもでき、同時に、第2のアームの軽鎖のVL領域及び重鎖のVH領域のそれぞれにアミノ酸置換によって、正電荷及び負電荷アミノ酸の同じ対を導入することができる。電荷対を形成するために使用されるアミノ酸には、通常、D/E(負電荷)及びK/R(正電荷)が含まれる。CH1/CL領域又はVH/VL領域にひとたび導入されると、電荷対アミノ酸は構造的にごく近接し、反対の電荷を介して同じアームの重鎖/軽鎖相互作用を強化し、同じ電荷を介してミスマッチの重鎖/軽鎖相互作用(ミスマッチの重鎖及び軽鎖は2つの異なるアームからである)を排除することが期待される。導入された電荷対のその結果生じる電荷分布は以下の通りである:H1(CH1正電荷)/L1(CL負電荷)/H2(CH1負電荷)/L2(CL正電荷)又はH1(CH1負電荷)/L1(CL正電荷)/H2(CH1正電荷)/L2(CL負電荷)。CH1及びCL境界面に複数の電荷対を組み合わせて導入することができ、全ての正電荷アミノ酸をCH1に導入し、全ての負電荷アミノ酸を同じアームのCLに導入すること、又はその反対によって、上記の分布パターンが満たされる。類似のアプローチをVH/VL境界面にも適用することができる。さらに、CH1/CL境界面に導入された1つ又は複数の電荷対と組み合わせて、1つ又は複数の電荷対をVH及びVLの境界面に導入することもでき、この場合、同じ鎖(H1、L1、H2又はL2のいずれか)に導入されたアミノ酸は通常、同じ電荷を有し、導入された電荷対のその結果生じる分布は以下の通りである:H1(CH1及びVH正電荷)/L1(CL及びVL負電荷)/H2(CH1及びVH負電荷)/L2(CL及びVL正電荷)又はH1(CH1及びVH負電荷)/L1(CL及びVL正電荷)/H2(CH1及びVH正電荷)/L2(CL及びVL負電荷)。電荷対置換を、コグネイト鎖の対形成の選好性(それぞれH1L1及びH2L2)をさらに改良するため、並びに/又はイオン交換クロマトグラフィー及び/若しくはHICを使用する二重特異性抗体の精製を容易にするために、他の改変と組み合わせることもできる。例えば、電荷対置換に加えて、二重特異性抗体の一方のアーム上の天然の鎖間ジスルフィド結合を移動させ、その一方で他方のアームは天然の鎖間ジスルフィド結合を有するようにすることができる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2021/126538を参照)。
電荷対の記載において、G166D/Eは、位置166(EU番号付け)のGのD又はEによる置換を表し、この場合、G166はノックイン部位である;D170D/Eは、位置170のDを保つか又は位置170のDのEにより置換することを表す;他の全ての置換も同じ命名規則に従う。
本明細書で使用される場合、「CD3、DLL3、及びその組み合わせに特異的に結合する」抗体又は「CD47、CLDN18.2、及びその組み合わせに特異的に結合する」抗体は、CD3、DLL3、及びその組み合わせ、又はCD47、CLDN18.2、及びその組み合わせ、好ましくはヒトCD3、ヒトDLL3、ヒトCD47、ヒトCLDN18.2、及びその組み合わせに、1×10-7M以下、好ましくは1×10-8M以下、より好ましくは5×10-9M以下、1×10-9M以下、5×10-10M以下、又は1×10-10M以下のKDで結合する抗体を指す。用語「KD」は解離定数を指し、これはKdとKaとの比(すなわち、Kd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される。抗体に関するKD値は、本開示に鑑みて、当技術分野における方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のKDは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、バイオセンサーシステム、例えば、Biacore(登録商標)システムを使用することによって、又はバイオレイヤーインターフェロメトリー技術、例えば、Octet RED96システムを使用することによって、決定することができる。
抗体のKDの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性は高い。
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、対照抗原と比較した場合の抗体若しくはその抗原結合断片への標的抗原の有意な結合、及び/又は対照抗体若しくは抗原結合断片と比較した場合の抗体若しくはその抗原結合断片への標的抗原の有意な結合を指し、ここで対照抗原は配列及び/又は構造の比較によって標的抗原とは異なり、並びに対照抗体又は抗原結合断片は、配列及び/又は構造の比較によって標的抗原とは異なるその対応する抗原のみに有意且つ選択的に結合する。
本明細書で使用される場合、用語「EC50」は、本発明のモノクローナル若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合断片の半最大効果濃度を指す。EC50は、特定の曝露時間にわたるベースラインと最大値との中間の生物学的応答(すなわち、細胞死)を誘導するための、モノクローナル若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合断片の濃度を指す。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又は二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片は、約1μM未満、約1000nM～約100nM、約100nM～約10nM、約10nM～約1nM、約1000pM～約500pM、約500pM～約200pM、約200pM未満、約200pM～約150pM、約200pM～約100pM、約100pM～約10pM、又は約10pM～約1pMのEC50を有する。
別の特定の態様によれば、本発明は、
a.第1の重鎖、H1、
b.第2の重鎖、H2、
c.第1の軽鎖、L1、及び
d.第2の軽鎖、L2
を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片であって、
H1及びL1は、第1の抗原、好ましくはヒト由来の第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合ドメインを含む第1のアームを形成し、
H2及びL2は、第2の抗原、好ましくはヒト由来の第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む第2のアームを形成し、
(a)H1及びH2はそれぞれ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH1領域を含み、
(b)L1及びL2はそれぞれ、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖のCL領域を含み、
H1L1及びH2L2はそれぞれ、以下のアミノ酸置換:
(1)それぞれH1のCH1におけるG166D/E及びL1のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるG166K/R及びL2のCLにおけるS114D/E、
(2)それぞれH1のCH1におけるT187D/E及びL1のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるT187K/R及びL2のCLにおけるD/N170D/E、
(3)それぞれH1のCH1におけるS131D/E及びL1のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるS131K/R及びL2のCLにおけるP119D/E、
(4)それぞれH1のCH1におけるA129D/E及びL1のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるA129K/R及びL2のCLにおけるS121D/E、
(5)それぞれH2のCH1におけるG166D/E及びL2のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるG166K/R及びL1のCLにおけるS114D/E、
(6)それぞれH2のCH1におけるT187D/E及びL2のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるT187K/R及びL1のCLにおけるD/N170D/E、
(7)それぞれH2のCH1におけるS131D/E及びL2のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるS131K/R及びL1のCLにおけるP119D/E、又は
(8)それぞれH2のCH1におけるA129D/E及びL2のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるA129K/R及びL1のCLにおけるS121D/E
からなる群から選択される電荷対を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。
ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、VH領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、CH1領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの重鎖H1及びH2はそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、Fc領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの軽鎖L1及びL2はそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、VL領域は、異なるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、2つの軽鎖L1及びL2はそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、CL領域は、異なるアミノ酸配列を有する。
別の特定の態様では、H1及びH2は、ヘテロ二量体を形成する。
別の特定の態様では、(a)負電荷を持つアミノ酸(D又はE)は、H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129で導入され(上記のようにL1のCLにおける対応する位置で導入される正電荷を持つアミノ酸と共に)、正電荷を持つアミノ酸(K又はR)は、H2のCH1における対応する残基で導入され(上記のようにL2のCLにおける対応する位置で導入される負電荷を持つアミノ酸と共に)、H1のVH領域及びL1のVL領域は、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域は、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有するか、又は(b)正電荷を持つアミノ酸(K又はR)は、H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129で導入され(上記のようにL1のCLにおける対応する位置で導入される負電荷を持つアミノ酸と共に)、負電荷を持つアミノ酸(D又はE)は、H2のCH1における対応する残基で導入され(上記のようにL2のCLにおける対応する位置で導入される正電荷を持つアミノ酸と共に)、H1のVH領域及びL1のVL領域は、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域は、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有する。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、CH1について配列番号17、18、19、又は20、及びCLについて配列番号21又は22のアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む2つのアームのうちの1つのCH1及びCL領域を含み、CH1及びCL領域におけるアミノ酸置換は、
(1)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(2)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(3)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるV209C及びC214X、又は
(4)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるV209C及びC214X
から選択され、Xは、S、A又はGから選択される。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、抗CD47抗体若しくは抗原結合断片アーム並びに抗TAA抗体若しくはその抗原結合断片アームを含み、CD47及びTAAは、同じ細胞上に発現され、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、CD47及びTAA、好ましくはヒトCD47及びTAAの両方への特異的な結合が可能である。単離された抗CD47抗体又はその抗原結合断片は、例えば、配列番号23、28、24及び29のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含むことができる。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、CD47、好ましくはヒトCD47に特異的に結合する第1の抗原結合ドメイン、及びCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。
別の特定の態様では、抗CD47抗原結合ドメインは、
(1)それぞれ配列番号1、27、2及び29、
(2)それぞれ配列番号1、28、2及び29、
(3)それぞれ配列番号1、27、2及び30、
(4)それぞれ配列番号1、28、2及び30、
(5)それぞれ配列番号1、31、2及び33、
(6)それぞれ配列番号1、32、2及び33、
(7)それぞれ配列番号1、31、2及び34、
(8)それぞれ配列番号1、32、2及び34、
(9)それぞれ配列番号1、35、2及び37、
(10)それぞれ配列番号1、36、2及び37、
(11)それぞれ配列番号1、35、2及び38、
(12)それぞれ配列番号1、36、2及び38、
(13)それぞれ配列番号1、39、2及び41、
(14)それぞれ配列番号1、40、2及び41、
(15)それぞれ配列番号1、39、2及び42、
(16)それぞれ配列番号1、40、2及び42、
(17)それぞれ配列番号1、43、2及び45、
(18)それぞれ配列番号1、44、2及び45、
(19)それぞれ配列番号1、43、2及び46、
(20)それぞれ配列番号1、44、2及び46、
(21)それぞれ配列番号1、47、2及び49、
(22)それぞれ配列番号1、48、2及び49、
(23)それぞれ配列番号1、47、2及び50、
(24)それぞれ配列番号1、48、2及び50、
(25)それぞれ配列番号1、51、2及び53、
(26)それぞれ配列番号1、52、2及び53、
(27)それぞれ配列番号1、51、2及び54、
(28)それぞれ配列番号1、52、2及び54、
(29)それぞれ配列番号1、55、2及び57、
(30)それぞれ配列番号1、56、2及び57、
(31)それぞれ配列番号1、55、2及び58、
(32)それぞれ配列番号1、56、2及び58、
(33)それぞれ配列番号23、27、24及び29、
(34)それぞれ配列番号23、28、24及び29、
(35)それぞれ配列番号23、27、24及び30、
(36)それぞれ配列番号23、28、24及び30、
(37)それぞれ配列番号25、31、26及び33、
(38)それぞれ配列番号25、32、26及び33、
(39)それぞれ配列番号25、31、26及び34、
(40)それぞれ配列番号25、32、26及び34、
(41)それぞれ配列番号23、35、24及び37、
(42)それぞれ配列番号23、36、24及び37、
(43)それぞれ配列番号23、35、24及び38、
(44)それぞれ配列番号23、36、24及び38、
(45)それぞれ配列番号25、39、26及び41、
(46)それぞれ配列番号25、40、26及び41、
(47)それぞれ配列番号25、39、26及び42、
(48)それぞれ配列番号25、40、26及び42、
(49)それぞれ配列番号23、43、24及び45、
(50)それぞれ配列番号23、44、24及び45、
(51)それぞれ配列番号23、43、24及び46、
(52)それぞれ配列番号23、44、24及び46、
(53)それぞれ配列番号25、47、26及び49、
(54)それぞれ配列番号25、48、26及び49、
(55)それぞれ配列番号25、47、26及び50、
(56)それぞれ配列番号25、48、26及び50、
(57)それぞれ配列番号23、51、24及び53、
(58)それぞれ配列番号23、52、24及び53、
(59)それぞれ配列番号23、51、24及び54、
(60)それぞれ配列番号23、52、24及び54、
(61)それぞれ配列番号25、55、26及び57、
(62)それぞれ配列番号25、56、26及び57、
(63)それぞれ配列番号25、55、26及び58、又は
(64)それぞれ配列番号25、56、26及び58
のアミノ酸配列を含むVH、CH1、VL、及びCLを含む。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体であり、第1の抗原結合ドメインは、VH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインは、VH、CH1、VL、及びCLを含み、これらは、
(1)それぞれ配列番号1、28、2、29、3、63、4及び64、
(2)それぞれ配列番号1、36、2、37、3、67、4及び68、
(3)それぞれ配列番号1、44、2、45、3、71、4及び72、
(4)それぞれ配列番号1、52、2、53、3、73、4及び74、
(5)それぞれ配列番号1、31、2、34、3、65、4及び66、
(6)それぞれ配列番号1、39、2、42、3、69、4及び70、
(7)それぞれ配列番号1、47、2、50、3、75、4及び76、
(8)それぞれ配列番号1、55、2、58、3、77、4及び78、
(9)それぞれ配列番号23、28、24、29、59、63、60及び64、
(10)それぞれ配列番号23、36、24、37、59、67、60及び68、
(11)それぞれ配列番号23、44、24、45、59、71、60及び72、
(12)それぞれ配列番号23、52、24、53、59、73、60及び74、
(13)それぞれ配列番号25、31、26、34、61、65、62及び66、
(14)それぞれ配列番号25、39、26、42、61、69、62及び70、
(15)それぞれ配列番号25、47、26、50、61、75、62及び76、又は
(16)それぞれ配列番号25、55、26、58、61、77、62及び78
のアミノ酸配列を含む。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、抗免疫細胞モジュレーター(ICM)抗体又はその抗原結合断片アームを含み、ICM、好ましくはヒトICMへの特異的な結合が可能である。ICMは、例えば、CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3、及び他の細胞表面免疫調節分子からなる群から選択され得る。
別の特定の態様では、抗ICM抗体又はその抗原結合断片は、抗CD3抗体又はその抗原結合断片であり、CD3、好ましくはヒトCD3への特異的な結合が可能である。単離された抗CD3抗体又はその抗原結合断片は、例えば、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み得る。
別の特定の態様では、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、T細胞でDLL3発現がん細胞を係合することが可能であり、がん細胞のT細胞媒介性死滅を活性化する。別の特定の態様では、第1の抗原結合ドメインは、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインは、配列番号13、14、15及び16のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含む。
本発明の全長二重特異性抗体は、例えば、2つの単一特異性二価抗体間のFabアーム交換(又は半分子交換)を用いて、インビトロで無細胞環境において又は共発現を用いて、別個の特異性を有する2つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に好都合となるように各半分子中の重鎖CH3の境界面に置換を導入することによって、生成することができる。Fabアーム交換反応は、ジスルフィド結合の異性化反応及びCH3ドメインの解離-会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合を減らす。その結果得られた、親単一特異性抗体の一方の遊離システインは、第2の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖間のジスルフィド結合を形成すると同時に、親抗体のCH3ドメインは、解離-会合によって離れそして再形成する。ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化が優先されるように、FabアームのCH3ドメインを遺伝子操作することができる。得られる生成物は、それぞれが別個のエピトープ(すなわちCD3上のエピトープ、DLL3上のエピトープ、及びその組み合わせ、又はCD47上のエピトープ、CLDN18.2上のエピトープ、及びその組み合わせ)に結合する2本のFabアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
本明細書で使用する「ホモ二量体化」とは、同一のCH3アミノ酸配列を有する2つの重鎖の相互作用を指す。本明細書で使用する「ホモ二量体」とは、同一のCH3アミノ酸配列を持つ2つの重鎖を有する抗体を指す。
本明細書で使用する「ヘテロ二量体化」とは、同一でないCH3アミノ酸配列を有する2つの重鎖の相互作用を指す。本明細書で使用する「ヘテロ二量体」とは、同一でないCH3アミノ酸配列を持つ2つの重鎖を有する抗体を指す。
「ノブ・イン・ホール(knob-in-hole)」戦略(例えば国際特許公開公報第WO2006/028936号を参照されたい)を用いて、全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトIgGにおけるCH3ドメインの境界面を形成する選択されたアミノ酸を、CH3ドメインの相互作用に影響を及ぼす位置で突然変異させて、ヘテロ二量体の形成を促進することができる。小さな側鎖(くぼみ(hole))を有するアミノ酸を、第1の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖の中に導入し、大きな側鎖(こぶ(knob))を有するアミノ酸を、第2の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖の中に導入する。2つの抗体を共発現させた後、「くぼみ」を有する重鎖と「こぶ」を有する重鎖とが優先的に相互作用する結果、ヘテロ二量体が形成される。こぶ及びくぼみを形成するCH3置換ペアの例は、以下のとおりである(第1の重鎖の第1のCH3ドメインの中の修飾位置/第2の重鎖の第2のCH3ドメインの中の修飾位置で表される):T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及びT366W/T366S_L368A_Y407V。
米国特許公開第2010/0015133号、米国特許公開第2009/0182127号、米国特許公開第2010/028637号、又は米国特許公開第2011/0123532号に記載されるように、一方のCH3表面に正電荷を持つ残基を、及び第2のCH3表面に負電荷を持つ残基を置換することにより、静電相互作用を用いて重鎖ヘテロ二量体化を促進する等の他の戦略を用いることができる。他の戦略において、ヘテロ二量体化は、以下の置換により促進することができる(第1の重鎖の第1のCH3ドメインの中の修飾位置/第2の重鎖の第2のCH3ドメインの中の修飾位置として表される):L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、又はT350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W(米国特許公開第2012/0149876号又は米国特許公開第2013/0195849号に記載)。
上記方法に加え、本発明の二重特異性抗体は、国際特許公開公報第WO2011/131746号に記載される方法に従って、ジスルフィド結合の異性化を可能にする還元条件下において、2つの単一特異性ホモ二量体抗体のCH3領域の中に非対称な突然変異を導入して2つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境においてインビトロで生成することができる。この方法では、第1の単一特異性二価抗体及び第2の単一特異性二価抗体を遺伝子操作して、CH3ドメインにおいて、ヘテロ二量体の安定性を促進するある種の置換を行う。これらの抗体を、ヒンジ領域のシステインにジスルフィド結合の異性化をさせるのに十分な還元条件下で一緒にインキュベートし、これにより、Fabアームを交換させて二重特異性抗体を生成する。インキュベート条件は、任意で、非還元条件に戻してもよい。使用することができる還元剤の例としては、2-メルカプトエチルアミン(2-MEA)、ジチオトレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、グルタチオン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、L-システイン及びβ-メルカプトエタノールが挙げられ、好ましくは、還元剤は、2-メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンからなる群より選択される。例えば、少なくとも90分間少なくとも20℃の温度にて、少なくとも25mM 2-MEAの存在下で又は少なくとも0.5mMジチオトレイトールの存在下で、pH5～8(例えばpH7.0又はpH7.4)にてインキュベートすることができる。
本発明の全長二重特異性抗体は、上記のヘテロ二量体化アプローチ及び以下のいくつかのアプローチの組み合わせを使用して作製することができる:(a)二重特異性抗体の一方のアーム上のHC/LC鎖間ジスルフィド結合を移動させること(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2021/126538を参照);(b)電荷対をVH/VL境界面に導入すること;(c)電荷対をCH1/CL境界面に導入すること、又は(d)(a)～(c)に記載されたアプローチの一部又は全ての組み合わせ。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離された核酸に関する。タンパク質のコード配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、変化させる(例えば、置換、欠失、挿入等)ことができることは当業者によって認識されるであろう。したがって、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変更され得ることは、当業者によって理解されるであろう。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。本開示を鑑みて、当業者に公知の任意のベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージベクター又はウイルスベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、例えば、プラスミドである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、及び複製起点を含むことができる。プロモーターは、構成性、誘導性又は抑制性プロモーターであってもよい。核酸を細胞に送達することが可能な多くの発現ベクターが、当技術分野で公知であり、本明細書において、細胞における抗体又はその抗原結合断片の産生に使用することができる。本発明の実施形態によれば、従来のクローニング技法又は人工遺伝子合成を使用して組換え発現ベクターを生成することができる。本開示に関して、このような技術は当業者に周知である。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞に関する。本開示に鑑みて、当業者に公知の任意の宿主細胞を、本発明の抗体又はその抗原結合断片の組換え発現に使用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)TG1若しくはBL21細胞(例えば、scFv又はFab抗体の発現用)、CHO-DG44若しくはCHO-K1細胞又はHEK293細胞(例えば、完全長IgG抗体の発現用)である。特定の実施形態によれば、従来の方法、例えば、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションによって、組換え発現ベクターは宿主細胞に形質転換され、組換え核酸が有効に発現されるように組換え発現ベクターが宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれる。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する条件下で培養するステップ、及び二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞又は細胞培養物から(例えば、上清から)回収するステップを含む方法に関する。当技術分野で公知であり、本明細書に記載される従来の技法に従って、発現された二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞から採取し、精製することができる。
医薬組成物
別の一般的態様では、本発明は、本発明の単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本明細書で使用する場合、本発明の抗体を、薬学的に許容される担体と一緒に含む生産物を意味する。本発明の抗体及びこれらを含む組成物は、本明細書で言及した治療適用のための医薬の製造においても有用である。
本明細書で使用する場合、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、相溶剤、油、脂質、ベシクルを含む脂質、マイクロスフェア、リポソーム封入、又は医薬製剤において使用するための当技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特徴は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されよう。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明による組成物の有効性又は本発明による組成物の生物学的活性を妨げない非毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示に鑑みて、抗体医薬組成物において使用するのに好適な任意の薬学的に許容される担体を、本発明において使用することができる。
薬学的に活性な成分の薬学的に許容される担体との製剤化は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第21版(2005)、その後の任意の版)にあるように、当技術分野で公知である。追加の成分の非限定例として、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張性調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。1つ以上の薬学的に許容される担体を、本発明の医薬組成物の製剤化において使用することができる。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、ゲル等を含むことができる。水性製剤は、典型的には、少なくとも50%w/wの水、又は少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、又は少なくとも95%w/wの水を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、注射デバイス(例えば、シリンジ又は輸液ポンプ)を介して注射することができる注射剤として製剤化することができる。注射は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、硝子体内、又は静脈内に送達することができる。
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物であり、これはそのまま使用してもよく、又は、医師若しくは患者が使用前に溶媒、及び/若しくは希釈剤を添加して使用してもよい。固体剤形としては、錠剤、例えば、圧縮錠剤、及び/又はコーティングされた錠剤、並びにカプセル(例えば、ハード又はソフトゼラチンカプセル)を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ剤、又は再構築用の粉末の形態であってもよい。
剤形は、即時放出(この場合、水溶性又は分散性担体を含み得る)であってもよく、又は、遅延放出、持続放出、若しくは修正放出(これらの場合は、胃腸管又は皮下における剤形の溶解速度を調節する非水溶性ポリマーを含み得る)であってもよい。
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、頬内、又は舌下送達され得る。
水性製剤のpHは、pH3～pH10の間であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のpHは、約7.0～約9.5である。本発明の別の実施形態では、製剤のpHは、約3.0～約7.0である。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定例として、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、クエン酸塩、リン酸水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、並びにこれらの混合物が挙げられる。緩衝剤は、個々に又は全体で、約0.01mg/ml～約50mg/ml、例えば、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的な緩衝剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、防腐剤を含む。防腐剤の非限定例として、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル4-ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、エチル4-ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル4-ヒドロキシベンゾエート、フェノール、2-フェノキシエタノール、2-フェニルエタノール、プロピル4-ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は全体で、約0.01mg/ml～約50mg/ml、例えば、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的な防腐剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。等張剤の非限定例として、塩(例えば、塩化ナトリウム)、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びトレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール、1,2-プロパンジオールプロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、及び1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、及びこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定例は、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンであってもよく、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、ショ糖、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ-HPCD、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウムが挙げられる。等張剤の別の例は糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも1つの-OH基を有するC(4～8)炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定例として、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。この段落に列挙される各等張剤を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。等張剤は、個々に又は全体で、約0.01mg/ml～約50mg/ml、例えば、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的な等張剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、キレート剤を含む。キレート剤の非限定例として、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は全体で、約0.01mg/ml～約50mg/ml、例えば、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的なキレート剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含む。安定剤の非限定例として、1つ以上の凝集阻害剤、1つ以上の酸化阻害剤、1つ以上の界面活性剤、及び/又は1つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含み、前記安定剤は、カルボキシ/ヒドロキシセルロース及びその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC)、シクロデキストリン、2-メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、塩(例えば、塩化ナトリウム)、硫黄含有物質、例えば、モノチオグリセロール)、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は全体で、約0.01mg/ml～約50mg/ml、例えば、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的な安定剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明のさらなる実施形態では、医薬組成物は、1つ以上の界面活性剤、好ましくは1つの界面活性剤、少なくとも1つの界面活性剤、又は2つの異なる界面活性剤を含む。用語「界面活性剤」は、水溶性(親水性)部分と、脂溶性(親油性)部分とから構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び/又は双極性イオン界面活性剤からなる群から選択することができる。界面活性剤は、個々に又は全体で、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的な界面活性剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
本発明のさらなる実施形態では、医薬組成物は、1つ以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、EDTA、及び/又は塩酸(HCl)ベンズアミジン等を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は全体で、約0.1mg/ml～約20mg/mlの濃度で存在してもよい。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各々を含む医薬組成物は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得るステップを含む方法に関する。
使用方法
一般的態様では、本発明は、がん細胞のマクロファージ媒介性食作用を活性化することによって、それを必要とする対象において、両方ともがん細胞表面上に発現されるCD47及びTAA(例えば、CLDN18.2)を標的化する方法であって、本発明の抗TAA/抗CD47二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。
一般的態様では、本発明は、T細胞を係合することによって、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現されるDLL3を標的化する方法に関する;この方法は、本発明の抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
標的抗原(例えば、ICM、例えば、CD3)に結合するモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又はTAA(例えば、DLL3)及びT細胞標的抗原(例えば、ICM、例えば、CD3)の両方に結合するか又は同じ細胞上のTAA及びCD47の両方に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合断片の機能的活性は、当技術分野で公知であって本明細書に記載の方法によって特徴付けることができる。TAA(例えば、DLL3)及びT細胞標的抗原(例えば、CD3)の両方に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合断片を特徴付けるための方法には、細胞の係合に基づく架橋アッセイ若しくはT細胞活性化アッセイ、並びにBiacore、ELISA、FACS及びOctetRed分析を含む親和性及び特異性アッセイが含まれるが、それらには限定されない。同じ細胞上のTAA(例えば、CLDN18.2)及びCD47の両方に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合断片を特徴付けるための方法には、Biacore、ELISA、FACS及びOctetRed分析を含む親和性及び特異性アッセイが含まれるが、それらには限定されない。特定の実施形態によれば、DLL3及びCD3の両方に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合断片を特徴付けるための方法には、以下に記載されるものが含まれる。ICMに結合するモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又はTAA(例えば、DLL3)及びCD3以外のICMの両方に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合断片の機能的活性は、上記のものに類似の方法によって特徴付けることができる。
別の一般的態様では、本発明は、CD3媒介性T細胞活性化を使用することを含む、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現される1つ又は2つの抗原を標的化する方法、及び/又はそれを必要とする対象において、がんを処置(治療)する方法であって、単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法に関する。任意選択で、がんは、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍からなる群から選択される。
別の一般的態様では、本発明は、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する条件下で培養するステップ、及び二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞又は培養物から回収するステップを含む方法に関する。
別の一般的態様では、本発明は、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得るステップを含む方法に関する。
別の一般的態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、本発明の単離されたヒト化二重特異性抗体又はその抗原結合断片、例えば、抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体、又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。がんは任意の液状又は固形がんであり得るが、例えば、以下に限定されないが、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍から選択され得る。
本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、治療有効量の、本発明の抗CD47/抗CLDN18.2又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、対象において、所望の生物学的又は医学的応答を誘発する、有効成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載された目的に関連して、経験的且つ慣用方法で決定することができる。
抗CD47/抗CLDN18.2又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関連して本明細書で使用する場合、治療有効量は、それを必要とする対象において、免疫応答をモジュレートする抗CD47/抗CLDN18.2又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片の量を意味する。また、抗CD47/抗CLDN18.2又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関連して本明細書で使用する場合、治療有効量は、疾患、障害、若しくは状態の治療をもたらすか、疾患、障害、若しくは状態を予防するか若しくはその進行を遅延させるか、又は疾患、障害、若しくは状態に伴う症状を低減するか若しくは完全に緩和する、抗CD47/抗CLDN18.2又は抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体又はその抗原結合断片の量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は状態は、がん、好ましくは、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍からなる群から選択されるがんである。他の特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は状態は、炎症性疾患、代謝性疾患、又は二重特異性抗体を療法に使用することができる任意の他の疾患である。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれを超えるものを達成するのに十分な治療の量を指す:(i)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の重症度を低減又は改善すること、(ii)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の期間を短縮すること、(iii)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の進行を予防すること、(iv)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の退縮を生じること、(v)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の進展又は発症を予防すること、(vi)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状の再発を予防すること、(vii)治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに伴う症状を有する対象の入院を減少させること、(viii)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状を有する対象の入院期間を短縮させること、(ix)治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状を有する対象の生存率を高めること、(xi)対象における、治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴う症状を阻害若しくは低減すること、並びに/或いは(xii)別の治療の予防的又は治療効果を強化又は改善すること。
治療有効量又は治療有効投与量は、様々な因子、例えば、治療される疾患、障害又は状態、投与の手段、標的部位、対象の生理学的状態(例えば、年齢、体重、健康を含む)、対象がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変動し得る。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するよう最適に用量設定される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載の組成物は、対象への意図した投与経路に好適となるように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物は、静脈内、皮下、又は筋肉内投与に好適となるよう製剤化することができる。
本明細書で使用する場合、用語「処置(治療)する(treat)」、「処置(治療)すること(treating)」、及び「処置(治療)(treatment)」はいずれも、がんに関連した少なくとも1つの測定可能な物理的パラメータの改善又は好転を指すことを意図し、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、及び「治療(treatment)」はまた、疾患、障害、又は状態の退縮を生じること、その進行を予防すること、又は少なくともその進行速度を低下させることを指してもよい。特定の実施形態では、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、及び「治療(treatment)」は、腫瘍、より好ましくはがん等の、疾患、障害、又は状態に伴う1つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、及び「治療(treatment)」は、疾患、障害、又は状態の再発の予防を指す。特定の実施形態では、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、及び「治療(treatment)」は、疾患、障害、又は状態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、及び「治療(treatment)」は、対象における疾患、障害、又は状態の消失を指す。
特定の実施形態によれば、がんの治療において使用される組成物が提供される。がん療法では、組成物は、以下に限定されないが、化学療法、抗TIM-3 mAb、抗LAG-3 mAb、抗CD73 mAb、抗アペリン mAb、抗CTLA-4抗体、抗EGFR mAb、抗HER-2 mAb、抗CD19 mAb、抗CD20 mAb、抗CD33 mAb、抗TIP-1 mAb、抗CLDN18.2 mAb、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1療法、他のがん免疫薬(immuno-oncology drug)、抗血管新生薬、放射線療法、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)、標的療法、又は他の抗がん薬を含む別の治療と組み合わせて使用され得る。
本明細書で使用する場合、対象への2つ以上の治療の施行の文脈における、用語「組み合わせて」は、2つ以上の治療の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用は、治療が対象に施行される順序を限定するものではない。例えば、第1の治療(例えば、本明細書に記載の組成物)を、対象への第2の治療の施行前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前に)、施行と同時に、又は施行後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後に)施行することができる。
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態1は、
a.第1の重鎖、H1、
b.第2の重鎖、H2、
c.第1の軽鎖、L1、及び
d.第2の軽鎖、L2
を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片であって、
H1及びL1は、第1の抗原、好ましくはヒト由来の第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合ドメインを含む第1のアームを形成し、
H2及びL2は、第2の抗原、好ましくはヒト由来の第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む第2のアームを形成し、
(a)H1及びH2はそれぞれ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH1領域を含み、
(b)L1及びL2はそれぞれ、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖のCL領域を含み、
H1L1及びH2L2はそれぞれ、以下のアミノ酸置換:
(1)それぞれH1のCH1におけるG166D/E及びL1のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるG166K/R及びL2のCLにおけるS114D/E、
(2)それぞれH1のCH1におけるT187D/E及びL1のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるT187K/R及びL2のCLにおけるD/N170D/E、
(3)それぞれH1のCH1におけるS131D/E及びL1のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるS131K/R及びL2のCLにおけるP119D/E、
(4)それぞれH1のCH1におけるA129D/E及びL1のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるA129K/R及びL2のCLにおけるS121D/E、
(5)それぞれH2のCH1におけるG166D/E及びL2のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるG166K/R及びL1のCLにおけるS114D/E、
(6)それぞれH2のCH1におけるT187D/E及びL2のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるT187K/R及びL1のCLにおけるD/N170D/E、
(7)それぞれH2のCH1におけるS131D/E及びL2のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるS131K/R及びL1のCLにおけるP119D/E、又は
(8)それぞれH2のCH1におけるA129D/E及びL2のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるA129K/R及びL1のCLにおけるS121D/E
からなる群から選択される電荷対を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態2は、
(a)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、VH領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
(b)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、CH1領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
(c)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、Fc領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
(d)2つの軽鎖L1及びL2がそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、VL領域が、異なるアミノ酸配列を有し、及び/又は
(e)2つの軽鎖L1及びL2がそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、CL領域が、異なるアミノ酸配列を有する、
実施形態1の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態3は、H1及びH2が、ヘテロ二量体を形成する、実施形態2の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態4は、単離された抗体又は抗原結合断片が、
(a)H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129において負電荷を持つアミノ酸(D又はE)を含み、H1のVH領域及びL1のVL領域が、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域が、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有するか、又は
(b)H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129において正電荷を持つアミノ酸(K又はR)を含み、H1のVH領域及びL1のVL領域が、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域が、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有する、
実施形態1～3のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態5は、2つのアームのうちの1つのCH1及びCL領域が、CH1について配列番号17、18、19、又は20、及びCLについて配列番号21又は22のアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、
CH1及びCL領域におけるアミノ酸置換が、
(1)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(2)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
(3)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるV209C及びC214X、又は
(4)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるV209C及びC214X
から選択され、Xが、S、A又はGから選択される、実施形態1～4のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態6は、第1の抗原結合ドメインが、CD47、好ましくはヒトCD47に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインが、CD47と同じ細胞上に発現されるTAA、好ましくはヒトTAAに特異的に結合する、実施形態1～5のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態7は、第2の抗原結合ドメインが、CD47と同じ細胞上に発現されるCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合する、実施形態6の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態8は、抗CD47抗原結合ドメインが、
(1)それぞれ配列番号1、27、2及び29、
(2)それぞれ配列番号1、28、2及び29、
(3)それぞれ配列番号1、27、2及び30、
(4)それぞれ配列番号1、28、2及び30、
(5)それぞれ配列番号1、31、2及び33、
(6)それぞれ配列番号1、32、2及び33、
(7)それぞれ配列番号1、31、2及び34、
(8)それぞれ配列番号1、32、2及び34、
(9)それぞれ配列番号1、35、2及び37、
(10)それぞれ配列番号1、36、2及び37、
(11)それぞれ配列番号1、35、2及び38、
(12)それぞれ配列番号1、36、2及び38、
(13)それぞれ配列番号1、39、2及び41、
(14)それぞれ配列番号1、40、2及び41、
(15)それぞれ配列番号1、39、2及び42、
(16)それぞれ配列番号1、40、2及び42、
(17)それぞれ配列番号1、43、2及び45、
(18)それぞれ配列番号1、44、2及び45、
(19)それぞれ配列番号1、43、2及び46、
(20)それぞれ配列番号1、44、2及び46、
(21)それぞれ配列番号1、47、2及び49、
(22)それぞれ配列番号1、48、2及び49、
(23)それぞれ配列番号1、47、2及び50、
(24)それぞれ配列番号1、48、2及び50、
(25)それぞれ配列番号1、51、2及び53、
(26)それぞれ配列番号1、52、2及び53、
(27)それぞれ配列番号1、51、2及び54、
(28)それぞれ配列番号1、52、2及び54、
(29)それぞれ配列番号1、55、2及び57、
(30)それぞれ配列番号1、56、2及び57、
(31)それぞれ配列番号1、55、2及び58、
(32)それぞれ配列番号1、56、2及び58、
(33)それぞれ配列番号23、27、24及び29、
(34)それぞれ配列番号23、28、24及び29、
(35)それぞれ配列番号23、27、24及び30、
(36)それぞれ配列番号23、28、24及び30、
(37)それぞれ配列番号25、31、26及び33、
(38)それぞれ配列番号25、32、26及び33、
(39)それぞれ配列番号25、31、26及び34、
(40)それぞれ配列番号25、32、26及び34、
(41)それぞれ配列番号23、35、24及び37、
(42)それぞれ配列番号23、36、24及び37、
(43)それぞれ配列番号23、35、24及び38、
(44)それぞれ配列番号23、36、24及び38、
(45)それぞれ配列番号25、39、26及び41、
(46)それぞれ配列番号25、40、26及び41、
(47)それぞれ配列番号25、39、26及び42、
(48)それぞれ配列番号25、40、26及び42、
(49)それぞれ配列番号23、43、24及び45、
(50)それぞれ配列番号23、44、24及び45、
(51)それぞれ配列番号23、43、24及び46、
(52)それぞれ配列番号23、44、24及び46、
(53)それぞれ配列番号25、47、26及び49、
(54)それぞれ配列番号25、48、26及び49、
(55)それぞれ配列番号25、47、26及び50、
(56)それぞれ配列番号25、48、26及び50、
(57)それぞれ配列番号23、51、24及び53、
(58)それぞれ配列番号23、52、24及び53、
(59)それぞれ配列番号23、51、24及び54、
(60)それぞれ配列番号23、52、24及び54、
(61)それぞれ配列番号25、55、26及び57、
(62)それぞれ配列番号25、56、26及び57、
(63)それぞれ配列番号25、55、26及び58、又は
(64)それぞれ配列番号25、56、26及び58
のアミノ酸配列を含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、実施形態6又は7の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態9は、第1の抗原結合ドメインが、VH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインが、VH、CH1、VL、及びCLを含み、これらが、
(1)それぞれ配列番号1、28、2、29、3、63、4及び64、
(2)それぞれ配列番号1、36、2、37、3、67、4及び68、
(3)それぞれ配列番号1、44、2、45、3、71、4及び72、
(4)それぞれ配列番号1、52、2、53、3、73、4及び74、
(5)それぞれ配列番号1、31、2、34、3、65、4及び66、
(6)それぞれ配列番号1、39、2、42、3、69、4及び70、
(7)それぞれ配列番号1、47、2、50、3、75、4及び76、
(8)それぞれ配列番号1、55、2、58、3、77、4及び78、
(9)それぞれ配列番号23、28、24、29、59、63、60及び64、
(10)それぞれ配列番号23、36、24、37、59、67、60及び68、
(11)それぞれ配列番号23、44、24、45、59、71、60及び72、
(12)それぞれ配列番号23、52、24、53、59、73、60及び74、
(13)それぞれ配列番号25、31、26、34、61、65、62及び66、
(14)それぞれ配列番号25、39、26、42、61、69、62及び70、
(15)それぞれ配列番号25、47、26、50、61、75、62及び76、又は
(16)それぞれ配列番号25、55、26、58、61、77、62及び78
のアミノ酸配列を含む、実施形態8の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態10は、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片が、抗免疫細胞モジュレーター(ICM)抗体又はその抗原結合断片アームを含み、ICMへの特異的な結合が可能である、実施形態1～5のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態11は、ICMが、CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3、及び他の細胞表面免疫調節分子からなる群から選択される、実施形態10の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態12は、第1の抗原結合ドメインが、CD3、好ましくはヒトCD3に特異的に結合し、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、実施形態1～5及び10～11のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態13は、第1の抗原結合ドメインが、CD3、好ましくはヒトCD3に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインが、DLL3、好ましくはヒトDLL3に特異的に結合する、実施形態1～5及び10～12のいずれか1つの単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態14は、第1の抗原結合ドメインが、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインが、配列番号13、14、15及び16のアミノ酸配列を含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、実施形態13の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
実施形態15は、実施形態1～14のいずれか1つの二重特異性抗体又は抗原結合断片をコードする単離された核酸である。
実施形態16は、実施形態15の単離された核酸を含むベクターである。
実施形態17は、実施形態16のベクターを含む宿主細胞である。
実施形態18は、実施形態1～14のいずれか1つの単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
実施形態19は、T細胞を係合することによって、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現されるDLL3を標的化する方法であって、実施形態18のその医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。
実施形態20は、マクロファージ媒介性食作用のCD47阻止誘導性活性化又はCD3媒介性T細胞活性化を使用することを含む、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現される1つ又は2つの抗原を標的化する方法、及び/又はそれを必要とする対象において、がんを処置する方法であって、実施形態1～14のいずれか1つの単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、任意選択で、がんが、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍からなる群から選択される、方法である。
実施形態21は、実施形態1～14のいずれか1つの二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する条件下で培養するステップ、及び二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞又は培養物から回収するステップを含む方法である。
実施形態22は、実施形態1～14のいずれか1つの二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得るステップを含む方法である。
［実施例１］
電荷対を有する二重特異性抗体の構築
図1は、H1H2のヘテロ二量体中に2つの異なる重鎖(H1及びH2)及び2つの異なる軽鎖(L1及びL2)を有する二重特異性抗体(bsAb)を示し、これは、ノブ・イン・ホール及び電荷対等の一般的なアプローチで容易にすることができる。反対の電荷を持つアミノ酸を、二重特異性抗体の各アームのCH1及びCL領域に導入して、各重鎖のその対応する軽鎖との正しいコグネイト対形成(H1L1及びH2L2)を強化することができる。反対の電荷を持つ対は、bsAb、及び産生プロセス中に細胞によって発現される潜在的不純物の物理的特性をよりよく識別し、クロマトグラフィーでの意図したbsAbのその不純物からの分離、したがって意図したbsAbの精製及び産生を容易にし、一般的なmAb製造プラットフォーム(典型的には、プロテインAアフィニティー、陰イオン交換及び陽イオン交換クロマトグラフィーのステップを含む)を使用して、二重特異性抗体を製造することを可能にする。以下の実施例は、ヒトIgG1重鎖CH1及びカッパ軽鎖CL配列における二重特異性抗体を用いて示される(図2A～2B及び表5)。この概念はまた、ヒトIgG2、IgG3、又はIgG4重鎖のCH1(図2A及び表5)、及びヒトラムダ軽鎖のCL(保存されたノックイン部位が存在する場合はいつでも)(図2B及び表5)を使用する二重特異性抗体の構築に適用することができる。ノックイン部位が、たまたま、意図した電荷アミノ酸と同一の天然電荷残基である場合はいつでも、それを直接使用して、意図した電荷対を形成することができる。設計された電荷対を表1に列挙する(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2021/126538に最初に記載される)。電荷対の記載において、G166D/Eは、位置166(EU番号付け)のGのD又はEによる置換を表し、この場合、G166はノックイン部位である;D170D/Eは、位置170のDを保つか又は位置170のDのEにより置換することを表す;他の全ての置換も同じ命名規則に従う。二重特異性抗体を構築するために使用されるいくつかのmAbのVH及びVL配列を図2C～2F及び表2に示す。
抗CD47及び抗CLDN18.2 mAb(図2C～2D及び表2)を使用して、様々な電荷対設計を導入した二重特異性抗体を構築した。抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体中に使用した電荷対設計を表3に列挙する。bsAbのVH及びVL領域を、それぞれヒトIgG1重鎖(HC)及びカッパ軽鎖(LC)の定常領域に融合した。mAb 1(抗CD47)アーム上のHCとLCとの間の鎖間ジスルフィド結合を、HC上のK133及びLC上のF209に移動させる戦略を用いた。これらのステップを、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2021/126538に記載されるように実施した。bsAbのヒトIgG1重鎖及びカッパ軽鎖(VH及びVL領域についてKabat番号付け;CH1及びCL領域についてEU番号付け)の骨格上に、mAb 1(抗CD47)HCは、「こぶ」を形成するためのT366W(CH2及びCH3領域についてEU番号付け)突然変異を有し、mAb 2(抗CDN18.2)HCは、「くぼみ」を形成するための突然変異T366S、L368A、及びY407Vを有するため、2つの重鎖は、ヘテロ二量体HC(mAb 1 HC/mAb 2 HC)を有するbsAbを形成するのに好都合であった。さらに、ヘテロ二量体の重鎖のヘテロ二量体対形成を安定化するために、S354Cシステイン突然変異を、mAb 1 HCに導入し、Y349Cシステイン突然変異を、mAb 2 HCに導入した(Merchant et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998))。様々な電荷対設計を有する抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体(表3)を、ExpiCHO-S細胞にトランスフェクトし、同じ細胞において2つの重鎖及び2つの軽鎖を同時に発現させることにより、所望のbsAb及び特定の不純物の発現及び集合が生じた。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して、二重特異性抗体を精製した。
抗CD3 mAb及びヒト化抗DLL3 mAb(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報第WO2019217145号に記載される)を使用して、抗CD3/抗DLL3 bsAbを構築した(図2E～2F及び表2)。bsAbのVH及びVL領域を、それぞれヒトIgG1重鎖(HC)及びカッパ軽鎖(LC)の定常領域に融合した。電荷対HC(Q39E、T187E)/LC(Q38K、D170K)を、bsAbの抗DLL3アームに導入した;電荷対HC(Q39K、T187K)/LC(Q38E、D170E)を、bsAbの抗CD3アームに導入した。2つのHC及び2つのLCを、トランスフェクトされる細胞に共トランスフェクトした場合に、意図したbsAbの発現、精製、及び/又は産生に好都合となるだけでなく、安定性を増加させるように、mAb 2(抗DLL3)アーム上のHCとLCとの間の鎖間ジスルフィド結合を、HC上のK133及びLC上のF209に移動させる戦略を用いた。これらのステップを、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2021/126538に記載されるように実施した。最終的なbsAb(bsAb_33と名付けた)のVH、CH1、VL及びCL配列を表4に列挙する。
上記のように、bsAb_33は、ヒトIgG1重鎖及びカッパ軽鎖(VH及びVL領域についてKabat番号付け;CH1及びCL領域についてEU番号付け)の骨格上にある。mAb 1(抗CD3)HCは、「こぶ」を形成するためのT366W(CH2及びCH3領域についてEU番号付け)突然変異を有し、mAb 2(抗DLL3)HCは、「くぼみ」を形成するための突然変異T366S、L368A、及びY407Vを有するため、2つの重鎖は、ホモ二量体HC(mAb 1 HC/mAb 1 HC又はmAb 2 HC/mAb 2 HC)よりもヘテロ二量体HC(mAb 1 HC/mAb 2 HC)を有するbsAbを形成するのに好都合であった。さらに、ヘテロ二量体の重鎖のヘテロ二量体対形成を安定化するために、S354Cシステイン突然変異を、mAb 1 HCに導入し、Y349Cシステイン突然変異を、mAb 2 HCに導入した(Merchant et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998))。さらに、L234A及びL235A突然変異を、H1及びH2の両方のCH2領域に導入した。
bsAb bsAb_33をExpiCHO-S細胞にトランスフェクトし、同じ細胞において2つの重鎖及び2つの軽鎖を同時に発現させることにより、所望のbsAb及び特定の不純物の発現及び集合が生じた。プロテインAクロマトグラフィーを使用して、bsAbを精製した。
Figure 2024505673000002
Figure 2024505673000003
Figure 2024505673000004
Figure 2024505673000005
Figure 2024505673000006
Figure 2024505673000007
Figure 2024505673000008
Figure 2024505673000009
［実施例２］
電荷対を有する抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体の特性
それぞれに一対の電荷対を有する抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体を、両アームのDNAを1:1比(標準比)でトランスフェクトすることによって、ExpiCHO-S細胞において産生させた。WT及びPAC12(表3)を対照として使用した。これらのトランスフェクションからプロテインA精製した試料を、ブリッジングELISAアッセイで分析して、意図した二重特異性抗体の形成を確認した(図3A～3B)。bsAbを捕捉するためにプレート上でヒトCLDN18.2を安定して発現するExpiCHO-S細胞を使用して、ブリッジングELISAアッセイを実施した。次いで、ビオチン化ヒトCD47タンパク質を添加して、捕捉されたbsAbに結合させ、HRPコンジュゲート化ストレプトアビジンを使用して検出を実施した。プロテインA精製試料を、それらの主不純物標準と共にCEX-HPLCでも分析した(図3C～3N)。直線的塩勾配[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH6.0)及び2%アセトニトリル;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH6.0)、1M NaCl及び2%アセトニトリル]を使用して、CEX-HPLCを実行した。WT、PAC12、ek又はke試料と比較して(図3C～3F)、2X抗CD47 LCミスマッチ不純物は、「EK」[(EK(gs)、EK(td)、EK(5)、及びEK(9)を含む;表3]bsAb試料(図3G～3J)において主ピークから分離された。さらに、2X抗CD47及び2X抗CLDN18.2の両方のLCミスマッチ不純物は、「KE」[(KE(gs)、KE(td)、KE(5)、及びKE(9)を含む;表3]bsAb試料(図3K～3N)において主ピークから分離された。これらのデータは、「EK」及び「KE」電荷対が、直線的塩勾配を使用した陽イオン交換(CEX)クロマトグラフィーで、LCミスマッチ不純物の一方又は両方の物理的特性を、bsAbの物理的特性から識別でき、CEXクロマトグラフィーでLCミスマッチ不純物の一方又は両方からのbsAbの分離を容易にし得ることを示す。この特性は、製造現場でのbsAbの精製及び産生を容易にし得る。プロテインA精製試料を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)で分析した。結果は、意図したbsAbが各試料中に存在し、EK(9)では2X抗CD47 LCミスマッチがほとんど検出できなかった(図3P)ことを除いて、2X抗CD47及び2X抗CLDN18.2の両方のLCミスマッチ不純物が、これらの試料中に検出された(図3O～3Q)ことを示す。
それぞれに「EK」電荷対の一対の電荷対を有する抗CD47/抗CLDN18.2二重特異性抗体(表3)を、抗CD47 LC DNA及び抗CLDN18.2 LC DNAを2:1の比(抗CD47 LC DNA:抗CLDN18.2 LC DNA=2:1;偏ったDNA比)でトランスフェクトすることによって、ExpiCHO-S細胞において産生させた。WT及びPAC12(表3)を対照として使用した。「EK」二重特異性抗体によるトランスフェクションからプロテインA精製した試料を、ブリッジングELISAアッセイで分析して、意図した二重特異性抗体の形成を確認した(図4A)。プロテインA精製試料を、上記のように直線的塩勾配を使用して、それらの主不純物標準と共にCEX-HPLCでも分析した。2つの異なるLCについて偏ったDNA比でのトランスフェクションと一致して、比較的より多くの2X抗CD47 LCミスマッチ不純物が産生された(図4B)。主不純物種の存在を、LC/MSを使用して分析した(図4C～4D)。プロテインA精製試料を、直線的pH勾配[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)及び50mM NaCl;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH8.0)及び50mM NaCl]を使用してCEX-FPLCで分離した。単一のピークとして現れたWT、PAC12、ek又はke試料とは異なり(図4E)、「EK」試料では、主ピーク(bsAbが存在するピーク1)及び1つのLCミスマッチ不純物種が分離した(図4F)。ピークから収集した画分を、上記と同じブリッジングELISAアッセイを使用して分析した(図4G)。結果は、bsAbが、各試料のピーク1にあることを示す(図4G)。CEX-FPLC後に2X抗CD47 LCミスマッチ不純物からのbsAbの分離がなかったWT、PAC12、ek及びke試料とは異なり(図4H)、CEX-FPLC精製した「EK」試料のそれぞれにおけるピーク1は、意図したbsAbを主生成物として有した(図4I～4L)。これらのデータは、電荷対を「EK」bsAb設計に導入することによって、主bsAbが、直線的pH勾配を使用したCEX-FPLCで2X抗CD47 LCミスマッチ不純物から分離可能であることを実証し、このことは、電荷対が、bsAbの精製を容易にするのに優れた特性を有することを示す。
上記のように、標準的DNA比を使用したトランスフェクションからの、「KE」電荷対を有するプロテインA精製したbsAb試料を、ブリッジングELISAアッセイ(図3B)、CEX-HPLC(図3K～3N)、及びLC/MS(図3Q)を使用して分析した。これらの試料を、直線的pH勾配[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)及び50mM NaCl;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH8.0)及び50mM NaCl]を使用したCEX-FPLCでも分離した。単一のピークとして現れたWT、PAC12、ek又はke試料とは異なり(図4E)、「KE」試料では、主ピーク(bsAbが存在するピーク1)及び両方のLCミスマッチ不純物種が分離した(図5A)。ピークから収集した画分を、ブリッジングELISAアッセイ(図5B)及びLC/MS(図5C～5F)を使用して分析した。結果は、bsAbが、各試料のピーク1にあることを示す(図5A)。CEX-FPLC後に2X抗CD47 LCミスマッチ不純物からのbsAbの分離がなかったWT、PAC12、ek及びke試料とは異なり(図4H)、CEX-FPLC精製した「KE」試料のそれぞれにおけるピーク1は、意図したbsAbを主生成物として有した(図5C～5F)。これらのデータは、電荷対を「KE」bsAb設計に導入することによって、主bsAbが、直線的pH勾配を使用したCEX-FPLCで2X抗CD47 LC及び2X抗CLDN18.2 LCミスマッチ不純物から分離可能であることを実証し、このことは、電荷対が、bsAbの精製を容易にするのに優れた特性を有することを示す。
偏ったDNA比でのトランスフェクションからプロテインA精製した「EK」bsAb試料を、段階的溶出法[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)及び80mM NaCl;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH8.0)及び40mM NaCl]を使用して精製した。この方法を各bsAb試料について最適化した。「EK」二重特異性抗体を、不純物ピークから分離した主bsAbピーク(ピーク1)を用いて精製した(図6A)。主ピーク中の意図したbsAbの存在を、ブリッジングELISAアッセイ(図6B)及びLC/MS分析(図6C～6F)を使用して確認した。これらのデータは、電荷対を有する二重特異性抗体が、段階的溶出法を使用したCEX-FPLCで精製可能であることを実証する。
「ekEK」又は「keKE」電荷対を組み込んだ二重特異性抗体設計(表3)を、標準的1:1DNA比で両アームDNAをトランスフェクトしたExpiCHO-S細胞において産生させた。これらの設計からプロテインA精製した試料を、ブリッジングELISAアッセイで試験して、二重特異性活性を確認した(図7A)。同じ試料を、それらのそれぞれの主不純物標準と共に上記のように直線的塩勾配を使用したCEX-HPLCで(図7B～7I)及びLC/MSによって(図7J～7K)も分析した。プロテインA精製した「ekEK」bsAb試料を、上記のように直線的pH勾配[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)及び50mM NaCl;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH8.0)及び50mM NaCl]を使用したCEX-FPLCで分離した。WT、PAC12、ek及びke試料と比較して(図4E)、「ekEK」bsAb試料では、主ピーク(bsAbが存在するピーク1)は、1つのLCミスマッチ不純物種からよりよく分離した(図8A)。ピークから収集した画分を、同じブリッジングELISAアッセイ(図8B)及びLC/MSアッセイ(図8C～8F)を使用して分析して、bsAbがピーク1にあることを確認した。同様に、WT、PAC12、ek及びke試料と比較した場合(図4E)、「keKE」bsAb試料では、主ピーク(bsAbが存在するピーク1)は、1つ又は2つのLCミスマッチ不純物種からよりよく分離した(図8G)。ピークから収集した画分を、同じブリッジングELISAアッセイ(図8H)及びLC/MSアッセイ(図8I～8L)を使用して分析して、bsAbがピーク1にあることを確認した。二重特異性抗体「keKE(gs)」及び「keKE(td)」は、2X抗CD47 LC及び2X CLDN18.2LCの両方のミスマッチ種から分離された(図8I～8J)。二重特異性抗体「keKE(5)」及び「keKE(9)」は、2X抗CD47 LCミスマッチから分離された(図8K～8L);2X CLDN18.2 LCミスマッチは検出されなかった。
2つの「ekEK」(図9A)及び4つの「keKE」二重特異性抗体(図9E)を、CEX-FPLCで、カスタマイズした段階的溶出法[緩衝液A:25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)及び80mM NaCl;緩衝液B:25mMリン酸ナトリウム(pH8.0)及び40mM NaCl]を使用して精製し、精製された二重特異性抗体の活性を、ブリッジングELISAアッセイ(図9B及び9F)及びLC/MSアッセイ(図9C～9D及び9G～9J)を用いて確認した。これらの結果は、表1における電荷対を、他の電荷対(ek又はke設計;表3)と組み合わせることによって使用して、CEX-FPLCでのbsAbの精製を容易にすることができることを示す。様々な電荷対設計を有する抗CD47抗体アーム及び抗CLDN18.2抗体における様々な領域の配列を、表6に列挙する。これらの抗CD47抗体配列を使用して、表3における設計に従って対応する電荷対を導入することができる、抗CLDN18.2等の別の抗体アームを有する二重特異性抗体を構築することができる。
Figure 2024505673000010
Figure 2024505673000011
Figure 2024505673000012
Figure 2024505673000013
［実施例３］
電荷対を有する抗CD3/抗DLL3二重特異性抗体の特性
抗CD3/抗DLL3 bsAbのプロテインA精製した試料を最終pH5.5にpH調整し、25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)+210mM NaClで予め平衡化したporos XS(Thermo)CEXカラムに直接ロードした。試料を、直線的勾配[緩衝液A-25mMリン酸ナトリウム(pH5.8)+210mM NaCl;緩衝液B-25mMリン酸ナトリウム(pH8)+115mM NaCl]で溶出させた。溶出した画分を強陽イオン交換(SCX)HPLCによって分析し、2x抗DLL3 LCミスマッチ(両方のアーム上にマッチする抗DLL3 LCを有するHCヘテロ二量体)の完全な除去を示す画分をプールした。プールした画分に(NH4)2SO4を最終濃度700mMまで添加し、50mMトリス(pH7.5)+700mM(NH4)2SO4+3%グリセロールで予め平衡化したブチルセファロース高速(Cytiva)HIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)カラムに試料を直接ロードした。試料を、直線的勾配[緩衝液A-50mMトリス(pH7.5)+700mM(NH4)2SO4+3%グリセロール;緩衝液B-50mMトリス(pH7.5)+10%グリセロール]を使用して溶出させた。溶出した画分をHIC HPLCによって分析し、2x抗CD3 LCミスマッチ(両方のアーム上にマッチする抗DLL3 LCを有するHCヘテロ二量体)の完全な除去を示す画分を、精製されたタンパク質としてプールした。
精製された二重特異性抗体を、HIC HPLC、SCX HPLC及びSEC HPLCで分析した(図10A～10C)。潜在的不純物についての標準を、所与の不純物についての成分のみを用いた一過的トランスフェクションを使用して生成し(すなわち、2x抗CD3 LCミスマッチを生成するために、抗DLL3 HC、抗CD3 HC及び抗CD3 LCのみをトランスフェクションで使用して、抗CD3 LCミスマッチ標準を強制的に形成させた;所与のアームのみのHC及びLCを細胞にトランスフェクトすることによって、ホモ二量体/半分子を生成した)、プロテインAで精製し、分析において参照として使用した(図10A～10B)。データは、精製されたbsAb_33が高い純度を有することを示す。
DLL3及びCD3の両方に対するbsAb_33の結合活性を同時に評価するために、精製されたbsAbを、異なる蛍光マーカーで標識したSHP-77細胞及びJurkat細胞と共にインキュベートした。bsAb_33によって誘導される二重染色イベントを、フローサイトメトリーによって検出し、定量した。手短に述べると、Jurkat細胞をViolet Proliferation Dye 450(BD、カタログ番号562158)で染色し、SHP-77細胞をCFSE(ThermoFisher、カタログ番号34554)により、製造元のプロトコールに従って染色した。次いで、標識されたSHP-77細胞及びJurkat細胞を1:1の比で、2μg/mLのbsAb_33と共にインキュベートした。mAb遮断について、SHP-77細胞を4.5μMの抗DLL3遮断mAbにより室温で10分間処理し、その後にJurkat細胞とのインキュベーションを抗DLL3遮断mAbの最終濃度1.5μMで行うか、又はJurkat細胞を4.5μMの抗CD3遮断mAbにより室温で10分間処理し、その後にSHP-77細胞とのインキュベーションを抗CD3遮断mAbの最終濃度1.5μMで行った。CO2インキュベーターにおける37℃での1時間のインキュベーション後に、細胞を2%ホルムアルデヒドで固定し、TBSで1回洗浄して、FACS緩衝液(HBSS、0.1%BSA、0.05%アジ化ナトリウム)中に再懸濁させて、次いでフローサイトメトリー(Attune NxT)によって分析した。bsAb_33の存在下での2つの細胞型の架橋をFACSで検出し、シグナルは、抗DLL3又は抗CD3遮断mAbによって阻害された(図11A)。これらのデータは、bsAb_33が、bsAbとして機能することを実証する。
bsAb bsAb_33を、機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞を活性化するためにも使用した。活性化(CD3媒介性活性化を含む)によりホタルルシフェラーゼを条件的に発現するJurkat NFATルシフェラーゼレポーター細胞株(BPS Bioscience)を使用した。bsAb_33の存在下、及び抗DLL3遮断抗体の存在下又は非存在下で、レポーター細胞をSHP-77標的細胞と共に、CO2インキュベーターにおいて37℃で22時間、増殖培地中でインキュベートした。次いで細胞を、ルシフェラーゼ検出試薬及びルミノメーターにより、活性化についてアッセイした。bsAb bsAb_33は、標的細胞SHP-77と共にインキュベートした場合にレポーター細胞の用量依存的活性化を誘導し、このシグナルは抗DLL3遮断抗体(抗DLL3アームのmAbバージョン)によって阻害され(図11B)、このことはbsAb_33のT細胞エンゲージャー機能を実証する。
当業者には、上記の実施形態に対して、その広義の発明概念から逸脱することなく変更がなされ得ることは理解されよう。したがって、本発明は、開示した特定の実施形態に限定されず、本明細書によって定義されている本発明の趣旨及び範囲内の改変を網羅するものとすると理解される。

Claims (22)

  1. a.第1の重鎖、H1、
    b.第2の重鎖、H2、
    c.第1の軽鎖、L1、及び
    d.第2の軽鎖、L2
    を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片であって、
    H1及びL1は、第1の抗原、好ましくはヒト由来の第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合ドメインを含む第1のアームを形成し、
    H2及びL2は、第2の抗原、好ましくはヒト由来の第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む第2のアームを形成し、
    (a)H1及びH2はそれぞれ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH1領域を含み、
    (b)L1及びL2はそれぞれ、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖のCL領域を含み、
    H1L1及びH2L2はそれぞれ、以下のアミノ酸置換:
    (1)それぞれH1のCH1におけるG166D/E及びL1のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるG166K/R及びL2のCLにおけるS114D/E、
    (2)それぞれH1のCH1におけるT187D/E及びL1のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるT187K/R及びL2のCLにおけるD/N170D/E、
    (3)それぞれH1のCH1におけるS131D/E及びL1のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるS131K/R及びL2のCLにおけるP119D/E、
    (4)それぞれH1のCH1におけるA129D/E及びL1のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH2のCH1におけるA129K/R及びL2のCLにおけるS121D/E、
    (5)それぞれH2のCH1におけるG166D/E及びL2のCLにおけるS114K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるG166K/R及びL1のCLにおけるS114D/E、
    (6)それぞれH2のCH1におけるT187D/E及びL2のCLにおけるD/N170K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるT187K/R及びL1のCLにおけるD/N170D/E、
    (7)それぞれH2のCH1におけるS131D/E及びL2のCLにおけるP119K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるS131K/R及びL1のCLにおけるP119D/E、又は
    (8)それぞれH2のCH1におけるA129D/E及びL2のCLにおけるS121K/R、及びそれぞれH1のCH1におけるA129K/R及びL1のCLにおけるS121D/E
    からなる群から選択される電荷対を含む、単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  2. (a)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、VH領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
    (b)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、CH1領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
    (c)2つの重鎖H1及びH2がそれぞれ、VH領域、CH1領域、及びFc領域(CH2及びCH3領域を含有する)を含み、Fc領域が、異なるアミノ酸配列を有し、
    (d)2つの軽鎖L1及びL2がそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、VL領域が、異なるアミノ酸配列を有し、及び/又は
    (e)2つの軽鎖L1及びL2がそれぞれ、VL領域及びCL領域を含み、CL領域が、異なるアミノ酸配列を有する、
    請求項１に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  3. H1及びH2が、ヘテロ二量体を形成する、請求項２に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  4. 単離された二重特異性抗体が、
    (a)H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129において負電荷を持つアミノ酸(D又はE)を含み、H1のVH領域及びL1のVL領域が、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域が、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有するか、又は
    (b)H1のCH1におけるG166、T187、S131、又はA129において正電荷を持つアミノ酸(K又はR)を含み、H1のVH領域及びL1のVL領域が、それぞれQ39K及びQ38E置換突然変異を有し、H2のVH領域及びL2のVL領域が、それぞれQ39E及びQ38K置換突然変異を有する、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  5. 2つのアームのうちの1つのCH1及びCL領域が、CH1について配列番号17、18、19、又は20、及びCLについて配列番号21又は22のアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、
    CH1及びCL領域におけるアミノ酸置換が、
    (1)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
    (2)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるF209C及びC214X、
    (3)CH1におけるR133C及びC131X、及びCLにおけるV209C及びC214X、又は
    (4)CH1におけるK133C及びC220X、及びCLにおけるV209C及びC214X
    から選択され、Xが、S、A又はGから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  6. 第1の抗原結合ドメインが、CD47、好ましくはヒトCD47に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインが、CD47と同じ細胞上に発現されるTAA、好ましくはヒトTAAに特異的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  7. 第2の抗原結合ドメインが、CD47と同じ細胞上に発現されるCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合する、請求項６に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  8. 抗CD47抗原結合ドメインが、
    (1)それぞれ配列番号1、27、2及び29、
    (2)それぞれ配列番号1、28、2及び29、
    (3)それぞれ配列番号1、27、2及び30、
    (4)それぞれ配列番号1、28、2及び30、
    (5)それぞれ配列番号1、31、2及び33、
    (6)それぞれ配列番号1、32、2及び33、
    (7)それぞれ配列番号1、31、2及び34、
    (8)それぞれ配列番号1、32、2及び34、
    (9)それぞれ配列番号1、35、2及び37、
    (10)それぞれ配列番号1、36、2及び37、
    (11)それぞれ配列番号1、35、2及び38、
    (12)それぞれ配列番号1、36、2及び38、
    (13)それぞれ配列番号1、39、2及び41、
    (14)それぞれ配列番号1、40、2及び41、
    (15)それぞれ配列番号1、39、2及び42、
    (16)それぞれ配列番号1、40、2及び42、
    (17)それぞれ配列番号1、43、2及び45、
    (18)それぞれ配列番号1、44、2及び45、
    (19)それぞれ配列番号1、43、2及び46、
    (20)それぞれ配列番号1、44、2及び46、
    (21)それぞれ配列番号1、47、2及び49、
    (22)それぞれ配列番号1、48、2及び49、
    (23)それぞれ配列番号1、47、2及び50、
    (24)それぞれ配列番号1、48、2及び50、
    (25)それぞれ配列番号1、51、2及び53、
    (26)それぞれ配列番号1、52、2及び53、
    (27)それぞれ配列番号1、51、2及び54、
    (28)それぞれ配列番号1、52、2及び54、
    (29)それぞれ配列番号1、55、2及び57、
    (30)それぞれ配列番号1、56、2及び57、
    (31)それぞれ配列番号1、55、2及び58、
    (32)それぞれ配列番号1、56、2及び58、
    (33)それぞれ配列番号23、27、24及び29、
    (34)それぞれ配列番号23、28、24及び29、
    (35)それぞれ配列番号23、27、24及び30、
    (36)それぞれ配列番号23、28、24及び30、
    (37)それぞれ配列番号25、31、26及び33、
    (38)それぞれ配列番号25、32、26及び33、
    (39)それぞれ配列番号25、31、26及び34、
    (40)それぞれ配列番号25、32、26及び34、
    (41)それぞれ配列番号23、35、24及び37、
    (42)それぞれ配列番号23、36、24及び37、
    (43)それぞれ配列番号23、35、24及び38、
    (44)それぞれ配列番号23、36、24及び38、
    (45)それぞれ配列番号25、39、26及び41、
    (46)それぞれ配列番号25、40、26及び41、
    (47)それぞれ配列番号25、39、26及び42、
    (48)それぞれ配列番号25、40、26及び42、
    (49)それぞれ配列番号23、43、24及び45、
    (50)それぞれ配列番号23、44、24及び45、
    (51)それぞれ配列番号23、43、24及び46、
    (52)それぞれ配列番号23、44、24及び46、
    (53)それぞれ配列番号25、47、26及び49、
    (54)それぞれ配列番号25、48、26及び49、
    (55)それぞれ配列番号25、47、26及び50、
    (56)それぞれ配列番号25、48、26及び50、
    (57)それぞれ配列番号23、51、24及び53、
    (58)それぞれ配列番号23、52、24及び53、
    (59)それぞれ配列番号23、51、24及び54、
    (60)それぞれ配列番号23、52、24及び54、
    (61)それぞれ配列番号25、55、26及び57、
    (62)それぞれ配列番号25、56、26及び57、
    (63)それぞれ配列番号25、55、26及び58、又は
    (64)それぞれ配列番号25、56、26及び58
    のアミノ酸配列を含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、請求項６又は７に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  9. 第1の抗原結合ドメインが、VH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインが、VH、CH1、VL、及びCLを含み、これらが、
    (1)それぞれ配列番号1、28、2、29、3、63、4及び64、
    (2)それぞれ配列番号1、36、2、37、3、67、4及び68、
    (3)それぞれ配列番号1、44、2、45、3、71、4及び72、
    (4)それぞれ配列番号1、52、2、53、3、73、4及び74、
    (5)それぞれ配列番号1、31、2、34、3、65、4及び66、
    (6)それぞれ配列番号1、39、2、42、3、69、4及び70、
    (7)それぞれ配列番号1、47、2、50、3、75、4及び76、
    (8)それぞれ配列番号1、55、2、58、3、77、4及び78、
    (9)それぞれ配列番号23、28、24、29、59、63、60及び64、
    (10)それぞれ配列番号23、36、24、37、59、67、60及び68、
    (11)それぞれ配列番号23、44、24、45、59、71、60及び72、
    (12)それぞれ配列番号23、52、24、53、59、73、60及び74、
    (13)それぞれ配列番号25、31、26、34、61、65、62及び66、
    (14)それぞれ配列番号25、39、26、42、61、69、62及び70、
    (15)それぞれ配列番号25、47、26、50、61、75、62及び76、又は
    (16)それぞれ配列番号25、55、26、58、61、77、62及び78
    のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  10. 単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片が、抗免疫細胞モジュレーター(ICM)抗体又はその抗原結合断片アームを含み、ICMへの特異的な結合が可能である、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  11. ICMが、CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3、及び他の細胞表面免疫調節分子からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  12. 第1の抗原結合ドメインが、CD3、好ましくはヒトCD3に特異的に結合し、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、請求項１～５及び１０～１１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  13. 第1の抗原結合ドメインが、CD3、好ましくはヒトCD3に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインが、DLL3、好ましくはヒトDLL3に特異的に結合する、請求項１～５及び１０～１２のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  14. 第1の抗原結合ドメインが、配列番号9、10、11及び12のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含み、第2の抗原結合ドメインが、配列番号13、14、15及び16のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH、CH1、VL、及びCLを含む、請求項１３に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸。
  16. 請求項１５に記載のその単離された核酸を含むベクター。
  17. 請求項１６の記載のそのベクターを含む宿主細胞。
  18. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  19. T細胞を係合することによって、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現されるDLL3を標的化する方法であって、請求項１８に記載のその医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
  20. マクロファージ媒介性食作用のCD47阻止誘導性活性化又はCD3媒介性T細胞活性化を使用することを含む、それを必要とする対象において、がん細胞表面上に発現される1つ又は2つの抗原を標的化する方法、及び/又はそれを必要とする対象において、がんを処置する方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、任意選択で、がんが、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、及び他の液状腫瘍からなる群から選択される、方法。
  21. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を産生する条件下で培養するステップ、及び二重特異性抗体又はその抗原結合断片を細胞又は培養物から回収するステップを含む方法。
  22. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得るステップを含む方法。
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