KR20230141839A - 전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체 및 이의 용도 - Google Patents

전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체 및 이의 용도 Download PDF

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하이쿤 지아
후이 주
후이웬 우
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Abstract

CH1과 CL의 계면에 단독으로 또는 VH와 VL의 계면에 다른 전하쌍과 함께 도입된 전하쌍을 갖는 조작된 이중 특이성 항체가 기재되어 있다. 또한 항-CD47/항-CLDN18.2 및 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편이 기재되어 있다. 또한 이중 특이성 항체를 인코딩하는 핵산, 이중 특이성 항체를 포함하는 조성물, 이중 특이성 항체를 생산하는 방법 및 암 및/또는 관련 합병증과 같은 질환을 치료 또는 예방하기 위한 이중 특이성 항체를 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 63/146,334 및 2021년 8월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/260,463을 우선권으로 주장한다. 각 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
발명의 분야
본 발명은 중쇄와 경쇄 사이의 계면에 설계된 전하 잔기를 포함하는 조작된 이중 특이성 항체에 관한 것이다. 본 발명은 전하쌍, 전하쌍을 포함하는 이중 특이성 항체, 이중 특이성 항체를 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 벡터를 포함하는 재조합 세포 및 이중 특이성 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 이중 특이성 항체의 물리적 특성 및 생산 시 그 주요 불순물을 구별할 수 있는 전하쌍 설계를 스크리닝하고 사용하는 방법, 이중 특이성 항체를 제조하는 방법 및 암 및/또는 관련 합병증을 포함한 질환을 치료하기 위해 이중 특이성 항체를 사용하는 방법도 제공된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일면이 "065799.35WO1 Sequence Listing"이고 생성 날짜가 2021년 12월 10일이며 크기가 80kb인 ASCII 형식의 서열 목록으로 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 명세서의 일부이며 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
항체(면역글로불린)는 박테리아 및 바이러스와 같은 이물질로부터 신체를 방어하는 데 면역 체계의 기능에서 중요한 역할을 하는 자연 발생 단백질이다. 고유 구조의 항체는 각각 동일한 중쇄(HC)와 동일한 경쇄(LC)를 포함하는 2개의 아암(arm)으로 구성된 Y-형 단백질로 존재한다. 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, CH2 및 CH3의 순서로 배열된 1개의 가변 영역(VH) 및 3개의 불변 영역(각각 CH1, CH2 및 CH3)을 포함하고, 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로 VL 및 CL의 순서로 배열된 하나의 가변 영역(VL) 및 하나의 불변 영역(CL)을 포함한다. 각 아암에서 중쇄와 경쇄의 조합은 일반적으로 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하는 "쌍이룸(pairing)"이라고 한다. VH와 VL은 서로 물리적으로 상호 작용하여 항원에 대한 항체의 결합 도메인을 형성하므로 Y-형 항체는 동일한 항원에 대해 각 아암에 하나씩 2개의 동일한 결합 도메인을 가지므로 단일 클론 항체(mAb)의 전형적인 특성인 2가 및 단일 특이성이다.
항체 구조의 일부로서 CH1과 CL은 또한 서로 물리적으로 상호 작용하며 물리적 접촉뿐만 아니라 각각 CH1과 CL에 있는 2개의 천연 시스테인의 유리 티올 그룹에 의해 형성된 사슬간 디설파이드 결합("디설파이드 가교"라고도 함)을 포함한다. 사슬간 디설파이드 결합은 각 아암의 중쇄와 경쇄에 의해 형성된 전체 구조를 안정화하는 데 도움이 된다. 또한 내부 사슬 디설파이드 결합도 천연 항체 구조의 일부로 형성된다. 중쇄의 C-말단(CH2 및 CH3)은 단단한 구조를 형성하며 이는 천연 항체의 2가에 중요하다.
단일 클론 항체(mAb)는 항원에 대한 높은 친화력 결합, 생체 내 긴 반감기, 자연적으로 발생하는 안정적인 구조, 약물 표적에 대한 면역 체계 활성화 능력 및 기타 여러 측면으로 인해 우수한 단백질 치료 플랫폼으로 사용되어 왔다. 그러나, 치료 전략이 하나의 항체로 동일한 암 세포에 있는 2개의 종양 특이적 항원과 같이 2개의 개별 항원을 표적으로 삼아야 하는 경우 mAb는 그 목적을 수행할 수 없다. 이러한 상황에서 이중 특이성 항체는 동일한 세포에서 2개의 다른 항원을 표적으로 하여 한쪽 아암은 제1 항원에 결합하고 다른 아암은 제2 항원에 결합하도록 만들어진다. 각각의 항원 결합에 대해 단일가가 있지만, 동일한 세포 상의 두 항원에 대한 결합은 각 항원에 대한 이가성의 손실로 인해 손실된 결합력을 보상할 수 있다. 이중 특이성 항체는 항원 중 하나만을 발현하는 세포보다 두 항원을 모두 발현하는 세포에 대해 더 높은 결합을 갖기 때문에 mAb와 비교할 때 증가된 선택성을 제공한다. 이는 정상 세포 또는 조직이 두 항원 중 하나를 발현할 때 안전성 문제를 줄이는 데 특히 중요하다. 이중 특이성 항체는 2개의 상이한 세포 표면 항원 또는 가용성 리간드/단백질에 결합할 때 2개의 경로를 동시에 표적화할 수 있으며, 이는 mAb에 비해 또 다른 이점이다. 제1 세포에 있는 하나의 항원과 제2 세포에 있는 또 다른 항원에 결합하는 이중 특이성 항체는 2개의 세포를 결합하고 의도된 생물학적 효과를 유발하여 치료 목표를 달성하기 위해 세포 관여자(engager)(예를 들어, T 세포 관여자)로 사용될 수 있다.
이중 특이성 항체가 2개의 mAb로부터 만들어진다면, 생성물은 각각 2개의 mAb로부터의 2개의 다른 아암을 포함할 것이며, 각각의 아암은 고유한 중쇄 및 고유한 경쇄를 가진다. 제조 공정 중 생산 세포에서 이중 특이성 항체의 발현은 4개의 상이한 단백질, 즉 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 발현을 필요로 한다. 목표는 생산 중에 이중 특이성 항체의 각 아암에 대응하는 LC와 각 HC 쌍을 갖는 것이지만, 일반적으로 잘못된 쌍이룸(한 아암의 LC와 다른 아암의 HC 쌍)이 발생하고 원치 않는 생성물을 생성하므로 의도된 이중 특이성 항체 생성물을 생산 및 분리하도록 놓여진다. 이중 특이성 항체의 제조 측면을 개선하기 위해 여러 접근법이 사용되고 있다. 한 가지 예는 단백질 공학을 통해 공통 경쇄를 식별하는 것이다. 그러나, 단백질 공학에 사용되는 도메인 스왑 및 많은 돌연변이는 고유 항체 구조를 크게 변경하여 응집 위험을 증가시키거나 안정성을 감소시킬 수 있다.
T 세포 관여자는 암 세포의 표면에 발현된 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 하나의 도메인과 T 세포를 활성화하는 세포 표면 분자에 결합하는 다른 도메인으로 구성된 적어도 2개의 결합 도메인으로 이루어진 다중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다양한 T 세포 결합 도메인이 활성화 성분으로 사용되었지만 항-CD3 결합 도메인이 T 세포 관여자로 널리 사용되고 있다. 항-CD3 이중 특이성 항체는 T 세포를 종양 세포로 모집하여 암 살해를 촉진하기 위한 T 세포 관여 면역치료제로 사용되고 있다.
발명의 개요
하나의 일반적인 측면에서, 본 발명은 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로서,
a. 제1 중쇄, H1;
b. 제2 중쇄 H2;
c. 제1 경쇄, L1; 및
d. 제2 경쇄, L2를 포함하고;
여기서 H1 및 L1은 제1 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 아암을 형성하고,
H2 및 L2는 제2 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 아암을 형성하며, 여기서
(a) H1 및 H2는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 영역을 포함하고;
(b) L1 및 L2는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 영역을 포함하며;
여기서 H1L1 및 H2L2는 각각 다음 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전하쌍을 포함한다:
(1) 각각 H1의 CH1에 G166D/E 및 L1의 CL에 S114K/R, 및 각각 H2의 CH1에 G166K/R 및 L2의 CL에 S114D/E;
(2) 각각 H1의 CH1에 T187D/E 및 L1의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H2의 CH1에 T187K/R 및 L2의 CL에 D/N170D/E;
(3) 각각 H1의 CH1에 S131D/E 및 L1의 CL에 P119K/R, 및 각각 H2의 CH1에 S131K/R 및 L2의 CL에 P119D/E;
(4) 각각 H1의 CH1에 A129D/E 및 L1의 CL에 S121K/R, 및 각각 H2의 CH1에 A129K/R 및 L2의 CL에 S121D/E;
(5) 각각 H2의 CH1에 G166D/E 및 L2의 CL에 S114K/R, 및 각각 H1의 CH1에 G166K/R 및 L1의 CL에 S114D/E;
(6) 각각 H2의 CH1에 T187D/E 및 L2의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H1의 CH1에 T187K/R 및 L1의 CL에 D/N170D/E;
(7) 각각 H2의 CH1에 S131D/E 및 L2의 CL에 P119K/R, 및 각각 H1의 CH1에 S131K/R 및 L1의 CL에 P119D/E; 또는
(8) 각각 H2의 CH1에 A129D/E 및 L2의 CL에 S121K/R, 각각 H1의 CH1에 A129K/R 및 L1의 CL에 S121D/E.
특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 VH 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 CH1 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 VL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 CL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, H1 및 H2는 헤테로이량체를 형성한다.
특정 실시양태에서, 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E)이 H1의 CH1에서 G166, T187, S131, 또는 A129에 도입되고(상기 기재된 바와 같이 L1의 CL에서 상응하는 위치에 양전하를 띤 아미노산이 도입됨), 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R)이 H2의 CH1에서 상응하는 잔기에 도입되며(상기 기재된 바와 같이 L2의 CL에서 상응하는 위치에 음전하를 띤 아미노산이 도입됨), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖거나; 또는 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R)이 H1의 CH1에서 G166, T187, S131 또는 A129에 도입되고(상기 기재된 바와 같이 L1의 CL에서 상응하는 위치에 음전하를 띤 아미노산이 도입됨), 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E)이 H2의 CH1에서 상응하는 잔기에 도입되며(상기 기재된 바와 같이 L2의 CL에 상응하는 위치에 양전하를 띤 아미노산이 도입됨), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CH1에 대해 서열 번호 17, 18, 19, 또는 20 및 CL에 대해 서열 번호 21 또는 22의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 두 아암 중 하나의 CH1 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 CH1 및 CL 영역의 아미노산 치환은 다음 중에서 선택되며:
i. CH1의 K133C 및 C220X, CL의 F209C 및 C214X;
ii. CH1의 R133C 및 C131X, CL의 F209C 및 C214X;
iii. CH1의 R133C 및 C131X, CL의 V209C 및 C214X; 또는
iv. CH1의 K133C 및 C220X, CL의 V209C 및 C214X;
여기서 X는 S, A 또는 G로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD47 항체 또는 항원-결합 단편 아암 및 항-TAA 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하며, 여기서 CD47 및 TAA는 동일한 세포 상에서 발현되고, CD47 및 TAA 모두, 바람직하게는 인간 CD47 및 TAA 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 CD47, 바람직하게는 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및 클라우딘 18.2(CLDN18.2), 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-CD47 항원-결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 29;
(2) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 29;
(3) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 30;
(4) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 30;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 33;
(6) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 33;
(7) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 34;
(8) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 34;
(9) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 37;
(10) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 37;
(11) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 38;
(12) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 38;
(13) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 41;
(14) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 41;
(15) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 42;
(16) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 42;
(17) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 45;
(18) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 45;
(19) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 46;
(20) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 46;
(21) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 49;
(22) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 49;
(23) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 50;
(24) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 50;
(25) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 53;
(26) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 53;
(27) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 54;
(28) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 54;
(29) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 57;
(30) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 57;
(31) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 58;
(32) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 58;
(33) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 29;
(34) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29;
(35) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 30;
(36) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 30;
(37) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 33;
(38) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 33;
(39) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 34;
(40) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 34;
(41) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 37;
(42) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 37;
(43) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 38;
(44) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 38;
(45) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 41;
(46) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 41;
(47) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 42;
(48) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 42;
(49) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 45;
(50) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 45;
(51) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 46;
(52) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 46;
(53) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 49;
(54) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 49;
(55) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 50;
(56) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 50;
(57) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 53;
(58) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 53;
(59) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 54;
(60) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 54;
(61) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 57;
(62) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 57;
(63) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 58; 또는
(64) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 58.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체이며, 여기서 제1 항원-결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하며, 이들은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 28, 2, 29, 3, 63, 4 및 64;
(2) 각각 서열 번호 1, 36, 2, 37, 3, 67, 4 및 68;
(3) 각각 서열 번호 1, 44, 2, 45, 3, 71, 4 및 72;
(4) 각각 서열 번호 1, 52, 2, 53, 3, 73, 4 및 74;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2, 34, 3, 65, 4 및 66;
(6) 각각 서열 번호 1, 39, 2, 42, 3, 69, 4 및 70;
(7) 각각 서열 번호 1, 47, 2, 50, 3, 75, 4 및 76;
(8) 각각 서열 번호 1, 55, 2, 58, 3, 77, 4 및 78;
(9) 각각 서열 번호 23, 28, 24, 29, 59, 63, 60 및 64;
(10) 각각 서열 번호 23, 36, 24, 37, 59, 67, 60 및 68;
(11) 각각 서열 번호 23, 44, 24, 45, 59, 71, 60 및 72;
(12) 각각 서열 번호 23, 52, 24, 53, 59, 73, 60 및 74;
(13) 각각 서열 번호 25, 31, 26, 34, 61, 65, 62 및 66;
(14) 각각 서열 번호 25, 39, 26, 42, 61, 69, 62 및 70;
(15) 각각 서열 번호 25, 47, 26, 50, 61, 75, 62 및 76; 또는
(16) 각각 서열 번호 25, 55, 26, 58, 61, 77, 62 및 78.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-면역 세포 조절자(ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하고 ICM, 바람직하게는 인간 ICM에 특이적으로 결합할 수 있다. ICM은 예를 들어 CD3, CD16, CD27, CD28, CD40, CD122, NKp46, OX40, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, VISTA, SIGLEC7, SIGLEC9, KIR, BTLA, B7-H3 및 기타 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-ICM 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체이고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체이고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 13, 14, 15 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함한다.
본원에 개시된 본 발명의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이 또한 제공된다.
본원에 개시된 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
본원에 개시된 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또한 본 발명의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 세포의 대식세포-매개 식균 작용을 활성화함으로써 상기 대상체의 암 세포 표면 상에서 둘 다 발현되는 CD47 및 TAA(예를 들어, CLDN18.2)를 표적화하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포를 관여시킴으로써(engaging) 상기 대상체에서 암 세포 표면 상에서 발현되는 DLL3을 표적화하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대식세포-매개 식세포작용 또는 CD3-매개 T 세포 활성화의 CD47 차단 유도된 활성화를 사용하는 것을 포함하여, 상기 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현된 1개 또는 2개의 항원을 표적화하는 방법이 제공된다.
또한 암 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 암은 임의의 액형 또는 고형 암일 수 있으며, 예를 들어 폐암, 위암, 식도암, 담도암, 담관암, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 기타 액형 종양으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하기 위한 조건 하에서 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고 세포 또는 배양물로부터 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 또한 제공된다.
이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약학 조성물을 얻는 것을 포함하는, 본 발명의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이 또한 제공된다.
전술한 요약 뿐만 아니라 본 출원의 바람직한 실시양태에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 결부하여 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원은 도면에 나타낸 정확한 실시양태에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 도면에서:
도 1은 mAb 1 아암 및 mAb 2 아암을 갖는 이중 특이성 항체(bsAb)의 도식적 구조를 나타낸다. 두 아암은 상이한 중쇄 VH 및 경쇄 VL 영역을 가지고 있다; 이중 특이성 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)는 예를 제시할 목적으로 각각 IgG1 및 카파의 백본에 있다. 놉-인-홀(Knob in the hole(KiH)) 돌연변이가 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위해 양 HC의 CH3 영역에 도입된다. 또한, 2개의 CH3 영역 각각에 시스테인 잔기를 도입하여 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 촉진하여 헤테로이량체를 안정화시켰다. H1 및 L1은 각각 mAb 1 아암의 중쇄 및 경쇄이고, H2 및 L2는 각각 mAb 2 아암의 중쇄 및 경쇄이다.
도 2A-2F는 다양한 항체 구성 성분의 서열을 나타낸다. 도 2A는 인간 IgG1(서열 번호 17), IgG2(서열 번호 18), IgG3(서열 번호 19) 및 IgG4(서열 번호 20)의 CH1 영역 정렬을 나타낸다. 도 2B는 인간 카파(서열 번호 21) 및 람다(서열 번호 22) 경쇄의 CL 영역 정렬을 나타낸다. 도 2C-2D는 항-CD47 mAb(VH: 서열 번호 1; VL: 서열 번호 2) 및 항-CLDN18.2 mAb(VH: 서열 번호 3; VL: 서열 번호 4)의 VH(도 2C) 및 VL(도 2D) 서열을 나타낸다. 도 2E-2F는 항-CD3 mAb(VH: 서열 번호 5; VL: 서열 번호 6) 및 항-DLL3 mAb(VH: 서열 번호 7; VL: 서열 번호 8)의 VH(도 2E) 및 VL(도 2F) 서열을 나타낸다. Kabat 방법으로 결정된 CDR 영역이 강조 표시된다. *는 알려진 대립형질 변이 부위를 나타낸다.
도 3A-3Q는 표준 형질감염 비율을 갖는 다양한 전하쌍으로 작제된 이중 특이성 항체의 분석을 나타낸다. 도 3A-3B는 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터 단백질 A 정제된 샘플을 사용한 브릿징 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. 도 3C-3N은 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염되거나 이중 특이성 항체 작제물에 대한 주요 불순물 표준으로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터 단백질 A 정제된 샘플의 CEX-HPLC(고성능 액체 크로마토그래피 상의 양이온 교환 크로마토그래피) 분석을 나타낸다. 도 3O-3Q는 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플의 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 분석을 나타낸다. 도 1에 제시된 바와 같은 항-CD47(mAb 1 아암) 및 항-CLDN18.2(mAb 2 아암) 아암을 갖는 WT, 이중 특이성 항체; 다른 이중 특이성 항체는 표 3에 기재된 바와 같이 WT 작제물에 대한 변형을 함유한다. 각각의 이중 특이성 작제물에 대한 주요 불순물 표준을 생성하고 해당 이중 특이성 항체와 함께 CEX-HPLC에서 분석하였다: 항-CD47 놉 호모이량체/1/2 몰, 이중 특이성 항체 설계의 항-CD47 HC 및 LC로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터 단백질 A 정제된 샘플; 항-CLDN18.2 홀 단일이량체/1/2 몰, 이중 특이성 항체 설계의 항-CLDN18.2 HC 및 LC로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플; 2X 항-CD47 LC 미스매치(2X 항-CD47 LC라고도 함), 이중 특이성 항체 설계의 항-CD47 HC 및 LC 및 항-CLDN18.2 HC로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플; 2X 항-CLDN18.2 LC 미스매치(2X 항-CLDN18.2 LC라고도 함), 이중 특이성 항체 설계의 항-CLDN18.2 HC 및 LC 및 항-CD47 HC로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플.
도 4A-4L은 형질감염을 위해 편향된 DNA 비율을 갖는 다양한 "EK" 전하쌍으로 작제된 이중 특이성 항체의 분석을 나타낸다. 도 4A는 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 편향된 DNA 비율로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플을 사용한 브릿징 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. 도 4B는 단백질 A 정제된 샘플의 CEX-HPLC 분석을 나타낸다. 도 4C-4D는 편향된 DNA 비율의 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플의 LC/MS 분석을 나타낸다. 도 4E-4F는 선형 pH 구배를 사용한 지시된 단백질 A 정제된 이중 특이성 항체 샘플의 CEX-FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피 상의 양이온 교환 크로마토그래피) 분석을 나타낸다. 도 4G는 도 4E-4F의 상이한 피크로부터의 샘플의 브릿징 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. 도 4H-4L은 도 4E-4F의 CEX-FPLC 크로마토그래피로부터의 피크의 LC/MS 분석을 나타낸다.
도 5A-5F는 형질감염을 위해 표준 DNA 비율을 갖는 다양한 "KE" 전하쌍으로 작제된 이중 특이성 항체의 분석을 나타낸다. 도 5A는 선형 pH 구배를 사용한 지시된 단백질 A 정제된 이중 특이성 항체 샘플의 CEX-FPLC 분석을 나타낸다. 도 5B는 도 5A의 상이한 피크로부터의 샘플의 브릿징 ELISA 분석 결과를 나타낸다. 도 5C-5F는 도 5A의 CEX-FPLC 크로마토그래피로부터의 피크의 LC/MS 분석을 나타낸다.
도 6A-6F는 "EK" 전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체의 단계별 CEX-FPLC 정제 및 분석을 나타낸다. 상이한 이중 특이성 항체 작제물로 편향된 DNA 비율로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터 단백질 A 정제된 샘플을 CEX-FPLC에서 분석하고, 최적화된 단계별 정제 방법을 사용하여 각각의 이중 특이성 항체를 정제하였다(도 6A). 도 6A의 단계적 CEX-FPLC의 각 피크로부터의 샘플을 이중 특이성 활성에 대한 브릿징 ELISA 검정에서 분석하고(도 6B), 각 피크의 순도를 또한 LC/MS를 사용하여 분석하였다(도 6C-6F).
도 7A-7K는 다양한 "ekEK" 또는 "keKE" 전하쌍으로 작제된 이중 특이성 항체의 분석을 나타낸다. 도 7A는 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플을 사용한 브릿징 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. 도 7B-7I는 지시된 이중 특이성 항체 작제물 또는 각각의 주요 불순물 표준물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플의 CEX-HPLC 분석을 나타낸다. 도 7J-7K는 지시된 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플의 LC/MS 분석을 나타낸다.
도 8A-8L은 "ekEK" 또는 "keKE" 전하쌍을 갖는 지시된 단백질 A 정제된 이중 특이성 항체의 CEX-FPLC 분석 및 각 피크의 브릿징 ELISA 및 LC/MS 분석의 결과를 나타낸다. 도 8A 및 8G는 선형 pH 구배를 사용한 "ekEK" 및 "keKE" 이중 특이성 항체 각각의 CEX-FPLC 분석을 나타낸다. 도 8B 및 8H는 각각 8A 및 8G의 상이한 피크로부터의 샘플의 브릿징 ELISA 분석 결과를 나타낸다. 도 8C-8F는 도 8A의 CEX-FPLC 크로마토그래피로부터의 피크의 LC/MS 분석을 나타낸다. 도 8I-8L은 도 8G의 CEX-FPLC 크로마토그래피로부터의 피크의 LC/MS 분석을 나타낸다.
도 9A-9J는 전하쌍을 갖는 지시된 단백질 A 정제된 이중 특이성 항체의 단계별 CEX-FPLC 정제 및 각 피크의 브릿징 ELISA 및 LC/MS 분석의 결과를 나타낸다. 상이한 이중 특이성 항체 작제물로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포의 배지로부터의 단백질 A 정제된 샘플을 CEX-FPLC에서 분석하고, 최적화된 단계별 정제 방법을 사용하여 각각의 이중 특이성 항체를 정제하였다(도 9A 및 9E). 9A 및 9E의 단계별 CEX-FPLC의 각각의 수집가능한 피크로부터의 샘플을 이중 특이성 활성에 대한 브릿징 ELISA 검정에서 분석하였고(도 9B 및 9F), 각 피크의 순도를 또한 LC/MS를 사용하여 분석하였다(도 9C-9D 및 9G-9J).
도 10A-10C는 상이한 분석 방법을 사용한 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 bsAb_33의 순도를 나타낸다. 도 10A는 비교를 위한 여러 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb_33의 HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) HPLC 분석이다; 도 10B는 비교를 위한 여러 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb_33의 강한 양이온 교환(SCX) HPLC 분석이다; 도 10C는 정제된 bsAb_33의 SEC(크기 배제 크로마토그래피) HPLC 분석이다.
도 11A-11B는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 bsAb_33을 사용한 분석 결과를 나타낸다. 도 11A는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 bsAb_33에 의한 SHP-77 세포(DLL3 발현) 및 Jurkat 세포(CD3 발현)의 가교결합을 나타낸다. 도 11B는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 bsAb_33에 의해 매개되는 SHP-77 세포(DLL3 발현)의 존재 하에 리포터 Jurkat 세포(CD3 발현)의 활성화를 나타낸다. 항-DLL3 차단 mAb는 bsAb_33의 항-DLL3 아암의 mAb 버전이다; 항-CD3 차단 mAb는 bsAb_33의 항-CD3 아암의 mAb 버전이다.
발명의 상세한 설명
다양한 간행물, 기사 및 특허가 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 설명되어 있다; 이들 각각의 참고문헌은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이러한 논의는 이러한 문제 중 일부 또는 전부가 개시되거나 청구된 발명과 관련하여 선행 기술의 일부를 이룬다는 것을 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본원에 인용된 특정 용어는 명세서에 제시된 것과 같은 의미를 갖는다.
본원 및 이어지는 청구범위에서 사용되는 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 수치 값은 일반적으로 인용된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10%(w/v)의 농도 범위는 0.9%(w/v) 내지 11%(w/v)를 포함한다. 본원에서 사용되는 수치 범위의 사용은 문맥에서 명확히 달리 제시하지 않는 한, 명시적으로 모든 가능한 하위 범위, 그러한 범위 내의 모든 개별적인 수치 값, 범의 내의 정수를 포함한 그 범위 내의 모든 개별 수치 값 및 값의 분수를 포함한다.
달리 표시하지 않으면, 일련의 요소에 선행되는 "적어도"라는 용어는 그 시리즈의 모든 요소를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 당업자는 통상의 실험을 벗어나지 않고 본원에 기술된 본 발명의 특별한 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포괄시키고자 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하다", "포함하는", "포괄하다", "포괄하는", "가지다", "가지는" 또는 "함유하다" 또는 "함유하는" 또는 이의 임의의 다른 별형은 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹의 배제가 아니라, 명시된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해하며, 비배제적이거나 또는 개방형을 의도하고자 한다. 예를 들어, 구성요소의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장비는 그들 구성요소에만 반드시 제한적이지 않고, 이러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장비에 대해 분명하게 열거되지 않거나 또는 내재하지 않는 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 또한, 반대로 분명히 명시하지 않으면, "또는"은 배제적 또는이 아니라 포함적 또는을 의미한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나를 충족한다: A는 참 (또는 존재)이고 B는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고, A는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고 B는 참 (또는 존재)이고, A 및 B 둘 모두가 참 (또는 존재)이다.
본원에서 사용되는, 다수의 열거된 요소 사이에 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 선택안 둘 모두를 포괄하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 2개 구성요소가 "및/또는"으로 결합된 경우에, 첫번째 선택안은 두번째없이 첫번째 구성요소의 적용가능성을 의미한다. 두번째 선택안은 첫번째없이 두번째의 적용가능성을 의미한다. 세번째 선택안은 함께 첫번째 및 두번째 구성요소의 적용가능성을 의미한다. 이들 선택안 중 어느 하나는 의미 내에 속하는 것으로 이해하고, 그러므로 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"의 요건을 충족한다. 복수의 선택안의 동시 적용가능성이 또한 의미 내에 속하는 것으로 이해하고, 그러므로, 용어 "및/또는"의 요건을 충족한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이루어지다" 또는 별형 예컨대 "이루어진다" 또는 "이루어지는"은 본 명세서 및 청구항 전반에서 사용되고, 임의의 열거된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지만, 추가의 정수 또는 정수 그룹이 명시된 방법, 구조, 또는 조성물에 첨가될 수 없음을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "본질적으로 이루어지다" 또는 별형 예컨대 "본질적으로 이루어진다" 또는 "본질적으로 이루어지는"은 명세서 및 청구항 전반에서 사용되고, 임의의 나열된 정수 또는 정수의 그룹의 포함, 및 명시된 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규 성질을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 나열된 정수 또는 정수 그룹의 선택적 포함을 의미한다. M.P.E.P. § 2111.03을 참조한다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포괄한다. 포유동물의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이, 인간 등, 보다 바람직하게 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단어 "오른쪽", "왼쪽", "아래" 및 "위"는 참조되는 도면에서의 방향을 표시한다.
또한 바람직한 발명의 성분의 치수 또는 특징을 언급할 때 본원에서 사용되는, 용어 "약", "대략", "일반적으로", "실질적으로" 등의 용어는 당분야의 통상의 기술을 갖는 당업자가 이해하는 바와 같이, 기술된 치수/특징이 엄격한 경계 또는 매개변수가 아니고 기능적으로 동일하거나 또는 유사한 소수의 변동을 배제하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 최소한, 수치 매개변수를 포함하는 이러한 참조는 당분야에서 허용되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 올림, 측정 또는 다른 계통 오류, 제조 공차 등)를 사용하여, 적어도 유효 자릿수가 가변적이지 않은 변동을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서 및 청구항 전반에서 사용되는 용어 "상이한 중쇄" 또는 "상이한 경쇄"는 중쇄 또는 경쇄가 서로 동일하지 않은 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 이중 특이성 항체, 항-CD3 항체, 항-DLL3 항체, 항-CD47 항체, 항-CLDN18.2 항체, 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체, 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체, DLL3 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CD3 폴리펩티드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, CD47 폴리펩티드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CLDN18.2 폴리펩티드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 육안 검사를 통해서 측정하여, 최대 상응도에 대해 비교 및 정렬될 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정한 백분율을 갖거나 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 하위 서열을 의미한다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는, 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 하위 서열 좌표를 필요하면 디자인하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 디자인한다. 그 다음에 서열 비교 알고리즘은 디자인된 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대해서 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 ([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사 (일반적으로, [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조)을 통해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 각각 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기술된, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에서 공공으로 입수가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 중 동일 길이의 단어와 정렬했을 때 일부 양성-값 한계치 점수 T에 일치하거나 또는 그를 만족하는, 문의 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 확인하여 높은 채점 서열 쌍(HSP)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 한계치라고 한다(Altschul et al, 상동). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾도록 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이어서 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있을 때까지 각 서열을 따라서 양쪽 방향으로 연장된다.
누적 점수는 뉴클레오티드 서열 경우에, 매개변수 M(일치 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매치 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용해 계산된다. 아미노산 서열 경우에, 채점 매트릭스가 누적 점수를 계산하는데 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 획득 값으로부터 분량 X만큼 줄어들 때; 누적 점수가 하나 이상의 음성-채점 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 이하로 갈 때; 또는 양쪽 서열의 말단에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용한다(참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
서열 동일성 백분율 계산 이외에도, BLAST 알고리즘은 또한 2개 서열 간 유 사성의 통계 분석을 수행한다(참조: 예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리즘으로 제공되는 유사성의 한 측정은 최소 총합 확률(P(N))로서, 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간 매치가 우연히 일어나게 되는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산과 시험 핵산의 비교에서 최소 총합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게 약 0.001 미만이면 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가 표시는 하기 기술된 바와 같이, 제1 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하고, 예를 들어, 여기서 2개 펩티드는 오직 보존성 치환만이 상이하다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일한 다른 표시는 2개 분자가 엄격 조건 하에서 서로 혼성화하는 것이다.
"핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"과 동의어로 지칭되는 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 제한없이 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥, 또는 보다 전형적으로, 이중 가닥 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역을 의미한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어, 트리틸화 염기 및 특이한 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 만들어질 수 있고; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 전형적으로 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 화학적으로, 효소적으로 또는 물질대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포괄한다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 종종 올리고뉴클레오티드라고 하는, 비교적 짧은 핵산 사슬을 포괄한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 다른 핵산 절편이 작동적으로 삽입되어서 절편의 복제 또는 발현을 일으키는 레플리콘이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. "숙주 세포"는 임의 유형의 세포, 예를 들어, 초대 세포, 배양 세포, 또는 세포주 유래 세포일 수 있다. 일 실시양태에서, "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자로 형질감염된 세포이다. 다른 실시양태에서, "숙주 세포"는 이러한 형질감염된 세포의 자손 또는 잠재적 자손이다. 세포의 자손은 예를 들어, 다음 세대에서 발생될 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈으로 핵산 분자의 통합에 기인하여, 부모 세포와 동일할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이 용어는 유전자의 RNA로의 전사를 포괄한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로 RNA의 번역을 포괄하고, 또한 모든 자연적으로 발생하는 전사후 및 번역후 변형을 포괄한다. 발현되는 이중 특이성 항체는 숙주 세포의 세포질 내에, 세포외 환경, 예컨대 세포 배양의 성장 배지에 있을 수 있거나 또는 세포막에 앵커링될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산으로 구성된 분자를 지칭할 수 있고 당업자가 단백질로 인식할 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 통상의 1-글자 또는 3-글자 코드가 본원에서 사용된다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 이 정의 내에, 예를 들어, 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체를 비롯하여, 당분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에 기술된 펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 영역이 좌측에 있고 C-말단 영역은 우측에 있는 일반적인 협약에 따라 기재된다. 아미노산의 이성질체 형태가 공지되어 있지만, 달리 분명하게 표시하지 않으면 표시되는 것은 아미노산의 L-형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CD47"은 세포 이동, 부착, 및 T 세포 기능을 포함한, 다수 세포 과정에 관여되는 것으로 제안된, 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 다중-스패닝 막관통 수용체를 지칭한다. 인테그린-연관 단백질(IAP), 난소 암 항원(OA3), Rh-관련 항원, 및 MER6으로도 알려진, CD47은 본래 인간 난소 암 상에서 종양 항원으로 확인되었었고, 이후에 조혈 및 고형 종양 둘 모두를 포함한, 다수의 인간 종양 유형 상에서 발현되는 것으로 확인되었다. CD47 및 마크로파지 상에서 발현되는 억제성 단백질인 신호 조절 단백질 알파(SIRPα) 간 상호작용은 CD47-발현 세포의 식세포작용을 방지한다. CD47은 추가적으로 실제로 모든 비-악성 세포 상에서 낮은 수준으로 발현된다. 용어 "인간 CD47"은 인간에서 기원된 CD47을 의미한다. 인간 CD47의 예시적인 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_001768.1로 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CLDN18.2"는 막관통 단백질의 클라우딘 패밀리에 속하는 클라우딘 18 변이체 2, 클라우딘 18.2, 클라우딘-18.2 또는 클라우딘-18a2.1을 지칭한다. CLDN18.2는 위의 상피 세포 표면에서 특이적으로 발현되며(Niimi et al., Mol Cell Biol. 2001; 21:7380-7390) 상피 세포 사이의 긴밀한 접합부의 주요 구조적 구성 요소 중 하나가 된다(Sahin et al., Physiol Rev. 2013;93:525-569). "인간 CLDN18.2"라는 용어는 인간으로부터 기원한 CLDN18.2를 지칭한다. 인간 CLDN18.2의 예시적인 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 AAL15637.1에 제시되어 있다.
본원에서 기재되는 바와 같이, 용어 "DLL3"은 델타 유사 3 또는 델타 유사 단백질 3으로도 알려진 델타 유사 표준 노치 리간드 3(DLL3)을 지칭하며, 이는 초기 발생 동안 체절 분절에 요구된다(Dunwoodie et al., Development 129:1795-806 (2002)). 노치 수용체 신호전달을 모두 트랜스로 활성화시키는 포유동물 노치 패밀리 리간드 DLL1, DLL4, JAG1 및 JAG2(Ntziachristos et al., Cancer Cell 25(3):318-34 (2014))와 달리 , DLL3은 골지체에서 주로 국소화되고 노치 신호전달을 활성화시킬 수 없다(Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16 (2011) 및 Geffers et al., J Cell Biol 178(3):465-76 (2007)). 정상 발생 동안, DLL3은 Notch 및 DLL1과 상호작용함으로써 시스-작용 및 트랜스-작용 노치 경로 활성화 모두를 억제한다(Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16(2011)). DLL3은 뇌를 제외한 성인 정상 조직에서 보통 부재하거나 매우 낮은 수준으로 존재하지만, 폐암, 고환암, 신경교종 및 흑색종 샘플에서 과발현된다(Uhlen et al., Science 357(6352): eaan2507 (2017)). 또한, DLL3은 소세포 폐암(SCLC) 및 대세포 신경내분비암종(LCNEC) 종양 세포의 표면에서 검출가능하여(Saunders et al., Sci Transl Med 7(302):302ra136 (2015) 및 Sharma et al., Cancer Res 77(14):3931-41 (2017)), 암 치료요법을 위한 단일 클론 항체의 잠재적 표적이 되게 한다. 따라서, 항-DLL3 단일 클론 항체는 DLL3-발현 종양 세포를 특이적으로 표적화하고 잠재적인 항암 치료제로서 작용하도록 사용될 수 있다. 용어 "인간 DLL3"은 인간에서 기원하는 DLL3을 지칭한다. 인간 DLL3의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_058637.1에 제시되어 있다.
본원에서 기재되는 바와 같은 용어 "CD3"은 T 세포 수용체(TCR)에 대한 보조 수용체로서 기능하는 멀티-서브유닛 단백질 복합체인 분화 클러스터 3(Cluster of Differentiation 3)을 지칭한다(Dong et al., Nature 573(7775):546-552 (2019)). 표적 세포 표면 상의 펩티드-MHC(pMHC)에 대한 TCR의 결합은 TCR-CD3 복합체의 클러스터링을 유도하며 CD3의 ζ 사슬에 의해 매개된 세포내 신호전달을 활성화시킨다(Annu Rev Immunol. 27:591-619 (2009)). CD3은 CAR-T-세포 및 CD3-기반 T 세포 관여자에서와 같이 치료제에 의한 T-세포의 활성화 및 이의 pMHC-독립적 활성화에 요구되며, 종양 세포를 사멸시키기 위해 T 세포를 동원시키는데 매우 효과적이다(Brown and Mackall, Nat Rev Immunol 19(2):73-74 (2019) 및 Clynes and Desjarlais, Annu Rev Med 70:437-450 (2019)). 인간 CD3 엡실론 서브유닛의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_000724.1에 제시되어 있다.
본원에 기재되는 "종양-관련 항원(TAA)"은 정상 조직에서보다 종양에서 더 높은 수준으로 존재하는 임의의 세포 표면 펩티드 및/또는 항원 또는 세포 표면 펩티드 및/또는 항원과 이의 번역후 변형 모이어티 (예컨대 글리코실화)의 조합을 지칭한다. 종양에 특이적으로 존재하는 종양-관련 항원 중 일부는 또한 종양-특이적 항원(TSA)으로 알려져 있다. 종양-관련 항원의 예는 종양원성 바이러스에 의해 인코딩된 바이러스 단백질; 돌연변이된 종양단백질 또는 종양 억제인자; 종양 세포 상에서 및/또는 종양 세포에서 과발현된 정상 단백질; 세포 표면 단백질의 번역후 변형; 발현이 성인 조직이 아닌 발생 단계에서 보통 제한되는 종양태아 단백질; 및 발현이 비필수 조직으로 제한되는 세포 유형 특이적 단백질이다.
본원에서 기재되는 "면역 세포 조절제(ICM)"는 면역 세포의 표면에서 발현되어 면역 세포의 기능을 조절하는 단백질과 같은 임의의 세포 표면 분자를 지칭한다. ICM은 자극 분자 및 억제 분자를 포함한다. 자극 ICM은 특정한 특성을 갖는 특이성 항체 또는 항원-결합 단편이 자극 ICM에 특이적으로 결합할 때 면역 세포의 활성화를 매개할 수 있다. 억제 ICM은 리간드/상호작용 파트너에 의한 결합시 면역 세포의 활성을 억제하며, 이는 면역 세포의 활성화를 유도하는 특정한 특성을 갖는 특이성 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 차단될 수 있다. 이들 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포 또는 면역계의 다른 유형의 세포일 수 있다. ICM의 예는 CD3, CD16, CD27, CD28, CD40, CD122, NKp46, OX40, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, VISTA, SIGLEC7, SIGLEC9, KIR, BTLA, 및 B7-H3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "완전 차단" 또는 "완전 봉쇄"는 표적 항원-결합 도메인(예를 들어, 단일 클론 또는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 결합하는 표적 항원(예를 들어, ICM, 예컨대 CD3)의 완전 억제를 지칭한다. 표적 항원-결합의 완전 억제는 표적 항원-결합 도메인에 표적 항원이 결합하지 않음(예를 들어, 0% 결합)을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "부분 차단" 또는 "부분 봉쇄"는 표적 항원-결합 도메인(예를 들어, 단일 클론 또는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 결합하는 표적 항원(예를 들어, ICM, 예컨대 CD3)의 불완전 억제를 지칭한다. 표적 항원-결합의 불완전 억제는 표적 항원-결합 도메인에 표적 항원이 적어도 일부 결합함(예를 들어, 1% 내지 99% 결합)을 의미한다.
항체 및 이중 특이성 항체
본 발명은 일반적으로 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한 정제를 용이하게 하기 위해 동족 사슬 짝짓기 선호도를 개선하고/하거나 이중 특이성 항체 자체 및 잘못 쌍을 이룬 불순물의 물리적 특성을 변형 및 구별하기 위해 각 아암의 CH1 및 CL 계면에 전하 돌연변이를 포함하는 단리된 이중 특이성 항체에 관한 것이다.
2개의 상이한 중쇄(HC)와 경쇄(LC)로 형성된 이중 특이성 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄가 잘못 짝지어지는 경향이 있어 생성이 어려우며, 이로 인해 제조 공정에서 제거하기 어려운 원치 않는 산물의 생산으로 이어지고; 잘못 짝지움으로 인한 원치 않는 산물이 정제 중에 제거될 수 있는 경우에도, 잘못 짝지움은 의도된 이중 특이성 항체 산물의 생산 효율을 감소시킨다. 하나의 아암 전략(PCT/US2020/063066, 출원일: 2020년 12월 3일, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용됨)에서 "이동된 사슬간 디설파이드 결합"을 전하쌍과 조합하고, 놉-인-홀 및 디설파이드물 결합 형성 시스테인 돌연변이를 Fc 영역에 동시에 도입함으로써, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법을 사용하여 향상된 효율과 정제 용이성으로 이종이량체 이중 특이성 항체를 생산할 수 있다. 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체 및 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 이러한 이중 특이성 항체의 생성은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 공동-발현함으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 전하쌍, 또는 전하쌍의 조합, 또는 제2 아암에 천연 사슬간 디설파이드 결합을 유지하면서 한 아암에 이동된 사슬간 디설파이드 결합을 갖는 전하쌍의 조합을 갖는 단리된 이중 특이성 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 일반적으로 동일한 암 세포에서 발현되는 2개의 항원, 하나는 암 세포에 있고 다른 하나는 가용성 리간드에 있는 2개의 항원, 또는 하나는 암 세포에 있고 다른 하나는 면역 세포와 같은 다른 세포에 있는 2개의 항원에 대한 이중 특이성 항체; 이중 특이성 항체를 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터; 벡터를 포함하는 재조합 세포; 및 이중 특이성 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이중 특이성 항체를 만드는 방법, 및 암을 비롯한 질환을 치료하기 위해 이중 특이성 항체를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 두 항원 모두에 대한 고친화성 결합, 두 항원 모두에 대한 높은 특이성, 이펙터-매개 종양 세포 용해를 유도하는 능력, 하나 또는 2개의 항원을 발현하는 세포에 대한 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 식세포작용(ADPC) 및/또는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 자극하는 능력, 접합된 약물의 모집을 매개하는 능력 및 단독으로 또는 다른 항암 요법과 조합하여 투여했을 때 대상체 및 동물 모델에서 종양 성장을 억제하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 바람직한 기능적 특성을 보유한다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 다중 생물학적 효과를 매개하고 동일한 세포 상의 2개의 상이한 항원에 결합하는 두 아암을 갖는 것일 수 있다. 2개의 아암 중 하나는 대식세포-매개 식세포작용을 유도하기 위해 차단될 수 있는 CD47일 수 있다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 또한 한 아암은 암 세포 상의 항원에 결합하고 다른 아암은 T 세포에 결합하여 T-세포 의존성 암 세포 사멸을 매개하는 T 세포 관여자와 같은 면역 세포 관여자일 수 있다. 이중 특이성 항체의 각각의 아암의 CH1 및 CL 영역에 도입된 반대로 하전된 아미노산은 각각의 중쇄와 이의 상응하는 경쇄(H1L1 및 H2L2)의 정확한 동족 짝지움을 향상시킬 수 있다. 반대로 하전된 쌍(들)은 이중 특이성 항체의 물리적 특성과 생산 공정에서 세포에 의해 발현되는 잠재적인 불순물을 더 잘 구별하여 의도된 이중 특이성 항체의 정제 및 생산을 용이하게 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며 인간, 인간화, 복합 및 키메라 항체, 및 항체 단편(단일 클론 또는 다중클론)을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다. 일반적으로, 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 널리 공지되어 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라 5개의 주요 부류(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 배정될 수 있다. IgA 및 IgG는 동형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로서 추가로 하위분류된다. 따라서, 본 발명의 항체는 5개의 주요 부류 중 어느 하나 또는 상응하는 하위부류의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 척추동물 종의 항체 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 2개의 명확히 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나에 배정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 래트 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 추가로, 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성되는 항원-결합 부위를 함유하며, 이의 각각은 3개의 도메인(즉, 상보성 결정 영역 1-3; CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지칭되며, 중쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지칭된다.
항체 내 아미노산 잔기의 넘버링에 여러 시스템이 사용된다. Kabat 넘버링 방법은 항체의 가변 영역을 기반으로 하는 체계이다(Elvin A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991). EU 넘버링 시스템은 불변 도메인(CH1, 힌지 및 Fc의 부분을 포함함)에 널리 사용된다(Elvin A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, DLL3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 DLL3에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없고; CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD3에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없고; CD3 및 DLL3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체는 CD3 및 DLL3에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없다). 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 본 발명의 단일 클론 항체는 하이브리도마 방법, 파지 디스플레이 기술, 단일 림프구 유전자 클로닝 기술 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일 클론 항체는 인간 중쇄 전이유전자(transgene) 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스 또는 래트와 같은 트랜스제닉 비인간 동물로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예를 들어, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 안정화 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중 특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 안정화 디아바디(ds 디아바디), 단일 사슬 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(이가 디아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 다중 특이성 항체, 카멜화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 이가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하나 완전 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편이 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 Fd 절편을 포함한다. 다른 특정 실시양태에 따르면, 항원-결합 단편은 Fab 및 F(ab')를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일-사슬 항체"는 약 15 내지 약 20개 아미노산의 짧은 펩티드에 의해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 당업계의 통상적인 단일-사슬 항체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일 도메인 항체"는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나 중쇄 가변 영역만을 포함하는 당업계의 통상적인 단일 도메인 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체"는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 만들어진 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 인간에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 이러한 정의는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 항체의 항원-결합 특성이 유지되나 인체 내 이의 항원성이 감소되도록, 인간 항체에 대한 서열 상동성을 증가시키기 위해 변형되는 비-인간 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 종종, 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 한 종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또 다른 종의 포유동물(예를 들어, 인간) 로부터 유래된 항체의 서열에 상응하여, 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 방지한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "다중 특이성 항체"는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 복수의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지고, 복수의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않거나 실질적으로 중첩되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 상이한 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 일 실시양태에서, 다중 특이성 항체는 제3, 제4 또는 제5 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 다중 특이성 항체는 이중 특이성 항체 분자, 삼중 특이성 항체 분자 또는 사중 특이성 항체 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이중 특이성 항체"는 2개 이하의 에피토프 또는 2개의 항원에 결합하는 다중 특이성 항체를 지칭한다. 이중 특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 있다. 일 실시양태에서, 이중 특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 이중 특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 반-항체(half antibody) 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 반-항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 이중 특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "전하쌍"은 하나는 양전하를 갖고 다른 것은 음전하를 갖는 아미노산의 쌍을 지칭하며, 이는 이중 특이성 항체의 제1 아암의 중쇄 CH1 영역 및 경쇄 CL 영역 내의 천연 아미노산 잔기를 각각 대체하여 도입될 수 있고, 동시에, 동일한 양전하 및 음전하 아미노산 쌍은 이중 특이성 항체의 제2 아암의 경쇄 CL 영역 및 중쇄 CH1 영역 내의 천연 아미노산 잔기를 각각 대체하여 도입될 수 있다. 대안적으로, 양전하 및 음전하 아미노산은 이중 특이성 항체의 제1 아암의 중쇄의 VH 영역 및 경쇄의 VL 영역에 대한 아미노산 치환 각각에 의해 도입될 수 있고, 동시에, 동일한 양전하 및 음전하 아미노산 쌍은 제2 아암의 경쇄의 VL 영역 및 중쇄의 VH 영역에 대한 아미노산 치환 각각에 의해 도입될 수 있다. 전하쌍을 형성하는데 사용되는 아미노산은 통상 D/E (음전하) 및 K/R (양전하)을 포함한다. CH1/CL 영역 또는 VH/VL 영역에 도입되고 나면, 전하쌍 아미노산은 구조적으로 매우 근접해 있고, 반대 전하를 통해 동일한 아암의 중쇄/경쇄 상호작용을 향상시키고 동일한 전하를 통해 미스매칭된 중쇄/경쇄 상호작용(미스매칭된 중쇄 및 경쇄는 2개의 상이한 아암로부터 유래함)을 축출할 것으로 예상된다. 도입된 전하쌍의 생성된 전하 분포는 하기와 같다: H1(CH1 양전하)/L1(CL 음전하)/H2(CH1 음전하)/L2(CL 양전하) 또는 H1(CH1 음전하)/L1(CL 양전하)/H2(CH1 양전하)/L2(CL 음전하). 다수의 전하쌍은 조합되고 CH1 및 CL 계면에 도입될 수 있는데, 모든 양전하 아미노산이 CH1에 도입되고 모든 음전하 아미노산이 동일한 아암의 CL에 도입되거나 또는 그 반대여서, 상기 분포 패턴을 만족시킬 수 있다. 유사한 접근방식을 VH/VL 계면에 적용할 수 있다. 또한, 하나 또는 다수의 전하쌍이 또한 CH1/CL 계면에 도입된 하나 또는 다수의 전하쌍과 조합으로 VH 및 VL의 계면에 도입될 수 있다 - 동일한 사슬(H1, L1, H2 또는 L2)에 도입된 아미노산은 통상 동일한 전하를 가지며, 도입된 전하쌍의 생성 분포는 하기와 같다: H1(CH1 및 VH 양전하)/L1(CL 및 VL 음전하)/H2(CH1 및 VH 음전하)/L2(CL 및 VL 양전하) 또는 H1(CH1 및 VH 음전하)/L1(CL 및 VL 양전하)/H2(CH1 및 VH 양전하)/L2(CL 및 VL 음전하). 전하쌍 치환은 또한 동족 사슬 쌍형성 선호도(각각 H1L1 및 H2L2)를 추가로 개선하고/하거나 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 HIC를 사용하여 이중 특이성 항체의 정제를 촉진시키기 위해 다른 변형과 조합될 수 있다. 예를 들어, 전하쌍 치환에 추가로, 이중 특이성 항체의 하나의 아암 상의 천연 사슬간 디설파이드 결합은 이동될 수 있는 한편, 다른 아암은 천연 사슬간 디설파이드 결합을 갖는다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 WO2021/126538 참조).
전하쌍을 기재함에 있어서, G166D/E는 위치 166(EU 넘버링)에서의 G의 D 또는 E로의 치환을 나타내며, 이 경우 G166은 녹-인 부위이고; D170D/E는 위치 170에서의 D의 유지 또는 위치 170에서의 D의 E로의 치환을 나타내고; 모든 다른 치환은 동일한 명명 규칙을 따른다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD3, DLL3 및 이들의 조합에 특이적으로 결합하는" 또는 "CD47, CLDN18.2 및 이들의 조합에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 1×10-9 M 이하, 5×10-10 M 이하, 또는 1×10-10 M 이하의 KD로, CD47, CLDN18.2 및 이들의 조합, 바람직하게는 인간 CD3, 인간 DLL3, 인간 CD47, 인간 CLDN18.2 및 이들의 조합에 결합하는 항체를 지칭한다. 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고, 이는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 수득되며 몰 농도(M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 본 개시내용을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 사용하거나, 생체층 간섭계 기술, 예컨대 Octet RED96 시스템을 사용하여 결정될 수 있다.
항체의 KD 값이 작을수록, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화성이 높아진다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "특이적 결합"은 대조군 항원과 비교하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 유의한 결합, 및/또는 대조군 항체 또는 항원-결합 단편과 비교하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 유의한 결합을 지칭하며, 여기서 대조군 항원은 서열 및/또는 구조 비교에 의해 표적 항원과 상이하고, 대조군 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 및/또는 구조 비교에 의해 표적 항원과 상이한 이의 상응하는 항원에만 유의하고 선택적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "EC50"은 본 발명의 단일 클론 또는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 최대 유효 농도의 절반을 의미한다. EC50은 지정된 노출 시간에 걸쳐 기준선과 최대값 사이의 중간 지점에서 생물학적 반응(즉, 세포 사멸)을 유도하기 위한 단일 클론 또는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 단일 클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1 μM 미만, 약 1000 nm 내지 약 100 nM, 약 100 nm 내지 약 10 nM, 약 10 nm 내지 약 1 nM, 약 1000 pM 내지 약 500 pM, 약 500 pM 내지 약 200 pM, less than 약 200 pM, 약 200 pM 내지 약 150 pM, 약 200 pM 내지 약 100 pM, 약 100 pM 내지 약 10 pM, 또는 약 10 pM 내지 약 1 pM의 EC50을 갖는다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로서,
a. 제1 중쇄, H1;
b. 제2 중쇄 H2;
c. 제1 경쇄, L1; 및
d. 제2 경쇄, L2를 포함하고;
여기서 H1 및 L1은 제1 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 아암을 형성하고,
H2 및 L2는 제2 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 아암을 형성하며, 여기서
(a) H1 및 H2는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 영역을 포함하고;
(b) L1 및 L2는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 영역을 포함하며;
여기서 H1L1 및 H2L2는 각각 다음 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전하쌍을 포함한다:
(1) 각각 H1의 CH1에 G166D/E 및 L1의 CL에 S114K/R, 및 각각 H2의 CH1에 G166K/R 및 L2의 CL에 S114D/E;
(2) 각각 H1의 CH1에 T187D/E 및 L1의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H2의 CH1에 T187K/R 및 L2의 CL에 D/N170D/E;
(3) 각각 H1의 CH1에 S131D/E 및 L1의 CL에 P119K/R, 및 각각 H2의 CH1에 S131K/R 및 L2의 CL에 P119D/E;
(4) 각각 H1의 CH1에 A129D/E 및 L1의 CL에 S121K/R, 및 각각 H2의 CH1에 A129K/R 및 L2의 CL에 S121D/E;
(5) 각각 H2의 CH1에 G166D/E 및 L2의 CL에 S114K/R, 및 각각 H1의 CH1에 G166K/R 및 L1의 CL에 S114D/E;
(6) 각각 H2의 CH1에 T187D/E 및 L2의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H1의 CH1에 T187K/R 및 L1의 CL에 D/N170D/E;
(7) 각각 H2의 CH1에 S131D/E 및 L2의 CL에 P119K/R, 및 각각 H1의 CH1에 S131K/R 및 L1의 CL에 P119D/E; 또는
(8) 각각 H2의 CH1에 A129D/E 및 L2의 CL에 S121K/R, 각각 H1의 CH1에 A129K/R 및 L1의 CL에 S121D/E.
특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 VH 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 CH1 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 VL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 CL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 특정 측면에서, H1 및 H2는 헤테로이량체를 형성한다.
또 다른 특정 측면에서, (a) 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E)은 H1의 CH1에서 G166, T187, S131, 또는 A129에 도입되고(상기 설명한 바와 같이 양전하를 띤 아미노산이 L1의 CL에서 상응하는 위치에 도입됨), 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R)은 H2의 CH1에서 상응하는 잔기에 도입되고(상기 설명한 바와 같이 음전하를 띤 아미노산이 L2의 CL에서 상응하는 위치에 도입됨), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖거나; 또는 (b) 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R)이 H1의 CH1에서 G166, T187, S131 또는 A129에 도입되고(상기 설명한 바와 같이 음전하를 띤 아미노산이 L1의 CL에서 상응하는 위치에 도입됨) 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E)이 H2의 CH1에서 상응하는 잔기에 도입되고(상기 설명한 바와 같이 양전하를 띤 아미노산이 L2의 CL에 상응하는 위치에 도입됨), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖는다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CH1에 대해 서열 번호 17, 18, 19, 또는 20 및 CL에 대해 서열 번호 21 또는 22의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 두 아암 중 하나의 CH1 및 CL 영역을 포함하고, 여기서 CH1 및 CL 영역의 아미노산 치환은 다음 중에서 선택되며:
i. CH1의 K133C 및 C220X, CL의 F209C 및 C214X;
ii. CH1의 R133C 및 C131X, CL의 F209C 및 C214X;
iii. CH1의 R133C 및 C131X, CL의 V209C 및 C214X; 또는
iv. CH1의 K133C 및 C220X, CL의 V209C 및 C214X;
여기서 X는 S, A 또는 G로부터 선택된다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD47 항체 또는 항원-결합 단편 아암 및 항-TAA 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하며, 여기서 CD47 및 TAA는 동일한 세포 상에서 발현되고, CD47 및 TAA 모두, 바람직하게는 인간 CD47 및 TAA 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함할 수 있다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 CD47, 바람직하게는 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및 클라우딘 18.2(CLDN18.2), 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 특정 측면에서, 항-CD47 항원-결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 29;
(2) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 29;
(3) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 30;
(4) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 30;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 33;
(6) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 33;
(7) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 34;
(8) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 34;
(9) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 37;
(10) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 37;
(11) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 38;
(12) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 38;
(13) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 41;
(14) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 41;
(15) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 42;
(16) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 42;
(17) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 45;
(18) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 45;
(19) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 46;
(20) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 46;
(21) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 49;
(22) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 49;
(23) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 50;
(24) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 50;
(25) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 53;
(26) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 53;
(27) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 54;
(28) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 54;
(29) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 57;
(30) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 57;
(31) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 58;
(32) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 58;
(33) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 29;
(34) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29;
(35) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 30;
(36) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 30;
(37) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 33;
(38) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 33;
(39) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 34;
(40) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 34;
(41) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 37;
(42) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 37;
(43) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 38;
(44) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 38;
(45) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 41;
(46) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 41;
(47) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 42;
(48) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 42;
(49) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 45;
(50) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 45;
(51) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 46;
(52) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 46;
(53) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 49;
(54) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 49;
(55) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 50;
(56) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 50;
(57) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 53;
(58) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 53;
(59) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 54;
(60) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 54;
(61) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 57;
(62) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 57;
(63) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 58; 또는
(64) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 58.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체이며, 여기서 제1 항원-결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하며, 이들은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 28, 2, 29, 3, 63, 4 및 64;
(2) 각각 서열 번호 1, 36, 2, 37, 3, 67, 4 및 68;
(3) 각각 서열 번호 1, 44, 2, 45, 3, 71, 4 및 72;
(4) 각각 서열 번호 1, 52, 2, 53, 3, 73, 4 및 74;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2, 34, 3, 65, 4 및 66;
(6) 각각 서열 번호 1, 39, 2, 42, 3, 69, 4 및 70;
(7) 각각 서열 번호 1, 47, 2, 50, 3, 75, 4 및 76;
(8) 각각 서열 번호 1, 55, 2, 58, 3, 77, 4 및 78;
(9) 각각 서열 번호 23, 28, 24, 29, 59, 63, 60 및 64;
(10) 각각 서열 번호 23, 36, 24, 37, 59, 67, 60 및 68;
(11) 각각 서열 번호 23, 44, 24, 45, 59, 71, 60 및 72;
(12) 각각 서열 번호 23, 52, 24, 53, 59, 73, 60 및 74;
(13) 각각 서열 번호 25, 31, 26, 34, 61, 65, 62 및 66;
(14) 각각 서열 번호 25, 39, 26, 42, 61, 69, 62 및 70;
(15) 각각 서열 번호 25, 47, 26, 50, 61, 75, 62 및 76; 또는
(16) 각각 서열 번호 25, 55, 26, 58, 61, 77, 62 및 78.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-면역 세포 조절자(ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하고 ICM, 바람직하게는 인간 ICM에 특이적으로 결합할 수 있다. ICM은 예를 들어 CD3, CD16, CD27, CD28, CD40, CD122, NKp46, OX40, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, VISTA, SIGLEC7, SIGLEC9, KIR, BTLA, B7-H3 및 기타 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 특정 측면에서, 항-ICM 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함할 수 있다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 실시양태에서, 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 DLL3-발현 암 세포를 T 세포와 결합시킬 수 있고 암세포의 T 세포-매개 사멸을 활성화할 수 있다. 또 다른 특정 측면에서, 제1 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 13, 14, 15 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함한다.
본 발명의 전장 이중 특이성 항체는 예를 들어, 동시발현을 사용하거나 시험관내 무세포 환경에서 별개 특이성을 갖는 2개 항체 절반 분자의 헤테로이량체 형성에 호의적이도록 각 절반 분자에서 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입시킴으로써 2개 단일 특이적 2가 항체들 사이에서 Fab 아암 교환 (또는 절반 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있다. Fab 아암 교환 반응은 CH3 도메인의 해리-결합 및 디설파이드-결합 이성질체화 반응의 결과이다. 모(parent) 단일 특이성 항체의 힌지 부위에서 중쇄 디설파이드 결합이 환원된다. 모 단일특이성 항체 중 하나의 생성 유리 시스테인은 제2의 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 디설파이드 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인은 해리-결합에 의해 방출되고 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 호모이량체화에 비해서 헤테로이량체화에 선호하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은 별개의 에피토프, 즉 CD3 상의 에피토프, DLL3 상의 에피토프 및 이들의 조합, 또는 CD47 상의 에피토프, CLDN18.2 상의 에피토프, 및 이들의 조합에 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 절반 분자를 갖는 이중 특이성 항체이다.
본원에서 사용되는 "호모이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "호모이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "헤테로이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "헤테로이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"놉-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, PCT 공개 번호 WO2006/028936 참조)을 사용하여 전장 이중 특이성 항체를 생성할 수 있다. 간략하게, 인간 IgG에서의 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산은 헤테로이량체 형성을 촉진하도록 CH3 도메인 상호작용에 영향을 미치는 위치에서 돌연변이될 수 있다. 소형 측쇄(홀)를 갖는 아미노산은 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄에 도입되고, 대형 측쇄(놉)를 갖는 아미노산은 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄에 도입된다. 2개 항체의 동시발현 후, 헤테로이량체는 "홀"을 갖는 중쇄와 "놉"을 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 형성된다. 놉 및 홀을 형성하는 예시적 CH3 치환 쌍은 (제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내 변형된 위치로 표시): T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V이다.
US 특허 공개 번호 US2010/0015133; US 특허 공개 번호 US2009/0182127; US 특허 공개 번호 US2010/028637; 또는 US 특허 공개 번호 US2011/0123532에서 기재된 바와 같이, 하나의 CH3 표면에서 양전하를 띤 잔기 및 제2의 CH3 표면에서 음전하를 띤 잔기를 치환함으로써 정전기적 상호작용을 사용하여 중쇄 헤테로이량체화를 촉진시키는 것과 같은 다른 전략을 사용할 수 있다. 다른 전략에서, 헤테로이량체화는 하기 치환에 의해 촉진될 수 있다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내 변형된 위치로 표시): 미국 특허 공개 번호 US2012/0149876 또는 미국 특허 공개 번호 US2013/0195849에서 기재된 바와 같은 L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
상기 기재된 방법에 추가로, 본 발명의 이중 특이성 항체는 PCT 특허 공개 번호 WO2011/131746에 기재된 방법에 따라, 2개 단일 특이적 호모이량체 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입하고 환원 조건에서 2개 모 단일 특이성 호모이량체 항체로부터 이중 특이성 헤테로이량체 항체를 형성시켜 디설파이드 결합 이성질체화를 허용시킴으로써 시험관내 무세포 환경에서 생성될 수 있다. 방법에서, 제1 단일특이적 2가 항체 및 제2 단일특이적 2가 항체는 헤테로이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에 특정 치환을 갖도록 조작되고; 항체는 힌지 영역 내 시스테인이 디설파이드 결합 이성질체화를 거치도록 하기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그로써 Fab 아암 교환에 의해 이중 특이성 항체가 생성된다. 인큐베이션 조건은 임의로는 비-환원 조건으로 복원될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적 환원제는 2-머캅토에틸아민(2-MEA), 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-머캅토에탄올이고, 바람직하게는 환원제는 2-머캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카복시에틸) 포스핀으로 이루어지는 군에서 선택된다. 예를 들어, 적어도 90분 동안 적어도 20℃의 온도에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하 또는 적어도 0.5 mM 디티오트레이톨의 존재 하, pH 5-8, 예를 들어 pH 7.0 또는 pH 7.4에서의 인큐베이션을 사용할 수 있다.
본 발명의 전장 이중 특이성 항체는 상기 헤테로이량체화 접근법 및 하기와 같은 여러 접근법의 조합을 사용하여 생성될 수 있다: (a) 이중 특이성 항체의 하나의 아암 상의 HC/LC 사슬간 디설파이드 결합을 이동시킴(예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 WO2021/126538 참조); (b) VH/VL 계면에 전하쌍을 도입시킴; (c) CH1/CL 계면에 전하쌍을 도입시킴; 또는 (d) (a)-(c)에 기재된 일부 또는 모든 접근법의 조합.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 단백질의 코딩 서열이 변화(예를 들어, 대체, 결실, 삽입 등) 될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 당업자는 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열이 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 개시내용을 고려하여 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은, 당업자에게 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 발현 벡터이다. 벡터는 발현 벡터의 종래의 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 요소, 종결요소, 인핸서, 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 핵산을 세포에 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조를 위해 본원에서 사용될 수 있다. 종래의 클로닝 기법 또는 인공 유전자 합성을 사용하여 본 발명의 실시양태에 따른 재조합 발현 벡터를 생성할 수 있다. 이러한 기법은 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 잘 공지되어 있다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포가 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균(E. coli) TG1 또는 BL21 세포(예를 들어, scFv 또는 Fab 항체의 발현을 위함), CHO-DG44 또는 CHO-K1 세포 또는 HEK293 세포(예를 들어, 전장 IgG 항체의 발현을 위함)이다. 특정 실시양태에 따르면, 재조합 발현 벡터는 화학적 형질감염, 열 충격 또는 전기천공법과 같은 종래의 방법에 의해 숙주 세포에 형질전환되는데, 재조합 핵산이 효과적으로 발현되도록 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 조건 하에 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고, 세포 또는 세포 배양물(예를 들어, 상청액)로부터 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다. 발현된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 종래의 기법에 따라 및 본원에 기재된 바와 같이 세포로부터 수확 및 정제될 수 있다.
약학 조성물
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약학 조성물"은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명의 항체를 포함하는 생성물을 의미한다. 본 발명의 항체 및 이를 포함하는 조성물은 또한 본원에 언급된 치료 적용을 위한 약제의 제조에 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소포, 미소구체, 리포솜 캡슐화, 또는 약학 제형에서의 사용을 위해 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 지칭한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특성이 특정 적용을 위한 투여 경로에 의존적일 것임이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 효과 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비-독성 물질을 지칭한다. 특정 실시양태에 따르면, 본 개시내용을 고려하여, 항체 약학 조성물에서 사용하기에 적합한 임의의 약학적으로 허용되는 담체가 본 발명에서 사용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체와의 약학적 활성 성분의 제형화는 당업계에, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy(예를 들어, 21 판(2005), 및 임의의 이후 판)에 공지되어 있다. 추가적 성분의 비-제한적 예는 완충제, 희석제, 용매, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제 및 킬레이트제를 포함한다. 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체가 본 발명의 약학 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 약학 조성물은 액체 제형이다. 액체 제형의 바람직한 예는 수성 제형, 즉 물을 포함하는 제형이다. 액체 제형은 용액, 현탁액, 에멀전, 마이크로에멀전, 겔 등을 포함할 수 있다. 수성 제형은 전형적으로 적어도 50% w/w의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 적어도 95% w/w의 물을 포함한다.
일 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들어 주사 장치(예를 들어, 주사기 또는 주입 펌프)를 통해 주사될 수 있는, 주사형으로서 제형화될 수 있다. 주사는 예를 들어 피하, 근육내, 복강내, 유리체강내 또는 정맥내로 전달될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 고체 제형, 예를 들어, 동결 건조 또는 분무 건조된 조성물이며, 그대로 사용되거나, 의사 또는 환자가 사용 전에 이에 용매 및/또는 희석제를 첨가하여 사용될 수 있다. 고체 투약 형태는 정제, 예컨대 압축 정제 및/또는 코팅 정제, 및 캡슐(예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐)을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 예를 들어 향낭, 드라기제, 분말, 과립, 로젠지, 또는 재구성용 분말의 형태일 수 있다.
투약 형태는 수용성 또는 수분산성 담체를 포함할 수 있는 경우인 즉시 방출형일 수 있거나, 위장관 또는 피부 아래에서의 투약 형태의 용해 속도를 조절하는 수불용성 중합체를 포함할 수 있는 경우 지연 방출, 지속 방출 또는 변형 방출일 수 있다.
다른 실시양태에서, 약학 조성물은 비강내, 협내 또는 설하로 전달될 수 있다.
수성 제형 중의 pH는 pH 3 내지 pH 10 일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 제형의 pH는 약 7.0 내지 약 9.5이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형의 pH는 약 3.0 내지 약 7.0이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 완충제를 포함한다. 완충제의 비제한적인 예는 아르기닌, 아스파르트산, 비신, 시트레이트, 인산수소이나트륨, 푸마르산, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 리신, 말레산, 말산, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 인산이수소나트륨, 인산나트륨, 숙시네이트, 타르타르산, 트리신 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 완충제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 완충제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제의 비제한적인 예는 벤즈에토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 브로노폴, 부틸 4-하이드록시벤조에이트, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로헥시딘, 클로르페네신, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 에틸 4-하이드록시벤조에이트, 이미드우레아, 메틸 4-하이드록시벤조에이트, 페놀, 2-페녹시에탄올, 2-페닐에탄올, 프로필 4-하이드록시벤조에이트, 소듐 데하이드로아세테이트, 티오메로살, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 보존제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 보존제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 등장화제를 포함한다. 등장화제의 비제한적인 예는 염(예컨대 염화나트륨), 아미노산(예컨대 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 및 트레오닌), 알디톨(예컨대 글리세롤, 1,2-프로판디올 프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 및 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG400), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 등장화제의 또 다른 예는 당을 포함한다. 당의 비제한적인 예는 단당류, 이당류 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸, 예를 들어 프룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로스, 트레할로오스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 알파 및 베타-HPCD, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 소듐 카복시메틸셀룰로오스일 수 있다. 등장화제의 또 다른 예는 당 알코올이며, 여기서 용어 "당 알코올"은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C(4-8) 탄화수소로서 정의된다. 당 알코올의 비제한적인 예는 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 본 단락에 기술된 등장화제 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다. 등장화제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 등장화제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제의 비제한적인 예는 시트르산, 아스파르트산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 염, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 킬레이트제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 킬레이트제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비제한적인 예는 하나 이상의 응집 억제제, 하나 이상의 산화 억제제, 하나 이상의 계면활성제 및/또는 하나 이상의 프로테아제 억제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 안정화제를 포함하는데, 여기서 상기 안정화제는 카복시-/하이드록시셀룰로오스 및 이의 유도체(예컨대 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 사이클로덱스트린, 2-메틸티오에탄올, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어 PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 피롤리돈, 염(예를 들어 염화나트륨), 황-함유 물질 예컨대 모노티오글리세롤, 또는 티오글리콜산이다. 안정화제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 안정화제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 바람직하게는 계면활성제, 적어도 하나의 계면활성제, 또는 2개의 상이한 계면활성제를 포함한다. 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분 및 지용성(친유성) 부분으로 구성되는 임의의 분자 또는 이온을 지칭한다. 계면활성제는 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및/또는 양쪽이온성 계면활성제로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 계면활성제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 계면활성제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 프로테아제 억제제, 예를 들어, EDTA, 및/또는 벤자미딘 염산(HCl)을 포함한다. 프로테아제 억제제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 프로테아제 억제제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 실시양태를 구성한다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함하는, 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
사용 방법
일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-TAA/항-CD47 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 세포의 대식세포-매개 식세포작용을 활성화함으로써 상기 대상체의 암 세포 표면 상에서 둘 다 발현되는 CD47 및 TAA(예컨대 CLDN18.2)를 표적화하는 방법에 관한 것이다.
일반적인 측면에서, 본 발명은 T 세포와 결부됨으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현되는 DLL3을 표적화하는 방법에 관한 것이며; 이 방법은 본 발명의 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
표적 항원(예를 들어, CD3과 같은 ICM)에 결합하는 단일 클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 TAA(예를 들어, DLL3) 및 T 세포 표적 항원(예를 들어, CD3과 같은 ICM) 둘 모두에 결합하거나 동일한 세포 상의 TAA 및 CD47 모두에 결합하는 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 활성은 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법에 의해 특성화될 수 있다. TAA(예를 들어, DLL3) 및 T 세포 표적 항원(예를 들어, CD3) 모두에 결합하는 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특성화하는 방법에는 세포 결합 기반 가교 분석 또는 T 세포 활성화 분석 및 Biacore, ELISA, FACS 및 OctetRed 분석을 포함한 친화성 및 특이성 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 동일한 세포 상의 TAA(예를 들어, CLDN18.2) 및 CD47 모두에 결합하는 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특성화하는 방법에는 Biacore, ELISA, FACS 및 OctetRed 분석을 포함하는 친화도 및 특이성 분석이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에 따르면, DLL3 및 CD3 모두에 결합하는 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특성화하는 방법은 하기 기재된 것을 포함한다. ICM에 결합하는 단일 클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CD3 외에 ICM 및 TAA(예를 들어, DLL3) 둘 모두에 결합하는 이중 특이성 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 활성은 상기의 것들과 유사한 방법에 의해 특성화할 수 있다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, CD3-매개 T 세포 활성화를 사용하는 것을 포함하여 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현된 1개 또는 2개의 항원을 표적화하는 방법 및/또는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 선택적으로 암은 폐암, 위암, 식도암, 담관암(bile duct cancer), 담도암종(cholangiocarcinoma0, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 기타 액형 종양에서 선택된다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고 상기 세포 또는 배양물로부터 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 단리된 인간화 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 본 발명의 항-CD47/항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체, 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 암은 임의의 액형 또는 고형 암일 수 있으며, 예를 들어 폐암, 위암, 식도암, 담도암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 기타 액형 종양으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 약학 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항-CD47/항-CLDN18.2 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 활성 요소 또는 성분의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 명시된 목적과 관련하여 경험적으로 및 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 항-CD47/항-CLDN18.2 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 치료적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 항-CD47/항-CLDN18.2 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 의미한다. 또한 항-CD47/항-CLDN18.2 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 치료적 유효량은 질환, 장애 또는 상태의 치료를 초래하고; 질환, 장애 또는 상태의 진행을 방지 또는 늦추거나; 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상을 감소시키거나 완전히 경감시키는 항-CD47/항-CLDN18.2 또는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 의미한다.
특정 실시양태에 따르면, 치료될 질환, 장애 또는 병태는 암, 바람직하게는 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담도암종, 결장암, 간세포 암종, 신장 세포 암종, 방광 요로상피암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML), 및 기타 액형 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는 암이다. 다른 특정 실시양태에 따르면, 치료될 질환, 장애 또는 병태는 염증성 질환, 대사 질환, 또는 이중 특이성 항체가 치료법으로 사용될 수 있는 임의의 다른 질환이다.
특정 실시양태에 따르면, 치료적 유효량은 하기 효과 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 치료요법의 양을 지칭한다: (i) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나 완화시킴; (ii) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 지속기간을 감소시킴; (iii) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 진행을 방지함; (iv) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 퇴행을 유발함; (v) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 발전 또는 발병을 방지함; (vi) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상의 재발을 방지함; (vii) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 입원을 감소시킴; (viii) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 입원 길이를 감소시킴; (ix) 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 생존을 증가시킴; (xi) 대상체에서 치료할 질환, 장애 또는 상태, 또는 이와 연관된 증상을 억제 또는 감소시킴; 및/또는 (xii) 또 다른 치료요법의 예방 또는 치료 효과(들)를 향상 또는 개선시킴.
치료적 유효량 또는 투약량은 치료할 질환, 장애 또는 상태, 투여 수단, 표적 위치, 대상체의 생리학적 상태(예를 들어, 연령, 체중, 건강 포함), 대상체가 인간 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방 또는 치료인지 여부와 같은 다양한 인자에 따라 가변적일 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 치료 투약량을 최적으로 적정한다.
특정 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물은 대상체에 대해 의도된 투여 경로에 적합한 것으로 제형화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 정맥내, 피하 또는 근육내 투여에 적합한 것으로 제형화될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 모두 암과 관련된 적어도 하나의 측정가능한 물리적 매개변수의 개선 또는 반전을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 대상체에서 반드시 식별가능한 것은 아니지만 대상체에서 식별될 수 있다. 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 또한, 퇴행을 일으키거나, 진행을 예방하거나, 적어도 질환, 장애 또는 상태의 진행을 늦추는 것을 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, "치료", "치료하는" 및 "치료"는 종양 또는 보다 바람직하게는 암과 같은 질환, 장애 또는 상태와 연관된 하나 이상의 증상의 경감, 발생 또는 발병의 예방, 또는 지속기간의 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환, 장애 또는 상태의 재발의 예방을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체의 생존 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체에서의 질환, 장애 또는 상태의 제거를 지칭한다.
특정 실시양태에 따르면, 암 치료에 사용되는 조성물이 제공된다. 암 치료요법을 위해, 조성물은 화학요법, 항-TIM-3 mAb, 항-LAG-3 mAb, 항-CD73 mAb, 항-아펠린 mAb, 항-CTLA-4 항체, 항-EGFR mAb, 항-HER-2 mAb, 항-CD19 mAb, 항-CD20 mAb, 항-CD33 mAb, 항-TIP-1 mAb, 항-CLDN18.2 mAb, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, PD-1/PD-L1 치료요법, 다른 면역항암 약물, 항혈관신생제, 방사선 요법, 항체-약물 접합체(ADC), 표적 치료요법, 또는 기타 항암 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 치료와 조합으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 2 이상의 치료요법을 투여하는 맥락에서 용어 "조합으로"는 하나 초과의 치료요법의 사용을 지칭한다. 용어 "조합으로"의 사용은 치료요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제1 치료요법(예를 들어, 본원에 기재된 조성물)은 제2 치료요법을 대상체에게 투여하기 전(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전), 제2 치료요법을 대상체에게 투여하는 것과 동시에, 또는 제2 치료요법을 대상체에게 투여한 후(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후)에 투여될 수 있다.
실시양태
본 발명은 또한 다음의 비제한적 실시양태를 제공한다.
실시양태 1은 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 제1 중쇄, H1;
b. 제2 중쇄 H2;
c. 제1 경쇄, L1; 및
d. 제2 경쇄, L2를 포함하고;
여기서 H1 및 L1은 제1 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 아암을 형성하고,
H2 및 L2는 제2 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 아암을 형성하며, 여기서
(a) H1 및 H2는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 영역을 포함하고;
(b) L1 및 L2는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 영역을 포함하며;
여기서 H1L1 및 H2L2는 각각 다음 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전하쌍을 포함한다:
(1) 각각 H1의 CH1에 G166D/E 및 L1의 CL에 S114K/R, 및 각각 H2의 CH1에 G166K/R 및 L2의 CL에 S114D/E;
(2) 각각 H1의 CH1에 T187D/E 및 L1의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H2의 CH1에 T187K/R 및 L2의 CL에 D/N170D/E;
(3) 각각 H1의 CH1에 S131D/E 및 L1의 CL에 P119K/R, 및 각각 H2의 CH1에 S131K/R 및 L2의 CL에 P119D/E;
(4) 각각 H1의 CH1에 A129D/E 및 L1의 CL에 S121K/R, 및 각각 H2의 CH1에 A129K/R 및 L2의 CL에 S121D/E;
(5) 각각 H2의 CH1에 G166D/E 및 L2의 CL에 S114K/R, 및 각각 H1의 CH1에 G166K/R 및 L1의 CL에 S114D/E;
(6) 각각 H2의 CH1에 T187D/E 및 L2의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H1의 CH1에 T187K/R 및 L1의 CL에 D/N170D/E;
(7) 각각 H2의 CH1에 S131D/E 및 L2의 CL에 P119K/R, 및 각각 H1의 CH1에 S131K/R 및 L1의 CL에 P119D/E; 또는
(8) 각각 H2의 CH1에 A129D/E 및 L2의 CL에 S121K/R, 각각 H1의 CH1에 A129K/R 및 L1의 CL에 S121D/E.
실시양태 2는 실시양태 1의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서
(a) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 VH 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
(b) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 CH1 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
(c) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
(d) 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하며, 여기서 VL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고/거나;
(e) 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하며, 여기서 CL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
실시양태 3은 실시양태 2의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 H1 및 H2는 헤테로이량체를 형성한다.
실시양태 4는 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) H1의 CH1에 G166, T187, S131 또는 A129에서 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖거나;
(b) H1의 CH1에 G166, T187, S131 또는 A129에서 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R), H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖는다.
실시양태 5는 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 두 아암 중 하나의 CH1 및 CL 영역은 CH1에 대한 서열 번호 17, 18, 19 또는 20 및 CL에 대한 서열 번호 21 또는 22의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하고; 여기서 CH1 및 CL 영역에서의 아미노산 치환은
(1) CH1의 K133C 및 C220X, 및 CL의 F209C 및 C214X;
(2) CH1의 R133C 및 C131X, 및 CL의 F209C 및 C214X;
(3) CH1의 R133C 및 C131X, 및 CL의 V209C 및 C214X; 또는
(4) CH1의 K133C 및 C220X, 및 CL의 V209C 및 C214X로부터 선택되며;
여기서 X는 S, A 또는 G 중에서 선택된다.
실시양태 6은 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 CD47, 바람직하게는 인간 CD47에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD47과 동일한 세포 상에 발현된 TAA, 바람직하게는 인간 TAA에 특이적으로 결합한다.
실시양태 7은 실시양태 6의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제2 항원 결합 도메인은 CD47과 동일한 세포 상에서 발현된 CLDN18.2, 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다.
실시양태 8은 실시양태 6 또는 7의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항-CD47 항원 결합 도메인은 다음의 아미노산을 포함하는 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 29;
(2) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 29;
(3) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 30;
(4) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 30;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 33;
(6) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 33;
(7) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 34;
(8) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 34;
(9) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 37;
(10) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 37;
(11) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 38;
(12) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 38;
(13) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 41;
(14) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 41;
(15) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 42;
(16) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 42;
(17) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 45;
(18) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 45;
(19) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 46;
(20) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 46;
(21) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 49;
(22) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 49;
(23) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 50;
(24) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 50;
(25) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 53;
(26) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 53;
(27) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 54;
(28) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 54;
(29) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 57;
(30) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 57;
(31) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 58;
(32) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 58;
(33) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 29;
(34) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29;
(35) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 30;
(36) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 30;
(37) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 33;
(38) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 33;
(39) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 34;
(40) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 34;
(41) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 37;
(42) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 37;
(43) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 38;
(44) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 38;
(45) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 41;
(46) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 41;
(47) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 42;
(48) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 42;
(49) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 45;
(50) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 45;
(51) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 46;
(52) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 46;
(53) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 49;
(54) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 49;
(55) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 50;
(56) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 50;
(57) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 53;
(58) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 53;
(59) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 54;
(60) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 54;
(61) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 57;
(62) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 57;
(63) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 58; 또는
(64) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 58.
실시양태 9는 실시양태 8의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함하며 이들은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
(1) 각각 서열 번호 1, 28, 2, 29, 3, 63, 4 및 64;
(2) 각각 서열 번호 1, 36, 2, 37, 3, 67, 4 및 68;
(3) 각각 서열 번호 1, 44, 2, 45, 3, 71, 4 및 72;
(4) 각각 서열 번호 1, 52, 2, 53, 3, 73, 4 및 74;
(5) 각각 서열 번호 1, 31, 2, 34, 3, 65, 4 및 66;
(6) 각각 서열 번호 1, 39, 2, 42, 3, 69, 4 및 70;
(7) 각각 서열 번호 1, 47, 2, 50, 3, 75, 4 및 76;
(8) 각각 서열 번호 1, 55, 2, 58, 3, 77, 4 및 78;
(9) 각각 서열 번호 23, 28, 24, 29, 59, 63, 60 및 64;
(10) 각각 서열 번호 23, 36, 24, 37, 59, 67, 60 및 68;
(11) 각각 서열 번호 23, 44, 24, 45, 59, 71, 60 및 72;
(12) 각각 서열 번호 23, 52, 24, 53, 59, 73, 60 및 74;
(13) 각각 서열 번호 25, 31, 26, 34, 61, 65, 62 및 66;
(14) 각각 서열 번호 25, 39, 26, 42, 61, 69, 62 및 70;
(15) 각각 서열 번호 25, 47, 26, 50, 61, 75, 62 및 76; 또는
(16) 각각 서열 번호 25, 55, 26, 58, 61, 77, 62 및 78.
실시양태 10은 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항면역 세포 조절자(ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하고 ICM에 특이적으로 결합할 수 있다.
실시양태 11은 실시양태 10의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 ICM은 CD3, CD16, CD27, CD28, CD40, CD122, NKp46, OX40, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, VISTA, SIGLEC7, SIGLEC9, KIR, BTLA, B7-H3, 및 기타 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 12는 실시양태 1 내지 5 및 10 내지 11 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고, 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함한다.
실시양태 13은 실시양태 1 내지 5 및 10 내지 12 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 특이적으로 결합한다.
실시양태 14는 실시양태 13의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 각각 서열 번호 13, 14, 15 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함한다.
실시양태 15는 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이다.
실시양태 16은 실시양태 15의 단리된 핵산을 포함하는 벡터이다.
실시양태 17은 실시양태 16의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
실시양태 18은 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이다.
실시양태 19는 실시양태 18의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포를 관여시킴으로써 상기 대상체에서 암세포 표면 상에 발현되는 DLL3을 표적화하는 방법이다.
실시양태 20은 대식세포 매개 식세포작용의 CD47 차단 유도 활성화 또는 CD3-매개 T 세포 활성화를 사용하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현된 1개 또는 2개의 항원을 표적화하는 방법 및/또는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 선택적으로 암은 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담도암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 기타 액형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 21은 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하기 위한 조건 하에서 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고, 세포 또는 배양물로부터 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 로부터 회수하는 단계를 포함한다.
실시양태 22는 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약학 조성물을 얻는 단계를 포함한다.
실시예
실시예 1: 전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체의 작제
도 1은 놉-인-홀 및 전하쌍과 같은 일반적인 접근법으로 촉진될 수 있는, H1H2의 헤테로이량체에 2개의 상이한 중쇄(H1 및 H2) 및 2개의 상이한 경쇄(L1 및 L2)를 갖는 이중 특이성 항체(bsAb)를 예시한다. 반대로 하전된 아미노산은 이중 특이성 항체의 각 아암의 CH1 및 CL 영역에 도입되어 각각의 중쇄와 이의 상응하는 경쇄(H1L1 및 H2L2)의 정확한 동족 쌍이룸을 향상시킬 수 있다. 반대로 하전된 쌍(들)은 bsAb의 물리적 특성과 생산 공정에서 세포에 의해 발현되는 잠재적인 불순물을 더 잘 구별할 수 있어, 크로마토그래피에서 의도한 bsAb를 불순물로부터 분리하여 의도한 bsAb의 정제 및 생산을 용이하게 할 수 있고, 일반적인 mAb 제조 플랫폼(전형적으로 단백질 A 친화성, 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계 포함)을 사용하여 이중 특이성 항체의 제조를 가능케 할 수 있다. 하기 실시예는 인간 IgG1 중쇄 CH1 및 카파 경쇄 CL 서열에서의 이중 특이성 항체와 함께 제시된다(도 2A-2B 및 표 5). 이러한 개념은 또한 보존된 녹인 부위가 존재하는 경우에는 언제나 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄의 CH1(도 2A 및 표 5) 및 인간 람다 경쇄의 CL(도 2B 및 표 5)을 사용하여 이중 특이성 항체를 작제하는 데에도 적용될 수 있다. 녹인 부위가 의도한 전하 아미노산과 동일한 고유 전하 잔기로 일어나는 경우에 언제나 이는 의도한 전하쌍을 형성하는 데 직접 사용될 수 있다. 설계된 전하쌍은 표 1에 열거되어 있다(그 전체가 본원에 참조로 원용되는 WO2021/126538에서 처음으로 기술되었다). 전하쌍을 기술할 때 G166D/E는 위치 166(EU 넘버링)의 G를 D 또는 E로 치환하는 것을 나타내며, 이 경우 G166은 녹인 부위이다; D170D/E는 위치 170에서 D를 유지하거나 위치 170에서 D를 E로 치환하는 것을 나타내고; 다른 모든 치환은 동일한 명명 규칙을 따른다. 이중 특이성 항체를 작제하기 위해 사용된 여러 mAb의 VH 및 VL 서열이 도 2C-2F 및 표 2에 제시되어 있다.
항-CD47 및 항-CLDN18.2 mAb(도 2C-2D 및 표 2)를 사용하여 다양한 전하쌍 설계가 도입된 이중 특이성 항체를 작제하였다. 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체에 사용된 전하쌍 설계가 표 3에 나열되어 있다. bsAb의 VH 및 VL 영역을 인간 IgG1 중쇄(HC) 및 카파 경쇄의 불변 영역(LC)에 각각 융합시켰다. mAb 1(항-CD47) 아암 상의 HC와 LC 사이의 사슬간 디설파이드 결합을 HC 상의 K133 및 LC 상의 F209로 이동시키는 전략이 사용되었다. 이들 단계는 그 전체가 본원에 참조로 원용된 WO2021/126538에 기술된 바와 같이 수행되었다. bsAb의 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄의 백본에서(VH 및 VL 영역의 경우 Kabat 넘버링; CH1 및 CL 영역의 경우 EU 넘버링), mAb 1(항-CD47) HC에는 "놉"을 형성하는 T366W(CH2 및 CH3 영역의 경우 EU 넘버링) 돌연변이가 있고, mAb 2(항-CDN18.2) HC에는 "홀"을 형성하는 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이가 있어 2개의 중쇄가 헤테로이량체 HC(mAb 1 HC/mAb 2 HC)와 bsAb를 형성하는 데 유리하다. 또한, S354C 시스테인 돌연변이를 mAb 1 HC에 도입하고 Y349C 시스테인 돌연변이를 mAb 2 HC에 도입하여 헤테로이량체 중쇄의 헤테로이량체 쌍을 안정화하였다(Merchant et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998)). 상이한 전하쌍 설계를 갖는 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체(표 3)를 ExpiCHO-S 세포에 형질감염시켰고, 동일한 세포에서 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 동시 발현이 원하는 bsAb 및 특정 불순물의 발현 및 조립을 초래하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이중 특이성 항체를 정제하였다.
항-CD3 mAb 및 인간화 항-DLL3 mAb(그 전체가 본원에 참조로 원용되는 국제 특허 공개 번호 WO2019217145)를 사용하여 항-CD3/항-DLL3 bsAb를 작제하였다(도 2E-2F 및 표 2). bsAb의 VH 및 VL 영역을 인간 IgG1 중쇄(HC) 및 카파 경쇄(LC)의 불변 영역에 각각 융합시켰다. 전하쌍 HC(Q39E, T187E)/LC(Q38K, D170K)를 bsAb의 항-DLL3 아암에 도입하였다; 전하쌍 HC(Q39K, T187K)/LC(Q38E, D170E)를 bsAb의 항-CD3 아암에 도입하였다. mAb 2(항-DLL3) 암의 HC와 LC 사이의 사슬간 디설파이드 결합을 HC의 K133 및 LC의 F209로 이동시키는 전략을 사용하여 2개의 HC 및 2개의 LC가 형질감염된 세포에서 공동-형질감염되었을 때 의도된 bsAb의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 발현, 정제 및/또는 생산을 선호하도록 하였다. 이들 단계는 그 전체가 본원에 참조로 원용된 WO2021/126538에 기술된 바와 같이 수행되었다. 최종 bsAb(bsAb_33으로 명명됨)의 VH, CH1, VL 및 CL 서열이 표 4에 나열되어 있다.
전술한 바와 같이, bsAb_33은 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄의 백본 상에 있다(VH 및 VL 영역에 대해 Kabat 넘버링; CH1 및 CL 영역에 대해 EU 넘버링). mAb 1(항-CD3) HC에는 "놉"을 형성하는 T366W(CH2 및 CH3 영역에 대해 EU 넘버링) 돌연변이가 있고 mAb 2(항-DLL3) HC에는 "홀"을 형성하는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V가 있어 2개의 중쇄가 호모이량체 HC(mAb 1 HC/mAb 1 HC 또는 mAb 2 HC/mAb 2 HC)보다는 헤테로이량체 HC(mAb 1 HC/mAb 2 HC)를 갖는 bsAb를 형성하는 데 유리하였다. 또한, S354C 시스테인 돌연변이를 mAb 1 HC에 도입하고 Y349C 시스테인 돌연변이를 mAb 2 HC에 도입하여 헤테로이량체 중쇄의 헤테로이량체 쌍을 안정화하였다(Merchant et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998)). 또한, L234A 및 L235A 돌연변이를 H1 및 H2 모두의 CH2 영역에 도입하였다.
bsAb bsAb_33을 ExpiCHO-S 세포에서 형질감염시켰고 동일한 세포에서 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 동시 발현은 원하는 bsAb 및 특정 불순물의 발현 및 조립을 초래하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 bsAb를 정제하였다.
전하쌍이룸을 위한 CH1 및 CL 영역의 아미노산 잔기
전하쌍 명 CH1 CL
G166/S114 G166 S114
T187/D170 T187 D170
S131/P119 S131 P119
A129/S121 A129 S121
참고: CH1 및 CL 영역에 EU 넘버링이 사용되었다.
참고: bsAb, 이중 특이성 항체. VH 및 VL 영역에 Kabat 넘버링이 사용되었고; CH1 및 CL 영역에 EU 넘버링이 사용되었으며; 블랭크에는 돌연변이가 도입되지 않았다.
참고: 아미노산 치환으로 인한 잔기는 굵게 표시되고 밑줄이 그어진 형태이다.
실시예 2: 전하쌍을 갖는 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체의 특성
두 아암의 DNA를 1:1 비율(표준 비율)로 형질감염시켜 각각에 한 쌍의 전하쌍을 가지고 있는 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체를 ExpiCHO-S 세포에서 생성하였다. WT 및 PAC12(표 3)를 대조군으로 사용하였다. 이러한 형질감염으로부터 단백질 A 정제된 샘플을 브릿징(Bridging) ELISA 검정으로 분석하여 의도된 이중 특이성 항체의 형성을 확인하였다(도 3A-3B). bsAb를 포획하기 위해 플레이트 상에서 인간 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 ExpiCHO-S 세포를 사용하여 브릿징 ELISA 검정을 수행하였다. 이어서 비오티닐화 인간 CD47 단백질을 첨가하여 포획된 bsAb에 결합시키고 HRP-접합된 스트렙타비딘을 사용하여 검출을 수행하였다. 단백질 A 정제된 샘플도 주요 불순물 표준물질과 함께 CEX-HPLC에서 분석하였다(도 3C-3N). 선형 염 구배[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 6.0) 및 2% 아세토니트릴; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 6.0), 1M NaCl 및 2% 아세토니트릴]를 사용하여 CEX-HPLC를 실행하였다. WT, PAC12, ek 또는 ke 샘플(도 3C-3F)과 비교하여, 2X 항-CD47 LC 미스매치 불순물이 "EK" [(EK(gs), EK(td), EK(5), 및 EK(9) 포함, 표 3] bsAb 샘플(도 3G-3J)에서 주요 피크로부터 분리되었다. 또한, 2X 항-CD47 및 2X 항-CLDN18.2 LC 미스매치 불순물 모두 "KE" [(KE(gs), KE(td), KE(5) 및 KE(9) 포함; 표 3) bsAb 샘플에서 주요 피크로부터 분리되었다(도 3K-3N). 이들 데이터는 "EK" 및 " KE" 전하쌍이 선형 염 구배를 사용하여 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 상에서 LC 미스매치 불순물 중 하나 또는 둘 모두의 물리적 특성을 bsAb의 것과 구별할 수 있으며 CEX 크로마토그래피 상에서 LC 미스매치 불순물 중 하나 또는 둘 모두에서 bsAb의 분리를 용이하게 할 수 있음을 제시한다. 이러한 특성은 제조 환경에서 bsAb의 정제 및 생산을 촉진할 수 있다. 단백질 A 정제된 샘플을 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS)으로 분석하였다. 그 결과 의도한 bsAb가 각각의 샘플에 존재하고, EK(9)에서 2X 항-CD47 LC 미스매치가 거의 검출되지 않는 것을 제외하고(도 3P) 2X 항-CD47 및 2X 항-CLDN18.2 LC 미스매치 불순물 모두 이들 샘플에서 검출된 것으로 나타났다(도 3O-3Q).
항-CD47 LC DNA 및 항-CLDN18.2 LC DNA를 2:1의 비율(항-CD47 LC DNA: 항-CLDN18.2 LC DNA = 2:1; 편향된 DNA 비율)로 형질감염시켜 각각에 "EK" 전하쌍의 한 쌍의 전하쌍(표 3)을 갖는 항-CD47/항-CLDN18.2 이중 특이성 항체를 ExpiCHO-S 세포에서 생성하였다. WT 및 PAC12(표 3)를 대조군으로 사용하였다. "EK" 이중 특이성 항체로의 형질감염으로부터 단백질 A 정제된 샘플을 브릿징 ELISA 검정에서 분석하여 의도된 이중 특이성 항체의 형성을 확인하였다(도 4A). 단백질 A 정제된 샘플을 또한 위에서 설명한 선형 염 구배를 사용하여 주요 불순물 표준과 함께 CEX-HPLC에서 분석하였다. 2개의 상이한 LC에 대한 편향된 DNA 비율에서의 형질감염과 일치하게, 상대적으로 더 많은 2X 항-CD47 LC 미스매치 불순물이 생성되었다(도 4B). 주요 불순물 종의 존재를 LC/MS를 사용하여 분석하였다(도 4C-4D). 단백질 A 정제된 샘플을 선형 pH 구배[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) 및 50 mM NaCl; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 8.0) 및 50 mM NaCl]를 사용하여 CEX-FPLC 상에서 분리하였다. 단일 피크로 나타난 WT, PAC12, ek 또는 ke 샘플(도 4E)과 달리, "EK" 샘플은 분리된 주 피크(bsAb가 존재하는 피크 1)와 하나의 LC 미스매치 불순물 종(도 4F)을 가졌다. 피크로부터 수집된 분획을 상기 기재된 것과 동일한 브릿징 ELISA 검정을 사용하여 분석하였다(도 4G). 결과는 bsAb가 각 샘플의 피크 1에 있음을 나타낸다(도 4G). CEX-FPLC 후 2X 항-CD47 LC 미스매치 불순물로부터 bsAb의 분리가 없었던 WT, PAC12, ek 및 ke 샘플과 달리(도 4H), 각각의 CEX-FPLC 정제된 "EK" 샘플에서 피크 1은 주요 생성물로서 의도된 bsAb를 가졌다(도 4I-4L). 이 데이터는 "EK" bsAb 설계에 전하쌍을 도입함으로써 주요 bsAb가 선형 pH 구배를 사용하여 CEX-FPLC에서 2X 항-CD47 LC 미스매치 불순물로부터 분리될 수 있음을 보여주며, 이는 전하쌍들이 bsAbs의 정제를 촉진하는 특성을 가지고 있음을 제시한다.
전술한 바와 같이, 표준 DNA 비율을 사용한 형질감염으로부터 "KE" 전하쌍을 갖는 단백질 A 정제된 bsAb 샘플을 브릿징 ELISA 검정(도 3B), CEX-HPLC(도 3K-3N) 및 LC/MS(도 3Q)를 사용하여 분석하였다. 이들 샘플을 또한 선형 pH 구배[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) 및 50 mM NaCl; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 8.0) 및 50 mM NaCl]를 사용하여 CEX-FPLC 상에서 분리하였다. 단일 피크로 나타난 WT, PAC12, ek 또는 ke 샘플과 달리(도 4E), "KE" 샘플은 분리된 주요 피크(bsAb가 존재하는 피크 1) 및 두 LC 미스매치 불순물 종(도 5A)을 가졌다. 피크로부터 수집된 분획을 브릿징 ELISA 검정(도 5B) 및 LC/MS(도 5C-5F)를 사용하여 분석하였다. 결과는 bsAb가 각 샘플의 피크 1에 있음을 나타낸다(도 5A). CEX-FPLC 후 2X 항-CD47 LC 미스매치 불순물로부터 bsAb의 분리가 없었던 WT, PAC12, ek 및 ke 샘플과 달리(도 4h), 각각의 CEX-FPLC에서 피크 1은 정제된 " KE' 샘플은 주요 생성물로서 의도된 bsAb를 가졌다(도 5C-5F). 이 데이터는 "KE" bsAb 설계에 전하쌍을 도입함으로써 주요 bsAb가 선형 pH를 사용하여 CEX-FPLC에서 2X 항-CD47 LC 및 2X 항-CLDN18.2 LC 미스매치 불순물로부터 분리될 수 있음을 보여준다. 이는 전하쌍이 bsAbs의 정제를 용이하게 하는 우수한 특성을 가짐을 나타낸다.
DNA 비율이 편향된 형질감염으로부터의 단백질 A 정제된 "EK" bsAb 샘플을 단계적 용출 방법[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) 및 80 mM NaCl; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 8.0) 및 40 mM NaCl]을 사용하여 정제하였다. 방법을 각 bsAb 샘플에 대해 최적화하였다. 불순물 피크(들)로부터 분리된 주요 bsAb 피크(피크 1)로 "EK" 이중 특이성 항체를 정제하였다(도 6A). 주요 피크에서 의도된 bsAb의 존재를 브릿징 ELISA 검정(도 6B) 및 LC/MS 분석(도 6C-6F)을 사용하여 확인하였다. 이들 데이터는 전하쌍을 갖는 이중 특이성 항체가 단계적 용출 방법을 사용하여 CEX-FPLC에서 정제될 수 있음을 입증한다.
표준 1:1 DNA 비율로 양쪽 아암 DNA로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포에서 "ekEK" 또는 "keKE" 전하쌍(표 3)을 포함하는 이중 특이성 항체 설계물을 생성하였다. 이들 설계물로부터의 단백질 A 정제된 샘플을 브릿징 ELISA 검정에서 시험하여 이중 특이성 활성을 확인하였다(도 7A). 동일한 샘플을 각각의 주요 불순물 표준물(도 7B-7I)과 함께 상기 기재된 바와 같은 선형 염 구배를 사용하여 LC/MS(도 7J-7K)에 의해 CEX-HPLC 상에서 또한 분석하였다. 단백질 A 정제된 "ekEK" bsAb 샘플을 상술된 바와 같이 선형 pH 구배[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) 및 50 mM NaCl; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 8.0) 및 50 mM NaCl]를 사용하여 CEX-FPLC 상에서 분석하였다. WT, PAC12, ek 및 ke 샘플(도 4E)과 비교하여, "ekEK" bsAb 샘플은 하나의 LC 미스매치 불순물 종으로부터 주요 피크(bsAb가 존재하는 피크 1)가 더 잘 분리되어 나타났다(도 8A). 피크로부터 수집된 분획을 분석하여 동일한 브릿징 ELISA 검정(도 8B) 및 LC/MS 분석(도 8C-8F)을 사용하여 bsAb가 피크 1에 있음을 확인하였다. 유사하게, "keKE" bsAb 샘플은 WT, PAC12, ek 및 ke 샘플(도 4E)과 비교하여 1개 또는 2개의 LC 미스매치 불순물 종으로부터 주요 피크(bsAb가 존재하는 피크 1)가 더 잘 분리되어 나타났다(도 8G). 피크로부터 수집된 분획을 분석하여 동일한 브릿징 ELISA 검정(도 8H) 및 LC/MS 분석(도 8I-8L)을 사용하여 bsAb가 피크 1에 있음을 확인하였다. 이중 특이성 항체 "keKE(gs)" 및 "keKE(td)"는 2X 항-CD47 LC 및 2X CLDN18.2 LC 미스매치 종 모두로부터 분리되었다(도 8I-8J). 이중 특이성 항체 "keKE(5)" 및 "keKE(9)"는 2X 항-CD47 LC 미스매치로부터 분리되었고(도 8k-8l); 2X CLDN18.2 LC 미스매치가 검출되지 않았다.
2개의 "ekEK"(도 9A) 및 4개의 "keKE" 이중 특이성 항체(도 9E)를 CEX-FPLC 상에서 맞춤형 단계적 용출 방법[완충액 A: 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) 및 80 mM NaCl; 완충액 B: 25 mM 인산나트륨(pH 8.0) 및 40 mM NaCl]을 사용하여 정제하고 정제된 이중 특이성 항체의 활성을 브릿징 ELISA 검정(도 9B 및 9F) 및 LC/MS 분석(도 9C-9D 및 9G-9J)으로 확인하였다. 이 결과는 CEX-FPLC에서 bsAb의 정제를 용이하게 하기 위해 표 1의 전하쌍을 다른 전하쌍(ek 또는 ke 설계, 표 3)과 결합하여 사용할 수 있음을 나타낸다. 상이한 전하쌍 설계를 갖는 항-CD47 항체 아암 및 항-CLDN18.2 항체에서의 다양한 영역의 서열이 표 6에 나열되어 있다. 이들 항-CD47 항체 서열은 표 3의 설계에 따라 대응 전하쌍이 도입될 수 있는 항-CLDN18.2와 같이 또 다른 항체 아암을 가지는 이중 특이성 항체를 작제하는 데 사용될 수 있다.
참고: 아미노산 치환으로 인한 잔기는 굵게 표시되고 밑줄이 그어진 형태이다.
실시예 3: 전하쌍을 갖는 항-CD3/항-DLL3 이중 특이성 항체의 특성
항-CD3/항-DLL3 bsAb의 단백질 A 정제된 샘플을 최종 pH 5.5로 pH 조정하고 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) + 210 mM NaCl로 사전 평형화한 poros XS(Thermo) CEX 컬럼에 직접 로딩하였다. 샘플을 선형 구배[완충액 A - 25 mM 인산나트륨(pH 5.8) + 210 mM NaCl; 완충액 B - 25 mM 인산나트륨(pH 8) + 115 mM NaCl]로 용출하였다. 용출된 분획을 강 양이온 교환(SCX) HPLC로 분석하고, 2x 항-DLL3 LC 미스매치(양 아암에 매칭하는 항-DLL3 LC를 갖는 HC 헤테로이량체)의 완전한 제거를 나타내는 분획을 풀링하였다. (NH4)2SO4를 풀링된 분획에 최종 농도 700 mM로 첨가하고, 샘플을 50 mM 트리스(pH 7.5) + 700 mM(NH4)2SO4 + 3% 글리세롤로 사전 평형화한 부틸 세파로스 고성능(Cytiva) HIC(소수성 상호 작용 크로마토그래피) 컬럼에 직접 로딩하였다. 샘플을 선형 구배[완충액 A - 50 mM 트리스(pH 7.5) + 700 mM(NH4)2SO4 + 3% 글리세롤; 완충액 B - 50 mM 트리스(pH 7.5) + 10% 글리세롤]를 사용하여 용출하였다. 용출된 분획을 HIC HPLC로 분석하고, 2x 항-CD3 LC 미스매치(양 아암에 매칭하는 항-DLL3 LC를 갖는 HC 헤테로이량체)의 완전한 제거를 나타내는 분획을 정제된 단백질로 풀링하였다.
정제된 이중 특이성 항체를 HIC HPLC, SCX HPLC 및 SEC HPLC로 분석하였다(도 10A-10C). 주어진 불순물에 대한 성분만으로 일시적인 형질감염을 사용하여 잠재적인 불순물에 대한 표준을 생성하였다(즉, 2x 항-CD3 LC 미스매치를 생성하기 위해 항-CD3 LC 미스매치 표준의 형성을 강제하기 위한 형질감염에 항-DLL3 HC, 항-CD3 HC 및 항-CD3 LC만 사용됨; 주어진 아암의 HC 및 LC로만 세포를 형질감염시켜 호모이량체/절반 분자를 생성하였다) - 단백질 A로 정제되었으며 분석에서 참조로 사용됨(도 10A-10B). 데이터는 정제된 bsAb_33이 고순도임을 나타낸다.
동시에 DLL3 및 CD3 모두에 대한 bsAb_33의 결합 활성을 평가하기 위해, 정제된 bsAb를 상이한 형광 마커로 표지된 SHP-77 세포 및 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션하였다. bsAb_33에 의해 유도된 이중 염색된 이벤트를 검출하고 유세포 측정법으로 정량화하였다. 간략하게, Jurkat 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Violet Proliferation Dye 450(BD, Cat: 562158)으로 염색하고 SHP-77 세포를 CFSE(ThermoFisher, Cat: 34554)로 염색하였다. 1:1 비율로 표지된 SHP-77 및 Jurkat 세포를 2 μg/ml bsAb_33과 함께 인큐베이션하였다. mAb 차단을 위해, SHP-77 세포를 1.5 μM 항-DLL3 차단 mAb의 최종 농도에서 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션하기 전에 실온에서 10분 동안 4.5 μM 항-DLL3 차단 mAb로 처리하거나, Jurkat 세포를 1.5 μM 항-CD3 차단 mAb의 최종 농도에서 SHP-77 세포와 함께 인큐베이션하기 전에 실온에서 10분 동안 4.5 μM 항-CD3 차단 mAb로 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, 세포를 2% 포름알데하이드로 고정하고, TBS로 1회 세척하고, FACS 완충액(HBSS, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드)에 재현탁한 다음 유세포 분석법(Attune NxT)으로 분석하였다. bsAb_33의 존재 하에 두 세포 유형의 가교가 FACS에서 검출되었고 신호는 항-DLL3 또는 항-CD3 차단 mAb에 의해 억제되었다(도 11A). 이 데이터는 bsAb_33이 bsAb로서 기능함을 보여준다.
bsAb bsAb_33을 또한 기능적 T 세포 활성화 검정에서 T 세포를 활성화하는 데 사용하였다. CD3 매개 활성화를 포함하여 활성화 시 반딧불이 루시퍼라제를 조건부로 발현하는 Jurkat NFAT 루시퍼라제 리포터 세포주(BPS Bioscience)를 사용하였다. 리포터 세포를 bsAb_33의 존재 및 항-DLL3 차단 항체의 존재 또는 부재하에 SHP-77 표적 세포와 함께 CO2 인큐베이터에서 37℃의 성장 배지에서 22시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 루시퍼라제 검출 시약 및 광도계에 의해 활성화에 대해 검정하였다. bsAb bsAb_33은 표적 세포 SHP-77과 함께 인큐베이션되었을 때 리포터 세포의 용량 의존적 활성화를 유도했고, 신호는 항-DLL3 차단 항체(항-DLL3 아암의 mAb 버전)에 의해 억제되어(도 11B) bsAb_33의 T 세포 관여자 기능을 입증하였다.
본 발명의 넓은 개념에서 벗어나지 않고 전술한 실시양태에 변경이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시양태에 제한되지 않으며, 본 명세서에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위 내에서 수정을 포함하도록 의도되는 것으로 이해하여야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Phanes Therapeutics, Inc. <120> Bispecific Antibodies with Charge Pairs and Uses Thereof <130> 065799.11231/35WO1 <150> US 63/146,334 <151> 2021-02-05 <150> US 63/260,463 <151> 2021-08-20 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Thr Asp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 VL <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 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Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 CL S121R <400> 54 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Arg Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 55 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 CH1 A129K <400> 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Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser 100 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 CL S121D <400> 57 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 CL S121E <400> 58 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 59 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 VH Q39K <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 VL Q38E <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 VH Q39E <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 VL Q38K <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 63 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CH1 G166K <400> 63 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Lys Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CL S114E <400> 64 Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 65 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CH1 G166E <400> 65 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Glu Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CL S114K <400> 66 Arg Thr Val Ala Ala Pro Lys Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 67 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CH1 T187K <400> 67 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CL D170E <400> 68 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 69 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CH1 T187E <400> 69 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti- CLDN18.2 CL D170K <400> 70 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Lys Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 71 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CH1 S131K <400> 71 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Lys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CL P119E <400> 72 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Glu Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 73 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CH1 A129K <400> 73 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Lys Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CL S121E <400> 74 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 75 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CH1 S131E <400> 75 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 76 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CL P119K <400> 76 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Lys Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 77 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CH1 A129E <400> 77 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Glu Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CLDN18.2 CL S121K <400> 78 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (22)

  1. 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 제1 중쇄, H1;
    b. 제2 중쇄 H2;
    c. 제1 경쇄, L1; 및
    d. 제2 경쇄, L2를 포함하고;
    여기서 H1 및 L1은 제1 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 아암(arm)을 형성하고,
    H2 및 L2는 제2 항원, 바람직하게는 인간 기원의 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 아암을 형성하며, 여기서
    (a) H1 및 H2는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 영역을 포함하고;
    (b) L1 및 L2는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 영역을 포함하며;
    여기서 H1L1 및 H2L2는 각각 다음 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전하 쌍을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 각각 H1의 CH1에 G166D/E 및 L1의 CL에 S114K/R, 및 각각 H2의 CH1에 G166K/R 및 L2의 CL에 S114D/E;
    (2) 각각 H1의 CH1에 T187D/E 및 L1의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H2의 CH1에 T187K/R 및 L2의 CL에 D/N170D/E;
    (3) 각각 H1의 CH1에 S131D/E 및 L1의 CL에 P119K/R, 및 각각 H2의 CH1에 S131K/R 및 L2의 CL에 P119D/E;
    (4) 각각 H1의 CH1에 A129D/E 및 L1의 CL에 S121K/R, 및 각각 H2의 CH1에 A129K/R 및 L2의 CL에 S121D/E;
    (5) 각각 H2의 CH1에 G166D/E 및 L2의 CL에 S114K/R, 및 각각 H1의 CH1에 G166K/R 및 L1의 CL에 S114D/E;
    (6) 각각 H2의 CH1에 T187D/E 및 L2의 CL에 D/N170K/R, 및 각각 H1의 CH1에 T187K/R 및 L1의 CL에 D/N170D/E;
    (7) 각각 H2의 CH1에 S131D/E 및 L2의 CL에 P119K/R, 및 각각 H1의 CH1에 S131K/R 및 L1의 CL에 P119D/E; 또는
    (8) 각각 H2의 CH1에 A129D/E 및 L2의 CL에 S121K/R, 각각 H1의 CH1에 A129K/R 및 L1의 CL에 S121D/E.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 VH 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
    (b) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 CH1 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
    (c) 2개의 중쇄 H1 및 H2는 각각 VH 영역, CH1 영역 및 Fc 영역(CH2 및 CH3 영역 함유)을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고;
    (d) 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하며, 여기서 VL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖고/거나;
    (e) 2개의 경쇄 L1 및 L2는 각각 VL 영역 및 CL 영역을 포함하며, 여기서 CL 영역은 상이한 아미노산 서열을 갖는,
    단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, H1 및 H2는 헤테로이량체를 형성하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 이중 특이성 항체는 다음을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) H1의 CH1에 G166, T187, S131 또는 A129에서 음전하를 띤 아미노산(D 또는 E) - H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 가짐 -; 또는
    (b) H1의 CH1에 G166, T187, S131 또는 A129에서 양전하를 띤 아미노산(K 또는 R) - H1의 VH 영역 및 L1의 VL 영역은 각각 Q39K 및 Q38E 치환 돌연변이를 갖고, H2의 VH 영역 및 L2의 VL 영역은 각각 Q39E 및 Q38K 치환 돌연변이를 가짐 -.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 두 아암 중 하나의 CH1 및 CL 영역은 CH1에 대한 서열 번호 17, 18, 19 또는 20 및 CL에 대한 서열 번호 21 또는 22의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하고; 여기서 CH1 및 CL 영역에서의 아미노산 치환은
    (1) CH1의 K133C 및 C220X, 및 CL의 F209C 및 C214X;
    (2) CH1의 R133C 및 C131X, 및 CL의 F209C 및 C214X;
    (3) CH1의 R133C 및 C131X, 및 CL의 V209C 및 C214X; 또는
    (4) CH1의 K133C 및 C220X, 및 CL의 V209C 및 C214X로부터 선택되며;
    여기서 X는 S, A 또는 G 중에서 선택되는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 CD47, 바람직하게는 인간 CD47에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD47과 동일한 세포 상에 발현된 TAA, 바람직하게는 인간 TAA에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 CD47과 동일한 세포 상에서 발현된 CLDN18.2, 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 항-CD47 항원 결합 도메인은 다음의 아미노산을 포함하는 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 29;
    (2) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 29;
    (3) 각각 서열 번호 1, 27, 2 및 30;
    (4) 각각 서열 번호 1, 28, 2 및 30;
    (5) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 33;
    (6) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 33;
    (7) 각각 서열 번호 1, 31, 2 및 34;
    (8) 각각 서열 번호 1, 32, 2 및 34;
    (9) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 37;
    (10) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 37;
    (11) 각각 서열 번호 1, 35, 2 및 38;
    (12) 각각 서열 번호 1, 36, 2 및 38;
    (13) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 41;
    (14) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 41;
    (15) 각각 서열 번호 1, 39, 2 및 42;
    (16) 각각 서열 번호 1, 40, 2 및 42;
    (17) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 45;
    (18) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 45;
    (19) 각각 서열 번호 1, 43, 2 및 46;
    (20) 각각 서열 번호 1, 44, 2 및 46;
    (21) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 49;
    (22) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 49;
    (23) 각각 서열 번호 1, 47, 2 및 50;
    (24) 각각 서열 번호 1, 48, 2 및 50;
    (25) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 53;
    (26) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 53;
    (27) 각각 서열 번호 1, 51, 2 및 54;
    (28) 각각 서열 번호 1, 52, 2 및 54;
    (29) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 57;
    (30) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 57;
    (31) 각각 서열 번호 1, 55, 2 및 58;
    (32) 각각 서열 번호 1, 56, 2 및 58;
    (33) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 29;
    (34) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 29;
    (35) 각각 서열 번호 23, 27, 24 및 30;
    (36) 각각 서열 번호 23, 28, 24 및 30;
    (37) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 33;
    (38) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 33;
    (39) 각각 서열 번호 25, 31, 26 및 34;
    (40) 각각 서열 번호 25, 32, 26 및 34;
    (41) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 37;
    (42) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 37;
    (43) 각각 서열 번호 23, 35, 24 및 38;
    (44) 각각 서열 번호 23, 36, 24 및 38;
    (45) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 41;
    (46) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 41;
    (47) 각각 서열 번호 25, 39, 26 및 42;
    (48) 각각 서열 번호 25, 40, 26 및 42;
    (49) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 45;
    (50) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 45;
    (51) 각각 서열 번호 23, 43, 24 및 46;
    (52) 각각 서열 번호 23, 44, 24 및 46;
    (53) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 49;
    (54) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 49;
    (55) 각각 서열 번호 25, 47, 26 및 50;
    (56) 각각 서열 번호 25, 48, 26 및 50;
    (57) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 53;
    (58) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 53;
    (59) 각각 서열 번호 23, 51, 24 및 54;
    (60) 각각 서열 번호 23, 52, 24 및 54;
    (61) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 57;
    (62) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 57;
    (63) 각각 서열 번호 25, 55, 26 및 58; 또는
    (64) 각각 서열 번호 25, 56, 26 및 58.
  9. 제8항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함하며, 이들은 다음의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 각각 서열 번호 1, 28, 2, 29, 3, 63, 4 및 64;
    (2) 각각 서열 번호 1, 36, 2, 37, 3, 67, 4 및 68;
    (3) 각각 서열 번호 1, 44, 2, 45, 3, 71, 4 및 72;
    (4) 각각 서열 번호 1, 52, 2, 53, 3, 73, 4 및 74;
    (5) 각각 서열 번호 1, 31, 2, 34, 3, 65, 4 및 66;
    (6) 각각 서열 번호 1, 39, 2, 42, 3, 69, 4 및 70;
    (7) 각각 서열 번호 1, 47, 2, 50, 3, 75, 4 및 76;
    (8) 각각 서열 번호 1, 55, 2, 58, 3, 77, 4 및 78;
    (9) 각각 서열 번호 23, 28, 24, 29, 59, 63, 60 및 64;
    (10) 각각 서열 번호 23, 36, 24, 37, 59, 67, 60 및 68;
    (11) 각각 서열 번호 23, 44, 24, 45, 59, 71, 60 및 72;
    (12) 각각 서열 번호 23, 52, 24, 53, 59, 73, 60 및 74;
    (13) 각각 서열 번호 25, 31, 26, 34, 61, 65, 62 및 66;
    (14) 각각 서열 번호 25, 39, 26, 42, 61, 69, 62 및 70;
    (15) 각각 서열 번호 25, 47, 26, 50, 61, 75, 62 및 76; 또는
    (16) 각각 서열 번호 25, 55, 26, 58, 61, 77, 62 및 78.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 조절자(ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편 아암을 포함하고 ICM에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, ICM은 CD3, CD16, CD27, CD28, CD40, CD122, NKp46, OX40, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, VISTA, SIGLEC7, SIGLEC9, KIR, BTLA, B7-H3, 및 기타 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제5항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고, 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL, 및 CL을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제5항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 각각 서열 번호 13, 14, 15 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH, CH1, VL 및 CL을 포함하는, 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  16. 제15항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  19. 제18항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포를 관여시킴으로써(engaging) 상기 대상체에서 암세포 표면 상에 발현되는 DLL3을 표적화하는 방법.
  20. 대식세포 매개 식세포작용의 CD47 차단 유도 활성화 또는 CD3-매개 T 세포 활성화를 사용하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현된 1개 또는 2개의 항원을 표적화하는 방법 및/또는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 암은 폐암, 위암, 식도암, 담관암(bile duct cancer), 담도암(cholangiocarcinoma), 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 기타 액형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하기 위한 조건 하에서 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고, 세포 또는 배양물로부터 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 로부터 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약학 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
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